Determinação Da Toxicidade de Um Resíduo Líquido

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Roteiro de prtica de laboratrio

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<ul><li><p>DETERMINACIN DE LA TOXICIDAD A UN RESIDUO LQUIDO </p><p>OBJETIVO: determinacin de la toxicidad de un residuo lquido mediante el ensayo de bioluminiscencia de la bacteria Photobacterium phosphoreum. COMENTARIO: Photobacterium phosphoreum es una bacteria gram-negativa anaerobia facultativa, de la familia Vibrionaceae, bastante similar a las enterobacterias terrestres. La caracterstica ms peculiar de estas bacterias marinas es la bioluminiscencia, estabilidad de emisin y su gran sensibilidad a una amplia variedad de sustancias txicas. La reaccin responsable de la produccin de luz en presencia de abundante oxgeno es el enzima luciferasa que cataliza la oxidacin de un flavinmononucletido reducido (FMNH2) a una forma oxidada (FMN) con desprendimiento de luz. </p><p>FMNH2 + O2 + RCHO FMN + H2O + RCOOH + luz Esta reaccin, y la emisin de luz, est ligada al sistema de transporte electrnico en la respiracin metablica de la bacteria, y por lo tanto una disminucin de la bioluminiscencia indicar una disminucin de la respiracin celular. La estrecha relacin existente entre el mecanismo de emisin de luz y el metabolismo celular es el fundamento del test de toxicidad. Cualquier sustancia presente en el medio que pueda alterar (intoxicar) el metabolismo celular, va a introducir una cada en la emisin de la luz de las fotobacterias. El test est basado en la determinacin de la influencia de una serie de diluciones de la muestra a examinar en la luminiscencia de las bacterias. A la muestra se le aade NaCl, puesto que las fotobacterias, como organismos marinos, necesitan un determinado contenido salino. Como medida de la toxicidad se utiliza la disminucin de la bioluminiscencia que experimentan las preparaciones de fotobacterias, tras un perodo de incubacin de 15 minutos con la muestra a examinar, a una temperatura de 15C. El resultado se expresa en forma de EC50, es decir, dilucin de la muestra que en contacto con la bacteria reduce su emisin de luz al 50%. Corresponde a una inhibicin del metabolismo respiratorio del 50%. La EC50 se expresa en mg/l si se trata de una sustancia pura o bien en % (V/V) si se trata de una muestra ambiental compleja. NORMATIVA COMUNIDAD AUTNOMA DE MURCIA En el Anexo III, del Decreto 16/1999, de 22 de abril, sobre vertidos de aguas residuales industriales al alcantarillado, se recogen los valores mximos instantneos de los parmetros de contaminacin, establecindose un valor para la toxicidad de 25 Equitox/m3. </p><p>1001/50</p><p>3</p><p>ECmEquitox =</p></li><li><p>PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL Preparacin del ordenador: ejecutar el archivo mmstat.exe, que se encuentra dentro del subdirectorio MTX7 Procedimiento de ensayo para una muestra 1.- Preparacin del analizador 1.1 Conectar el analizador de toxicidad 1.2 Chequear mediante DATA CAPTURE TEST (del Men principal), si existe conexin </p><p>con el ordenador. 1.3 Colocar las cubetas limpias en el bloque de incubacin, en las filas A y B y en la celda </p><p>del reactivo (Reagent). 1.4 Aadir 1 ml de disolucin de reconstitucin en la cubeta del reactivo (Reagent). 1.5 Aadir 0,5 ml de diluyente en las cubetas de la fila B 1.6 Aadir 1,0 ml de diluyente en las cubetas A1, A2, A3 y A4 2.- Preparacin de la muestra 2.1 Aadir 2,5 ml de muestra a la cubeta A5 2.2 Aadir 0,25 ml de moas (ajustador osmtico) a la cubeta A5 y mezclar. 3.- Dilucin seriada de la muestra (factor de dilucin 2) 3.1 Trasvasar 1 ml de la cubeta A5 a A4 y mezclar 3.2 Trasvasar 1 ml de la cubeta A4 a A3 y mezclar 3.3 Trasvasar 1 ml de la cubeta A3 a A2 y mezclar 3.4 La cubeta A1 es el blanco 3.5 Esperar 5 minutos 4.- Preparacin de las bacterias 4.1 Sacar las bacterias del congelador 4.2 Quitar el tapn sellador del vial 4.3 Tomar la cubeta que contiene el reconstituyente en la celda reagent 4.4 Verter el contenido de la cubeta de reconstituyente, de golpe, sobre el vial de </p><p>bacterias. No verter lentamente, sino de golpe. 4.5 Agitar el vial varias veces con la mano y volcar el contenido sobre la cubeta. 4.6 Con la pipeta de 500 l mezclar 10 veces para homogeneizar la suspensin. NOTA: los pasos del punto 4 slo es necesario realizarlos al comenzar a medir la </p><p>primera muestra. Para posteriores muestras, no es necesario repetirlos. 5.- Trasvase de las bacterias 5.1 Trasvasar 10 l de bacterias reconstituidas a cada cubeta de la fila B. 5.2 Mezclar las cubetas de la fila B agitando con los dedos. 5.3 Dejar atemperarse las cubetas 15 minutos para que las bacterias estabilicen su emisin </p><p>de luz. 6.- Preparacin del programa 6.1 Cargar el programa del Test Bsico 6.2 Seleccionar: START TESTING </p></li><li><p> Nmero de tests: 1 Introducir un nombre para el archivo donde se almacenar la informacin del test. 6.3 Establecer los parmetros del test: Layout: Nmero de controles (1) Nmero de diluciones (4) Duplicados (NO) Tiempo del test (15) Informacin sobre la muestra: Concentracin inicial (45 si se utiliza MOAS, 50 si no se utiliza) Factor de dilucin (2) Tabla de concentracin Unidades (%) Ajuste osmtico (X) 7.- Protocolo del test 7.1 Tomar la cubeta B1 e introducirla en la celda del fotomultiplicador. Pulsar SET. 7.2 Pulsar la barra espaciadora del teclado. 7.3 Leer los niveles de luz a tiempo cero de las cubetas B1 a B5 introducindolas en la </p><p>celda del fotomultiplicador a medida que lo indique el ordenador y pulsando la tecla READ a continuacin. </p><p> 7.4 Trasvasar 05 ml de: A1 a B1 y mezclar 2 veces con la pipeta A2 a B2 y mezclar A3 a B3 y mezclar A4 a B4 y mezclar A5 a B5 y mezclar en estas operaciones se puede usar la misma punta de pipeta. 7.5 Pulsar la barra espaciadora del teclado. 7.6 Cuando el reloj del ordenador suene, leer los niveles de luz de las cubetas B1 a B5, </p><p>introducindolas en la celda del fotomultiplicador a medida que lo indique el ordenador y pulsando la tecla READ a continuacin. </p><p> 8.- Resultados En el men principal escoger la opcin RUN STATISTICS ON A DATA FILE, y </p><p>cargar el archivo donde se han grabado los datos del anlisis de nuestra muestra (el nombre del archivo fue introducido en el apartado 6.2). </p><p> El programa calcula el EC50 (concentracin de muestra que reduce al 50% la emisin </p><p>de luz). Es conveniente que este valor est comprendido entre las concentraciones de las diluciones de muestra preparadas (las 4 diluciones seriadas preparadas de la muestra son: 56, 1125, 225 y 45; es conveniente para tener un dato ms exacto que el EC50 est comprendido entre 56 y 45). </p><p> A partir de EC50, el programa calcula las Unidades de Toxicidad: </p><p>100150EC</p><p>ToxicidaddeUnidades =</p></li><li><p> CLCULO DE EC50 El programa utilizado da directamente el valor de EC50, sin embargo este valor puede ser calculado a partir de los valores medidos de emisin de luz. Para ello es preciso construir la siguiente tabla: </p><p>Cubeta C (%) t = 0 t = 15 min (t) ln C Ln (t) B1 0 I(0)b I(t)b B2 5,625 I(0) I(t) B3 11,25 I(0) I(t) B4 22,5 I(0) I(t) B5 45 I(0) I(t) </p><p> I(0)b= intensidad de luz emitida a t = 0 por la cubeta B1 I(0)= intensidad de luz emitida a t = 0 por las cubetas B2 a B5 I(t)b= intensidad de luz emitida por la cubeta B1, 15 minutos despus de la adicin de </p><p>0,5 ml procedentes de la cubeta A1 I(t)= intensidad de luz emitida por las cubetas B2 a B5, 15 minutos despus de la </p><p>adicin de 0,5 ml procedentes de las cubetas A2 a A5. </p><p> Si se representa ln C frente a ln (t), por regresin lineal se obtiene la ecuacin de una recta: </p><p> Donde a es la ordenada en el origen y b la pendiente de dicha recta. Como la EC50 representa la dilucin de la muestra original que provoca un 50% de reduccin de la tasa de emisin de luz, quiere decir que la luz perdida es igual a la luz remanente. Por tanto (t) es igual a 1, y su correspondiente logaritmo es cero. Con ello se obtiene que ln C = a, o lo que es lo mismo C = ea. Ese valor corresponde a la EC50. EQUIPO INSTRUMENTAL UTILIZADO Analizador de Toxicidad MICROTOX M 500 Micropipeta de 10 l Pipeta regulable: 100 - 1000 l Puntas de pipeta Cubetas de vidrio </p><p>b</p><p>bI</p><p>tItR )0()()( =</p><p>[ ] 1)()0()()()()0()()( === tIItRtItIItRremanenteluzperdidaluzt</p><p>)(lnln tbaC +=</p></li><li><p> REACTIVOS UTILIZADOS Bacteria liofilizada: Photobacterium phosphoreum Disolucin de reconstitucin: agua ultrapura. Diluyente: disolucin que contiene un 2% de NaCl Ajustador osmtico: disolucin que contiene un 22% de NaCl Muestra suministrada por el profesor de prcticas para determinacin de su toxicidad. NORMALIZACIN DEL ENSAYO DE TOXICIDAD Norma ASTM D 5660-95 Norma AFNOR T90-320 Norma DIN 38412 </p></li></ul>

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