SNPse

APLICAÇÕES

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS

CENTRO DE DESENVOLVIMENTO TECNOLÓGICO

CURSO DE BIOTECNOLOGIA

DISCIPLINA DE GENÔMICA II

NÃO É ESTÁTICO

constantemente sujeito a mudanças

MUTAÇÕES

MUTAÇÕES

germinativas somáticas

Alterações no DNA

Mutações espontâneas

Mutações induzidas

agentes mutagênicos

Mutações cromossômicas: mudanças na estrutura ou no número de cromossomos

Mutações gênicas: mudanças em um ou poucos nucleotídeos

MUTAÇÕES GÊNICAS

Inserções e Deleções

Substituições de bases

envolvem a substituição de, normalmente, uma única base

casos raros: várias bases são substituídas

SNPs

Polimorfismos de base única

Frequência de mais de 1% na população

Single Nucleotide Polymorphism

Sequenciamento do Genoma Humano

2 milhões de SNPs

comum

G para C

variante

DNA SNP T para A

Códon no RNAGAU para GUU

AminoácidoAspartato

para Valina

Mudança na proteína

Aspartato Valina

mRNA

C T

G A U G U U

GAU GUU

C AA A

MUTAÇÃO SINÔNIMASubstituição resulta em um novo códon que codifica o

MESMO aminoácido

MUTAÇÃO NÃO SINÔNIMASubstituição resulta em um novo códon que codifica um

aminoácido DIFERENTE

MUTAÇÃO SILENCIOSACódon que especifica um aminoácido é substituído por um

códon de terminação

IMPORTÂNCIA

“Combustível” que dirige a evolução

Causas de anormalidades

Suscetibilidade a doenças

MESTRADO

Variantes polimórficas 2029C>T e 2258G>A no gene que codifica para o TLR2 humano:

avaliação de uma população brasileira e revisão sistematizada

Mestranda HELENA STRELOW THUROW

Orientadora Profa. Dra. Clarice Alho

PPG EM BIOLOGIA CELULAR E MOLECULAR

SEPSE

Problema de saúde pública

Infecção Generalizada

InfecçãoSIRS

Sepse

Buras et al., 2005

sucesso Recuperação

agravamento Danos Irreversíveis/Morte

- febre ou hipotermia

- taquipnéia

- taquicardia

- leucocitose ou

leucopenia

+

18 milhões de casos de sepse por ano

Marcadores Moleculares

Condição frequente

Alto índice de mortalidade

Elevado custo do tratamento

SEPSE

Carpenter et al., 2007

Receptores PRR Toll-like Receptors

Papel chave no início da imunidade inata

Reconhecimento de PAMPs – bactérias, vírus, fungos

Família de pelo menos 12 receptores

Receptores com elevada especificidade

Texereau et al., 2005

cromossomo 4

locus 4q31.3-32

Texe

reau

et

al.,

20

05

Dois SNPs têm sido relacionados ao aumento do risco de infecção. Modelos animais sugerem que uma sinalização defeituosa do TLR2 é um fator para o aumento na susceptibilidade a doenças bacterianas.

2029C>T (Arg677Trp)

Citosina para Timina no nucleotídeo 2029

Arginina para Triptofano no aminoácido 677

Lepra Lepromatosa

[Kang et al., 2001; Kang et al., 2004]

Tuberculose

[Bem-Ali et al., 2004]

Texe

reau

et

al.,

20

05

Dois SNPs têm sido relacionados ao aumento do risco de infecção. Modelos animais sugerem que uma sinalização defeituosa do TLR2 é um fator para o aumento na susceptibilidade a doenças bacterianas.

2258G>A (Arg753Gln)

Guanina para Adenina no nucleotídeo 2258

Arginina para Glutamina no aminoácido 753

Risco para sepse após infecção por bactérias Gram-positivas

[Lorenz, et al., 2000].

Tuberculose [Ogus, et al., 2004];

Restenose [Hamann, et al., 2005];

Doença de Lyme [Schröder, et al., 2005];

Febre Reumática Aguda [Berdeli, et al., 2005];

Transplante de fígado [Eid et al., 2007]

Infecções bacterianas [Kutukculer et al., 2007]

Infecção do trato urinário [Tabel et al., 2007]

• Realizar uma análise da possibilidade de aplicação

clínica da genotipagem dos polimorfismos 2029C>T e

2258G>A do gene do TLR2 como marcadores da sepse

OBJETIVOS

• Realizar um estudo associativo entre os SNPs 2029C>T e 2258G>A do gene do

TLR2 e a suscetibilidade à sepse e/ou aos desfechos críticos a partir da sepse

ESTUDOS DOS PACIENTES

• Pacientes da UTI do Hospital São Lucas da PUCRS (2004 a 2006)

• Extração de DNA a partir de sangue

• 422 pacientes críticos admitidos na UTI

• Máximo de internação: 242 dias

• Comitê de Ética da PUCRS

ESTUDOS DOS PACIENTES

Qual segmento do DNA será amplificado e sequenciado?

2041 ctgtgccacc gtttccatgg cctgtggtat atgaaaatga tgtgggcctg gctccaggcc

2101 aaaaggaagc ccaggaaagc tcccagcagg aacatctgct atgatgcatt tgtttcttac

2161 agtgagcggg atgcctactg ggtggagaac cttatggtcc aggagctgga gaacttcaat

2221 ccccccttca agttgtgtct tcataagcgg gacttcattc ctggcaagtg gatcattgac

2281 aatatcattg actccattga aaagagccac aaaactgtct ttgtgctttc tgaaaacttt

2341 gtgaagagtg agtggtgcaa gtatgaactg gacttctccc atttccgtct ttttgatgag

2401 aacaatgatg ctgccattct cattcttctg gagcccattg agaaaaaagc cattccccag

2461 cgcttctgca agctgcggaa gataatgaac accaagacct acctggagtg gcccatggac

2521 gaggctcagc gggaaggatt ttgggtaaat ctgagagctg cgataaagtc ctaggttccc

2581 atatttaaga ccagtctttg tctagttggg atctttatgt cactagttat agttaagttc

2641 attcagacat aattatataa aaactacgtg gatgtaccgt catttgagga cttgcttact

Gene TLR2 - cromossomo 4 locus 4q31.3-32

2029 C (Arg677): cgg 2258 G (Arg753): cgg

2029 T (Trp677): tgg 2258 A (Gln753): cag

vermelho: primer FORWARD

azul: primer REVERSE

verde: códon da Arg677Trp

amarelo: códon da Arg753Gln

roxo: fragmento de 340pb

Realizar um estudo associativo entre os alelos

2029T e 2258A do gene do TLR2 e a

suscetibilidade à sepse e/ou aos desfechos

críticos a partir da sepse

Realizar uma análise da possibilidade de

aplicação clínica da genotipagem dos

polimorfismos 2029C>T e 2258G>A do gene do

TLR2 como marcadores da sepse

2029C>T (Arg677Trp)

2258G>A (Arg753Gln)

ABI PRISM 3100 Avant Genetic Analyzer, Perkin-Elmer, USA

MegaBase 1000 capillary DNA sequencer, Amersham Biosciences, UK

Fo

rw

ard

Reverse

Fo

rw

ard

Reverse

A

B

Análise do genótipo do SNP 2029C>T por sequenciamento

2029C>T (Arg677Trp)

2029CC = 0.998 (421/422) 2029C = 0.99 (843/844)

2029CT = 0.002 (1/422) 2029T = 0.01 (1/844)

2029TT = 0

2258G>A (Arg753Gln)

2258GG = 1 (422/422) 2258G = 1 (844/844)

2258GA = 0 2258A = 0

2258AA = 0

Não foi possível realizar análise da possibilidade de aplicação clínica da

genotipagem dos polimorfismos como marcadores da sepse

Os resultados da genotipagem não suportam uma

aplicação clínica dos alelos dos SNPs do TLR2

SNPs 2029C>T e 2258G>A não são bons marcadores

genéticos no estudo da sepse na nossa população.

DOUTORADO

Prevalência dos polimorfismos oncogênicos dos éxons 4 a 8 do gene

da p53 no banco de DNA da coorte de 1982, Pelotas – RS e fatores de risco

Doutoranda HELENA STRELOW THUROW

Orientadora FABIANA KÖMMLING SEIXAS

COORTE

Grupo de indivíduos que têm algo em comum ao serem reunidos e que são observados por um determinado período para que se possa avaliar o que ocorre com eles.

Estudos raros Elevado custo

Estudo da Coorte dos indivíduos nascidos na cidade

de Pelotas no ano de 1982

Maior e mais longo estudo de coorte de nascimentos

Acompanhamento desde o nascimento

Informações sobre desenvolvimento e exposições

CÂNCER

Crescimento desordenado de células que invadem os tecidos e órgãos

Células agressivas e incontroláveis

Tumores

ORIGEMEquilíbrio entre a origem e a morte da

célula é direcionado para uma proliferação incontrolada

MALIGNOS

BENIGNOS

Crescimento com invasão de tecidos próximos e espalhamento de metástases

Crescimento localizado e sem invasão a tecidos adjacentes

CÂNCER MORTE

2007 7.9 milhões de mortes

13% de todos os óbitos70% em países de

média ou baixa renda

Estimativa de 12 milhões de mortes

no ano de 2030

principal causa

ESTATÍSTICAS

OMS

PulmãoEstômago

FígadoColorretalEsôfagoPróstata

MamaPulmão

EstômagoColorretalCervical

CAUSAS

Fatores internos e externos ao organismo

Fatores genéticos

Fatores ambientais: radiação, dieta, tabaco

Mutações na p53

GENE TP53

11 éxons e 10 íntrons

20 Kb

cromossomo 17p13.1

P53

393 aminoácidos

53kD

GUARDIÃO DO GENOMA

p53

P53

CÂNCER

Mutações no gene TP53

Mutações em mediadores da P53

Desencadeado por mecanismos

Proliferação incontrolada

Marca universal de tumores

MUTAÇÕES NA P53

IARC

24.785 mutações somáticas

423 mutações germinativas

2300 proteínas mutantes

International Agency for Research on Cancer

95% DAS MUTAÇÕES

5% DAS MUTAÇÕES

CÓDON 72

CCC PROLINA

CGC ARGININA

MUDANÇA NÃO CONSERVATIVA

Éxon 4

80% das mutações

Éxons 5 a 8

30% destas mutações

Códons hot spots

70% destas mutações

Mais de 200 códons

Mutações na p53

Metade de todos os cânceres

Frequência de 5 a 50 %

Eventos iniciais em tecidos premalinos

CÂNCER E P53

Câncer Colorretal Câncer Gástrico

Câncer de Ovário Câncer de Mama

Câncer de Bexiga Câncer de Pulmão

OBJETIVOS

Identificar a freqüência de polimorfismos genéticos da p53, através de técnicasavançadas de Biologia Molecular, na Coorte de 1982 em uma população de adultos jovensque vem sendo estudada desde o nascimento em Pelotas, RS.

GERAL

OBJETIVOS

ESPECÍFICOS

Verificar a freqüência e o perfil dos genótipos do polimorfismo do códon 72 do gene dap53 no banco de DNA de indivíduos nascidos em 1982 incluídos na coorte

Analisar os polimorfismos presentes nos éxons 4 a 8 do gene da p53 no banco de DNAde indivíduos nascidos em 1982 incluídos na coorte

Relacionar os polimorfismos oncogênicos com fatores de riscos ambientais (tabagismomaterno, crescimento uterino, amamentação, ganho de peso, tabagismo, álcool, drogas edieta) durante exposições fetais, infância e aos 23 anos

METODOLOGIA

ORIGEM DOS INDIVÍDUOS

Coorte de 1982

Indivíduos nascidos nas maternidades de Pelotas entre Janeiro e

Dezembro de 1982, incluídos no banco de DNA do Centro de Pesquisas

Epidemiológicas da UFPel

Genotipagem do polimorfismo do códon 72 do gene da p53

digestão – AciI ou SfcI

sangue DNA PCR eletroforese análise em gel

eletroforese

360C

2hClivagem ezimática

BstU I

sangue DNA PCR eletroforese análise em gel

eletroforese

de agarose

análise em gelanálise em gel de agarose

Tabela 1 – Seqüências dos primers para a detecção do polimorfismo do códon 72 no éxon 4

Primer Seqüência* (5’-3’) Tamanho (bp) Referência

72S TTGCCGTCCCAAGCAATGGATGA 199 Anschau et al., 2005

72A TCTGGGAAGGGACAGAAGATGAC

Tabela 2 – Fragmentos do polimorfismo do códon 72 obtidos com a RFLP e seus respectivos

genótipos

Fragmentos

(pb)

Genótipos

Pro/Pro Pro/Arg Arg/Arg

199 Sim Sim Não

113 Não Sim Sim

86 Não Sim Sim

Análise dos éxons 4-8 do gene da p53

sangue DNA PCR eletroforese análise em gelsangue DNA PCR eletroforese análise em gel

anáanálisessequenciamento

de agarose

Tabela 3 – Sequências dos primers gerais dos éxons 4 a 8 do gene da p53.

Tabela 3 – Sequências dos primers gerais dos éxons 4 a 8 do gene da p53.

Primer Seqüência* (5’-3’) Referência

P53_4leftextPCR_F TGAGGACCTGGTCCTCTGAC Lehman et al., 1991

P53_4rightextPCR_R AGAGGAATCCCAAAGTTCCA Lehman et al., 1991

P53_4leftintSEQ_F TGCTCTTTTCACCCATCTAC Lehman et al., 1991

p53_4rghtintSEQ_R ATACGGCCAGGCATTGAAGT Lehman et al., 1991

P53_5/6PCR_F GCCGTGTTCCAGTTGCTTTA Verselis et al., 2000

P53_5/6PCR_R TAAGCAGCAGGAGAA AGCCC Verselis et al., 2000

P53_5/6SEQ_F TGTTCACTTGTGCCCTGACT Lehman et al., 1991

P53_5/6SEQ_R TTAACCCCTCCTCCCAGAGA Lehman et al., 1991

P53_7/8PCR_F CTTGCCACAGGTCTCCCCAA Lehman et al., 1991

P53_7/8PCR_R AGGCATAAC TGCACCCTTGGT Lehman et al., 1991

P53_7/8SEQ_F AGGCGCACTGGCCTCATCTT Lehman et al., 1991

P53_7/8SEQ_R TCCACCGCT TCT TGTCCTGC Bumroongkit et al., 2008

ANÁLISE DOS DADOS

FATORES DE RISCO

Exposições Fetais

Infância

Aos 23 Anos

tabagismo materno na gestação e crescimento intra-uterino

amamentação e ganho de peso

tabagismo, álcool, drogas e dieta

RESULTADOS ESPERADOS

Obtenção das freqüências do polimorfismo do códon 72 do gene da p53

Análise dos polimorfismos presentes nos éxons 4 a 8 do gene da

p53 de DNA de indivíduos da coorte de 1982

Verificação da relação entre os polimorfismos dos éxons 4 a 8 do gene

da p53 e fatores de riscos

BIOTECNOLOGIA

O monitoramento das prevalências de mutações e perfis genéticos das populações promovido através da biotecnologia médica, oferece ferramentas no desenvolvimento de programas avançados de prevenção de riscos e na atenção à saúde baseados nos genomas

e estudos de Coortes.

RESULTADOS

PCR 11PCR 5PCR

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Controle

Negativo

PCR 11PCR 5CLIVAGEM ENZIMÁTICA

Marc

1Kb1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Arg

Arg

Pro

Arg

Pro

Arg

Arg

Arg

Pro

Arg

Pro

Arg

Pro

Arg

Pro

Arg

Arg

Arg

Pro

ProGENÓTIPOS

PCR 11PCR 5SEQUENCIAMENTO

1

Arginina

Arginina

PCR 11PCR 5Amostra 1 – Arginina/Arginina

PCR 11PCR 5Amostra 2 – Prolina/Arginina

2

Prolina

Arginina

PCR 11PCR 5Amostra 9 – Prolina/Prolina

9

Prolina

Prolina