Clonagem Gênica

1-Introduçao2-Estratégia geral de clonagem gênica3-Clonagem gênica4-Vetores de clonagem plasmidial5-Isolamento de gene por PCR

Edmar Vaz de Andrade

1-Introduçao

Vetor + fragmento de DNA isolado

DNA recombinante

Multiplicação do DNA recombinante em uma célula hospedeira

Isolamento e estudos para a caracterização do fragmento de DNA purificado (gene isolado)

Tecnologia do DNA recombinante (TDR):Tecnologia do DNA recombinante (TDR): conjunto de técnicas que permite o isolamento de fragmentos gênicos.

1-IntroduçaoTecnologia do DNA recombinante (TDR):Tecnologia do DNA recombinante (TDR): conjunto de técnicas que permite o isolamento de fragmentos gênicos.

Duas importantes classes de enzimas:

Endonucleases de restrição (Tipo II)

DNA ligase

Relevância: possibilita o isolamento e multiplicação de genes in vitro para posterior análise/caracterização

2-Estratégia geral de clonagem gênica

1-isolamento de um fragmento de DNA

2-Inserção em um vetor de escolha (DNA recombinante ou quimera)

3-Transporte para o interior de uma célula hospedeira (transformação)

4-Seleçao de células transformantes (OGM)

5-Replicação da molécula de DNA recombinante

6-Multiplicação de células, cada uma contendo cópias do mesmo plasmídio recombinante (clones)

Clivagem do DNA pela enzima de restrição EcoRIExtremidades Coesivas

Clivagem

Extremidades coesivas

3-Clonagem gênica

3-Clonagem gênica

Fragmentos de DNA genômico

Extremidades complementares

Extremidades incompatíveis (b e c)

não se ligam ao vetor

Vetor de clonagem

DNA recombinante

Isolamento de fragmento gênico com enzimas de

restrição tipo II

Ligação de fragmentos isolados a um vetor de

clonagem pela DNA ligase

4-Vetor de Clonagem Plasmidial

Componentes básicos de vetor plasmidial de clonagem

Região de Múltiplos Sítios de Clonagem Vetor Plasmidial de

Clonagem

4-Vetor de Clonagem Plasmidial

pBR322: plasmídio para clonagem em Escherichia coli (1977)

1-Origem de replicação em E. coli (10 a 20 cópias do plasmídio por célula)

2-Genes que conferem resistência a antibióticos

3-Sítios únicos para diferentes endonucleases de restrição

Gene de phuA

FW (BamH I)

Rev (HInd III)

DNA genômico de C. violaceum

Gene de phuA

5’

5’3’

3’

BamH I

Hind IIIIA-3’

3’-A

PCR

Amplificação do gene de phuA de Chromobacterium violaceum

Iniciadores específicos para Chromobacterium violaceum ATCC12472

5-Isolamento de gene por PCR

Clonagem do gene de phuA

5-Isolamento de gene por PCR