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Prof. Ronald NetoBiomédico – Lab. Citogenética USS
Replicação de Ac. Nucléicos in vitro
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Replicação de DNA
in vivo:
• Biossíntese de DNA a partir de um molde de DNA
• Ocorre na fase S
• Ocorre no sentido 5’ – 3’• contínua• descontínua (Fragmentos de OKASAKI)
• Semi-conservativo
• Várias origens de replicação (A-T)
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Replicação de DNA
Componentes da reação:
• Primer
• Helicase
• DNA Polimerase SIGMA
• Topoisomerase
• Primase
• DNA Ligase
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Replicação de DNA
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Reação em Cadeia da Polimerase – PCR(polymerase chain reaction)
Descoberta:
1983- Kary Banks Mullis
1985- 1º paper (Nature/Science - recusado)
1993 - Nobel da Química
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• Método de amplificação rápida in vitro de seguimentos específicos de ácidos nucléicos.
• Se baseia em uma ação enzimática através de ciclos contínuos de alternância de temperaturas.
PCR
Princípios da metodologia:
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Etapas da PCR:
Coleta e Preparo da Amostra
Extração de DNA
PCR
Detecção e Análise de Resultados
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Enzima - Polimerase termoestável (Tac ou Pfu);
dNTPs - A,T,C,G;
Molde ou Template;
Um ou mais pares de primers;
Tampão e sais;
Cofatores enzimáticos;
TERMOCICLADOR
Componentes da PCR:
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Temperatura:
Desnaturação: 95o C
Hibridização: 60oC
Extensão: 72oC
Vários Ciclos: 30
Condições da PCR:
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PCR
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Video:
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Análise:
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Aplicações:
• Diagnósticos de doenças genéticas e infecciosas;
• Estabelecimento de vínculo genético;
• Genética forense;
• Pesquisa;
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PCR por um mundo melhor