Orientador(a): Prof. (ª) THANNYA NASCIMENTO SOARES

UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS ESCOLA DE AGRONOMIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E MELHORAMENTO DE PLANTAS

DIVERSIDADE E ESTRUTURA GENÉTICA EM POPULAÇÕES NATURAIS DE PTERODON EMARGINATUS VOGEL (LEGUMINOSAE)

MARCOS VINÍCIUS PEREIRA PINTO

Setembro – 2017

Goiânia - GO Brasil

Marcos Vinícius Pereira Pinto

Diversidade e estrutura genética em populações

naturais de Pterodon emarginatus Vogel

(Leguminosae)

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em

Genética e Melhoramento de Plantas, da Universidade

Federal de Goiás, como requisito parcial à obtenção do

título Mestre em Genética e Melhoramento de Plantas.

Orientador (a):

Prof. (ª) Dr. (ª) Thannya Nascimento Soares

Goiânia, GO – Brasil 2017

RESUMO

PINTO, M. V. P. Diversidade e estrutura genética em populações naturais de Pterodon

emarginatus Vogel (Leguminosae). 2017. 49 f. Dissertação (Mestrado em Genética e

Melhoramento de Plantas) – Escola de Agronomia, Universidade Federal de Goiás, Goiânia,

2017.1

A diversidade genética é componente fundamental para a sobrevivência de qualquer espécie ao longo

do tempo evolutivo, isto porque configura-se como o repertório de possíveis respostas ás pressões

ambientais, que são dinâmicas e constantes. O conhecimento da magnitude e dos padrões de

estruturação dessa diversidade permite entender como fatores ambientais e microevolutivos tem

interagido ao longo do tempo e moldado as populações, possibilitando melhor uso e conservação.

Marcadores microssatélites tem sido a ferramenta molecular mais utilizada nas últimas décadas para

estudos de mapeamento de diversidade e estrutura genética, devido ao seu alto grau de polimorfismo,

abundância genômica e natureza codominante. Para espécies nativas raramente esses marcadores

estão disponíveis, no entanto, as regiões que flanqueiam os microssatélites costumam ser

conservadas entre espécies evolutivamente próximas, o que possibilita a transferência desses

marcadores. Pterodon emarginatus Vogel, popularmente conhecida como Sucupira Branca, é uma

planta arbórea pertencente à família das leguminosas. Esta espécie é amplamente utilizada com

propósitos medicinais devido ao vasto potencial terapêutico de seus compostos secundários. Além

disso, fornece madeira rígida de interesse para construção civil e também é utilizada como espécie

ornamental. Apesar da grande quantidade de estudos direcionados para o potencial medicinal, pouco

se sabe sobre a diversidade genética presente nessa espécie. Diante disso, os objetivos do trabalho

foram transferir para P. emarginatus marcadores microssatélites desenvolvidos para Dipteryx alata

e acessar a diversidade e estrutura genética em populações naturais de P. emarginatus. Para isso, foi

testada à amplificação cruzada de 25 iniciadores e 12 populações naturais foram genotipadas para 6

locos microssatelites. Dos 25 iniciadores testados, 2 (8%) apresentaram bom padrão de amplificação

e polimorfismo. O conjunto de marcadores utilizados revelou um total de quarenta e cinco alelos,

com uma média de 7,667 por loco. Esse valor variou de 4 (DaE12) a 22 (PVESTBR067). As

populações apresentaram nível intermediário de diversidade genética (He=0,555) e maior

variabilidade dentro de populações do que entre populações. Foram detectados pequenos, porém

significativos, níveis de endogamia devido tanto ao sistema de acasalamento quanto a subdivisão

populacional (f= 0,07; Fst= 0,073). Esses resultados suportam que a espécie apresenta sistema misto

de acasalamento. O padrão de divergência entre as populacionais demonstrou-se moderadamente

estruturado no espaço (Mantel= 0,440; p<0,002) indicando um perfil de grandes populações

continuas, com níveis significativos de fluxo gênico em distancias até aproximadamente 400 km.

Palavras-Chave: Pterodon emarginatus Vogel, microssatélite, diversidade genética, estrutura

genética.

________________

1 Orientador (a): Prof.a Dr.a Thannya Nascimento Soares. ICB-UFG

ABSTRACT

PINTO, M. V. P. Diversity and genetic structure in natural populations of Pterodon

emarginatus Vogel (Leguminosae). 2017. 49 f. Dissertation (Master of Science in Genetics

and Plant Breeding) – Escola de Agronomia, Universidade Federal de Goiás, Goiânia, 2017.1

Genetic diversity is a fundamental component for the survival of any species over evolutionary time,

because it is the repertoire of possible responses to environmental pressures, which are dynamic and

constant. Knowledge of the magnitude and structuring patterns of this diversity allows to understand

how environmental and microevolutionary factors have interacted over time and shaped the

populations. Microsatellite markers have been the most used molecular tool in recent decades for

mapping studies of diversity and genetic structure due to its high degree of polymorphism, genomic

abundance and codominant nature. For native species these markers rarely are available, however,

the regions flanking the microsatellites are usually conserved among evolutionarily close species,

which allows the transfer of these markers. Pterodon emarginatus Vogel, popularly known as

Sucupira branca, is a tree plant belonging to the legume family. This species is widely used for

medicinal purposes because of the broad properties of its secondary compounds. In addition, it

provides rigid wood of interest for construction and is also used as an ornamental species. Despite

the substantial number of studies directed to the medicinal potential, little is known about the genetic

diversity present in this species. Therefore, the objectives of the work were to transfer to P.

emarginatus microsatellite markers developed for Dipteryx alata and to access the diversity and

genetic structure in natural populations of P. emarginatus. For this, the cross-amplification of 25

primers were tested and 12 natural populations were genotyped for 6 loci. Of the 25 primers tested,

2 (8%) showed good amplification and polymorphism pattern. The set of markers used revealed a

total of 45 alleles for the 12 populations evaluated, with a mean of 7.667 per locus. This value ranged

from 4 (DaE12) to 22 (PVESTBR067). Populations showed intermediate levels of genetic diversity

(He = 0.555) and greater variability within populations than among populations. Small but significant

levels of inbreeding were detected due to both the mating system and the population subdivision (f =

0.07; Fst = 0.073). These results support that the species presents a mixed mating system, being

preferentially allogama. The pattern of divergence among populations was moderately structured in

space (Mantel = 0.440, p <0.002) indicating a profile of large continuous populations with significant

levels of gene flow over distances up to approximately 400 km.

keywords: Pterodon emarginatus Vogel, microsatelite, genetic diversity, genetic structure.

________________

1 Orientador (a): Prof.a Dr.a Thannya Nascimento Soares. ICB-UFG

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO .......................................................................................................................... 10

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA .................................................................................................. 12

2.1 Pterodon emarginatus VOGEL ............................................................................................. 12

2.1.1 Classificação taxonômica .............................................................................................. 12

2.1.2 Descrição Botânica ........................................................................................................ 13

2.1.3 Distribuição, Importância sócio-econômica e ambiental ........................................... 15

2.2 DIVERSIDADE GENÉTICA ................................................................................................ 16

2.3 ESTRUTURA GENÉTICA ................................................................................................... 17

2.4 MARCADORES MICROSSATÉLITES ............................................................................... 19

3. MATERIAL E MÉTODOS ....................................................................................................... 21

3.1 AMOSTRAGEM ................................................................................................................... 21

3.2 EXTRAÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DO DNA .................................................................... 22

3.3 TESTE AMPLIFICAÇÃO CRUZADA E SELEÇÃO DE LOCOS MICROSSATÉLITES

POLIMÓRFICOS ........................................................................................................................ 22

3.4 GENOTIPAGEM ................................................................................................................... 25

3.5 ANÁLISES GENÉTICO POPULACIONAIS ....................................................................... 25

4. RESULTADOS ........................................................................................................................... 27

5. DISCUSSÃO ............................................................................................................................... 34

6. CONCLUSÕES .......................................................................................................................... 38

7. REFERÊNCIAS ......................................................................................................................... 39

8. APÊNDICES ............................................................................................................................... 46

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Populações amostradas para análise de diversidade e estrutura genética. Goiás

(GO), Minas Gerais (MG) e Mato Grosso (MT) ............................................................ 21

Tabela 2. Marcadores desenvolvidos para Dipteryx alata utilizados nos testes de

amplificação cruzada. .......................................................................................................... 23

Tabela 3. Marcadores utilizados na genotipagem das populações de Pterodon emarginatus

Vog. ..................................................................................................................................... 27

Tabela 4. Estatísticas descritivas relativas aos seis locos microssatélites avaliados: Número

de indivíduos avaliados (N); Número de alelos por loco polimórfico (A); Número médio de

alelos por loco para as populações (Ar); Heterozigosidade observada (Ho); Heterozigosidade

esperada (He); Índice de fixação intra-populacional (f). ..................................................... 28

Tabela 5. Estatísticas descritivas relativas as doze populações avaliadas. São apresentadas

as estimativas dos parâmetros: Número médio de alelos por loco para as populações (Ar);

heterozigosidade observada (Ho); heterozigosidade esperada (He); índice de fixação intra-

populacional (f).................................................................................................................... 29

Tabela 6. Valores estimados e intervalo de confiança para os parâmetros: índice de fixação

intra-populacional (f), coeficiente de endogamia total (F) e diferenciação inter-populacional

(θ) geradas pela análise de variância das frequências alélicas com seis locos microssatélites

para a espécie Pterodon emarginatus Vog. .......................................................................... 29

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Indivíduo de Pterodon emarginatus Vog.. ........................................................... 14

Figura 2. Variação para a cor das flores em Pterodon emarginatus Vog. ........................... 14

Figura 3. Frutos de Pterodon emarginatus Vog.. ................................................................. 15

Figura 4. Populações amostradas para o estudo de diversidade e estrutura genética em

Pterodon emarginatus Vog. ARGMT= Araguaiana, ARUGO= Aruanã, COCMT=

Cocalinho, IPOGO= Iporá, PERMG= Perdizes, PIRGO= Pirenópolis, POTGO= Portelândia,

PTUMG= Paracatu, SECGO= Serra de Caldas, SFRGO= São Francisco de Goiás, SILGO=

Silvânia, TUPMG= Tupaciguara. ........................................................................................ 22

Figura 5. Análise de Coordenadas Principais. Primeiro eixo (PCo1) e segundo eixo (PCo2).

Entre parêntesis a porcentagem de explicação de cada eixo. .............................................. 30

Figura 6. Correlação entre distancia genética e distancia espacial das populações naturais de

Pterodon emarginatus Vog. ................................................................................................. 31

Figura 7. Representação gráfica da análise de agrupamento bayesiana para 12 populações de

Pterodon emarginatus baseada em 6 locos microssatélites e para k=5. Cada indivíduo é

representado por uma barra vertical, apresentando a proporção do seu genoma pertencente a

cada um dos grupos estabelecidos. ...................................................................................... 31

Figura 8. Correlograma entre I de Moran e classes de distância entre populações naturais de

Pterodon emarginatus Vog. Os pontos representam o valor médio do I de Moran para cada

classe de distância e as linhas tracejadas o desvio padrão. Entre parêntesis a quantidade de

valores significativos a 5% (p<0,001). ................................................................................ 32

Figura 9. Descontinuidade genética (seta) em populações naturais de Pterodon emarginatus

Vog estimada pelo algoritmo de máxima diferenciação de Monmonier a partir do primeiro

eixo da PCoa e da rede de Gabriel. A intensidade da cor que preenche cada quadrado

representa a orientação de cada população no primeiro eixo da PCoA............................... 33

Figura 10. Modelo linear entre latitude e variação genética para as doze populações de

Pterodon emarginatus Vog. ................................................................................................. 33

1. INTRODUÇÃO

A diversidade genética é componente imprescindível para manutenção das

espécies ao longo do tempo, pois permite aos indivíduos responderem as constantes

mudanças ambientais que lhes são impostas. Populações naturais geralmente apresentam

estruturação dessa diversidade no tempo e no espaço, devido à ação de diferentes forças

microevolutivas, fatores ambientais e biologia reprodutiva de cada espécie. O conhecimento

da magnitude da diversidade e dos padrões de estruturação permite entender como esses

fatores tem interagido ao longo do tempo e moldado as populações. Essa compreensão é

fundamental para melhor uso e conservação de qualquer espécie.

Marcadores microssatélites tem sido a ferramenta molecular mais utilizada nas

últimas décadas para estudos de mapeamento de diversidade genética, devido seu alto grau

de polimorfismo, abundancia genômica e natureza codominante. No entanto, para espécies

nativas sem imediato interesse econômico, raramente esses marcadores estão disponíveis. O

desenvolvimento de novo de microssatélites pode demandar quantidade significativa de

tempo e dinheiro, o que geralmente também não está disponível para esse tipo de espécies.

Nesse contexto, a possibilidade de se transferir marcadores disponíveis para espécies

filogeneticamente próximas mostra-se uma alternativa interessante (Kalia et al., 2011).

Pterodon emarginatus Vog. popularmente conhecida como sucupira branca, é

uma planta arbórea pertencente à família das leguminosas. As populações de P. emarginatus

estão distribuídas geograficamente nas regiões norte (Rondônia e Tocantins), nordeste

(Bahia, Ceará, Maranhão, Piauí), centro-oeste (Goiás, Distrito Federal, Mato Grosso e Mato

Grosso do Sul) e sudeste (Minas Gerais e São Paulo) sendo comumente encontrada no

Cerrado. Está presente em quase todos os domínios fitogeográficos brasileiros, exceto nos

Pampas, e não é uma espécie endêmica do Brasil (Almeida et al. 1998; Lima & Lima, 2016).

Esta espécie é amplamente utilizada com propósitos medicinais devido as

propriedades antireumaticas (Coelho, 2004), analgésicas (Coelho, 2005) e anti-inflamatorias

11

(Santos, 2010) de seus compostos secundários. Além das propriedades terapêuticas, P.

emarginatus fornece madeira rígida de interesse para construção civil (Lima et al., 2012) e

também é utilizada como espécie ornamental e apícola devido a beleza de suas flores

(Aquino et al., 2007)

Apesar da grande quantidade de estudos direcionados para o potencial

medicinal, pouco se sabe sobre a diversidade genética presente nessa espécie. Além disso, a

resolução taxonômica do gênero ainda é bastante controversa e, dependendo da literatura

consultada, P. pubescens é tratada como sinônimo de P. emarginatus (Vieira et al., 2007;

Hansen et al., 2012; The Plant List, 2013; International Legume Database and Information

Service, 2015).

Grande parte dessa confusão ocorre devido à existência de duas morfos

distintas: Indivíduos com flores roxas e folíolos glabros e indivíduos com flores rosas e

folíolos pubescentes. Lewis (1987) considerou esse dimorfismo como variação fenotípica

dentro de P. emarginatus. Por outro lado, Rocha (2006) obteve dados moleculares sugerindo

que as duas morfos representam duas entidades biológicas distintas. No entanto, essa questão

ainda carece de dados adicionais e permanece inconclusiva. Em função disto, neste trabalho

utilizamos a abordagem de Lewis (1987), que trata P. emarginatus como uma espécie

politípica.

Os objetivos do trabalho foram transferir para P. emarginatus sensu Lewis

marcadores microssatélites desenvolvidos para Dipteryx alata e acessar a diversidade e

estrutura genética presentes em populações naturais de P. emarginatus.

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1 Pterodon emarginatus VOGEL

2.1.1 Classificação taxonômica

O gênero Ptetodon possui seis espécies descritas até o presente, sendo elas P.

apparicioi Pedersoli, P. macrophyllus Klotzsch, P. abruptus (Moric.) Benth, P. pubescens

(Benth.) Benth, P. polygalaeflorus (Benth.) Benth.e P. emarginatus Vog. No entanto, esse

número não é consenso e varia de acordo com a fonte consultada. O programa The Plant List

(2013) reconhece apenas três desses nomes, atribuindo o status de “aceito” para P. abruptus

e P. emarginatus e “não resolvido” para P. macrophyllus. A base de dados ILDIS

(International Legume Database and Information Service, 2015) lista os seis nomes descritos

para o gênero, porém atribui o status de “aceito” somente para P. emarginatus e P. abruptus.

P. polygalaeflorus é considerado “variante” de P. emarginatus e os demais nomes recebem

o status de “duvidoso”.

O programa Flora do Brasil 2020 (2016) reconhece P. abruptus, P. apparacioi,

P. emarginatus e P. pubescens com entidades taxonômicas distintas e considera

P.polygalaeflorus sinônimo de P. emarginatus. A base de dados IPNI (The International

Plant Names Index, 2005) reconhece todos os seis nomes existentes como válidos. Grande

parte dessa variação no número de espécies aceitas para o gênero é devida à incerteza na

delimitação das espécies P. emarginatus, P. pubescens e P. polygalaeflorus. Essa incerteza

é gerada pela ocorrência de indivíduos apresentando folhas pubescentes com 6-19 folíolos e

flores variando do róseo claro a róseo escuro e indivíduos com folhas glabras com 4-10

folíolos e flores roxas

13

Lewis (1987) considerou essas duas morfos como variação dentro de uma

espécie, P. emarginatus. Mais recentemente, Rocha (2006) realizou análises em nível de

DNA utilizando marcadores moleculares RAPD (Random Amplified Polymorfic DNA) e

dados morfológicos para investigar a variação encontrada dentro de P. emarginatus sensu

Lewis. Apoiada em seus resultados a autora concluiu que P. emarginatus e P. pubescens são

duas espécies diferentes, e P. polygalaeflorus deve continuar sendo mantida como sinônimo

de P. emarginatus. A análise molecular demonstrou que 74% da variância encontrada é

explicada pela diferença entre as formas rósea e roxa, sendo P. emarginatus caracterizada

pela flor roxa e P. pubescens pela flor rósea. No entanto, não existe revisão publicada para

o gênero até o presente, o que torna a questão inconclusiva. Diante disso, optamos por

abordar p. emarginatus como proposto por Lewis (1987).

2.1.2 Descrição Botânica

P. emarginatus é uma árvore de altura aproximada entre 5 e 15 metros (Figura

1), troncos com diâmetros de até 70 cm; ritidoma de cor acinzentada ou amarelada, ásperos

com depressões e deiscência de placas irregulares; casca descamante em arvores velhas,

podendo apresentar rachaduras ou fissuras. Suas folhas são compostas; paripinadas;

alternadas, espiraladas; com 4 a 19 folíolos; podendo ser alternos ou opostos; oblongos ou

ovados; de 2 a 6cm de comprimento e 1 a 4cm de largura; ápices emarginados ou

arredondados (Brasil, 2016).

14

Figura 1. Indivíduo de Pterodon emarginatus Vogel. Fonte: Brasil 2016.

O florescimento ocorre entre os meses de julho e outubro e frutificação entre

junho e setembro. (Lorenzi, 2002; Brasil, 2016). As flores são pequenas, hermafroditas,

zigomorfas, com cálice variando do rosa claro ao roxo (Figura 2) e com duas sépalas

superiores livres e três inferiores fundidas. As flores são polinizadas principalmente por

abelhas do gênero Bombus (Afonso, 1997).

Figura 2. Variação para a cor das flores em Pterodon emarginatus Vogel. Fonte: Brasil 2016.

15

O fruto é do tipo criptossâmara monospérmico, indeiscente, comprimido, oval

ou raramente oblongo, inflado no núcleo seminífero com a superfície composta por venações

concentradas no centro entorno da câmara onde encontra-se a semente tornando-se

inconspícuas em direção as alas (Figura 3). Esse tipo de fruto em P. emarginatus demonstra

uma adaptação para anemocoria em ambientes abertos e está relacionada à ausência de

barreiras físicas e disponibilidade de vento, condições observadas no Cerrado, para que os

frutos contendo a semente sejam facilmente transportados (Janzen, 1980; Paiva et al., 2001;

Pinto et al., 2014). Suas sementes dispersas por anemocoria são elípticas a oblongas,

levemente comprimidas, com arilo reduzido ao redor do hilo, textura coriácea, cor castanho-

clara, com um pericarpo que se desprende e o mesocarpo que forma um alo circundando a

semente proeminente.

Figura 3. Frutos de Pterodon emarginatus Vogel. Fonte: Brasil 2016.

2.1.3 Distribuição, Importância sócio-econômica e ambiental

As populações de P. emarginatus estão distribuídas geograficamente nas regiões

norte (Rondônia e Tocantins), nordeste (Bahia, Ceará, Maranhão, Piauí), centro-oeste

(Goiás, Distrito Federal, Mato Grosso e Mato Grosso do Sul) e sudeste (Minas Gerais e São

Paulo) sendo comumente encontrada no Cerrado. Está presente em todos os domínios

fitogeográficos, exceto nos Pampas, e apesar de sua ampla distribuição, não é uma espécie

endêmica do Brasil (Lima & Lima, 2015; Brasil, 2016).

P. emarginatus conhecida popularmente como “sucupira-branca” ou “faveiro” é

reconhecida na medicina popular por suas propriedades terapêuticas, sendo utilizada para

16

diversas finalidades, muitas já corroboradas por estudos científicos (Hansen et al., 2012). Na

medicina popular todas as partes da planta são utilizadas, desde a raiz até as folhas, sob a

forma de infusão e decocção (Ferreira et al., 2014).

Os frutos são usados em macerações hidroalcoólicas para tratar infecções

laringológicas, para uso infantil em compostos “fortificantes ou estimulantes do apetite”. O

óleo da semente é usado no tratamento de dores de garganta (Nunan et al., 1982) e no

tratamento de infecções ginecológicas (Almeida & Gottilieb, 1975). As túberas radiculares

são empregadas no tratamento do diabetes e a casca tem atividade antimicrobiana

(Bustamante et al., 2010), cicatrizante, leishmanicida, antiulcerogênica, antiinflamatória,

analgésica (Dutra, 2008), antitumoral (Hansen et al., 2012) e para tratamento de doença

remática (Lorenzi, 2002)

A madeira de P. emarginatus é dura e resistente à umidade com grande potencial

para a construção civil (Lima et al., 2012). Além da madeira, possui características

ornamentais e apícolas apreciáveis (Aquino et al., 2007). Por ser tolerante à luz direta e a

baixa fertilidade do solo, é indicada em reflorestamentos mistos destinados a áreas

degradadas de preservação (Lorenzi, 2002).

2.2 DIVERSIDADE GENÉTICA

A diversidade genética é constituída pela variedade de alelos e genótipos

encontrados em determinado grupo de uma espécie (Frankham, 2010). A diversidade

genética é considerada pela International Union for Conservation of Nature (IUCN) como

uma das prioridades globais para a conservação. Isto porque para a manutenção e

persistência das espécies ao longo do tempo evolutivo, estas precisam possuir diversidade

genética suficiente para responder as diversas imposições do ambiente, que são processos

contínuos, ininterruptos e que podem ser intensificados pela ação antrópica.

A compreensão dos padrões de distribuição da diversidade genética e do nível

de diferenciação são de fundamental importância para a definição de estratégias de

conservação e uso sustentado desses recursos genéticos, sendo importante no intuito de

preservar a máxima variabilidade genética possível e subsidiar programas de conservação

para as espécies (Loveless & Hamrick, 1984; Frankham, 2010; Cruz et al., 2011).

17

A caracterização da variabilidade genética dentro de populações pode ser

efetuada a partir de medidas de diversidade genética intrapopulacional, que podem ser

estimadas a partir de dados de marcadores genéticos. A análise dos dados genéticos deve ser

baseada em alguma teoria ou modelo. Um modelo é sempre insatisfatório em algum aspecto,

sendo incapaz de refletir toda a complexidade do mundo real. Por outro lado, quanto mais

um modelo se aproxima da realidade, mais complexo matematicamente ele se torna. Desse

modo, um bom modelo é aquele que não é tão distante da realidade e nem tão complexo ao

ponto de ser incompreensível matematicamente (Hedrick, 2004)

A variação intrapopulacional pode ser caracterizada pela variação alélica em

locos estruturais como a porcentagem de locos polimórficos (P), o número médio de alelos

por loco (Ar), heterozigosidade observada (Ho) e a heterozigosidade média esperada (He)

segundo as expectativas do Equilíbrio de Hardy-Weinberg (Hedrick, 2004).

Um loco polimórfico pode ser arbitrariamente definido como aquele que o alelo

mais comum tem frequência igual ou inferior a 0,95 ou 0,99. A medida de locos polimórficos

expressa a quantidade de polimorfismo e é dada pela razão entre os locos polimórficos e o

total de locos da amostra. A porcentagem de locos polimórficos como medida da variação

genética é indicada para análise de populações com um grande número de indivíduos e de

locos. O número médio de alelos por loco polimórfico (Ar) é uma medida de riqueza alélica,

que é proporcional ao polimorfismo (Brown & Weir, 1983) e também é fortemente

dependente do tamanho amostral (Hedrick, 2004).

A heterozigosidade média esperada (He) ou diversidade gênica é a probabilidade

de que dois genes escolhidos ao acaso numa população sejam diferentes. Esta tem sido a

medida mais utilizada nas ultimas décadas e é considerada a mais completa pois reúne a

variação genética de uma população em uma única estatística e não depende da definição de

polimorfismo (Nei, 1987; Berg & Hamrick, 1997). Seja pi a frequência populacional do i-

ésimo alelo em um loco, a heterozigosidade para este loco em uma população de

cruzamentos ao acaso é definida como: ĥ = 1 − Σpi2 (Hedrick, 2004).

2.3 ESTRUTURA GENÉTICA

Na maioria das espécies, as populações são subdivididas em unidades menores

devido a fatores geográficos, ecológicos e comportamentais. Quando uma população está

18

subdividida, a conectividade genética entre suas partes pode diferir. Essa conectividade

depende primariamente da quantidade de fluxo gênico que ocorre entre os subgrupos. A

distância geográfica geralmente representa forte limitante desse fluxo, fazendo com que

populações mais próximas apresentem maiores taxas e populações mais distantes

apresentem menores taxas de fluxo gênico (Hedrick, 2004; Bradburd et al., 2013).

A combinação entre deriva genética local e fluxo gênico restrito resulta em

diferenças locais de frequências alélicas, cuja magnitude tende a aumentar

proporcionalmente com o aumento da distância geográfica. Desse modo, o nível de

diferenciação genética entre populações é determinado pelo balanço entre a força

homogeneizadora do fluxo gênico e processos que promovem a diferenciação, tais como

deriva genética e adaptações locais (Bradburd et al., 2013).

O fundamento dos estudos de estrutura genética parte do teorema de Hardy-

Weinberg. Em conformidade com seus pressupostos (população infinita, cruzamento

aleatório e ausência de mutação, migração e seleção) o modelo assume que as frequências

gênicas e genotípicas permanecem constantes de geração para geração mantendo a variação

genética (Futuyma, 1992). Desse modo, a partir dos desvios encontrados em cada caso,

torna-se possível inferir os fatores responsáveis pela estrutura populacional observada (Foll

& Gaggiotti, 2006).

Diferentes modelos matemáticos foram propostos para caracterizar a estrutura

genética populacional, dos quais cita-se: as estatísticas F (Wright, 1951); a diversidade

genética de Nei (1973) e as análises de variância das frequências alélicas (Cockerham, 1969;

Weir & Cockerham, 1984). Wright desenvolveu uma abordagem para dividir a variação

genética que é comunmente utilizada pois fornece intuitiva descrição da diferenciação. Essa

abordagem consiste em três coeficientes (F) de correlação, usados para para alocar a

variabilidade genética ao nível total da população (T), subpopulações (S) e indivíduos (I).

Na análise de frequências alélicas, os coeficientes de coancestralidade entre indivíduos ou

grupos são obtidos a partir da decomposição dos componentes da análise de variância das

frequências alélicas (Hedrick, 2004; Holsinger & Weir, 2009).

F (FIT de Wright) é a correlação entre alelos dentro de indivíduos em todas as

populações, representando o coeficiente de endogamia dos indivíduos em relação ao

19

conjunto de populações. O estimador θ (FST de Wright) é a correlação de todos os alelos de

diferentes indivíduos na mesma população. É o coeficiente de coancestralidade e mede a

divergência entre populações. O estimador f (FIS de Wrigth) é a correlação dos alelos dentro

de indivíduos dentro da população a qual estes indivíduos pertencem, ou seja, representa

grau de endogamia dentro de populações e pode ser expresso como f = (F - θ) / (1 - θ)

(Holsinger & Weir, 2009; Hart & Clark, 2010).

2.4 MARCADORES MICROSSATÉLITES

Microssatélites são regiões do DNA compostas de pequenos motivos de um a

seis nucleotídeos repetidos em tandem. Outras denominações são utilizadas como

sinônimos de microssatélite, como SSR (Simple Sequence Repeats) e STR (Short Tandem

Repeats) (Ferreira & Grattapaglia, 1998). São classificadas pela composição de motivo

repetido podendo ser mono, di, tri, tetra, penta e hexanucleotídeos e, também, pelo tipo de

sequência repetitiva, como microssatélites perfeitos, imperfeitos e compostos, em função

do tipo de repetição que eles apresentam (Tóth et al., 2000).

São ditos perfeitos os microssatélites onde a repetição não apresenta interrupção

(por exemplo, CACACACACA). São ditos imperfeitos quando a sequência é interrompida

por alguma base que não pertença ao motivo (por exemplo, CACACGACACA). E são

considerados compostos os microssatélites que apresentam dois ou mais tipos de repetição

conjuntamente (por exemplo, CACACAGCGCGC) (Tautz & Schlötterer, 1994; Goldstein

et al., 1994).

A técnica de microssatélites revela polimorfismo em determinado loco devido a

diferenças no número de vezes em que estas repetições de sequência simples ocorrem. Para

iniciar estudos com marcadores microssatélites, há a necessidade de se ter disponível

iniciadores desenvolvidos que flanquearão as regiões microssatélites. Desse modo,

conhecendo-se estas regiões adjacentes às sequências microssatélites, é possível o desenho

de pares de iniciadores específicos, possibilitando a amplificação, via PCR (polimerase

chain reaction), dos fragmentos que contêm o DNA repetitivo em diferentes genótipos (Zane

et al., 2002).

O polimorfismo em cada loco microssatélite é resultado da diferença no número

de repetições de cada unidade de repetição. Podemos, então, distinguir vários alelos, de um

20

mesmo loco, pelo tamanho. As sequências microssatélites em um loco variam de um

indivíduo a outro, contudo, as sequências de DNA que flanqueiam os microssatélites são

bastante conservadas entre espécies evolutivamente próximas (Tautz & Schlötterer, 1994;

Oliveira et al., 2006; Kalia et al., 2011).

A identificação dos alelos nos locos microssatélites pode ser feita diretamente

com auxílio de brometo de etídeo em géis de agarose, nitrato de prata em géis de

poliacrilamida ou através da detecção de picos de fluorescência em analisador automático de

DNA. Os iniciadores marcados com fluorescência possibilitam sistemas múltiplos de

detecção (multiplex), e consequentemente, permitem a genotipagem simultânea de vários

locos de cada amostra analisada (Ferreira & Grattapaglia, 1998).

Nas últimas décadas, os marcadores microssatélites tem sido a ferramenta mais

utilizada para estudos genético populacionais devido principalmente a grande ocorrência nos

genomas de praticamente todos os organismos e sua natureza codominante e multialélica

(Ferreira & Grattapaglia, 1998; Oliveira, 2006; Kalia et al., 2011). Além disso, uma vez

desenvolvidos os iniciadores para microssatélites, estes podem ser rapidamente sintetizados

e testados em espécies evolutivamente proximas (Varshney et al., 2005).

A transferibilidade de um conjunto de iniciadores para amplificar determinados

locos microssatélites facilita os estudos entre espécies estreitamente relacionadas, pois

descarta a necessidade de desenvolver iniciadores específicos para a espécie. A

probabilidade de sucesso de uma amplificação heteróloga para uma sequência de DNA via

PCR está inversamente relacionada a distância evolutiva entre duas espécies (Zucchi, 2003).

A transferabilidade tem demonstrado sucesso principalmente no nível infra-genérico, com

uma estimativa de sucesso de até 60% em dicotiledôneas e de 40% em monocotiledôneas

estreitamente relacionadas (Barbará et al., 2007)

Devido as características desses marcadores para estudos em genética de

populações, os marcadores microssatélites têm sido escolhidos para diversos estudos em

populações de diferentes espécies da flora brasileira, como Dipteryx alata Vogel (Soares et

al., 2012), Tibouchina papyrus (Souza et al., 2014) e Pilosocereus gounellei (Monteiro et

al., 2015).

3. MATERIAL E MÉTODOS

3.1 AMOSTRAGEM

Foram coletadas amostras foliares de pelo menos vinte e três árvores adultas de

P. emarginatus em doze localidades (Tabela 1; Figura 3). Estas amostras foram embaladas

em sacos plásticos com sílica gel, identificados com o código da espécie e região de coleta,

para o transporte até o Laboratório de Genética & Biodiversidade, da Universidade Federal

de Goiás onde os dados moleculares foram obtidos.

Tabela 1. Populações de Pterodon emarginatus Vogel amostradas para análise de diversidade e

estrutura genética. Goiás (GO), Minas Gerais (MG) e Mato Grosso (MT)

População Código N° de indivíduos Longitude Latitude

Perdizes/MG PERMG 32 -47,36658 -19,35077

São Francisco de Goiás/GO SFRGO 32 -49,25153 -15,92095

Cocalinho/MT COCMT 32 -51,36029 -14,95497

Ipora/GO IPOGO 32 -51,15724 -16,41614

Aruanã/GO ARUGO 32 -51,07816 -14,94036

Tupaciagura/MG TUPMG 32 -48,90082 -18,53749

Araguaiana/MT ARGMT 32 -51,83409 -15,45103

Silvania/GO SILGO 32 -48,37823 -16,59767

Paracatu/MG PTUMG 32 -47,04568 -17,06915

Pirenópolis/GO PIRGO 31 -48,95528 -15,74817

Portelândia/GO POTGO 23 -52,60776 -17,35041

Serra de Caldas/GO SECGO 32 -48,66000 -17,77250

22

Figura 4. Populações amostradas para o estudo de diversidade e estrutura genética em Pterodon

emarginatus Vogel. ARGMT= Araguaiana, ARUGO= Aruanã, COCMT= Cocalinho,

IPOGO= Iporá, PERMG= Perdizes, PIRGO= Pirenópolis, POTGO= Portelândia,

PTUMG= Paracatu, SECGO= Serra de Caldas, SFRGO= São Francisco de Goiás,

SILGO= Silvânia, TUPMG= Tupaciguara.

3.2 EXTRAÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DO DNA

O DNA genômico foi extraído a partir do tecido foliar, seguindo o protocolo

descrito em Doyle & Doyle (1987). Após a extração, o DNA total foi quantificado com

auxílio de um marcador de peso molecular conhecido em gel de agarose 1% e tampão de

eletroforese TBE (Tris Borato EDTA) na concentração de 1X. Em seguida o DNA foi diluído

para uma concentração aproximada de 2,5 ng/μl.

3.3 TESTE AMPLIFICAÇÃO CRUZADA E SELEÇÃO DE LOCOS

MICROSSATÉLITES POLIMÓRFICOS

Para os testes de amplificação cruzada foram utilizados vinte e cinco primers

desenvolvidos para a espécie D. alata (Guimaraes et al., 2017) (Tabela 2). Os testes foram

realizados utilizando o DNA de três indivíduos de P. emarginatus e os primers que

apresentaram bom padrão de amplificação foram avaliados quanto à presença de

polimorfismo, utilizando o DNA de oito indivíduos.

23

Tabela 2. Marcadores desenvolvidos para Dipteryx alata Vogel utilizados nos testes de amplificação

cruzada.

Marcador Sequências (5'-3') Motivo Tamanho fragmento

Dal_01 F:TTGTTGAAAGCTAGCAAAGTGAA

R:CAAAGAACCCAACAAAATCTTTC CT 152

Dal_02 F: AAGCAGCTTCTGCATGAACTAT

R: TAAGCAAGGCCAAATTCGAG GA 167

Dal_03 F: CAAAGCTTTATACAATAACGCAAA

R: TCATTTCCACTGCCCAATTT AC 198

Dal_04 F: AAAGAGTAGCTGCAGACAGAATTG

R: AAAGAAGTCCTCAAATGCCTTG AG 176

Dal_05 F: TGCCATGATGCTACAAGTATGA

R: AGCCCCAAAACCGTTAAAAG AG 188

Dal_06 F: TGAAAGTGGATGCAAAAAGG

R: AATCCTTTAATCCCACAAATCA TG 156

Dal_07 F: CCCATGTCATTATCAAAAATGCT

R: CCTGTCATCATCGTGCGTAT GA 179

Dal_08 F: TTCAAGAAGCTCCGGTTGAT

R: CGAATGAGGAAGGAAGCAAA CT 169

Dal_09 F: ACCTGAGCCGAACCTCTTCT

R: GGCGAAAAGCTTCCCATAAT AG 161

Dal_10 F: AAATAAGATAAAGCTGTTGCAAAAAT

R: GATGCGCACCTAGTCTTTTTC GA 171

Dal_11 F: CATTTGCCCCTTCTTGTCTTT

R: AATGCCGATAATTTGTGTTGTTC TC 174

Dal_12 F: TGCTGCGTTCATTTTATAGTTTT

R: CTTTCTTCTTTGGGAGTTTGCT TC 189

Dal_13 F: GATTTGTTGGGTAACAGGAAG

R: GAGTCATTTTAGTCACACTGAGG AG 192

24

Dal_14 F: CATCTCACCAAAGCCATACAGA

R: TTGTTGCTTCCCGTTTTCTC AG 179

Dal_15 F: CAACTCCATCAACCAATACACC

R: AAATGAACCCCTCCAACACTT CAGGCA 214

Dal_16 F: AATTGCGAGGCACAAAAACT

R: TGAATGATAATGGGGGCAAA TC 185

Dal_17 F: AAAGTGAAATTATGTGCTATAAATGG

R: CAACGAATGATCAAAATCACAA AG 176

Dal_18 F: CGATAAGCATTACTATTTCCCTTT

R: GTGATTGACATCTAACCTCCTCT AG 198

Dal_19 F: CATCATACAGAGGCCAGACATT

R: TTGAGATTTACTGGTGACTTGTCC TG 184

Dal_20 F: CACGACTAGGAACCCCTTATTTT

R: TCTTTGTCATCCTTTCCCTTTG TC 183

Dal_21 F: TCTAGCCTCAACACACTGCTTC

R: CAAGAAAGATGATATGGGAAAAGG TC 162

Dal_22 F: TAGAAAGGACCTGAGAAGGAGA

R: ATCAAGATCATCAATAGCAGCA AG 199

Dal_23 F: TAGACAAAGTGCTTGGGGAAA

R: TTCTTGATTTTTGGATCTCTATCG AG 155

Dal_24 F: ATTTTGAGGAAGTCTCTTTGGT

R: TGGAGTTCATATCCTTATCTTTG AC 129

Dal_25 F: CCAGGTGGTGGGATGAGATA

R: ATGATGGACACACGAAAGTGAA ATTGAG 166

As reações em cadeia da polimerase (PCRs) foram realizadas a partir da

montagem de um coquetel, com volume final de 10 µL por reação, contendo 7,5 ng de DNA,

0,9 µM de cada primer, 5 U de Taq DNA Polymerase (Phoneutria, Belo Horizonte, BR), 2,5

25

µM de cada dNTP, 25mg/ml de BSA, tampão 10X (10 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, 1,5 mM

MgCl2, pH 8,3). Os ciclos de amplificação ocorreram em 3 etapas: (1a) desnaturação inicial

da dupla fita de DNA a 94°C/5min; (2a) realização de 30 ciclos, sendo que cada ciclo

compreendeu respectivamente, a desnaturação do DNA a 95°C/5seg, o anelamento dos

primers à fita molde, variando entre 48°- 60°C/1min (dependendo do iniciador) e a extensão

da fita a 72°/30seg; (3a) extensão final a 72°/45min.

Os produtos amplificados foram submetidos a eletroforese vertical em gel

desnaturante de poliacrilamida 6% em TBE 1X submetido a uma corrente elétrica de 70 W

por aproximadamente duas horas. Para a visualização dos fragmentos amplificados o gel foi

submetido a coloração com nitrato de prata conforme o protocolo descrito por Creste et al.

(2001).

3.4 GENOTIPAGEM

Os pares de iniciadores que apresentaram polimorfismo tiveram seus iniciadores

Forward ressintetizados adicionando os fluoróforos 6-FAM (azul), HEX (verde) ou NED

(amarelo) na extremidade 5’ e, juntamente com os marcadores transferidos por Santana

(2015), foram utilizados na genotipagem das populações amostradas. O conjunto de

marcadores padronizados foi organizado em conjuntos para a genotipagem em sistema

multiplex no Analisador genético ABI PRISM® 3500 DNA (Applied Biosystems).

As reações de PCR foram realizadas seguindo o mesmo protocolo descrito na

seção de transferibilidade. A presença de amplificaçao foi confirmada em gel de agarose 3%.

O tamanho dos fragmentos foi determinado usando marcador interno GeneScan 600 LIZ

(Applied Biosystems) e os genótipos de cada indivíduo foram estabelecidos utilizando o

programa Gene Mapper (Applied Biosystems).

3.5 ANÁLISES GENÉTICO POPULACIONAIS

O programa FSTAT 2.9.3 (Goudet, 2002) foi utilizado para estimar os seguintes

parâmetros genéticos: Diversidade genética de Nei (He); Heterozigozidade observada (Ho);

Número de alelos por loco polimórfico (NA); Riqueza alélica (AR); Índice de fixação intra-

populacional (f); Desequilíbrio de ligação entre os locos. O programa Identity 4.0 (Wagner

26

and Sefc, 1999) foi utilizado para estimar a probabilidade de exclusão de paternidade (Q) e

a probabilidade de identidade (I).

Com o intuito de avaliar a magnitude e a distribuição da variabilidade entre e

dentro das populações, foram estimados os parâmetros de estrutura genética por meio de

uma análise de variância de frequências alélicas (Weir & Cockerham, 1984). Foram

utilizadas 10000 reamostragens para estabelecer os intervalos de confiança a 95 % para os

valores de f, F e θ. Essas análises foram realizadas no programa GDA-Genetic Data Analysis

(Lewis & Zaykin, 2002).

O pacote Hierfstat (Goudet, 2005) do software R foi utilizado para estimar os

valores de FST par a par segundo Weir & Cockerham (1984) e gerar uma matriz de distância

genética entre as populações aqui estudadas. A partir desta matriz, foi realizada análise de

coordenadas principais (PcoA – principal coordinates analysis), para verificar possíveis

padrões de divergência genética. O programa Structure 2.3.2 (Pritchard et al., 2000) foi

utilizado para designar indivíduos a grupos genéticos (K) e visualizar a estrutura genética

das populações de P. emarginatus. A determinação do número K mais provável foi realizada

pela estatística ΔK desenvolvida por Evanno et al. (2005).

Com o intuito de verificar padrão espacial na divergência genética entre

populações, o pacote Vegan (Oksanen et al, 2017) do software R foi utilizado para

correlacionar a matriz de distâncias genéticas com a matriz de distâncias geográficas a partir

do teste de Mantel. O software R também foi utilizado para realizar analise de regressão

linear entre latitude e primeiro eixo da PCoA. Foi realizada análise de autocorrelação

espacial para as frequências alélicas, com base no índice I de Moran. Essa análise foi

realizada no software R utilizando script gentilmente cedido por Diniz-Filho (2016). O

pacote Adegenet (Jombart, 2008) do software R foi utilizado para identificação de

descontinuidade genética entre as populações, a partir do algoritmo de Monmonier.

4. RESULTADOS

Dos vinte e cinco marcadores testados, sete (28%) apresentaram amplificação

cruzada e dois (0,8%) apresentaram polimorfismo e completaram a bateria de marcadores

utilizados para a genotipagem das populações. Dos nove marcadores transferidos por

Santana et al. (2015), quatro apresentaram bom padrão de amplificação para todas as

populações avaliadas e foram utilizados na genotipagem das populações. Desse modo, seis

marcadores, dos quais três (BM164, PVESTBR067 e PVESTBR268) transferidos da espécie

P. vulgaris e três (Da_E12, Dal_15 e Dal_25) transferidos da espécie D. alata, foram

utilizados no estudo de diversidade e estrutura genética de P. emarginatus (Tabela 3).

Tabela 3. Marcadores utilizados na genotipagem das populações de Pterodon emarginatus Vogel.

Marcador Sequências (5’ – 3’) Motivo

Amplitude

alélica

(bp)

Ta

(°C) Transferibilidade

BM164 F: CCACCACAAGGAGAAGCAAC (GT)9 (GA)21

160-168 58°

Santana et al. (2015)

R: ACCATTCAGGCCGATACTCC

PVESTBR067 F: CACTGAGGTTTTCCTCTGCTTT (CT)8

254-290 54°

R: TGTTGAAGGCAAAACATGAAAC

Da_E12 F: CCTTCTATGCGCTCTCTGCT (ATTTTT)18 200-224 60°

R: TACTTCAACGCCAGCTTCCT

PVESTBR268 F: AGATGCAGAACAGATGCTTCAA (CCA)6 282-320 58°

R: TGAAAGGGTCTTCTTGTTCCAT

Dal_15 F: CAACTCCATCAACCAATACACC (CAGGCA)9 210-238 58°

Presente estudo

R: AAATGAACCCCTCCAACACTT

Dal_25 F: CCAGGTGGTGGGATGAGATA (ATTGAG)5 152-170 58°

R: ATGATGGACACACGAAAGTGAA

Ta: Temperatura de anelamento.

O conjunto de marcadores utilizados revelou um total de quarenta e cinco alelos

para as doze populações avaliadas, com uma média de 7,667 por loco. Individualmente, esse

valor variou de quatro (DaE12) a vinte e dois alelos (PVESTBR067).

28

A diversidade genética de Nei (1978) apresentou média global de 0,555,

variando de 0,342 (Dal_25) a 0,850 (PVESTBR067). O marcador PVESTBR067 também

apresentou maior riqueza alélica (13,937) enquanto Dal_25 apresentou a menor (2,397)

(Tabela 4).

Não foi encontrado evidência de desequilíbrio de ligação entre os pares de locos.

O conjunto de marcadores apresentou poder de exclusão de paternidade (Q=0.994) e de

probabilidade de identidade (PI=3.551 x 10-8)

Tabela 4. Estatísticas descritivas relativas aos seis locos microssatélites avaliados: Número de

indivíduos avaliados (N); Número de alelos por loco polimórfico (A); Número médio de

alelos por loco para as populações (Ar); Heterozigosidade observada (Ho);

Heterozigosidade esperada (He); Índice de fixação intra-populacional (f).

Loco A Ar Ho He f

BM164 5 4,776 0,306 0,403 0,240

DaE12 4 3,653 0,539 0,551 0,022

Dal_25 4 2,397 0,329 0,342 0,037

Dal_15 6 5,040 0,684 0,670 -0,021

PVESTBR268 4 3,641 0,473 0,517 0,086

PVESTBR067 22 13,937 0,778 0,850 0,085

Média 7,667 5,674 0,518 0,555 0,075

Em nível populacional, ARGMT apresentou maior riqueza alélica (5,245) e

SILGO apresentou a menor riqueza (3,712). ARGMT também apresentou maior diversidade

genética (He=0,694) enquanto que COCMT apresentou menor diversidade (He=0,479).

ARGMT foi a única população que apresentou valor significativo para a estatística f (0,249),

indicando déficit de heterozigotos em relação ao esperado sob equilíbrio de HW (Tabela 5).

29

Tabela 5. Estatísticas descritivas relativas as doze populações avaliadas. São apresentadas as

estimativas dos parâmetros: Número médio de alelos por loco para as populações (Ar);

heterozigosidade observada (Ho); heterozigosidade esperada (He); índice de fixação

intra-populacional (f).

População Ar Ho He f

PERMG 4,641 0,422 0,480 0,121

SFRGO 4,567 0,516 0,545 0,054

COCMT 4,127 0,453 0,479 0,054

IPOGO 4,415 0,563 0,534 -0,054

ARUGO 4,519 0,495 0,528 0,062

TUPMG 5,142 0,542 0,580 0,066

ARGMT 5,245 0,521 0,694 0,249*

SILGO 3,712 0,547 0,546 -0,002

PTUMG 4,294 0,464 0,541 0,144

PIRGO 5,027 0,581 0,611 0,050

POTGO 4,333 0,630 0,608 -0,037

SECGO 4,245 0,484 0,518 0,065

Média 4,522 0,518 0,555 0,048

*Valor significativo ao nível de 5% (p<0,00069).

A análise de variância das frequências alélicas apresentou valores significativos

para as três estatísticas estimadas (Tabela 6). O valor de θ indica estruturação moderada entre

as populações avaliadas.

Tabela 6. Valores estimados e intervalo de confiança para os parâmetros: índice de fixação intra-

populacional (f), coeficiente de endogamia total (F) e diferenciação inter-populacional

(θ) geradas pela análise de variância das frequências alélicas com seis locos

microssatélites para a espécie Pterodon emarginatus Vog.

Estimativas f F θ

Limite superior (95%) 0,017 0,075 0,050

Limite Inferior (95%) 0,136 0,218 0,094

Média dos locos 0,070 0,138 0,073

O primeiro e o segundo eixos da PCoA foram capazes de explicar

aproximadamente 57% e 35% da variação presente na matriz, respectivamente. PERMG,

PTUMG e SILGO demonstraram-se as populações mais divergentes enquanto que o restante

das populações foram agrupadas em praticamente um grande grupo (Figura 4).

30

Figura 5. Análise de Coordenadas Principais. Primeiro eixo (PCo1) e segundo eixo (PCo2). Entre

parêntesis a porcentagem de explicação de cada eixo.

O teste de Mantel apresentou valor de correlação matricial igual a 0,440

(p=0,002) (Figura 5), indicando que parte do padrão de divergência genética presente entre

populações avaliadas pode ser explicado pela distância espacial, ou seja, indivíduos distantes

espacialmente tendem a ser distantes geneticamente.

31

Figura 6. Correlação entre distancia genética e distancia espacial das populações naturais de

Pterodon emarginatus Vogel.

O número de grupos K=5 é o que melhor explica a estrutura genética presente

nas populações, conforme a estatística delta K. A atribuição de genótipos realizada pelo

Structure revelou grande quantidade de mistura dentro dos indivíduos para a maioria das

populações (Figura 6). No entanto, PERMG, SILGO e POTGO apresentaram-se mais

homogêneas, contendo indivíduos com genótipos quase que totalmente atribuídos a apenas

um grupo.

Figura 7. Representação gráfica da análise de agrupamento bayesiana para 12 populações de

Pterodon emarginatus Vogel baseada em 6 locos microssatélites e para k=5. Cada

indivíduo é representado por uma barra vertical, apresentando a proporção do seu genoma

pertencente a cada um dos grupos estabelecidos.

32

A população de ARGMT apresentou composição de praticamente dois grupos distintos:

16 indivíduos alocados quase que totalmente ao grupo amarelo e 16 indivíduos apresentando mistura

entre os grupos roxo, rosa e verde. Ao considerar esses dois conjuntos de 16 indivíduos como duas

populações distintas, foi obtido um θ de 0,279 entre elas. Esse valor representa alta divergência entre

os indivíduos e é aproximadamente quatro vezes maior do que o valor de θ encontrado para todas as

populações.

O correlograma resultante da análise de autocorrelação espacial das frequências

alélicas revelou inexistência de padrão espacial em curtas distâncias e indicou que

populações com distâncias acima de 400 km tendem a se tornar geneticamente diferentes

(Figura 7).

Figura 8. Correlograma entre I de Moran e classes de distância entre populações naturais de

Pterodon emarginatus Vogel. Os pontos representam o valor médio do I de Moran para

cada classe de distância e as linhas tracejadas o desvio padrão. Entre parêntesis a

quantidade de valores significativos a 5% (p<0,001).

O algoritmo de Monmonier revelou a existência de descontinuidade genética

entre SILGO e as populações PIRGO e SECGO, separando as populações em dois subgrupos

(Figura 8).

33

Figura 9. Descontinuidade genética (seta) em populações naturais de Pterodon emarginatus Vogel

estimada pelo algoritmo de máxima diferenciação de Monmonier a partir do primeiro eixo

da PCoa e da rede de Gabriel. A intensidade da cor que preenche cada quadrado representa

a orientação de cada população no primeiro eixo da PCoA.

A análise de regressão linear entre latitude e o primeiro eixo da PCoA revelou r2

ajustado no valor de 0,640, indicando que aproximadamente 64% da variação genética

presente em P. emarginatus pode ser explicada pela latitude (Figura 9).

Figura 10. Modelo linear entre latitude e variação genética para as doze populações de Pterodon

emarginatus Vogel.

5. DISCUSSÃO

A chance de sucesso de amplificação cruzada de um iniciador microssatélite é

inversamente proporcional à distância evolutiva entre as espécies envolvidas. Considerando

que o parentesco entre P. emarginatus e D. alata ocorre em nível de tribo, a taxa de sucesso

obtida no presente estudo (0,8%) pode ser considerada baixa (Dayanandan et al.,1997;

Barbará et al. 2007). Em concordância com a maior distância evolutiva, Santana (2015)

obteve menor taxa de sucesso na amplificação cruzada de 539 iniciadores desenvolvidos

para P. vulgaris.

O loco Dal_25 apresentou maior número de alelos em P. emarginatus (4)

quando comparado com o encontrado D. alata (3) e maior heterozigosidade observada

(Ho=0,329 e Ho=0,261), no entanto, apresentou menor heterozigosidade esperada,

respectivamente (He=0,342 e He=0,595). O loco Dal_15 apresentou o mesmo número de

alelos (6), no entanto, apresentou tanto maior heterozigozidade observada (Ho=0,684 e

Ho=0,361) quanto heterozigosidade esperada, respectivamente (He=0,670 e He=0,463).

Entretanto, essa comparação pode estar enviesada devido ao menor número de indivíduos

avaliados em D. alata (Guimaraes et al., 2017).

Santana (2015) utilizou 88 indivíduos provenientes de 3 populações para a

caracterização dos 9 marcadores transferidos para P. emarginatus, sendo que 4 desses

marcadores foram utilizados no presente estudo. Apesar do menor número de indivíduos

avaliados, a autora encontrou para esses 4 marcadores estatísticas semelhantes com as do

presente estudo. A única exceção ocorreu para PVESTBR067, para o qual o aumento de

indivíduos avaliados resultou em um aumento de 9 alelos.

Rocha (2006) utilizou 32 marcadores RAPD para avaliar 119 indivíduos

provenientes de 7 populações P. emarginatus sensu Lewis. Apesar do marcador empregado

pela autora possuir diferente natureza genética, a magnitude da diversidade genética

detectada está em concordância com a verificada no presente estudo.

35

No mesmo sentido, Santana (2015) obteve valores intermediários de diversidade

genética para os 88 indivíduos avaliados com 9 marcadores microssatélites. Diante disso, é

possível inferir que P. emarginatus apresenta nível intermediário de diversidade genética.

Quando comparadas com outras plantas do cerrado avaliadas com

microssatélites, P. emarginatus apresentou maior diversidade que D. alata He=0,415

(Guimaraes et al, 2017); e menor diversidade que Byrsonima cydoniifolia He=0,727

(Bernardes et al., 2014) e Cariocar brasiliensis He=0,856 (Collevatti et al, 2001).

Em plantas, as principais fontes de endogamia são autofecundação e fluxo

gênico restrito. Esses fatores aumentam a correlação entre os gametas que são combinados

durante a fecundação, resultando em homogeneização genotípica dentro de populações e

aumentando a diferenciação genética entre populações. No sentido contrário, fecundação

cruzada e fluxo gênico amplo reduzem a correlação entre gametas e a subdivisão intra-

populacional. A estimativa do parâmetro f capta o efeito do sistema de cruzamento na

endogamia que existe dentro das populações, representando a proporção da variação

genética total que está entre indivíduos dentro das populações (Loveless & Hamrick, 1984;

Holsinger & Weir, 2009).

No presente estudo, o valor estimado de f demonstrou-se estatisticamente

diferente de zero, no entanto foi relativamente baixo (0,07), sugerindo baixas taxas de

autofecundação. P. emarginatus apresenta flores hermafroditas, o que possibilitaria a

ocorrência de autofecundação. Estudando a viabilidade de pólen em P. emarginatus, Rocha

(2006) encontrou correlação negativa entre percentagem de pólen fértil e sementes viáveis

dentro de indivíduos, sugerindo que os indivíduos da espécie podem apresentar investimento

diferencial na produção de pólen fértil e sementes. Esses resultados corroboram com a

hipótese de que as flores da espécie não são funcionalmente hermafroditas e que a espécie

apresenta sistema de acasalamento preferencialmente alógamo.

A subdivisão populacional promove a ação da deriva genética, que por sua vez

resulta na diferenciação genética entre as subpopulações. No sentido contrário, o fluxo

gênico entre populações reduz a subdivisão populacional e consequentemente reduz a

estruturação genética. Por serem organismos sesseis, o fluxo gênico em plantas está restrito

a dispersão de seus gametas via pólen, e de indivíduos via semente. O parâmetro θ representa

a proporção da variação genética total que está entre as populações e é influenciado pela

36

subdivisão populacional. No presente estudo foi encontrado valor significativo para essa

estatística (0,075), indicando que aproximadamente 7% da variabilidade genética está entre

as populações, e que 93% da variabilidade está contida dentro das populações. Utilizando

marcadores RAPD, Rocha (2006) encontrou valores semelhantes de estruturação entre

populações. Essa magnitude de estruturação sugere que P. emarginatus apresenta níveis

suficientes de fluxo gênico para contrapor os efeitos da deriva genética.

Esses resultados estão de acordo com o esperado para espécies de plantas que

apresentam estratégias de dispersão de gametas semelhantes as observadas em P.

emarginatus. O movimento de seus polens é mediado por abelhas do gênero Bombus

(Afonso, 1997) que apresentam alto potencial de dispersão. Suas sementes apresentam

adaptações para anemocoria, o que pode resultar também em dispersão de longas distâncias.

Esses dois fatores combinados contribuem para maior fluxo gênico e consequentemente

menor divergência entre populações.

Em concordância com os resultados obtidos no presente estudo, Braga &

Collevatti (2011) avaliaram a dispersão de pólen e estrutura espacial em Tabebuia aurea,

espécie arbórea tropical que também é polinizada por abelhas do gênero Bombus e apresenta

dispersão de sementes por anemocoria. As autoras detectaram longas distâncias de dispersão

de pólen (máxima= 2,608 m e média=351,5 m) e fraca estrutura espacial.

Algumas populações se apresentam individualmente em grupos distintos, como

é o caso de SILGO, PTUMG e PERMG. Para as duas últimas, essa divergência pode ser

explicada pela distância geográfica em relação as demais populações, o que é corroborado

pelo teste de Mantel e pelo padrão latitudinal de divergência genética detectado pela análise

de regressão linear. As demais populações apresentaram relativo baixo nível de divergência,

sugerindo que as populações de P. emarginatus se comportam como grandes complexos

contínuos, com níveis significativos de fluxo gênico entre elas. No entanto, o correlograma

demonstra que essa continuidade é interrompida a partir de distâncias acima de 400 km,

sendo que a partir dessa distância as populações começam a ficar geneticamente mais

distantes do que o esperado pelo acaso.

O presente estudo não foi delineado para avaliar a diferença genética entre as

morfos e provavelmente a maioria dos indivíduos amostrados é da morfo rosa, pois a

literatura descreve a ocorrência da morfo rosa principalmente para o sul de Goiás e os estados

37

de Minas Gerais e São Paulo, o que coincide com região amostrada no presente estudo

(Rocha, 2006). Rocha (2006) encontrou grande divergência genética entre as duas morfos

de P. emarginatus, o que levou a autora concluir que as morfos representam entidades

biológicas (espécies) distintas. O fato de termos encontrado baixos valores de estrutura e

distância genética entre as populações, corrobora com o fato de que provavelmente não

coletamos populações de morfos distintas.

Por outro lado, existe a possibilidade de termos amostrados indivíduos de morfos

distintas dentro das populações, o que explicaria a formação de dois grupos divergentes

dentro de ARGMT e a divergência genética apresentada por SILGO em relação as

populações geograficamente próximas. Ainda assim, a magnitude da divergência obtida para

os dois casos anteriores foi relativamente baixa e também pode ser explicada pela coleta de

um subconjunto de indivíduos aparentados no caso de ARGMT e restrição de fluxo gênico

devido a fatores ambientais para o caso de SILGO. De fato, ARGMT foi a única população

que apresentou nível de endogamia significativo (f=0,249; p<0,00069), o que corrobora a

hipótese de coleta de indivíduos aparentados.

6. CONCLUSÕES

Os marcadores transferidos no presente estudo demonstraram boa qualidade para

realizar analises genético-populacionais e agregaram poder de resolução ao conjunto de

marcadores previamente transferidos para P. emarginatus. As populações naturais avaliadas

apresentaram nível intermediário de diversidade genética e maior variabilidade dentro de

populações do que entre populações. Foram detectados pequenos, porem significativos,

níveis de endogamia devido tanto ao sistema de acasalamento quanto a subdivisão

populacional. Esses resultados suportam que a espécie apresenta sistema misto de

acasalamento, com maiores proporções de alogamia. O padrão de divergência entre as

populacionais demonstrou-se moderadamente estruturado no espaço, apresentando gradiente

latitudinal de divergência genética. Esses resultados indicam um perfil de grandes

populações continuas, com altos níveis de fluxo gênico em distancias até aproximadamente

400 km.

7. REFERÊNCIAS

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8. APÊNDICES

Apêndice A. Frequências alélicas obtidas para o loco BM164

47

Apêndice B. Frequências alélicas obtidas para o loco DaE12

48

Apêndice C. Frequências alélicas obtidas para o loco Dal_25

49

Apêndice D. Frequências alélicas obtidas para o loco Dal_25

50

Apêndice E. Frequências alélicas obtidas para o loco PVESTBR268

51

Apêndice F. Frequências alélicas obtidas para o loco PVESTBR067