Download - Cultivo Celular aplicado à Oncologia
Cultivo Celular aplicado à
Oncologia
Workshop do Projeto Própolis
Cultivo celular aplicado à Oncologia
1. Banco de Células GPO
2. Estrutura Laboratorial
3. Linhagens Celulares
4. Testes de Avaliação
5. Resultados Publicados
6. Trabalhos em andamento
• Infraestrutura:
Laboratório 8 – Laboratório de Embriologia Molecular e Transgênese
Laboratório 9 – Laboratório de Genômica Funcional
Grupo de Pesquisa em Oncologia
Laboratório de Cultivo Celular
Sala do Cultivo:
• 2 Fluxo Laminar Vertical
• 1 Estufa de CO2
• Microscópio invertido
• Banho-Maria
• Centrifuga
Sala de Experimentação:
• Citômetro de Fluxo
• Leitor de placa
• Geladeira
• Botijões de Nitrogênio
Banco de Células GPO
Linhagens de Células Humanas
A549 Carcinoma de Pulmão
5637 Carcinoma de Bexiga
HT-29 Adenocarcinoma de Colorretal
MCF-7 Adenocarcinoma de Mama
MDA-MB-231 Carcinoma de Mama
MG-63 Osteossarcoma
HeLa Adenocarcinoma Cervical
SH-SY5Y Neuroblastoma
LNCap Carcinoma de Prostata
HL-60 Leucemia Promielocítica Aguda
Outras Linhagens Celulares
CHO Ovário de Hamster Chinês
Banco de Célula do Rio de Janeiro -
BCRJ
www.bcrj.hucff.ufrj.br/
Treinamento Banco de Células do Rio de Janeiro
• estabelecida a partir do carcinoma da bexiga primário (grau II) de um paciente por Dr. G. Cannon em 1974;
• Meio: RPMI + 10% SFB, 37°C em 5% de CO2
• Adenocarcinoma alveolar de células epiteliais basais
• Esta linha foi iniciado em 1972 por D.J. Giard, através da cultura de tecido de carcinoma pulmonar de um homem;
• Meio de cultivo: DMEM + 10% SFB, a 37°C em 5% CO2
A549 – Carcinoma de Pulmão
5637– Carcinoma de Bexiga
• Adenocarcinoma de Mama, retirada de mulher caucasiana de 69 anos, isolada em 1970;
• Possui expressão de receptores de estrogenio;
• Meio: RPMI + 20% SFB, 37°C em 5% de CO2
• Adenocarcinoma colorretal, retirada de mulher, caucasiana de 44 anos;
• Isolada em 1964 por J. Fogh de tumor primário;
• Meio: DMEM + 10% SFB, 37°C em 5% de CO2
HT-29– Adenocarcinoma de Colorretal
MCF-7– Adenocarcinoma de Mama
Realização de Experimentos no Cultivo Celular
1. Novas drogas antitumorais:
Chalconas
2. Drogas antitumorais modificadas estruturalmente:
AZT: AZT-Se-Me e AZT-Se-CL
Disseleneto de Difenila
3. Drogas antitumorais Nanoencapsuladas:
Tretionoína
Metotrexato
4. Compostos com ação antitumoral:
Própolis Vermelha
5. Outras Estratégias:
BCG recombinante
1. Morfologia
2. Ensaio de MTT
3. Colorações
4. Citometria de fluxo
5. Expressão Gênica
6. Western blotting
Formas de avaliação da ação antitumoral
Brometo de 3-[4,5-dimetil-tiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazólio
Avalia a atividade metabólica das células;
• Teste de triagem:
amplamente utilizado na avaliação do efeito antiproliferativo de drogas tumorais;
• Baseado na capacidade das células viáveis reduzirem metabolicamente o sal de MTT;
• Formação de cristais de formazan de cor azul-púrpura, que se acumulam no citoplasma celular;
Ensaio de MTT
Redução mitocondrial
Cristais de formazan
Células viáveis!!
Ensaio de MTT
Cultura de células com determinado composto
Incubação do reagente MTT
Lise das células e diluição dos
cristais com DMSO
Leitura por espectrofotometria
Ensaio de MTT
LIVE/DEAD® Viability/Cytotoxicity Kit
• Determina a viabilidade de células de uma população com base na integridade da membrana plasmática e atividade intracelular de esterase;
Colorações para viabilidade celular
• Células discriminadas:
Vivas com coloração verde da calceína-AM (atividade esterase intracelular);
Mortas com coloração vermelha do etídio homodímero-1 (perda de integridade da membrana plasmática);
Controle Meio + Soro
∆leuD + Ag85B Pasteur + Ag85B
Controle BCG Pasteur
Cél. 5637; Aumento 20 X
Guava Nexin Reagent
Guava Cell Cycle Reagent
Guava Multi Caspase SR Kit
Guava® TUNEL Assay
Membrane Permeability/Dead Cell Apoptosis Kit with YO-
PRO®-1 and PI for Flow Cytometry
Citometria de Fluxo
Guava Nexin Reagent Avaliação de apoptose inicial;
O ensaio baseia-se na translocação da fosfatidilserina para a superfície externa da membrana celular → associado ao início da apoptose;
Anexina V possui alta afinidade por fosfatidilserina;
Na Apoptóse Inicial, as moléculas de fosfatidilserina são translocadas para a superfície externa da membrana celular, então Anexina V liga-se facilmente;
O ensaio baseia-se em duas estratégias:
1) Anexina V-PE detecta fosfatidilserina na membrana de células apoptóticas;
2) 7-AAD (corante impermeável na membrana celular íntegra) penetra na membrana celular de células mortas e em apoptose tardia, indicando integridade de membrana;
Citometria de Fluxo
Guava Nexin Reagent
Céls. não apoptóticas: Annexin V(-) e 7-AAD(-)
Céls. em Apoptose Inicial: Annexin V(+) e 7-AAD(-)
Céls. em Apoptose Tardia: Annexin V(+) e 7-AAD(+)
• Gráfico:
quadrante inferior esquerdo: céls. viáveis;
quadrante inferior direito céls em apoptose inicial;
quadrante superior direito: apoptose tardia ou necrose.
Guava Cell Cycle Reagent
• Determina a percentagem de células em: G0/G1, S e G2/M com base no conteúdo de DNA;
• Através da coloração do DNA celular com iodeto de propídio (PI);
Células em repouso (G0/G1) contêm duas cópias de cada cromossomo, assim como as em S: permitindo intercalação PI com intensidade 1x de fluorescência;
Células em Fase G2/M possuem o DNA duplicado, portanto com intensidade 2x de fluorescência;
Citometria de Fluxo
Guava Cell Cycle Reagent
• Histograma:
M1: células em G0/G1
M2: células em S
M3: células em G2/M
Guava Multi Caspase SR Kit
• Diferencia células apoptóticas de células não-apoptóticas;
• As caspase desempenham um papel central na morte celular por apoptose;
• Caspases iniciadoras: -2, -8, -9, -10; Caspases efetoras: -3, -6, -7;
• Fluorocromos:
sulforrodamina-valil-alanil—aspartilfluoromethylketone (SR-VAD-FMK); a intensidade de fluorescência vermelha é proporcional a atividade de caspases;
7-AAD é um indicador da integridade da membrana;
Citometria de Fluxo
Guava Multi Caspase SR Kit
• Céls. vivas: SR-VAD-FMK (-) e 7-AAD (-) → verde-azulado
• Apotose inicial: SR-VAD-FMK (+) e 7-AAD (-) → azul
• Apoptose tardia: SR-VAD-FMK (+) e 7-AAD (+) → rosa
• Céls. mortas: SR-VAD-FMK (- ou fraco) e 7-AAD (+) → roxo
Guava® TUNEL Assay
Distingue duas populações: células não apoptóticas (TUNEL-negativo) de células apoptóticas (TUNEL-positivo), através da fragmentação da cromatina nuclear;
cadeias de DNA com a extremidade 3'-hidroxila exposta são enzimaticamente marcadas, Desoxinucleotidil-transferase terminal (TdT) catalisa a incorporação de bromo-desoxiuridina (BrdU), TRITC conjugado anticorpo anti-BrdU marca estas fragmentações;
M1: céls não-apoptóticas; M2: céls. apoptóticas;
Citometria de Fluxo
PCR em Tempo Real
1. Genes relacionados a apoptose
2. Genes relacionados ao ciclo celular
3. Genes de enzimas antioxidantes
Expressão Gênica
qRT-PCR1. Genes apoptóticos: Bax Bcl-2 Survivin
2. Genes relacionados ao ciclo celular: p53 p21
3. Genes de enzimas antioxidantes: CAT (Catalase) GPx (Glutationa Peroxidase) TRX (Thioredoxina redutase-1) GST (Glutationa-S-transferase) CuZn-SOD (Cobre-Zinco Superóxido Dismutase) Mn-SOD (Manganês Superóxido Dismutase)
AIF Endo G Caspases 3, 8 e 9
qRT-PCR1. Genes apoptóticos:
Bax
Bcl-2
AIF
Endo G
Survivin
Caspase 8
Caspase 9
Caspase 3
Via de ativação
mitocondrial
Proteína Inibidora
de Apoptose
Caspases
Iniciadoras
Caspase
Efetora
qRT-PCR
2. Genes relacionados ao ciclo celular:
p53
p21
qRT-PCR3. Genes de enzimas antioxidantes:
CuZn-SOD (Cobre-Zinco Superóxido Dismutase)
Mn-SOD (Manganês Superóxido Dismutase)
CAT (Catalase)
GPx (Glutationa Peroxidase)
TRX (Thioredoxina redutase-1)
GST (Glutationa-S-transferase)
• Detecta as proteínas de uma amostra através de anticorpos específicos
Bcl-2
Bax
p53
Western blotting
Trabalhos publicados e em andamento do Cultivo de Células -GPO
• Avaliação do efeito antitumoral de disseleneto de difenila e duas modificações deste composto em adenocarcinoma de cólon (HT-29);
• As modificações propostas, 3-(trifluorometil)- disseleneto de difenila e 4-metoxi difenil diseleneto, induziram citotoxicidade por apoptose nas céls HT-29.
• Objetivo: testar uma cepa auxotróficas de BCG recombinante superexpressando
Ag85B (BCG ΔleuD /Ag85B) na citotoxicidade em carcinoma de bexiga (5637);
• Resultados: sugerem que esta modificação aumenta a citotoxicidade do BCG
recombinante in vitro;
• Objetivo: sintetizar e testar a citotoxicidade de seis derivados de
chalcona em células de adenocarcinoma do cólon humano (HT-29);
Nanobiotecnologia
A aplicação da Nanotecnologia na liberação de drogas possibilita a criação de novas estratégias terapêuticas, capazes de alterar o cenários
das indústrias farmacêutica e biotecnológica.
Biotecnologia Médica
Metotrexato Alta toxicidade
Nanoformulação contendo diéster etilíco de metotrexato
Faculdade de Farmácia da Universidade Federal do Rio Grande do Sul
Doutoranda Virginia Yurgel
Avaliação da atividade antitumoral in vitro de tretinoinananoencapsulada em linhagem tumoral de
adenocarcinoma de pulmão (A549)
Faculdade de Farmácia da Universidade Federal do Rio Grande do Sul
Doutoranda Eduarda Schultze
• Delineamento experimental
• Resultados Preliminares
Avaliação da atividade antitumoral in vitro da Própolis Vermelha
Profa. Fabiana K Seixas
Pós-doutoranda Priscila M. M. de Leon
Doutoranda Karine R. Begnini
Priscila Marques Moura de [email protected]
www.ufpel.edu.br/cenbiotPPGB (Programa de Pós - graduação em Biotecnologia)- UFPel
Obrigada pela atenção!