ISSN 2175-8395

Empresa Brasileira de Pesquisa AgropecuáriaEmbrapa Instrumentação Agropecuária

Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento

Rede de Nanotecnologia Aplicada ao AgronegócioAnais do V Workshop 2009

Odílio Benedito Garrido de AssisWilson Tadeu Lopes da Silva

Luiz Henrique Capparelli MattosoEditores

Embrapa Instrumentação AgropecuáriaSão Carlos, SP

2009

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Presidente: Dr. Luiz Henrique Capparelli MattosoMembros: Dra. Débora Marcondes Bastos Pereira Milori,Dr. João de Mendonça Naime,Dr. Washington Luiz de Barros MeloValéria de Fátima CardosoMembro Suplente: Dr. Paulo Sérgio de Paula Herrrnann Junior

Supervisor editorial: Dr. Victor Bertucci NetoNormalização bibliográfica: Valéria de Fátima CardosoCapa: Manoela Campos e Valentim MonzaneImagem da Capa: Imagem de AFM de nanofibra de celulose - Rubens Bemardes FilhoEditoração eletrônica: Manoela Campos e Valentim Monzane

l!! edição1ª impressão (2009): tiragem 200

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Anais do V Workshop da rede de nanotecnologia aplicada aoagronegócio 2009 - São Carlos: Embrapa InstrumentaçãoAgropecuaria, 2009.

IrregularISSN: 2175-8395

1. Nanotecnologia - Evento. L Assis, Odílio Benedito Garrido de.lI. Silva, Wilson Tadeu Lopes da. IlI. Mattoso, Luiz HenriqueCapparelli. IV. Embrapa Instrumentação Agropecuaria

© Embrapa 2009

Rede de Nanotecnologia Aplicada ao Agronegócio - Anais do V Workshop

DESENVOLVIMENTO DE UM IMUNOSSENSOR PARA DETECÇÃODE ANAPLASMOSE BOVINA

Andre Santiago Afonso'>, Ronaldo Censi Faria', Luiz Henrique Capparelli Mattoso"

'Depto. de Quimica - UFSCar, 13560-905, São Carlos/SP2Laboratório Nacional de Nanotecnologia para o Agronegócio, Embrapa Instrumentação Agropecuária,

13560-970, São Carlos/SP *mattoso@cnpdia.embrapa.br

Projeto Componente: PC2 Plano de Ação: 01.05.1.02.03

Resumo

A proposta deste projeto é o desenvolvimento de um imunossensor para detecção de Anaplasmamarginale causadora da anaplasmose bovina, uma doença endêmica que acarreta considerávelprejuízo na cadeia produtiva bovina. Um dispositivo sensor será desenvolvido utilizando comomaterial bioativo uma das seis proteínas principais de superfície da A. marginale, a MPS5. Aimobilização da MPS5 sobre o eletrodo será realizada covalentemente utilizando mono camadasautomontadas de tíois. Como sistema de transdução avaliar-se-á a utilização da técnica demicrobalança de cristal de quartzo (QCM). Para caracterização dos filmes e do processo deimobilização da biomolécula serão utilizadas as técnicas de espectroscopia de reflectânciaespecular na região do infravermelho. A validação do imunossensor será realizada comparando osresultados obtidos do sistema sensor desenvolvido com resultados obtidos por ensaioimunoabsorvente ligado a uma enzima (ELISA) realizados com amostras de animais sadios einfectados.

Palavras-chave: Anaplasmose, immunosensor, QCM.

Introdução

A anaplasmose bovina é uma enfermidadecausada pela riquétsia intra-eritrocítica Anaplasmamarginale, um dos agentes etiológicos da tristezaparasitária bovina (TPB), juntamente com doishemoprotozoários, Babesia bovis e Babesiabigemina (DUMLER et al., 2001).

Com o advento da tecnologia do DNArecombinante, as pesquisas voltadas para os testessoro lógicos foram focadas nas proteínas demembrana, devido à possibilidade de sua produçãoem culturas bacterianas. Seis proteínas principais desuperfície (Major Surface Proteins-MSPs: MSPla,MSPlb, MSP2 MSP3, MSP4 e MSP5) foraminicialmente identifícadas em A. marginale deri vadode eritrócitos bovinos e de tecidos de carrapatos.Essas proteínas, expostas na superfície da riquétsia,

são facilmente acessíveis ao sistema imunológico dohospedeiro, e desempenham importantes funçõespara a sobrevivência do parasita. A proteína MSP5possui maior potencial para ser utilizada comoantígeno em diagnóstico soro lógico, devido às suascaracterísticas de conservação entre diferentesespécies e isolados de Anaplasma sp. Devido àfacilidade de manuseio e segurança, dentre os testessoro lógicos, o Enzyme Linked Sorbent Assay(ELISA), é o mais utilizado para o diagnóstico deinfecções por A. marginale. Esta técnica consiste nareação antígeno-anticorpo, em que o antígeno éimobilizado por adsorção física sobre a superfície demicroplacas de poliestireno, e através de uma reaçãoenzimática na presença do analito de interesse, háuma mudança de coloração do sistema, o qual émonitorado com um espectrofotômetro.

Apesar dos imunoensaios apresentaremgrande sensibilidade e seletividade para o

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diagnóstico da anaplasmose bovina e para a pesquisaepidemiológica essas técnicas demandam tempo,pessoal qualificado e custo elevado, o que dificulta omonitoramento e controle da doença. Tais problemaspodem ser contornados com o desenvolvimento desistemas baseados nas reações biológicasdenominados biossensores.

Materiais e métodos

Em uma primeira etapa avaliar-se-á adeposição de tiol em monocamada sobre diferenteseletrodos.

Os filmes automontados derivados dealcanotióis serão depositados por imersão dosubstrato em solução alcoólica demercaptoundecanoíco e decanotiól na proporção de1:3 em diferentes concentrações por 3 horas e depoislavados e secos ao ar de acordo com Briand et aI.(2006).

A modificação da superfície será avaliada porvoltametria cíclica (CV) avaliando os perfis dosvoltamogramas antes e após a modificação dassuperfícies com os filmes, em solução de eletrólitosuporte. A principal caracterização será realizadapor espectroscopia de reflectância especular naregião do infravermelho com transformada deFourier (FTIR). O antígeno, proteína MSP5 (majorsurface protein), será fornecido pela Embrapa Gadode Corte, para imobilização sobre as diferentesmatrizes. Os eletrodos modificados com derivadosde alcanotióis serão imersos em solução contendo 20mmol.L-l de N-hidroxisuccinimida (NHS) e 10mmol.L-1 de hidrocloreto de l-etil-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) variandoo tempo de incubação. Em seguida serão lavados esecos. Amodificação dos filmes com esses reagentesserão avaliados por FTIR por reflectância. Opróximo passo será a imobilização da proteínaMSP5, imergindo os eletrodos modificados emsolução do antígeno e tampão fosfato pH 7,0 pordiferentes intervalos de tempo e concentração,lavados com tampão e secos. Após essa etapa, amodificação também será avaliada por FTIR porrefletância e QCM.

OS sítios ainda disponíveis serão bloqueadospor imersão do biossensor em solução contendoalbumina soro bovino 1% (m/v) em tampão fosfatopH 7,4 por duas horas.

O senso r será avaliado antes e após aexposição à amostra de soro contendo o anticorpoanti-MSP5 de animais infectados e em soros deanimais sadios em diferentes intervalos de tempo deincubação sendo em seguida lavado' com soluçãotampão. Como técnicas de transdução será microbalança de crista de quartzo.

As medidas nanogravimétricas serãorealizadas em uma QCM Stanford modelo Q200. Oeletrodo de trabalho será um disco de cristal dequartzo corte-AT com freqüência fundamental de 5MHz com eletrodos de ouro de área igual a 0,25 cm2

em ambos os lados do cristal. A resposta do sistemasensor será avaliada por meio da variação defreqüência em função do tempo antes e após a adiçãoda amostra. Avaliar-se-á a resposta do sistema após alavagem do sistema com solução tampão com oobjetivo de avaliar a regeneração do eletrodo.

Os resultados obtidos com o immunosensorserão avaliados com relação o grau de concordânciautilizando o método de ELISA como método dereferência, uma vez que é a técnica utilizada para odiagnóstico de anaplasmose. Os testes serãorealizados como controle para animais sadios einfectados tanto para o imunossensor quanto para ométodo ELISA. O estado de infectividade dosanimais será confirmado por PCR para o gene msp5.

Resultados esperados

Para a confirmação da modificação dasuperfície dos eletrodos com os a1canotióis serãoanalisadas as respostas eletroquímicascaracterísticas da superfície dos eletrodos de ouromodificados ou não por voltametria cíclicamonitorando as mudanças nos valores de correntedos voltamogramas antes e após a modificação como amonocamada.

Os resultados obtidos por FTIR serãoanalisados pela mudança nas bandas característicasdos grupos funcionais a monocamanda antes e após amodificação com reagentes NHS e EDC, e oantigeno. A variação de massa das superfícies com ossubstratos com os agentes modificantes serãoavaliado com QCM diminuindo a freqüência deoscilação do cristal de quartzo.

Para a reação entre o antígeno e anticorpo, osquais serão monitorados por QCM será avaliado odiminuição da freqüência de oscilação do cristal dequartzo na presença do analito de interesse.

Agradecimentos

CNPq, FIPAI, EMBRAPA, FINEPIMCT.

Referências

DUMLER, J. S.; BARBET, A. F.; BEKKER, C. P. J.;DASCH, G A.; PALMER, G H.; RAY, S. C.;RIKIHISA, Y.; RURANGIRWA, F. R.International journal of Systematic andEvoluationary microbiology, Reading, v. 51, p.2145,2001.BRIAND, E.; SALMAIN, M.; HERRY, I-M.;PERROT, H.; COMPERE, C.; PRADIER, C-MoBiosensors and Bioelectronics, Essex, v. 22, p. 440,2006.

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