dr. edilson ramos gomes dr. enrique alonso zuñiga drª luz ... · ausência de metais pesados,...

Dr. Edilson Ramos Gomes

Dr. Enrique Alonso Zuñiga

Drª Luz Maria Ruiz Machuca

(Orgs.)

O ESTRESSE DAS PLANTAS

CULTIVADAS

&

PROTOCOLOS DE ANÁLISE

CONSELHO EDITORIAL ACADÊMICO

RESPONSÁVEL PELA PUBLICAÇÃO DESTA OBRA

Prof. Dr. JOÃO CARLOS CURY SAAD FCA/UNESP – Campus de Botucatu

Prof. Dr. WILLIAN FERNANDO ZAMBUZZI IBB/UNESP – Campus de Botucatu

Prof. Dr. GUSTAVO DA ROCHA DE CASTRO IBB/UNESP – Campus de Botucatu

© 2018 Editora Fepaf

Fundação de Estudos e Pesquisas Agrícolas e Florestais

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Fazenda Experimental Lageado - Botucatu - SP.

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FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO TÉCNICA DE AQUISIÇÃO E TRATAMENTO DA INFORMAÇÃO

– DIRETORIA TÉCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - UNESP - FCA - LAGEADO - BOTUCATU (SP)

O estresse das plantas cultivadas & protocolos de aná-

E82 lise / Organizadores: Edilson Ramos Gomes; Enrique

Alonso Zuñiga; Luz Maria Ruiz Machuca - Botucatu: FEPAF,

2018

110 p.: fots. color., grafs., ils. color., tabs.

1 livro digital

Disponível em: http://www.fepaf.org

ISBN 978-85-7170-000-0

Inclui bibliografia

1. Estresse - Plantas. 2. Produção vegetal. 3. Bioquí-

mica. 4. Métodos analíticos. I. Gomes, Edilson Ramos. II.

Alonso Zuñiga, Enrique. III. Machuca, Luz Maria Ruiz. IV.

Fundação de Estudos e Pesquisas Agrícolas e Florestais. V.

Júlio de Mesquita Filho. Faculdade de Ciências Agronômicas.

CDD 23. ed. (632.1)

Sumário

CAPÍTULO 1 ................................................................................................................................... 1

CARACTERIZAÇÃO E PROCESSO DE ANÁLISE DE ÁGUA RESIDUÁRIA ............................................ 1

1. Introdução ................................................................................................................................. 1

2. Metodologia de coleta e análise de água residuária ................................................................ 2

2.1 Diagnóstico físico-químico da água residuária .................................................................... 3

2.2 Processo de filtragem e ozonização da água residuária ..................................................... 5

2.2.1 Filtragem ...................................................................................................................... 5

2.2.2 Ozonização ................................................................................................................... 6

2.3 Análise microbiológica da água residuária .......................................................................... 7

2.3.1 Coliformes totais e coliformes termotolerantes .......................................................... 7

2.3.2 Contagem de ovos de helmintos na água residuária ................................................... 9

Referências .................................................................................................................................. 11

CAPÍTULO 2 ................................................................................................................................. 12

ETAPAS PARA DIMENSIONAMENTO DE EXPERIMENTO COM DÉFICE HÍDRICO ......................... 12

1. Introdução ............................................................................................................................... 12

2. Etapas cronológicas de execução ............................................................................................ 13

2.1 Determinação de delineamento experimental ................................................................. 13

2.2 Características químicas e físicas ...................................................................................... 13

2.2 Análises hídricas ................................................................................................................ 14

2.2.1 Curva de retenção de água do solo ............................................................................ 14

2.2.2 Etapas para determinação da curva de retenção ...................................................... 14

2.2.3 Ajuste da curva de retenção de água no solo ............................................................ 16

2.3 Instalação dos tensiômetros de punção e monitoramento da tensão de água do solo ... 17

2.4 Manejo da irrigação (irrigação por gotejamento) ............................................................. 17

Referências .................................................................................................................................. 19

CAPÍTULO 3 ................................................................................................................................. 21

REUSO DE ÁGUA NA AGRICULTURA: ASPECTOS AMBIENTAIS E AGRONÔMICOS ...................... 21

1. Introdução ............................................................................................................................... 21

2. Potencial agrícola das águas residuárias ................................................................................. 22

3. Tratamento dos efluentes ....................................................................................................... 23

4. Aplicação das águas residuárias em culturas agrícolas ........................................................... 24

5. Considerações finais ................................................................................................................ 25

Referências .................................................................................................................................. 26

CAPÍTULO 4 ................................................................................................................................. 29

ASPECTOS QUALITATIVOS DA ÁGUA PARA IRRIGAÇÃO .............................................................. 29

1. Introdução ............................................................................................................................... 29

2. Principais critérios para estabelecer a qualidade da água para irrigação ............................... 30

2.1 Salinidade .......................................................................................................................... 30

2.2 Sodicidade ......................................................................................................................... 31

2.3 Concentração de íons específicos ..................................................................................... 32

2.4 Interpretação da qualidade de água para irrigação .......................................................... 33

Referências .................................................................................................................................. 34

CAPÍTULO 5 ................................................................................................................................. 36

CONTEXTUALIZAÇÃO ECONÔMICO-FINANCEIRA SOBRE O USO DO LODO DE ESGOTO NA

AGRICULTURA ............................................................................................................................. 36

1. Introdução ............................................................................................................................... 36

2. O potencial do lodo de esgoto para economia ....................................................................... 37

Referências .................................................................................................................................. 40

CAPÍTULO 6 ................................................................................................................................. 42

LODO DE ESGOTO: CARACTERISTICAS NUTRICIONAIS E EFEITOS DA UTILIZAÇÃO NO SOLO ..... 42

1. Introdução ............................................................................................................................... 42

2. Lodo de esgoto ........................................................................................................................ 43

2.1 Características nutricionais do lodo de esgoto ................................................................. 45

2.2 Efeitos da utilização de lodo de esgoto no solo ................................................................ 46

Referências .................................................................................................................................. 49

CAPÍTULO 7 ................................................................................................................................. 51

USO DO LODO DE ESGOTO EM PLANTAS .................................................................................... 51

1. Introdução ............................................................................................................................... 51

2. Lodo de esgoto na nutrição de plantas ................................................................................... 52

Referências .................................................................................................................................. 56

CAPÍTULO 8 ................................................................................................................................. 59

PIGMENTOS FOLIARES ................................................................................................................ 59

1. Introdução ............................................................................................................................... 59

2. Clorofilas .................................................................................................................................. 59

3. Antocianinas ............................................................................................................................ 61

4. Extração e análise dos teores de pigmentos ........................................................................... 61

4.1 Preparo da amostra ........................................................................................................... 61

4.2 Ensaio ................................................................................................................................ 62

Referências .................................................................................................................................. 64

CAPÍTULO 9 ................................................................................................................................. 65

PROTEÍNAS SOLÚVEIS TOTAIS ..................................................................................................... 65

1. Introdução ............................................................................................................................... 65

2. Material e reagentes ............................................................................................................... 66

2.1 Determinação de Proteína solúvel total pelo método Bradford (Bradford, 1976) ........... 66

2.1.1 Ensaio ......................................................................................................................... 66

2.1.2 Preparo das soluções ................................................................................................. 66

2.1.3 Curva padrão .............................................................................................................. 67

2.2 Determinação de Proteína pelo método do amido negro (Popov, 1975) ........................ 67

2.3 Protocolo ........................................................................................................................... 68

Referências .................................................................................................................................. 70

CAPÍTULO 10 ............................................................................................................................... 71

RAZÃO ISOTÓPICA DE 13C/12C E 15N/14N ..................................................................................... 71

1. Introdução ............................................................................................................................... 71

2. Aplicação dos isótopos δ 13C e δ 15N em plantas sob estresse ................................................ 72

2.1 Coleta e processamento do material vegetal ................................................................... 73

2.2 Análises da razão isotópica de 13C/12C e de 15N/14N ......................................................... 75

2.3 Determinação da razão isotópica de 13C/12C e de 15N/14N ............................................... 75

Referências .................................................................................................................................. 76

CAPÍTULO 11 ............................................................................................................................... 77

FLUORESCÊNCIA DA CLOROFILA a: ASPECTOS GERAIS E PROTOCOLO DE MEDIDA PARA LI-

6400/LI-6400XT ........................................................................................................................... 77

1. Introdução ............................................................................................................................... 77

2. Testes básicos de funcionamento da câmara de fluorescência da folha (LCF) ....................... 82

2.1 Calibração do flash retangular .......................................................................................... 85

2.2 Definição da intensidade ótima da luz de medidas (Meas) .............................................. 86

2.3 Definição da intensidade do flash de saturação ............................................................... 87

2.4 Protocolo para flash multifásico (MultiPhase Flash) ......................................................... 89

2.5 Medida da fluorescência da clorofila ................................................................................ 91

Referências .................................................................................................................................. 94

CAPÍTULO 12 ............................................................................................................................... 96

CURVA FOTOSSINTÉTICA DE RESPOSTA À LUZ (CURVA A-Q): CONSIDERAÇÕES TEÓRICAS E

PASSO A PASSO PARA EXECUÇÃO ............................................................................................... 96

1. Introdução ............................................................................................................................... 96

2. Considerações operacionais .................................................................................................... 97

2.1 Curva rápida ...................................................................................................................... 97

2.2 Curva lenta ........................................................................................................................ 98

2.3 Luz ..................................................................................................................................... 98

2.4 CO2 ..................................................................................................................................... 98

2.5 Temperatura...................................................................................................................... 99

2.6 Umidade ............................................................................................................................ 99

2.7 Passo a passo da curva de luz rápida automática (Autoprogram) .................................... 99

Referências ................................................................................................................................ 102

CAPÍTULO 13 ............................................................................................................................. 103

CURVA FOTOSSINTÉTICA DE RESPOSTA AO CO2 (CURVA A-CI): CONSIDERAÇÕES TEÓRICAS E

PASSO A PASSO PARA EXECUÇÃO ............................................................................................. 103

1. Introdução ............................................................................................................................. 103

2. IRGA LI-6400XT ...................................................................................................................... 105

2.1 Luz ................................................................................................................................... 105

2.2 CO2 ................................................................................................................................... 105

2.3 Temperatura.................................................................................................................... 105

2.4 Controle da umidade ....................................................................................................... 106

2.5 Match .............................................................................................................................. 106

2.6 Passo a passo da curva automática (Autoprogram)........................................................ 106

Referências ................................................................................................................................ 109

PREFÁCIO

Esta obra reúne temas relacionados a estresse em plantas, com ênfase em diferentes

aspectos na aplicação de água de reúso e lodo na agricultura. Versa também sobre

técnicas de estudo do estresse, desde o dimensionamento de ensaios de deficiência

hídrica a técnicas de avaliação bioquímica de plantas submetidas. Por fim, capítulos

específicos da avaliação fotossintética, ferramenta muito útil para estudo de plantas

cultivadas sob estresse. A obra é coletiva e recebeu contribuições de acadêmicos da

FCA e do IBB da UNESP-Campus de Botucatu e de profissionais das ESALQ/USP –

Piracicaba, SP. Espera-se que a publicação desperte interesse em acadêmicos da área

biológica que se dedicam a estudar estresse em plantas cultivadas.

Prof. Dr. Fernando Broetto

Botucatu, Novembro de 2018.

O Estresse das Plantas Cultivadas & Protocolos de Análise

1

CAPÍTULO 1

CARACTERIZAÇÃO E PROCESSO DE ANÁLISE DE

ÁGUA RESIDUÁRIA

Edilson Ramos Gomes1, Fernando Broetto2, Osvaldir Feliciano dos

Santos3, João de Jesus Guimarães3, Ícaro Monteiro Galvão3,

Dayanne Fabricio Bressan4

1Engenheiro Agrônomo, Doutor em Agronomia (Irrigação e Drenagem) – Faculdade de

Ciências Agronômicas, Universidade Estadual Paulista. Rua José Barbosa de Barros, 1780,

CEP 18610-307, Botucatu – SP, Brasil. e-mail: [email protected]; 2Professor Associado

– Departamento de Química e Bioquímica, Universidade Estadual Paulista/Unesp, Campus de

Botucatu – Instituto de Biociências, Rua Profa. Dr

a. Irina Delanova Gemtchujnicov, s/n

0, CEP:

18618-693, Botucatu, São Paulo, Brasil. 3Pós-graduação em Agronomia (Irrigação e

Drenagem) – Faculdade de Ciências Agronômicas, Universidade Estadual Paulista. Rua José

Barbosa de Barros, 1780, CEP 18610-307, Botucatu – SP, Brasil. 4Doutora em Agronomia

(Irrigação e Drenagem) – Faculdade de Ciências Agronômicas, Universidade Estadual Paulista.

Rua José Barbosa de Barros, 1780, CEP 18610-307, Botucatu – SP, Brasil.

1. Introdução

Os recursos naturais são de suma importância para a sobrevivência de

animais e planta. Com a limitação de recursos como a água potável, surgem

procedentes que interferem no desenvolvimento e evolução das plantas. As

plantas utilizam água durante o processo fotossintético, sendo que parte se

perde durante a transpiração. A água na forma líquida permite a difusão e

fluxo de massa de solutos tornando-se essencial para o transporte e

distribuição de nutrientes e metabólitos, além disso, exerce importantes

funções no protoplasma e na parede celular, mantendo a turgescência nos

órgãos das plantas (TAIZ; ZEIGER, 2013).

O Brasil se destaca por apresentar elevada disponibilidade hídrica em seu

território, onde estão situadas grandes reservas de água do planeta. Contudo,

a distância entre as bacias hidrográficas dos centros urbanos, faz com que

esse recurso seja mal aproveitado. Assim, o uso eficiente da água é

indispensável e necessário para manutenção do ambiente. Com o crescimento

mailto:[email protected]


2

populacional em regiões de baixa disponibilidade hídrica, observa-se acréscimo

na contaminação de mananciais, ineficiência na distribuição hídrica, má

gerenciamento dos recursos hídricos e zonas com épocas de estiagem

prolongadas. O fornecimento da água com qualidade promove a preservação

ambiental e desenvolvimento sustentável, além de induzir a busca de

alternativas para o uso racional dos recursos hídricos (HESPANHOL, 2015).

Uma das alternativas para minimizar a escassez hídrica seria o

aproveitamento de águas residuárias, previamente tratadas para fins agrícolas.

Mancuso e Santos (2003), destacam que a água residuária proporciona ganhos

econômicos quando utilizada para fins agrícolas, pois traz benefícios como

menor proporção de efluentes de esgotos lançados em corpos de água. Além

disso, apresenta alta carga de nutrientes, favorece a conservação do solo,

maior acúmulo de matéria orgânica, dentre outros.

A água residuária previamente tratada é rica em nutrientes básicos para o

crescimento e desenvolvimento das plantas, destacando-se os macronutrientes

N, P, K e elementos como As, Cd, Cr, Hg, Mo, Ni, Pb, Se e Zn, sendo que

alguns destes são imprescindíveis ao crescimento e outros potencialmente

tóxicos (LEAL et al. 2010). No entanto a utilização da água residuária via

sistema de irrigação pode ser empregada para a produção de grãos, frutas,

plantas medicinais e outros tipos de alimentos, por oferecer boa quantidade de

nutrientes, embora possa existir certo risco de contaminação (CAMARA, 2012).

Portanto, o uso de água residuária previamente tratada possibilita seu uso

na irrigação de plantas e esse efluente deve ser de origem principalmente

doméstica, pois apresenta menores riscos, bem como baixos teores ou até

ausência de metais pesados, complexos orgânicos e fitotóxicos (BAÑON et al.

2011). Segundo Leal et al. (2010), a água residuária além de suprir

parcialmente a adubação mineral, pode proporcionar acréscimo da produção

das culturas. Entretanto, esta prática dependerá da origem do efluente

(doméstico ou industrial), forma de tratamento, técnica de irrigação utilizada e o

período de coleta da água residuária, pois esses fatores podem influenciar no

acúmulo de compostos, minerais tóxicos, orgânicos, inorgânicos e até mesmo

salinizando o solo (HESPANHOL, 2015).

2. Metodologia de coleta e análise de água residuária


3

A água residuária é originária da Estação de Tratamento de Esgoto (ETE-

SABESP), Botucatu-SP. A ETE recebe todo o esgoto doméstico da cidade o

qual passa por sistema misto de tratamento composto por um desarenador,

seguido de tanque de equalização, reator anaeróbico de fluxo ascendente e

decantadores (tratamento primário). Após passar pelo sistema de tratamento

primário o efluente ainda deverá passar por tratamento secundario com

filtração e ozonização, para que atenda os critérios do Decreto nº 10.755 de

22/11/1977 (enquadra-se sobre os corpos da água). O transporte deve ser feito

em caminhão pipa ou via sistema pressurizado em tubulações especificas.

Quando distante da ETE a água residuária, deve ser armazenada em caixa de

água com tampa. Em seguida, deve-se coletar amostra do efluente para

realizar analises físico-químicas.

2.1 Diagnóstico físico-químico da água residuária

Para a análise físico-química de água residuária, amostras são divididas

em duas partes, uma relacionada ao tratamento primário (antes de passar pelo

filtro de areia e ozonizador) e outro com tratamento secundário Figura 1B (após

passar pela filtragem e ozonização). Deve-se coletar um volume de 2 L para

cada amostra a ser analisada quanto ao teor de minerais e metais pesados

(Figura 1A). A análise do efluente com tratamento primário (ECTP) e

secundário (ECTS) segue o protocolo do Standard Method para esse fim

(Tabela 1 e 2).

Figura 11. Amostras coletadas para análise (A) e (B) ponto de coleta após

tratamento secundário. ECTP, Efluente com tratamento primário; ECTS,

Efluente com tratamento secundário.

A B

ECTP ECTS


4

Para análises Físico-Químicas e metais pesados (Tabela 1 e 2), a água

residuária recebeu classificação como C2S1 com média salinidade e baixo teor

de sódio, sendo de boa qualidade para irrigação de plantas (CORDEIRO,

2001).

Tabela 1. Análise Físico-Química da água residuária de Botucatu (*), com

tratamento primário e com tratamento secundário em três épocas de coletas.

Parâmetros Coleta 1 Coleta 2 Coleta 3

Unidades C.T.P C.T.S C.T.P C.T.S C.T.P C.T.S

Aspecto Amarelo Amarelo Am./Turva Amarela Esc. c/ precip.

Amarelada -

Odor Objetável Objetável Objetável Objetável Objetável Objetável - Cor 40 15 24,5 10 >70 10 Mg Pt-Col L

-1

Turbidez 8,78 2,77 3,04 1,04 7,44 1,44 NTU pH 7,36 7,77 6,56 6,52 6,11 5,11 - Dureza total 68 60 56 50 82 68 mg CaCO3 L

-1

Dureza cálcica 58 50 34 26 34 32 mg CaCO3 L-1

Dureza de magnésio

33,6 28,4 30 20,2 40,32 30,24 mg CaCO3 L-1

Ferro 0,057 0,056 0,046 0,035 0,037 0,031 mg L-1

Cloreto 64,42 63,04 27,6 27,14 28,923 28,09 mg L

-1

Sulfato 43,18 39,18 18 15,301 22,152 16,967 mg L-1

Fluoreto 1,22 0,76 2,74 0,337 0,253 0,292 mg L

-1

Cond. Elétrica 734,4 729,4 314,5 279,5 298,4 211,6 μS cm-1

Fósforo total 2,15 1,98 2,004 1,606 ND 0,404 mg L

-1

Nitrato 2,01 2,59 3,26 4,28 7,44 7,52 mg L-1

Nitrito 2,22 2,1 3,1 2,1 2,2 1,365 mg L

-1

TOC 19,1 19,1 17,44 32,06 9,507 8,216 mg L-1

TN 20 33,33 15 14,89 11,22 13,39 mg L

-1

Óleos e graxas 11 4 4,6 5,1 3,9 61 mg L-1

DQO 31,84 27,15 0,426 ND ND 0,272 mg L

-1

Sulfeto 0,213 0,213 0,12 0,12 0,213 0,213 mg L-1

Sódio 2,138 2,048 2,018 1,945 2,03 1,943 mg L

-1

Cloro Residual Total

0,41 0,07 0,04 0,03 0,0012 ND mg L-1

(*) analise de água coletada em 2015.


5

Tabela 2. Análise de metais pesados da água residuária de Botucatu (*), com

tratamento primário (C.T.P) e com tratamento secundário (C.T.S) em três

épocas de coletas.

Parâmetros Coleta 1 Coleta 2 Coleta 3

Unidades C.T.P C.T.S C.T.P C.T.S C.T.P C.T.S

Bário ≤ 0,0001 ≤ 0,0001 ≤ 0,0001 ≤ 0,0001 ≤ 0,0017 ≤ 0,0009 mg L-1

Cádmio ≤ 0,0001 ≤ 0,0001 ≤ 0,0001 ≤ 0,0001 ≤ 0,0001 ≤ 0,0001 mg L-1

Chumbo ≤ 0,0001 ≤ 0,0001 ≤ 0,0001 ≤ 0,0001 ≤ 0,0001 ≤ 0,0001 mg L-1

Cobre ≤ 0,0001 ≤ 0,0001 ≤ 0,0000 ≤ 0,0001 ≤ 0,0001 ≤ 0,0001 mg L-1

Crômio Total ≤ 0,0001 ≤ 0,0001 ≤ 0,0000 ≤ 0,0001 ≤ 0,0001 ≤ 0,0001 mg L-1

Estanho ≤ 0,0001 ≤ 0,0001 ≤ 0,0000 ≤ 0,0001 ≤ 0,0001 ≤ 0,0001 mg L-1

Mercúrio ≤ 0,0001 ≤ 0,0001 0,0005 ≤ 0,0001 ≤ 0,0001 ≤ 0,0001 mg L-1

Níquel ≤ 0,0001 ≤ 0,0001 0,0003 ≤ 0,0001 ≤ 0,0004 ≤ 0,0001 mg L-1

Prata ≤ 0,0017 ≤ 0,0001 0,0008 ≤ 0,0001 ≤ 0,0001 ≤ 0,0001 mg L-1

Selênio ≤ 0,0001 ≤ 0,0001 ≤ 0,0001 ≤ 0,0001 ≤ 0,0001 ≤ 0,0001 mg L-1

Zinco 0,0057 ≤ 0,0001 ≤ 0,0001 ≤ 0,00017 0,0007 0,0085 mg L-1

Arsênio ≤ 0,0001 ≤ 0,0001 ≤ 0,0000 ≤ 0,0001 ≤ 0,0001 ≤ 0,0001 mg L-1

Manganês 0,444 0,377 0,251 0,141 0,503 0,456 mg L-1

(*) analise de água coletada em 2015.

2.2 Processo de filtragem e ozonização da água residuária

2.2.1 Filtragem

A água residuária deve passar por filtro de areia com 0,70 m de altura

composto por uma coluna mista de areia com granulometria grossa e fina de

0,60 m, uma cama de 0,01 m de material esponjoso e por último uma camada

de 0,09 m de brita n° 0. A finalidade deste procedimento é a remoção física de

ovos de helmintos remanescentes na água residuária, pois o sistema

convencional de tratamento de esgoto não remove estes ovos de parasitas

(WHO, 2006). O processo de filtragem da água residuária deve ocorrer por

gravidade (Figura 2). A cada 1500 L de água filtrada deve-se trocar todos os

componentes do filtro. A areia a ser utilizada no filtro deve ser lavada em água

corrente por 12 h e autoclavada.


6

Figura 2. Sistema de filtragem de água residuária por gravidade. Fonte: Gomes

(2016)

2.2.2 Ozonização

Após a água residuária passar pelo filtro de areia, a mesma deve ser

transferida via tubo até o reator de ozônio, visando a eliminação da carga

microbiana (Figura 3). O ozonizador apresentado na figura abaixo tem

capacidade de processar uma vazão média de 1 L min-1 de água residuária.

Após a ozonização a água será armazenada em caixa de água.

Figura 3. Esquema do ozonizador utilizado no processo de eliminação da

carga microbiana na água residuária (A e B). Fonte: Gomes (2016).

Resumo do tratamento secundário da água residuária, onde, o ozonizador

está ajustado com 100% de intensidade de liberação de ozônio (O3) e o filtro

Chave Geral

Fonte Mat.

40 kv

A B


7

com fluxo de 100% de água (Figura 4). Ao final dos tratamentos, a água

residuária a ser empregada na irrigação de plantas tem que atender os critérios

estabelecidos pela Portaria do Ministério da Saúde, N° 2.914 de 12 de

dezembro de 2011.

Figura 4. Resumo do sistema de tratamento secundário de água residuária.

Fonte: Gomes (2016).

2.3 Análise microbiológica da água residuária

2.3.1 Coliformes totais e coliformes termotolerantes

Para a determinação do número mais provável (NMP) de coliformes totais

(CTo) e termotolerantes (CTe) na água residuária, deve-se coletar duas

amostras, sendo uma com tratamento primário e outra com tratamento

secundário (após passar pelo filtragem e ozonização). O volume mínimo a ser

coletado deve ser 125 mL para cada amostra que, em seguida, será

acondicionada em gelo (Figura 5).

Reservatório

3000 L

Filtro de

Areia

Ozonizador

Reservatório

1000 L


8

Figura 5. Amostra de água residuária acondicionada em gelo (A) e (B) saco

plástico estéril 125 mL. Fonte: Gomes (2016).

Para analisar a água residuária deve-se utilizar 10 mL de cada amostra e

homogeneizar em 90 mL de água tamponada esterilizada e, a partir desta

diluição inicial a 10-1, organizar uma série de diluições decimais, empregando-

se o mesmo diluente. A diluição da amostra deve ser armazenada em volumes

de 1 mL, em cada fileira de três tubos por diluição, englobando 10 mL de caldo

lauril sulfato (Difco) com um tubo de Durham invertido. Após incubação a 35 ºC

por 24-48 horas, realizar a leitura dos tubos e os inóculos positivos

expressaram-se na presença de gás no tubo de Durham.

Em seguida, três fragmentos de cada tubo positivo deve-se repicar em

tubos de ensaio incluindo 10 mL de caldo lactose bile verde brilhante (CLBVB)

e Difco ara a confirmação da presença de CTo, mais três fragmentos eram

recriados em tubos de 5 mL de caldo EC (Difco) para a confirmação de CTe.

Todos os tubos de CLBVB e de EC apresentavam tubos de Durham invertidos.

O CLBVB incubado a 35 ºC por até 48 horas e o caldo EC, a 45 ºC/24 horas.

Após o período de incubação, realizar a leitura pela observação da presença

de gás no tubo de Durham invertido. Na Tabela 2, consta o NMP onde foram

calculados os CTo e CTe por mL de amostra analisada de acordo com (RACE,

2012).

A B


9

Tabela 21. Análise microbiológica de água residuária utilizado na irrigação de

plantas. A técnica utilizada para as contagens foi a dos Tubos Múltiplos, de

acordo com a Portaria do Ministério da Saúde, Nº 2.914 de 12/12/2011. Fonte:

Gomes (2016).

Coleta

A.R.C.T.P A.R.C.T.S

Coliformes

Totais

Coliformes

Termotolerantes

Coliformes

Totais

Coliformes

Termotolerantes

(NMP mL-1) (NMP mL-1) (NMP mL-1) (NMP mL-1)

1 1,1 x 105 1,5 x 104 460 21

2 1,1 x 105 1,5 x 104 93 21

3 2,4 x 105 9,5 x 104 150 93

Água residuária com tratada primário (ARCTP); água residuária com tratada secundário

(ARCTS); NMP: número mais provável.

2.3.2 Contagem de ovos de helmintos na água residuária

A verificação da presença de ovos de helmintos na água residuária deve

seguir a metodologia de AYRES et al. (1991) com algumas modificações

realizado por Gomes (2016). Deve-se realizar uma coleta composta para cada

tipo de água, sendo dividido em duas amostras, uma com tratamento primário

(antes de passar pelo filtro de areia e ozonizador) e outra com tratamento

secundário (após passar pela filtragem e ozonização). Deve-se coletar 1L de

água residuária para cada amostra e levadas ao Laboratório.

Para a análise parasitária, deve-se seguir a seguinte metodologia

modificada por Gomes (2016) para água residuária (Figura 6).

a) As amostras devem ser colocadas em cálice de 500 e 250 mL para

sedimentar por 2 horas;

b) Retirar aproximadamente 90% do sobrenadante usando um sifão,

garantindo um volume de aproximadamente 100 mL de água residuária tratada

e não tratado. Ter o cuidado para não ressuspender o sedimento;

c) Transferir cuidadosamente o sedimento para tubos Falcon de 15 mL e

ajustar o peso de todos os tubos;

d) Levar os tubos para a centrifugação a 1000 G por 15 minutos. Após a

primeira centrifugação, descartar o sobrenadante; transferir todos os

sedimentos para um único tubo e centrifugar novamente a 1000 G por mais 15

minutos;


10

e) Rejeitar todo o sobrenadante com um único movimento firme e rápido,

deixando no tubo apenas o sedimento. Acrescentar um volume de solução de

sulfato de zinco igual a 5 vezes o volume do sedimento. Em seguida

homogeneizou-se a amostra com equipamento tipo vortex;

f) Remover uma alíquota da amostra final com o auxílio de uma pipeta de

Pasteur e transferir para a câmara de McMaster. Deixar a câmara de contagem

em repouso por 5 minutos para permitir que os ovos flutuarem e atingirem a

superfície do retículo de contagem;

g) Observar no microscópio com lentes objetivas de 10x e 40x se haverá

a presença de ovos de helmintos e realizar a contagem.

Para a água residuária de Botucatu, não constatou a presença de ovos

de helmintos na água residuária tratada e não tratada em ensaios no qual

utilizou-se essa água na irrigação de planta em diferentes anos por Bressan

(2015) e Gomes (2016).

Figura 6. Análise da contagem de ovos de helmintos na água residuária com

tratada primário e com tratamento secundário (A) sedimentação em cálice de

500 e 250 mL, (B) Tubos Falcon após centrifugação, (C) transferência de

alíquota final para câmara de McMaster, (D) Observação no microscópio em

objetivas de 10x e 40x. Fonte: Gomes, 2016.

A B

C D


11

Referências

AYRES, R.; STOTT, R.; LEE, D. L.; MARA, D. D.; SILVA, S. A. Comparison of techniques for the enumeration of human parasitic helminth eggs in treated wastewater. Environmental Technology. 12, p. 617-623, 1991. BAÑÓN, S. et al. Effects of diluted and undiluted treated wastewater on the growth, physiological aspects and visual quality of potted lantana and polygala plants. Scientia Horticulturae, v. 129, n. 4, p. 869–876, jul. 2011. BRESSAN, F. D. Água de reuso e seu efeito sobre parâmetros fisiológicos em manjericão (Ocimum basilicum L.). Tese (Doutorado) - Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” Faculdade de Ciências Agronômicas, Botucatu, 129 p. 2015. CAMARA, H. Bioágua Familiar: Reuso de água cinza para produção de alimentos no Semiárido/ Fábio dos Santos Santiago... [et al.]. 2012. Recife, 2012. CORDEIRO, G. G. Qualidade de água para fins de irrigação (conceitos básicos e práticas). Petrolina, PE: Embrapa Semi Árido, 2001. 32 p. (Documentos; 167). GOMES, E. R. Aplicação de água residuária e deficiência hídrica em espécies de interesse agronômico. Botucatu, SP, 2016. 161p. Tese (Doutorado) – Faculdade de Ciências Agronômicas / Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”. HESPANHOL, I. A inexorabilidade do reúso potável direto. Revista DAE, v. 63, n. 198, p. 63–82, 2015. LEAL, R. M. R.; FIRME, L. P.; HERPIN, U.; FONSECA, A. F.; MONTES, C. R.; DIAS, C.T.S; MELF, A. J. Carbon and nitrogen cycling in a tropical Brazilian soil cropped with sugarcane and irrigated with wastewater. Agricultural Water Management, n° 97, p. 271–276, 2010. MANCUSO, P. C. S.; SANTOS, H. F. dos. A escassez e o reúso de água em âmbito mundial. In: Reúso de água. Mancuso, P. C. S.; Santos, H. F. dos; Philippi Jr., A. (coord.). Barueri: Manole, 2003. 18p. RICE, E.W.; BAIRD, R.B.; EATON, A.D.; CLESCERI, L.S. Standard Methods for the examination of water and wastewater. American Public Health organization, Washington, DC., 22th, 2012. TAIZ, L; ZEIGER, E. Fisiologia vegetal. 5.ed. Porto Alegre: Artmed, 2013. 918p. WHO - WORLD HEALTH ORGANIZATION (WHO). Guidelines for the safe use of wastewater, excreta and greywater: Wastewater use in agriculture, Geneva. v. 2, 2006.


12

CAPÍTULO 2

ETAPAS PARA DIMENSIONAMENTO DE

EXPERIMENTO COM DÉFICE HÍDRICO

Osvaldir Feliciano dos Santos1, Fernando Broetto2, Edilson Ramos

Gomes3, Ícaro Monteiro Galvão1, João de Jesus Guimarães1

1Pós-graduação em Agronomia (Irrigação e Drenagem) – Faculdade de Ciências Agronômicas,

Universidade Estadual Paulista. Rua José Barbosa de Barros, 1780, CEP 18610-307, Botucatu

– SP, Brasil, e-mail: [email protected]. 2Professor Associado – Departamento de

Química e Bioquímica, Universidade Estadual Paulista/Unesp, Campus de Botucatu – Instituto

de Biociências, Rua Profa. Dra. Irina Delanova Gemtchujnicov, s/n, CEP: 18618-693, Botucatu,

São Paulo, Brasil. 3

Engenheiro Agrônomo, Doutor em Agronomia (Irrigação e Drenagem) –

Faculdade de Ciências Agronômicas, Universidade Estadual Paulista. Rua José Barbosa de

Barros, 1780, CEP 18610-307, Botucatu – SP, Brasil.

1. Introdução

O défice hídrico é tido como um dos principais precursores da queda de

produtividade em diversas culturas agrícolas, o que ocorre devido ao fato deste

recurso alterar o metabolismo da planta, além de ocorrer em vastas extensões

de áreas cultiváveis (Nogueira et al., 2001). Dentre os processos fisiológicos

afetados pode-se destacar alterações na respiração, condutância estomática,

captura da radiação solar, fotossíntese e transporte de elétrons, ocasionando

redução de seu crescimento (Parry et al., 2002; Lawlor & Cornic, 2002).

Todavia, é valido ressaltar que este efeito sobre a planta é complexo, pois

a mesma pode responder de formas distintas através de processos

adaptativos, no intuito de mitigar este estresse, como por exemplo, a redução

do potencial hídrico foliar (Nogueira et al., 2005). Isto ocorre devido ao tempo

de exposição que a planta permanece submetida a estas condições, ao estágio

fenológico e a frequência de ocorrência (Chaves et al., 2009).

Neste sentido, o estudo da tolerância ou alternativas que visem reduzir

e/ou mitigar este tipo de estresse em culturas agrícolas são cruciais na adoção


13

de novas estratégias de irrigação, elevando assim, o potencial produtivo destas

culturas.

2. Etapas cronológicas de execução

2.1 Determinação de delineamento experimental

A primeira etapa a ser definida é a delimitação do delineamento

estatístico a ser adotado, pois, com base nisto será possível reorganizar e

definir os tratamentos de défice hídrico assim como os possíveis sub-

tratamentos, além de toda a parte cronológica das análises a serem definidas,

como: biométricas, fisiológicas, bioquímicas e nutricionais dentre outras. É

importante ressaltar a importância desta etapa visto que, será baseado nela

que as demais etapas deverão ocorrer.

2.2 Características químicas e físicas

Após definição prévia do delineamento a ser adotado, procede-se para a

coleta do solo, cuja quantidade de amostras a serem obtidas devem ser

definidas com base nos requisitos pré-estabelecidos no projeto. Salienta-se

que quanto maior a quantidade de amostras utilizadas para determinação dos

quesitos químicos, físicos e hídricos, maior a precisão e acurácia dos

resultados obtidos.

A análise do solo (Tabela 1) é imprescindível por ser a única metodologia

capaz de conhecer as características prévias que um determinado solo possui,

em suprir nutrientes bem como reter água para as plantas. Sendo este,

considerado simples, prático e econômico cuja eficiência é bastante elevada,

tornando-o precursor para recomendação de quantidades adequadas de

corretivos e fertilizantes (Cardoso et al., 2009).


14

Tabela 1. Análise química hipotética de um determinado solo.

pH M.O P(resina) Al3+

H+Al K Ca Mg SB CTC V B Cu

CaCl2 g dm-3

mg dm-3

-----------------mmolc dm-3

---------------- % --mg dm-3

-

5,2 13,5 1,1 14 60 0,5 1,0 1,0 2,5 58 4 0,59 1,1

Com base nos resultados provenientes da análise de solo deve-se corrigir

e aduba-lo seguindo as recomendações de manuais e/ou boletins pré-

estabelecidas, para que a cultura atinja seu potencial máximo produtivo na

região de implantação do estudo.

2.2 Análises hídricas

2.2.1 Curva de retenção de água do solo

A retenção de água no solo, expressa a relação entre o conteúdo de água

presente no solo em base de volume ou massa, além do potencial matricial do

mesmo, tornando esta caracterização importante ferramenta para a descrição

da mecânica do solo não saturado e de seu comportamento físico-hídrico

(Cichota & Jong van Lier, 2004) geralmente efetuadas utilizando a Câmara de

pressão de Richards. Cujas etapas para sua determinação são realizadas

seguindo a metodologia adaptada de Andrade júnior et al., (2007) descritas a

seguir.

2.2.2 Etapas para determinação da curva de retenção

2.2.2.1 Coleta de amostras

As amostras devem ser coletadas da área de estudo, utilizando anéis

cilíndricos cujo volume seja conhecido em uma profundidade pré-estabelecida,

no intuito de preservar as características do solo.

Obs: Caso o experimento seja executado em vasos, alocar o solo para estes

recipientes e realizar o “molhamento” dos mesmos periodicamente durante 7

dias, após este período retirar as amostras conforme relatado no passo

anterior.

2.2.2.2 Saturação das amostras

Alocar as amostras juntamente com a membrana porosa (Figura 1) dentro

de um recipiente contendo água destilada (metade da altura do cilindro), no


15

intuito de saturar o meio, o tempo de permanência é variável dependendo da

textura do solo. Depois de constatada a saturação das mesmas, efetuar a

pesagem no intuito de determinar o conteúdo de água no ponto de saturação.

Figura 1. Amostras de solo previamente preparadas. Fonte: Andrade júnior et

al., (2007).

2.2.2.3 Alocação das amostras na câmara de Richards

Após a saturação, as amostras devem ser encaminhadas para a câmara

de Richards (Figura 2) o qual posteriormente devem-se aplicar os pontos de

pressão dos quais comumente são utilizadas as: 6, 10 (capacidade de campo),

30, 100, 300 e 1.500 (ponto de murcha permanente) kPa. Ao atingir a pressão

requerida, retira-se a amostra da câmara e efetua-se a sua pesagem (após a

drenagem do excedente da umidade), sendo que em seguida a mesma deve

ser colocada na câmara com posterior ajuste do próximo ponto de tensão.

Figura 2. Amostras de solo alocadas dentro da câmara de pressão de

Richards. Fonte: Andrade Júnior et al. (2007).


16

Ao final da coleta de todos os pontos de pressão, as amostras devem ser

encaminhadas para uma estufa com circulação de ar forçado a 105 ºC por 48

horas, no intuito de determinar a densidade aparente além do peso seco da

amostra.

2.2.3 Ajuste da curva de retenção de água no solo

Para a determinação dos parâmetros de ajustes (θr, θs, α, m, n, ρ), utiliza-

se o software Soil Water Retention Curve versão 3.0 proposto por Dourado

Neto et al., (1995) os quais são gerados baseados nos pontos de pressão

obtidos na câmara de pressão de Richards. Em posse de tais dados utiliza-se o

modelo proposto por Van Genuchten (1980) equação (1), para ajuste da curva

de retenção (Figura 3).

𝜃 = 𝜃𝑟 𝜃𝑠− 𝜃𝑟

[1+ (𝛼 ⌊Ψ𝑚⌋)𝑛]𝑚 (1)

Em que:

θ (ѱm) - umidade volumétrica em função do potencial mátrico, cm3 cm3;

θr - umidade volumétrica residual do solo, em cm3 cm3;

θs - umidade volumétrica do solo saturado, em cm3 cm3;

n e m - parâmetros de regressão da equação, adimensionais;

α - parâmetros com dimensão igual ao inverso da tensão, em KPa-1; e

ѱm - potencial matricial de água no solo, em KPa.

Figura 3. Curva de retenção de água do solo hipotética.


17

2.3 Instalação dos tensiômetros de punção e monitoramento da tensão de

água do solo

Antes da instalação dos tensiômetros na área experimental, os mesmos

devem permanecer durante 24h submersos em água deionizada no intuito de

saturar as capsulas porosas. Após este período as mesmas devem ser

alocadas próximas a planta e preenchidas com água (Figura 4a), a

profundidade a ser adotada será relativa em função a cultura a ser implantada.

Com o auxílio de um tensímetro digital deve-se efetuar o monitoramento da

água no solo diariamente, de preferência no período da manhã (entre 8 e 10h)

cujos valores obtidos serão utilizados para determinação da lâmina de irrigação

(Figura 4b).

Figura 4. Alocação do tensiômetro de punção próximo a planta (a) e aferição

da tensão de água no solo com o auxílio de um tensímetro digital (b). Fontes:

Bressan (2015); Gomes (2016).

2.4 Manejo da irrigação (irrigação por gotejamento)

Neste tipo de manejo a irrigação é efetuada com base na capacidade de

água disponível no solo (CAD), onde os valores da capacidade de campo (CC

– geralmente 10 kPa), o ponto crítico para a cultura (PC – varia de acordo com

os tratamentos empregados) e a profundidade do sistema radicular (Z) são

estipulados mediante os tratamentos empregados, onde tais variáveis serão

empregadas conforme a equação 2 (Gomes, 2016).


18

CAD = (CC − PC) x Z (2)

Onde:

CAD - capacidade de água disponível (mm);

CC - teor de água volumétrico na capacidade de campo (cm3 cm-3);

PC - teor de água volumétrico atual (cm3 cm-3);

Z - profundidade efetiva do sistema radicular (mm).

Com base nos valores obtidos de CAD emprega-se os mesmos na

equação 3 no intuito de estimar a lâmina de irrigação (mm) o qual

posteriormente será utilizada para se determinar o tempo (em minutos) de

irrigação para cada tratamento conforme a Equação 4.

La = CAD

Ef (3)

Onde:

La - lâmina aplicada (mm);

CAD - capacidade de água disponível (mm);

Ef - eficiência de irrigação.

𝑇i = [La x A

n x q] x 60 (4)

Onde:

Ti - tempo de irrigação (minuto);

La - lâmina aplicada (mm);

A - área ocupada por planta (m²);

n - número de emissores por planta;

q - vazão do gotejador.


19

Referências

ANDRADE JÚNIOR, A. S.; BASTOS, E. A.; MASCHIO, R.; SILVA, E. M. Determinação da curva de retenção de água no solo em laboratório. Teresina: EMBRAPA, 2007, 6p. BRESSAN, D. F. Água de reuso e seu efeito sobre parâmetros fisiológicos em manjericão (Ocimum basilicum L.). Botucatu, SP, 2015. 149p. Tese (Doutorado) – Faculdade de Ciências Agronômicas / Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”. CARDOSO, E. L.; FERNANDES, A. H. B. M.; FERNANDES, F. A. Análise de Solos: Finalidade e Procedimentos de Amostragem. Corumbá: EMBRAPA, 2009. (Comunicado técnico n. 79). CHAVES, M. M.; FLEXAS, J.; PINHEIRO, C. Photosynthesis under drought and salt stress: regulation mechanisms from whole plant to cell. Annals of botany, v. 103, p 551-560, 2009. CICHOTA, R. & JONG van LIER, Q. Análise da variabilidade espacial de pontos amostrais da curva de retenção de água no solo. Revista brasileira de ciência do solo, 28:585-596, 2004. DOURADO NETO, D.; NIELSEN, D. R.; HOPMANS, J. W.; REICHARDT, K.; BACCHI, O. O. S. Programa SWRC (Version 3.0): Soil-Water Retention Curve (Software). Piracicaba: ESALQ; Davis: University of Califórnia, 1995. GOMES, E. R. Aplicação de água residuária e deficiência hídrica em espécies de interesse agronômico. Botucatu, SP, 2016. 161p. Tese (Doutorado) – Faculdade de Ciências Agronômicas/Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”. LAWLOR, D. W.; CORNIC, G. Photosynthetic carbono assimilation and associated metabolism in relation to water deficits in higher plants. Plant Cell Environmental, v. 25, p. 275-294, 2002. NOGUEIRA, R. J. M. C.; ALBUQUERQUE, M. B.; SILVA, E. C. Aspectos ecofisiológicos da tolerância à seca em plantas da caatinga. In: NOGUEIRA, R. J. M. C.; ARAÚJO, E. L.; WILLADINO, L. G.; CAVALCANTE, U. M. T.; (Ed.). Estresses ambientais: danos e benefícios em plantas. Recife: UFRPE, Imprensa Universitária, 2005. p.22-31. NOGUEIRA, R. J. M. C.; MORAES, J. A. P. V.; BURITY, H. A.; BEZERRA NETO, E. Alterações na resistência à difusão de vapor das folhas e relações hídricas em aceroleiras submetidas a déficit de água. Revista Brasileira de Fisiologia Vegetal, Campinas, v. 13, p. 75-87, 2001. PARRY, M. A. J.; ANDROLOJC, P. J.; KHAN, S.; LEA, P. J.; KEYS, A. J. Rubisco activity: effects of drought stress. Annals of botany, v. 89, p. 833-838, 2002.


20

VAN GENUCHTEN, M. T. A Closed-form Equation for Predicting the Hydraulic Conductivity of Unsaturated Soils1. Soil Science Society of America Journal, v. 44, n. 5, p. 892, 1980.


21

CAPÍTULO 3

REUSO DE ÁGUA NA AGRICULTURA: ASPECTOS

AMBIENTAIS E AGRONÔMICOS

João de Jesus Guimarães1, Fernando Broetto2, Edilson Ramos

Gomes3, Osvaldir Feliciano dos Santos1, Ícaro Monteiro Galvão1,

Dayanne Fabricio Bressan4






São Paulo, Brasil. 3

Engenheiro Agrônomo, Doutor em Agronomia (Irrigação e Drenagem) –


Barros, 1780, CEP 18610-307, Botucatu – SP, Brasil. 4

Doutora em Agronomia (Irrigação e

Drenagem) – Faculdade de Ciências Agronômicas, Universidade Estadual Paulista. Rua José

Barbosa de Barros, 1780, CEP 18610-307, Botucatu – SP, Brasil.

1. Introdução

A agricultura é uma das principais atividades desenvolvidas no mundo,

bem como, responsável por atender a grande demanda de alimentos. A água é

um insumo primordial para a obtenção dos alimentos. Estudos apontam que a

agricultura utiliza cerca de 70 a 80% da água do planeta (KHURANA & SINGH,

2012; WHO, 2013).

De acordo com a FAO (2013) em 2050 a agricultura sofrerá drasticamente

com a crise dos recursos hídricos, onde ocorrerá a diminuição de

aproximadamente 40% da água utilizada para os fins agrícolas. Mas, nos dias

atuais a escassez dos recursos hídricos já afeta vários locais do mundo.

A escassez dos recursos hídricos e as projeções para o futuro tem levado

os agricultores, e principalmente os irrigantes a reavaliar as práticas de manejo

da água (URBANO, 2013). Além disso, tem despertado a atenção de



22

pesquisadores, com intuito de desenvolver técnicas para o tratamento de

efluentes e seu devido reuso na agricultura (GUIMARÃES et al., 2018).

O reuso de água na agricultura surge com uma alternativa para a

diminuição dos impactos causados ao meio ambiente, ocasionados pelo

lançamento inadequado e sem conscientização de efluentes, ou seja, águas

residuárias nos cursos d´água que contaminam os mananciais superficiais e os

subterrâneos (SANTOS et al., 2010; SOUZA & DUARTE, 2014; MENDES,

2014), além disso, disponibiliza água e fertilizantes para as culturas, promove a

ciclagem de nutrientes e aumento na produção agrícola (MATOS, 2016).

Segundo Cabral et al. (2011) & Filho (2013) as águas residuárias contém

em sua composição macro e micronutrientes que podem ser utilizados como

biofertilizante, se usado adequadamente (MAGGI et al., 2013) e assim

economizar, ou até mesmo substituir a aplicação de fertilizantes químicos nas

lavouras.

Todavia, o reuso de água sem critérios pode causar problemas de

contaminação do solo e da água, degradação das caracteristicas fisicas do

solo, diminuição da capacidade de absorção de água pelas plantas, promover

toxicidade e estresse salino às plantas (ERTHAL et al., 2010; VARALLO et al.,

2010). Com isso, Matos (2016) cita a importancia de se conhecer o nutriente

com maior concentração relativa na água residuária e, também, a necessidade

nutricional da cultura para que os níveis exigidos não sejam suplantados.

2. Potencial agrícola das águas residuárias

As águas residuárias apresentam um grande potencial agrícola.

Diversos autores na literatura citam a presença de macro e micronutrientes nas

águas residuárias, sendo eles: nitrogênio, fosforo, potássio, cálcio, magnésio,

ferro, zinco e cobre (CABRAL et al., 2011; MAGGI et al., 2013; MA et al., 2016).

Em decorrência da presença de macro e micronutrientes, as águas

residuárias podem ser utilizadas como biofertilizantes agrícolas (DOBLINSKI et

al., 2010), reduzindo o uso de fertilizantes químicos URBANO (2013),

proporcionar incrementos na produtividade em solos com baixa fertilidade

(DEON et al., 2010; VARALLO et al., 2010), ganhos econômicos, além de

promover a sustentabilidade do setor agrícola (SINGH et al., 2012).


23

Diversos trabalhos na literatura confirmam o potencial agrícola das águas

residuárias quando utilizadas na agricultura. Taxas de aplicações de água

residuária da bovinocultura aumentou a CTC e a saturação de bases nas

camadas superficiais de um argissolo (ERTHAL et al. 2010). Fertirrigação com

água residuária da piscicultura apresentou resultados positivos para as

variáveis: largura de folha e altura de plantas de tomate (NASCIMENTO et al.,

2016), com água residuária proveniente do esgoto doméstico na cultura da

cana-de-açúcar promoveu maiores crescimento de colmo (FREITAS et al.,

2012), ganhos na produtividade e redução de adubação mineral com nitrogênio

(DEON et al., 2010), além disso, Silva et al. (2010) verificou o efeito de

correção da acidez do solo.

Além disso, o uso de fertirrigação com água residuária da suinocultura

promoveu aumento da área foliar e crescimento do tomateiro (SOUZA et al.,

2010), melhor desenvolvimento de mudas de eucalipto (BATISTA et al., 2014)

e Corymbia citriodora (COELHO et al., 2017), melhorias nos atributos físicos,

físicoquímicos, químicos e biológicos do solo (BRUNETTO et al., 2012).

3. Tratamento dos efluentes

Dada a importância e aos benefícios que as águas residuárias podem

proporcionar ao meio ambiente e a agricultura, é importante que se realize o

tratamento dos efluentes antes de qualquer reutilização e/ou disposição.

Salienta-se o fato de que o tipo de tratamento dependerá das condições físicas

e químicas do efluente, estruturais, financeiras, mão de obra e conhecimento.

Segundo Nuvolari & Costa (2010) e Souza & Duarte (2014) os sistemas

de tratamento são divididos em: preliminar, primário; secundário e terciário. De

acordo com os mesmos autores os tratamentos constituem-se e objetivam-se

da seguinte forma:

Tratamento preliminar: corresponde a etapa inicial do tratamento. Para

esse tratamento são utilizadas grades, telas, peneiras, caixa de areia (a

granulometria da areia dependerá da quantidade de sólidos presentes no

efluente) e caixa de remoção de óleos e graxas. Objetiva-se com esse

tratamento remover partes solidas, como galhos, restos de materiais, detritos

minerais, além de materiais insolúveis, como óleos e graxas. Ressalta-se ainda


24

que este tratamento não apresenta eficiência na remoção de DBO – Demanda

Bioquímica de Oxigênio, mas proteger sistema de irrigação contra

entupimentos.

Tratamento primário: corresponde a etapa intermediária, onde se utiliza

tanques de sedimentação, clarificadores, reatores anaeróbios ou filtros

aeróbios. Objetiva-se com este tratamento a remoção de materiais não

grosseiros que se encontra em suspensão, solutos flutuantes e redução de

carga orgânica. Salienta-se que, a eficiência de remoção é 60 a 70 % para

sólidos que se encontram suspensos, 30 a 40 % de DBO e 30 a 40 % de

coliformes.

Tratamento secundário: corresponde a remoção de matéria orgânica

biodegradável presente nos sólidos em suspensão. Utiliza-se neste tratamento

lagoas de estabilização, facultativas, anaeróbias, biodigestores, reatores

anaeróbios e wetlands. Objetiva-se com este tratamento a remoção de material

orgânico (DBO em suspensão) através de ações bioquímicas promovidas por

bactérias, vírus e protozoários, que se alimentam do material orgânico, como

também nutrientes como o nitrogênio e o potássio. A eficiência da remoção de

DBO e coliformes é de 60 a 99 % e nutrientes é de 10 a 50 %.

Tratamento terciário: representa o tratamento de efluentes mais

avançado, como também o mais caro. Neste tratamento utiliza-se radiação

ultravioleta, ozonização, osmose reversa etc. Objetiva-se a remoção e/ou

redução de nutrientes como: nitrogênio e potássio, remoção de metais

pesados, substâncias com alto nível de toxidade e agentes patogênicos.

4. Aplicação das águas residuárias em culturas agrícolas

A fertirrigação surge nesse cenário como uma alternativa eficiente para a

aplicação de água residuária nas culturas agrícolas. A fertirrigação traduz na

técnica de aplicação de fertilizantes, fungicidas, herbicidas via sistema de

irrigação localizada, aspersão ou superfície.

O aproveitamento desta técnica contribui para a redução de custos de

produção com fertilizantes químicos, promove uma maior eficiência de

aplicação, pois disponibiliza nutrientes no volume de solo explorado pelo


25

sistema radicular da cultura, reduz a mão de obra e o mais importante,

economia de água (SOUZA et al. 2010; PINTO & BRITO, 2010).

Matos (2014) destaca o uso da fertirrigação, mas salienta a importância

de se controlar e definir a taxa de aplicação em níveis adequados para as

culturas, visto que a fertirrigação trata-se da aplicação de nutrientes junto a

água de irrigação. Deste modo, Matos (2016) afirma que a taxa de aplicação de

águas residuárias via fertirrigação deve ser baseada no nutriente com maior

presença na água residuária e nas exigências nutricionais das culturas.

A literatura confirma o uso da fertirrigação como técnica para aplicação de

águas residuarias, como: bovinocultura (ERTHAL et al., 2010), suinocultura

(BOLZANI et al., 2012; BRUNETTO et al., 2012; BATISTA et al., 2014;

COELHO et al., 2017), piscicultura (NASCIMENTO et al., 2016), lavagem e

despolpa de café Conilon (FARIA et al., 2015) e agroindústria (GONÇALVES,

2016), das quais apresentou resultados favoráveis quanto a técnica e a

resposta das culturas.

5. Considerações finais

Na agricultura, a água se destaca por ser um importante insumo agrícola,

o qual é responsável por promover o crescimento e desenvolvimento das

culturas. Entretanto, nos últimos anos a má gestão deste recurso, manejo sem

critério e a falta de conscientização dos usuários tem contribuído para a sua

escassez, tornando um fator limitante para o desenvolvimento deste setor.

O reuso de água surge como uma alternativa interessante no cenário

mundial, visto que, ameniza os danos causados pela disposição inadequada de

águas residuárias no solo e nas águas, e também, disponibiliza água e

fertilizantes para as culturas agrícolas promovendo incrementos de

produtividade.


26

Referências

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29

CAPÍTULO 4

ASPECTOS QUALITATIVOS DA ÁGUA PARA

IRRIGAÇÃO

Ícaro Monteiro Galvão1, Fernando Broetto2, Edilson Ramos Gomes3,

Osvaldir Feliciano dos Santos1, João de Jesus Guimarães1






São Paulo, Brasil. 3Engenheiro Agrônomo, Doutor em Agronomia (Irrigação e Drenagem) –



1. Introdução

A agricultura lidera o ranking de consumo hídrico com aproximadamente

67,1% da água doce no Brasil (ANA, 2017), sendo a irrigação o principal meio

de uso. Apesar de elevado consumo, a maior parte da água captada para

irrigação volta ao ciclo hidrológico através do processo de evapotranspiração

pelas culturas e infiltração no solo, alimentando o lençol freático.

O uso da água na agricultura provém de diferentes fontes, sendo de

origem superficial, subterrânea ou águas de reuso. Essas apresentam

características diversas, dependendo da origem e do grau de contaminação

antes do uso, conferindo diferentes níveis de qualidade e capacidade de uso.

Qualidade da água é um termo difícil de conceituar, pois leva em

consideração diversos fatores. Ayres e Westcot (1999) comentam que se refere

às características de um suprimento de água e sua relação com um uso

específico, ou seja, uma água para ser caracterizada como de boa qualidade



30

deverá ser analisada física, química e biologicamente e levada em

consideração sua finalidade de uso.

Quanto as características que determinam a sua qualidade para uso em

irrigação, de maneira geral segundo Bernardo et al. (2013) deve-se levar em

consideração alguns parâmetros básicos como: concentração totais de sais

solúveis ou salinidade; proporção relativa de sódio; concentração de íons

tóxicos; concentração de bicarbonatos; aspecto sanitário e capacidade de

contaminação; potencial de corrosão dos equipamentos e entupimento de

emissores em sistemas de irrigação.

A análise da água de irrigação e sua avaliação periódica quanto a

qualidade é de extrema importância para garantir a sustentabilidade da

produção e deve ser adotado por parte dos produtores e técnicos

responsáveis, uma vez que a utilização de fontes inadequadas pode acarretar

grandes prejuízos, como redução da produção devido ao estresse às plantas e

inviabilização do solo para cultivo, ocasionada principalmente pela salinização.

2. Principais critérios para estabelecer a qualidade da água para irrigação

Os principais critérios para inferir sobre a qualidade da água para

irrigação estão baseados naqueles que afetam principalmente o rendimento e a

qualidade dos produtos colhidos e relacionados com a conservação do solo.

2.1 Salinidade

O processo de degradação dos solos está presente em muitas regiões

agricultáveis em todo mundo e a salinização constitui um dos grandes

problemas enfrentados pela agricultura (FAO, 2015). A salinização dos solos

pode ocorrer naturalmente durante o processo de formação dos solos, ou de

forma antrópica através principalmente do uso de água de elevado teor salino

na irrigação (PEDROTTI, et al., 2015).

No Brasil ocorre predomínio desses solos em regiões de clima árido e

semiárido como no Nordeste do país. A precipitação pluviométrica reduzida

nessas regiões e alta de demanda evapotranspirométrica local, são fatores

determinantes que associados a baixa drenagem, levam à formação de solos

com alta concentração de sais (HOLANDA et al., 2007).


31

A salinidade além de se caracterizar como um grande problema

ambiental, ocasiona perdas consideráveis para a pois altas concentrações de

sais na zona das raízes podem reduzir o potencial hídrico do solo, causando

estresse osmótico (ABREU et al., 2013) que induzirá um estresse através da

superprodução de espécies reativas de oxigênio, afetando o crescimento e

desenvolvimento das plantas (ALVES et al., 2018). Além disso o aumento do

potencial osmótico do solo dificulta a absorção de água pelas plantas (ABREU

et al., 2013, GONÇALVES, et al., 2011) resultando em um estresse hídrico por

um período de tempo significativo. As intensidades dos efeitos negativos

dependem da cultura, da variedade e do seu estágio fenológico.

Existem alguns parâmetros utilizados para determinar a salinidade da

água e seu potencial de salinização dos solos, que são as medidas de

condutividade elétrica (CE) e a quantidade de Sais Dissolvidos Totais (SDT). A

condutividade elétrica devido a sua facilidade de medição por meio de

aparelhos amplamente disponíveis no mercado é mais utilizada e considera

basicamente a quantidade total de sais presentes sem especifica-los. No

sistema internacional (SI) a unidade adotada é deciSiemens por metro (dS m-1).

A medida de SDT é feita através da soma da concentração de todos os íons

analisados em uma amostra de água e expressos em mg L-1 ou g L-1...

Existem algumas classificações para água de irrigação quanto ao risco de

salinização dos solos. A seguir é apresentada a classificação proposta pelo

Laboratório de Salinidade dos Estado Unidos baseada em valores da CE

(BERNADO et al., 2013):

C1 – salinidade baixa - (CE 0 – 0,25 dS m-1 a 25°C)

C2 – salinidade média - (CE 0,25 – 0,75 dS m-1 a 25°C)

C3 – salinidade alta - (CE 0,75 – 2,25 dS m-1 a 25°C)

C4 – salinidade muito alta- (CE 2,25 – 5,00 dS m-1 a 25°C)

2.2 Sodicidade

A sodicidade é dada pelo conteúdo de sódio na água e sua relação com

os demais íons presentes. Seu uso como um importante parâmetro de

qualidade é principalmente devido ao seu efeito sobre a capacidade de

infiltração dos solos e toxidade às plantas (ALMEIDA, 2010). As principais


32

medidas relacionadas com a sodicidade dos solos são a Porcentagem de

Sódio (Na+) na água e Razão de Adsorção de Sódio (RAS).

A RAS é o parâmetro atualmente recomendado para classificação da

água de irrigação quanto à sodicidade. Este índice leva em consideração a

proporção relativa entre os íons sódio (Na+) e os cátions bivalentes cálcio

(Ca2+) e magnésio (Mg2+) e é expresso pela equação a seguir:

RAS =Na+

√Ca2+ + Mg2+

2

Solos com elevada RAS terá sua capacidade de infiltração reduzida, por

efeito da dispersão das partículas coloidais, obstruindo os poros do solo (PAES

et al., 2013), principalmente nos primeiros centímetros podendo provocar um

efeito de déficit hídrico às culturas (SILVA, et al., 2011b) e em estado crítico,

inundação do terreno aumentando a susceptibilidade a erosão e limitando a

capacidade de uso do terreno (MIRANDA et al., 2008).

Assim como para a CE o Laboratório de Salinidade dos Estados Unidos

propôs uma classificação da água de irrigação baseado na nos valores da RAS

(ALMEIDA, 2010):

S1 – baixa concentração; RAS ≤ 18,87 - 4,4 log CE

S2 – média concentração: 18,87 - 4,4 log CE < RAS ≤ 31,31- 6,6 log CE

S3 – alta concentração; 31,31 - 6,6 log CE < RAS ≤ 43,75 - 8,87 log CE

S4 – muito alta; RAS > 43,75 - 8,87 log CE

2.3 Concentração de íons específicos

Diversos são os íons presentes na água e o conhecimento da

concentração de cada um deles é extrema importância, uma vez que em altas

concentrações passarão a se tornar tóxicos as plantas, imprimindo uma

condição de estresse com consequências negativas ao crescimento e

desenvolvimento das culturas. A magnitude do problema depende

principalmente da concentração e da sensibilidade da cultura ao elemento

(BERNARNDO et al., 2013).

Os íons sódio, cloro e boro são os principais causadores de toxidez entre

os elementos comumente encontrados nas águas de irrigação (SILVA, et al.,


33

2011b). Esses íons acumulam-se nas folhas, onde causam problemas de

clorose e queima dos tecidos, levando a distúrbios fisiológicas que podem

evoluir reduzindo a produção ou até a morte das plantas. Outros íons de

importância secundária devem também ser avaliados principalmente quanto a

sua capacidade de causar danos ao sistema de irrigação, como os íons

bicarbonatos, ferro, manganês e enxofre (SILVA et al., 2011a; ALMEIDA,

2010).

2.4 Interpretação da qualidade de água para irrigação

Na Tabela 1 estão apresentados os parâmetros para interpretação da

qualidade de água para irrigação levando em consideração os potenciais

problemas que podem causar e os graus gerais de restrição de uso para a

maioria das condições.

Tabela 1: Diretrizes gerais para interpretação da qualidade de água para

irrigação. Fonte: Adaptado de Ayres e Westcot (1999)

Problema Potencial Unidade

Graus de Restrição de Uso

Nenhum Moderado Severo

Salinidade

CE dS m-1 < 0.7 0.7 – 3.0 > 3.0

SDT mg L-1 < 450 450 – 2000 > 2000

Infiltração (avaliar utilizando RAS e CE)

RAS = 0 – 3 CE = dS m-1 > 0.7 0.7 – 0.2 < 0.2

= 3 – 6

= dS m-1 > 1.2 1.2 – 0.3 < 0.3

= 6 – 12

= dS m-1 > 1.9 1.9 – 0.5 < 0.5

= 12 – 20

= dS m-1 > 2.9 2.9 – 1.3 < 1.3

= 20 – 40

= dS m-1 > 5.0 5.0 – 2.9 < 2.9

Toxidade de íons específicos

Sódio

Irrigação por superfície RAS < 3 3 – 9 > 9 Irrigação por aspersão mmolc/L < 3 > 3

Cloro

Irrigação por superfície mmolc/L < 4 4 – 10 > 10

Irrigação por aspersão mmolc/L < 3 > 3

Boro

mg L-1 < 0.7 0.7 – 3.0 > 3.0

pH Amplitude normal 6.5 - 8.4


34

Referências

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ALVES, R. C., MEDEIROS, A. S., NICOLAU, M. C. M., PIZOLATO NETO, A., OLIVEIRA, F. A., LIMA, L. W., TEZOTTO, T., GRATÃO, P. L. The partial root-zone saline irrigation system and antioxidant responses in tomato plantas. Plant Physiology and Biochemistry. v. 127, p. 366-379. 2018.

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PAES, J. L. A., RUIZ, H. A., FERNANDES, R. B. A., FREIRE, M. B. G., BARROS, M. F. C., ROCHA, G. C. Dispersão de argilas em solos afetados por sais. Revista Brasileira de Engenharia Agrícola e Ambiental, v.17, n.10, p.1135–1142, 2013.

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35

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36

CAPÍTULO 5

CONTEXTUALIZAÇÃO ECONÔMICO-FINANCEIRA

SOBRE O USO DO LODO DE ESGOTO NA

AGRICULTURA

Tamiris Cristina Oliveira de Andrade1, Fernando Broetto2,

Alessandro Reinaldo Zabotto1, Irineu Eduardo Kühn1, Dariane

Priscila Franco de Oliveira1, Anny Mery Marcon Ruiz3, Mara Lúcia

Cruz De Souza1

1Pós-graduação em Agronomia (Irrigação e Drenagem e Energia na Agricultura) – Faculdade

de Ciências Agronômicas, Universidade Estadual Paulista. Rua José Barbosa de Barros, 1780,

CEP 18610-307, Botucatu – SP, Brasil, e-mail: [email protected]. 2Professor Associado –

Departamento de Química e Bioquímica, Universidade Estadual Paulista/Unesp, Campus de

Botucatu – Instituto de Biociências, Rua Profa. Dr

a. Irina Delanova Gemtchujnicov, s/n, CEP:

18618-693, Botucatu, São Paulo, Brasil. 3

Engenheira Florestal, Mestranda em Ciência Florestal

- Faculdade de Ciências Agronômicas, Universidade Estadual Paulista. Rua José Barbosa de


1. Introdução

O aumento da população junto ao desenvolvimento urbano e econômico

são fatores que evidenciam o crescimento da geração do lodo de esgoto

(CASTRO, 2015). A disposição adequada desses resíduos se tornou um

desafio para as empresas de saneamento (BITTENCOURT, 2018).

No Brasil o destino mais comum para o lodo de esgoto é o aterro

sanitário, visto que outras opções para destinação ainda são pouco utilizadas.

Em outros países o reuso agrícola é o método mais aplicado para o

aproveitamento desse resíduo (DE GODOY, 2013).

O crescimento gradativo dos custos operacionais das implantações dos

aterros e o desprovimento da disponibilidade de áreas para esta implantação

causou a promoção de diferentes estudos de análises técnicas e econômicas


37

das alternativas não prejudiciais à saúde pública e também ao meio ambiente

(SAMPAIO, 2013).

Segundo o estudo Cenário da Disposição do Lodo de Esgoto: uma

revisão das publicações ocorridas no Brasil de 2004 a 2014, dentro do período

de 11 anos, é predominante na literatura os estudos voltados ao uso agrícola

para afins de produção vegetal e restauração de áreas degradadas como uma

alternativa para melhor alocação do lodo de esgoto, sendo estes representados

por 91,7% (CASTRO, 2015).

O interesse voltado ao uso do lodo de esgoto no meio agrícola, tem se

destacado por ser uma alternativa que evita a sua disposição sobre opções de

alto custo e de grande impacto para meio ambiente e para a sociedade.

2. O potencial do lodo de esgoto para economia

As frequentes práticas de disposição de lodo de esgoto como a alocação

em aterros sanitários e despejo a céu aberto, são opções de custo elevado e

ainda potencialmente impactantes ao meio ambiente, uma vez que fomentam

os problemas de saúde pública (NETO; JÚNIOR; MURAOKA, 2007).

A utilização do lodo de esgoto como fertilizante, vem sendo apontada

como alternativa benéfica, quando comparada a essas opções já existentes

(QUINTANA, 2011).

Dentro da orçamentação operacional de um sistema de tratamento, o

destino correto para o lodo de esgoto pode chegar a custar até 50% de todo o

processo (BETTIOL e CAMARGO, 2000).

A destinação do lodo de esgoto para fins agrícolas é favorável aos

agricultores, ao passo que diminui custos de produção e ainda melhora ou

mantém a produtividade de uma lavoura (TRANNIN et al., 2005), vindo a ser

um complemento que reduz o uso de fertilizantes químicos e consecutivamente

reduz os custos com a adubação (QUINTANA, 2011).

O lodo de esgoto processado, do qual se faz uso como fertilizante e

condicionador de solo pelo fato de possuir nutrientes e matéria orgânica, é

denominado biossólido (LIRA et al., 2008). Quando tratado adquire aspectos


38

que são permitidos para a utilização agrícola de forma ambientalmente segura

(OLIVEIRA, 2017).

O uso como fertilizante na substituição da adubação química, evita perdas

econômicas e energéticas específicas do exercício de fertilização de solo. Com

a disposição em aterros sanitários de alto custo de manutenção, se desperdiça

a energia que conseguiria ser aplicada adequadamente de outras formas

(QUINTANA, 2011).

O estudo de Análise da Viabilidade Econômico-Financeira da Utilização

Agrícola de Biossólido em Unidade de Gerenciamento de Lodo demonstra que

existe viabilidade econômica tanto para investimentos no empreendimento

privado, quanto para autarquia municipal. Observa-se no estudo que o

gerenciamento privado pode apresentar atratividade ao investimento, contudo,

a autarquia municipal denota maiores retornos do capital investido. Tal

observação é justificada pelo fato de que o gerenciamento privado requer de

mais recursos, quando comparado à autarquia, que apenas tem a necessidade

de complementar o sistema de um serviço de saneamento pré-existente

(CARVALHO, 2017).

De acordo o estudo Análise Econômica da Produção de Lodo de Esgoto

Compostado Para o Uso na Agricultura, realizado na cidade de Botucatu-SP, o

processamento do lodo representa meramente cerca de 27% do custo de

alocação em aterro sanitário. A Estação de Tratamento de Esgoto (ETE) da

SABESP de Botucatu produz 16 toneladas de lodo por dia, gerando um custo

diário de aproximadamente R$4.073,44 em transporte e disposição em aterros

(MARTINS, 2016).

As dificuldades encontradas na literatura para utilização dos biossólidos

estão diretamente ligadas ao teor de umidade e os custos com movimentação

e transporte (DE GODOY, 2013; SAMPAIO, 2013).

O custo com transporte é um dos critérios significativos para a viabilidade

econômica da aplicação do lodo de esgoto para fins agrícola, pois quanto maior

o volume transposto por caminhão, menor o custo unitário da viagem (VON

SPERLING, 2001).

Um dos fatores decisivos no custo de operação é a distância entre

estação de tratamento de esgoto e o campo no qual o lodo será empregado,


39

além do teor de sólidos que definirá o transporte mais apropriado (DE GODOY,

2013).

Não é adequado dizer que haja uma distância limite que inviabilize

economicamente o transporte, uma vez que essa distância está sujeita a

particulares condições como: existência e tipo de estrada de acesso,

quantidade e preço de pedágios no percurso, dentre outros (SAMPAIO, 2013).

No campo, o emprego do lodo de esgoto tem se mostrado como a melhor

alternativa de viabilidade técnica-financeira para a silvicultura. Contudo, é

necessário o aprimoramento dos estudos voltados para o processamento deste

resíduo nas estações de tratamento, determinação das formas de aplicação,

lixiviação dos nutrientes, dentre outras (NETO; JÚNIOR; MURAOKA, 2007).


40

Referências

BETTIOL, W.; CAMARGO, O. A. Lodo de esgoto: impactos ambientais na agricultura. Jaguariúna: Embrapa Meio Ambiente, 2006. 349 p.

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CARVALHO, L. C. do C. S. et al. Análise da viabilidade econômico-financeira da utilização agrícola de biossólido em unidade de gerenciamento de lodo. In: CONGRESSO ABES FENASAN 2017, 1, 2017, São Paulo. Anais... São PAULO, SP.

CASTRO, A. L. F. G.; SILVA, O. R.; SCALIZE, P. S. Cenário da disposição do lodo de esgoto: uma revisão das publicações ocorridas no Brasil de 2004 a 2014. Multi-Science Journal, v. 1, n. 2, p. 66-73, 2015.

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LEMAINSKI, J.; SILVA, J. E. da. Avaliação agronômica e econômica da aplicação de biossólido na produção de soja. Pesquisa Agropecuária Brasileira, Brasília, v. 41. n. 10, p. 1477-1484, 2006.

LIRA, A. C.; GUEDES, M. C.; SCHALCH, V. Reciclagem de lodo de esgoto em plantação de eucalipto: carbono e nitrogênio. Engenharia Sanitária e Ambiental, v.13, n. 2, p. 207-216, 2008.

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NETO, S. P.; JÚNIOR, C. H.; MURAOKA, T. Uso de Biossólido em Plantios Florestais. 1. ed. Planaltina DF: Embrapa Cerrado, 2007. 26 p.

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QUINTANA, N. R. G.; DO CARMO, M.S.; DE MELO, W. J. Lodo de esgoto como fertilizante: produtividade agrícola e rentabilidade econômica. Nucleus, v. 8, n. 1, 183-191. 2011.

SAMPAIO, A. O. Afinal, queremos ou não viabilizar o uso agrícola do lodo produzido em estações de esgoto sanitário? Uma avaliação crítica da Resolução CONAMA 375. Revista DAE, n. 193, p. 16-27. 2013.

TRANNIN I. C. B. Avaliação agronômica de um biossólido industrial e de seus efeitos sobre atributos do solo. 2004. 171p. Tese (Doutorado em Agronomia/ Solos e Nutrição de Plantas) - Universidade Federal de Lavras, Lavras, 2004.


41

VON SPERLING, M. Lodo de esgotos: tratamento e disposição final. Belo Horizonte: Departamento de Engenharia Sanitária e Ambiental – UFMG; Companhia de Saneamento do Paraná, 2001. 484 p.


42

CAPÍTULO 6

LODO DE ESGOTO: CARACTERISTICAS

NUTRICIONAIS E EFEITOS DA UTILIZAÇÃO NO SOLO

Alessandro Reinaldo Zabotto1; Irineu Eduardo Kühn1, Fernando

Broetto2, Dariane Priscila Franco de Oliveira1, Anny Mery Marcon

Ruiz3, Tamiris Cristina Oliveira de Andrade1, Enrique Alonso Zuñiga4



CEP 18610-307, Botucatu – SP, Brasil, e-mail: [email protected], [email protected]. 2Professor Associado – Departamento de Química e Bioquímica, Universidade Estadual

Paulista/Unesp, Campus de Botucatu – Instituto de Biociências, Rua Profa. Dr

a. Irina Delanova

Gemtchujnicov, s/n, CEP: 18618-693, Botucatu, São Paulo, Brasil. 3

Engenheira Florestal,

Mestranda em Ciência Florestal - Faculdade de Ciências Agronômicas, Universidade Estadual

Paulista. Rua José Barbosa de Barros, 1780, CEP 18610-307, Botucatu – SP, Brasil. 4Doutor

em Agronomia (Irrigação e Drenagem) – Faculdade de Ciências Agronômicas, Universidade

Estadual Paulista. Rua José Barbosa de Barros, 1780, CEP 18610-307, Botucatu – SP, Brasil.

1. Introdução

O destino final do lodo de esgoto é uma preocupação em quase todas as

cidades brasileiras. Por se tratar de um resíduo poluente, se faz necessário o

seu descarte de maneira correta e apropriada, evitando a contaminação do

meio ambiente. Na maioria das cidades, o lodo de esgoto é descartado em

aterros sanitários, o que diminui a capacidade dos aterros e eleva os custos

operacionais das estações de tratamento. O lodo de esgoto necessita de

tratamento que, depois de higienizado, pode ser utilizado como adubo ou

condicionador de solo na agricultura, na recuperação de áreas degradadas e

na silvicultura, sendo estas as formas apropriadas de utilização deste resíduo,

principalmente pelo fato de ser um excelente fertilizante orgânico.

Devido ao crescimento populacional, a demanda por alimentos é

crescente, assim surge uma oportunidade para a reciclagem do lodo de esgoto,

e consequentemente, redução de custos com fertilizantes para os agricultores.

Nos países desenvolvidos, o lodo de esgoto já é utilizado por décadas. Nos




43

EUA, por exemplo, metade do lodo de esgoto produzido é aplicado na

agricultura (Khai, 2007).

A resolução do CONAMA nº 375 de 2006 regulamenta e define critérios

para o uso do lodo de esgoto em áreas agrícolas, visando os benefícios a

agricultura e evitando os riscos à saúde pública e ao meio ambiente. Por conter

patógenos, o Art 3º da resolução obriga o seu tratamento para posterior

utilização na agricultura (CONAMA, 2006).

Diversos estudos têm sido realizados no Brasil, principalmente nos

estados do Paraná e São Paulo, a fim de adequar a sua utilização e conhecer

os efeitos do seu uso sobre diversas culturas.

Figura 1. Composição de lodo doméstico (Adaptado de Melo & Marques,

2000).

2. Lodo de esgoto

O lodo de esgoto é considerado um material isolado de estações de

tratamento de efluentes domésticos ou não, após a passagem pelos processos

primário e secundário. Esses procedimentos visam enquadrar os efluentes aos

padrões normatizados pela legislação. Além disso, podem ser decisivos para

remover ou diminuir a concentração de muitos compostos potencialmente

tóxicos ou impactantes ao meio ambiente. Segundo Saito (2007), o volume e

destino do lodo têm preocupado pesquisadores, órgãos ambientais,

legisladores e as empresas de tratamento do esgoto em todo o mundo.

O lodo de esgoto é classificado como resíduo orgânico gerado pelo

processamento de efluentes urbanos, sendo que seu volume é fator

preponderante para sua destinação. Segundo Oliveira et al. (1995) o lodo de


44

esgoto possui altos teores de matéria orgânica e nutrientes fazendo com que

seu uso potencial seja promissor para fins agrícolas.

A utilização do lodo de esgoto possui duplo benefício, pois contribui

ecologicamente na devolução dos nutrientes ao solo e do carbono orgânico,

além do benefício social pela redução do impacto ao meio ambiente (Chiba,

2005). Entre os benefícios potenciais do uso do lodo de esgoto, Saito (2007)

argumenta que o mesmo aporta grande quantidade de nutrientes minerais.

Quando aplicado ao solo pode melhorar suas propriedades físicas, químicas e

biológicas e globalmente, a produtividade agrícola. No entanto, o autor discute

ainda que, como o lodo pode conter altas concentrações de contaminantes,

essa prática pode resultar em adição direta de patógenos diversos e

substâncias químicas indesejáveis ao solo e consequentemente na cadeia

alimentar (Saito, 2007).

A aplicação de lodo de esgoto na agricultura é a alternativa mais utilizada

no Brasil, sendo que 91,7% é utilizado na produção vegetal ou na

recomposição de áreas degradadas, e destas, 82,1% estão relacionados com a

agricultura, silvicultura e produção de plantas ornamentais. O estado de São

Paulo possui o maior número de pesquisas relacionadas ao tema, com 61,8%

do total de pesquisas publicadas (Castro et al., 2015).

Figura 2. Lodo de esgoto em processo de compostagem. Fonte: Mateus, 2017.


45

2.1 Características nutricionais do lodo de esgoto

O lodo de esgoto possui macronutrientes essenciais para as plantas como

N, P, Ca, Mg e S, e diversos estudos têm demonstrado o potencial da utilização

do lodo de esgoto como fertilizante e condicionador de solo, além de

reciclagem da matéria orgânica (Saito, 2007). Em sua composição, em torno de

40% é matéria orgânica, 3% nitrogênio, 2% fósforo e 1% de potássio (Munhoz

& Berton, 2001).

O lodo de esgoto possui potencial para ser utilizado como fertilizante

nitrogenado, pois possui alto teor de N em sua composição (Backes et al.,

20017). O processo de liberação do N para as plantas ocorre lentamente e de

forma continua, pois a maior parte do N presente no lodo se encontra na forma

orgânica, entre 70 a 90%, variando de acordo com o tipo de solo e o lodo

utilizado (Colodro, 2005; Boeira et. al., 2002).

Estudos sugerem um aumento na produtividade em várias culturas

quando utilizados lodo de esgoto como fertilizante, superando inclusive, em

alguns casos culturas fertilizadas com adubação mineral. O lodo de esgoto é

pobre em K, portanto, em determinadas culturas, pode ser necessária

adubação complementar (Silva et al., 2001). O lodo de esgoto aumenta o teor

disponível de P no solo, o que pode ocorrer, devido a matéria orgânica

presente no lodo de esgoto favorecer a disponibilidade de P (Ribeirinho et al.,

2012).

Apesar dos benefícios para as plantas e para o solo, o lodo de esgoto

apresenta restrições, pois pode conter metais pesados que são tóxicos para as

plantas (Bettiol & Camargo, 2000). As concentrações de metais pesados porem

variar dependendo da origem do lodo. Normalmente, os metais pesados

presentes nos lodos de esgoto são o cobre, zinco, níquel, cádmio, chumbo

dentre outros. A disponibilidade destes metais para as plantas depende da

forma química encontrada no solo, sendo que diversos estudos mostraram que

estes metais estão presentes em quantidades não toxicas ao ambiente, não

causando, portanto, toxidez nos vegetais (Silva et al., 2001; Fytili & Zabaniotou,

2008).


46

Tabela 2. Características químicas do lodo de esgoto gerado pela Estação de

Tratamento de Efluentes / Fazenda Lajeado – Botucatu (SP).

N P2O5 K2O Ca Mg S U-65oC MO C

----------------------------------------- ** porcentagem ao natural ------------------------

2,5 3,2 0,1 1,2 0,2 2,4 29 33 18

Na B Cu Fe Mn Zn

C/N pH

-----------------**mg kg ao natural ------------------

ao natural

568 145 159 33465 315 870

7/1 6,4

2.2 Efeitos da utilização de lodo de esgoto no solo

Conhecendo as propriedades do lodo de esgoto e a necessidade de

destinar de maneira correto este resíduo, tem se realizado uma série de

estudos quanto a capacidade de recuperação e condicionamento de solos em

áreas degradadas, buscando reestruturar e aumentar a fertilidade, com intuito

de tornar estes, novamente produtivos.

Sabe-se que solos desestruturados, são aqueles que naturalmente ou por

má utilização, se tornam ácidos, pobre em nutrientes e gradativamente chegam

ao ponto de se tornarem totalmente improdutivos. A utilização do lodo de

esgoto, enquanto fonte de material orgânico tem a capacidade de formar

agregados do solo, que reduzem o potencial erosivo, promove povoação

microbiana, aumento da fertilidade e capacidade de armazenamento de água,

além de favorecem o desenvolvimento de raízes (Tsutiya, 2001).

O lodo de esgoto melhora as condições físicas do solo, densidade,

porosidade e a retenção de água e por possuir alto teor de matéria orgânica,

eleva o pH, aumenta a CTC e a capacidade de fornecer nutrientes para as

plantas, e promove a ciclagem de nutrientes no solo (Malta, 2001).

Uma das importantes atribuições do solo é armazenar água e manter

disponível para que as plantas consigam se nutrir, desenvolver, reproduzir e

completar seu ciclo. Porém, solos desestruturados apresentam menor

capacidade de armazenamento e consequentemente menor disponibilidade

hídrica, que compreende a quantidade de água entre a capacidade de campo e

o ponto de murcha permanente (Klein, 2014). Em estudo sobre as

características físicas de solos, os resultados mostraram que a utilização do

lodo de esgoto proporcionou alterações nos macro e microporos e,


47

consequentemente, na porosidade total de um Latossolo vermelho distrófico,

espaços estes responsáveis por reter água e ar (Campos & Alvez, 2008).

A capacidade de armazenamento de nutrientes em solos degradados é

extremamente baixa, e tem se percebido que o uso do lodo proporciona

aumento da matéria orgânica destes, que está diretamente ligada a capacidade

de troca de cátions do solo (Seki, 1995), estes responsáveis por armazenar

nutrientes essenciais às plantas, como macro e micronutrientes, em seus

coloides.

Nas Tabelas 1 e 2, do estudo de Bonini et al., (2015), pode-se verificar a

melhora dos atributos químicos, na profundidade de 0-0,40 m, do solo

submetido aos tratamentos com lodo de esgoto.

Tabela 1. Bonini et al., (2015) adaptado - Valores médios de teor de fósforo

(P), potássio (K), cálcio (Ca) e magnésio (Mg), matéria orgânica (MO),

potencial hidrogeniônico (pH), acidez potencial (H + Al), soma de bases (SB),

capacidade de troca catiônica (CTC) e saturação por bases (V%) nas camadas

de 0-0,05 e 0,05-0,10 m em solos cultivados com eucalipto e braquiária,

submetidos aos tratamentos testemunha, 30 ou 60 Mg ha-1 de lodo de esgoto.

Tratamentos P resina MO pH

K Ca Mg H+Al SB CTC V%

mg dm-3 mg dm-3 mmolc dm-3

0-0,05

Testemunha 1c 6b 5,6b 0,5c 6b 8b 11d 14,5b 25,5c 57a

30 Mg ha-1 55b 9b 5,9a 0,7b 9ab 13a 16c 22,7a 38,7b 57a

60 Mg ha-1 97a 13a 5,2b 0,7b 13a 14a 21b 22,7a 48,7a 57a

0,05-0,10

Testemunha 1c 8b 5,8b 0,4bc 7b 6b 11c 13,4b 24,4b 55b

30 Mg ha-1 39b 9b 5,1b 0,5b 7b 8b 15b 15,5b 30,5a 51b

60 Mg ha-1 98a 10b 4,8b 0,5b 11a 10a 19b 21,5a 40,5a 53b


48

Tabela 2. Bonini et al., (2015) adaptado - Valores médios de teor de fósforo

(P), potássio (K), cálcio (Ca) e magnésio(Mg), matéria orgânica (MO), potencial

hidrogeniônico (pH), acidez potencial (H + Al), soma de bases (SB),

capacidade de troca catiônica (CTC) e saturação por bases (V%) nas camadas

de 0,10-0,20 e 0,20-0,40 m em solos cultivados com eucalipto e braquiária,

submetidos aos tratamentos testemunha, 30 ou 60 Mg ha-1 de lodo de esgoto.

Tratamentos P resina MO pH

K Ca Mg H+Al SB CTC V%

mg dm-3 mg dm-3 mmolc dm-3

0,10-0,20

Testemunha 1b 5bc 6,2a 0,3c 8ab 6a 10d 14,3a 24,3ab 59a

30 Mg ha-1 6b 6bc 5,4ab 0,3c 5b 4ab 12d 9,3a 21,3b 44a

60 Mg ha-1 35a 6b 5,1bc 0,2c 10a 8bc 14bc 18,2a 32,2a 57a

0,20-0,40

Testemunha 1c 3b 5a 0,2c 5a 3a 12bc 8,2a 20,2ab 41a

30 Mg ha-1 3b 3b 4,7b 0,1c 4b 2b 12bc 6,1b 22,1a 34b

60 Mg ha-1 4b 3b 4,9b 0,1c 7a 3a 12bc 10,1a 23,5a 46a

Estudos sugerem que o lodo de esgoto pode desempenhar um papel

importante como condicionador de solo, que a aplicação eleva a CTC e SB, e

por consequência, aumento significativo do teor de nutrientes do solo.


49

Referências

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50

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http://unan.unesp.br/destaques/28036/projeto-pesquisa-compostagem-com-lodo-de-esgoto

http://unan.unesp.br/destaques/28036/projeto-pesquisa-compostagem-com-lodo-de-esgoto


51

CAPÍTULO 7

USO DO LODO DE ESGOTO EM PLANTAS

Dariane Priscila Franco de Oliveira1, Anny Mery Marcon Ruiz2,

Fernando Broetto3, Alessandro Reinaldo Zabotto1, Irineu Eduardo

Kühn1, Tamiris Cristina Oliveira de Andrade1, Luz Maria Ruiz

Machuca4



CEP 18610-307, Botucatu – SP, Brasil, e-mail: [email protected],. 3Engenheira

Florestal, Mestranda em Ciência Florestal - Faculdade de Ciências Agronômicas, Universidade

Estadual Paulista. Rua José Barbosa de Barros, 1780, CEP 18610-307, Botucatu – SP, Brasil. 3Professor Associado – Departamento de Química e Bioquímica, Universidade Estadual

Paulista/Unesp, Campus de Botucatu – Instituto de Biociências, Rua Profa. Dr

a. Irina Delanova

Gemtchujnicov, s/n0, CEP: 18618-693, Botucatu, São Paulo, Brasil.

4Doutor em Agronomia



1. Introdução

O crescimento populacional promoveu o aumento do volume de efluentes

(QADIR et al., 2010) e resíduos sólidos domésticos gerados pelas estações de

tratamento de esgoto - ETEs (TASSO JÚNIOR et al., 2007). A administração

inadequada referente ao descarte ou uso desses resíduos pode causar graves

problemas ambientais ao contaminar corpos hídricos e conflitos sociais por

oferecer riscos à saúde pública.

O lodo de esgoto é um resíduo sólido, gerado ao fim do processo

realizado em ETEs (AFÁZ et al., 2017). O material coletado pelas redes de

esgoto passa por procedimentos de coagulação, floculação,

sedimentação, decantação e filtração (BITTENCOURT et al., 2012;

ANDREOLI, 2001), cujo objetivo é purificação e devolução da água aos corpos

hídricos ou seu reuso para irrigação (QUINTANA et al., 2011; JELIC et al.,

2011). Quando tratado e estabilizado através de processos químicos e


52

biológicos, o lodo é chamado de biossólido (OLIVEIRA, 2017; DORES-SILVA,

2011). Esta estabilização visa atenuar seus odores e seu conteúdo de

microrganismos patogênicos (ANDREOLI, 2001).

É possível preparar o lodo, resultante do processo de purificação da água,

antes de sua utilização para cumprir normas legais e também adequá-lo quanto

ao uso final desejado, por diferentes procedimentos tecnológicos (SUTHAR,

2010). O lodo gerado pode ser incinerado, descartado em aterros sanitários,

disposto em oceanos e reutilizado na agricultura e silvicultura como adubo e

condicionador do solo (LIRA et al., 2008; JELIC et al., 2011; QUINTANA et al.,

2011; VIEIRA et al., 2011). Ocorrem muitas variações físicas e químicas do

lodo de esgoto de modo que tais fatores podem definir se o material em

questão será classificado como seguro ou inseguro. Portanto, é importante que

o material resultante desses procedimentos seja submetido a análises químicas

abrangentes precedentes à sua utilização (CIÉSLIK et al., 2015).

O Conselho Nacional do Meio Ambiente (CONAMA) na Resolução no 375,

proíbe o uso do lodo e seus derivados em pastagens, cultivo de olerícolas,

tubérculos e raízes, culturas inundadas e culturas cuja parte comestível entre

em contato com o solo. Em contrapartida, a resolução permite seu uso em

cultivos de café, silvicultura, culturas para produção de fibras e óleos ou em

outras culturas após 48 meses perante determinadas restrições (CONAMA,

2006). Esta aplicação traz como benefícios a redução do descarte de lodo em

aterros sanitários, incineradores, mares e corpos hídricos, ciclagem de

nutrientes, maior teor de matéria orgânica no solo e redução de custos com o

uso de fertilizantes minerais (AFÁZ et al., 2017), contribuindo assim para a

redução do lançamento de resíduos no meio ambiente.

2. Lodo de esgoto na nutrição de plantas

O tratamento de efluentes municipais resulta na produção de grandes

quantidades de lodo de esgoto, o que requer uma gestão adequada e

ambientalmente correta antes da disposição final (KELESSIDIS e

STASINAKIS, 2012). Em estimativas do Instituto Trata Brasil (2017), referentes

às capitais brasileiras, um volume aproximado de 1,2 bilhão de m3 de esgoto foi

lançado nos corpos hídricos em 2013 sem nenhum tratamento. Visando mitigar


53

este efeito ambiental nocivo e incentivar a utilidade deste material, o uso do

lodo de esgoto como fertilizante tem sido praticado como alternativa à

incineração e seu depósito em aterros, esta forma de alocação tem

evidenciado vantagens econômicas e ambientais (ROCHA et al., 2016).

O lodo apresenta decomposição lenta, disponibilizando gradualmente os

nutrientes no solo (SILVA et al., 2012), por isso torna-se um material

interessante em nutrição de plantas uma vez que os nutrientes são

disponibilizados mais lentamente quando comparados a fertilizantes químicos

comerciais que apresentam elementos na forma imediata de absorção pela

planta podendo ser perdidos por volatilização, lixiviação e percolação.

Altamente rico em nutrientes, o lodo apresenta compostos orgânicos,

macronutrientes e micronutrientes como N, P, K, Ca, Mg e Fe (MARTINEZ et

al., 2003), micro poluentes orgânicos, microrganismos (KULLING, 2001) e alto

teor de metais pesados (DEDE e OZDEMIR, 2016), como o cobre (Cu), um dos

metais pesados em maior proporção no lodo (MOSQUERA-LOSADA et al.,

2016). Para a reciclagem segura do lodo devem ser consideradas as condições

do solo, a qualidade do lodo e a cultura pretendida (OLIVEIRA, 2017).

Os efeitos do lodo de esgoto em plantas perpassam pela germinação,

desenvolvimento inicial, crescimento, fenologia, acúmulo de matéria seca e de

metais pesados (SINGH e AGRAWAL, 2008).

Estudos relatam efeitos benéficos à produtividade de plantios florestais

sob efeito da aplicação de lodo de esgoto. A fertilização com aplicação de lodo

em plantas de Corymbia citriodora promoveu incremento de biomassa foliar,

óleo essencial e biomassa lenhosa (SILVA et al., 2012). Plantas de Eucalyptus

urograndis adubadas com fertilizante comercial como as plantas adubadas com

lodo de esgoto apresentaram taxa relativa de crescimento semelhante,

corroborando o potencial de substituição do fertilizante comercial pelo lodo de

esgoto (AFÁZ et al., 2017). No cultivo de Eucalyptus camaldulensis sob

aplicação do lodo obtiveram parâmetros biométricos aproximadamente 20%

superiores às plantas adubadas convencionalmente, o mesmo estudo

evidenciou que o tratamento com o lodo implicou em um aumento de 40% no

número de folhas das plantas (SOUDANI et al., 2017).

Em culturas agrícolas o efeito do lodo de esgoto também tem sido

avaliado. Um estudo conduzido em Varanasi, Índia, plantas de arroz (Oryza


54

sativa L.) apresentaram redução do comprimento das raízes, enquanto que o

comprimento das folhas, número de folhas, área foliar e a biomassa total

aumentaram significativamente quando cultivadas sob várias taxas de lodo de

esgoto. O rendimento de arroz aumentou de 60%, a 137% de acordo com o

aumento da quantidade de lodo incorporada ao solo. Todavia estas plantas

apresentaram contaminação por metais pesados (SINGH e AGRAWAL, 2010).

Em gramíneas a aplicação de lodo de esgoto favoreceu o crescimento de

biomassa (ARAÚJO et al., 2009; BACKES et al., 2010). Em um experimento

desenvolvido na China, a biomassa de duas espécies de gramíneas (Zoysia

japonica e Poa annua) aumentou e a estação de crescimento destas foi mais

longa, as concentrações de metais pesados mantiveram-se dentro do permitido

com exceção do Cádmio (Cd) que ultrapassou a recomendação vigente no país

(WANG et al, 2008).

Plantas de milho nutridas via lodo de esgoto (Zea mays L.) se

desenvolveram de maneira semelhante às plantas do tratamento controle, no

mesmo estudo, teores de Cr, Pb e Zn nos grãos, quando detectados,

permaneceram abaixo dos limites máximos estabelecidos para o consumo

humano conforme a legislação brasileira (NOGUEIRA et al., 2008).

Em de plantas de alfafa (Medicago sativa L) a aplicação de lodo melhorou

a fotossíntese líquida, resultando em maior crescimento e produtos

fotossintéticos (açúcares solúveis) necessários para o metabolismo de nódulos

(ANTOLÍN et al., 2010), indicando alterações do uso de lodo de esgoto em

níveis fisiológicos da planta.

Em um estudo realizado com a cultura da cana de açúcar, o tratamento

que recebeu o lodo de esgoto como fertilizante apresentou maior quantidade

de sacarose acumulada expressa em termos de açúcar total (CHIBA et al,

2008). Outro estudo concluiu que uso do lodo de esgoto em comparação às

plantas de cana de açúcar cultivadas com fertilização mineral, não alterou a

qualidade da matéria-prima, destacando o expressivo potencial desse material

no aspecto nutricional (CÓ JUNIOR et al. 2008).

Em plantas de feijão o aumento da dose de lodo de esgoto promoveu o

incremento no número de vagens, rendimento de matéria seca, rendimento de

grãos e na massa de 1000 grãos (LOBO et al., 2011). Em uma pesquisa

realizada na Índia, todas as concentrações de metais acumulados em plantas


55

de feijão cultivadas em solos com aplicação de logo de esgoto, exceto Cd no

grão, estavam abaixo dos limites padrão da Organização das Nações Unidas

para Alimentação e Agricultura (FAO) / Organização Mundial da Saúde (OMS)

(KUMAR e CHOPRA, 2014).

Diante deste contexto, o uso de lodo de esgoto na nutrição de plantas

pode apresentar efeitos benéficos no desenvolvimento de culturas florestais e

agrícolas. Em função da variação da composição do lodo de esgoto, é

recomendável uma análise física e química do material antes de sua aplicação

e um monitoramento regular dos níveis de metais em produtos agrícolas para

evitar seu acúmulo na cadeia alimentar e atender às legislações vigentes nos

diversos países.


56

Referências

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59

CAPÍTULO 8

PIGMENTOS FOLIARES

Mara Lúcia Cruz De Souza1, Anny Mery Marcon Ruiz2, Fernando

Broetto3, Luz Maria Ruiz Machuca4, Enrique Alonso Zuñiga4, Tamiris

Cristina Oliveira de Andrade1



CEP 18610-307, Botucatu – SP, Brasil, e-mail: [email protected]. 2Engenheira

Florestal, Mestranda em Ciência Florestal - Faculdade de Ciências Agronômicas, Universidade

Estadual Paulista. Rua José Barbosa de Barros, 1780, CEP 18610-307, Botucatu – SP, Brasil. 3Professor Associado – Departamento de Química e Bioquímica, Universidade Estadual

Paulista/Unesp, Campus de Botucatu – Instituto de Biociências, Rua Profa. Dra. Irina Delanova

Gemtchujnicov, s/n0, CEP: 18618-693, Botucatu, São Paulo, Brasil. 4

Doutor em Agronomia



1. Introdução

Os pigmentos foliares podem ser empregados como sinalizadores de

estresse em plantas. Plantas submetidas a estresse bióticos e abióticos

apresentam decréscimo na assimilação de nutrientes que compõem a molécula

de clorofila, prejudicando o aparelho fotossintético (CODOGNOTTO et al.,

2002). Cavalcante et al. (2009), infere que plantas cultivadas em solos salinos

sofrem degradação da clorofila devido ao acréscimo da atividade da enzima

clorofilase reduzindo a concentração de clorofila nas folhas.

2. Clorofilas

A clorofila é o pigmento mais abundante nas plantas e ocorrem nos

cloroplastos das folhas e em outros tecidos vegetais. É objeto fundamental

para a fotossíntese, absorvendo luz solar e convertendo em energia química,

processo primordial para as plantas. A fotossíntese abrange duas fases: fase

fotoquímica e fase bioquímica, na fase fotoquímica ocorrem as reações



60

luminosas, essas reações acontecem quando as plantas estão iluminadas. Na

fase bioquímica ocorrem as reações de fixação de carbono que não dependem

de energia luminosa.

A presença e a concentração de pigmentos fotossintéticos nas plantas

são dependentes da espécie. Os seres vivos que realizam fotossíntese que

produz oxigênio (oxigênica) apresentam a clorofila a. Alguns seres vivos são

destituídos da clorofila a, apresentando como pigmento fotossintético a

bacterioclorofila, é o caso das bactérias fotossintetizantes. A primeira fase do

processo da fotossíntese (fase clara) utiliza como pigmento a clorofila a. Já os

demais pigmentos, conhecidos como acessórios que integram diferentes tipos

de clorofilas (Clorofilas b, Clorofilas c, Clorofilas d e carotenoides) são

utilizados auxiliando na assimilação de luz e na movimentação da energia

radiante para os núcleos de reação (TAIZ & ZIEGER, 2004).

A máxima capacidade fotossintética das plantas é determinada pelos

teores de pigmentos (clorofilas e carotenoides) nos tecidos foliares, pois

possuem uma relação com a assimilação e movimentação de energia luminosa

e ao desenvolvimento e adaptação a vários ambientes (REGO e POSSAMAI,

2006).

Para extração de clorofilas deve-se ter cuidado, pois as ligações entre as

moléculas de clorofilas são bem delicadas (não covalentes), podendo se

romper facilmente ao macerar os tecidos em solventes orgânicos. O melhor

solvente a ser utilizado na extração de uma substância sofre influência direta

do caráter hidrofílico/hidrofóbico da substância, segundo Mussi (2003).

Para uma eficiente extração dos pigmentos foliares, utilizam-se solventes

polares (o acetato de etila, a acetona, o etanol, o metanol, dimetilformamida e a

piridina). O éter de petróleo e o hexano são solventes apolares pouco eficientes

na extração de pigmentos.

As plantas verdes possuem principalmente clorofila a que correspondem

a 75% dos pigmentos verdes totais, sendo que as clorofilas a e b são

encontradas nos organismos em uma proporção de 3:1. A proporção varia com

as condições de crescimento e fatores ambientais, assim plantas que crescem

na sombra apresentam uma quantidade elevada de clorofila b, o que pode

estar relacionado com suas propriedades de absorção da luz. A clorofila b é


61

capaz de absorver fortemente entre 450 e 480 nm, enquanto a clorofila a

absorve entre 400 e 450 nm (SILVA et al., 2013).

Entretanto, as moléculas de clorofila podem sofrer degradação por se

tratar de moléculas instáveis. Variações no meio como alterações no pH,

estresse térmico ou excesso de luz são fatores que causam degradações nas

clorofilas, dando origem a produtos denominados feopigmentos. A feofitina,

originada da degradação da clorofila, causa várias alterações nas medidas

deste pigmento, por absorver luz na mesma região do espectro que a clorofila

(CETESB, 2014).

3. Antocianinas

A palavra antocianina tem origem grega (anthos, uma flor, e kyanos, azul

escuro). As antocianinas são o segundo mais importante grupo de pigmentos

de origem vegetal são encontradas em maior quantidade nas angiospermas

(LOPES et al., 2007).

As antocianinas têm como principais funções em flores e frutos vários

mecanismos reprodutores das plantas, tais como dispersão de sementes e a

polinização, atuam também protegendo vários tecidos das plantas de

processos oxidativos, agindo como filtro das ações da luz (MALACRIDA e

MOTA, 2006). Costa et al. (2015) informa que em algumas espécies vegetais,

as antocianinas estão relacionadas à resistência de patógenos e agem

aprimorando e controlando a fotossíntese.

4. Extração e análise dos teores de pigmentos

4.1 Preparo da amostra

Coletar folhas frescas em campo e armazenar em recipiente com isolação

térmica, no intuito de manter a umidade das folhas. Em laboratório deve-se

retirar amostras circulares com o auxílio de um “cortador com diâmetro pré-

definido” os quais posteriormente devem ser alocados em tubos de ensaio.

Deve-se utilizar folhas sadias e evitar a realização do corte sobre nervuras, e

áreas com possíveis danos.


62

4.2 Ensaio

a. Para análise das antocianinas “A”: adicione 1 mL de solução de

Dimetilformamida ácido em cada tubo.

b. Preparo da solução de Dimetilformamida ácido (0.1 N HCL com DMF):

Para um volume total de 500 mL, misturar 1,53 mL de HCL concentrado (puro)

com 498.5 mL de dimetilformamida.

c. Para análise de clorofilas “C” e outros pigmentos: adicione 1 mL de solução

de Dimetilformamida puro em cada tubo.

Tampe os tubos com papel alumínio e mantenha no escuro por 24 horas

ou mais. Ao final da incubação, os discos devem ter aparência incolor. A

solução “A” deve ter uma coloração vermelha e a solução “C” deve apresentar

coloração verde (Figura 1).

Figura 1. Detalhe da extração de clorofilas em folhas de eucalipto.

Ao final da incubação as leituras devem ser realizadas nos comprimentos

de onda λ. a 525, 654 e 666 nm para antocianinas “A” e para clorofilas “C”, leia

a D.O a 480, 646,8 e 663,8 nm, conforme Lee et al. (1987). Utilize

Dimetilformamida, como branco do espectrofotômetro.

A determinação das antocianinas, clorofilas e outros pigmentos serão

calculadas pelas equações estabelecidas por Porra et al. (1989), expressas em

µg mL-¹.


63

Antocianinas

𝐴𝑛𝑡𝑜𝑐𝑖𝑎𝑛𝑖𝑛𝑎 =𝐴525 − (0,14053 × 𝐴654 + 0,01746)

38

Onde:

A525 = leitura da amostra a 525 nm;

A654= leitura da amostra a 654nm.

Clorofila a

𝐶𝑙𝑜𝐴 = (12 × 𝐴663,8) − (3,11 × 𝐴646,8)

Onde:

CloA – Clorofila a;

A663,8 – Leitura da amostra a 663,8nm;

A646,8 - Leitura da amostra a 646,8nm.

Clorofila b

𝐶𝑙𝑜𝐵 = (20,78 × 𝐴663,8) − (4,88 × 𝐴646,8)

Onde:

CloB - Clorofila b;

A663,8 – Leitura da amostra a 663,8nm;

A646,8 - Leitura da amostra a 646,8nm.

Carotenoides

𝐶𝑎𝑟𝑇 = ((1000 × 𝐴480) − (1,12 × 𝑐𝑙𝑜𝐴) − (34,07 × 𝐶𝑙𝑜𝐵)

245)

Onde:

CarT – carotenoides totais;

A - Leitura da amostra a 480nm;

CloA – Clorofila a;

CloB - Clorofila b.


64

Referências

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ENSINO, PESQUISA E EXTENSÃO, 9. 2009, Pernambuco. Resumos...

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(bixa orellana) por meio de cromatografia em papel. VIII Simpósio de

Pesquisa dos Cafés do Brasil 25 a 28 de novembro de 2013, Salvador - BA.

TAIZ, L.; ZIEGER, E. Fisiologia vegetal. 3.ed. Porto Alegre: Artmed, 2004.

p.693.


65

CAPÍTULO 9

PROTEÍNAS SOLÚVEIS TOTAIS

Fernando Broetto1, Luz Maria Ruiz Machuca2, Enrique Alonso

Zuñiga2, Mara Lúcia Cruz De Souza3, Anny Mery Marcon Ruiz4,

Alessandro Reinaldo Zabotto3, Cristiane de Pieri5

1Professor Associado – Departamento de Química e Bioquímica, Universidade Estadual


Gemtchujnicov, s/n, CEP: 18618-693, Botucatu, São Paulo, Brasil, e-mail:

[email protected]. 2

Doutor em Agronomia (Irrigação e Drenagem) – Faculdade de


CEP 18610-307, Botucatu – SP, Brasil. 3Pós-graduação em Agronomia (Irrigação e Drenagem

e Energia na Agricultura) – Faculdade de Ciências Agronômicas, Universidade Estadual

Paulista. Rua José Barbosa de Barros, 1780, CEP 18610-307, Botucatu – SP, Brasil.

4Engenheira Florestal, Mestranda em Ciência Florestal - Faculdade de Ciências Agronômicas,


– SP, Brasil. 5Doutora em Ciência Florestal - Faculdade de Ciências Agronômicas,


– SP, Brasil.

1. Introdução

A análise de proteínas solúveis totais pode ser feita de forma bastante

simples através de métodos espectrofotométricos. O protocolo mais difundido

é o Bradford, o qual utiliza Coomassie Brilliant Blue G-250. Este composto

carregado negativamente liga-se a cargas positivas da cadeia polipeptídica. O

corante apresenta em dois picos de absorção: vermelho (Amax. = 465nm) e azul

(Amax. = 595 nm). Apesar da predominância da forma vermelha de absorção, a

mesma converte-se para a forma azul, quando o corante reage com a proteína.

A reação é altamente reproduzível e rápida, completando-se em cerca de dois

minutos com estabilidade de cor por até uma hora. No entanto, as leituras

devem ser efetuadas após 15 minutos de incubação. O segundo método,

pouco conhecido, mas muito preciso é uma modificação da técnica do biureto

com algumas vantagens relativas a maior precisão (5 a 10 vezes), curva de


66

calibração linear e mantem a qualidade da detecção de proteínas sem

influência em relação a presença de muitos compostos.

2. Material e reagentes

2.1 Determinação de Proteína solúvel total pelo método Bradford

(Bradford, 1976)

2.1.1 Ensaio

Para obtenção do extrato, moer 500 mg de tecido vegetal em 2 mL de

tampão fosfato 0, 1 M, pH 6.7 e centrifugar por 10 min a 5000 x g e separar o

sobrenadante (extrato bruto); Pipetar três alíquotas de 100 µL (triplicata) de

extrato e acrescentar 5 mL do reativo de Bradford (agitar); Ler a absorbância

em 595 nm após 15 minutos. Comparar a leitura obtida em espectrofotômetro

com a curva padrão, através da equação da reta. Para melhorar a precisão,

determinar poucas amostras de cada vez para que as leituras não demorem,

considerando-se que a linearidade do método começa a alterar após 15

minutos de reação. Utilizar preferencialmente cubetas de vidro ou plástico

(metacrilato) e não de quartzo para evitar a adesão do complexo corante-

proteína nas mesmas.

2.1.2 Preparo das soluções

Comassie Brilliant Blue G-250

Dissolver 100 mg do corante em 50 mL de etanol 95% e adicionar 100 mL de

ácido fosfórico 85% e misturar bem em Becker; Diluir até 1 L em balão volumétrico e

filtrar 2 vezes em papel de filtro e armazenar em frasco escuro em geladeira.

Albumina de soro bovino - BSA (1 mg mL-1)

Dissolver 0,88 g de NaCl (PM = 58,45) em 100 mL de H2O para obter

solução salina 0,15 M; Dissolver 100 mg de proteína (BSA, albumina de soro

bovino) em 100 mL de solução salina 0,15 M, e armazenar em freezer.


67

2.1.3 Curva padrão

Organize um esquema de análise como o quadro abaixo em triplicata e

proceda a reação e leitura da D.O a 595 nm. A regressão linear dos valores

médios obtidos será utilizada como referência para análises de proteína solúvel

em tecido vegetal.

Quadro. Reação e leitura da D.O a 595 nm para análises de proteína solúvel

em tecido vegetal

Identificação Componentes do ensaio

Tubo # Concentração

(µg) BSA (µL)

H2O

(µL)

Coomassie

brilliant Blue

(mL)

1 0 0 100 5.0

2 10 10 90 5.0

3 20 20 80 5.0

4 30 30 70 5.0

5 40 40 60 5.0

6 50 50 50 5.0

7 60 60 40 5.0

8 70 70 30 5.0

9 80 80 20 5.0

10 90 90 10 5.0

11 100 100 0 5.0

2.2 Determinação de Proteína pelo método do amido negro (Popov, 1975)

Para o ensaio, serão preparadas soluções padronizadas de proteína

(BSA) em concentração final de 0.1 mg BSA mL-1 em água bidestilada

(armazenar em freezer a -22°C). A solução corante será formulada inicialmente

com o preparo de uma solução estoque com 0.13 g amidonegro10B dissolvido

em 1 mL de ácido acético 100%, p.A. e 9 mL de etanol. Esta mistura deverá

permanecer em agitação por uma noite e mantida a 4°C. Para o teste, mistura-


68

se 0.5 mL da solução estoque com 24.5 mL de Ácido (10 mL de ácido acético

com 90 mL de etanol). A solução de trabalho deverá ser preparada apenas

antes do uso e filtrada. Ainda para o teste, será necessário o preparo de uma

solução 1N de NaOH (dissolver 2 g NaOH em água bidestilada, completando-

se o volume para 50 mL.

2.3 Protocolo

A curva padrão deverá ser preparada em triplicata, em tubos Eppendorf:

BSA, em µg µL padrão

0 0

2 20

4 40

6 60

8 80

As amostras de extrato vegetal serão analisadas em triplicata (tubos

Eppendorf) sendo que padrões e amostras são tratados paralelamente.

Alíquotas de 100 µL de amostra serão misturadas a 0.6 mL da solução

corante e incubadas por 5 min a temperatura ambiente. Os tubos serão então

centrifugados por 5 min a 12,000 x g (centrífuga para Eppendorf), descartando-

se o sobrenadante. Adicionar 1.0 mL do Ácido e agitar em vortex, seguindo-se

de centrifugação por 5 min a 12,000 x g. Esta etapa será repetida mais uma

vez, descartando-se o sobrenadante completamente. O pellet resultande será

dissolvido em 300 µL de NaOH 1N por agitação em vortex. Ao final, determinar

a a absorção em 624 nm (branco, utilizar padrão sem BSA).

Alternativamente, a D.O. poderá ser obtida a partir da leitura em Elisa-

reader (filtro: 620 nm), conforme modelo abaixo.


69

Quadro. Modelo D.O. para leitura em Elisa-reader (filtro: 620 nm).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A 0µg

BSA

0µg

BSA

2µg

BSA

2µg

BSA

4µg

BSA

4µg

BSA

6µg

BSA

6µg

BSA

8µg

BSA

8µg

BSA empty empty

B sample

1a

sample

1b

sample

1c

sample

2a

sample

2b

sample

2c

sample

3a

sample

3b

sample

3c

sample

4a

sample

4b

sample

4c

C sample

5a

sample

5b

sample

5c

sample

6a

sample

6b

sample

6c

sample

7a

sample

7b

sample

7c

sample

8a

sample

8b

sample

8c

D sample

9a

sample

9b

sample

9c

sample

10a

sample

10b

sample

10c

sample

11a

sample

11b

sample

11c

sample

12a

sample

12b

sample

12c

E sample

13a

sample

13b

sample

13c

sample

14a

sample

14b

sample

14c

sample

15a

sample

15b

sample

15c

sample

16a

sample

16b

sample

16c

F sample

17a

sample

17b

sample

17c

sample

18a

sample

18b

sample

18c

sample

19a

sample

19b

sample

19c

sample

20a

sample

20b

sample

20c

G sample

21a

sample

21b

sample

21c

sample

22a

sample

22b

sample

22c

sample

23a

sample

23b

sample

23c

sample

24a

sample

24b

sample

24c

H sample

25a

sample

25b

sample

25c

sample

26a

sample

26b

sample

26c

sample

27a

sample

27b

sample

27c

sample

28a

sample

28b

sample

28c


70

Referências

BRADFORD, M.M. A rapid and sensitive method for the microgram quantities of

protein utilizing the principle of protein-dye-binding. Analytical Biochemistry,

72:248-254, 1976.

POPOV, N.; SCHIMITT, M. SCHULZEL, S.; MATTHIES, H. Einei störungsfreie

Mikromethode zur Bestimmung des Proteingehaltes in Gewebehomogenaten.

Acta Biologica Medica Germanica. 34, 1975, 1441-1446.


71

CAPÍTULO 10

RAZÃO ISOTÓPICA DE 13

C/12

C E 15

N/14

N

Fernando Broetto1, Luz Maria Ruiz Machuca2, Enrique Alonso

Zuñiga2, Mara Lúcia Cruz De Souza3, Irineu Eduardo Kühn3,

Cristiane de Pieri4

1Professor Associado – Departamento de Química e Bioquímica, Universidade Estadual


Gemtchujnicov, s/n0, CEP: 18618-693, Botucatu, São Paulo, Brasil. e-mail:

[email protected]; 2Doutor em Agronomia (Irrigação e Drenagem) – Faculdade de


CEP 18610-307, Botucatu – SP, Brasil,. 3Pós-graduação em Agronomia (Irrigação e Drenagem)

– Faculdade de Ciências Agronômicas, Universidade Estadual Paulista. Rua José Barbosa de

Barros, 1780, CEP 18610-307, Botucatu – SP, Brasil. 4

Doutora em Ciência Florestal -



1. Introdução

Medidas de discriminação isotópica são técnicas de grande utilidade para

compreensão das relações entre as plantas e o meio ambiente onde se

desenvolvem. Os isótopos são átomos de um mesmo elemento que diferem

unicamente no número de nêutrons e, portanto, na sua massa atômica,

mantendo-se idênticas as suas propriedades químicas (MATEO et al., 2004).

No caso do nitrogênio, o 15N é o isótopo estável de maior interesse nos

estudos de ecofisiologia (MARTÍNEZ-ALCÁNTARA, 2010). Sua descoberta

data de 1929, sendo que sua aplicação aumentou fundamentalmente nas três

últimas décadas graças à implantação de metodologias que utilizam a

espectrometria de massas de fluxo de isótopos (MIDDELBOE e JOHANSEN,

1990). Da mesma forma, o carbono é um isótopo de interesse em plantas. A

atmosfera contem CO2 cujas formas ocorrem como isótopos 12C, 13C, e 14C nas

proporções de 98.9%, 1.1%, e 10-10 %, respectivamente. As propriedades

químicas do 13CO2 são idênticas aquelas do 12CO2, porém devido à pequena


72

diferença na massa (2.3%), as plantas tendem a fixar menos o 13CO2 que o

12CO2. Plantas C3 (δ13C–28‰) discriminam mais 13CO2 que as plantas C4

(δ13C–14 ‰). A maior discriminação de carbono ocorre durante a reação de

carboxilação catalizada pela RUBISCO, a enzima primária de fixação de CO2

em plantas C3, apresentando uma discriminação intrínseca (δ 13C) de –30 ‰.

Por outro lado, a PEP carboxilase, a enzima primária de fixação em plantas C4,

apresenta um efeito de discriminação isotópica muito menor, sendo δ 13C = –2

a 5.7 ‰ (CONDON et al., 2002).

2. Aplicação dos isótopos δ 13C e δ 15N em plantas sob estresse

Os isótopos δ13C e δ 15N são utilizados na ecofisiologia para avaliar as

respostas das plantas a mudanças climáticas, sendo que ambos são sensíveis

às restrições ambientais (PEUKE et al., 2006)

As análises isotópicas do carbono medem a relação de 13C/12C das

amostras e os resultados são expressos em termos de diferença de 13C em

relação ao padrão.

Em plantas, a maioria dos trabalhos com isótopo δ13C é realizado em

nível foliar, sabendo-se que nesse órgão vegetativo ocorre o maior

fracionamento da fotossíntese. No entanto, o carbono nas plantas pode ter

variações genotípicas e ambientais diferentes, dependendo do órgão

vegetativo. (MATEO et al., 2004). A discriminação do isótopo δ13C pelas folhas

de plantas C3 está relacionada com as trocas gasosas da fotossíntese,

podendo estar controlada pela razão da concentração do CO2 nos espaços

intercelulares das folhas e da atmosfera Farquhar et al. (1982).

As plantas sob condições de boa disponibilidade de água no solo,

aproveitam a maior disponibilidade de CO2 para aumentar sua eficiência

hídrica. Embora haja redução da condutância estomática nessas condições

não há limitação da fotossíntese, tornando-se os valores do isótopo δ13C mais

negativos (maior discriminação do δ13C) à medida que a concentração de CO2

aumenta (BEERLING; WOODWARD 1995).

A composição isotópica natural do 15N/14N (δ15N) poderia ser usado como

marcador do metabolismo do N em plantas sob diferentes condições. No

entanto, sabe-se que o metabolismo no N primário é complexo e as perdas ou

ganhos diferem com o tempo (ARIZ et al., 2015). O fracionamento do isótopo


73

de nitrogênio na planta ocorre como resultado da assimilação do NO-3 ou NH+4

na translocação para as folhas e o metabolismo no nitrogênio no citoplasma.

Diversos estudos observaram que o δ15N diminui com a idade da planta e

intensidade de luz, no entanto, aumenta com maiores concentrações de NO-3

(WADA; HATTORI, 1978; KOHL; SHEARER, 1980).

2.1 Coleta e processamento do material vegetal

Recomenda-se coletar folhas totalmente expandidas do terço médio da

planta e depositá-las dentro de sacolas de papel devidamente identificadas, em

seguida as amostras deverão ser levadas cuidadosamente para o laboratório.

As amostras vegetais (folhas) deverão ser secas em estufa de ventilação

forçada (Figura 1), a temperatura de 50° C por um período de 48 h.

Figura 1. Estufa com circulação forçada de ar para secagem de tecidos vegetais.

Após secagem, as amostras deverão transferir-se para potes plásticos

especiais (que suportem condições de baixas temperaturas) e moídas

individualmente em moinho criogênico (2010 GENO/GRINDER – Spex

SamplePrep, USA) durante três minutos após resfriamento a -196 °C. O material

obtido deverá apresentar características homogêneas e de granulometria menor

que 60 µm (DUCATTI et al., 1982).

Fonte: Autores do capitulo (2018)


74

Figura 2. Transferência das amostras para tubos plásticos (A), resfriamento em

nitrogênio líquido (B) e moagem em moinho criogênico (C).

As amostras moídas devem ser transferidas para tubos Eppendorf e

posteriormente pesadas em cápsulas de estanho (Figura 3) com

aproximadamente 60 µg e 600 µg para análise da razão isotópica 13C/12C e

15N/14N respectivamente.

Figura 3. Potes plásticos com amostras (A) e pesagem em capsulas de

estanho (B).

As capsulas deverão ser introduzidas por meio de amostrador automático

no EA onde, em presença de oxigênio (O2) sofrerão a combustão e

redução para a obtenção de CO2 ou N2 dependendo da análise. Os gases

formados serão direcionados para o IRMS utilizando He como gás de arreste.

A B C

A

Fonte: Autores do capitulo (2018)

B

Fonte: Autores do capitulo (2018) Fonte: Autores do capitulo (2018)


75

2.2 Análises da razão isotópica de 13C/12C e de 15N/14N

As amostras deverão ser analisadas por espectrometria de massa de

razão isotópica de fluxo contínuo CF-IRMS “continuous-flow isotope ratio mass

spectrometry” utilizando um IRMS (Delta V Advantage Isotope Ratio MS –

Thermo Scientific, Germany) acoplado a um analisador elementar – EA

“elemental analyzer” (Flash 2000 Organic Elemental Analyzer – Thermo

Scientific, Germany) por meio da interface (ConFlo IV Universal Interface –

Thermo Scientific, Germany).

2.3 Determinação da razão isotópica de 13C/12C e de 15N/14N

Os valores das razões isotópicas são expressos em valor de delta per mil

(δ‰) relativos aos padrões internacionais PeeDee Belemnite (PDB) para o 13C

e, nitrogênio do ar atmosférico para 15N, de acordo com a seguinte equação

geral:

δ‰ (amostra, padrão) = [(Ramostra – Rpadrão) / Rpadrão] x 1000 (15)

Em que R representa a razão entre o isótopo menos abundante e o mais

abundante, em particular 13C/12C e 15N/14N. Recomenda-se que cada amostra

seja analisada duas vezes para a obtenção dos valores médios; as medidas

serão repetidas exclusivamente quando o desvio padrão for superior que 0,2‰

para δ13C e 0,4‰ para δ15N.


76

Referências

ARIZ, I. et al. Leaf δ15N as a physiological indicator of the responsiveness of N2-fixing alfalfa plants to elevated [CO2], temperature and low water availability. Front. Plant Sci. 6:p.574. 2015.

BEERLING, D. J.; WOODWARD, F. I. Leaf stable carbon isotope composition records increased water-use efficiency of C3 plants in response to atmospheric CO2 enrichment. Functional Ecology. 9, p.394–401, 1995.

CONDON, A.G., RICHARDS, R.A., REBETZKE, G.J. AND FARQUHAR, G.D. Improving intrinsic water-use efficiency and crop yield. Crop Sci. 42, 122-131, 2002.

DUCATTI, C.; MATSUI, E. &; SALATTI, E; Fundamentos teóricos dos fatores de correção para a análise das variações relativas das razões 13C/12C e 18O/16O por espectrometria de massa. Energ. Nucl. Agric. 4 (1): 41-58, 1982.

FARQUHAR, G.D.; O'LEARY, M.H.; BERRY, J.A. On the relationship between carbon isotope discrimination and intercellular carbon dioxide concentration of leaves. Australian Journal of Plant Physiology. 9, p.121-137. 1982.

KOHL, D. H; G. SHEARER. “Isotopic fractionation associated with symbiotic N2 fixation and uptake of NO3 - by plants.” Plant Physiology. 66: p.51-56, 1980.

MARTÍNEZ-ALCÁNTARA, B. Estudio de la absorción y translocación del nitrógeno en cítricos en función del aporte estacional del abono nitrogenado, mediante la técnica de dilución isotópica. Tesis Doctoral. Valencia. 2010.

MATEO, M.A., FERRIO, P., ARAUS, J.L. Isotopos estables en ecofisiologia vegetal. La Ecofisiologia Vegetal. Una ciencia de sintesis. Reigosa M.J., Pedrol N. y Sanchez-Moreiras eds. Paraninfo S.A. p.113-160, 2004.

MIDDELBOE, V. Y JOHANSEN, H.S. Analysis of nitrogen, carbon and oxygen isotope ratios by optical emission spectrometry. In: Soil Analysis. Modern Instrumental Techniques (KA Smith, ed.) Marcel Dekker, Inc., New York, USA. p.433-464. 1990.

PEUKE, A.D., GESSLER, A., RENNENBERG, H. The effect of drought on C and N stable isotopes in different fractions of leaves, stems and roots of sensitive and tolerant beech ecotypes. Plant Cell Environ. 29, p.823–835, 2006.

WADA, E. and A. HATTORI. “Nitrogen isotope effects in the assimilation of inorganic nitrogenous compounds by marine diatoms.” Geomicrobiological Journal. 1: p.85-101, 1978.


77

CAPÍTULO 11

FLUORESCÊNCIA DA CLOROFILA a: ASPECTOS

GERAIS E PROTOCOLO DE MEDIDA PARA LI-6400/LI-

6400XT

Diogo Capelin1, Gabriel Silva Daneluzzi1, Ricardo Ferraz de

Oliveira1, Fábia Barbosa da Silva1, Aécio Mendes da Silva1,

Francynês da Conceição Oliveira Macedo1, Aldeir Ronaldo Silva1,

Marina Viana Queiroz1, Fernando Broetto2

1Escola Superior de Agricultura "Luiz de Queiroz"/ Universidade de São Paulo, Piracicaba – SP,

Brasil, e-mail: [email protected], [email protected], [email protected],

[email protected], [email protected],[email protected], [email protected],

[email protected]. 2Professor Associado – Departamento de Química e Bioquímica,

Universidade Estadual Paulista/Unesp, Campus de Botucatu – Instituto de Biociências, Rua

Profa. Dra. Irina Delanova Gemtchujnicov, s/n, CEP: 18618-693, Botucatu, São Paulo, Brasil.

1. Introdução

O desenvolvimento de uma sólida compreensão das relações entre os

parâmetros de fluorescência e o transporte de elétrons fotossintéticos in vivo

aliado a disponibilidade comercial de uma variedade de fluorômetros portáteis e

de fácil operação (BAKER, 2008), tem levado a difusão da técnica de medida

de fluorescência da clorofila in vivo em estudos de ecofisiologia de plantas

(HALNET, 2018).

Os métodos de medida da fluorescência da clorofila baseiam-se no

pressuposto de que a energia luminosa absorvida pelas moléculas de clorofila

pode ser dissipada por três diferentes, competitivas e interligadas vias:

dissipação fotoquímica (fotossíntese); dissipação não fotoquímica (emissão de

calor); ou reemissão em um comprimento de onda maior que o absorvido pelas

clorofilas a fluorescência. Desta forma, a mudança em uma das vias resultará

em alterações nas demais (HALNET, 2018).



78

Além de ser uma medida não invasiva, a fluorescência da clorofila pode

ser uma ferramenta muito poderosa para o estudo do desempenho

fotossintético das plantas (MURCHIE; LAWSON, 2013). Fornece ainda,

informações sobre a quantidade da energia que está disponível para a

dissipação fotoquímica, especialmente quando combinada com outras medidas

não invasivas, como análise de trocas gasosas e termometria infravermelha

(BAKER, 2008).

Para fins de medida é importante conhecer os parâmetros que são

considerados pelos métodos mais difundidos. A partir dos anos 80, a

introdução da técnica de fluorescência por pulso de amplitude modulada (PAM)

abriu novas oportunidades para o estudo detalhado das formas de dissipação

nos fotossistemas (RUBAN, 2016). Nesta técnica, plantas adaptadas ao escuro

são submetidas a uma baixa intensidade de luz, suficiente para induzir a

emissão de fluorescência, porém insuficiente para arrancar elétrons do centro

de reação do fotossistema II (PSII).

Assim é obtida a fluorescência mínima ou inicial da clorofila “a” no estado

adaptado ao escuro (Fo) (figura 1) que representa a emissão de luz pela

molécula de clorofila “a” quando esta encontra-se em estado de excitação

anterior à dissipação da energia para os centros de reação do PSII, em uma

condição em que todos os aceptores primários de elétrons, quinona A

(QA), estejam em estado oxidado (KRAUSE e WEIS, 1991). Esta forma de

dissipação de energia ocorre independentemente dos eventos fotoquímicos

(CONROY, 1986).

A fluorescência máxima no estado adaptado ao escuro (Fm) (Figura 1) é

obtida quando todos os aceptores primários de elétrons do PSII tenham sido

“fechados” (QA totalmente reduzida) em resposta a um pulso de alta

intensidade (aproximadamente 9000 µmols m2 s-1) e curta duração (de 0,5 a

1,0 segundo) (CONROY, 1986). Nesta condição, a energia é completamente

dissipada através da fluorescência da clorofila, uma vez que, durante um curto

espaço de tempo, as QA’ s encontram-se completamente reduzidas, impedidas,

portanto, de receber novos elétrons oriundos dos centros de reação dos PSII

(MAXWELL; JOHNSON, 2000).


79

Figura 1. Medidas básicas de fluorescência da clorofila. Em folhas adaptadas

ao escuro, são medidos os valores de fluorescência mínima da folha adaptada

ao escuro Fo, e Fluorescência máxima da folha adaptada ao escuro Fm. Em

folhas iluminadas, são medidos Fluorescência no estado estável Fs ou F,

Fluorescência máxima da folha adaptada ao claro Fm’, e Fluorescência mínima

da folha adaptada ao claro Fo’. Fv: fluorescência variável adaptada ao escuro;

Fv’: fluorescência variável adaptada ao claro; ΔF ou Fq; Fluorescência que é

dissipada a partir do nível máximo Fm’ até F’ pela fotoquímica do PSII.

A partir desse simples procedimento, obtém-se a fluorescência inicial da

clorofila a (Fo) e a fluorescência máxima (Fm) que reflete a máxima capacidade

energética das clorofilas.

A partir desses parâmetros pode-se calcular a eficiência quântica

potencial de PSII (Fm-Fo) / Fm também conhecido como Fv/Fm (CONROY, 1986;

GENTY et al., 1992; MURCHIE; LAWSON, 2013). Fv/Fm possui grande

relevância pois reflete o máximo (ou potencial) rendimento quântico do PSII e é

uma boa medida de sua integridade. Valores ótimos de Fv/Fm medidos em

várias espécies de plantas encontraram-se próximos de 0,83 (BJORKMAN;


80

DEMMIG, 1987). Essa variável tem sido amplamente utilizada como referência

para detectar perturbações induzidas por estresse no aparato fotossintético

(BAKER; ROSENQVIST, 2004; SILVA et al., 2014).

Conforme descrito acima, Fv/Fm é obtida em plantas adaptadas ao escuro.

Quando as plantas são submetidas a luminosidade, ou seja, são adaptadas à

luz, a dissipação da energia captada pelas clorofilas ocorre através das vias

fotoquímica, calor (dissipação não fotoquímica) e fluorescência.

Quando as plantas são expostas a luz, a máxima fluorescência observada

em Fm é reduzida pelas demais formas de dissipação atingindo um estado

estável conhecido como Fs. Nessa condição, a aplicação de um pulso de

radiação saturante elevará a fluorescência ao nível máximo no estado

adaptado a luz (Fm’) e o valor obtido é menor que Fm, uma vez que, em

condições de adaptação à luz, a fotoquímica e o calor são formas de

dissipação atuantes e reduzem a energia dissipada através da fluorescência.

Um pulso de escuro, que pode ser associado a utilização de luz no

comprimento do vermelho-distante, reduz a fluorescência ao seu nível mínimo,

obtido em plantas previamente adaptadas a luz (Fo’) (HALNET, 2018) (figura 1).

A Tabela 1 apresenta as principais variáveis obtidas através das medidas

de fluorescência da clorofila a. É importante salientar que a literatura utiliza

nomenclatura variável para cada parâmetro, sendo necessária atenção para a

forma de cálculo de cada um, a fim de evitar que uma informação seja tomada

por outra.

Embora a medida da fluorescência da clorofila seja uma técnica

poderosa, ela também é limitada. Mesmo com fácil manuseio, a teoria

subjacente, o processo por trás das medições e o ajuste do instrumento

precisam ser entendidos, caso contrário, os dados produzidos causarão

interpretações enganosas, uma vez que, uma grande quantidade de dados é

produzida e sua interpretação permanece bastante complexa. Além disso, a

análise da fluorescência não é suficiente para explicar o que acontece na

fotossíntese ou para calcular, por exemplo, a produção de biomassa (HALNET,

2018).

Tabela 1. Variáveis relacionadas à medida de fluorescência da clorofila com base no

manual do LI-6400 /LI-6400XT (LI-COR Biosciences, 2012).


81

Variável Equação Descrição

Medida

Escuro Fo --

Fluorescência mínima da folha adaptada ao

escuro

Fm --

Fluorescência máxima da folha adaptada

ao escuro

Claro

FS -- Fluorescência no estado estável

Fm' --

Fluorescência máxima da folha adaptada

ao claro

Fo' --

Fluorescência mínima da folha adaptada ao

claro

Calculada

Escuro Fv Fm-Fo Fluorescência variável adaptada ao escuro

Fv/Fm (Fm-Fo)/Fm Eficiência quântica potencial do PSII

Claro

qP (Fm’-Fs)/(Fm’-Fo’) Dissipação fotoquímica

qN

(Fm – Fm')/(Fm –

Fo') Dissipação não fotoquímica

NPQ (Fm- Fm’)/Fm’ Dissipação não fotoquímica alternativa

ETR

ΦPSII*PPFD*

αleaf*f Taxa efetiva de transporte de elétrons

ΦCO2

(A –

Adark)/Iαleaf

Rendimento quântico associado a

assimilação de CO2

ΦPSII (Fm’ - Fs)/Fm’ Eficiência quântica efetiva do PSII

Onde PPFD é densidade de fluxo de fótons incidentes, αleaf é a absorbância

fracionária de luz pela folha (o LI-6400 usa o valor de αleaf de 0,84 – LI-COR

Biosciences, 2012; Baker, 2008) e f é a fração de quanta absorvida que é usada

pelo PSII, sendo tipicamente assumida como 0,5 para plantas C3 e 0,4 para

algumas plantas C4 como o milho (LI-COR Biosciences 2012).

Diversos processos podem utilizar o poder redutor e energia (NADPH e

ATP) gerados pelo fluxo de elétrons na cadeia transportadora do cloroplasto,

como a fotorrespiração e ciclo do nitrogênio, além de sua utilização para a

fixação de carbono (TAIZ; ZAIGER, 2013). Além disso, a própria dissipação

não fotoquímica através do ciclo das xantofilas requer NADPH na conversão de

zeaxantina para violaxantina (JAHNS; LATOWSKI; STRZALKA, 2009).


82

A dissipação da energia das clorofilas via formação de espécies reativas

de oxigênio constitui uma válvula de segurança para a liberação do excesso de

energia. A produção de 1O2 nos centros de reação ocorre quando os aceptores

de elétrons do PSII (pool de plastoquinona) estão em um estado altamente

reduzido, geralmente em condições de alta luminosidade ou seca

(CZARNOCKA; KARPINSKI, 2018). Isoladamente a análise de fluorescência da

clorofila é incapaz de quantificar a energia dissipada por estes processos.

Uma aplicação mais eficaz da fluorescência é combina-la com outras

técnicas, em particular, medições de troca gasosas, para obter uma imagem

completa da resposta das plantas ao seu ambiente (HALNET, 2018).

Para mais informações sobre a fluorescência da clorofila consulte Maxwell

e Johnson (2000), Baker e Rosenqvist (2004), Baker (2008), Murchie e Lawson

(2013) e Ruban (2016).

Neste capítulo propomos um protocolo para auxiliar a execução de boas

medidas de fluorescência da clorofila, em especial para os usuários do LI-6400

acoplado a câmara de fluorescência.

2. Testes básicos de funcionamento da câmara de fluorescência da folha

(LCF)

A câmara de fluorescência da folha (6400-40 Leaf Chamber Fluorometer -

LCF) é composta por três tipos de LEDs diferentes quanto ao comprimento de

onda que produzem: 3 LEDs azuis (comprimento de onda de aproximadamente

470 nm), 1 LED vermelho distante (comprimento de onda de aproximadamente

740 nm) e o restante dos LEDs são vermelhos (comprimento de onda de

aproximadamente 640 nm). A LCF possui, além das fontes de luz, um detector

de fluorescência e outro detector de luz actínica (figura 2). Na parte inferior da

câmara da folha está localizado um termopar responsável pela medida de

temperatura da folha.


83

Figura 2. Conjunto de LEDs e detectores para a medida de fluorescência da

clorofila. Vista superior interna da câmara de fluorescência da folha. A- LEDs

azuis, M- luz de medida, FR- LED de comprimento de onda na faixa do

vermelho distante; os demais LEDs emitem luz no comprimento de onda do

vermelho. Adaptado de LI-COR Bioscience, 2012.

Para a realização de boas medidas de fluorescência da clorofila todos os

componentes da LCF precisam estar devidamente calibrados. Com o intuito de

assegurar ao usuário o bom funcionamento dos componentes da LCF alguns

testes básicos são sugeridos abaixo.

Com o equipamento ligado, entre no menu “HOME MENU” na tela

principal do equipamento. Vá em “Diagnostics & Tests” clique em enter, desça

até a linha “LCF Control Panel...” (figura 3) e siga os passos descritos a seguir.


84

Figura 3. Imagem ilustrativa do “LCF Control Panel” - menu utilizado para

diagnósticos e testes da câmara da fluorescência da folha (LCF).

1. LCF ON/OFF:

Alterne o LCF entre ON e OFF clicando nas setas para baixo e para cima

localizadas nas laterais do painel do LI-6400. Quando em OFF, o cooler da

câmara deve parar. Quando em ON, o cooler deve ligar.

2. Mod ON/OFF:

Com LCF: ON, Mod: ON, e Meas: 3.0, o LED verde de status MSR deve

estar ligado; este LED localiza-se no cabo de conexão entre o console e a

sensor head na extremidade ligada ao console. Agora olhe para os dois

LEDs vermelhos na LCF enquanto você alterna a função Mod entre ON e

OFF. Os dois LEDs devem ficar mais brilhantes quando Mod é OFF, e com

menos brilho quando Mod é ON. O LED verde de status MSR permanecerá

aceso.

3. Configurações de frequência - Freq:

Com Mod ON, percorra as definições frequência (0,25 - 1,0 - 10 - 20 KHz).

Você deverá ver o brilho nos dois LEDs mudar. Quanto maior a freqüência

mais brilhante deverão ser os LEDs.

4. Zere o sinal de fluorescência:

Mude a função Mod para ON e defina o valor 0 para Meas. O sinal ("Final

F") deve ir a zero (+/- 4). Pressione Z para zera-lo caso este valor não seja

atingido.


85

5. Verifique a resposta da fluorescência: Com Meas em 3, Mod ON, Filter em

0,5, e Gain em 10, prenda o cartão rosa fluorescente (que vem com o

equipamento) na câmara de fluorescência. As leituras devem ser cerca de

300 ou 400. O ruído ou variação do sinal deve ser de cerca de 2 ou 3. A

ausência de resposta ao cartão, ou a qualquer folha clipada na câmara,

indica que o fluorômetro não está funcionando.

Obs: Cada equipamento LI-6400 possui um cartão rosa fluorescente

particular, não utilize cartões de outros equipamentos.

6. Verifique filtro digital - Filter: Alterar para 200 Hz (pressione a seta para

baixo para saltar de 0,5 para 200). O pico de ruído vai aumentar em um

fator de 10. Defina o filtro de volta para 0,5 Hz.

7. Verificação do funcionamento dos LEDs azuis: Altere Blue de 0 para 2.

Verifique se todos os três LEDs azuis actínicos na LCF estão ligados. Agora

aumente-os até 10. O valor de parIn_μm deverá ser cerca de 150 ou 200.

Volte o valor de Blue para 0.

8. Verificação do funcionamento dos LEDs vermelhos: Altere Red para 1 e

veja se eles ligam. Eles deverão estar todos ligados em 1 e todos

desligados em 0. Desligue-os.

Atenção: não há impedimentos para elevar o brilho dos LEDs vermelhos até

seu valor máximo 10, entretanto, em valores próximos ao máximo eles se

tornarão muito brilhantes, sendo que sua observação direta é perigosa,

além disso, a manutenção de valores altos por mais que alguns segundos

encurtará a vida uútil dos LEDs.

9. Verificação do funcionamento do LED vermelho-distante (Far red): Mude o

valor de Far para 10. Veja se ele está iluminado. Posteriormente desligue-o.

2.1 Calibração do flash retangular

Essa é uma rotina importante e inerente ao método MPF (Multiphase

Flash Protocol). Para obter flashes retangulares bons é necessário fazer a

calibração. Para isso, você pode usar a câmara fechada sem a folha, aberta,

ou com folha.

Na tela inicial, vá em Calib Menu, LCF Source e escolha Square Flash

Calibration. Pressione Y. O procedimento levará alguns minutos. A rotina de


86

calibração do flash retangular roda a LCF por uma variedade de flashes de

duração e intensidade variáveis e determina algumas relações empíricas que o

sistema usa posteriormente para fornecer flashes razoavelmente retangulares

e as fases 1 e 3 do multifásico também retangulares.

Quando perguntado Keep?, pressione Y.

A razão para que a calibração seja feita é que a eficiência dos LEDs cai

com o calor por ele próprio gerado. Quando os LEDs são acionados muito

intensamente para um flash, seu output começa a cair quase imediatamente ao

atingir o brilho desejado. Isso é compensado tentando aumentar a corrente

elétrica para os LEDs apenas o suficiente para equilibrar isso.

Portanto essa rotina deve ser feita no começo do dia e periodicamente ao

longo do dia se a temperatura mudar muito.

2.2 Definição da intensidade ótima da luz de medidas (Meas)

Este programa oferece um protocolo para a determinação da melhor

intensidade de luz de medida (Meas) para a determinação da fluorescência

inicial Fo. Para a determinação deste parâmetro é necessário o fornecimento de

uma intensidade luminosa tão grande quanto possível para induzir a

fluorescência sem induzir a fotossíntese, ou seja, é necessária uma intensidade

luminosa máxima capaz de produzir fluorescência da clorofila, porém

imediatamente inferior ao necessário para produzir o deslocamento de elétrons

dos centros de reação dos fotossistemas.

Com uma folha adaptada a condição de escuro clipada na câmara de

medidas vá para o menu de calibração “Calib menu” e em “LCF source”

selecione “Optimum Meas Intensity”. Forneça uma série de intensidades que

serão aplicadas pela Meas. Pressione enter. Insira o tempo que o feixe de

medição ficará ligado em cada intensidade. Pressione enter. Defina o tempo de

recuperação entre cada intensidade quando o feixe de medidas permanecerá

desligado (Figura 4). Pressione enter. Na dúvida, deixe os valores padrão.

Aparecerá a seguinte pergunta: Store results at end? Pressione Y caso você

deseje. Se não, pressione N. Ao final, aparecerá Plot results? Pressione Y para

ver o gráfico.


87

Figura 4. Menu para a determinação de “Optimum Meas Intensity”.

Durante o "tempo em cada intensidade", o programa coletará os dados de

fluorescência F e, em seguida, determinará a taxa de variação de F (por

minuto) (dF/dt) marcado como slope. Ao final, será gerado um gráfico destes

valores de slope em função da intensidade de medida. Intensidades de Meas

mais altas que o ideal resultam em um aumento de slope, o que indica o início

da dissipação fotoquímica, tornando o valor obtido para Fo incorreto. Por este

motivo toma-se como ideal a maior intensidade de Meas que resulta na menor

variação de slope (Figura 5).

Figura 5. Gráfico apresentado como resultado do teste para definição da

intensidade ótima de Meas. Adaptado de LI-COR Biosciences, 2012.

2.3 Definição da intensidade do flash de saturação

Este programa oferece um protocolo para a determinação da melhor

intensidade do flash de saturação utilizado para a determinação de Fm e Fm’.


88

Com uma folha adaptada a condição de luz clipada na câmara de

medidas vá até o menu de calibração “Calib menu”, “LCF source” e selecione

“Optimum Flash Intensity”. Forneça uma série de intensidades para o flash,

bem como, o tempo de recuperação entre cada flash (figura 6). Pressione enter

para aparecer essas opções à medida que você as vai escolhendo. Responda

Y para sim ou N para não quando aparecer as perguntas Store each flash?,

Store results at end? Pressione enter para começar.

Figura 6. Menu para a determinação de “Optimum Flash Intensity”.

Ao final será apresentado um gráfico de Fmax plotado contra a intensidade

do flash. A menor intensidade do flash que produz o maior valor de

fluorescência é considerada ideal (figura 7). Se esta condição for obtida na

intensidade mais alta (10), é possível que mesmo a maior intensidade do flash

seja incapaz de promover a máxima fluorescência. Neste caso é recomendável

a utilização do protocolo “MultiPhase Flash”, capaz de calcular a máxima

fluorescência da clorofila.


89

Figura 7. Gráfico apresentado como resultado do teste para definição de

“Optimum Flash Intensity’. Adaptado de LI-COR Biosciences, 2012.

2.4 Protocolo para flash multifásico (MultiPhase Flash)

A medida da fluorescência máxima de folhas adaptadas a luz (Fm’) é

necessária para o cálculo da eficiência quântica efetiva de PSII (PSII) e da

taxa de transporte de elétrons (ETR). Com relação a Fm', ele geralmente é

medido com um único flash de saturação para reduzir o aceptor de elétrons

primário do PSII (QA). Em muitas condições, especialmente em plantas de

campo adaptadas de alta luminosidade, a redução completa do pool de QA é

dificultada e muitas vezes o protocolo padrão que utiliza um flash retangular

não é capaz de alcançar esta condição, nestes casos é sugerida a utilização do

flash de saturação com formato multifásico (Figura 8).


90

Figura 8. Esquema ilustrativo dos diferentes formatos de flash de saturação.

Esquerda: flash retangular; Direita: Flash multifásico. Adaptado de LI-COR

Biosciences, 2012.

O flash multifásico é composto por três fases com diferentes intensidades

luminosas (Q). A fase 1 utiliza alta intensidade, por aproximadamente 250 ms

para reduzir o pool de QA-PQ; A fase 2 é uma rampa de queda de Q que dura

cerca de 500 ms; Na fase 3 a Q do flash retorna ao valor inicial a fim de

garantir que a dissipação não-fotoquímica não foi ativada pelo flash. Com os

valores de Fm’ obtidos na fase 2 é gerada uma regressão, que, quando

extrapolada, intercepta o eixo y em um gráfico de fluorescência vs. 1E4/Q

(figura 9). Neste gráfico o ponto do intercepto do eixo y é tido como um valor de

Fm’ obtido com uma Q que tende ao infinito.


91

Figura 9. Regressão dos valores de Fm' obtidos na fase 2 do flash multifásico,

plotados vs. 1E4/Q e extrapolados para estimar a fluorescência máxima na

intensidade do flash que tende ao infinito. Adaptado de LI-COR Biosciences,

2012.

O adequado ajuste da regressão é atestado por um valor elevado de r2

que pode ser obtido adequando os tempos de duração, intensidade de cada

fase do flash e especialmente adequando a porcentagem de queda da rampa.

A configuração do flash multifásico pode ser feita na linha 8, f2 “Flr

Editor”; em flash selecione o “type” alterando-o para “Multiphase”, defina a

porcentagem da rampa bem como a duração de cada fase. Uma boa

porcentagem de queda da rampa situa-se entre 15% e 40%.

Para visualizar o flash obtido, na linha 0 aperte f5 “View Fsh/Drk”. Na tela

serão exibidos os detalhes do flash. Aperte f1 “View Graph”. Na tela “Flr Event

Viewer” aperte F para “latest Flash” D “latest Dark Pulse” e P para “Previously

stored file”. Para visualizar a regressão obtida na linha 0 aperte f5 “View

Fsh/Drk” na tela que exibe os detalhes do flash. Aperte f3.

2.5 Medida da fluorescência da clorofila

As medidas de fluorescência da clorofila a iniciam-se com a folha

adaptada ao escuro. Esta adaptação é feita pela manutenção das folhas em

ausência de luminosidade e pode ser obtida diretamente com a folha clipada a

LCF, ou com a utilização de clips de papel apropriados que acompanham o

equipamento (9964-091 dark adapting clip kit).


92

Nesta fase registramos os parâmetros Fo (Fluorescência com todos os

aceptores do fotossistema II (PS II) “abertos”; QA’s totalmente oxidadas). Para

esta medida os dois LEDs representando a Meas (Figura 1) estarão ligados.

Com a folha ainda adaptada ao escuro será obtida a fluorescência

máxima da clorofila (Fm) através da aplicação de um flash de saturação, de

modo que todos os aceptores do PS II tenham sido “fechados” (QA’s totalmente

reduzidas).

Entre no menu “New Msmnts”, na linha 8 aperte f4 para selecionar “Msr

Adjust”, neste menu será inserida a intensidade de “Meas” definida no

protocolo “Optimum Meas Intensity” descrito acima. Os LEDs responsáveis

pela “Meas” são modulados (ligam e desligam) muito rapidamente e é permitido

ao usuário escolher a frequência de modulação (0,25, 1, 10 ou 20 kHz). Esta

luz vermelha modulada é referida como “a luz de medida”. Em frequências

elevadas a quantidade de radiação fornecida aumenta e pode levar ao início da

dissipação fotoquímica da energia, o que acarretaria em medidas errôneas de

Fo, desta forma é recomendado que para a determinação deste parâmetro seja

utilizada a frequência de 0,25 KHz de “Meas”.

Para as definições do flash de saturação e determinação de Fm ainda na

linha 8 aperte f2 para acessar “Flr Editor”. Será exibido como padrão o flash do

tipo retangular, você poderá altera-lo para Multiphase-flash caso necessário.

Defina a intensidade de acordo com o obtido no protocolo “Optimum Flash

Intensity”. A frequência dos LEDs para o flash de saturação deve ser mantida

em 20 kHz.

Abra um arquivo para salvar suas leituras: na linha 1 aperte f1 “Open

LogFile”. Na linha 9 você observará “meas is on”; “actinic is off”; e “far red is

off”. Nas medidas com adaptação ao escuro necessariamente “actinic” deverá

estar “off” para que nenhuma radiação em excesso seja fornecida a folha, isso

habilitará os comandos para as leituras de Fo e Fm, presentes na linha 0. Na

linha 0 aperte f3 “Do Fo Fm” para registrar Fo e aplicar o flash para

determinação de Fm, ou registre um por vez apertando f1 “Do Fo” e f2 “Do Fm”,

nunca na ordem inversa.

Inicie a adaptação da folha a condição luminosa. Na linha 8 aperte f3,

“Define Actinic”, selecione PAR, em “Target” entre com o valor de radiação

(PAR) previamente definido em uma curva de luz, (ver próximo capítulo) aperte


93

f5 “Keep”. Repare que na linha 9 aparecerá “Actinic is ON” na posição f4. Isso

ligará os LEDs azuis e vermelhos no interior da LCF e habilitará os comandos

para leituras com a folha adaptada a luz presentes na linha 0.

OBS: para as leituras dos parâmetros de fluorescência da clorofila com a

folha adaptada à luz, o IRGA deve estar devidamente ajustado para a

realização de medidas de trocas gasosas, uma vez que, uma boa medida

destes parâmetros necessita que a dissipação fotoquímica esteja estável. Faça

a checagem do equipamento conforme o fabricante (LI-COR Bioscience, 2012)

e como detalhado em Capelin et al. (2017) (Check-list de preparação).

Quando os parâmetros de trocas gasosas estiverem estáveis aperte f4

“Do Fs Fm’ Fo’” na linha 0. Observe que os parâmetros relacionados a folha

adaptada à luz são seguidos por um (’). Para a determinação de Fo’ é utilizado

um período de escuro e um período no qual o LED no comprimento de onda do

vermelho-distante (far red) se acende. Ele é responsável por estimular a

drenagem dos elétrons na cadeia transportadora, promovendo a re-oxidação

de todas as QA’s, gerando um novo valor mínimo de fluorescência, desta vez

em folhas adaptadas a luz.


94

Referências

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RUBAN, A.V. Nonphotochemical chlorophyll fluorescence quenching: mechanism and effectiveness in protecting plants from photodamage. Plant Physiology, v. 170, p. 1903-1916, 2016.


96

CAPÍTULO 12

CURVA FOTOSSINTÉTICA DE RESPOSTA À LUZ

(CURVA A-Q): CONSIDERAÇÕES TEÓRICAS E PASSO

A PASSO PARA EXECUÇÃO

Gabriel Silva Daneluzzi1, Diogo Capelin1, Ricardo Ferraz de










1. Introdução

As medidas de trocas gasosas usando analisadores de gases por

infravermelho é uma técnica bastante difundida e de fácil uso para

determinação de parâmetros importantes para o entendimento da fisiologia de

uma planta. Entre eles, taxa e eficiência fotossintéticas e componentes

fisiológicos e bioquímicos que são limitantes ao processo. Além disso, o uso de

fluorômetros ampliou a capacidade de avalição da fotossíntese (LONG;

BERNACCHI, 2003).

Duas abordagens podem ser utilizadas: medidas pontuais e as curvas de

resposta. Nessa última, medidas são feitas variando a concentração de um

substrato da fotossíntese (CO2) ou da fonte energética (luz). A curva

fotossintética de resposta à luz (A-Q) descreve a assimilação líquida de CO2

(A, µmol CO2 m-2 s-1) por uma folha como uma função de alterações na


97

intensidade luminosa (Q, µmol fótons m-2 s-1), ou seja, a densidade de fluxo de

fótons fotossintéticos (DFFF).

Muitos modelos matemáticos têm sido usados para descrever curvas A-Q

e os parâmetros calculados a partir delas são usados para descrever a

capacidade fotossintética, eficiência etc. Lobo et al. (2013) apresenta os

modelos matemáticos mais comuns para ajuste de curva A-Q utilizando a

função Solver do Microsoft Excel. O trabalho é acompanhado de planilhas do

Excel que permitem escolher a curva A-Q mais ajustada, selecionando-a pelo

menor valor da soma dos quadrados dos erros, que é uma medida estatística

da discrepância entre os dados e um modelo de estimativa.

A curva A-Q pode fornecer parâmetros como taxa de respiração no

escuro, ponto de compensação de luz (valor de luz no qual o CO2 assimilado

pela fotossíntese está em equilíbrio com o CO2 produzido pela respiração na

luz e fotorrespiração), eficiência quântica (obtida pela inclinação inicial da

curva) e taxa fotossintética máxima (Amax) (LI-COR Biosciences, 2012; LOBO et

al., 2013).

Em alguns casos, depois de atingir o valor Amax, um subsequente

decréscimo de A com aumento de intensidade luminosa, referido como

fotoinibição, pode ser observado (Ye, 2007).

Segundo Lobo et al. (2013), não há um modelo matemático definitivo para

descrever a curva A-Q que possa ser empregado em todas as situações.

Vários pesquisadores têm desenvolvidos esses modelos e ano após anos eles

são aprimorados. Por isso, nunca deixe de consultar a literatura.

Este capítulo traz orientações para a execução da curva fotossintética de

resposta à luz no IRGA LI-6400XT (LI-COR Biosciences, Lincoln, EUA)

seguindo instruções do fabricante (LI-COR Biosciences, 2012).

2. Considerações operacionais

2.1 Curva rápida

Esse método se aproveita do fato que o aparato fotossintético responde

quase imediatamente a luz, especialmente decréscimos de luz, assim a curva

se desenvolve de maneira rápida, como o nome sugere.

Comece com a folha equilibrada a alta intensidade luminosa, ou seja,

aguarde até que a abertura estomática e a assimilação estejam estáveis.


98

Diminua a luz gastando um ou dois minutos em cada ponto, decrescendo 200

µmol m-2 s-1 ou menos. Ao fazer isso, você vai perceber que os estômatos não

tiveram tempo de se ajustar e tendem a estarem mais abertos nos valores de

baixa luminosidade do que normalmente estariam. Isso se manifesta como um

Ci (fração molar do CO2 intercelular) que aumenta progressivamente ao longo

da medição. Isso não é errado, porém os valores de condutância estomática

não são reequilibrados em cada novo ponto da curva, ou seja, tome cuidado

com seu uso.

2.2 Curva lenta

Nessa abordagem, os estômatos tem tempo para se equilibrarem em

cada nível de luz. Você pode usar o Ci como indicador de equilíbrio estomático

para fazer o registro de cada ponto, na medida em que o Ci ficará

razoavelmente constante ao longo da curva, desde que você espere (algo que

pode levar de 15 a 20 minutos em cada nível luminoso – por isso a curva é

lenta).

Dessa maneira você pode começar com alta intensidade luminosa e ir

decrescendo, ou com a luz desligada, em seguida, ligando-a, e aumentando o

seu nível gradativamente.

2.3 Luz

A melhor fonte de luz para realizar essa curva é a 6400-02B (vermelha +

azul) ou a 6400-40 LCF (fluorômetro, que também possui LEDs vermelhos e

azuis). A fonte 6400-02 contém somente LEDs vermelhos, o que causa

fechamento estomático além do normal à medida que a luz diminui, ou retarda

a abertura estomática à medida que a luz aumenta. Para mais detalhes sobre a

influência da luz azul na abertura estomática veja a revisão de Zeiger (1983).

2.4 CO2

Mantenha a concentração de CO2 na câmara constante. Use o mixer

controlando Sample CO2. Do contrário, os efeitos do dióxido de carbono na

fotossíntese serão confundidos com os efeitos da luz.


99

2.5 Temperatura

Mantenha constante a temperatura da folha. Isso pode ser feito

indiretamente controlando a temperatura do bloco. Pela nossa experiência, o

controle da temperatura do bloco mantém a temperatura da folha relativamente

constante. É mais difícil de obter estabilidade controlando a temperatura da

folha diretamente.

2.6 Umidade

Isso pode ser feito com o próprio LI-6400. Opere o controle do fluxo pela

fração molar de água. Se a curva vai da luz para o escuro, as taxas de

condutância estomática e transpiração vão cair, então deixe uma margem para

o fluxo cair também. Se for do escuro para a luz as taxas aumentarão e o fluxo

também aumentará (ocorrerá de modo automático pelo controle do

equipamento).

Caso você disponha de um LI-610 Portable Dew Point Generator (gerador

de ponto de orvalho) ou outro equipamento que forneça ar com umidade

controlada, você pode utilizá-lo na entrada de ar do LI-6400.

Faça a checagem do equipamento conforme o fabricante (LI-COR

Biosciences, 2012) e como detalhado em Capelin et al. (2017) (Check-list de

preparação). Dê atenção especial a vazamentos.

Você pode fazer a curva manualmente, alterando os valores de luz e

registrando cada ponto quando as leituras estiverem estáveis. Antes de iniciar

a curva manual ou automática, espere a folha atingir um estado estável:

fotossíntese e condutância estomática sem tendência de aumento ou

diminuição e coeficiente de variação das medidas (TotalCV) de valor baixo.

Isso assegura que os estômatos estejam abertos e que enzimas e envolvidas

na fixação de CO2 estejam completamente ativas (JOHNSON; MURCHIE,

2011).

2.7 Passo a passo da curva de luz rápida automática (Autoprogram)

Controle o valor de CO2, luz, fluxo de ar, umidade e temperatura. Ajuste a

razão estomática e a área foliar. Faça o Match dos IRGAs.


100

Abra um arquivo (Open LogFile) e dê um nome a ele. Vá na linha 5,

AUTO PROG. Escolha a opção Light Curve2. Aparecerá a seguinte

mensagem: Append to the current log file? Pressione Y. Se preferir, você pode

ir direto em AUTO PROG, Light Curve2 e nomear o arquivo. A partir daí você

estará no menu de configuração da curva.

Em Summary, em Lamp control, selecione PAR. Em SetPts, escolhas os

valores de intensidade luminosa total e a intensidade de luz azul (em % ou

µmol). Use 0 para quantidade em µmol ou 1 para porcentagem. Entre com os

valores como o exemplo: 2000, 10, 1. Isso significa que esse ponto será de

2000 µmol m-2 s-1 de luz total, com 10% de luz azul, sendo o restante vermelha

(caso você esteja usando as fontes de luz 6400-02B ou 6400-40 LCF). Nas

linhas de baixo coloque os próximos valores. O mais comum é trabalhar com

10% de azul (padrão do equipamento). Mas isso não impede de você ajustar os

valores conforme o objetivo de sua pesquisa.

Em Stability wait, escolha os valores mínimo e máximo. Para o valor

mínimo, 120 segundos é geralmente adequado. Este é o tempo que o sistema

irá aguardar em cada ponto para checar a estabilidade antes de registrar as

medidas. Para o tempo máximo, 200 segundos é adequado. Este é o máximo

que o sistema aguardará pela estabilidade antes do registro. Escolha a ação do

Log e os critérios de estabilidade.

Em Log Opts, escolha entre Beep on ou off, para ouvir, ou não, um som

quando for registrada uma medida. Em Match, as opções são Never, Always ou

“If one of…”. Never significa nunca fazer o Match, Always, sempre fazê-lo. Na

terceira opção, você pode escolher que o Match seja feito em algumas

situações, são elas: Elapsed time (tempo decorrido), CO2 change (mudança de

CO2) e CO2 (variação de CO2 entre amostra e referência). Na dúvida, escolha

essa opção e deixe os padrões do equipamento. Match sempre não é

obrigatório, porém não escolha a opção Never.

Depois de se certificar que esteja tudo certo, pressione START (f5) e o

equipamento fará automaticamente a curva de resposta à luz.

Se você desejar ver o gráfico da curva sendo feito, selecione na linha 1 a

opção VIEW FILE (f2), Import GrafDef (f1), Light curve. Pressione SELECT. É

necessário sair do gráfico (escape) para que a curva siga adiante. A cada novo


101

ponto registrado, vá em VIEW FILE (f2) e pressione REPLOT GRAPH (f2) para

vê-lo novamente. Retorne ao menu de medidas.

Na linha k é possível acompanhar nas opções Program e ProgPrgs a

contagem de tempo para cada etapa e o progresso da curva com o os pontos

já feitos, respectivamente. Após o término da curva, feche o arquivo: Linha 1,

Close File (f3).


102

Referências

CAPELIN, D.; DANELUZZI, G.S.; OLIVEIRA, R.F.; BRESSAN, D.F.; CORRÊA, C.V.; JOCA, T.A.C.; ALVES, M.S.; BROETTO, F. Utilização do IRGA - Analisador de gases por infravermelho para avaliação de trocas gasosas em plantas: Check list de preparação. In: BROETTO, F.; GOMES, E.R.; JOCA, T.A.C. (Orgs.) O Estresse das Plantas - Teoria e Prática. São Paulo: Cultura Acadêmica, 2017. cap. 13, p.187-194.

JOHNSON, G.; MURCHIE, E. Gas Exchange Measurements for the Determination of Photosynthetic Efficiency in Arabidopsis Leaves. In. Jarvis, R.P. (Ed.) Chloroplast Research in Arabidopsis: Methods and Protocols, Volume II. New York: Springer, 2011. Cap. 17. p. 311- 326.


LOBO, F.A.; BARROS, M.P.; DALMAGRO, H.J.; DALMOLIN, A.C.; PEREIRA, W.E.; Souza, E.C.; VOURLITIS, G.L.; RODRÍGUEZ-ORTÍZ, C.E. Fitting net photosynthetic light-response curves with Microsoft Excel – a critical look at the models. Photosynthetica, v. 51, n. 3, p. 445–456, 2013.

LONG, S.P.; BERNACCHI, C.J. Gas exchange measurements, what can they tell us about the underlying limitations to photosynthesis? Procedures and sources of error. Journal of Experimental Botany, v. 54, n. 392, p. 2393-2401, 2003.

YE, Z.-P. A new model for relationship between irradiance and the rate of photosynthesis in Oryza sativa. Photosynthetica, v. 45, n. 4, p. 637-640, 2007.

ZEIGER, E. The biology of stomatal guard cells, Annual Review of Plant Physiology, v. 34, p. 441-75, 1983.


103

CAPÍTULO 13

CURVA FOTOSSINTÉTICA DE RESPOSTA AO CO2

(CURVA A-CI): CONSIDERAÇÕES TEÓRICAS E PASSO

A PASSO PARA EXECUÇÃO

Gabriel Silva Daneluzzi1, Diogo Capelin1, Ricardo Ferraz de










1. Introdução

A fotossíntese é um processo que pode ser rotineiramente avaliado em

tempo real em plantas intactas pelas técnicas de trocas gasosas e

fluorescência da clorofila, que fornecem informações detalhadas de suas

diversas etapas. Isso é feito por meio de analisadores de gases por

infravermelho (infrared gas analyzer - IRGA) acoplados, muitas vezes, a

fluorômetros.

Os equipamentos disponíveis no mercado são sistemas abertos,

portáteis, de fácil uso e permitem um alto grau de controle do ambiente foliar,

incluindo concentração de CO2, luz, umidade e temperatura. Entre eles

podemos citar: LI-6400XT e LI-6800 (LI-COR, Lincoln, EUA), GFS-3000

(WALZ, Effeltrich, Alemanha), LCpro-SD e LCi-SD (ADC Bioscientific,

Hoddesdon, Inglaterra) e CIRAS-3 (PP Systems, Amesbury, EUA) (LONG;

BERNACCHI, 2003).


104

O princípio básico de funcionamento é o mesmo, independentemente do

sistema. Uma folha intacta aderida à planta é colocada em uma câmara

hermética e ar com concentrações conhecidas de CO2 e H2O é passado

através dessa câmara com uma vazão constante. A quantidade de CO2 e H2O

produzidos ou consumidos na câmara é medida como diferenças na

absorbância nos analisadores por infravermelho (JOHNSON; MURCHIE,

2011).

Dessa maneira o equipamento fornece medidas em tempo real de

assimilação de carbono (A, µmol m-2 s-1), condutância estomática (gs, mol m-2 s-

1), transpiração (E, mmol m-2 s-1), fração molar do CO2 intercelular (Ci µmol

mol-1) entre outras (LONG; BERNACCHI, 2003).

O método mais frequentemente utilizado para entender como a

fotossíntese de plantas C3 responde a variações ambientais é o modelo de

Farquhar, von Caemmerer e Berry (FARQUHAR et al., 1980). Ele descreve a

fotossíntese como sendo limitada pela rubisco ou pela regeneração de RUBP

(ribulose 1,5-bisfosfato). Uma terceira limitação, uso de triose-fosfato, foi

adicionada por Sharkey (1985).

Curvas fotossintéticas de resposta ao CO2, mais conhecidas como curvas

A-Ci, são adequadas para avaliar esses três mecanismos e fornece uma série

de informações sobre a fisiologia e bioquímica de uma planta (SHARKEY,

2016). Teoricamente, cinco parâmetros podem ser estimados a partir dessas

curvas em plantas C3: taxa máxima de carboxilação da rubisco (Vcmax), taxa

máxima de transporte de elétrons para uma dada intensidade luminosa (J),

taxa máxima de uso de triose-fosfato (TPU), respiração diurna (Rd) e

condutância mesofílica (gm) (SHARKEY, 2016).

Para mais detalhes consulte o trabalho de Sharkey et al. (2007), que

fornece uma explicação detalhada de como modelar a curva A-Ci e estimar os

parâmetros acima citados, além de Sharkey (2016), que fornece uma planilha

em Excel com os cálculos para curva de CO2, além de curva de luz.

Uma abordagem mais detalhada está disponível no material suplementar

em Bellasio et al. (2016b), que fornece uma série de planilhas que permitem a

estimativa de muito mais parâmetros. Bellasio et al. (2016a) fornece planilhas

para cálculos relacionados a curva A-Ci e de luz para plantas C4.


105

O presente capítulo traz orientações para a execução da curva A-Ci no

IRGA LI-6400XT (Open versão 6.3.4) seguindo instruções do fabricante (LI-

COR Biosciences, 2012). Considerações a serem feitas quando for realizar

uma curva de resposta ao CO2.

2. IRGA LI-6400XT

2.1 Luz

Mantenha a luz constante durante a curva. Como o comportamento

estomático não é tão importante nesse caso, desde que os estômatos estejam

razoavelmente abertos, a câmara 6400-02 LED, que contém apenas luz

vermelha, funcionará igualmente bem a que contém luzes azuis e vermelhas

6400-02B LED.

2.2 CO2

Use o mixer no modo de controle do CO2 na referência (CO2R). Defina a

ordem que a curva vai ser realizada. Algumas considerações devem ser feitas.

Altas concentrações de CO2 podem induzir fechamento estomático, portanto

elas devem ficar no final da curva. Ademais, se muito tempo é gasto perto do

ponto de compensação de CO2, pode haver desativação enzimática. Um

esquema de medida sugerido é: começar com CO2 em concentração ambiente,

reduzir sua concentração ao ponto de compensação de CO2, retornar a

concentração ambiente e então aumentar até o limite superior.

2.3 Temperatura

Esta curva deve ser realizada sob temperatura constante. Você pode

escolher entre controlar a temperatura do bloco ou da folha. Geralmente, o

controle da temperatura do bloco mantém a temperatura da folha relativamente

constante. Controlando a temperatura da folha, as medidas demoram mais a

estabilizar, uma vez que esse controle é feito de forma indireta, onde o

equipamento altera a temperatura do bloco até que a temperatura da folha

atinja a temperatura alvo.


106

2.4 Controle da umidade

Isso pode ser feito com o próprio LI-6400. No ajuste do fluxo de ar,

selecione o controle da fração molar de água e escolha o valor desejado. É

provável que haja maiores taxas de condutância estomática e transpiração em

valores baixos de CO2, então escolha um valor de fração molar que forneça

uma taxa de fluxo que possa ser aumentada (automaticamente pelo

equipamento).

Caso você disponha de um gerador de ponto de orvalho, por exemplo, LI-

610 Portable Dew Point Generator, ou outro equipamento que forneça ar com

umidade controlada, você pode utilizá-lo na entrada de ar do LI-6400.

2.5 Match

Faça antes de cada medida já que a concentração de CO2 estará

mudando bastante. Faça a checagem do equipamento conforme o fabricante

(LI-COR Biosciences, 2012) e como detalhado em Capelin et al. (2017) (Check-

list de preparação). Dê atenção especial a vazamentos.

Você pode fazer a curva manualmente, alterando os valores de CO2 na

referência e registrando cada ponto quando as leituras estiverem estáveis.

Antes de iniciar a curva manual ou automática, espere a folha atingir um estado

estável: fotossíntese e condutância estomática sem tendência de aumento ou

diminuição e coeficiente de variação das medidas (TotalCV) de valor baixo

(<5%). Lembre-se, quanto maior a diferença entre o ambiente em que a planta

está e as condições ambientais da câmara, mais tempo será necessário para

as medidas ficarem estáveis.

2.6 Passo a passo da curva automática (Autoprogram)

Escolha o valor de luz, que deve ser saturante (usualmente maior que

1500 μmol m-2 s-1 para plantas C3). Se você fez curvas de luz em suas plantas

(ver capítulo anterior), o valor saturante é aquele que resultou na máxima

assimilação de carbono.

Escolha o valor de fluxo desejado (μmol s-1), ou controle pela fração molar

de água (mmol mol-1).


107

Defina a temperatura levando em conta as considerações feitas acima.

Ajuste a razão estomática e área foliar. Faça o Match dos IRGAs.

Abra um arquivo (Open LogFile) e dê um nome a ele. Vá na linha 5,

AUTO PROG. Escolha a opção A-Ci Curve2. Aparecerá a seguinte mensagem:

Append to the current log file? Pressione Y.

Ao invés disso, você pode ir direto em AUTO PROG, A-Ci Curve2 e

nomear o arquivo. A partir daí você estará no menu de configuração da curva.

Em Summary, em CO2 control, escolha Reference CO2. Em seguida,

escolha os pontos de CO2. Seguindo o que foi dito acima, você pode usar os

seguintes valores: 400 300 200 100 50 400 400 600 800 1000 1200. Se você

estiver trabalhando com uma planta C4, use 0 ao invés de 50. Note que há dois

pontos de 400 em sequência após o valor mais baixo. Isso deve ser feito para

que a folha tenha tempo de se recuperar após o valor de CO2 baixo.

Posteriormente, esse primeiro valor pode ser descartado. Os valores de

assimilação de carbono nesses pontos de 400 devem ser similares àquele

primeiro valor de 400, onde a planta estava no estado estável.

A literatura traz exemplos diversos de valores de CO2 utilizados em

curvas A-Ci (veja ZENG et al., 2010, MOUALEU-NGANGUE et al., 2017,

GŁOWACKA et al., 2018). Quanto mais pontos na curva, melhores serão as

estimativas nos modelos matemáticos para os cálculos dos parâmetros

derivados da curva A-Ci. Use valores adequados às suas condições.

Depois ajuste o tempo de espera para estabilidade (Stability wait). Para o

tempo mínimo, 60 segundos é geralmente adequado. Este é o tempo que o

sistema irá aguardar em cada ponto para checar a estabilidade antes de

registrar as medidas. Para o tempo máximo, 120 segundos é adequado. Este é

o máximo que o sistema aguardará pela estabilidade antes do registro.

Em Log, deixe selecionado Log. Em Stability definition, escolha os

critérios de estabilidade. Em Log Opts, escolha entre Beep on ou off, para

ouvir, ou não, um som quando for registrada uma medida.

Em Match, escolha entre Never, Always ou “If one of…”. Never significa

nunca fazer o Match, Always, sempre fazê-lo. Na terceira opção, você pode

escolher que o Match seja feito em algumas situações, são elas: Elapsed time

(tempo decorrido), CO2 change (mudança de CO2) e CO2 (variação de CO2

entre amostra e referência). Na dúvida, deixe os padrões do equipamento. É


108

recomendado fazer o Match sempre ou atendendo algumas daquelas

condições.

Após os ajustes feitos, pressione START e o equipamento fará

automaticamente a curva de resposta ao CO2. Se você desejar ver o gráfico da

curva sendo feito, selecione na linha 1 a opção VIEW FILE (f2), Import GrafDef

(f1), A Ci Curve. Pressione SELECT. É necessário sair do gráfico (escape) para

que a curva siga adiante. A cada novo ponto registrado, vá em VIEW FILE (f2)

e pressione REPLOT GRAPH (f2) para vê-lo novamente. Retorne ao menu de

medidas.

Na linha k é possível acompanhar nas opções Program e ProgPrgs a

contagem de tempo para cada etapa e o progresso da curva com o os pontos

já feitos, respectivamente. Após o término da curva, feche o arquivo: linha 1,

Close File (f3).


109

Referências

BELLASIO, C.; BEERLING, D.J.; GRIFFITHS, H. Deriving C4 photosynthetic parameters from combined gas exchange and chlorophyll fluorescence using an Excel tool: theory and practice. Plant, Cell & Environment, v. 39, n. 6, p. 1164-1179, 2016a.

BELLASIO, C.; BEERLING D.J.; GRIFFITHS, H. An Excel tool for deriving key photosynthetic parameters from combined gas exchange and chlorophyll fluorescence: theory and practice. Plant, Cell & Environment, v. 39, n. 6, p. 1180-1197, 2016b.

CAPELIN, D.; DANELUZZI, G.S.; OLIVEIRA, R.F.; BRESSAN, D.F.; CORRÊA, C.V.; JOCA, T.A.C.; ALVES, M.S.; BROETTO, F. Utilização do IRGA - Analisador de gases por infravermelho para avaliação de trocas gasosas em plantas: Check list de preparação. In: Broetto, F.; Gomes, E.R.; JOCA, T.A.C. (Orgs.) O Estresse das Plantas - Teoria e Prática. São Paulo: Cultura Acadêmica, 2017. cap. 13, p.187-194.

FARQUHAR, G.D.; von CAEMMERER, S.; BERRY, J.A. A biochemical model of photosynthetic CO2 assimilation in leaves of C3 species. Planta, v. 149, p. 78-90, 1980.

GŁOWACKA, K.; KROMDIJK, J.; KUCERA, K.; XIE, J.; CAVANAGH, A.P.; LEONELLI, L.; LEAKEY, A.D.B.; ORT, D.R.; NIYOGI, K.K.; LONG, S.P. Photosystem II Subunit S overexpression increases the efficiency of water use in a field-grown crop. Nature Communications, 9:868, 2018.

JOHNSON, G.; MURCHIE, E. Gas Exchange Measurements for the Determination of Photosynthetic Efficiency in Arabidopsis Leaves. In. Jarvis, R.P. (Ed.) Chloroplast Research in Arabidopsis: Methods and Protocols, Volume II. New York: Springer, 2011. cap. 17. p. 311- 326.


LONG, S.P.; BERNACCHI, C.J. Gas exchange measurements, what can they tell us about the underlying limitations to photosynthesis? Procedures and sources of error. Journal of Experimental Botany, v. 54, n. 392, p. 2393-2401, 2003.

MOUALEU-NGANGUE, D.P.; CHEN, T.; STÜTZEL, H. A new method to estimate photosynthetic parameters through net assimilation rate–intercellular space CO2 concentration (A-Ci) curve and chlorophyll fluorescence measurements. New Phytologist, v. 213, n. 3, p. 1543–1554, 2017.

SHARKEY, T.D.; BERNACCHI, C.J.; FARQUHAR, G.D.; SINGSAAS, E.L. Fitting photosynthetic carbon dioxide response curves for C3 leaves. Plant, Cell & Environment, v. 30, p. 1035–1040, 2007.

SHARKEY, T.D. Photosynthesis in Intact Leaves of C3 Plants: Physics, Physiology and Rate Limitations. The Botanical Review, v.51, n. 1, 1985.


110

SHARKEY, T.D. What gas exchange data can tell us about photosynthesis. Plant, Cell and Environment, v. 39, n. 6, p. 1161–1163, 2016.

ZENG, W.; ZHOU, G.S.; JIA, B.R.; JIANG, Y.L.; WANG, Y. Comparison of parameters estimated from A/Ci and A/Cc curve analysis. Photosynthetica, v. 48, n.3, p. 323-331, 2010.

dr. edilson ramos gomes dr. enrique alonso zuñiga drª luz ... · ausência de metais pesados,...

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