DETERMINACIÓN DE LA TOXICIDAD A UN RESIDUO LÍQUIDO
OBJETIVO: determinación de la toxicidad de un residuo líquido mediante el ensayo de bioluminiscencia de la bacteria Photobacterium phosphoreum. COMENTARIO: Photobacterium phosphoreum es una bacteria gram-negativa anaerobia facultativa, de la familia Vibrionaceae, bastante similar a las enterobacterias terrestres. La característica más peculiar de estas bacterias marinas es la bioluminiscencia, estabilidad de emisión y su gran sensibilidad a una amplia variedad de sustancias tóxicas. La reacción responsable de la producción de luz en presencia de abundante oxígeno es el enzima luciferasa que cataliza la oxidación de un flavinmononucleótido reducido (FMNH2) a una forma oxidada (FMN) con desprendimiento de luz.
FMNH2 + O2 + RCHO → FMN + H2O + RCOOH + luz Esta reacción, y la emisión de luz, está ligada al sistema de transporte electrónico en la respiración metabólica de la bacteria, y por lo tanto una disminución de la bioluminiscencia indicará una disminución de la respiración celular. La estrecha relación existente entre el mecanismo de emisión de luz y el metabolismo celular es el fundamento del test de toxicidad. Cualquier sustancia presente en el medio que pueda alterar (intoxicar) el metabolismo celular, va a introducir una caída en la emisión de la luz de las fotobacterias. El test está basado en la determinación de la influencia de una serie de diluciones de la muestra a examinar en la luminiscencia de las bacterias. A la muestra se le añade NaCl, puesto que las fotobacterias, como organismos marinos, necesitan un determinado contenido salino. Como medida de la toxicidad se utiliza la disminución de la bioluminiscencia que experimentan las preparaciones de fotobacterias, tras un período de incubación de 15 minutos con la muestra a examinar, a una temperatura de 15ºC. El resultado se expresa en forma de EC50, es decir, dilución de la muestra que en contacto con la bacteria reduce su emisión de luz al 50%. Corresponde a una inhibición del metabolismo respiratorio del 50%. La EC50 se expresa en mg/l si se trata de una sustancia pura o bien en % (V/V) si se trata de una muestra ambiental compleja. NORMATIVA COMUNIDAD AUTÓNOMA DE MURCIA En el Anexo III, del Decreto 16/1999, de 22 de abril, sobre vertidos de aguas residuales industriales al alcantarillado, se recogen los valores máximos instantáneos de los parámetros de contaminación, estableciéndose un valor para la toxicidad de 25 Equitox/m3.
1001/50
3
ECmEquitox =
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL Preparación del ordenador: ejecutar el archivo mmstat.exe, que se encuentra dentro del subdirectorio MTX7 Procedimiento de ensayo para una muestra 1.- Preparación del analizador 1.1 Conectar el analizador de toxicidad 1.2 Chequear mediante DATA CAPTURE TEST (del Menú principal), si existe conexión
con el ordenador. 1.3 Colocar las cubetas limpias en el bloque de incubación, en las filas A y B y en la celda
del reactivo (Reagent). 1.4 Añadir 1 ml de disolución de reconstitución en la cubeta del reactivo (Reagent). 1.5 Añadir 0,5 ml de diluyente en las cubetas de la fila B 1.6 Añadir 1,0 ml de diluyente en las cubetas A1, A2, A3 y A4 2.- Preparación de la muestra 2.1 Añadir 2,5 ml de muestra a la cubeta A5 2.2 Añadir 0,25 ml de moas (ajustador osmótico) a la cubeta A5 y mezclar. 3.- Dilución seriada de la muestra (factor de dilución 2) 3.1 Trasvasar 1 ml de la cubeta A5 a A4 y mezclar 3.2 Trasvasar 1 ml de la cubeta A4 a A3 y mezclar 3.3 Trasvasar 1 ml de la cubeta A3 a A2 y mezclar 3.4 La cubeta A1 es el blanco 3.5 Esperar 5 minutos 4.- Preparación de las bacterias 4.1 Sacar las bacterias del congelador 4.2 Quitar el tapón sellador del vial 4.3 Tomar la cubeta que contiene el reconstituyente en la celda “reagent” 4.4 Verter el contenido de la cubeta de reconstituyente, de golpe, sobre el vial de
bacterias. No verter lentamente, sino de golpe. 4.5 Agitar el vial varias veces con la mano y volcar el contenido sobre la cubeta. 4.6 Con la pipeta de 500 µl mezclar 10 veces para homogeneizar la suspensión. NOTA: los pasos del punto 4 sólo es necesario realizarlos al comenzar a medir la
primera muestra. Para posteriores muestras, no es necesario repetirlos. 5.- Trasvase de las bacterias 5.1 Trasvasar 10 µl de bacterias reconstituidas a cada cubeta de la fila B. 5.2 Mezclar las cubetas de la fila B agitando con los dedos. 5.3 Dejar atemperarse las cubetas 15 minutos para que las bacterias estabilicen su emisión
de luz. 6.- Preparación del programa 6.1 Cargar el programa del Test Básico 6.2 Seleccionar: START TESTING
Número de tests: 1 Introducir un nombre para el archivo donde se almacenará la información del test. 6.3 Establecer los parámetros del test: Layout: Número de controles (1) Número de diluciones (4) Duplicados (NO) Tiempo del test (15) Información sobre la muestra: Concentración inicial (45 si se utiliza MOAS, 50 si no se utiliza) Factor de dilución (2) Tabla de concentración Unidades (%) Ajuste osmótico (X) 7.- Protocolo del test 7.1 Tomar la cubeta B1 e introducirla en la celda del fotomultiplicador. Pulsar SET. 7.2 Pulsar la barra espaciadora del teclado. 7.3 Leer los niveles de luz a tiempo cero de las cubetas B1 a B5 introduciéndolas en la
celda del fotomultiplicador a medida que lo indique el ordenador y pulsando la tecla READ a continuación.
7.4 Trasvasar 0’5 ml de: A1 a B1 y mezclar 2 veces con la pipeta A2 a B2 y mezclar A3 a B3 y mezclar A4 a B4 y mezclar A5 a B5 y mezclar en estas operaciones se puede usar la misma punta de pipeta. 7.5 Pulsar la barra espaciadora del teclado. 7.6 Cuando el reloj del ordenador suene, leer los niveles de luz de las cubetas B1 a B5,
introduciéndolas en la celda del fotomultiplicador a medida que lo indique el ordenador y pulsando la tecla READ a continuación.
8.- Resultados En el menú principal escoger la opción RUN STATISTICS ON A DATA FILE, y
cargar el archivo donde se han grabado los datos del análisis de nuestra muestra (el nombre del archivo fue introducido en el apartado 6.2).
El programa calcula el EC50 (concentración de muestra que reduce al 50% la emisión
de luz). Es conveniente que este valor esté comprendido entre las concentraciones de las diluciones de muestra preparadas (las 4 diluciones seriadas preparadas de la muestra son: 5’6, 11’25, 22’5 y 45; es conveniente para tener un dato más exacto que el EC50 esté comprendido entre 5’6 y 45).
A partir de EC50, el programa calcula las Unidades de Toxicidad:
100150EC
ToxicidaddeUnidades =
CÁLCULO DE EC50 El programa utilizado da directamente el valor de EC50, sin embargo este valor puede ser calculado a partir de los valores medidos de emisión de luz. Para ello es preciso construir la siguiente tabla:
Cubeta C (%) t = 0 t = 15 min Γ(t) ln C Ln Γ(t) B1 0 I(0)b I(t)b B2 5,625 I(0) I(t) B3 11,25 I(0) I(t) B4 22,5 I(0) I(t) B5 45 I(0) I(t)
I(0)b= intensidad de luz emitida a t = 0 por la cubeta B1 I(0)= intensidad de luz emitida a t = 0 por las cubetas B2 a B5 I(t)b= intensidad de luz emitida por la cubeta B1, 15 minutos después de la adición de
0,5 ml procedentes de la cubeta A1 I(t)= intensidad de luz emitida por las cubetas B2 a B5, 15 minutos después de la
adición de 0,5 ml procedentes de las cubetas A2 a A5.
Si se representa ln C frente a ln Γ(t), por regresión lineal se obtiene la ecuación de una recta:
Donde a es la ordenada en el origen y b la pendiente de dicha recta. Como la EC50 representa la dilución de la muestra original que provoca un 50% de reducción de la tasa de emisión de luz, quiere decir que la luz perdida es igual a la luz remanente. Por tanto Γ(t) es igual a 1, y su correspondiente logaritmo es cero. Con ello se obtiene que ln C = a, o lo que es lo mismo C = ea. Ese valor corresponde a la EC50. EQUIPO INSTRUMENTAL UTILIZADO • Analizador de Toxicidad MICROTOX M 500 • Micropipeta de 10 µl • Pipeta regulable: 100 - 1000 µl • Puntas de pipeta • Cubetas de vidrio
b
bI
tItR )0()()( =
[ ] 1)()0()(
)()()0()()( −⎥⎦
⎤⎢⎣⎡=−==Γ tI
ItRtI
tIItRremanenteluz
perdidaluzt
)(lnln tbaC Γ+=
REACTIVOS UTILIZADOS • Bacteria liofilizada: Photobacterium phosphoreum • Disolución de reconstitución: agua ultrapura. • Diluyente: disolución que contiene un 2% de NaCl • Ajustador osmótico: disolución que contiene un 22% de NaCl • Muestra suministrada por el profesor de prácticas para determinación de su toxicidad. NORMALIZACIÓN DEL ENSAYO DE TOXICIDAD Norma ASTM D 5660-95 Norma AFNOR T90-320 Norma DIN 38412
