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UUNNIIVVEERRSSIIDDAADDEE DDEE ÉÉVVOORRAA
ESCOLA DE CIÊNCIAS E TECNOLOGIA
Mestrado em Bioquímica
Dissertação
Diversidade microbiológica no solo temperado- uma análise estrutural e
funcional com uso de técnicas moleculares de “fingerprinting”
Rui Miguel Vieira Ferreira
Orientador:
Doutora Margarida Maria Cabral Lages Azevedo Santana
Setembro de 2012
Mestrado em Bioquímica
Dissertação
Diversidade microbiológica no solo temperado- uma análise estrutural e
funcional com uso de técnicas moleculares de “fingerprinting”
Rui Miguel Vieira Ferreira
Orientador:
Doutora Margarida Maria Cabral Lages Azevedo Santana
Agradecimentos
Gostava de deixar aqui presente os meus agradecimentos às pessoas que, de
alguma forma, tornaram possível a realização deste trabalho.
Em primeiro lugar, à Doutora Margarida Santana, minha orientadora, por me
ter dado a oportunidade de integrar este projeto, pelos conselhos, pela dedicação, por
tudo o que me ensinou, pelo apoio e pela paciência.
À Professora Maria Ivone Clara, à Professora Rosário Félix e à Doutora Carla
Varanda pelo apoio científico, pelo incentivo e simpatia que revelaram durante todo o
percurso de trabalho.
À D. Maria Mário Azedo, Técnica de Laboratório de Virologia Vegetal, por toda
a ajuda no apoio técnico da componente experimental.
Ao Doutor Juan M. Gonzales do Instituto de Recursos Naturais e Agrobiologia
(IRNAS-CSIC, Sevilla), por todo o apoio científico.
À Professora Solange Oliveira, Doutora Ana Alexandre e Doutora Marta Laranjo do
Laboratório de Microbiologia do Solo, pelo auxílio sempre que necessário.
Ao professor Carlos Alexandre do Departamento de Geociências da
Universidade de Évora, pelo apoio científico, fornecimento de dados e informação
bibliográfica sobre os valores e conteúdos a abordar.
Ao Engenheiro Gonçalo Pinheiro da Fundação Eugénio de Almeida pela ajuda e
disponibilidade no momento da recolha das amostras para a realização do trabalho
experimental.
À minha colega Helena Gaspar, “companheira de armas” no âmbito deste
trabalho, por toda a simpatia e pela disponibilidade.
À minha mãe, tia, irmão e à minha namorada, pela educação, carinho, apoio,
compreensão e conselhos. Deram-me a força e incentivo necessárias para nunca
desistir de mim e de que sou capaz de alcançar os meus objetivos
Aos meus amigos, colegas e ex-colegas pela partilha de experiências,
informação e apoio. Seguimos caminhos separados, mas apoiamo-nos continuamente.
I
Resumo
Estudos recentes sugerem um papel importante de bactérias termofílicas do
Phylum Firmicutes, presentes em solos temperados, na fertilidade dos mesmos, por
meio da produção de sulfato e amónia, elementos importantes na nutrição das
plantas. Neste trabalho pretendeu-se avaliar a dinâmica da população de bactérias
termofílicas de um solo temperado agrícola, e a dos seus potenciais antagonistas
quanto à utilização de sulfato e amónia pelas plantas, as bactérias sulfato-redutoras e
as bactérias oxidativas da amónia da classe β-Proteobacteria, respetivamente. Dois
fatores capazes de alterar a diversidade dessas populações são a temperatura e o
cobre, este último frequentemente utilizado em tratamentos fitosanitários. A
diversidade microbiana relativa a estes grupos, sob influência do cobre e da
temperatura, foi avaliada através da técnica de DGGE (Denaturing Gradient Gel
Electrophoresis), uma técnica de fingerprint molecular. Como resultado deste estudo,
identificaram-se bactérias resistentes ao cobre, presentes no solo agrícola analisado e
pertencentes aos grupos taxonómico alvo, e concluiu-se sobre a sua contribuição para
a fertilização no solo tratado.
II
“Microbial diversity in temperate soil – a structural and functional analysis
using molecular techniques for "fingerprinting"”
Abstract
Recent studies suggest an important role of thermophilic bacteria of the
Phylum Firmicutes in soil fertility, through the production of sulphate and ammonia,
important elements in plant nutrition. In this work, we evaluated the dynamics of the
thermophilic bacteria population in a temperate soil, as well as the one of their
potential antagonists on the use of sulphate and ammonia by plants, i.e. sulfate-
reducing bacteria and ammonia oxidizing β-proteobacteria. Temperature and copper
are factors changing the diversity of these populations; the latter is often used in
phytosanitary treatments. The change on the microbial diversity in each of these
groups, under the effect of copper and temperature, was evaluated by DGGE
(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis), a molecular fingerprint technique. As a
result of this study, we identified copper resistant bacteria belonging to the targeted
taxonomic groups, and we concluded on their contribution for fertilization in the
copper treated soil.
III
Abreviaturas gerais
A260 – absorvância a 260nm;
A280 – absorvância a 280nm;
Água MilliQ – água purificada no sistema MilliQ (Millipore);
AOB – Bactérias Oxidativas de Amónia (Ammonia Oxidizing Bacteria);
APS - Persulfato de amónia;
ATP – Adenosina Trifosfato;
Bisacrilamida – N,N’-metileno-bis-acrilamida;
DGGE – Eletroforese em gel com gradiente desnaturante (Denaturing Gradient Gel
Electrophoresis);
DNA – ácido desoxirribonucleico (deoxyribonucleic acid);
DNase – desoxiribonuclease;
dNTPs – desoxinucleótidos trifosfatados;
D.O. – densidade ótica;
EDTA – ácido etileno-diaminatetracético;
g – unidade de força centrífuga;
kb – kilobases;
M – molar (quando antecedida de um valor numérico);
mM – milimolar;
NB - Nutrient Broth-Oxid;
NBA - Nutrient Broth-Oxid com 15% de agar;
nm – nanómetro;
NOB – Bactérias Oxidativas de Nitrato (Nitrite Oxidizing Bacteria);
pb – pares de bases;
PCR – Reação em cadeia da polimerase (Polymerase chain reaction);
IV
ppm – parte por milhão;
p/v – relação peso/volume;
RNA – ácido ribonucleico (ribonucleic acid);
rpm – rotações por minuto;
rRNA – RNA ribossomal (ribosomal RNA)
SRB – Bactérias Redutoras de Sulfato (Sulfate Reducting Bacteria);
TAE - tampão Tris-Acetato-EDTA;
Taq – DNA polimerase de Thermophilus aquaticus;
TE – Tampão Tris-EDTA;
TEMED – N,N,N’,N’-Tetrametiletilenodiamina;
Tris – tris(hidroximetil)aminometano;
UV – ultravioleta;
V
Índice
Introdução ........................................................................................................................ 1
1. Ciclos biogeoquímicos do azoto e do enxofre ....................................................... 1
2. Metabolismo de oxidação da amónia ................................................................... 4
3. Metabolismo de redução do sulfato ..................................................................... 5
4. População bacteriana dos solos ............................................................................ 7
5. Presença de bactérias termofílicas do Phylum Firmicutes em solos temperados 8
6. Papel e impacto das bactérias termofílicas em ambientes terrestres ................ 11
7. Efeito do cobre nas comunidades bacterianas ................................................... 12
8. Cobre como bioelemento.................................................................................... 13
9. Métodos moleculares na análise da dinâmica de comunidades bacterianas ..... 16
Objetivos gerais .............................................................................................................. 18
Objetivos específicos ...................................................................................................... 18
Metodologia ................................................................................................................... 19
1. Recolha de amostras do solo e caracterização do local de amostragem ........... 19
2. Enriquecimento seletivo das amostras em diferentes condições....................... 20
2.1. Quantificação de amónio presente nos enriquecimentos .............................. 22
2.2. Quantificação do sulfato presente nos enriquecimentos ............................... 22
3. Isolamento bacteriano e caracterização fenotípica, fisiológica e molecular. ..... 23
3.1. Análise fenotípica ............................................................................................ 24
3.2. Análise fisiológica ............................................................................................ 24
3.2.1 Culturas do isolado ....................................................................................... 24
3.2.2 Quantificação da Proteína celular total do isolado ...................................... 25
3.3. Análise molecular ............................................................................................ 25
4. Extração de DNA total e quantificação ............................................................... 27
5. PCR-DGGE ............................................................................................................ 28
5.1. Amplificação do gene 16S rRNA ...................................................................... 28
5.2. Primers e reações de PCR ................................................................................ 29
5.3. Etapas de amplificação .................................................................................... 31
5.4. Visualização dos produtos de PCR .................................................................. 33
5.5. Eletroforese em gel com gradiente desnaturante (DGGE) ............................. 33
VI
5.5.1. Preparação dos géis ................................................................................. 33
5.5.2. Condições de corrida ............................................................................... 34
5.6. Excisão de bandas e purificação ...................................................................... 34
Resultados e discussão ................................................................................................... 36
1. Parâmetros físico-químicos ................................................................................. 36
2 Quantificação nos enriquecimentos ....................................................................... 37
2.1 Produção de amónio ....................................................................................... 37
2.2 Produção de sulfato ........................................................................................ 38
3 Caracterização fenotípica, fisiológica e molecular do isolado ................................ 40
3.1 Análise fenotípica e fisiológica ........................................................................ 40
3.2.Análise molecular ................................................................................................. 43
4. Análise dos géis de DGGE e sequenciação .......................................................... 44
4.1. PCR-DGGE de amostras de DNA do solo ........................................................ 44
4.2. PCR-DGGE de amostras de DNA extraído dos enriquecimentos .................... 45
4.2.1. Phylum Firmicutes .................................................................................... 47
4.2.2. Subgrupo filogenético β-Proteobacteria ................................................. 51
4.2.3. Subgrupo filogenético Desulfovibrio/Desulfomicrobium ......................... 54
Conclusões e perspetivas futuras ................................................................................... 57
Referências Bibliográficas............................................................................................... 60
Anexos ............................................................................................................................ 67
i. Tabelas referentes à quantificação de sulfato e amónia nos enriquecimentos . 67
ii. Sequência do 16S rDNA do isolado ................................................................. 68
iii. Sequências das bandas recolhidas do gel DGGE ............................................. 69
a. Firmicutes .................................................................................................... 69
b. β-Proteobacteria ......................................................................................... 70
c. Desulfovibrio/Desulfomicrobium ................................................................. 71
VII
Índice de figuras
Figura 1: Ciclo do azoto (adaptado de Mandigan et al, 2003) ...................................................... 2
Figura 2: Ciclo do enxofre (adaptado de Madigan et al, 2003) .................................................... 3
Figura 3: Via da oxidação da amónia por Nitrosomonas europaea (retirado de Metacyc) .......... 4
Figura 4: Via dissimilativa da redução do sulfato, proposta para Desulfovibrio vulgaris (retirado
de MetaCyC) .................................................................................................................................. 6
Figura 5: Contribuição de cada Phylum em bibliotecas 16S RNA de comunidades bacterianas de
solos (2920 clones em 21 bibliotecas) (adaptado de Janssen, 2006) ........................................... 8
Figura 6 : Imagem de satélite mostrando um trajeto de transporte e dispersão de partículas
com origem no Sahara no dia 13 de setembro e 2001, usando SeaWiFS e modelo de dispersão
baseado nas estações EARLINET ................................................................................................. 10
Figura 7: Modelo de homeostase do cobre para Bacilllus subtilis. (adaptado de Chillapaggari et
al, 2009) ....................................................................................................................................... 15
Figura 8: Fotografia do local de amostragem (Google Earth, 2012) ........................................... 20
Figura 9: Quantificação de amónio nos enriquecimentos seletivos A) Produção absoluta de
amónio B) Produção de amónio normalizada por unidades formadoras de colónias ................ 37
Figura 10: Quantificação de sulfato nos enriquecimentos seletivos A) Produção absoluta de
sulfato B) Produção de sulfato normalizada por unidades formadoras de colónias. ................. 39
Figura 11: Visualização do isolado ao Microscópio ótico Olympus BX41 após coloração
diferencial de Gram. .................................................................................................................... 41
Figura 12: Produção absoluta de sulfato total (mM) (azul) e produção de sulfato normalizada
em relação ao conteúdo proteico celular (mmol mg-1 ) (vermelho), para os diferentes tempos
T1 a T4........................................................................................................................................... 42
Figura 13: Visualização do isolado ao Microscópio ótico Olympus BX41 ao tempo T3. a)
Preparação a fresco, b)) após coloração diferencial de Gram .................................................... 42
Figura 14: Géis de DGGE das amostras resultantes de amplificação por nested-PCR sobre o DNA
extraído das amostras compostas do solo A- Gel resultante da amplificação com os primers
para os géneros Desulfovibrio e Desulfomicrobium; B - Gel resultante da amplificação com os
primers para a classe β-Proteobacteria. ...................................................................................... 44
Figura 15: Gel de DGGE das amostras resultantes de amplificação direta sobre o DNA extraído
dos enriquecimentos. .................................................................................................................. 46
Figura 16: Gel de DGGE das amostras de DNA extraído dos enriquecimentos seletivos,
amplificadas com o par de primers específicos para o subgrupo filogenético Firmicutes. ........ 47
Figura 17: Perfil dos picos obtidos para as bandas da amostra NB30 Cu100, e da amostra NB30
Cu500; o cálculo da área de algumas bandas está indicado ....................................................... 48
Figura 18: Gel de DGGE das amostras de DNA extraído dos enriquecimentos seletivos,
amplificadas com o par de primers específicos para o subgrupo filogenético β-Proteobacteria51
Figura 19: Montagem do gel de DGGE das amostras de DNA extraído dos enriquecimentos
seletivos, amplificadas com o par de primers específicos para os géneros
Desulfovibrio/Desulfomicrobium................................................................................................. 54
VIII
Índice de esquemas
Esquema 1: Enriquecimento seletivo das amostras a diferentes condições de temperatura e
concentração de sulfato de cobre ............................................................................................... 21
Esquema 2. Esquema das metodologias utilizadas, de amplificação direta e por nested-PCR. . 29
Índice de tabelas
Tabela 1: Parâmetros registados na recolha de amostras .......................................................... 20
Tabela 2: Sumário dos primers 16S rRNA universais e específicos para os subgrupos
filogenéticos em estudo, a sua posição em E. coli e a temperatura de annealing ..................... 32
Tabela 3: Parâmetros físico-químicos das amostras recolhidas no solo do olival ...................... 36
Tabela 4: Resultados da análise Blast da sequência parcial do gene 16S rDNA do isolado ........ 43
Tabela 5: Tabela resultante da análise conjunta da sequência e da intensidade relativa de
bandas selecionadas no gel-Figura16 ......................................................................................... 50
Tabela 6: Tabela resultante da análise conjunta da sequência e da intensidade relativa de
bandas, selecionadas no Gel-Figura 18 ....................................................................................... 53
Tabela 7: Tabela resultante da análise conjunta da sequência e da intensidade relativa de
bandas, selecionadas no Gel-Figura 19 ....................................................................................... 56
Tabela 8 - Quantificação de amónio nos enriquecimentos. ....................................................... 67
Tabela 9 - Quantificação de sulfato nos enriquecimentos .......................................................... 68
Tabela 10 – Sequência 16S rDNA do isolado obtido a partir do enriquecimento....................... 68
Tabela 11 - Sequências obtidas a partir das bandas recolhidas do gel de DGGE........................ 69
Tabela 12 - Sequências obtidas a partir das bandas recolhidas do gel de DGGE........................ 70
Tabela 13 - Sequências obtidas a partir das bandas recolhidas do gel de DGGE........................ 71
1
Introdução
Os solos, como sistemas biológicos complexos, dependem da interação de três
fatores: ambiente geofísico, comunidade microbiana presente e atividade biológica.
Encontra-se documentada a importância dos microrganismos no solo, em particular de
bactérias, que participam nos ciclos biogeoquímicos dos elementos, em particular do
carbono (C), fósforo (PO), azoto (N) e enxofre (S); diversos microrganismos são
responsáveis pela incorporação destes elementos tanto em compostos orgânicos
como inorgânicos, graças aos distintos metabolismos envolvendo processos de
oxidação e de redução, que se traduzem na dissimilação versus assimilação de
nutrientes no sistema biótico e na contínua reutilização dos elementos acima
referidos.
1. Ciclos biogeoquímicos do azoto e do enxofre
O azoto e o enxofre encontram-se entre os nutrientes fundamentais para o
crescimento e manutenção da homeostasia das plantas. O azoto pode ser absorvido
pelas plantas na forma de nitrato (NO3-) ou de amónio (NH4
+), enquanto o enxofre é
absorvido na forma de sulfato (SO4 2-). O azoto também pode ser absorvido sob a
forma de aminoácidos biodegradados, nomeadamente glicina (Jones et al, 1999; 2005)
Apesar de uma grande fração do azoto presente nos solos estar sob forma
orgânica, em muitas situações, em particular devido à lixiviação dos solos, o azoto é
um elemento limitante para o crescimento vegetal. A produção de alimentos deve-se
em grande parte à produção de fertilizantes contendo amónio (NH4+) como fonte de
azoto, num processo químico patenteado por Fritz Haber e Carl Bosh em 1910 (Appl,
2006).
As bactérias do género Rhizobium estabelecem uma relação simbiótica com
plantas leguminosas que constitui uma das principais fontes de fixação biológica de
azoto inorgânico (N2). No processo simbiótico de fixação de azoto, os rizóbios
convertem o azoto atmosférico, não assimilável, em amónia passível de ser utilizado
pela planta leguminosa hospedeira.
A amónia pode também ser sintetizada por intermédio da degradação de
aminoácidos e redução de compostos azotados presentes em ácidos húmicos
resultantes da decomposição da biomassa. Algumas bactérias anaeróbias pertencentes
ao Phylum Firmicutes e Proteobacteria 1(em particular γ-Proteobacteria) contribuem
1 Para descrição sumária, ver secção 2
2
também na produção de amónia ao utilizar o nitrato como aceitador alternativo da
cadeia respiratória e reduzindo-o a amónia.
A transformação de amónia em nitrato é realizada em duas fases; as bactérias
do género Nitrosomonas realizam a oxidação da amónia a nitrito (NO2-) como parte do
seu metabolismo para produção de energia e divisão celular. A oxidação do nitrito em
nitrato (NO3-) é realizada por microrganismos do género Nitrobacter, sendo o nitrato
asssimilado pelas plantas (Teske et al, 1994; Suzuki et al, 1997; De Boer et al, 1992,
2000).
A Figura 1 mostra como os microrganismos do solo, no seu conjunto, são
importantes no ciclo biogeoquímico do azoto e na formação de nitrato ou amónia
assimiláveis pelas plantas.
Figura 1: Ciclo do azoto (adaptado de Mandigan et al, 2003)
O enxofre é outro nutriente necessário para maximizar a qualidade das
culturas, sendo utilizado na sua forma elementar como constituinte de muitos
fertilizantes.
No solo, o enxofre encontra-se principalmente na forma orgânica SH, em
resíduos de biomassa na constituição de aminoácidos (cisteína e metionina) e em
compostos mais complexos como o ácido húmico. Em solos não fertilizados, a
mineralização do enxofre orgânico em sulfato inorgânico (SO42-) é considerado o maior
contribuinte para o crescimento das plantas (Eriksen, 1996). Este processo consiste
Bactérias
termofílicas
(Firmicutes)
3
numa decomposição efetuada por exemplo por fungos, do enxofre em sulfureto de
hidrogénio (SH2), seguida de oxidação do sulfureto em tiossulfato (S2O32), um produto
intermédio da oxidação do sulfato, realizada por bactérias quimiolitotróficas oxidativas
do enxofre (por exemplo Beggiatoa, Sulfurimonas).
Também α-Proteobacteria quimiolitotróficas facultativas (p.e.Paracoccus)
oxidam o enxofre inorgânico, nestas o sistema multienzimático de oxidação do
tiossulfato (SOX) constitui a via central dessa oxidação (Ghosh et al, 2009).Este sistema
é induzido pelo tiossulfato, que se liga covalentemente à subunidade SoxY, dando-se
uma oxidação dos átomos de enxofre do tiossulfato pela transferência de eletrões para
a subunidade SoxXA. O complexo pode aceitar outras espécies de enxofre como o
sulfureto (SH), enxofre elementar (S0), o sulfito (SO3) e tetrationato (S4O6 (Sauvé et al,
2007; Ghosh et al, 2009). As bactérias redutoras de sulfato, que incluem, entre outros,
o género Desulfovibrio contribuem largamente para a produção de sulfureto de
hidrogénio, utilizado pelas bactérias quimiolitotróficas suprarreferidas. Diversos
estudos apontam uma fraca mineralização do enxofre orgânico a sulfato no solo
(Eriksen, 2008). Diametralmente oposta à mineralização, ocorre a imobilização do
sulfato inorgânico que consiste na assimilação pela comunidade bacteriana e outros
organismos (e.g. plantas) e incorporação em matéria orgânica.
A Figura 2 mostra o ciclo biogeoquímico de enxofre e os microrganismos do
solo que nele intervêm.
Figura 2: Ciclo do enxofre (adaptado de Madigan et al, 2003)
Bactérias
termofílicas
(Firmicutes)
4
2. Metabolismo de oxidação da amónia
A oxidação da amónia em nitrato é um dos passos fundamentais para o ciclo do
azoto. Esta é realizada em dois passos, a conversão de amónia em nitrito, que, por sua
vez é convertida em nitrato, pela ação de dois diferentes grupos de microrganismos: as
bactérias oxidativas de amónia (AOB), e as bactérias oxidativas de nitrato (NOB), com
metabolismo químiolitoautotrófico e aeróbias obrigatórias (Kowalchuk et al, 2001).
As bactérias oxidativas de amónia pertencem na sua grande maioria à classe β-
Proteobacteria (Nitrosomonas; Nitrosospira; Nitrosolobus), embora seja conhecido um
género pertencente à classe γ-Proteobacteria (Nitrosococcus oceanus) (Head et al,
1993). No entanto, nenhuma das γ-Proteobacterias oxidativas de amónia foi isolada
em ecossistemas terrestres (Kowalchuk et al, 2001).
A conversão de amónia a nitrito envolve duas reações distintas, a oxidação de
amónia (NH3) em hidroxilamina (NH2OH), catalisada pelo complexo enzimático
membranar amónia monooxigenase (AMO; EC 1.14.99.39), codificada pelos genes
amoA/B/C; e a oxidação da hidroxilamina a nitrito e produção de 4 eletrões, catalisada
pela enzima periplasmática hidroxilamina oxidoreductase (HAO; EC 1.7.3.4), conforme
indica a figura 3.
Figura 3: Via da oxidação da amónia por Nitrosomonas europaea (retirado de Metacyc)
Considera-se que a amónia é o substrato de eleição para esta via ao invés do
ião amónio (NH4+), e que o rácio NH3/ NH4
+ pode afetar a produção de energia e,
consequentemente, o crescimento bacteriano. Assim podemos considerar a oxidação
da amónia como o passo limitante para a nitrificação em muitos ecossistemas, visto
que a acumulação de nitrito nos ecossistemas é rara (De Boer et al, 1992).
As bactérias oxidativas de nitrato catalisam o segundo passo na nitrificação: a
oxidação de nitrito (NO2-) a nitrato (NO3
-). Estudos filogenéticos de 16S rRNA
consideraram 4 géneros: Nitrobacter (β-Proteobacterias), Nitrospina (δ–
Proteobacterias), Nitrococcus (γ-Proteobacterias) e Nitrospira (domínio Bacteria,
Phylum Nitrospira) (Juretschko et al, 1998). A bactéria quimiolitotrófica facultativa
5
Nitrobacter é considerada a espécie dominante em ecossistemas terrestres e de água
doce. Os outros três géneros apresentam um metabolismo litoautotrófico obrigatório
e foram isolados em ecossistemas aquáticos.
A conversão de nitrito a nitrato é catalisada pela enzima nitrito oxidoreductase
(NOR, EC 1.7.2._), constituída por duas subunidades ligadas ao citrocromo C. Esta
proteína apresenta um heteroátomo de molibdênio no seu centro ativo e um cluster
[Fe-S]. Em condições aeróbicas, participa na cadeia transportadora de eletrões, do
nitrito para o oxigénio, gerando o já enunciado nitrato e o ião molibdênio (IV) (Meincke
et al, 1992)
Encontra-se bastante documentado que a assimilação de azoto nas plantas é
determinada pela abundância e acessibilidade das várias espécies químicas no solo, o
que leva à preferência por nitrato e amónio sobre outras espécies de azoto em solos
agrícolas. Também a manutenção do equílibrio iónico pelas plantas pode ser fator
preferencial na escolha da espécie química para a homeostasia das plantas (Wirén et
al, 1997). Em solos bastante fertilizados, o nitrato é a fonte mais abundante de azoto,
com concentrações entre 0.5 e 10 µM enquanto que a concentração de amónio é 10 a
1000 x menor, sendo mais abundante em solos onde a nitrificação foi inibida
(Marschner, 1995). Assim, em condições normais de fertilização, o nitrato é a espécie
mais absorvida pelas raízes das plantas, sendo posteriormente reduzida a amónia nos
tecidos. No entanto, esta diferença de concentrações não reflete o ratio de absorção
de azoto, visto que a maioria das plantas superiores preferencialmente assimila
amónio quando o fornecimento de azoto por fertilizantes é limitado e estando as duas
espécies químicas disponíveis (Jones et al, 2004).
3. Metabolismo de redução do sulfato
As bactérias redutoras de sulfato (SRB) formam um grupo filogeneticamente
diverso de microrganismos anaeróbios que utilizam o sulfato. Muitos dos redutores de
sulfato pertencem a 23 géneros da classe δ-Proteobacteria, seguindo-se micro-
organismos gram-positivos do Phylum Firmicutes (Desulfotomaculum,
Desulfosporosinus e Desulfosporomusa). Também se encontram sulfato-redutores
termofílicos; são membros do género Thremodesulfovibrio, Phylum Nitrospirae e
membros dos Phylums Thermodesulfobacteria e Thermodesulfobium.
No geral, as SRB são classificadas em dois grupos quanto ao seu metabolismo:
aqueles que degradam compostos orgânicos de modo incompleto a acetato e aqueles
que os degradam completamente a dióxido de carbono. O metabolismo de redução do
sulfato representa o maior contributo na degradação de matéria orgânica em
ecossistemas ricos em enxofre. Estima-se que 50% da degradação da biomassa
provenha deste processo oxidativo em ambientes marinhos (Muyzer et al, 2008).
6
O metabolismo das SRB baseia-se na utilização do sulfato como aceitador de
eletrões em processos de degradação de matéria orgânica com produção de energia e
resultando na produção de sulfureto de hidrogénio (SH2). Esta redução do sulfato
constitui portanto uma via dissimilatória. Em todos os procariotas que apresentam
este metabolismo, o processo dissimilatório é mediado por três enzimas fundamentais
(figura 4). A enzima ATP sulfurilase (EC 2.7.7.4) catalisa a ativação do sulfato inerte em
adenosina-5’-fosfosulfato (APS). O APS é reduzido em adenosina-monofosfato (AMP) e
sulfito, por ação da enzima adenilsulfato reductase (EC 1.8.99.2). A última enzima da
via, sulfito-reductase (Dsr; EC 1.8.99.1/3) catalisa a redução do sulfito em sulfureto.
Esta redução envolve 6 eletrões e é considerada o passo fundamental na via
dissimilatória de redução do sulfato (Meyer et al, 2007; Muyzer et al, 2008).
Figura 4: Via dissimilativa da redução do sulfato, proposta para Desulfovibrio vulgaris (retirado de MetaCyC)
As enzimas Dsr contêm um grupo prostético hemo e clusters [4Fe-4S] e estão
presentes em todos os organismos capazes de reduzir sufitos em sulfuretos em
condições anaeróbicas (Stahl et al, 2002). A estrutura desta enzima apresenta dois
polipéptidos distintos com conformação α2β2, em que os genes que codificam as duas
subunidades (dsrAB) encontram-se adjacentes nos genomas respetivos (Stahl et al,
2002). Diversos estudos demonstraram a presença de homólogos do gene dsrAB em,
7
pelo menos 5 grupos filogenéticos procariotas (Wagner et al, 1998) e um elevado
estado de conservação deste gene em SRB e membros do domínio Archaea (Dahl et al,
1993). Estes dados sugerem que a enzima sulfito-reductase presente nas bactérias
redutoras de sulfato é uma evolução de genes ancestrais (Stahl et al, 2002).
Apesar de as bactérias redutoras de sulfato serem classificadas como
organismos anaeróbios obrigatórios, foram detetadas em ecossistemas aeróbios, tais
como zonas de depósitos de cianobactérias ricos em oxigénio (Krekeler et al, 1997) e
biofilmes que contêm oxigénio, formados em estações de tratamento de águas
(Ramsing et al, 1993). Também no solo, membros do género Desulfovibrio encontram-
se frequentemente na interfase entre a zona óxica e anóxica dos sedimentos (Dilling et
al, 1990)
4. População bacteriana dos solos
Os microrganismos do solo desempenham portanto um papel fundamental na
manutenção dos ciclos biogeoquímicos dos elementos, com uma grande variedade de
taxa microbiana. Estima-se que existam 104 – 106 diferentes microrganismos por
grama de solo e um total de 1010micróbios.g-1 (Gonzalez et al, 2012). A análise de
bibliotecas genómicas de 16S rRNA de comunidades bacterianas de diferentes solos,
revelou uma afiliação dos genes de 16S rRNA com 32 Phylums. Os mais dominantes são
os Proteobacteria, Acidobacteria, Actinobacteria, Verrucomicrobia, Bacteroidetes,
Cloroflexi, Planctomycetes, Gemmatimonadetes e Firmicutes, contribuindo para um
total de 92% das bibliotecas genómicas (Janssen, 2006).
8
Figura 5: Contribuição de cada Phylum em bibliotecas 16S RNA de comunidades bacterianas de solos (2920 clones em 21 bibliotecas) (adaptado de Janssen, 2006)
Membros do Phylum Proteobacteria, que engloba bactérias gram-negativas
anaeróbias obrigatórias ou facultativas e metabolismo quimioautotrófico ou
heterotrófico, constituem cerca de 39% das bibliotecas. A maior parte pertencem às
classes α-Proteobacteria, β-Proteobacteria, γ-Proteobacteria e δ- Proteobacteria sendo
as ζ- Proteobacteria as menos abundantes com uma contribuição média de 0.04%
(Janssen, 2006). De entre estas classes é importante nomear as bactérias redutoras de
sulfato como por exemplo Desulfovibrio, Desulfobacter ( δ- Proteobacteria) e as
bactérias oxidativas da amónia que incluem membros das β e γ-Proteobacteria.
Os géneros Bacillus e Clostridium do Phylum Firmicutes, o qual engloba
bactérias gram-positivas (com as exceções das classes Megasphaera, Pectinatus,
Selenomonas e Zymophilus) anaeróbios (Clostridia) ou aeróbios obrigatórios ou
facaultativos (Bacilli), têm sido considerados pela comunidade científica como comuns
na comunidade microbiana dos solos, mas as classes Bacilli e Clostridia do Phylum
Firmicutes, que compreendem em conjunto 214 géneros, incluindo os géneros acima
referidos, contribuem apenas com uma média de 2% para as bibliotecas (Janssen,
2006).
5. Presença de bactérias termofílicas do Phylum Firmicutes em
solos temperados
Desde há muito, têm sido isolados microrganismos em ambientes considerados
extremos nos quais pH, temperatura, concentração salina e outros parâmetros
Co
ntr
ibu
ição
(%
)
9
ultrapassam os valores considerados como padrões para a proliferação da maioria dos
seres vivos. Os microrganismos termofílicos têm sido isolados a partir de ambientes
geotermicamente estáveis. Estes termofílicos não apenas resistem, mas também
requerem altas temperaturas para sobreviver.
Os microrganismos termofílicos incluem quer termófilos moderados com
temperaturas ótimas de crescimento entre 40 e 50°C como termófilos extremos
capazes de crescer otimamente a temperaturas entre 65 e 85°C.
A distribuição biogeográfica de bactérias termofílicas tem sido alvo de muitos
estudos (Wiegel et al, 1979; Mutzel et al, 1996; Rahman et al, 2004), sobretudo desde
há cerca de uma década quando foram isoladas bactérias do género Geobacillus, com
temperatura ótima de crescimento de 70°C em solos temperados frios (temperatura
máxima de 15°C da Irlanda do Norte (Marchant et al, 2002, 2008). Estes autores
propuseram uma origem endémica destes isolados, pois foram obtidos de solos sem
qualquer característica geotérmica e encontrados em número significativo em
camadas subsuperficiais do solo. Huber et al (2009,2010) isolaram bactérias
termofílicas anaeróbias em sedimentos marinhos recolhidos no Ártico e sugeriram que
a sua presença neste ambiente hostil era devido à proximidade de reservatórios de
petróleo no subsolo, que apresentam temperaturas mais elevadas.
A comunidade científica dividiu-se em duas linhas de pensamento acerca da
presença de termófilicos em solos temperados. A ocorrência de isolados pode ser
resultado do transporte e dispersão a curta ou longa distância através de via aérea ou
aquática, de ecossistemas a maiores latitudes que apresentam elevadas temperaturas
médias do solo (Portillo et al, 2008; Huber et al, 2009; Marchant et al, 2010). Esta
teoria é apoiada por estudos de dispersão de partículas proveniente da Africa
Sahariana no espaço Europeu ou da América do Norte. Outra corrente aponta para
uma adaptação e especialização in situ, pelo menos nalguns casos, de modo a explorar
nichos espaciais e temporais, como resultado de um longo processo evolutivo (Portillo
et al, 2012). Essa adaptação seria independente, claro está, dos mecanismos de
transporte iniciais dos termófilicos, sendo que presentemente estes representam taxa
endémica e uma minoria estabelecida entre a comunidade bacteriana do solo
temperado.
10
Figura 6 : Imagem de satélite mostrando um trajeto de transporte e dispersão de partículas com origem no Sahara no dia 13 de setembro e 2001, usando SeaWiFS e modelo de dispersão baseado nas estações EARLINET
Fonte: (http://visibleearth.nasa.gov/data/ev102/ev10286_S2001286.L1A_HROM_DUN_CAN.EuropeDust.png)
(http://www.earlinet.org/index.php?id=earlinet_homepage)
Os mecanismos de sobrevivência das bactérias termofílicas em solo temperado,
em particular em solos nórdicos estão sob estudo; é de facto surpreendente que estes
microrganismos possam sobreviver em solos onde são incapazes de crescer. Na
literatura, encontra-se documentado que bactérias Gram-positivas termofílicas, que
produzem endósporos (p.e. Bacillales e Clostridia), podem sobreviver por longos
períodos de tempo, resistindo a condições extremas como a seca, radiação UV e frio.
(Saffary et al, 2002). Contudo o trabalho de Marchant el al (2002 e 2008) bem como o
de Portillo et al, (2012) confirmam que uma fração desses termofílicos está presente
nos solos sob forma vegetativa. A possibilidade de um crescimento muito lento mas
contínuo, foi sugerida por Marchant et al (2008). Assim, é possível que em ambientes
terrestres temperados como aqueles presentes a latitudes mais próximas dos polos,
um crescimento lento resulte num aumento de células viáveis. Contudo, em locais de
maior temperatura, as bactérias termofílicas podem ter oportunidade de crescimento
a taxas elevadas durante as estações mais quentes. Tal será o caso nos países do Sul da
Europa e regiões de latitude similar onde a temperatura de camadas superficiais do
solo pode facilmente ultrapassar os 40°C durante o verão (Santana et al, não
publicado).
Apesar de representarem uma minoria dentro das comunidades bacterianas do
solo, as bactérias termofílicas estão metabolicamente ativas. Num estudo recente de
quantificação relativa do RNA ribossomal por RT-PCR (reação de transcrição reversa,
seguida de amplificação por PCR) em tempo real, efetuado em amostras ambientais e
visando os géneros Brevibacillus, Geobacillus, e Ureibacilllus foram detetadas frações
metabólicas de RNA bacteriano termofílico até 3.14% da comunidade bacteriana
11
(Portillo et al, 2012). Esta quantificação relativa foi também realizada em função da
temperatura, revelando que a porção de RNA termofílico em comunidades bacterianas
do solo depende da temperatura. Assim, estas bactérias termofílicas poderão
desempenhar um papel metabólico ativo em alguns solos temperados, pelo menos,
dentro de um período sazonal mais quente.
6. Papel e impacto das bactérias termofílicas em ambientes
terrestres
Diversos estudos caracterizam o cultivo, isolamento e classificação de estirpes
termofílicas, muitos focam o interesse em processos e produtos metabólicos passíveis
de uso em processos industriais, graças por exemplo ao facto destes microrganismos
possuírem enzimas termoestáveis (Wiegel et al, 1979; Mutzel et al, 1996; Rahman et
al, 2004). Contudo, a recente descoberta de isolados termofílicos extremos em solos
temperados revela uma lacuna no estudo do potencial metabólico destas bactérias.
Gonzalez e colaboradores (Portillo et al (2012); Santana et al (2012)) realizaram
diversos estudos que permitiram concluir da capacidade de alguns membros do
Phylum Firmicutes, em particular, dos géneros Geobacillus, Brevibacillus e Ureibacillus,
na mineralização do azoto e do enxofre orgânicos. Inicialmente, foram efetuados
enriquecimentos seletivos de sedimentos recolhidos em diferentes locais, em meio
rico, por incubação a diferentes temperaturas (25°C e 50°C). A monitorização do
amónio e sulfato produzidos ao longo do tempo revelou uma produção similar a
superior do ião amónio e nítidamente superior de ião sulfato a 50ºC. Foram isoladas
bactérias mesofílicas e termofílicas a partir das amostras estudadas, respetivamente a
25°C e a 50°C e efetuadas culturas destes microrganismos pertencentes às
comunidades microbianas sob estudo. Também aqui se verificou um aumento
significativo da produção de sulfato; nalgumas estirpes, o conteúdo em sulfato
libertado para o meio de cultura era dez vezes superior ao valor produzido pelos
mesofílicos, o qual nunca foi superior ao valor máximo de 0.2 mM, este registado para
um isolado do género Paenibacillus. Verificou-se também que as culturas de
termófilicos suplementadas com tiossulfato ou não suplementadas apresentavam
valores similares de concentração de sulfato solúvel. O tiossulfato é um intermediário
da oxidação do enxofre inorgânico e a maioria das bactérias que a efetuam são
capazes de oxidar o tiossulfato a sulfato (Madigan et al, 2003) Este resultado mostra
que a produção de sulfato pelos isolados termófilicos é independente da oxidação de
fontes de enxofre inorgânico. Pelo contrário, trata-se de uma oxidação dissimilativa do
enxofre orgânico, já que os autores observaram uma proporcionalidade na
concentração de sulfato com a disponibilidade de nutrientes orgânicos. Esta
proporcionalidade também se observa relativamente à concentração de amónio no
meio de cultura.
12
Estes resultados revestem-se de particular importância, dado que é validado o
papel de bactérias termofílicas de solos temperados na mineralização de biomassa
com consequente produção de sulfato e amónia; as bactérias termófilas serão capazes
de explorar nichos espaciais e temporais para participar nos ciclos biogeoquímicos do
azoto e enxofre, conforme indicado pelas setas na figura 1 (ciclo do azoto) e figura 2
(ciclo do enxofre). Fica também refutada a afirmação sobre o papel limitante das
bactérias na mineralização do S-orgânico, afirmação baseada em estudos efetuados a
temperatura moderada (20°C) (Ghani et al, 1993). A participação das bactérias
termofílicas isoladas do solo na mineralização direta do S-orgânico define uma nova via
no ciclo do enxofre – oxidação dissimilativa do enxofre – tal como apresentada na
figura 2.
Atendendo a que tanto o azoto como, em particular, o enxofre orgânicos,
constituem frações maioritárias do N e S em ambientes terrestres, e que ambos os
elementos são nutrientes fundamentais para as plantas, as capacidades das bactérias
termofílicas aqui descritas reveste-se da maior importância para o estabelecimento de
modelos agrícolas mais produtivos e sustentáveis. Nestes futuros modelos é possível
prever a possível aplicação destas bactérias como adjuvantes na fertilização em solos
temperados, com carência em enxofre e/ou azoto (Santana et al, não publicado).
7. Efeito do cobre nas comunidades bacterianas
O cobre é um elemento que ocorre naturalmente em todos os ecossistemas. É
considerado um micronutriente essencial para os seres vivos, participando nos
processos de respiração (participa na cadeia transportadora de eletrões como parte da
enzima citocromo c oxidase), fotossíntese e como cofactor da enzima superóxido
dismutase (SOD, EC 1.15.1.1) (Madigan et al, 2003). No entanto, em elevadas
concentrações, o cobre é extremamente tóxico; a toxicidade do cobre pode estar
relacionada com a síntese de espécies reativas de oxigénio (ROS) e consequente stress
celular (ver secção 8).
O cobre presente no solo encontra-se maioritariamente no estado oxidativo +2
(ião cúprico – Cu+2), sendo esta forma mais solúvel e disponível para a biota em
condições acídicas (Brady et al, 2000). Uma fração do ião encontra-se na camada
subsuperficial do solo, associada através de processos de quelação com moléculas de
húmus e constituindo uma reserva no solo (Brady et al, 2000). O fluxo deste elemento
para os solos provém de várias fontes tais como emissão aérea e efluentes de
indústrias metalúrgicas e eletrónicas, poluição atmosférica devido ao tráfico, efluentes
de centrais de tratamento de água e esgotos, bem como às aplicações na agricultura
como pesticida, fungicida e fertilizante. Devido ao uso contínuo de fertilizantes e
fungicidas e a um elevado índice de bioacumulação, os solos agrícolas normalmente
13
apresentam valores elevados de concentrações de cobre, o que pode levar a uma
fitotoxicidade nas plantas A quantificação da concentração de cobre nos solos revelou
valores compreendidos entre 0.3 e 15 mg/kg de solo (Laboratório Químico Agrícola,
2006). No entanto, já foram reportados valores que excedem 3000mg/kg em solos
florestais com elevados valores de ácidos húmicos (Kiikila et al, 2000)
Lejoin et al (2010) avaliaram os potenciais efeitos de contaminações de cobre
nas comunidades bacterianas. Para isso os autores recorreram a incubações de
microcosmos (ecossistema artificial, usado para estimular e prever comportamentos
de ecossistemas naturais em condições controladas) com distintos tipos e quantidades
de matéria orgânica do solo. Em cada microcosmo, procedeu-se à adição de 250 mg de
Cu por kg de solo, um valor elevado. Resultados da contagem e caracterização
molecular bacteriana indicaram que o impacto do cobre na comunidade bacteriana
presente dependia das propriedades bioquímicas da matéria orgânica presente. Em
relação à diversidade bacteriana, a amplificação genómica do 16S rRNA bacteriano e
subsequente comparação das sequências obtidas com as da base de dados no
GenBank, revelou a ausência de diferenças significativas nas comunidades bacterianas
resistentes ao cobre. A classe α-Proteobacteria era a mais representativa (53-57%),
com o género Methylobacterium em destaque. Os Firmicutes representavam 38-43%
da comunidade, sendo maioritariamente Staphylococcus (17-37%) e Bacillus (6-17%).
8. Cobre como bioelemento
O potencial redox do par Cu2+/ Cu+ faz com que este elemento seja cofactor de
mais de 30 enzimas, denominadas coproenzimas, em eucariotas superiores (Karlin,
1993). Dependendo do tipo de coordenação entre o ião e a proteína, o potencial redox
pode variar entre 200 a 800 mV. Em ambientes anaeróbios, como na atmosfera
primordial, o cobre encontrava-se na forma de Cu(I) em sulfuretos insolúveis e apenas
biodisponível em condições acídicas, como fontes hidrotermais, onde a concentração
de iões metálicos é elevada. O surgimento de oxigénio na atmosfera pela possível ação
de cianobactérias há 3 biliões de anos, levou a que muitos organismos adquirissem um
metabolismo oxidativo. As enzimas envolvidas em metabolismos anaeróbios tiveram
de se adaptar à presença do di-oxigénio, com a procura de um metal com elevado
potencial redox para lidar com as capacidades oxidativas do oxigénio. Assim o Cu(I)
sofreu uma oxidação a Cu(II), um ião solúvel, aumentando a sua biodisponibilidade
(Solioz et al, 2010)
A presença de metaloproteínas no domínio Bacteria é relevante. A análise
bioinformática de sequências genómicas, quanto à presença de genes codificantes de
metaloproteínas implicadas no transporte de cobre ou de coproenzimas envolvidas em
processos metabólicos vários mostrou que o Phylum Actinobacteria (gram-positivos
14
comuns na comunidade microbiana de ecossistemas terrestres e aquáticos e
participantes ativos no ciclo do carbono pela decomposição de matéria orgânica)
apresenta uma taxa de ≈ 90% de membros com coproproteínas (Ridge et al, 2008). No
Phylum Firmicutes essa taxa decresce para 50%, com a particularidade de as espécies
deste Phylum que apresentam coproproteínas, terem um genoma médio de 3 Mb,
superior aos que não as possuem (2.3 Mb) (Solioz et al, 2010)
O Phylum Cyanobacteria constitui o único grupo bacteriano que necessita de
importar iões cobre para o espaço citoplasmático para a síntese de coproenzimas. Os
restantes grupos apresentam coproenzimas situadas na membrana citoplasmática ou
no periplasma, parecendo não requerer cobre intracelular (Solioz et al, 2010). Em
particular, em bactérias Gram-positivas, as enzimas associadas à homeostase do cobre
poderão ter como única função a expulsão do cobre (Solioz et al, 2010).
Até à presente data, todos os genomas sequenciados de microrganismos,
mesmo os que não possuem qualquer proteína dependente de cobre, apresentam um
ou vários mecanismos de defesa contra a toxicidade do cobre, através da presença de
proteínas exportadoras de cobre. Uma explicação para este facto pode residir no
processo evolutivo que ocorreu nos ecossistemas primordiais, onde elevadas
temperaturas, acidez e consequentes altas concentrações de metais pesados
dissolvidos causaram a prioridade evolutiva no desenvolvimento de mecanismos de
defesa contra estes elementos tóxicos.
É frequente a referência à toxicidade do cobre como resultado da formação de
espécies reativas de oxigénio, nomeadamente radicais hidroxílicos (OH), peróxido de
hidrogénio (H2O2) e superóxido (O2-), através de uma reação de Fenton. Também a
oxidação de sulfidril (R-SH) mediada pelo Cu (II) com a formação de dissulfureto (R-SS-
R) foi avançada como causadora de stress celular. No entanto, vários dados
experimentais incluíndo a descoberta de que os níveis de cobre livre intracelular são
mínimos ou mesmo não existentes (Solioz et al, 2010) levaram à consideração de
outros mecanismos de toxicidade além do stress oxidativo. Dados recentes
demonstram um novo mecanismo de toxicidade associado à destruição dos centros
ferro-enxofre de enzimas, devido à deslocacão do ferro pelo cobre (Macomber et al,
2009)
O sistema de homeostase do cobre mais estudado é o de Enterococcus hirae,
bactéria gram-positiva da classe Bacilli. Esta possui o operão que contem os genes
copY, copZ, copA e copB; copA e copB codificam ATPases transportadoras de cobre,
copY codifica um repressor transcripcional dependente do cobre, que desbloqueia a
transcrição do operão em condições de excesso do ião. O gene copZ codifica uma
molécula chaperone de cobre cuja função é guiar o transporte intracelular do ião. Este
operão permite que a bactéria cresça em meios com concentrações de cobre até 8mM
e em condições onde o cobre esteja limitado (Solioz et al, 2010). A via de homeostase
15
inicia-se com a entrada do cobre na célula via ATPase copA. O cobre citoplasmático em
excesso liga-se ao chaperone copZ que pode doar o cobre excedente à ATPase copB ou
ao repressor, o qual associado ao cobre se liberta da sequência promotora do operão,
deste modo induzindo a transcrição dos genes a jusante. Em concentrações baixas de
cobre, copY associa-se a átomos de zinco e permanece associado à sequência
promotora, impedindo a transcrição do operão. (Solioz et al, 2003, 2010).
Em Bacillus subtilis, o gene csoR localizado a montante do operão copZA ,
codifica um repressor transcripcional que sob elevado nível de cobre leva à
desrepressão de copZA. As proteínas codificadas pelo operão são responsáveis pelo
efluxo de cobre. Chillappagari et al (2009) reportaram a identificação de um gene –
ycnJ com papel fundamental no metabolismo do cobre nesta bactéria. ycnJ é
sobreexpresso em condições limitantes de cobre e um mutante de delecção neste
gene tem um crescimento reduzido em condições limitantes deste elemento. Estes
dados revelam o papel de YcnJ no transporte de cobre para a célula através da
membrana citoplasmática (Cooksey et al, 1994). A montante de ycnJ encontra-se o
gene ycnK que codifica um repressor transcripcional da síntese de YcnJ. Quando
associado ao cobre, o repressor impede a transcrição de ycnJ. Este sistema permite
regular a síntese do transportador mediante a disponibilidade celular de cobre (Figura
7)
Figura 7: Modelo de homeostase do cobre para Bacilllus subtilis. (adaptado de Chillapaggari et al, 2009)
Os repressores transcripcionais CsoR e YcnK estão representados a verde quando ativos e a vermelho quando
inativos.
Redução
16
Também em bactérias gram-negativas, da classe γ-Proteobacterias é possível
encontrar diferentes mecanismos de resistência a um excesso de cobre intracelular.
Estudos realizados em diversas estirpes fitopatogénicas de Pseudomonas syringae
expostas a concentrações elevadas de cobre mostraram uma acumulação de iões Cu2+
no espaço periplasmático e membrana externa. Este sequestro de cobre é
determinado por proteínas de ligação ao cobre, localizadas no espaço periplasmático
(CopA e CopC) e na membrana (CopB e CopD) (Cooksey et al, 1991), e codificadas pelo
operão de resistência ao cobre copABCD. Este operão está presente num plasmídio, e
é regulado pelos genes do operão copRS, também localizado no mesmo plasmídeo. A
produção das proteínas Cop é feita por indução do cobre (Chillappagari et al, 2009).
Os sítios de ligação ao cobre da proteína periplasmática CopA mostram uma
conservação com sítios de ligação ao cobre de proteínas homólogas presentes em
procariotas gram-negativos como E. coli. Mas, apesar desta homologia os mecanismos
de resistência ao excesso de cobre intracelular são distintos. A resistência ao cobre em
E.coli faz-se por mecanismos de efluxo deste ião, enquanto que em Pseudomonas
syringae, o cobre citosólico em excesso é sequestrado (Chillappagari et al, 2009).
Estudos reportando a resistência ao cobre por parte de membros da classe β-
proteobacteria são praticamente inexistentes. Análises de polimorfismos de
fragmentos de restrição terminais (T-RFLP) em sedimentos recolhidos num lago
severamente contaminado com cobre identificaram isolados do género Ralstonia
(Ordem Burkhoderiales, família Ralstoniaceae). O mecanismo de resistência ao cobre
foi identificado por microscopia eletrónica de varrimento, consistindo num mecanismo
de sequestro deste elemento. A nível molecular, o mecanismo de resistência está
associada à presença de um operão de resistência ao cobre copABCD, homólogo ao
presente em bactérias γ-Proteobacterias, como a já descrita Pseudomonas syringae
(Konstantinidis et al, 2003).
9. Métodos moleculares na análise da dinâmica de comunidades
bacterianas
Devido à sua importância, diversas técnicas moleculares foram utilizadas para o
estudo de comunidades microbianas nos seus ecossistemas. As técnicas ditas
“clássicas” consistem no uso de sondas, por exemplo oligonucleótidos específicos
usados para detetar por hibridação um dado grupo microbiano (Ravenschlag et al,
2000). Outras utilizam como base a reação de PCR. Por exemplo, a técnica ARDRA (do
inglês Amplified rDNA restriction analysis) consiste numa amplificação com primers
específicos para as regiões conservadas do gene 16S rRNA, seguida do uso de
endonucleases de restrição que irão reconhecer sítios específicos no genoma. Os
17
fragmentos obtidos após clivagem são representativos das espécies analisadas (Sklarz
et al, 2009)
A eletroforese em gel de gradiente de desnaturação (DGGE) é uma técnica
molecular de fingerprinting muito utilizada na caracterização estrutural e na análise da
dinâmica de comunidades microbianas. De facto, este método permite demonstrar a
diversidade e alterações de populações, registando diferenças não detetáveis por
outros métodos de fingerprinting. O uso desta técnica apresenta algumas limitações,
por exemplo, requer uma concentração significativa de DNA, obrigando a uma prévia
amplificação por PCR (Green, 2005), o que significa que todos os problemas que
podem estar associados a esta técnica, como a conceção de primers, a definição de
condições ótimas de amplificação, etc., devem ser considerados.
O princípio básico desta técnica consiste na separação dos fragmentos de DNA
de cadeia dupla com tamanho idêntico mas diferentes sequências nucleotídicas. A
análise electroforética destes produtos de PCR é feita em gel de acrilamida contendo
um gradiente de um agente desnaturante. Os fragmentos de cadeia dupla de DNA
ricos em guanina e citosina (G-C) apresentam maior estabilidade devido às três
ligações de hidrogénio por par. Assim a cadeia dupla dos fragmentos só irá dissociar-se
quando atingir uma maior concentração de desnaturante. As moléculas de DNA de
cadeia dupla apresentam assim uma maior distância de migração no gel de acrilamida,
enquanto as moléculas de DNA desnaturado migram a menor velocidade ou mesmo
deixam de migrar (Green, 2005).
O uso do DGGE como ferramenta para análise de comunidades microbianas é
complementado pela análise de sequências nucleotídicas para identificação de
componentes de interesse na população. Uma das desvantagens deste método na
análise de comunidades bacterianas consiste na resolução dos géis utilizados:
múltiplas sequências podem apresentar comigração; também podem obter-se
múltiplas bandas correspondentes ao mesmo microrganismo (Green, 2005). Isto
acontece frequentemente quando são usados os genes 16SrRNA, dada a existência nos
procariotas de operões com múltiplas sequências heterogéneas desses genes. Assim,
quando se recorre à excisão de bandas e após reamplificação se verifica que
constituem uma mistura de sequências, o produto dessa reamplificação é triado num
novo DGGE. Desse modo, é possível verificar qual subproduto de PCR reflete a banda
excisada. Alternativamente, o produto de PCR pode ser usado de imediato para a
obtenção de clones, os quais são triados num novo DGGE, em paralelo com o PCR da
amostra ambiental (Green, 2005).
18
Objetivos gerais
Estudo da diversidade microbiológica em solo agrícola temperado, sob efeito
de diferentes temperaturas e tratamento com cobre, com especial atenção à
proporção de bactérias do Phylum Firmicutes e Proteobacteria.
Relação entre essa diversidade microbiológica e fisiologia microbiana, com
relevo para a produção microbiana de amónia e sulfato.
Isolamento de bactérias termofílicas, produtoras de sulfato e resistentes ao
cobre.
Objetivos específicos
Uso de métodos bioquímicos para determinação do conteúdo de vários
elementos em amostras de solo diretas e enriquecidas.
Aplicação de técnicas moleculares de “fingerprinting” (DGGE - Denaturing
Gradient Gel Electrophoresis) para o estudo da diversidade e posterior
sequenciação.
Utilização de métodos clássicos de microbiologia para isolamento de bactérias
resistentes ao cobre.
19
Metodologia
1. Recolha de amostras do solo e caracterização do local de
amostragem
As amostras de solo foram recolhidas num local designado setor 1, de um olival
de variedade cobrançosa, pertença da Fundação Eugénio de Almeida, freguesia de São
Manços, concelho de Évora. Nesse olival, a sementeira é feita por enrelvamento linha
a linha, o que resulta numa menor erosão do solo.
O solo é pobre em matéria orgânica e sob tratamento fitossanitário com
Cuprital® (oxicloreto de cobre, Cl2Cu4H6O6) com recurso a atomizador com cone de
proteção, tratamento executado aproximadamente trinta dias antes da recolha das
amostras de solo. Este apresentava-se húmido devido à forte pluviosidade e baixas
temperaturas características da época em que foi efetuada a recolha (novembro de
2011)
A recolha das amostras foi efetuada numa camada superficial do solo, onde é
expetável a presença de grande mistura mineral com húmus e foi executada de modo
a minimizar o fator humano, com uso de luvas e com limpeza do material de recolha
com etanol, efetuada entre cada amostragem. As amostras recolhidas foram colocadas
em tubos de Falcon estéreis e devidamente identificados, transportados em gelo, e
também recolhidas para sacos, devidamente identificados, para posterior análise dos
parâmetros físico-químicos no laboratório Químico Agrícola da Universidade de Évora.
Foram recolhidas 4 amostras compostas, constituídas por 3 furos paralelos e
foram medidas a profundidade e temperatura do solo no ponto de recolha. As
amostras foram designadas: T-DC-debaixo de copa com solo tratado-, T-EC -entre
copas com solo tratado-NT-DC-debaixo de copas com solo não tratado- e NT-EC -entre
copas com solo não tratado. As amostras foram colhidas entre 4,0-7,5cm de
profundidade; as temperaturas no sítio da recolha foram distintas para as diferentes
amostras sendo a mínima de 7,6°C e a máxima de 13,2°C (tabela 1).
20
Tabela 1: Parâmetros registados na recolha de amostras
Amostras T-DC T-EC NT-DC NT-EC
Furos # I II III I II III I II III I II III
Profundidade –
recolha (cm)
4.5 -
5.0
4.5 –
7.0
4.0
- 7.0
4.5 -
7.5
4.5 -
6.0
4.0 -
6.0
5.0 -
6.5
4.5 -
7.5
5.0 -
6.0
4.0 -
6.0
3.5 -
5.5
4.0 -
5.5
Temperatura (°C) 7.6 7.9 7.8 9.3 9.1 9.3 13.2 13.2 13.1 9.6 10.0 10.6
Figura 8: Fotografia do local de amostragem (Google Earth, 2012)
A): T-DC-debaixo de copa com solo tratado; B) T-EC -entre copas com solo tratado; C) NT-DC-debaixo de copas com solo
não tratado; D) NT-EC -entre copas com solo não tratado
2. Enriquecimento seletivo das amostras em diferentes condições
Foram preparados previamente nove meios de cultura NB (Nutrient Brot
Oxoid), em erlenmeyers de 100 mL, divididos em três séries: a primeira consiste em 15
mL de meio (controlo); a segunda em 15 mL de meio ao qual foi adicionado sulfato de
cobre penta hidratado (CuSO4.5H2O) a uma concentração final de 100 µM. A terceira
21
série consiste em 15 mL de meio a que foi adicionado sulfato de cobre com uma
concentração final de 500 µM. Procedeu-se a uma aferição do valor de pH dos meios.
A cada meio de cultura previamente esterilizado, foi adicionado 6,00 g da
amostra composta NT-EC1 (entre copas com solo não tratado) em ambiente estéril,
amostra esta que revelou menor conteúdo em cobre.
Os meios foram incubados cerca de 24 horas a 180 rpm e duas temperaturas
diferentes: 30°C; 50°C durante cerca de 24 horas. Um dos erlenmeyers inicialmente a
50°C foi posteriormente transferido a 80°C durante cerca de 7 horas, sem agitação,
conforme indicado no esquema 1:
Esquema 1: Enriquecimento seletivo das amostras a diferentes condições de temperatura e concentração de sulfato de cobre
A escolha destes valores de temperatura baseou-se nas temperaturas de
crescimento de bactérias mesofílicas e termofílicas, conforme descrito na literatura
(Wiegel et al, 1979; Mutzel et al, 1996; Rahman et al, 2004).
A par da recolha de amostras, para as quantificações descritas nas secções 2.1 e
2.2. e para extração de DNA (secção 3.), foram realizadas diluições seriadas (diluições
decimais sucessivas) em meio NB a partir destes enriquecimentos. As diluições 10-6 e
10-8 foram plaqueadas em NBA (Nutrient Broth com 15% p/v Agar) por dispersão de 50
e 100 µL e as placas incubadas a 50°C durante 24 horas. Após este período, foram
calculadas as unidades formadoras de colónias (cfu/mL) para cada enriquecimento,
conforme equação 1.
Equação 1: Cálculo de unidades formadoras de colónias
22
2.1. Quantificação de amónio presente nos enriquecimentos
Para a quantificação do amónio presente em cada enriquecimento, utilizou-se
o protocolo descrito por Kartal et al (2000), com ligeiras modificações. Este protocolo
tem como base a interação entre o-fthalaldeido (OPA) e β-mercaptoetanol, dois dos
constituintes do reagente utilizado (reagente A) com formação de o-fthalaldeído β-
mercaptoetanol (OPAME), um agente fluorogénico. Este agente reage com aminas
primárias quando excitado a 420 nm. Preparou-se previamente 50 mL de reagente A,
pela adição de 5 mL de etanol (Aga®) e 45 mL de tampão fosfato a 400 mM, a 0.249 g
de OPA (Fluka®). 50 µL de β-mercaptoetanol são adicionados ao reagente A no
momento da quantificação.
Para a curva de calibração, prepararam-se soluções de concentração conhecida
de cloreto de amónio em água destilada. Após a adição de 40 µL de cada solução de
calibração e 40 µL de água destilada (branco) a 760 µL de reagente A, deixou-se
repousar cada mistura à temperatura ambiente durante 20 min. As soluções
homogenizadas foram transferidas em seguida para uma placa de microtitração e leu-
se a absorvância a 415nm com uso do leitor de microplacas (Bio-Rad Model 680). As
soluções foram lidas em triplicado.
Para a leitura das amostras, procedeu-se de início a uma centrifugação a 12 000
g durante 5 min de 1 mL de cada meio enriquecido e recolheu-se o sobrenadante, o
qual foi adicionado ao Reagente A, como acima descrito; a mistura obtida foi tratada
de igual modo. Foram usados como branco os meios respetivos, não inoculados,
submetidos ao mesmo procedimento. A absorvância foi lida a 415nm no leitor de
microplacas (Bio-Rad Model 680). Cada amostra recolhida foi lida em triplicado.
A análise estatistica dos resultados obtidos nos ensaios de quantificação de
amónio foi realizada utilizando análises ANOVA no programa MedCalc versão 12.3.0.
2.2. Quantificação do sulfato presente nos enriquecimentos
Na determinação da concentração do sulfato presente em cada
enriquecimento, utilizou-se o ensaio turbidimétrico descrito por Kolmet et al (2000).
Este ensaio turbidimétrico é baseado na precipitação de iões SO42- com iões Ba2+ após a
adição de cloreto de bário; essa precipitação é seguida por espectrofotometria da
suspensão resultante.
Para a curva de calibração, preparam-se soluções de concentração conhecida
de sulfato de potássio em água MilliQ. Após a adição de 1 mL de cada solução de
calibração a 1 mL de reagente condicionante, a mistura foi homogeneizada. De
seguida, 60 mg de BaCl2.2H2O (Merck®) foram adicionados. As misturas foram agitadas
no vortex durante 30 segundos. Após esta agitação, foram transferidas de imediato
para cuvettes e foram feitas leituras a 319nm, com recurso ao espetrofotómetro
23
NanoDrop® 2000 c (ThermoScientific, EUA). Um mL de água MilliQ, tratado do mesmo
modo, foi usado como branco.
Para a determinação da concentração de sulfato nas amostras, foi feita uma
centrifugação prévia a 12 000 g, durante 5 min de 1 mL de cada meio enriquecido. Ao
sobrenadante recolhido, foram adicionados 1 mL de reagente condicionante e
procedeu-se como para as soluções de calibração. Foram utilizados como branco, os
meios de enriquecimento não inoculados, tratados do mesmo modo.
A análise estatística dos resultados obtidos nos ensaios de quantificação de
amónio foi realizada utilizando análises ANOVA no programa MedCalc versão 12.3.0.
3. Isolamento bacteriano e caracterização fenotípica, fisiológica e
molecular.
O crescimento de populações microbianas em meios de cultura no laboratório
e posterior isolamento é uma das ferramentas mais utilizadas em Microbiologia e
permite a obtenção de culturas puras. O isolamento promove a separação de um
microrganismo a partir de culturas com populações mistas. As culturas puras podem
ser obtidas através de vários métodos, nos quais se visa o desenvolvimento de uma
população a partir de uma colónia formada a partir de uma única célula, e é
importante fazer subculturas a partir de uma nova colónia isolada da cultura
precedente, para certificação da pureza das culturas.
Foram plaqueados 100µL em meio NBA, em duplicado, provenientes de
diluições seriadas (ver secção 2) 10-4 a 10-7, efetuadas a partir do enriquecimento em
meio NB a 80°C contendo 500 µM de cobre. Após incubação das placas a 50°C, durante
cerca de 24 horas, foram recolhidas colónias isoladas com distintas morfologias, tendo
sido cada uma purificada em placa NBA, pela técnica do riscado. O objetivo do riscado
é o de produzir colónias bem separadas umas das outras. No riscado é usada uma
ansa, que é flamejada antes da mudança de cada direção de arrastamento da colónia
no meio, o que causa uma diminuição do número de células arrastadas ao longo do
riscado, e a formação de colónias isoladas no final deste. Após a execução do riscado,
as placas de Petri foram incubadas a 50°C, durante cerca de 24 horas.
Após esta última incubação, cada uma das colónias isoladas foi utilizada como
inóculo para crescimento em meio NB, a 50°C, 180 rpm e posterior congelamento de
alíquotas a -80oC, mediante a adição de glicerol a 15% (v/v). Amostras do crescimento
de um dos isolados obtidos foram usadas para análise morfológica por observação ao
microscópio ótico e para identificação pela coloração de Gram (ver secção 3. 1.).
24
3.1. Análise fenotípica
Para observação de microrganismos pode recorrer-se a preparações a fresco –
por exemplo para observar a mobilidade e o tipo de locomoção. Há, porém, objetivos
que tornam conveniente a coloração das preparações, como por exemplo na
diferenciação de organismos que reagem de modo diferente ao mesmo corante
(colorações diferenciais) e/ou na observação de estruturas particulares (por exemplo,
material nucleico, esporos, cápsulas, etc.)
A coloração de Gram é uma coloração diferencial específica para bactérias.
Quando são usados certos corantes básicos, as bactérias Gram-negativas podem ser
facilmente descoradas com solventes orgânicos (por exemplo, etanol, acetona),
enquanto as Gram-positivas resistem a esta descoloração, retendo o corante. A
capacidade das células reterem ou perderem o corante reflete diferenças na estrutura
fundamental da parede celular, nomeadamente ao nível da camada de peptidoglicano.
A solução de cristal violeta penetra nas células bacterianas mas, ligada á solução de
lugol, apenas consegue sair através das células Gram-negativas, que possuem uma
parede mais simples e frágil, ficando retida nas Gram-positivas, que adquirem a cor do
corante. A resposta à coloração de Gram é uma característica taxonómica importante,
usada numa fase inicial da identificação das bactérias.
A coloração de Gram foi usada no isolado obtido tanto como meio fenotípico
de identificação como teste complementar da pureza do isolado. Após preparação de
um esfregaço em lâmina de observação microscópica e fixação das células pelo calor,
estas foram coradas com uma solução de Cristal violeta (Merck®), cerca de um minuto,
e foi adicionada uma solução mordente de Lugol (Merck®), também durante um
minuto. Seguidamente, as células foram lavadas com uma solução de descoloração,
basicamente constituída por etanol, durante cerca de trinta segundos. Entre a adição
de cada reagente, foi efetuada uma breve lavagem com água destilada. Para uma
melhor visualização das bactérias Gram-negativas, foi depois adicionado durante 5
minutos, um corante de contraste, a solução de Safranina (Merck®), que apresenta
uma coloração rosada.
A análise morfológica do isolado e identificação Gram, foram realizadas
recorrendo a um Microscópio Ótico Olympus BX41 e Software Olympus Soft Imaging
GelTI.
3.2. Análise fisiológica
3.2.1 Culturas do isolado
O crescimento do isolado em meio NB a 50°C, com e sem adição de sulfato de
cobre a 500 µM, foi monotorizado pela medição da densidade ótica a 600 nm com o
espetrofotómetro Beckman DU530. Procedeu-se à quantificação do sulfato produzido
em meio NB com 500 µM de cobre, tal como descrito na secção 2.2.
25
Para contabilizar os esporos formados em cultura, foram retiradas alíquotas e
aquecidas a 100°C durante 10’. Foram efetuadas diluições seriadas em meio NB e 50
μL de cada diluição foram plaqueados em meio NBA; as placas foram retiradas ca 24h
depois para estimação do número de esporos germinados
3.2.2 Quantificação da Proteína celular total do isolado
O ensaio de quantificação de proteína baseou-se no método do Coomassie,
também conhecido por Bradford (Bradford et al, 1976). Este ensaio tem como base a
alteração da absorvância do reagente azul brilhante de Coomassie G-250 de 465 nm
para 595 nm, devido à formação de um complexo aniónico quando o corante se liga a
resíduos de proteína. Este método é sensível, com um nível de quantificação mínimo
de 1µg de proteína. O método sofre interferências na presença de detergentes, mas
não é afetado pela presença de agentes redutores e de iões metálicos.
Foi feita uma curva de calibração, com soluções de concentração conhecida de
soro de albumina bovina (BSA, Promega®) em água destilada. A 250µL de cada solução
de calibração adicionou-se, num microtubo, 250µL de hidróxido de sódio 1M. A
solução foi homogeneizada e incubada a 99°C, durante 10 minutos. Após
arrefecimento da solução à temperatura ambiente durante 15 minutos, esta foi
neutralizada pela adição de 50µL de ácido clorídrico 6M. Foram de seguida adicionados
500µL de reagente de Bradford (Sigma®). A mistura foi agitada no vortex e deixada à
temperatura ambiente durante 15 minutos. Por fim, a absorvância foi lida a um
comprimento de onda de 595nm, contra água destilada, tratada de igual modo. Para a
leitura da absorvância foi utilizado o espetrofotómetro Beckman DU530.
As amostras a quantificar foram retiradas do crescimento do isolado em meio
nutritivo e centrifugadas a 12 000 g, durante 3 minutos; o sobrenadante foi usado para
quantificar o sulfato produzido, enquanto o pellet é ressuspendido em água destilada,
previamente esterilizada, e submetido a um tratamento de lise com hidróxido de sódio
e subsequente neutralização com ácido clorídrico, como descrito no parágrafo
anterior. Foram então adicionados 500µL de reagente de Bradford a 500µL do lisado e
feita a leitura da absorvância a 595nm como acima mencionado.
3.3. Análise molecular
Para obter uma afiliação taxonómica de isolados, recorre-se a uma amplificação
por PCR do gene 16S rRNA. A técnica de PCR – “Polymerase chain reaction” é muito
usada em Biologia Molecular, pela sua praticabilidade. Consiste na capacidade de
desnaturação da cadeia dupla da molécula de DNA, seguida de uma renaturação das
cadeias complementares, amplificadas pela ação de uma polimerase termoestável. São
efetuados vários ciclos de desnaturação, amplificação e renaturação, pelo uso de
diferentes temperaturas em cada ciclo. A técnica é realizada in vitro, no interior de
tubos adequados.
26
Cada tubo contém uma solução aquosa com a amostra de DNA a amplificar,
uma mistura de desoxirribonucléotidos trisfosfatados (dNTPs mix), cloreto de
magnésio, pois o Mg2+ atua com cofator da polimerase, tampão PCR para estabilizar o
pH da reação, uma solução de dois oligonucleótidos iniciadores (também
denominados primers) de 18-30 pb e complementares à extremidade 3’ de cada
cadeia da sequência alvo e um dado volume de enzima. De salientar que em alguns
tampões comerciais, o MgCl2 já se encontra presente.
O processo de amplificação inicia-se então com a etapa de desnaturação onde
ocorre uma separação da cadeia dupla do DNA. As cadeias simples resultantes
constituem cadeias molde onde se associam os primers por emparelhamento
(annealing). O emparelhamento ocorre a uma temperatura condicionada pela
temperatura de dissociação dos primers à cadeia molde. A última etapa corresponde
ao alongamento das cadeias complementares por ação da enzima DNA polimerase que
adiciona dNTP’s complementares à cadeia molde. A temperatura desta última etapa
corresponde à temperatura de máxima atividade da polimerase. Cada ciclo do
processo permite duplicar a concentração de DNA.
Para a obtenção da sequência parcial do gene 16S rRNA do isolado, procedeu-
se de início à lise celular de uma única colónia. Com um palito estéril retirou-se uma
porção de uma colónia, a qual foi colocada num microtubo com 50µL de água MilliQ. O
microtubo foi colocado a 60°C, durante 15 minutos, depois a -20°C, durante cerca de
45 minutos e novamente a 60°C, durante 15 minutos. Este choque térmico em água
permite a lise celular e libertação do DNA molde a ser amplificado.
Após arrefecimento à temperatura ambiente, uma alíquota do lisado foi
utilizada para a reação de PCR. Os primers usados foram 341F (5’-CC TAC GGG AGG
CAG CAG-3’) e o 907R (5’ -C CGT CAA TTC MTT TGA GTT T-3’) (Muyzer, 1993). Estes são
primers universais bacterianos que têm como alvo de hibridação regiões conservadas
do gene 16S rRNA, mas permitem a amplificação de variantes informativas na
atribuição a um dado grupo taxonómico. As letras F e R referem-se aos termos em
inglês Forward e Reverse, respetivamente. O primer forward, encontra-se próximo da
extremidade 5’ do DNA e tem sequência igual à da cadeia modelo, o primer reverse
encontra-se próximo da extremidade 3’ e tem sequência complementar e reversa à da
cadeia modelo. A amplificação foi efetuada num volume total de 50µL, contendo
Tampão de PCR 1X, 0.2mM de dNTP’s, 0.4µM de cada primer, 0.25µL de enzima
FideliTaq DNA Polimerase 5U/µL (USB®, EUA) e 5µL do lisado.
A reação de PCR foi realizada no termociclador (Bio-Rad MyCycler) e iniciou-se
com uma etapa de desnaturação a 95°C durante 2 minutos, seguida de 35 ciclos, cada
um com três etapas consecutivas: desnaturação a 95°C, durante 30 segundos,
annealing a 54°C, durante 30 segundos e extensão a 68°C, durante 50 segundos. O
último ciclo foi seguido de uma etapa de extensão adicional a 68°C, durante 5 minutos.
27
Para verificar o tamanho do produto amplificado (ca 600 pb) e para estimar a
sua concentração, foram depositados 5µL do mesmo num gel de agarose (2% p/v em
tampão de corrida TAE 1x). Foi aplicado num dos poços do gel 5µL de marcador de
peso molecular de DNA 1Kb Plus DNA Ladder (Invitrogen®) a 100ng/µL. A deposição
em gel necessita da adição prévia no DNA a visualizar de um tampão de depósito (2µL),
o qual contém um componente viscoso, neste caso o glicerol, e um corante, neste caso
o azul de bromofenol, permitindo, respetivamente, a fácil deposição e a visualização
da migração em gel; a migração durou cerca de duas horas a uma diferença de
potencial de 70 volts. Após a migração, o gel foi colocado numa tina com brometo de
etídio (0.5mg/L) durante 10 minutos. Este agente intercalante do DNA é usado com
frequência para a visualização de ácidos nucleicos, devido à sua fluorescência quando
exposto à luz ultravioleta. Assim, o gel foi retirado da tina e colocado num
transiluminador sob luz UV e fotografado com o Software Kodak Gel Logic 200 (Kodak,
EUA).
O fragmento amplificado foi cortado do gel com uma lâmina de bisturi e
purificado com o kit DNA Clean & ConcentrationTM (Zymo Research®, EUA), de acordo
com as instruções do fabricante. O DNA extraído e purificado foi posteriormente
sequenciado, com uso dos primers acima referidos, nos Laboratórios da Empresa
Macrogen Inc.®.
4. Extração de DNA total e quantificação
O sucesso da técnica de DGGE, como outras de “fingerprinting”, depende da
obtenção de ácidos nucleicos íntegros, livres de nucleases e de inibidores da reação de
PCR. Ora, o solo inclui, entre muitas outras enzimas, nucleases libertadas pelos
microrganismos em proliferação ou pela decomposição de animais e plantas após a
morte. Estas enzimas são resistentes à inativação e encontram-se adsorvidas às
partículas de argila, mantendo a sua atividade.
Na camada superficial do solo é comum existir húmus, um material amorfo, de
composição variada e muito higroscópico. Os coloides húmicos têm capacidade de
permuta catiónica, e têm poder tamponizante e portanto existe uma certa semelhança
entre as propriedades do húmus e as da argila. Pode também ocorrer a formação de
complexos argilo-húmicos, estando as partículas de argila recobertas por materiais
húmicos. Estes complexos de matéria orgânica contêm inibidores da reação de PCR, de
difícil separação durante o processo de extração de ácidos nucleicos (Correia, 1986).
A extração de DNA do solo é pois um processo delicado, devido à presença de
húmus no solo. Geralmente é iniciado com uma homogeneização do material
recolhido e lise celular por métodos mecânicos e químicos. A adição de hidróxido de
sódio durante a lise é usada em alguns casos, já que soluções alcalinas extraem os
28
ácidos húmicos do solo (Benites et al, 2003). Hoje em dia, encontram-se
comercialmente disponíveis vários kits de extração do DNA do solo que incluem
reagentes para uma lise celular eficaz com proteção do ácido nucleico e a purificação
deste com recurso a algum tipo de gel ou coluna de sílica. A sílica liga-se inicialmente a
materiais húmicos que podem ser subsequentemente eluídos da matriz.
O kit de isolamento de DNA PowerSoil® (Mo Bio Laboratories Inc, EUA) foi
utilizado para a extração de DNA a partir das amostras de solo e dos enriquecimentos,
Este kit é destinado a ser usado em amostras de solo contendo alto teor de ácido
húmico, incluindo vários tipos de solos críticos, como a compostagem, sedimentos e
excremento. De acordo com as instruções do protocolo fornecido, adicionou-se cerca
de 0.25g de cada amostra de solo ou do pellet recolhido por centrifugação dos
enriquecimentos a 12 000 g, durante 5 minutos, para um tubo fornecido PowerBead.
De seguida, procedeu-se a uma suave homogeneização e à lise celular. Após
centrifugação a 10 000 g durante 30 segundos, o sobrenadante foi sujeito a vários
procedimentos para eliminar materiais húmicos e outros contaminantes orgânicos e
inorgânicos. Por fim, a concentração salina do sobrenadante é ajustada para a ligação
do DNA a uma membrana de sílica e segue-se uma lavagem com etanol afim de
remover o sal residual e outros contaminantes. No final desta etapa, procede-se à
eluição do DNA com uma solução apropriada, que carece de sal.
Após a extração, foi realizada uma análise electroforética para concluir da
integridade do DNA extraído. Fez-se um gel de agarose de 0.8% em tampão de corrida
TAE 1x. Foram aplicados 3 µL de marcador molecular 1Kb Plus DNA Ladder
(Invitrogen®; 100ng/µL) num dos poços e 5 µL de DNA genómico extraído nos
restantes. As condições de corrida foram 80 volts, durante aproximadamente 2 horas.
Após a corrida, o gel foi colocado numa tina com brometo de etídio (0.5 mg/L) durante
10 minutos, visualizado no transiluminador e fotografado com o software Kodak Gel
Logic 200 (Kodak, EUA).
Para a determinação da concentração do DNA extraído, utilizou-se o
espectrofotómetro (ThermoScientific NanoDrop® 2000 c) através da leitura da
absorvância a 260 nm. O sistema fornece também o valor da razão A260/A280, útil para
verificar a contaminação com proteínas típicas do solo, uma vez que as proteínas
também absorvem a 280nm.
5. PCR-DGGE
5.1. Amplificação do gene 16S rRNA
Para a amplificação do gene 16S rRNA das amostras diretas e enriquecimentos
seletivos, foram realizadas duas estratégias distintas: na primeira usaram-se primers
universais bacterianos, para avaliação da diversidade global da comunidade. Na
29
segunda, realizou-se uma estratégia de “nested PCR” (ver esquema 2), na qual são
inicialmente utilizados primers concebidos para a amplificação do 16S rDNA de um
determinado grupo taxonómico, seguida de uma reação de PCR sobre o produto
amplificado obtido, com uso de primers capazes de permitir a amplificação de uma
região interna de qualquer fragmento de DNA obtido na etapa precedente. O último
PCR realizado, nesta estratégia permite obter fragmentos de dimensões adequadas
para efetuar o DGGE, já que os fragmentos a colocar em gel DGGE não devem
ultrapassar 600 pb.
Os grupos taxonómicos escolhidos foram o Phylum Firmicutes, que contém as
bactérias termofílicas produtoras de sulfato e amónio, a classe β-Proteobacteria que
contém as bactérias oxidativas de amónia. Por fim, escolhemos as δ-Proteobacteria
que incluem as bactérias sulfato-redutoras. Foram utilizados primers já estabelecidos
para cada grupo, e reportados na bibliografia (Muhling et al, 2008). No entanto, não
foram encontrados primers para as δ-Proteobacteria, apenas para grupos específicos
de sulfato-redutoras dentro desta classe (Daly et al, 2000; Dar et al, 2005; Muyzer,
2005) Por isso, escolhemos primers descritos como específicos para sulfato-redutoras
dos géneros Desulfovibrio e Desulfomicrobium, estes frequentemente encontrados em
solos temperados. (Postgate, 1984).
Esquema 2. Esquema das metodologias utilizadas, de amplificação direta e por nested-PCR.
5.2. Primers e reações de PCR
Para a amplificação do gene 16S rRNA a partir das amostras do solo e
enriquecimentos, na abordagem direta, foram escolhidos os primers universais
foward, 341F GC (5’- CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG
GCC TAC GGG AGG CAG CAG -3’) e o primer reverse 518 R (5’ –ATT ACC GCG GCT GCT
GG -3’) (Muyzer et al, 1993). A extensão de 40 bases, rica em G-C no primer foward,
confere maior estabilidade aos fragmentos amplificados, o que é crucial para evitar
Extração de DNA
Amplificação com primers universais
bacterianos
Análise eletroforética por
DGGE
Amplificação com primers
específicos para grupos
filogenéticos
Nested-PCR com primers universais
e bacterianos
Análise eletroforética por
DGGE
Sequênciação e análise
filogenética
30
que as duas cadeias de DNA do produto de PCR se dissociem completamente durante
a eletroforese. As reações foram efetuadas num volume total de 25µL, contendo
Tampão de PCR 1X, dNTP’s 0.2 mM, cada primer a 0.4µM, 0.3µL de enzima DreamTaq
DNA Polimerase 5U/µL (Fermentas®, EUA). De seguida, foram adicionados aos
microtubos, 10 ng de DNA genómico extraído das amostras do solo ou dos
enriquecimentos.
Para a estratégia de nested –PCR utilizaram-se, tal como mencionado na secção
5.1, os primers referidos por Muhling et al, (2008) e Dar et al, (2005), conforme tabela
2.
Para a classe das β-Proteobacteria, a primeira amplificação foi efetuada com
uso dos primers Beta 359 F (5’ – GGG GAA TTT TGG ACA ATG GG – 3’) e Beta 682 R (5’ –
ACG CAT TTC ACT GCT ACA CG – 3’) de modo a obter fragmentos de cerca de 340pb
pertencentes a este grupo filogenético. Para a amplificação posterior, foram utilizados,
os primers 518 F GC (5’ - CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG
GGG GCC AGC AGC CGC GGT AAT – 3’) e Beta 682 R, acima referido, com obtenção de
um segundo fragmento de cerca de 180pb, originado a partir do produto obtido no
PCR anterior.
Para os géneros Desulfovibrio e Desulfomicrobium, foram usados os primers
forward DSV 230 (5’ - GRG YCY GCG TYY CAT TAG C -3’) e reverse DSV 838 (5’ – SYC CGR
CAY CTA GYR TYC ATC – 3’). A amplificação posterior foi realizada sobre o fragmento
obtido, de ca de 600 pb, com os primers supra – referidos 341FGC e 518R, obtendo-se
um produto de amplificação de ca de 190 pb.
Para o Phylum Firmicutes foi usado o primer 9bfm (5’ – GAG TTT GAT YHT GGC
TCA G -3’) e o primer reverse 1512 uR (5’ – ACG GHT ACC TTG TTA CGA CTT - 3’),
específicos para amplificação de bactérias para uma primeira amplificação, obtendo-se
um fragmento de ca de 1.5 Kb. De seguida, foram usados os primers específicos para o
Phylum Firmicutes Firm 350 F (5’ – GGC AGC AGT RGG GAA TCT TC - 3’) e o primer
reverse Firm 814 R (5’ – ACA CYT AGY ACT CAT CGT TT – 3’), obtendo-se um fragmento
de PCR de ca 480 pb, a partir do de 1.5Kb. Por fim, foram usados o primer 518FGC,
acima descrito e o primer reverse 785 R (5’ - CTA CCA GGG TAT CTA ATC C -3’), sendo
gerado um fragmento de ca 280 pb.
As primeiras reações de PCR, definidas para esta estratégia, foram feitas num
volume total de 50µL, contendo Tampão PCR 1X, 0.2mM de dNTP’s, 0.4µM de cada
primer e 0.2µL de Enzima FideliTaq DNA Polimerase 5U/µL (USB®, EUA). De seguida,
foram adicionados aos microtubos, 10 ng de DNA genómico extraído das amostras do
solo ou dos enriquecimentos. No caso da segunda amplificação definida para o Phylum
Firmicutes, foram usados 2µL do produto de PCR obtido na primeira amplificação.
31
As últimas reações de PCR, precedendo a deposição em gel DGGE, foram
também efetuadas num volume total de 50µL, contendo Tampão de PCR 1X, dNTP’s
0.2mM, 0.4µM de cada primer e 0.3µL de Enzima DreamTaq DNA Polimerase 5U/µL
(Fermentas®, EUA). Foram usados 2µL do produto de PCR obtido na amplificação
precedente.
5.3. Etapas de amplificação
A amplificação dos genes 16S rRNA pela abordagem direta e de “nested-PCR”
fez-se no Termociclador (Bio-Rad MyCycler).
Para a abordagem direta, procedeu-se a uma etapa de desnaturação a 95°C,
durante 2 minutos, e, seguidamente, realizaram-se 35ciclos, cada um com três etapas
consecutivas: uma desnaturação a 95°C, durante 30 segundos, seguida de annealing a
54°C, durante 30 segundos e extensão a 72°C, durante 30 segundos O último ciclo foi
seguido de uma etapa de extensão adicional a 72°C, durante 5 minutos.
Para a amplificação das cadeias molde pela estratégia de nested-PCR, a
temperatura de annealing foi dependente do par de primers utilizado. Para as
amplificações com uso da enzima FideliTaq DNA Polimerase, após uma desnaturação
inicial a 95°C durante 2 min, seguiram-se 35 ciclos incluindo cada um: uma etapa de
desnaturação a 95oC durante 30 s, seguida de annealing à temperatura apropriada
para cada par de primers (ver tabela 2) durante 30 s, e extensão a 68°C durante 1
minuto (para o primer 9bfm/1512 Ur, a extensão foi de 90 s). O último ciclo foi seguido
de uma etapa de extensão adicional a 68°C, durante 5 minutos.
Para as amplificações finais da estratégia referida, realizadas com uso dos
“primers F-GC” e enzima DreamTaq, procedeu-se a uma etapa de desnaturação a 95°C,
durante 2 minutos, seguida de 25 ciclos, cada um com três etapas: uma desnaturação
a 95°C, durante 30 segundos, annealing à temperatura apropriada para cada par de
primers (ver tabela 2) durante 30 segundos e extensão a 72°C, durante 30 segundos. O
último ciclo foi seguido de uma etapa de extensão adicional a 72°C, durante 5 minutos.
32
Tabela 2: Sumário dos primers 16S rRNA universais e específicos para os subgrupos filogenéticos em estudo, a sua posição em E. coli e a temperatura de annealing
Estratégia Primer Grupo alvo Posição em E. coli (kb) Nº de bases
Temperatura de annealing
(oC)
Referência
Direta
341 F GC
518 R
Universal
Bactérias
341-398
518-534
57
17
56 Muyzer et al, 1993
Nested- PCR
(Primeiro PCR Firmicutes)
9 bFM
1512 uR
Bactérias
9-27
1492-1512
18
20
52 Muhling et al, 2008
Nested –PCR
(Segundo PCR Firmicutes)
Firm 350 F
Firm 814 R
Firmicutes
350-369
814-833
19
19
57 Muhling et al, 2008
Nested – PCR
(Pré –DGGE Firmicutes)
518 F GC
785 R
Firmicutes
518-534
785-803
17
18
56 Muhling et al, 2008
Nested-PCR
(Primeiro PCR β-Proteobacteria)
Beta 359 F
Beta 682 R
Β -Proteobacterias
359-378
682-701
19
19
63 Muhling et al, 2008
Nested – PCR
(Pré- DGGE B-Proteobacteria)
518 F GC
Beta 682 R
Β - Proteobacterias
518-534
682-701
17
19
60 Muhling et al, 2008
Nested – PCR
(Primeiro PCR)
DSV 230
DSV 838
Desulfovibrio/Desulfomicrobium
230-248
818-838
18
20
61
Dar et al, 2005
Nested – PCR
(Pré- DGGE Desulfovibrio e Desulfomicrobium)
341 F GC
518 R
Desulfovibrio/Desulfomicrobium
341-398
518-534
57
17
56 Muyzer et al, 1993
33
5.4. Visualização dos produtos de PCR
Após cada amplificação, foi realizada uma análise de eletroforese em gel de
agarose de 2% p/v em tampão TAE 1x, para concluir da sua eficácia. Foram aplicados 3
µL de marcador molecular 1Kb Plus DNA Ladder (Invitrogen®; 100ng/µL) num dos
poços e 5 µL de cada produto de PCR nos restantes poços do gel. A migração em gel é
feita a uma diferença de potencial de 80 volts, durante aproximadamente 2 horas.
Após a corrida, o gel foi colocado em brometo de etídio (0-5 mg/L) durante 10
minutos, e seguidamente visualizado no transiluminador e fotografado com o software
Kodak Gel Logic 200 (Kodak, EUA)
5.5. Eletroforese em gel com gradiente desnaturante (DGGE)
A análise electroforética em gel de gradiente de desnaturação (DGGE) foi
baseada nos procedimentos descritos por Muyzer et al (1993) e Muhling et al (2008).
Para o efeito, recorreu-se a um sistema de DGGE -2001 acoplado a uma bomba de
agitação, com aquecimento e uma fonte de alimentação EPS-300 II (CBS Scientific®,
EUA).
Foram preparados géis a 8% (p/v) de poliacrilamida, contendo ureia e
formamida como agentes desnaturantes, para a migração dos produtos amplificados.
Utilizou-se um marcador contendo uma mistura de fragmentos de amplificação dos
genes 16S rRNA de espécies bacterianas, representativas de diferentes classes
filogenéticas. Esses fragmentos, obtidos com os primers 341F GC – 518R, foram
amplificados a partir do DNA dos seguintes microrganismos: Escherichia coli K12, e
Pseudomonas aeruginosa (γ-Proteobacteria), Paenibacillus sp. DSM 34 (Bacilli),
Streptomyces caviscabies (Actinobacteria).
5.5.1. Preparação dos géis
Os géis a 8% (p/v) de poliacrilamida foram preparados a partir de duas soluções
desnaturantes a 30% e a 50%, por forma a variar o gradiente de desnaturação entre
estes dois valores, com recurso a um formador de gradiente de 20 mL e a uma mini
bomba peristáltica MPP-100 (CBS Scientific®, EUA).
Prepararam-se soluções stock a 0% (1.5 mL de TAE 50x; 30 ml de acrilamida a
39% - acrilamida: 1% - bis-acrilamida (Sigma-Aldrich®); 120 mL de H2O destilada) e a
80% (1.5 mL de TAE 50x; 30 ml de acrilamida a 39% - acrilamida: 1% - bis-acrilamida ;
30mL de água destilada; 48 mL de formamida deionizada (PlusOne®); 50.4 g de ureia
(PlusOne®).
A solução 30 % foi preparada pela adição de 7 mL de solução stock a 0% a 4 mL
de solução stock a 80%. Para obter a solução 50%, foram adicionadas 4.1 mL de
solução stock a 0% a 6.9 mL de solução stock a 80%. A cada solução foram adicionados
7.7 µL do agente polimerizador tetrametilenodiamina (TEMED).
34
Imediatamente antes de inserir as soluções no formador de gradiente, foram
adicionados 55µL de persulfato de amónia a 10% (APS, 0.1g/mL. PlusOne®), um agente
oxidante que atua na polimerização da acrilamida. O formador de gradiente é
utilizado, até o interior das duas placas de vidro, usadas para a montagem do gel, ser
preenchido na quase totalidade (o gel liquefeito fica a uma distância de cerca de 2 cm
do topo do sistema de placas). No topo, são rapidamente adicionados, com uma pipeta
Pasteur, 10mL de solução stock a 0%, contendo 7.7µL de TEMED e 38µL de APS a 10%.
Por fim, é colocado o pente para formar os poços de deposição das amostras.
5.5.2. Condições de corrida
A eletroforese foi realizada em tampão tris-acetato-ETDA a 0.5X com uma
voltagem constante de 200 volts, a 60°C, durante 3.5 horas.
Seguindo a metodologia aconselhada (Green, 2005), o tampão TAE 0.5x foi
aquecido no sistema de DGGE até atingir uma temperatura de 60°C. Findo este passo,
os géis foram montados numa cassete específica e colocados no interior do sistema.
Foi realizada uma pré-corrida de 30 minutos, de modo a testar a migração a realizar,
pois foram colocados nos poços do gel 5µL de tampão de depósito contendo Azul de
Bromofenol (C19H10Br4O5S, Sigma-Aldrich®).
Os volumes dos produtos de PCR a depositar foram determinados após a
análise electroforética referida em 5.4. Assim foram utilizadas para a migração 7 µL de
cada produto de PCR obtido para o grupo Desulfovibrio/Desulfomicrobium e 8 µL para
os produtos de PCR relativos ao Phylum Firmicutes e classe β-Proteobacteria. No caso
dos produtos de PCR obtidos pela abordagem direta, foram usados 10 µL. Os produtos
de PCR foram homogeneizados com tampão de depósito (4 µL e 5 µL) e depositados
nos poços do gel.
Após a corrida, cada gel foi colocado numa tina com brometo de etídio (0.5
mg/L) durante 2 minutos, visualizado no transiluminador e fotografado com o software
Kodak Gel Logic 200 (Kodak, EUA).
O programa ImageJ®, desenvolvido pelo NIH (National Institute of Health, USA),
foi usado para a determinação da área e intensidade relativa das bandas obtidas, por
análise das imagens obtidas em formato tiff.
5.6. Excisão de bandas e purificação
As bandas de interesse foram excisadas a partir dos géis com uma lâmina de
bisturi estéril, sob luz UV e trituradas com bisturi ou uma ponta estéril. Adicionaram-se
50 µL de tampão TE aos tubos contendo as bandas. Os tubos são submetidos a ciclos
de variação térmica entre -20 e 65°C de modo a libertar o DNA da acrilamida. Após
centrifugação a 12 000 g durante 3 min, 5 µL do sobrenadante são utilizados para
reamplificação por PCR com primers de sequência idêntica à da dos primers usados na
35
última etapa da estratégia de nested-PCR, exceto que o primer forward não possui
qualquer extensão GC.
As reações de PCR foram efetuadas num volume total de 50 µL com tampão de
PCR 1x, 0.2 mM dNTPs, 0.6 uM de cada primer e 0.3 µL de Dream Taq 5U/µL
(Fermentas®, EUA). Inicialmente o DNA é desnaturado a 95°C durante 2 min e seguem-
se 35 ciclos, cada um com três etapas: uma desnaturação a 95°C 30 seg, seguida do
emparelhamento dos primers à temperatura de annealing respetiva (ver tabela 2)
durante 30 seg, e de extensão a 72°C a 30 seg. Após o último ciclo, foi efetuada uma
extensão adicional a 72°C durante 5 min.
Os produtos de PCR foram purificados com o kit Gel Band Purification® (GE
Healthcare, EUA), de acordo com as instruções do fabricante e visualizados após
eletroforese em gel de agarose a 2% (p/v). Após estimação da sua concentração, foram
enviados para sequenciação automática executada nos laboratórios da empresa
Macrogen®.
Para uma identificação preliminar das sequências obtidas foi feita uma análise
comparativa com as sequências de genes 16S rRNA presentes na base de dados
GEnBank, NCBI (National Center for Biotechnology Information) com recurso ao Blast
(Basic Local Alignment Search Tool).
36
Resultados e discussão
1. Parâmetros físico-químicos
Os resultados dos parâmetros físico-químicos, conforme dados do Laboratório
Químico-Agrícola da Universidade de Évora, encontram-se na tabela 3:
Tabela 3: Parâmetros físico-químicos das amostras recolhidas no solo do olival
Amostras T-DC T-EC NT-DC NT-EC
Fósforo (P2O5) (mol/kg)
7.326x10-4 5.494x10-4 6.199x10-4 2.958x10-4
Nitrato (NO3) (mol/kg)
7.257x10-5 7.257x10-5 1.128x10-4 1.048x10-4
Potássio (K2O) (mol/kg)
4.980x10-3 1.860x10-3 1.990x10-3 1.120x10-3
Cobre (Cu) (mol/kg) 1.640x10-3 2.187x10-4 1.510x10-3 5.507x10-5
Textura Média Média Média Média
pH (H2O) 6.80 6.60 7.30 7.50
O solo do olival sob estudo apresenta textura média, o que significa que
apresenta um equilíbrio entre os teores de areia, silte e argila. Normalmente, estes
solos apresentam boa capacidade de drenagem, bem como de retenção de água e
índice médio de erodibilidade. Assim, não requerem cuidados especiais, adequando-se
a todos os métodos de irrigação. As amostras das zonas tratadas com Cuprital® (T-DC;
T-EC) revelaram-se ligeiramente ácidas, o que pode indicar um efeito deste composto
(que apresenta pH 6.5 a 1% em água) sobre o pH do solo.
Pela análise da tabela verifica-se que as concentrações de nitrato nas amostras
dos solos tratados eram inferiores às dos solos não tratados. Este resultado poderá
estar relacionado com algum efeito direto do tratamento, por exemplo, um aumento
da lixiviação do nitrato, causada por repulsão com cargas negativas acumuladas no
solo, e/ou indireto, pela proliferação de bactérias resistentes ao cobre que usam o
nitrato.
O valor mais elevado de concentração de cobre foi medido na amostra
composta do solo tratado, recolhida debaixo de copa, como era esperado. De facto, o
tratamento com Cuprital® é realizado por projeção sobre a copa das árvores,
ocorrendo fenómenos de deposição de fungicida por lixiviação da copa e escorrimento
pelo tronco. Apesar de se tratar de um solo de textura média, com boa drenagem,
foram encontrados níveis de cobre entre 5,507x 10-5 (NT-EC) e 1,6 x 10 -3 mol/Kg (T-DC)
este último valor é superior ao valor de referência (ca 2x 10-4 mol/kg), utilizado em
37
laboratórios de análises de solos usado para classificar um solo como “de teor elevado
em cobre” (Manual de fertilização das culturas, 2ª Ed. 2006). Este valor foi obtido,
apesar de se terem passado aproximadamente 30 dias, entre o tratamento
fitossanitário e a recolha das amostras, podendo já ter ocorrido assimilação pela
comunidade microbiana presente e pelas plantas.
A amostra de solo NT-DC apresenta aqui um valor mais elevado que a amostra
T-EC, o que é questionável, dado que no “setor NT” ainda não tinha sido efetuado o
tratamento fitossanitário. Sendo o tratamento feito sobre as copas das oliveiras e de
modo rotativo (isto é, solos não tratados são sujeitos periodicamente a novo
tratamento), poderia prever-se uma semelhança de valores para alguns elementos
entre estas amostras, dependendo da diferente capacidade de retenção do solo em
relação a diferentes elementos. Neste contexto, é importante recordar que a recolha
das amostras foi feita em solo húmido, devido à ocorrência de precipitação nos dias
anteriores, o que pode ter levado a uma diluição dos iões no solo. O alto teor em cobre
pode ser portanto um resultado pontual, devido a algum fator localizado. Contudo, só
a recolha de um número muito maior de amostras permitiria alguma indicação sobre o
valor de cobre determinado.
2 Quantificação nos enriquecimentos
2.1 Produção de amónio
A quantificação de amónio presente foi efetuada nos enriquecimentos
seletivos, de modo a avaliar o efeito do cobre e da temperatura. Os resultados estão
expressos na Figura 9.
Figura 9: Quantificação de amónio nos enriquecimentos seletivos A) Produção absoluta de amónio B) Produção de amónio normalizada por unidades formadoras de colónias
Letras diferentes (a,b, a’, b’, etc) e algarismos diferentes (1, 2,1’, 2’, etc) representam diferenças estatisticamente significativas para o fator temperatura e concentração de cobre respetivamente (p <0.05).
38
Todos os enriquecimentos apresentaram uma produção similar de amónio
(figura 9, A) embora ligeiramente inferior a 80°C. As comunidades microbianas
implicadas nessa produção serão distintas a 30°C e a 50°C, e ambas produzem amónio
na mesma amplitude. Dado que os enriquecimentos a 80°C são obtidos pela
transferência das culturas a 50°C, o decréscimo observado estará associado a um
decréscimo metabólico dessa comunidade microbiana a 80°C, sugerindo que essa
comunidade será constituída na base por microrganismos moderadamente
termofílicos e não hipertermofílicos.
Experiências similares efetuadas por Portillo et al (2012), e apenas focando o
efeito da temperatura, 25°C versus 50°C, revelaram resultados diferentes, tendo sido
observado um incremento da produção a 50°C ou não, de acordo com o tipo de solo
agrícola (recolhas em solo florestal ou pastagem, por exemplo). Este fenómeno sugere
que não só o tipo de solo como a natureza da espécie agrícola cultivada pode
influenciar os resultados obtidos. Uma característica não poderá ser dissociada da
outra e é possível, por exemplo, que a absorção preferencial de algumas culturas
agrícolas de amónio versus nitrato, ou o inverso, influencie a dinâmica da comunidade
microbiana do solo.
Ao avaliarmos a produção de amónio normalizada por unidades formadoras de
colónias, é notório um aumento de produção de amónio nos enriquecimentos à
concentração de cobre mais elevada. Antes de mais, convém lembrar que a
determinação de cfu termofílicos foi feita por plaqueamento a 50°C. Isso significa que
as colónias obtidas serão maioritariamente as formadas por termofílicos moderados,
que conseguem proliferar ou sobreviver às restantes temperaturas sob estudo. Por
motivos técnicos, foi-nos impossível quantificar a proteína total nestes
enriquecimentos ou realizar uma contagem das células totais nos mesmos, por
intermédio da qual teríamos resultados distintos. Assim, os resultados observados
traduzem a natureza da população termofílica que está sob seleção em cada
enriquecimento, donde os valores obtidos para os enriquecimentos com maior
concentração de cobre, indicarão a presença de bactérias termófilicas produtoras de
amónia e resistentes ao cobre.
2.2 Produção de sulfato
A quantificação do sulfato presente nos enriquecimentos foi também avaliada
pela normalização por unidades formadoras de colónias.
Os resultados estão expressos na Figura 10:
39
Figura 10: Quantificação de sulfato nos enriquecimentos seletivos A) Produção absoluta de sulfato B) Produção de sulfato normalizada por unidades formadoras de colónias.
Letras diferentes (a,b, a’, b’, etc) e algarismos diferentes (1, 2,1’, 2’, etc) representam diferenças estatisticamente significativas para o fator temperatura e concentração de cobre respetivamente (p <0.05).
É importante referir a dificuldade inerente ao método de quantificação do
sulfato; é um método sensível, muito dependente do tempo de agitação aquando da
adição de cloreto de bário e sujeito a variações importantes de absorvância, variações
essas que tendem a aumentar com a concentração de sulfato (Kolmert et al, 2000).
Isso obriga a um número elevado de ensaios e leituras, que de facto não efetuamos,
não tendo mesmo havido a possibilidade de determinar o desvio padrão no caso do
enriquecimento a 80°C e 500 μM de cobre. Os ensaios efetuados mostraram uma
tendência de aumento da produção de sulfato com a temperatura, em particular a
80°C e a uma concentração de cobre de 100 μM de cobre.
Em estudos similares descritos por Portillo et al (2012), relativos ao efeito da
temperatura, foi também observado um aumento da produção de sulfato a 50°C,
sendo esse aumento muito mais significativo. Esta diferença poderá estar associada ao
tempo de incubação, o qual foi de 4 dias no estudo referido, ao invés de 24 h, como no
nosso caso. Santana et al (não publicado) descreveram um aumento na produção de
sulfato por isolados termofílicos, em fase estacionária de crescimento, o que pode
estar na base desta diferença.
Curiosamente, a produção de sulfato normalizada por unidades formadoras de
colónias, segue um padrão similar ao registado para a produção de amónio.
Atendendo, ao mencionado na secção precedente, também aqui os valores obtidos
para os enriquecimentos com maior concentração de cobre, indicarão a presença de
bactérias termófilicas produtoras de sulfato (e amónio) e resistentes ao cobre. Em
suma, os dados sugerem a presença de microrganismos termófilicos resistentes ao
cobre e capazes de processar o enxofre e azoto orgânicos presentes no meio de
cultura, produzindo sulfato e amónio.
1 1’ 2’
40
A presença de bactérias termofílicas nos enriquecimentos ocorreu, apesar de a
temperatura média registada, aquando da recolha da amostra composta NT-EC, ter
sido de apenas 10°C. Os solos temperados podem, no entanto, apresentar valores
muito superiores, tendo já sido registados valores de 60°C (Portillo et al, 2012).
Também em Évora, já foram registados valores próximos de 40°C a 4 cm de
profundidade em solo de olival, durante o verão (Santana et al., não publicado). Será
nesta estação mais quente, que as bactérias termofílicas poderão proliferar.
3 Caracterização fenotípica, fisiológica e molecular do isolado
3.1 Análise fenotípica e fisiológica
Dado que foi nos enriquecimentos com maior concentração de cobre que se
registaram valores elevados de produção de sulfato, a qual se manteve alta a 80°C, o
enriquecimento em meio NB 80°C Cu 500µM foi utilizado para a obtenção de isolados
potencialmente capazes de participar na produção observada. Assim, procedeu-se ao
isolamento como indicado na secção 3 da metodologia; obtiveram-se várias colónias
isoladas, no entanto apenas uma foi capaz de crescer em meio NB e NB Cu500µM.
Quando plaqueado, o isolado obtido formou colónias grandes com cerca de
0.8cm de diâmetro após cerca de 20 horas de incubação a 50°C. As colónias
apresentavam formato irregular, superfície lisa e cor bege. Esta morfologia de colónias
foi também detetada pelo plaqueamento do enriquecimento, realizado para a
contagem de unidades formadoras de colónias (ver secção 2 da metodologia). Quando
observadas ao microscópio verificou-se que as células tinham forma de bastonete e
encontravam-se frequentemente aos pares ou formando cadeias mais longas, com
maior número de células. Algumas células apresentavam grande mobilidade. Em
culturas do isolado, foi observada a formação de endósporos durante a fase
estacionária de crescimento. Esta formação está associada à limitação de nutrientes no
meio, durante esta fase de crescimento; os esporos estarão metabolicamente inativos
mas em contínua monitorização das condições externas (Nicholson et al, 2009).
A coloração diferencial de Gram identificou o isolado como Gram-Positivo. Em
fase estacionária, tal como acontece com as bactérias Gram-positivas nesta fase, as
células não coravam tão intensamente, (assemelhando-se a células Gram-negativas)
devido à diminuição da espessura da camada de peptidoglicano nas células mais
velhas. Também aqui eram visíveis os endósporos, que maduros, não absorvem o
corante, devido à sua estrutura resistente e hidrofóbica; os endósporos surgiam assim
como zonas dilatadas não coradas dentro da célula vegetativa (ver Figura 11).
41
Figura 11: Visualização do isolado ao Microscópio ótico Olympus BX41 após coloração diferencial de Gram.
As setas indicam endósporos em diferentes fases de maturação
Quando o isolado cresceu em NB a 50°C sem qualquer adição de cobre, o
rendimento de crescimento foi cerca de três vezes superior àquele obtido em presença
de 500 µM de cobre. Para investigar o efeito do cobre no crescimento, bem como para
determinar se o isolado obtido contribui para a produção de sulfato na presença de
cobre realizaram-se vários ensaios.
O isolado foi inoculado em meio NB Cu 500µM a 50°C, 180 rpm durante 25
horas, e de seguida a cultura foi transferida a 80°C, sem agitação. Foram retiradas
amostras ao fim dos tempos T1 20 h, T2 25 h, T3 28 h e T4 44 h. Portanto, as amostras
T1 e T2 correspondem ao período de incubação a 50°C, e T3 e T4 ao período de
incubação a 80°C. Para cada tempo foi medida a densidade ótica da cultura e feitas
observações ao microscópio ótico a fresco e após coloração de Gram. Foi quantificada
a presença de esporos a cada tempo como descrito em 3.2.1., procedeu-se também à
quantificação do sulfato e de proteína nas amostras, tal como indicado em 2.2. e 3.2.2,
respetivamente.
Verificou-se que a produção de sulfato aumentou de T1 a T4, tal como indicado
na Figura 12:
42
Figura 12: Produção absoluta de sulfato total (mM) (azul) e produção de sulfato normalizada em relação ao conteúdo proteico celular (mmol mg
-1 ) (vermelho), para os diferentes tempos T1 a T4.
Figura 13: Visualização do isolado ao Microscópio ótico Olympus BX41 ao tempo T3. a) Preparação a fresco, b)) após coloração diferencial de Gram
A leitura da densidade ótica não mostrou diferenças significativas entre T1-T3.
Em T1 a cultura já se encontrava em fase estacionária, e apenas em T4 se registou uma
queda de 24% no valor lido em relação ao valor máximo encontrado em T2. O ensaio
de choque térmico, bem como a observação microscópica revelaram a total ausência
de esporos. Quer nas preparações frescas, como nas resultantes de Gram, as células
apresentavam-se muito segmentadas. Nas preparações Gram, as células tinham zonas
coradas intervaladas com zonas não coradas, em particular aos tempos T3 e T4 (ver
Figura 13), e não foram observadas cadeias longas. Nas preparações a fresco não se
observaram células móveis. Estas observações sugerem que o isolado termofílico
obtido, produtor de sulfato, está sujeito a stress celular na presença de sulfato de
cobre a 500 µM. A resistência ao cobre observada, acarreta custos celulares, já que se
verificou uma diminuição do rendimento de crescimento; a morfologia das células
também foi alterada: não foram observadas longas cadeias de células e a coloração de
0
0.002
0.004
0.006
0.008
0.01
0.012
0.014
0.016
0.018
0.02
0
0.3
0.6
0.9
1.2
1.5
T1 T2 T3 T4
[SO
42-]m
mo
l mg-1
de
pro
teín
a
[SO
42-]m
M
Isolados
43
Gram sugere uma distribuição irregular dos componentes da parede celular. Além
disso, não foram observados esporos; o efeito inibitório do cobre na esporulação já foi
referido para outros membros da classe Bacilli (Rodriguez et al, 2010).
Quanto ao aumento da produção de sulfato, que é excretado no meio, é
também provável que este aumento esteja relacionado ao processamento de
moléculas orgânicas para a manutenção celular em condições de stress. Portillo et al
(2011) e Santana et al (não publicado) já tinham relatado uma dependência da
produção de sulfato com a temperatura, que é distinta para diferentes isolados
termofílicos, alguns apresentam maior produção de sulfato á temperatura ótima de
crescimento, outros, contudo, podem apresenta-la a temperaturas próximas dos
limites máximos e/ou mínimos de crescimento.
3.2.Análise molecular
Para obter uma atribuição filogenética preliminar do isolado, foi feita a análise
da sequência de 16SrDNA obtida, de 259 bp, com recurso ao Blast.
A tabela 4 apresenta o resultado obtido. Embora o valor E obtido, bem como a
percentagem de identidade indiquem uma igualdade absoluta entre o fragmento
sequenciado e outros do género Bacillus e Geobacillus, não podemos concluir
seguramente quanto a uma afiliação taxonómica a um ou outro género e muito menos
a qualquer espécie. Seria necessário efetuar uma análise filogenética por comparação
com sequências de genes 16S rRNA próximos destes grupos, de modo a estabelecer
um dendograma filogenético. A obtenção de um fragmento maior seria desejável para
uma maior robustez da análise Contudo, e em associação com os testes fenotípicos,
sabemos tratar-se de uma bactéria da classe Bacilli, Phylum Firmicutes.
Tabela 4: Resultados da análise Blast da sequência parcial do gene 16S rDNA do isolado
Microrganismo Número de
acesso Valor E
Máxima
Identidade
Bacillus subtilis estirpe P38 JQ669676.1 0.0 100%
Clone procariota não cultivadoMB7-77
JQ693078.1 0.0 100%
Bacillus sp. MBK-z1 JQ729680.1 0.0 100%
Bacillus sp. MBK-d2 JQ729678.1 0.0 100%
Bacillus subtilis ASC582 JQ796006.1 0.0 100%
Bacillus tequilensis BVC67 JQ660650.1 0.0 100%
Bacillus amyloliquefaciens BVC48 JQ660631.1 0.0 100%
Bacillus tequilensis CRRI-HN4 JQ695931.1 0.0 100%
Geobacillus sp. estirpe CRRI-HN1 JQ695928.1 0.0 100%
44
4. Análise dos géis de DGGE e sequenciação
4.1. PCR-DGGE de amostras de DNA do solo
Figura 14: Géis de DGGE das amostras resultantes de amplificação por nested-PCR sobre o DNA extraído das
amostras compostas do solo A- Gel resultante da amplificação com os primers para os géneros Desulfovibrio e Desulfomicrobium; B - Gel resultante da amplificação com os primers para a classe β-Proteobacteria.
A) 1 – TDC II; 2 – TEC II; 3 – NTDC; 4 – NTEC. B) M – marcador; 1 – TDC; 2 – TDC II; 3 – TEC II; 4 – NTDC; 5 – NTEC
Foram efetuados géis de DGGE com os produtos de PCR resultantes de
amplificação sobre o DNA extraído das amostras de solo. A amplificação foi feita quer
com uso dos primers universais, quer pela estratégia de nested-PCR (ver Esquema 2
secção 5.1). No primeiro caso, a resolução dos géis foi muito fraca para todas as
condições de corrida testadas, sendo contudo percebido um fingerprint diferente
entre amostras provenientes de solos tratados, por um lado, e não tratado com cobre,
por outro (resultados não apresentados). O uso de primers dirigidos para grupos
taxonómicos específicos, levou a uma melhoria da resolução dos géis, em particular no
que se refere às β-Proteobacteria, abundantes no solo (Figura 14).
O gel resultante da amplificação com os primers para os géneros
Desulfovibrio/Desulfomicrobium apresenta uma fraca resolução, sendo possível
verificar que as amostras recolhidas em solo tratado, tanto debaixo de copas como
entre copas, apresentam um fingerprint semelhante, embora a análise da intensidade
relativa entre algumas bandas, efetuada com recurso ao ImageJ®, seja distinta nos dois
casos. Isto sugere que o tratamento fitossanitário efetuado no setor de solo definido
Pseudomonas
aeruginosa
E. coli K12
Paenibacillus
sp. DSM 34
Streptomyces
caviscabies
45
para tal, levou a uma seleção de microrganismos resistentes ao tratamento. As
amostras de solo não tratado têm fingerprint distinto das amostras tratadas, e
semelhante entre si, como já referido; no caso das β-Proteobacteria verificou-se
também que a amostra NT-EC apresentou o fingerprint mais distinto, entre todas as
amostras, não apresentando algumas das bandas dominantes presentes em todos os
fingerprints. Por outro lado, NT-DC apresenta uma maior similaridade no fingerprint
com o das amostras T, o que não pode deixar de nos lembrar os resultados obtidos
aquando da medição dos teores em cobre para esta amostra, a qual apresentava um
teor também elevado para este elemento (ver tabela 3).
Acreditamos que uma maior quantidade de DNA molde, bem como o ensaio de
mais condições de corrida poderiam ter levado à obtenção de informação mais
detalhada a partir destas amostas. A quantidade limitante de DNA molde levará à
amplificação de genes 16SrRNA dominantes na população. Contudo, sabe-se que o uso
do Kit PowerSoil®, resulta numa eficiente na remoção de contaminantes que podem
limitar a reação de amplificação da Polimerase, mas em contrapartida na diminuição
do rendimento de DNA extraído (Dineen et al, 2010).
4.2. PCR-DGGE de amostras de DNA extraído dos enriquecimentos
A realização de enriquecimentos seletivos diminuiu a representatividade dos
microrganismos do solo, enquanto permitiu o aumento da resolução dos géis.
Contudo, os enriquecimentos foram perspetivados precisamente para que fossem
representados os grupos alvo que querámos estudar; os enriquecimentos tinham
como propósito a obtenção de bactérias termofílicas do Phylum Firmicutes, grupo,
como já referido, heterotrófico e produtor de amónio e sulfato. As β-Proteobacteria,
também alvo do nosso estudo, serão capazes de proliferar no mesmo meio, por
utilização direta deste e/ou dos produtos metabólicos produzidos pelas bactérias
termofílicas, provavelmente incluindo as bactérias oxidativas da amónia, pertencentes
a esta classe. Do mesmo modo, poderão ser encontrados sulfato-redutores, que
inicialmente presentes no solo vão proliferar nos enriquecimentos, graças à produção
de sulfato pelas bactérias termofílicas. As β-Proteobacteria oxidativas de amónia, bem
como os sulfato-redutores poderão ser encarados como microrganismos competidores
de amónia e sulfato, tornando-os menos disponíveis para as plantas, em especial para
aquelas que utilizam preferencialmente a amónia.
Os enriquecimentos procuravam também estudar o efeito do cobre e
identificar quais os microrganismos resistentes dentro dos grupos taxonómicos
escolhidos. Caso esses não incluam bactérias termofílicas, isso indicará um efeito
negativo do tratamento de cobre sobre este grupo e levará a uma diminuição do teor
em sulfato e amónio no solo, a menos que se trate de solos submetidos à adição de
fertilizantes. A concentração máxima de cobre escolhida (500 μM) é, grosso modo, três
1 2 3 4 5 6 M 7 8 9
46
vezes inferior à concentração máxima registada para a amostra recolhida T-DC (Tabela
3). A escolha das concentrações a usar baseou-se na maior disponibilidade do cobre
em solução, quando comparada com aquela do solo, onde o cobre se encontra
associado á carga negativa do húmus, bem como em referências bibliográficas várias
sobre o estudo de bactérias resistentes ao cobre (Chillappagari et al, 2009).
Figura 15: Gel de DGGE das amostras resultantes de amplificação direta sobre o DNA extraído dos
enriquecimentos.
1 – NB30; 2 – NB30 Cu100; 3 – NB30 Cu500; 4 – NB50; 5 – NB50 Cu100; 6 – NB50 Cu500; M – marcador 7 – NB80; 8 –
NB80 Cu100; 9 – NB80 Cu500;
A Figura 15 mostra um agrupamento de fingerprints similares segundo a
temperatura, o que sugere ter ocorrido um efeito mais seletivo da temperatura e não
do cobre sobre a comunidade microbiana. No entanto, o efeito da adição de cobre
sobre a diversidade foi mais drástico para valores mais elevados de temperatura, e à
concentração mais elevada de cobre.
Os resultados sugeriram também que poderiam ser revelados, pelo uso da
estratégia de nested-PCR, presença de micróbios resistentes ao cobre para os distintos
grupos taxonómicos, dada a presença de bandas correspondentes a microrganismos
resistentes ao cobre para as diferentes temperaturas.
47
4.2.1. Phylum Firmicutes
O gel de DGGE com os produtos de PCR resultantes da amplificação com os
primers específicos para o Phylum Firmicutes sobre o DNA extraído dos
enriquecimentos está na figura 16.
Figura 16: Gel de DGGE das amostras de DNA extraído dos enriquecimentos seletivos, amplificadas com o par de primers específicos para o subgrupo filogenético Firmicutes.
M – Marcador; 1 - NB30 Cu100; 2 - NB30 Cu500, 3 – NB50, 4 – NB50 Cu100; 5 – NB50 Cu500; 6 – NB80; 7 – NB80
Cu100; 8 – NB80 Cu500. As setas a vermelho representam as bandas que foram sequenciadas.
Foram escolhidas as bandas assinaladas para posterior sequenciação. A análise
conjunta das sequências- com recurso ao Blast- e da sua intensidade relativa em cada
enriquecimento-com recurso ao ImageJ® - permitiu a identificação preliminar dos
microrganismos sob efeito da temperatura e do cobre (ver Tabela 5).
A utilização do programa ImageJ® permitiu-nos de facto inferir da proporção
relativa de cada banda, dentro da mesma amostra e comparativamente às amostras
restantes, por comparação da área de cada uma, determinada após descontar o “ruído
de fundo” (Figura 17), Deste modo, qualquer erro resultante da deposição de
diferentes quantidades de DNA obtido nas distintas amplificações, é eliminado.
Pseudomonas
aeruginosa
Escherichia coli
k12
Paenibacillus sp.
DSM 34
M 1 2 3 4 5 6 7 8
1
2
3
4
5
6
7 8
9
48
Figura 17: Perfil dos picos obtidos para as bandas da amostra NB30 Cu100, e da amostra NB30 Cu500; o cálculo da área de algumas bandas está indicado
As identidades encontradas foram exploradas, pela consulta dos números de
acesso fornecidos pelo Blast. Lysinibacillus sp. e Bacillus cereus são mesofílicos,
frequentemente encontrados no solo, o que está de acordo com o padrão obtido
pelas bandas correspondentes, consequente ao aumento da temperatura. Também se
encontra em concordância com os dados conhecidos, a presença de bandas
correspondentes a estes microrganismos na presença de cobre; a base de dados do
EMBL revela a existência de proteínas de resistência ao cobre nos dois casos.
A temperaturas mais elevadas, são identificados os géneros Brevibacillus e
Geobacillus. Isolados pertencentes a estes géneros já foram descritos como
importantes na mineralização do enxofre e azoto, produzindo sulfato e amónia
(Portillo et al, 2012; Santana, não publicado (ver secção 6)) Atendendo à distribuição
das sequências apresentada na tabela 5, poderão ser membros destes géneros que
intervêm na produção de amónio e sulfato, nos enriquecimentos a 50°C com e sem
cobre. Em membros deste género, foi encontrado o gene codificante da molécula
chaperone CopZ, responsável no efluxo de cobre (ver secção 8). É importante referir
que o facto de se ter observado o aumento de intensidade de algumas bandas na
presença de cobre, não significa que haja um estímulo à proliferação de um dado
microrganismo pela ação direta do cobre, mas sim uma inibição da competição ao seu
crescimento por parte de outros micróbios não resistentes.
451
593
49
Dentro das sequências obtidas, é de salientar, as correspondentes às bandas 8
e 9, com grande intensidade a NB80Cu500. A sequência da banda 9 é idêntica à
sequência do isolado obtido (ver secção 3.2), alinhando exatamente entre as posições
201 e 449 pb desta última, e corroborando a abundância do isolado no enriquecimento
mencionado. Por outro lado, é idêntica à de Bacillus vallismortis, uma espécie isolada a
partir de dunas de areia no Vale da Morte, Califórnia. (Roberts et al, 1996). A
sequenciação total do gene 16SrRNA do isolado irá revelar se esta espécie poderá
também estar presente no solo húmido de um olival em Évora.
50
Tabela 5: Tabela resultante da análise conjunta da sequência e da intensidade relativa de bandas selecionadas no gel-Figura16
Amostras Bandas
(amostras) Resultados BLAST
Valor E NB30 Cu100
NB30 Cu500
NB50 NB50 Cu100
NB50 Cu500
NB80 NB80 Cu100
NB80 Cu500 Aumento da temperatura
Aumento de [Cu] no meio
1 NB30 Cu100
Lysinibacillus fusiformis strain Ulm26
6e-126
+ (+) (+) (+) ↓
2 NB30 Cu500
Bacillus cereus strain YAP13 Bacillus cereus strain SPD
6e-126
(-) + ↓ ↑
5 NB50 Cu500
Uncultured bacterium clone ncd957e10c1
Brevibacillus limnophilus strain DSM 6472
3e-123
+ (+) + (+) ↑ ↑
6 NB50 Cu500
Uncultured bacterium clone ncd957e10c1
Brevibacillus limnophilus strain DSM 6472
2e-125
(-) (-) (+) (+) + (-) ↑
7 NB80 Cu500
Uncultured organism clone Anoxybacillus sp. 3nP4
Geobacillus sp. JAM-FM0901 Geobacillus sp. MKK-2005
2e-126
+ (-) (+) + ↑ ↑
8 NB80 Cu500
Bacillus atrophaeus strain Uz1106 Bacillus subtilis QB928
Bacillus vallismortis strain UAC-21 Bacillus amyloliquefaciens strain
UAC-19 Brevibacterium halotolerans strain
UAC-13
7e-120
+ (-) (-) (+) + ↑ ↑
9 NB80 Cu500
Bacillus atrophaeus strain Uz1106
Bacillus subtilis QB928 Bacillus vallismortis strain
UAC-21 Bacillus amyloliquefaciens
strain UAC-19 [Brevibacterium] halotolerans
strain UAC-13
2e-126
(+) (-) + + (-) + + ↑
Nota: Os símbolos (+) e (-) simbolizam uma diminuição de intensidade e grande diminuição de intensidade, relativa ao total de bandas para cada poço, respetivamente
51
4.2.2. Subgrupo filogenético β-Proteobacteria
Foram efetuados géis de DGGE com os produtos de PCR resultantes da
amplificação por nested-PCR, com os primers específicos para as β-Proteobacteria
(figura 18).
Figura 18: Gel de DGGE das amostras de DNA extraído dos enriquecimentos seletivos, amplificadas com o par de primers específicos para o subgrupo filogenético β-Proteobacteria
M – marcador composto por uma mistura bacteriana; 6 – NB30; 7 – NB30 Cu100; 8 – NB30 Cu500; 9 –
NB50; 10 – NB50 Cu100; 11 – NB50 Cu500; 12 – NB80; 13 – NB80 Cu100; 14 – NB80 Cu500. As setas a vermelho
representam as bandas que foram sequenciadas.
Foram escolhidas as bandas assinaladas para posterior sequenciação. A análise
conjunta das sequências- com recurso ao Blast- e da sua intensidade relativa em cada
enriquecimento-com recurso ao ImageJ®- permitiu a identificação preliminar dos
microrganismos sob efeito da temperatura e do cobre (ver Tabela 6).
As identidades encontradas foram exploradas, pela consulta dos números de
acesso fornecidos por Blast. O género Massilia pertence à classe β-Proteobacteria,
ordem Burkhoderiales, família Oxalobacteraceae. Esta inclui grande número de
bactérias saprófitas, de enorme versatilidade; muitas são utilizadas como agentes de
controlo antifúngico e de bioremediação, dada à sua capacidade de metabolização de
inúmeros compostos orgânicos, incluindo herbicidas (Sangodkar et al, 1988). Os
relatos sobre a resistência ao cobre por parte de membros da classe B- Proteobacteria
são escassos. Recentemente foram isolados duas espécies de Massilia a partir de
superfícies metálicas de cobre (Espírito Santo et al, 2010). Esta descoberta é
Pseudomonas
aeruginosa
Escherichia coli
k12
Paenibacillus sp.
DSM34
52
consistente com os nossos resultados, os quais incluíram o género Massilia nas
sequências derivadas dos enriquecimentos com cobre.
Ochrobactrum foi um género igualmente identificado nas sequências obtidas.
Surpreendentemente, apenas surge no enriquecimento efetuado a 50oC, não se tendo
encontrado qualquer registo bibliográfico desse género a essa temperatura. Trata-se
de um género da ordem Rhizobiales, família Brucellacea, cujos membros são
quimiorganotróficos aeróbios. Contrariamente ao esperado é uma α-Proteobacteria,
mas, Muhling et al (2008) obtiveram também com a estratégia de nested-PCR
mencionada, 17% de sequências não-pertencentes ao grupo alvo β-Proteobacteria. A
base de dados UniProt (EMBL) regista a presença de proteínas de resistência ao cobre
similares ao sistema Cop já descrito (ver secção 8), também em Ochrobactrum. Este
organismo também já foi detetado aquando do isolamento de bactérias oxidativas da
amónia com metabolismo mixotrofico. Algumas espécies serão assim capazes de
crescer sob modo heterotrófico e autotrófico, oxidando a amónia com produção de
nitrito (Kouki et al, 2011). Assim, a proliferação de bactérias termofílicas poderá estar
associada à proliferação de bactérias de crescimento mixotrófico, oxidando a amónia
disponibilizada pelas primeiras.
53
Tabela 6: Tabela resultante da análise conjunta da sequência e da intensidade relativa de bandas, selecionadas no Gel-Figura 18
Amostras
Bandas (amostras)
Resultados BLAST Valor
E NB30 Cu100
NB30 Cu500
NB50 NB50 Cu100
NB50 Cu500
NB80 NB80 Cu100
NB80 Cu500
Aumento da temperatura
Aumento de [Cu] no meio
1 NB30 Não Determinado
2 NB30 Cu100
Uncultured bacterium clone YJ-114
Massilia sp. C1804
61e
-70 + (+) (-) ↓ ↑
3 NB30 Cu100
Unculture bacterium clone YJ-114
Massilia sp. C1804 Naxibacter sp. UFLA0 4-292
39e
-72 + (-) ↓ ↑
4 NB50 Similar a banda 5 2
2e-55
(-) + (-)
5 NB50
Ochrobactrum sp. FDK2 Ochrobactrum sp. He-Xw
Uncultured bacterium isolate
Uncultured beta proteobacterium
22e
-55 (-) + (-)
6 NB50 Ochrobactrum sp. FDK2
Ochrobactrum sp. He-Xw 7
2e-64
+ (+) + (+) ↑
7 NB50 Cu100
Uncultured bacterium clone YJ-114
Massilia sp. C1804
29e
-72 + + (-) + (-) ↑
8 NB80 Pantoea agglomerans strain
ZFJ-15 6
1e-47
(-) (+) + (+) ↑
9 NB80 Cu100
Ochrobactrum sp. FDK2 Ochrobactrum sp. He-Xw
63e
-63 + (+) + (+) ↑
NOTA - a banda 5 apresenta comigração de duas sequências distintas. Os símbolos (+) e (-) simbolizam uma diminuição de intensidade e grande diminuição de intensidade, relativa ao total de bandas para cada
poço, respetivamente
54
4.2.3. Subgrupo filogenético Desulfovibrio/Desulfomicrobium
Foram também efetuados géis de DGGE com os produtos de PCR resultantes da
amplificação com os primers específicos para o subgrupo filogenético
Desulfovibrio/Deslfomicrobium sobre o DNA extraído dos enriquecimentos (figura 19).
Figura 19: Montagem do gel de DGGE das amostras de DNA extraído dos enriquecimentos seletivos, amplificadas com o par de primers específicos para os géneros Desulfovibrio/Desulfomicrobium.
M – Marcador; 1 - NB30 Cu500; 2 - NB30 Cu100, 3 – NB30, 4 – NB50 Cu500; 5 – NB50 Cu100; 6 – NB50 C; 7 – NB80; 8 – NB80
Cu100; 9 – NB80 Cu500. As setas a vermelho representam as bandas que foram sequenciadas.
Foram escolhidas as bandas assinaladas para posterior sequenciação. Os
resultados obtidos através da análise das sequências pelo Blast, foram, não obstante,
distintos dos esperados. Obtiveram-se sequências correspondentes a microrganismos,
todos eles da classe Bacilli, família Paenibacillaceae. Em particular, várias sequências
mostravam identidade com membros do género Paenibacillus, género não detetado
na estratégia prévia de nested-PCR usada para o Phylum Firmicutes. Verificou-se de
facto, com uso do Primer-Blast (NCBI), que os primers DSV (ver secção 5.2) podem
emparelhar com o gene 16SrRNA de Brevibacillus e Paenibacillus, originando um
fragmento de tamanho similar ao esperado pelo emparelhamento com o gene
16SrRNA de membros do grupo-alvo. Esta observação está aliás associada à
degenerescência dos primers usados. Assim, estes primers descritos por Dar et al
(2005), na definição de uma estratégia para a deteção de baixos números de bactérias
sulfato-redutoras em comunidades microbianas complexas, revelam-se úteis apenas
quando usados para aquelas condições que favoreçam a proliferação de sulfato-
1 2 3 4 5 6 7 8 9 M
1
2
3
4
8
9
6
7 5
10
12
11
13
14
Pseudomonas
aeruginosa
Escherichia coli
estirpe k12
Paenibacillus sp.
DSM 34
55
redutores. Este foi aliás, o caso estudado pelos autores, que analisaram a diversidade
microbiana em reatores de tratamento de águas residuais.
Ao conjugar os resultados do Blast com os do ImageJ® (Tabela 7), várias
informações importantes foram colhidas. Além da deteção de Paenibacillus sp., como
acima mencionado, anaeróbios facultativos, mesofílicos e esporulantes,
frequentemente encontrados no solo, em particular na rizosfera, encontrámos
membros do género Brevibacillus, com um padrão de resposta similar ao observado
anteriormente (ver tabela 5). De reparar por exemplo, nas sequências das bandas 8 e
9, reportando identidade a Brevibacillus, presentes nos enriquecimentos a 50°C e na
presença de cobre, tal como já tinha sucedido quando da análise em 4.2.1.
Apenas uma banda (banda 11) correspondia a uma sequência de um clone
bacteriano não cultivado, a qual pode corresponder a um membro do género
Desulfomicrobium.
56
Tabela 7: Tabela resultante da análise conjunta da sequência e da intensidade relativa de bandas, selecionadas no Gel-Figura 19
Amostras Bandas
(amostras) Resultados BLAST Valor E NB30
NB30 Cu100
NB30 Cu500
NB50 NB50 Cu100
NB50 Cu500
NB80 NB80 Cu100
NB80 Cu500 Aumento da temperatura
Aumento de [Cu] no meio
3 NB30 Cu100
Não determinado +
4 NB30 Cu100
Paenibacillus sp. CAU1055
Paenibacillus glebae strain EA14
3e-66
+ + (-) + ↓
5 NB50 Brevibacillus
borstelensis strain MA5 8e
-73 + (+) ↑
6 NB50 Cu100
Paenibacillus residui strain R8-313
Paenibacillus sp. R-27413
3e-66
(-) + (-) ↑ ↑
7 NB50 Cu100
Brevibacillus borstelensis strain MA5
1e-71
+ (+) ↑
8 NB50 Cu500
Uncultured bacterium clone ncd957e10c1
1e-71
(+) (+) + (-) ↑ ↑
9 NB50 Cu500
Uncultured compost bacterium partial
Brevibacillus limnophilus strain E10
2e-59
(
(+) (+) + (-) ↑ ↑
10 NB80
Brevibacillus sp. enrichment culture clone
phylotype P25 3e
-67
((+)
++
↑
11 NB80 Cu100
Uncultured bacterium clone 65_51
2e-73
+ (-) + (+) ↑
12 NB80 Cu500
Não determinado +
13 NB80 Cu500
Não determinado +
14 NB80 Cu500
Paenibacillus barengoltzii 16S
3e-72
(-) (-) (-) + ↑ ↑
NOTA: Os símbolos (+) e (-) simbolizam uma diminuição de intensidade e grande diminuição de intensidade, relativa ao total de bandas para cada poço, respetivamente
57
Conclusões e perspetivas futuras
A descoberta recente do papel das bactérias termofílicas como produtoras de
amónio e sulfato, incita a vários estudos sobre a sua potencial aplicação como bio-
fertilizantes ou adjuvantes na fertilização dos solos e a considerá-las como elementos
de importância na elaboração de futuros modelos agrícolas, mais sustentáveis. Num
trabalho recente, Santana et al, (não publicado) mostraram um efeito do
sobrenadante de cultura de alguns isolados termofílicos do Phylum Firmicutes, na
estimulação da germinação de sementes de Nicotiana benthamiana in vitro. É assim
possível conceber uma utilização para as bactérias termofílicas a médio prazo, em
ambientes controlados, como em estufa, e em etapas iniciais do desenvolvimento de
plantas agrícolas. Contudo, o seu uso direto em solos agrícolas requer um estudo
deveras aprofundado. Esse estudo deve ter em consideração a influência de vários
fatores físico-químicos, aqueles inerentes à composição mineral do solo e fatores
climáticos, bem como fatores associados à quantidade, atividade e diversidade
microbiana do solo, que agem sobre os primeiros.
Será sempre impossível de compreender a interação global entre os vários
microrganismos do solo, mas é possível visar grupos específicos e realizar inúmeros
ensaios em campo, quando for desejada uma futura aplicação dos resultados
laboratoriais. Assim, na execução deste trabalho focamo-nos sobre grupos
taxonómicos de interesse: as bactérias termofílicas supramencionadas, e as bactérias
oxidativas de amónia (β-Proteobacteria) e redutoras de sulfato (Desulfovibrio e
Desulfomicrobium), potencialmente competidoras com as plantas na absorção de
amónio e sulfato, respetivamente, estes produzidos pelas primeiras. Foi estudado o
efeito da temperatura e do cobre sobre a dinâmica desses grupos. A temperatura tem
uma importância evidente sobre a proliferação das bactérias termofílicas. O cobre,
amplamente usado como elemento fitossanitário, a maioria das vezes sob a forma de
sulfato de cobre, pode ser extremamente tóxico como referido na secção 8. As
alterações na comunidade microbiana foram avaliadas sobre enriquecimentos
seletivos, obtidos a partir de uma amostra composta de solo de olival, visando
primariamente o enriquecimento em bactérias termofílicas presentes na amostra. A
técnica molecular de fingerprint – PCR-DGGE, foi a utilizada para tal estudo, já que
constituí uma ferramenta poderosa no estudo da diversidade microbiana, ao permitir
incluso a identificação de membros da comunidade, impossíveis de obter com os
tradicionais métodos de cultivo.
Entre os resultados obtidos, consequentes a esta análise, são importantes de
referir:
58
O aumento da temperatura e do cobre permitiram a proliferação de membros
do Phylum Firmicutes, dos géneros Bacillus, e em particular de Brevibacillus,
géneros com genes codificantes de proteínas resistentes ao cobre. Estes são
também os géneros reportados como produtores de amónio e sulfato, o que
mostrou que o tratamento com cobre (o qual foi usado nos ensaios em teor
similar ao encontrado no solo sob tratamento) não foi limitativo para o
crescimento destes microrganismos.
O teor de sulfato produzido foi aumentado a temperatura mais elevada, e em
particular à maior concentração de cobre utilizada, mostrando que o
tratamento com cobre não limita a produção de sulfato. Esse aumento,
concomitante à atividade dos géneros Bacillus e Brevibacillus detetados,
poderá estar associado a um mecanismo de stress despoletado pelo cobre, já
que um isolado produtor de sulfato, obtido a partir de um enriquecimento à
concentração de 500 μM de cobre, mostrou uma diminuição do rendimento de
crescimento.
O tratamento com cobre não influencia a produção total de amónia, a qual é
similar nos vários enriquecimentos.
A maior proliferação das bactérias termofílicas produtoras de sulfato e amónia
a temperatura mais elevada levou também à deteção de Proteobacteria
(género Ochrobactrum) capazes de utilizar amónio em crescimento mixotrófico.
Estes dados sugerem algumas estratégias a ter em conta no tratamento dos
solos agrícolas com cobre. Se considerarmos o potencial das bactérias termofílicas na
fertilização e que estas incluem membros resistentes ao cobre, então uma aplicação
preventiva deste elemento durante um período sazonal quente, teria menos impacto
sobre a população termofílica do solo, a qual, embora resistente ao cobre, terá um
fator limitante adicional ao seu crescimento durante uma estação fria (o fator
temperatura). Dado que a proliferação das bactérias termofílicas incentivará a
proliferação de populações mixotróficas com a consequente formação de nitrito e
nitrato, o uso potencial destas espécies endógenas como fertilizantes seria mais
adequado para aa culturas agrícolas que utilizem o nitrato, bem como a amónia.
Pretendemos, num futuro próximo, repetir ensaios de DGGE similares, todavia
com recurso a primers para genes codificantes de enzimas, como os genes codificantes
da amónia monooxigenase (AMO) e da sulfito reductase (DSR), para deste modo
proceder a uma análise comparativa, bem como a eliminar a frequente comigração
nos géis de DGGE, associada à existência de cópias múltiplas dos genes de RNA
ribossomal. Também perspetivamos a elaboração de bancos genómicos a partir do
DNA extraído dos enriquecimentos, e a utilização dos fragmentos sequenciados como
sondas a hibridar nesses bancos, de modo a obter a sequência total dos genes
59
16SrRNA aqui amplificados parcialmente. Por fim, a realização de PCR quantitativo em
tempo real, com recurso a primers específicos para os géneros aqui determinados
fornecerá uma informação mais completa sobre a sua interdinâmica.
60
Referências Bibliográficas
Ahmed, I., A Yokota, A., Yamazoe, A., Fujiwara, T. (2007): “Proposal of Lysinibacillus
boronitolerans gen. nov. sp. nov., and transfer of Bacillus fusiformis to Lysinibacillus
fusiformis comb. nov. and Bacillus sphaericus to Lysinibacillus sphaericus comb. nov”.
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67
Anexos
i. Tabelas referentes à quantificação de sulfato e amónia nos
enriquecimentos
Tabela 8 - Quantificação de amónio nos enriquecimentos.
Stock (mM) Média [NH4] mM Desvio padrão
(±) Média [NH4]/(CFU/ml)
Desvio padrão (±)
NB30 8.048 0.365836523 1.13349E-08 5.15263E-10
NB50 7.628 1.852541115 7.62812E-09 1.85254E-09
NB80 5.579 1.27166156 1.85977E-07 4.23887E-08
NB 30 Cu100 7.990 1.827855889 3.99484E-07 9.13928E-08
NB50 Cu100 8.228 2.008670577 8.22846E-09 2.00867E-09
NB80 Cu100 4.852 1.411358757 Não determinado
NB30 Cu500 7.777 1.229623121 2.59223E-07 4.09874E-08
NB50 Cu500 7.297 1.507482157 2.43233E-07 5.02494E-08
NB 80 Cu500 4.267 1.401566585 1.42239E-07 4.67189E-08
68
Tabela 9 - Quantificação de sulfato nos enriquecimentos
Stock (mM) Média [SO42-] mM Desvio padrão
(±) Média [SO4
2-]/(CFU/ml) Desvio padrão
(±)
NB30 0.287 0.153512882 4.0359E-10 2.16215E-10
NB50 0.392 0.171473394 3.9225E-10 1.71473E-10
NB80 0.615 0.092744125 2.0486E-08 3.09147E-09
NB 30 Cu100 0.288 0.089236876 1.4405E-08 4.46184E-09
NB50 Cu100 0.238 0.178120198 2.3795E-10 1.7812E-10
NB80 Cu100 0.735 0.301298199 Não determinado
NB30 Cu500 2.254 0.025950819 7.5145E-08 8.65027E-10
NB50 Cu500 2.219 0.035143207 7.3962E-08 1.17144E-09
NB 80 Cu500 1.271 Não
determinado 4.2368E-08 Não determinado
ii. Sequência do 16S rDNA do isolado
Tabela 10 – Sequência 16S rDNA do isolado obtido a partir do enriquecimento.
Amostra Sequência
Isolado
AGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACT
69
iii. Sequências das bandas recolhidas do gel DGGE
a. Firmicutes Tabela 11 - Sequências obtidas a partir das bandas recolhidas do gel de DGGE.
Bandas Amostras Sequências
1 NB30 Cu100
CGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGCGGTCCTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGGACTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGTGGAATTCCAAGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATTTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAG*
2 NB30 Cu500
CGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGTGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGAGACTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATATGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGTCTGTAACTGACACTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAG
5 NB50 Cu500
CGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGCGGCTATGTAAGTCTGGTGTTAAAGCCCGGGGCTCAACCCCGGTACGCATCGGAAACTGTGTAGCTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGCGGTATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGRCTYTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAG
6 NB50 Cu500
CGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGCGGCTATGTAAGTCTGGTGTTAAAGCCCGGGGCTCAACCCCGGTACGCATCGGAAACTGTGTAGCTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGCGGTATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTTTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAG
7 NB80 Cu500
CCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGCGGTTCCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGCGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAG
8 NB80 Cu500
CCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCKCGCAGGCGGTTYCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGYGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGRCTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGMGCGAAAGCGTGGGGAGCRAACAGGATTAGATACCCTGGTAG
9 NB80 Cu500
CCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAG
NOTA – a sublinhado encontra-se a sequência do primer Reverse (785R) usada na amplificação
por PCR das bandas recolhidas.
70
b. β-Proteobacteria
Tabela 12 - Sequências obtidas a partir das bandas recolhidas do gel de DGGE.
Bandas Amostras Sequências
1 NB30 -
2 NB30 Cu100
TAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGTGCGCAGGCGGTTTTGTAAGTCTGTCGTGAAAGCCCCGGGCTCAACCTGGGAATTGCGATGGAGACTGCAAGGCTTGAATCTGGCAGWGGGGGGTAGAATTCCACGTGTAGCAGTGAAATGCGT
3 NB30 Cu100
TAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGTGCGCAGGCGGTTTTGTAAGTCTGTCGTGAAAGCCCCGGGCTCAACCTGGGAATTGCGATGGAGACTGCAAGGCTTGAATCTGGCAGAGGGGGGTAGAATTCCACGTGTAGCAGTGAAATGCGT
4 NB50 Similar a banda 5.
5 NB50
TCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGYGCGCAGGCGGYTMTGTAAGTCTGGTGTTAAAGCCCSGGGCTCAACCCCGGTTCGCATCGGAAACTGTGTAGCTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGCGGTATTCCMCGTGTRKCASTGAAATGCGT
6 NB50
TCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGCGGCTATGTAAGTCTGGTGTTAAAGCCCGGGGCTCAACCCCGGTTCGCATCGGAAACTGTGTAGCTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGCGGTATTCCACGTGTAGCAGTGAAATGCGT
7 NB50 Cu100
TAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGTGCGCAGGCGGTTTTGTAAGTCTGTCGTGAAAGCCCCGGGCTCAACCTGGGAATTGCGATGGAGACTGCAAGGCTTGAATCTGGCAGAGGGGGGTAGAATTCCACGTGTAGCAGTGAAATGCGT
8 NB80
TCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGCGGTCGGGTAAGTCTGATGTCAAAGCCCGGGGCTCAACCCCGGTACGCATTGGAAACTGCTCGACTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGCGGAATTCCACGTGTAGCAGTGAAATGCGT
9 NB80 Cu100
TCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGCGGCTATGTAAGTCTGGTGTTAAAGCCCGGGGCTCAACCCCGGTTCGCATCGGAAACTGTGTAGCTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGCGGWATTCCACGTGTAGCAGTGAAATGCGT
NOTA – a sublinhado encontra-se a sequência do primer Reverse (682R) usada na amplificação
por PCR das bandas recolhidas.
71
c. Desulfovibrio/Desulfomicrobium
Tabela 13 - Sequências obtidas a partir das bandas recolhidas do gel de DGGE.
Bandas Amostras Sequências
3 NB30 Cu100 -
4 NB30 Cu100
GYCKGAMTARAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAARGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGCCAGGGAAGAACGCTTGGGAGAGTAACTGCTCTCAAGGTGACGGTACCTGAGAAGAAAGCCCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAAT*
5 NB50
SAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAACGATGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGTTCTGTTGTCAGAGACGAACAAGTACCGTTCGAACAGGGCGGTACCTTGACGGTACCTGACGAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCARCAGCCGCGGTAAT
6 NB50 Cu100
GCCTGACAGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAAACTCTGTTGCCAGAGAAGAAAGCTAAGGAGAGTCACTGCTCTTTGGTTGACGGTATCTGARAAGAAAGCCCCGGCTAACTACSTGCCAGCAGCCSCGGTAAT
7 NB50 Cu100
GTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAACGATGAARGTCTTCGGATTGTAAAGTTCTGTTGTCAGAGACGAACAAGTACCGTTCGAACAGGGCGGTACCTTGACGGTACCTGACGAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAAT
8 NB50 Cu500
GAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAACGATGAARGTCTTCGGATTGTAAAGTTCTGTTGTCAGGGACGAACAAGTACTGTTCGAATARGGCAGTACCTTGACGGTACCTGACGAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAAT
9 NB50 Cu500
GCGGAATAAGSACGCCGCGTGCACGATKATAGTCTTCGGATTGTAAAGTTCTGTTGTCAGGGACGAACAAGTACCGTTTGAACAAGGCGGTACCTTGACGGTACCTGACGAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAAT
10 NB80
GAAGGAGCAACGCCGCGTGAACGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGTTCTGTTGTCAGGGACGAACAAGTACCGTTCGAACAGGGCGGTACCTTGACGGTACCTGACGAGAAAGCCACGGCTAACTAAGTGCCAGCAGCCGCGGTAAT
11 NB80 Cu100
GACGAAAGTCTGATGAAGCAACGCCGCGTGAACGATGAAAGTCTTCGGATTGTAAAGTTCTGTTGTCAGGGACGAACAAGTACCGTTCGAACAGGGCGGTACCTTGACGGTACCTGACGAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAAT
12 NB80 Cu500 -
13 NB80 Cu500 -
14 NB80 Cu500
AAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGCCAGGGAAGARCGTCCGTTAGAGTAACTGCTAACGGAGTGACGGTACCTGAGAAGAAAGCCCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAAT
NOTA – a sublinhado encontra-se a sequência do primer Reverse (518R) usada na amplificação
por PCR das bandas recolhidas.