Clonagem Gênica
1-Introduçao2-Estratégia geral de clonagem gênica3-Clonagem gênica4-Vetores de clonagem plasmidial5-Isolamento de gene por PCR
Edmar Vaz de Andrade
1-Introduçao
Vetor + fragmento de DNA isolado
DNA recombinante
Multiplicação do DNA recombinante em uma célula hospedeira
Isolamento e estudos para a caracterização do fragmento de DNA purificado (gene isolado)
Tecnologia do DNA recombinante (TDR):Tecnologia do DNA recombinante (TDR): conjunto de técnicas que permite o isolamento de fragmentos gênicos.
1-IntroduçaoTecnologia do DNA recombinante (TDR):Tecnologia do DNA recombinante (TDR): conjunto de técnicas que permite o isolamento de fragmentos gênicos.
Duas importantes classes de enzimas:
Endonucleases de restrição (Tipo II)
DNA ligase
Relevância: possibilita o isolamento e multiplicação de genes in vitro para posterior análise/caracterização
2-Estratégia geral de clonagem gênica
1-isolamento de um fragmento de DNA
2-Inserção em um vetor de escolha (DNA recombinante ou quimera)
3-Transporte para o interior de uma célula hospedeira (transformação)
4-Seleçao de células transformantes (OGM)
5-Replicação da molécula de DNA recombinante
6-Multiplicação de células, cada uma contendo cópias do mesmo plasmídio recombinante (clones)
Clivagem do DNA pela enzima de restrição EcoRIExtremidades Coesivas
Clivagem
Extremidades coesivas
3-Clonagem gênica
3-Clonagem gênica
Fragmentos de DNA genômico
Extremidades complementares
Extremidades incompatíveis (b e c)
não se ligam ao vetor
Vetor de clonagem
DNA recombinante
Isolamento de fragmento gênico com enzimas de
restrição tipo II
Ligação de fragmentos isolados a um vetor de
clonagem pela DNA ligase
4-Vetor de Clonagem Plasmidial
Componentes básicos de vetor plasmidial de clonagem
Região de Múltiplos Sítios de Clonagem Vetor Plasmidial de
Clonagem
4-Vetor de Clonagem Plasmidial
pBR322: plasmídio para clonagem em Escherichia coli (1977)
1-Origem de replicação em E. coli (10 a 20 cópias do plasmídio por célula)
2-Genes que conferem resistência a antibióticos
3-Sítios únicos para diferentes endonucleases de restrição
Gene de phuA
FW (BamH I)
Rev (HInd III)
DNA genômico de C. violaceum
Gene de phuA
5’
5’3’
3’
BamH I
Hind IIIIA-3’
3’-A
PCR
Amplificação do gene de phuA de Chromobacterium violaceum
Iniciadores específicos para Chromobacterium violaceum ATCC12472
5-Isolamento de gene por PCR
Clonagem do gene de phuA
5-Isolamento de gene por PCR