dissertação de mestrado · streamline chelating para purificação do antígeno 503 de leishmania...

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE-UFRN

CENTRO DE TECNOLOGIA

DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA QUÍMICA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA QUÍMICA - PPGEQ

Dissertação de Mestrado

Avaliação de métodos de rompimento celular e de diferentes metais imobilizados em

resina Streamline Chelating para purificação do antígeno 503 de Leishmania i. chagasi.

Ana Laura Oliveira de Sá Leitão

Orientador: Prof. Dr. Everaldo Silvino Dos Santos

Coorientador: Dr. Francisco Canindé de Sousa Junior

NATAL/RN

FEVEREIRO/2017

Ana Laura Oliveira de Sá Leitão

Avaliação de métodos de rompimento celular e de diferentes metais imobilizados em resina

Streamline Chelating para purificação do antígeno 503 de Leishmania i. chagasi.

Dissertação de mestrado apresentada ao

Programa de Pós-Graduação em

Engenharia Química da Universidade

Federal do Rio Grande do Norte, como

parte dos requisitos para obtenção do

título de Mestre em Engenharia Química,

sob a orientação do Prof. Dr. Everaldo

Silvino dos Santos e coorientação do Dr.

Francisco Canindé de Sousa Junior.

NATAL/RN

FEVEREIRO/2017

Catalogação de Publicação na Fonte.

Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN / Sistema de Bibliotecas - SISBI

Biblioteca Setorial Especializada em Engenharia Química - CT

Leitão, Ana Laura Oliveira de Sá.

Avaliação de métodos de rompimento celular e de diferentes metais imobilizados

em resina Streamline Chelating para purificação do antígeno 503 de Leishmania i.

chagasi / Ana Laura Oliveira de Sá Leitão. - Natal, 2017.

96f.: il.

Orientador: Everaldo Silvino dos Santos.

Coorientador: Francisco Canindé de Sousa Junior.

Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro

de Tecnologia. Departamento de Engenharia Química. Programa de Pós-graduação

em Engenharia Química.

1. Leishmaniose - Dissertação. 2. Adsorção - Dissertação. 3. Lipopolissacarídeos

- Dissertação. I. Santos, Everaldo Silvino dos. II. Sousa Junior, Francisco Canindé de.

III. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. IV. Título.

RN/UF/BSEQ CDU 616.993.161(043.3)

LEITÃO, Ana Laura Oliveira de Sá – Avaliação de métodos de rompimento celular e de

diferentes metais imobilizados em resina Streamline Chelating para purificação do antígeno

503 de Leishmania i. chagasi. Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química. Área de

Concentração: Engenharia Química, Linha de pesquisa: Processos químicos, catalíticos e

biotecnológicos, 2017, Natal/RN, Brasil.

Orientador: Prof. Dr. Everaldo Silvino dos Santos


RESUMO

Com o desenvolvimento da indústria biotecnológica, é crescente o interesse por antígenos

recombinantes purificados para obtenção de vacinas. Porém, para essa aplicação esses

antígenos precisam apresentar um elevado grau de pureza, e por isso é de grande relevância o

desenvolvimento de técnicas que permitam a redução do número de operações unitárias

necessárias ao processo de purificação, permitindo ainda uma elevada recuperação e

proporcionando uma maior economia na obtenção dos bioprodutos. A Adsorção em Leito

Expandido (ALE) vem se destacando como uma alternativa propícia para o downstream

processing, pois é uma técnica cromatográfica de modo simples e de baixo custo, que integra

as etapas de clarificação, concentração, purificação em uma única operação. Neste contexto, o

presente trabalho tem como objetivo avaliar os métodos de rompimento celular e os diferentes

metais imobilizados em resina Streamline chelating para purificação do antígeno 503 de

Leishmania i. chagasi por ALE bem como remover os lipopolissacarídeos (LPS) liberados

durante a etapa de rompimento celular. Primeiramente, foi avaliado qual o melhor método de

rompimento celular para obtenção da proteína intracelular. As estratégias estudadas utilizando

lisozima, pérolas de vidro, ureia e EDTA foram avaliadas através de quatro planejamentos

experimentais. Em seguida, foram realizados testes de adsorção em batelada, utilizando-se

cinco íons metálicos (Cu2+, Ni2+, Zn2+, Co2+ e Fe3+) nas concentrações de 0,1, 0,5 e 0,8 mol/L

acoplados na resina Streamline chelating, escolhendo-se o metal que apresentou melhor

adsorção do antígeno para os ensaios usando ALE. Posteriormente, foi estimada a quantidade

mínima de tensoativo Triton X-114 necessária na etapa de lavagem da ALE para remoção do

LPS, a fim de obter-se o antígeno 503 livre desse contaminante. E por fim, foram realizados

ensaios de ALE visando recuperar e purificar a proteína de interesse. Para os ensaios usando

ALE utilizou-se uma coluna de 2,6 cm de diâmetro por 30 cm de altura, acoplada a uma bomba

peristáltica. Com os planejamentos experimentais realizados para avaliação do rompimento

celular, observou-se que maiores quantidades de proteínas totais e do antígeno 503 liberadas

foram obtidas para o método da ureia e que o único fator significativo para esse planejamento

foi a concentração, correspondente a 8,0 M. Como resultado para a triagem do íon metálico, o

cobre (Cu2+) foi o metal que apresentou maior capacidade de adsorção do antígeno 503,

apresentando valores de capacidade de adsorção de 0,102, 0,128 e 0,111 mg/mL de adsorvente

para as concentrações de 0,1, 0,5 e 0,8 mol/L, respectivamente. Tem-se ainda que para as três

condições analisadas (0,01, 0,05 e 0,1 % de Triton X-114) na etapa de lavagem da ALE o

percentual de remoção de LPS foi elevado e que a concentração mínima utilizada (0,01 %) já

foi suficiente para a remoção de 99,70 % deste contaminante. Para o teste de ALE utilizando

eluição isocrática (0,6 M de imidazol) os resultados obtidos mostraram baixa recuperação (3,0

%) do antígeno 503. Avaliou-se então a eluição em degrau, inicialmente em dois passos,

aplicando-se 0,6 mol/L e, em seguida, 1,0 mol/L de imidazol. Porém, esta estratégia ainda não

foi eficiente para recuperar a proteína de interesse. Um novo ensaio foi realizado, com um total

de três passos de eluição, utilizando 0,3 e 0,6 mol/L. Esse último teste mostrou uma recuperação

de 15,0 % da proteína de interesse e um fator de purificação de, aproximadamente, 3,0.

Portanto, a técnica cromatográfica de afinidade por íons metálicos imobilizados (IMAC)

mostrou ser uma alternativa eficiente na recuperação e purificação do antígeno 503 a partir do

homogeneizado de E. coli não clarificado.

Palavras-chave: Adsorção em Leito Expandido, purificação, íon metálico, antígeno 503,

remoção de LPS.

LEITÃO, Ana Laura Oliveira de Sá – Avaliação de métodos de rompimento celular e de

diferentes metais imobilizados em resina Streamline Chelating para purificação do antígeno

503 de Leishmania i. chagasi. Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química. Área de

Concentração: Engenharia Química, Linha de pesquisa: Processos químicos, catalíticos e

biotecnológicos, Natal/RN, Brasil.

Orientador: Prof. Dr. Everaldo Silvino dos Santos


ABSTRACT

Due to the development of biotechnology industry, there is a growing interest in purified

recombinant antigens to obtain vaccines. However, for this application these antigens require a

high degree of purity, thus, it is of great relevance the development of techniques that allow the

reduction in the number of unitary operations required for the purification process, this would

also allow a high recovery and a greater saving in obtaining bioproducts. The Expanded Bed

Adsorption (EBA) has shown as a suitable alternative for downstream processing, once it is a

simple and low cost chromatographic technique that integrates clarification, concentration and

purification in a single operation. This study aims at evaluating the methods of cell disruption

and the different metals immobilized in Streamline Chelating resin for purification of

Leishmania i. chagasi 503 antigen by EBA as well as removing the lipopolysaccharides

(endotoxin) released during the stage of cell disruption. Firstly, the best method of cell

disruption to obtain intracellular protein was evaluated. The strategies studied using lysozyme,

glass beads, urea and EDTA were evaluated through four experimental designs. Then, batch

adsorption tests were carried out using five metal ions (Cu2+, Ni2+, Zn2+, Co2+ and Fe3+) at

concentrations of 0.1, 0.5 and 0.8 M coupled in the Streamline chelating resin, selecting the

metal that showed the best adsorption of the antigen for the assays using EBA. Then, the

minimum amount of Triton X-114 tensioactive required in the EBA wash stage for LPS removal

was estimated in order to obtain the 503 antigen free of this contaminant. Finally, EBA assays

were performed in order to recover and purify the protein of interest. EBA experiments were

carried out using a column of 2.6 cm in diameter (30 cm height), coupled to a peristaltic pump.

The experimental plannings carried out to evaluate cell disruption, showed that higher amounts

of total proteins and 503 antigen released were obtained for the urea method and that the only

significant factor for this planning was the concentration corresponding to 8.0 M. As a result of

the metal ion screening, copper (Cu2+) was the metal with the highest adsorption capacity of

503 antigen, presenting adsorption capacity values of 0.102, 0.128 and 0.111 mg / mL of

adsorbent at concentrations of 0.1, 0.5 and 0.8 M, respectively. For the three analyzed

conditions (0.01, 0.05 and 0.1% Triton X-114) in the EBA washing stage, the percentage of

LPS removal was high and the minimum concentration used (0.01%) was enough to remove

99.70% of this contaminant. For the EBA test using isocratic elution (0.6 M imidazole) the

results obtained showed a low recovery (3.0 %) of the 503 antigen. The step elution was then

evaluated, initially in two steps, applying 0.6 M and then 1.0 M imidazole. However, this

strategy has not yet been effective in recovering the protein of interest. A new assay was

performed, with a total of three elution steps, using 0.3 and 0.6 M. This test showed that a

recovery of 15.0% of the protein of interest and a purification factor of 3.0. Therefore, the

immobilized metal ion affinity chromatography (IMAC) technique has been shown to be an

efficient alternative in the recovery and purification of the 503 antigen from the homogenized

E. coli unclarified.

Keywords: Expanded Bed Adsorption, purification, metallic ion, 503 antigen, LPS removal.

AGRADECIMENTOS

À Deus, pela vida, força, fé e coragem.

Aos meus pais, Gerardo e Lucinha, e ao meu irmão Bruno, pelo amor, afeto, dedicação e

confiança sempre depositada.

À minha vovó Laura (in memoriam), por sua infinita bondade, pelo carinho e cuidado de mãe

e pelas orações a mim ofertadas.

Ao meu orientador Prof. Dr. Everaldo Silvino dos Santos, pela orientação, disponibilidade,

comprometimento e atenção oferecidos durante este trabalho.

Ao meu coorientador Dr. Francisco Canindé de Sousa Junior, pela forma que me acolheu no

LEB e por ter sido tão solícito durante todo esse tempo de desenvolvimento da pesquisa.

Ao meu namorado Mauro André, pela compreensão, carinho e companheirismo demonstrados

no decorrer desta jornada.

À minha prima Naylla e minhas amigas Jéssyca, Cleitiane, Patrícia e Jhéssica, pela amizade,

apoio e incentivo, vocês foram essenciais em todo esse tempo.

As bolsistas de iniciação científica, Fernanda, Laura e Cecília, por toda ajuda e

comprometimento para a realização deste trabalho.

Aos meus colegas do LEB, Carlos, Sérgio, Millena, Emy e Naldo e aos demais integrantes

desse laboratório, pela receptividade, companhia, conversas, risadas e disponibilidade em

ajudar.

Aos servidores do PPGEQ pela disponibilidade e atenção.

SUMÁRIO

1. Introdução ............................................................................................................................. 16

2. Objetivos ............................................................................................................................... 19

2.1 Objetivos Gerais ............................................................................................................. 20

2.2 Objetivos Específicos ..................................................................................................... 19

3. Revisão Bibliográfica ........................................................................................................... 22

3.2 Leishmaniose .................................................................................................................. 22

3.2.1 Leishmaniose Visceral ............................................................................................. 23

3.2.1.1 Situação epidemiológica .................................................................................... 23

3.2.1.2 Agente etiológico e transmissão ........................................................................ 24

3.2.1.3 Quadro Clínico .................................................................................................. 24

4.2.1.4 Diagnóstico e tratamento ................................................................................... 25

3.3 Antígenos Recombinantes .............................................................................................. 26

3.3.1 Antígeno 503 ............................................................................................................ 26

3.4 Rompimento Celular ....................................................................................................... 27

3.4.1 Lise enzimática ......................................................................................................... 28

3.4.2 Pérolas de vidro ........................................................................................................ 29

3.4.3 EDTA - Mg2+ ........................................................................................................... 29

3.4.4 Ureia ......................................................................................................................... 29

3.5 Purificação de Proteínas .................................................................................................. 30

3.6 Cromatografia ................................................................................................................. 32

3.6.1 Adsorção em Leito Expandido ................................................................................. 32

3.6.1.1 Caracterização do leito expandido ..................................................................... 35

3.6.2 Cromatografia de Afinidade por Íons Metálicos Imobilizados (IMAC) .................. 36

3.7 Endotoxinas .................................................................................................................... 38

4. Metodologia .......................................................................................................................... 42

4.1 Material ........................................................................................................................... 42

4.1.1 Adsorvente ............................................................................................................... 42

4.1.2 Coluna ...................................................................................................................... 42

4.1.3 Material Biológico.................................................................................................... 43

4.1.4 Reagentes e Padrões ................................................................................................. 44

4.2 Métodos .......................................................................................................................... 44

4.2.1 Preparo do inóculo ................................................................................................... 44

4.2.2 Cultivo e indução ..................................................................................................... 45

4.2.3 Escolha do método para o rompimento celular ........................................................ 45

4.2.3.1 Método de lise enzimática ................................................................................. 46

4.2.3.2 Método de pérolas de vidro ............................................................................... 46

4.2.3.3 Método de rompimento celular usando ureia .................................................... 47

4.2.3.4 Método de rompimento celular usando EDTA - Mg2+ ...................................... 47

4.2.4 Triagem do íon metálico .......................................................................................... 48

4.2.5 Isoterma de adsorção ................................................................................................ 49

4.2.6 Purificação do antígeno 503 e remoção de LPS utilizando ALE ............................. 49

4.2.7 Determinação da concentração de proteínas totais .................................................. 50

4.2.8 Eletroforese em gel de poliacrilamida ...................................................................... 51

4.2.9 Derterminação da concentração de antígeno 503 ..................................................... 51

4.2.10 Determinação de LPS ............................................................................................. 52

4.2.11 Cálculos .................................................................................................................. 52

5. Resultados e Discussões ....................................................................................................... 55

5.1 Escolha do método para o rompimento celular .............................................................. 55

5.2 Triagem do íon metálico ................................................................................................. 63

5.3 Isoterma de adsorção ...................................................................................................... 66

5.4 Remoção de LPS ............................................................................................................. 67

5.5 Purificação do antígeno 503 e remoção de LPS utilizando ALE ................................... 69

6. Conclusões ............................................................................................................................ 78

7. Referências Bibliográficas .................................................................................................... 80

Apêndice 1 ................................................................................................................................ 94

Anexo 1 .................................................................................................................................... 96

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Endemicidade da Leishmaniose Visceral em todo o mundo no ano de 2013 (World

Health Organization, 2014). ..................................................................................................... 23

Figura 2 - Etapas de um processo genérico de purificação de biomoléculas. Fonte: Pessoa-Jr &

Kilikian, 2005. .......................................................................................................................... 31

Figura 3 - Princípio de funcionamento de um processo de adsorção em leito fixo e expandido.

Fonte: adaptado de Crase & Draeger, 1992. ............................................................................. 33

Figura 4 - Figura 4: Etapas do processo de adsorção em leito expandido. Fonte: Amersham

Pharmacia Biotech, 1997. ......................................................................................................... 35

Figura 5 - Estrutura química dos LPS de E. coli O11:B4 de acordo com Ohmo & Morrison

(1989). Abreviações - Hep: L-glicerol-D-mano-heptose; Gal: galactose; Glc: glicose; KDO:

ácido 2-ceto-3-deoxioctônico; NGa: N-acetil-galactosamina e NGc: N-acetil-glic ................. 39

Figura 6 - Aparato experimental utilizado para os ensaios de ALE. ....................................... 43

Figura 7 - Biorreator de bancada Biostat B. ............................................................................. 45

Figura 8 - (a) Diagrama de Pareto para a concentração de proteína total e (b) superfície de

resposta que apresenta os efeitos da concentração de lisozima (X1) e do tempo (X2) na

concentração de proteína total obtida. ...................................................................................... 58

Figura 9 - (a) Diagrama de Pareto para a concentração de antígeno 503 e (b) superfície de


concentração de antígeno 503 obtida........................................................................................ 58

Figura 10 -(a) Diagrama de Pareto para a concentração de proteína total e (b) superfície de

resposta que apresenta os efeitos da razão g de pérolas de vidro/mL de suspensão (X1) e do

tempo (X2) na concentração de proteína total obtida. .............................................................. 59



tempo (X2) na concentração de antígeno 503 obtida. .............................................................. 59


resposta que apresenta os efeitos da concentração de EDTA (X1) e do tempo (X2) na


Figura 13 - (a) Diagrama de Pareto para a concentração de antígeno e (b) superfície de resposta

que apresenta os efeitos da concentração de EDTA (X1) e do tempo (X2) na concentração de

antígeno 503 obtida. ................................................................................................................. 60


resposta que apresenta os efeitos da concentração de ureia (X1) e do tempo (X2) na




concentração de antígeno 503 obtida........................................................................................ 61

Figura 16 - Gel de eletroforese (SDS-PAGE) mostrando o perfil protéico apresentado para cada

ensaio do planejamento. Coluna 1: Padrão de massa molecular; Coluna 2: Ensaio 1 (2,0 M e 15

min); Coluna 3: Ensaio 2 (8,0 M e 15 min); Coluna 4: Ensaio 3 (2,0 M e 60 min). ................ 63

Figura 17 - Capacidade de adsorção do antígeno 503 para os íons estudados. ........................ 64

Figura 18 - Isoterma de adsorção para o antígeno 503 na resina Streamline Chelating. .......... 66

Figura 19 - Cromatograma do perfil de purificação do antígeno 503 a partir do homogeneizado

de E. coli não clarificado utilizando 0,01 % de Triton X-114 na etapa de lavagem e a eluição

isocrática. .................................................................................................................................. 69

Figura 20: Gel de eletroforese (SDS-PAGE) do antígeno 503 recuperado a partir do

homogeneizado de E. Coli usando 0,01 % de Triton X-114 na etapa de lavagem da ALE. Linha

1: Padrão de peso molecular; Linha 2: Homogeneizado de E. coli; Linha 3: Carga; Linha 4:

Lavagem: Linha 5: Eluição ...................................................................................................... 71



em degrau com 0,6 e 1,0 M. ..................................................................................................... 72

Figura 22 - Gel de eletroforese (SDS-PAGE) do antígeno 503 recuperado a partir do

homogeneizado de E. Coli usando 0,01 % de Triton X-114 na etapa de lavagem da ALE. Coluna

1: Padrão de massa molecular; Coluna 2: Homogeneizado de E. coli; Coluna 3: Carga; Coluna

4: Lavagem; Coluna 5: Eluição 0,6 M; Coluna 6: Eluição 1 M. .............................................. 74



em degrau com 0,3 e 0,6 M. ..................................................................................................... 74


homogeneizado de E. Coli usando 0,01 % de Triton X-114 na etapa de lavagem da ALE. Coluna

1: Padrão de massa molecular; Coluna 2: Homogeneizado de E. coli; Coluna 3: Carga; Coluna

4: Lavagem; Coluna 5: Eluição 0,3 M; Coluna 6: Eluição 0,6 M. ........................................... 76

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Principais características da resina Streamline chelating. ....................................... 42

Tabela 2 - Composição do meio de cultivo 2xTY (pH 7,0) ..................................................... 44

Tabela 3 - Fatores, variáveis codificadas e níveis para o planejamento experimental usando

lisozima. .................................................................................................................................... 46


pérolas de vidro. ....................................................................................................................... 47

Tabela 5 - Fatores, variáveis codificadas e níveis para o planejamento experimental usando a

ureia. ......................................................................................................................................... 47

Tabela 6 - Fatores, variáveis codificadas e níveis para o planejamento experimental usando o

EDTA - Mg2+. ......................................................................................................................... 48

Tabela 7- Condições de eluição para purificação do antígeno 503. ......................................... 50

Tabela 8 - Resultados de concentração de proteína total e antígeno 503 para o método de lise

enzimática (lisozima). ............................................................................................................... 55

Tabela 9 - Resultados de concentração de proteína total e antígeno 503 para o método pérolas

de vidro. .................................................................................................................................... 55

Tabela 10 - Resultados de concentração de proteína total e antígeno 503 para o método da ureia.

.................................................................................................................................................. 55

Tabela 11 - Resultados de concentração de proteína total e antígeno 503 para o método de

EDTA - Mg2+. ......................................................................................................................... 56

Tabela 12 - Percentagem de remoção de LPS nos ensaios de ALE. ........................................ 68

Tabela 13 - Dados da purificação do antígeno 503 a partir do homogeneizado de E. coli não

clarificado para o ensaio com a eluição isocrática. .................................................................. 69


clarificado para o ensaio com a eluição em degrau com dois passos. ...................................... 73


clarificado para o ensaio com a eluição em degrau com três passos. ...................................... 74

LISTA DE QUADRO

Quadro 1 - Sequência de aminoácidos do fator de alongamento 1-γ de L. infantum. .............. 27

LISTA DE ABREVIATURA E SIGLAS

ALE: Adsorção em Leito Expandido

ANOVA: Análise de variância

APT: Área de proteína total

API: Área de proteína de interesse

BSA: Albumina de Soro Bovino

cm: Centímetro

C: Concentração da proteína no equilíbrio na fase líquida

C0: Concentração inicial da proteína alvo na fase líquida

CPT: Concentração de proteína total

Ca503: Concentração do antígeno 503

cDNA: DNA complementar

DAT: Teste de Aglutinação Direta

DEAE: Dietil aminoetil

DEQ: Departamento de Engenharia Química

dp: Diâmetro da partícula

E. coli: Escherichia coli

EDTA: Ácido etilenodiaminotetracético

EF-1: Fator de alongamento 1

ELISA: Enzyme-linked Immunosorbent Assay

FP: Fator de Purificação

Fcal: Pontos de percentual calculados da distribuição F

Ftab: : Pontos de percentual tabelados da distribuição F

g: Aceleração da gravidade

Gal: Galactose

GE: Grau de expansão do leito

Glc: Glicose

GTP: guanosina trifosfato

H: Altura do leito expandido

H0: Altura do leito fixo

Hep: L-glicerol-D-mano-heptose

IDA: Ácido iminodiacético

IMAC: Cromatografia de Afinidade por Íon Metálico Imobilizado

INF-γ: Interferon gama

Kd: Constante de dissociação no equilíbrio

kDa: Kilodalton

KDO: Ácido 2-ceto-3-deoxioctônico

L: Litro

LAL: Limulus Amebocyte Lysate

LC: Leishmaniose Cutânea

LCM: Leishmaniose Cutâneo-Mucosa

LV: Leishmaniose Visceral

LPS: Lipopolissacarídeos

m: Metro

mg: Miligrama

min: Minuto

mL: Mililitro

mM: Milimolar

n: Índice de Richardson-Zaki

NGa: N-acetil-galactosamina

NGc: N-acetil-glicosamina

OMS: Organização Mundial da Saúde

q: Capacidade de adsorção

qmáx: Capacidade máxima de adsorção

R2: Coeficiente de regressão

RIFI: Reação de Imunofluorecência Indireta

ReP: Reynolds da partícula

rpm: Rotações por minuto

SABs: sistemas aquosos bifásicos

SDS-PAGE: Eletroforese em gel de poliacrilamida em condições desnaturantes

SP: Sulfapropil

tRNA: Aminoacil-RNA transportador

U: Velocidade da partícula

UE: Unidade de endotoxina

UFRN: Universidade Federal do Rio Grande do Norte

Ut: Velocidade terminal da partícula

V: Volume de extrato bruto

Vads: Volume de adsorvente utilizado

%: Percentagem

º C: Graus celsius

ε0: Porosidade inicial do leito

ε: Porosidade do leito

μ: Viscosidade do fluido

μL: Microlitro

ρp: Densidade da partícula

ρL: Densidade do fluido

CAPÍTULO I

INTRODUÇÃO

16

1. Introdução

Ana Laura Oliveira de Sá Leitão Fevereiro/2017

1. Introdução

Em muitos países, o aumento dos fatores de risco para a Leishmaniose tem despertando

uma crescente preocupação nos órgãos de saúde pública. Esta é uma doença causada por

protozoários do gênero Leishmania e classifica-se em três formas: Leishmaniose Visceral (LV),

Leishmaniose Cutânea (LC) e Leishmaniose Cutâneo-Mucosa (LCM) (World Health

Organization, 2014). Estima-se que cerca de 88 países são afetados e a população em risco é de

aproximadamente 350 milhões de pessoas (Desjeux, 2004).

A Leishmaniose Visceral (LV), umas das manifestações clínicas da Leishmaniose, é

uma doença crônica e potencialmente fatal para o homem se não tratada (Gontijo & Melo,

2004). A LV apresenta uma incidência anual de 200.000 a 400.000 novos casos (World Health

Organization, 2014) e exibe uma extensa distribuição ocorrendo na Ásia, na África, nas

Américas, na Europa e no Oriente Médio. Na América Latina, 90% dos casos ocorrem no

Brasil, principalmente na região Nordeste (Ministério da Saúde, 2014).

Até o presente não existe nenhuma vacina eficaz no tratamento da Leishmaniose em

humanos. As drogas que vem sendo empregadas, por mais de sessenta anos, para o tratamento

da doença são os antimoniais pentavalentes. No entanto, essas drogas apresentam custos

elevados, nem sempre são efetivas e apresentam elevada toxicidade. Diante desses aspectos,

avanços expressivos dos estudos de biologia molecular vêm contribuindo para a produção de

antígenos recombinantes purificados que poderão ser utilizados para obtenção de vacinas

(Gontijo & Melo, 2004).

Adicionalmente, com o desenvolvimento da indústria biotecnológica, o interesse pelas

proteínas é cada vez maior, devido a suas atividades enzimáticas e ações terapêuticas. Porém,

para a maioria de suas aplicações elas precisam apresentar um elevado grau de pureza (Chase,

1994). As técnicas utilizadas para separação e purificação de proteínas são conhecidas como

downstream processing (Santos, 2001). Esse processo envolve diferentes operações unitárias

como, por exemplo, centrifugação, filtração, precipitação, cromatografia e cristalização

(Padilha, 2013).

Por outro lado, a Escherichia coli encontra-se como um dos hospedeiros mais utilizados

na obtenção de proteínas recombinantes, principalmente por apresentar vantagens como

facilidade de manipulação e grande disponibilidade de informação genética, crescimento

rápido, alto nível de expressão em meios de baixo custo e facilidade na ampliação de escala

17

1. Introdução


(Huang et al., 2012). Nesses casos em que a proteína recombinante é expressa em E. coli, o

procedimento de ruptura celular ocasiona a liberação de grandes quantidades de

lipopolissacarídeos (LPS), uma vez que estes derivam da membrana celular externa de bactérias

Gram-negativas (Lopes et al., 2010). Esses LPSs apresentam elevada toxicidade sobre os seres

humanos, por isso é fundamental a sua remoção de produtos biológicos e farmacêuticos e, para

isso, diversos métodos vêm sendo testados. Uma alternativa que vem mostrando resultados

promissores na remoção de LPS integrado à purificação da proteína de interesse, é a aplicação

do Triton-X 114 durante a etapa de lavagem do processo cromatográfico (Sousa Junior, 2015).

Ainda segundo Sousa Junior (2015), devido ao elevado número de operações unitárias

necessárias, que é dependente do grau de purificação desejado, a etapa de purificação apresenta

um alto custo. Portanto, é de grande interesse o desenvolvimento de técnicas econômicas e que

permitam a redução dessas etapas para a purificação de proteínas.

Assim, vem sendo amplamente estudado o desenvolvimento das operações

integradas, as quais reduzem o número de operações unitárias necessárias ao processo de

purificação, permitindo uma elevada recuperação e, também, proporcionando uma maior

economia na obtenção dos produtos (Cavalcanti, 2010). Dessa forma, a Adsorção em Leito

Expandido (ALE) vem se destacando como uma alternativa promissora na área de recuperação

e purificação de biomoléculas, pois é uma técnica cromatográfica que integra as etapas de

clarificação, concentração e purificação em uma única etapa (Anspach et al., 1999). Além disso,

a mesma permite explorar diferentes técnicas cromatográficas, tais como: troca iônica,

interação hidrofóbica e afinidade por íons metálicos imobilizados (IMAC) (Zhao et al., 2009).

Dentre essas técnicas cromatográficas, a IMAC é uma cromatografia de afinidade em que a

biomolécula se liga reversivelmente ao metal imobilizado na resina e vem sendo bastante

utilizada na purificação de proteínas recombinantes que possuem caudas de histidina (Iwashita,

2012).

Estudos realizados por Campubrí et al. (2006), Dalal et al. (2008), Yap et al. (2010) e

Sousa Júnior et al. (2015) confirmam que a utilização da técnica cromatográfica IMAC

operando em leito expandido vem se mostrando eficiente para processos de purificação.

Nesse contexto, esse processo que integra a clarificação, recuperação e purificação da

proteína e remoção de LPS em uma única operação vem sendo estudado pelo grupo de pesquisa

em Engenharia de Bioprocessos do Departamento de Engenharia Química (DEQ) da

Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN) e trata-se de um processo simples e de

baixo custo quando comparado com outros procedimentos alternativos.

18

1. Introdução


O presente trabalho está dividido em sete capítulos. O Capítulo 1 consiste na introdução

aos assuntos discutidos no decorrer do trabalho, em seguida, tem-se o Capítulo 2, onde estão

expostos os objetivos propostos. O Capítulo 3, apresenta uma revisão da literatura com relação

à Leishmaniose, antígenos recombinantes, rompimento celular, purificação de biomoléculas,

cromatografia, adsorção em leito expandido, técnica de Cromatografia de Afinidade por Íons

Metálicos Imobilizados (IMAC) e endotoxinas. O Capítulo 4 irá abordar a metodologia

utilizada, seguido do Capítulo 5, que irá apresentar os resultados e discussões e no Capítulo 6

são apresentas as considerações finais. Por fim, o Capítulo 7 relata as referências estudadas para

a elaboração deste trabalho e em seguida tem-se o apêndice e o anexo.

CAPÍTULO II

OBJETIVOS

20

2. Objetivos


2. Objetivos

Os objetivos deste trabalho podem ser divididos em objetivos gerais e específicos.

2.1 Objetivos Gerais

• Avaliar os métodos de rompimento celular e os diferentes metais imobilizados em

resina Streamline Chelating para purificação do antígeno 503 de Leishmania i.

chagasi.

• Remover os lipopolissacarídeos liberados durante a etapa de rompimento celular.

2.2 Objetivos Específicos

• Avaliar quatro métodos de rompimento celular, utilizando lisozima, pérolas de

vidro, ureia e EDTA-Mg2+, para obtenção da proteína intracelular;

• Analisar a influência dos íons metálicos Cu2+, Ni2+, Zn2+, Co2+ e Fe3+ imobilizados

na resina Streamline chelating na adsorção do antígeno 503 usando o

homogeneizado celular em sistema de batelada;

• Determinar a quantidade mínima de tensoativo Triton X-114 necessária na etapa de

lavagem da ALE para remoção do LPS, a fim de obter-se o antígeno 503 livre desse

contaminante;

• Recuperar e purificar o antígeno 503 diretamente do homogeneizado bacteriano não

clarificado por adsorção em leito expandido, utilizando a resina Streamline

chelating com o metal imobilizado que apresentar melhor capacidade de adsorção.

CAPÍTULO III

REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

22

3. Revisão Bibliográfica



Neste capítulo é elaborada uma revisão da literatura baseada na temática deste trabalho,

abordando assuntos com relação à purificação de biomoléculas, incluindo processos de

rompimento celular, a técnica de adsorção em leito expandido e a IMAC. Além disso, um

contexto geral sobre a leishmaniose, antígenos recombinantes e endotoxinas também foram

estudados.

3.2 Leishmaniose

A leishmaniose constitui um complexo de doenças com uma importante diversidade

clínica e epidemiológica. A doença é causada por um parasita protozoário da família

Trypanosomatidae, que pertence ao gênero Leishmania. Cerca de 30 espécies foram

comprovadas, sendo 20 dessas espécies patogênicas para os seres humanos (Desjeux, 2004).

As manifestações clínicas da doença dependem da espécie de Leishmania e apresenta três

principais formas: visceral (LV), cutânea (LC) e mucocutânea (LMC) (World Health

Organization, 2014).

A doença é considerada endêmica em 88 países, dos quais 72 são países em

desenvolvimento e 13 estão entre os menos desenvolvidos. A maioria dos casos de leishmaniose

ocorre em populações rurais pobres e áreas suburbanas de alguns países, como: Índia, Sudão,

Bangladesh, Nepal, Brasil, Peru, Irã, Afeganistão, Argélia, Síria e Arábia Saudita (Desjeux,

1996). A Figura 1 apresenta o estado de endemicidade da Leishmaniose Visceral em todo o

mundo no ano de 2013.

23



3.2.1 Leishmaniose Visceral

3.2.1.1 Situação epidemiológica

A Leishmaniose Visceral (LV), também conhecida como calazar, é a forma clínica mais

grave, pois é geralmente fatal se não tratada (Boelaert et al., 2000). É uma doença sistêmica

que atinge as células do sistema monocular fagocitário do homem sendo os órgãos mais

afetados o baço, fígado, linfonodos, medula óssea e pele (Melo, 2004).

No Brasil, inicialmente a LV foi caracterizada como uma doença rural, ocorrendo

especialmente na região Nordeste. Com o aumento da urbanização houve uma expansão na

distribuição geográfica da LV e a doença se espalhou para todas as regiões do país, envolvendo

as regiões Norte, Nordeste, Centro-Oeste e Sudeste (Martins-Melo et al., 2014). Essas

modificações, do ponto de vista epidemiológico, resultam da alta densidade demográfica,

alterações climáticas e migração rural para áreas urbanas periféricas (Miranda, 2008).

Figura 1 - Endemicidade da Leishmaniose Visceral em todo o mundo no ano de 2013 (World Health

Organization, 2014).

24



Em 1998, fora da região Nordeste foram notificados 15% dos casos e, em 2005, essa

proporção aumentou para 44% (Harhay et al., 2011). Atualmente, a doença está distribuída em

21 estados brasileiros, com cerca de 3.500 casos anuais (Alvar et al., 2012). Aproximadamente

41,9% dos casos humanos do país correspondem a crianças com até nove anos de idade

(Marcondes & Rossi, 2013).

Os dados epidemiológicos dos últimos anos relatam a periurbanização e a urbanização

da LV, destacando-se a ocorrência de surtos nas seguintes cidades: Rio de Janeiro (RJ),

Araçatuba (SP), Santarém (PA), Belo Horizonte (MG), Corumbá (MS), Teresina (PI), São Luís

(MA), Natal (RN), Fortaleza (CE), Camaçari (BA), Três Lagoas (MS), Campo Grande (MS) e

Palmas (TO) (Ministério da Saúde, 2014).

3.2.1.2 Agente etiológico e transmissão

A LV é causada por espécies pertencentes ao complexo Leishmania donovani. No

Brasil, o agente etiológico é a L. chagasi, espécie semelhante à L. infantum encontrada em

alguns países do Mediterrâneo e da Ásia. Com a realização de estudos envolvendo técnicas

bioquímicas e moleculares, a L. chagasi e a L.infantum foram consideradas a mesma espécie, e

por isso este parasita é mencionado como L. infantum chagasi ou L. i. chagasi (Sousa Junior,

2015). Para que ocorra a transmissão da doença é necessária a presença do vetor susceptível,

bem como de um hospedeiro e um reservatório também susceptíveis (Gontijo & Melo, 2004).

No ambiente urbano o cão doméstico é o principal reservatório e fonte de infecção para os

vetores (Courtenay et al., 2002).

A principal forma de transmissão do parasita é através da picada de flebotomíneos do

sexo feminino. Outras formas de transmissão já foram registradas, como: congênita, seringas

contaminadas e transfusão de sangue (Quinnell & Courtenay, 2009). No Brasil, duas espécies

de vetores estão relacionadas com a transmissão da doença, Lutzomyia longipalpis e Lutzomyia

cruzi, sendo a primeira considerada o principal vetor da LV (Gontijo & Melo, 2004).

3.2.1.3 Quadro Clínico

As manifestações clínicas da LV apresentam as seguintes formas: assintomática,

oligossintomática e clássica (Sousa Junior, 2015).

25



A forma clássica da doença é caracterizada pela presença de febre, anemia,

hepatoesplenomegalia, manifestações hemorrágicas, linfadenomegalia, perda de peso,

taquicardia, além de tosse seca e diarréia, sendo estas duas últimas menos frequentes (Pastorino

et al., 2002). Apenas uma pequena parcela de indivíduos infectados desenvolve sinais e

sintomas da doença, a maioria desenvolve infecção assintomática ou oligossintomática (Lima

et al., 2012). De acordo com Ready (2014), aproximadamente 25% dos indivíduos infectados

evoluem para a forma clássica da doença.

4.2.1.4 Diagnóstico e tratamento

O diagnóstico da LV é baseado em parâmetros epidemiológicos, clínicos e laboratoriais

(Pastorino et al., 2002). Um dos problemas associado a esse diagnóstico é a semelhança no

quadro clínico que a LV apresenta com outras doenças presentes nas áreas onde ela ocorre,

como, por exemplo, Doença de Chagas, Esquistossomose, Malária, Tuberculose e Febre

Tifóide (Gontijo & Melo, 2004). Diante dos sinais e sintomas que são comuns a outras

patologias devem-se utilizar os métodos clínicos adjuntos aos métodos parasitológico,

sorológico e imunológico para construir o diagnóstico da LV (Souza et al., 2012).

O diagnóstico feito através do método clínico baseia-se em diversas indicações, como:

febre prolongada, anemia, esplenomegalia, hepatomegalia e leucopenia. O método

parasitológico, por sua vez, fundamenta-se na visualização direta em cultivo do parasito obtido

de baço, fígado, medula óssea ou linfonodos. Por outro lado, os métodos sorológicos e

imunológicos utilizam testes, tais como: a Reação de Imunofluorecência Indireta (RIFI), a

Reação Imunoenzimática Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) e o Teste de

Aglutinação Direta (DAT) (Assis et al., 2008).

O tratamento da LV vem sendo realizado com cinco medicamentos derivados de

moléculas naturais e sintéticas: antimônio pentavalente, anfotericina B (AmpB), miltefosine,

paromomicina e pentamidine. Atualmente, dois compostos antimoniais pentavalentes são

comercialmente disponíveis: Glucantime® (antimoniato de metilglucamina) e Pentostan®

(estibogluconato de sódio) (Hwan, 2016).

No Brasil, esses medicamentos à base de antimônio, são as drogas de primeira escolha

para o tratamento da doença e o único composto disponível é o antimoniato N-metil glucamina,

sendo a última adquirida previamente por meio da aminação redutora da glicose em presença

de metilamina (Rath et al., 2003). Devido a toxicidade do antimônio, a Organização Mundial

26



da Saúde (OMS) sugere que a dosagem dessa droga não ultrapasse 20 mg/kg/dia, com uma dose

máxima diária de 850 mg (Balaña-Fouce et al., 1998). Distúrbios cardiovasculares são os

principais efeitos colaterais do glucantime (Gontijo & Melo, 2004).

A anfotericina B é uma droga de segunda linha utilizada como tratamento alternativo,

em caso de resistência aos antimoniais. É um antibiótico antifúngico proveniente de uma cepa

de Streptomyces nodosus (Rath et al., 2003). O uso desse medicamento é restringido pela sua

elevada toxicidade, com isso a anfotericina B pode ser incorporada em lipossomas, reduzindo

a toxidade e elevando os níveis de cura (Freitas-Junior et al., 2012).

3.3 Antígenos Recombinantes

Com o surgimento da tecnologia do DNA recombinante, tornou-se possível expressar

proteínas recombinantes, tornando-se essa técnica uma ferramenta importante nos estudos da

estrutura, função e identificação de novas proteínas, principalmente com finalidades

terapêuticas (Vaz, 2008).

As proteínas recombinantes podem ser obtidas em diversos hospedeiros, tais como:

bactérias, leveduras, fungos filamentosos e células de mamíferos. A bactéria Gram-negativa,

Escherichia coli, é um dos hospedeiros mais bem estudados e utilizados para reprodução destas

proteínas, principalmente por ser bem caracterizada em termos de genética molecular, fisiologia

e sistema de expressão, permitindo assim que várias técnicas de manipulação genética fossem

desenvolvidas e aprimoradas (Makrides, 1996; Choi & Lee, 2004; Lima, 2004).

Proteínas de Leishmania, como por exemplo antígenos de Leishmania chagasi, têm sido

clonados e produzidos em bactérias para o desenvolvimento de vacinas e kits de diagnóstico

(Silva, 2013).

3.3.1 Antígeno 503

De acordo com o estudo realizado por Martins et al. (2006), observou-se que uma vacina

que produz proteção contra a LV deveria possuir mecanismo de ação que consistiria no estímulo

da produção de interferon gama (INF-γ). Para esse estudo foi gerada uma biblioteca de cDNA

(DNA complementar) da forma amastigota de Leishmania i. chagasi e os antígenos foram

27



identificados através da dupla varredura da biblioteca. O antígeno 503 apresentou 100% de

identidade com o fator de alongamento 1-γ de L. infantum, sendo observada uma massa de 56 kDa

e confirmando ainda, o potencial desta proteína como candidata à vacina ou teste para diagnóstico

específico da LV.

O fator de alongamento 1-γ é uma subunidade do fator de alongamento 1 (EF-1). O EF-

1 além de ser o principal fator traducional, é também uma das mais importantes proteínas

multifuncionais, uma proteína G que desempenha um papel importante na tradução de proteínas

em células eucarióticas. O EF-1 é composto por quatro subunidades principais: alfa, beta, gama

e delta (EF-1α, EF-1β, EF-1δ e EF-1γ). A subunidade EF-1α liga o aminoacil-RNA

transportador (tRNA) ao ribossomos 80s através da hidrólise do guanosina trifosfato (GTP),

enquanto as outras subunidades (EF-1β, EF-1δ e EF-1γ) apresentam como função a troca do

nucleotídeo EF-1α-guanosina difosfato (GDP) por EF-1α-GTP (Cañavate et al., 2002; Ejiri,

2002).

O Quadro 1 mostra a sequência de aminoácidos do fator de alongamento 1-γ de L.

infantum

3.4 Rompimento Celular

Existem dois tipos básicos de produtos produzidos por microrganismos: intracelular,

que são retidos no interior da célula do citoplasma e extracelular que são excretados para um

meio de crescimento (Geciova et al., 2002). Comparado aos produtos extracelulares, os

intracelulares dificultam o processo de purificação de biomoléculas, uma vez que exigem o

rompimento celular (Pessoa-Jr & Kilikian, 2005).

1 mtykllaplh pesaraqkim vaaayanvdv elkvcqygqe netpefarnc spcmrfpsmq

61 teegylfesn aimrhiarve ksgaklygat pfessqvdmw ldfasselda hnmpylmetf

121 agipaaesam atleeslagl elwletrtfl vgermtvadi svafalqwvy rmnvkhgeel

181 tkkyrnayrl yntvmqqpkt vevlkqwgat fgpakapkka aeakpkaekk pkeavgdeee

241 qsakeekkan pldalppssf vldaykreys ntdtrtvaap yffehydteg ytcfwaryky

301 nednkkqfmt anlvrgwfqr mehvrkyafg valiigedaa helvsfwvfr gkgmpeivse

361 vvdtelfewe eikdvqaeke kitdylcweg ptiprpvleg rcfk

Quadro 1 - Sequência de aminoácidos do fator de alongamento 1-γ de L. infantum.

Fonte: GenBank número CAC35543.1

28



De acordo com Pessoa-Jr (2005), o rompimento celular ocorre após a etapa de separação

e lavagem das células obtidas ao final do cultivo. Alguns fatores como: tamanho da célula,

necessidade de controle de temperatura, tempo de operação, tolerância a tensões de

cisalhamento, rendimento do processo, custo e capital de energia, devem ser considerados para

escolha da técnica de rompimento mais adequada.

Portanto, a ruptura celular consiste da primeira etapa no processo de recuperação de

produtos intracelulares e constitui um passo essencial do downstream processing, pois algum

dano ocasionado ao produto de interesse a ser recuperado, pode influenciar nas etapas seguintes

(Neves, 2003).

Os métodos para ruptura celular são classificados como: mecânicos e não-mecânicos.

Os métodos mecânicos incluem técnicas baseadas em forças de cisalhamento (moinho de bolas,

ultrassom) ou por pressão (homogeneizador a alta pressão). Os métodos não-mecânicos podem

ser: físicos (choque osmótico, termólise, congelamento e descongelamento), químicos

(detergentes, solventes, EDTA) e enzimáticos (lise enzimática) (Harrison, 1991; Ho et al.,

2006).

3.4.1 Lise enzimática

A lise enzimática é um método de rompimento celular atraente em termos da sua

especificidade, condições suaves de operação, baixo investimento de capital, além de ser

adequado para a recuperação de biomoléculas sensíveis à tensão de cisalhamento (Harrison,

1991).

Esse método de ruptura baseia-se na remoção da parede celular, com a ação das enzimas,

acompanhado do rompimento da membrana citoplasmática devido à pressão osmótica interna.

As enzimas atuam no rompimento, visto que a parede seja seu substrato (Pessoa-Jr, 2005).

Diferente das bactérias gram-positivas, as gram-negativas possuem uma estrutura mais

complexa. Estas são constituídas por uma parede de duas camadas: a interior, composta por

peptidoglicano e a membrana externa formada por fosfolipídios, proteínas, lipoproteínas e

lipopolissacarídeos. Logo, é necessário um pré-tratamento para remover a membrana externa e

expor o peptidoglicano ao ataque enzimático, esse pré-tratamento pode ser feito, por exemplo,

com o detergente Triton X-100 (Andrews & Asenjo, 1987).

29



3.4.2 Pérolas de vidro

Devido à sua simplicidade, esse método parece ser o mais simples para ruptura celular

quando equipamento especializado não estiver disponível (Benov & Al-Ibraheem, 2002).

O rompimento por pérolas de vidro é um método mecânico e ocorre devido à força de

cisalhamento aplicada pelas esferas de vidro contra a parede celular das células. Esse método é

bastante indicado para escala laboratorial, uma vez que não necessita de grande aparato

operacional. O procedimento desse método consiste, basicamente, da adição das pérolas de

vidros em um tubo, contendo um determinado volume de suspensão celular, agitado-se o tubo

vigorosamente por um determinado tempo (Neves, 2003).

3.4.3 EDTA - Mg2+

O EDTA (ácido etilenodiaminotetracético) é um agente quelante que causa

desestabilização ou remoção da membrana externa (Harrison, 1991). No caso da E. coli o

EDTA é necessário para romper a camada de peptidoglicano na membrana externa e Mg2+é

adicionado para estabilizar os esferoplastos (Xiang et al., 2002).

3.4.4 Ureia

A expressão de proteínas em E. coli frequentemente leva à produção de proteínas

agregadas e insolúveis expressas em corpos de inclusão no citoplasma bacteriano. Os agentes

mais usualmente utilizados para a solubilização de proteínas agregadas são guanidina e ureia.

Estes levam a formação de estruturas protéicas flexíveis e desordenadas e quando altos níveis

de concentração destes agentes desnaturantes são utilizados a solubilização pode ser completa

através da ruptura de interações intramoleculares (Clark, 2001; Singh & Panda, 2005)

Desse modo, a ureia é um agente caotrópico que age interrompendo as interações fracas

entre moléculas, como as interações hidrofóbicas entre as proteínas. Agentes caotrópicos são

eficazes na desnaturação de proteínas e por esse motivo são adicionados nos tampões de lise

(Geciova et al., 2002; Burden, 2012).

30



3.5 Purificação de Proteínas

O interesse por processos de purificação é crescente devido ao desenvolvimento da

biotecnologia e à demanda das indústrias farmacêutica e química por produtos com elevado

grau de pureza (Zuñiga et al., 2003). Destacam-se, dentre esses produtos, as proteínas,

interferons, insulinas, hormônios de crescimento, vacinas, cujas técnicas de separação e

purificação podem ser agrupadas no downstream processing. Essas operações unitárias são

bastante dispendiosas, podendo comprometer em até 80% do custo total (Santos, 2001). Dessa

forma, tem-se grande interesse no estudo e desenvolvimento de técnicas mais simples, ou seja,

que permita a redução das etapas desse processo, e que ofereça um menor custo para a

purificação de biomoléculas.

Diversas técnicas podem ser utilizadas na purificação de produtos biotecnológicos e a

seleção do processo mais adequado a ser utilizado vai depender da aplicação final da molécula-

alvo requerendo maior ou menor grau de pureza, das características físico-químicas e também

das impurezas. Biofármacos (diagnósticos e terapêuticos) são os que demandam maior grau de

pureza e, assim, acabam elevando a complexidade e os custos do processo de purificação

(Pessoa-Jr & Kilikian, 2005).

Na indústria biotecnológica, as técnicas cromatográficas são os métodos mais

empregados para recuperação e purificação de proteínas, principalmente quando alta

concentração e alta pureza são necessárias, e a adsorção em leito fixo, especificamente,

encontra-se com uma das técnicas de mais amplo estudo. Porém, uma das maiores limitações

desta técnica se dá após os processos fermentativos, onde são necessárias algumas operações

unitárias prévias, devido à presença de diversos contaminantes e materiais indesejados, como

subprodutos e resíduos celulares, os quais podem causar obstrução da coluna e, deste modo,

prejudicar o rendimento do processo de purificação (Azzoni, 2002; Zhao et al., 2009; Lima,

2014).

O objetivo de um processo de purificação de proteínas é atingir rendimento máximo

com alta seletividade, considerando os custos das operações empregadas. Sendo assim, é

necessário ter uma sequência adequada das etapas envolvidas no processo e um número

otimizado de operações unitárias envolvidas, reduzindo o tempo de processamento (Silva,

2000).

Em geral, o processo de recuperação e purificação envolve uma estratégia que inclui

quatro passos sequenciais: clarificação (remoção de compostos insolúveis), concentração

31



(isolamento do produto), purificação e polimento. Essa abordagem é uma das melhores

estratégias para a purificação de biomoléculas (Cussler & Ding, 1995; Zuñiga et al., 2003).

Nesse caso, como comentado anteriormente, técnicas que permitam integrar as etapas de

clarificação, concentração/purificação são de extrema importância. Dentre essas destacam-se

os sistemas aquosos bifásicos (SABs) e a adsorção em leito expandido (ALE), sendo essa última

usada no presente trabalho. A Figura 1 esquematiza as etapas de um processo de purificação de

biomoléculas.

Figura 2 - Etapas de um processo genérico de purificação de biomoléculas. Fonte: Pessoa-Jr

& Kilikian, 2005.

Meio de cultivo com células ou

microrganismos em suspensão

Clarificação

(separação células/meio)

Células ou microrganismos

(produtos intracelulares)

Sobrenadante

(produtos extracelulares)

eextracelularesexintracel

ulares) Rompimento de células

ou microrganismos

Remoção de fragmentos de

células ou microrganismos

Fração sólida

Sobrenadante

e

Separação/Concentração de

moléculas

Purificação

Tratamentos finais

32



3.6 Cromatografia

A introdução da cromatografia como técnica analítica ocorreu em 1906, por um

pesquisador russo, Mikhael Semenovich Tswett, ao descrever sua experiência de separar a

clorofila de uma mistura de pigmentos de planta (Moraes, 2009). Nas últimas décadas, a

cromatografia vem se destacando como uma das técnicas mais importantes para separação e

purificação de biomoléculas, devido ao seu alto desempenho e eficiência (Zhao et al., 2009).

Essa técnica baseia-se nas características físico-químicas dos componentes de interesse

e consiste da separação dos componentes entre uma fase móvel, que contém a mistura de

componentes a serem separados, e outra estacionária, esta normalmente é sólida e formada por

matriz de partículas empacotadas em uma coluna de forma tubular (Azzoni, 2002; Zuñiga et

al., 2003). Durante a passagem da fase móvel por meio da fase estacionária, os constituintes da

amostra são difundidos entre as duas fases, de tal forma que, cada um deles é seletivamente

retido pela fase estacionária, resultando em uma migração diferencial que promove a separação

(Collins et al., 2006).

As técnicas cromatográficas mais utilizadas para purificação de produtos

biotecnológicos são: cromatografia por exclusão molecular, troca iônica, interação hidrofóbica,

afinidade e imunoafinidade. Na cromatografia por exclusão molecular a separação ocorre em

função dos tamanhos das moléculas, enquanto que nos demais processos, as diferentes

moléculas adsorvem na matriz, e em seguida, ocorre dessorção seletiva, proporcionando a

separação dos componentes (Pessoa-Jr & Kilikian, 2005).

3.6.1 Adsorção em Leito Expandido

A Adsorção em Leito Expandido (ALE) tende a simplificar de forma significativa o

downstream processing, pois nessa técnica o caldo bruto proveniente da fermentação pode ser

utilizado sem que haja uma clarificação prévia, com o material particulado passando através do

leito sem ser retido. Esta técnica cromatográfica elimina as etapas de filtração, centrifugação e

concentração, integrando em uma única operação as etapas de clarificação, concentração e

purificação (Chase & Draeger, 1992; Hjorth, 1997). Essa característica de integrar essas etapas

em uma única operação unitária é a principal vantagem da utilização da adsorção em leito

expandido, sobre a técnica cromatográfica convencional em leito fixo.

33



A Figura 3 ilustra a comparação entre o funcionamento de um processo de adsorção em

leito fixo (3a) e expandido (3b), podendo-se observar que no leito fixo o material particulado

bloqueia a coluna. No entanto, ao ser operada de forma expandida a alimentação contendo o

material particulado passa pela coluna sem a obstrução do leito (Figura 3b) (Santos, 2001).

Figura 3 - Princípio de funcionamento de um processo de adsorção em leito fixo e expandido.

Fonte: adaptado de Crase & Draeger, 1992.

A ALE baseia-se na fluidização do leito de adsorventes cromatográficos (Padilha,

2013). Esse processo de fluidização do leito promove uma maior interação entre as matrizes

adsorventes e as moléculas alvo (Curvelo-Santana et al., 2008).

As propriedades das partículas adsorventes são de fundamental importância para formar

uma fluidização perfeita, nesse caso, faz-se necessário o uso de partículas com alta massa

específica, que permite o estabelecimento de elevadas velocidades de fluxo de líquido através

do leito expandido. Quando a fase móvel é bombeada em sentido ascendente através da coluna,

as partículas com tamanhos e densidades diferentes distribuem-se de forma não uniforme ao

longo da altura do leito (Lin et al, 2013). As partículas adsorventes maiores ou mais densas

Fluido com partículas

Partículas adsorventes

Material particulado que passa pelo leito

Torta de Células

(a) (b)

34



localizam-se na parte inferior do leito expandido e as menores ou menos densas na parte

superior, como pode ser visto na Figura 2b ilustrada acima (Hjorth, 1997).

O fluxo ascendente através do adsorvente fornece uma maior fração de vazios no interior

do leito, o que permite a utilização de material particulado, que passa através da fase sólida

enquanto a biomolécula alvo é adsorvida (Tong & Sun, 2002).

As matrizes adsorventes mais utilizadas para purificação de proteínas são as de celulose,

agarose, dextrana e poliacrilamida (Sousa Junior, 2015). Os ligantes clássicos (SP – sulfapropil,

DEAE – dietil aminoetil e IDA – ácido iminodiacético) são acoplados ao suporte das partículas

adsorventes (agarose-quartzo ou agarose-metal) elevando sua densidade e viabilizando a

expansão do leito. Estes adsorventes são identificados comercialmente como Streamline,

comercializados pela GE Healthcare e são compostos de 6% de agarose contendo um núcleo

de quartzo cristalino, que atua aumentando a densidade do adsorvente, com um tamanho de

partícula que varia de 100-300 µm, com tamanho médio de 200 µm e densidade em torno de

1,2 g/mL (Amersham Pharmacia Biotech, 1997; Kilikian & Santos, 2005).

O processo de cromatografia em leito expandido corresponde a uma sequência de

operações, que inclui o equilíbrio da resina, aplicação da amostra, a lavagem das proteínas não

adsorvidas, a eluição do composto e a regeneração da resina (Moraes, 2009). A ilustração dessa

sequência é representada na Figura 4. Primeiramente, o adsorvente do leito expandido é

equilibrado com o tampão de equilíbrio, aplicado em fluxo ascendente, causando a expansão

do leito em 2 ou 3 vezes, dependendo da velocidade. Após essa etapa, a amostra contendo as

células e partículas em suspensão é alimentada, no sentido ascendente, no leito estabilizado.

Dessa forma, a biomolécula alvo adsorve na resina, enquanto as células, restos celulares e

contaminantes saem pela parte superior da coluna. Nessa etapa, é importante manter o mesmo

grau de expansão do leito estabelecido e para isso deve-se controlar a velocidade. Em seguida,

efetua-se a lavagem de modo ascendente usando-se o tampão, para remoção de partículas e

proteínas fracamente adsorvidas. Depois da lavagem, a eluição da biomolécula de interesse é

conduzida após sedimentação do leito, ou seja, com o leito empacotado, podendo-se utilizar o

fluxo na forma ascendente ou descendente. Finalmente, a resina é limpa e regenerada para ser

novamente utilizada (Amersham Pharmacia Biotech, 1997).

35



Figura 4 - Etapas do processo de adsorção em leito expandido. Fonte: Amersham Pharmacia

Biotech, 1997.

3.6.1.1 Caracterização do leito expandido

Para as operações usando a ALE é de fundamental importância conhecer o

comportamento do leito em função das propriedades físicas das partículas e do fluido (Moraes,

2009). Uma das formas de conhecer esse comportamento é por meio da correlação de

Richardson & Zaki (1954), eles estudaram a sedimentação e fluidização de vidro, divinil

benzeno e balas de chumbo usando soluções como cloreto de sódio, M-cresol, bromofórmio e

glicerol e obtiveram uma expressão que relaciona a velocidade do fluido e a velocidade terminal

da partícula, com a porosidade do leito, conforme a Equação (1) (Santos, 2001):

U

Ut=εn (1)

Em que U é a velocidade do fluido, 𝑈𝑡 é a velocidade terminal da partícula, 𝜀 a

porosidade do leito e n é o índice de expansão (ou índice de Richardson-Zaki), sendo este uma

função do número de Reynolds terminal (Ret).

Ret=dPρ

LUt

μ (2)

Leito sedimentado

Equilíbrio

(expansão do leito)

Aplicação da amostra

Lavagem Eluição da proteína

Regeneração

36



No regime de Stokes, em que o 𝑅𝑒𝑝 < 0,1, a velocidade terminal de uma partícula isolada

𝑈𝑡 é dada por:

Ut=gdP

2(ρ

p-ρ

L)

18μ (3)

Sendo g a aceleração da gravidade, dp é o diâmetro da partícula, μ é a viscosidade do

fluido, e ρp e ρL são as densidades da partícula e do fluído, respectivamente.

Outro parâmetro importante na caracterização do leito expandido é o grau de expansão

(GE), que é um número adimensional e representa a razão entre a altura do leito expandido (H)

e a altura do leito fixo do adsorvente (𝐻0), para uma dada velocidade aplicada, como segue na

Equação (4). Para sistemas operando em leito expandido, os valores de GE giram em torno de

2,0 a 3,0 (Kilikian & Santos, 2005).

GE=H

H0 (4)

A Equação (5) representa a relação entre a porosidade do leito e o grau de expansão:

H

H0=

(1-ε0)

(1-ε) (5)

Em que ε é a porosidade do leito e 𝜀0 a porosidade inicial do leito (assumindo valor de

0,4) (Cavalcanti, 2010).

3.6.2 Cromatografia de Afinidade por Íons Metálicos Imobilizados (IMAC)

A IMAC foi introduzida por Porath e colaboradores em 1975 e, desde então, íons

metálicos imobilizado vem sendo empregados como ligantes gerais em cromatografia de

afinidade para a purificação de várias biomoléculas (Vançan, 1999).

Assim como as demais técnicas de cromatografia de afinidade, a IMAC é usada nos

casos em que se deseja uma purificação rápida e uma elevada pureza do produto. Apresenta

vantagens quando comparada a essas outras técnicas, como a estabilidade entre IMAC – ligante,

37



condições suaves de eluição, regeneração simples e de baixo custo, além da sua aplicabilidade

em condições desnaturantes, o que muitas vezes faz-se necessário quando as proteínas

recombinantes são expressas em E. coli na forma de corpos de inclusão, permitindo que as

proteínas marcadas com histidina possam ser separadas eficientemente na presença de

concentrações de desnaturantes, como ureia ou guanidina-HCl (Gaberc-Porekar & Menart,

2001).

Nessa técnica, a adsorção das proteínas é baseada na interação entre o íon metálico

imobilizado na matriz do adsorvente e um grupamento doador de elétrons localizados na

superfície das proteínas (Sousa Junior, 2015). Os íons metálicos mais usualmente empregados

são, Fe3+, Cu2+, Ni2+, Co2+, Zn2+, Al3+ e Ca2+. Sendo que para purificação de proteínas que

possuam resíduos de histidina, triptofano e cisteína, os mais utilizados são, Cu2+, Ni2+, Co2+,

Zn2+, onde esses íons interagem com o nitrogênio aromático dos grupamentos imidazol, indol

e com o enxofre do grupamento tiol, respectivamente, de cada aminoácido (Bresolin et al.,

2009).

Bresolin et al. (2009) reportam ainda uma predição de afinidade da proteína com o

ligante IDA baseado em resíduos de histidina acessíveis na superfície de proteínas. Para a

ocorrência de apenas um resíduo de histidina o Cu2+ é o íon mais indicado para adsorção de

proteína, quando houver mais de um resíduo de histidina os íons metálicos que devem ser

utilizados para retenção de proteínas são Cu2+ e Ni2+ e no caso de ocorrer um cluster de histidina

os íons apropriados para adsorção de proteína são Cu2+, Ni2+, Zn2+ e Co2+.

Segundo Sulkowski (1989), o par de elétrons presente no nitrogênio aromático do anel

imidazol da histidina é o principal colaborador na interação entre a proteína e íons metálicos de

transição (quando quelatados ao ácido iminodiacético, IDA) e que a presença de múltiplas

histidinas expostas na superfície da proteína a ser separada aumenta o grau desta interação.

Poucas são as proteínas que naturalmente contêm resíduos de histidina localizados na

superfície, porém com o advento da engenharia genética, proteínas que na sua forma original

não possuíam caudas de histidinas disponíveis para ligação com íons metálicos imobilizados,

são geneticamente modificadas para receberem uma cauda de histidina, o que facilita a

purificação da proteína alvo por IMAC (Serpa, 2002).

Nessa técnica cromatográfica, o processo de purificação depende de diversos fatores,

como a escolha dos íons metálicos, dos agentes quelantes, das matrizes cromatográficas usadas

para imobilização dos agentes quelantes e as condições de adsorção e dessorção, buscando

38



favorecer a interação entre a proteína e o metal para que alta recuperação e seletividade sejam

alcançadas (Bresolin et al., 2009).

3.7 Endotoxinas

As endotoxinas são lipopolissacarídeos (LPS) de alta massa molecular, derivados da

membrana celular de bactérias gram-negativas e são responsáveis pela sua organização e

estabilidade (Lopes, 2010; Lopes, 2014). A liberação de LPS ocorre durante a morte ou

multiplicação celular dessas bactérias (Cardoso, 2014). Em indústrias farmacêuticas, é possível

encontrar endotoxinas durante os processos de produção ou no produto final. Entretanto, a

presença do LPS mesmo em concentrações muito baixas (<1,0 UE/mL) é indesejável, devido à

potente reação inflamatória desencadeada por esta molécula, causando graves efeitos

fisiopatológicos sobre o hospedeiro como choque endotóxico, injúria tecidual e até morte

(Schädlich et al., 2009).

O lipopolissacarídeo é formado pelo núcleo polissacarídico, ao qual se liga a cadeia O-

antigênica e a unidade lipídica A (Lopes, 2014), como mostra a Figura 5.

39



Figura 5 - Estrutura química dos LPS de E. coli O11:B4 de acordo com Ohmo & Morrison

(1989). Abreviações - Hep: L-glicerol-D-mano-heptose; Gal: galactose; Glc: glicose; KDO:

ácido 2-ceto-3-deoxioctônico; NGa: N-acetil-galactosamina e NGc: N-acetil-glic.

O lipídeo A é considerado a porção ativa da membrana da bactéria Gram-negativa,

constituído por um dissacarídeo de glicosamina, sendo altamente substituído por ácidos graxos

de cadeia longa ligados por ligações do tipo éster ou amida (Fukumori, 2008). Essa região é

responsável pela maior parte das atividades biológicas da endotoxina, isto é, a sua toxicidade

(Magalhães et al., 2007).

A região oligossacarídica possui sua estrutura formada por uma região com o ácido 2-

ceto-3-deoxioctônico (KDO) ligado a heptoses, geralmente L-glicerol-D-mano-heptose (Hep)

e outra região ligada a hexoses, frequentemente glicose (Glc), galactose (Gal), N-acetil-

galactosamina e N-acetil-glicosamina (NGc) (Erridge et al., 2002).

A porção O-antígeno geralmente é formada por uma sequência de oligossacarídeos

idênticos, com unidades repetidas de três a oito monossacarídeos, os quais são específicos para

40



cada espécie de bactéria e determinam a sua identidade sorológica, o que permite a classificação

de mais de 100 sorotipos de E. coli e mais de 1000 de Salmonella (Petsch & Anspach, 2000).

As endotoxinas apresentam efeitos biológicos muito fortes ao entrar na corrente

sanguínea de humanos, que vão desde febre e calafrios até hipotensão, síndrome da angústia

respiratória do adulto, coagulação intravascular disseminada e choque (Gorbet & Sefton, 2005).

Os antibióticos usados para tratar doenças causadas por bactérias Gram-negativas podem

quebrar as células bacterianas e isso ocasiona a liberação de LPS, podendo levar a uma piora

imediata dos sintomas (Magalhães et al., 2007).

Devido ao potencial tóxico dos LPS, é de extrema importância sua remoção de

preparações injetáveis e de outros produtos biológicos e farmacêuticos (Lopes et al., 2010).

Porém, essas moléculas apresentam característica termoestável, ou seja, não é destruída de

forma eficaz pelos processos de esterilização amplamente utilizados como, por exemplo, o calor

úmido a 121°C por 30 minutos (Magalhães et al., 2007). Deste modo, diferentes processos têm

sido desenvolvidos para remover LPS de proteínas, entre eles estão, adsorção por afinidade,

ultrafiltração, cromatografia de troca iônica, cromatografia de interação hidrofóbica e extração

por duas fases aquosas. A aplicabilidade desses métodos depende das propriedades da

biomolécula de interesse (Lin et al., 2005).

De acordo com estudos realizados por Reichelt et al. (2006), Zimmerman et al. (2006)

e Sousa Junior (2015), a adição de um detergente não iônico, como o Triton X-114, durante a

etapa de lavagem dos processos cromatográficos, é uma alternativa eficiente para remoção de

LPS.

O tensoativo não-iônico, Triton X-114, auxilia na dissociação da endotoxina de

proteínas recominantes, proporcionando uma capacidade de separação das fases para a remoção

da endotoxina dissociada (Aida & Pabst, 1990).

CAPÍTULO IV

METODOLOGIA

42

4. Metodologia


4. Metodologia

Neste item serão apresentados os materiais e as metodologias empregadas para avaliar

os métodos de rompimento celular e de diferentes metais imobilizados em resina Streamline

Chelating para purificação do antígeno 503 de Leishmania i. chagasi, bem como a remoção

de LPS.

4.1 Material

4.1.1 Adsorvente

A resina Streamline chelating foi utilizada durante os ensaios com IMAC e adquirida

da GE Healthcare (Uppsala, Suécia). As características desse adsorvente são apresentadas na

Tabela 1.

Tabela 1 - Principais características da resina Streamline chelating.

Característica Descrição

Ligante Ácido iminodiacético (IDA)

Tamanho médio da partícula 200,0 μm

Variação no tamanho da partícula 100,0 – 300,0 μm

Densidade média da partícula 1,2 g/mL

Matriz Ligação cruzada de agarose 6,0 %

contendo núcleo de quartzo

pH de trabalho 3,0 – 13,0

pH de limpeza 3,0 – 14,0

Grau de expansão a 300 cm/h 2,0 – 3,0

Condições de estocagem Etanol 20,0 %

Fonte: adaptado de Amersham Pharmacia Biotech (1997).

4.1.2 Coluna

Uma coluna de vidro especialmente construída para operar em leito expandido, com

diâmetro igual a 2,6 cm e uma altura de 30,0 cm e equipada com um êmbolo ajustável para

43

4. Metodologia


minimizar o espaço de topo sobre o leito fluidizado, foi utilizada nos experimentos de ALE. A

coluna possuía uma régua (escala) na parede externa para registrar a altura do leito. A porção

inferior da coluna foi preenchida por esferas de vidros para distribuir o fluxo de entrada,

formando um leito com altura de 4,0 cm. Uma bomba peristáltica, modelo Perimax 12, da

Spetec, foi utilizada para bombear o líquido para a coluna, conforme ilustra a Figura 6.

Figura 6 - Aparato experimental utilizado para os ensaios de ALE.

4.1.3 Material Biológico

O microrganismo utilizado foi uma cepa de Escherichia coli M15, abrigando o

plasmídeo pQE-30 capaz de expressar o antígeno 503 com cauda de histidina, cedida pela Dra.

Mary Wilson da Universidade de Iowa (Iowa, EUA) (Martins et al., 2006)

A cepa de E. coli expressando o antígeno 503 é armazenada a -80°C em microtubos com

glicerol a 50% no Laboratório de Imunogenética do Departamento de Bioquímica da

Universidade Federal do Rio Grande do Norte

44

4. Metodologia


4.1.4 Reagentes e Padrões

O Triton X-114, lisozima, albumina do soro bovino (BSA), e os antibióticos ampicilina

e canamicina foram adquiridos da Sigma-Aldrich (St. Louis, EUA), o kit cromogênico cinético

de Limulus Amebocyte Lysate (LAL kinetic-QCL®) foi obtido da empresa Lonza (Walkersville,

EUA) e o padrão peso molecular para eletroforese de proteínas adquirido da GE Healthcare

(Uppsala, Suécia). Todos os outros reagentes utilizados foram de grau analítico. A água

deionizada utilizada nos experimentos foi proveniente do sistema de ultrapurificação modelo

EASYpure da Barnstead (Dubuque, USA).

4.2 Métodos

4.2.1 Preparo do inóculo

Para ativação do microrganismo, 200,0 µL da solução de glicerol contendo a cepa

armazenada a -80°C foram transferidos assepticamente para 50,0 mL do meio de cultivo 2xTY,

conforme a Tabela 2. O meio foi previamente esterilizado em autoclave a 120°C, durante 20

minutos, e depois suplementado com 50,0 µL de ampicilina (0,1g/L) e 50,0 µL de canamicina

(0,025g/L) em frascos de Erlenmeyers de 250,0 mL. Esse cultivo inicial foi realizado em

incubador rotativo a 37°C e 200 rpm, por 12 horas e chamado de pré-inóculo. Para preparo do

inóculo, foram adicionados 5,0 mL do pré-inóculo a 45,0 mL do meio de cultivo 2xTY, contidos

em Erlenmeyers de 250,0 mL, e incubados a 200 rpm e 37°C por 6 horas. Esta suspensão

constitui o inóculo dos ensaios (Vaz, 2011).

Tabela 2 - Composição do meio de cultivo 2xTY (pH 7,0)

Nutriente Composição (g/L)

Triptona 16,0

Extrato de Levedura 10,0

NaCl 5,0

45

4. Metodologia


4.2.2 Cultivo e indução

O clone foi cultivado em biorreator de bancada Biostat B (B. Braun Biotech

International) com um volume de trabalho de 1,5 L, a 37ºC, 400 rpm e uma vazão de aeração

de 1,0 - 1,5 L/min, durante 3 horas. Nesse método, 1350,0 mL do meio de cultivo 2xTY, foram

suplementados com 1,5 mL de ampicilina (0,1 g/L) e 1,5 mL de canamicina (0,025 g/L) e

inoculados com 150,0 mL de inóculo na fase exponencial do crescimento. No cultivo, o pH do

meio foi mantido em 7,0 com a adição automática de uma solução de NH4OH (25,0 %) ou HCl

(1,0 N). Após uma hora do início do cultivo, o mesmo foi induzido pela adição de 150,0 mL de

lactose para concentração final de 10,0 g/L (Vaz, 2011). A Figura 6 ilustra o biorreator de

bancada onde foram realizados os cultivos.

Figura 7 - Biorreator de bancada Biostat B.

Decorrido as 3 horas, as células foram separadas por centrifugação a 2800 rpm, durante

30 min, segundo Vaz (2011). As células sedimentadas foram ressuspensas em tampão de lise

apropriado conforme método de rompimento, para obter uma suspensão com concentração

celular de 5,0 % (p/v).

4.2.3 Escolha do método para o rompimento celular

Com o objetivo de avaliar a melhor técnica para a lise celular, foi elaborado um

planejamento fatorial completo 22 para cada método analisado (lisozima, pérolas de vidro, ureia

46

4. Metodologia


e EDTA - Mg2+). Os planejamentos analisaram dois fatores, com dois níveis e duplicata no

ponto central, totalizando 6 experimentos.

A resposta do planejamento foi avaliada em termos da concentração de proteínas totais

e da quantidade de antígeno 503 liberada. A análise dos efeitos das variáveis sobre a resposta

foi feita usando o software Statistica 7.0 (StatSoft), com uma significância estatística de 95,0

%.

4.2.3.1 Método de lise enzimática

Nesse método a enzima utilizada para o rompimento celular foi a lisozima.

Primeiramente, as células foram ressuspensas no tampão de lise (30,0 mM Tris-HCl, 30,0 mM

NaCl, pH 8,0) e, em seguida, rompidas com 0,1 – 0,5 mg/mL de lisozima na presença de 20,0

mM de MgCl2. Para tal, um volume de 5,0 mL da suspensão foi agitada em shaker, a 100 rpm

e 25 °C, durante um de tempo de 30 a 60 minutos (Ho et al., 2006; Haddad et al., 2015),

conforme mostra a Tabela 3. As células foram centrifugadas a 2800 rpm, por 30 minutos e o

sobrenadante recolhido para análise de proteínas totais e antígeno 503. Os fatores e os níveis

analisados para esse método estão apresentados na Tabela 3.


lisozima.

Fatores Variáveis codificadas Níveis

-1 0 1

Concentração lisozima (mg/mL) X1 0,1 0,3 0,5

Tempo (min) X2 30,0 45,0 60,0

4.2.3.2 Método de pérolas de vidro

As células foram ressuspensas no tampão de lise (30,0 mM Tris-HCl, 30,0 mM NaCl

30,0, pH 8,0), homogeneizadas no vórtex, e logo após, 5,0 mL da suspensão foi agitada com

0,1 – 1,0 g de pérola de vidros/mL de suspensão em um tempo variando de 5,0 a 10,0 minutos,

conforme a Tabela 4. Em seguida, as células foram centrifugadas a 2800 rpm, por 30 minutos

e o sobrenadante recolhido para análise de proteínas totais e antígeno 503.

47

4. Metodologia



pérolas de vidro.


-1 0 1

Razão (g pérolas/mL de

suspensão) X1 0,1 0,55 1,0

Tempo (min) X2 5,0 7,5 10,0

4.2.3.3 Método de rompimento celular usando ureia

Para esse rompimento celular as células foram ressuspensas em um tampão de lise a

base de ureia (100,0 mM NaH2PO4, 10,0 mM Tris-HCl, 2,0 – 8,0 mol/L ureia, pH 8,0) e 5,0

mL da suspensão foi homogeneizada no vórtex, durante 15 a 60 minutos (Vaz, 2011), como

apresentado na Tabela 5. Para remover os resíduos celulares realizou-se centrifugação a 2800

rpm por 30 minutos e o sobrenadante foi recolhido para análise de proteínas totais e antígeno

503. As variáveis analisadas, concentração de ureia e tempo, e os seus respectivos níveis são

mostrados na Tabela 5.

Tabela 5 - Fatores, variáveis codificadas e níveis para o planejamento experimental usando a

ureia.


-1 0 1

Concentração de ureia (mol/L) X1 2,0 5,0 8,0

Tempo (min) X2 15,0 37,5 60,0

4.2.3.4 Método de rompimento celular usando EDTA - Mg2+

Nesse procedimento as células foram ressuspensas no tampão de lise (200,0 mM ácido

bórico, 150,0 mM NaCl, 1,0 – 5,0 mM EDTA, 5,0 mM MgSO4, pH 8,0) e 5,0 mL das

suspensões foram agitadas no shaker, a 4 °C e 70 rpm, por um tempo de 6,0 a 12,0 horas (Xiang

et al., 2002), de acordo com a Tabela 6. Em seguida, como descrito nos métodos anteriores,

cada suspensão foi centrifugada a 2800 rpm por 30 minutos e o sobrenadante foi recolhido para

análise de proteínas totais e antígeno 503.

48

4. Metodologia


Tabela 6 - Fatores, variáveis codificadas e níveis para o planejamento experimental usando o

EDTA - Mg2+.


-1 0 1

Concentração de EDTA (mM) X1 1,0 3,0 5,0

Tempo (horas) X2 6,0 9,0 12,0

4.2.4 Triagem do íon metálico

Essa etapa teve como objetivo avaliar o íon metálico que apresenta maior capacidade de

adsorção do antígeno, para isso cinco metais foram estudados: Cu2+, Ni2+, Zn2+, Co2+ e Fe3+,

em diferentes concentrações da solução de sulfato do metal analisado. A resina foi carregada

com os íons com auxílio de um sistema de filtração à vácuo. Primeiramente, 3,0 mL do

adsorvente foi lavado com 30,0 mL de água destilada e, em seguida, carregado com 15,0 mL

da solução de sulfato de íon analisado nas concentrações de 0,1, 0,5 e 0,8 mol/L . Para garantir

a adsorção do metal na resina aguardou-se um tempo de 15 minutos. Para remover os íons

fracamente ligados, a resina foi lavada com 30,0 mL de tampão (100,0 mM acetato de sódio,

0,5 M cloreto de sódio, pH 4,0). Por último, a resina foi lavada com 15,0 mL de água destilada

(Clemmitt & Chase, 2000).

Após a etapa acima, a resina foi previamente equilibrada com tampão de equilíbrio (20,0

mM NaH2PO4, 2,4 M NaCl e 10,0 mM imidazol, pH 8,0) e, em seguida, 0,75 mL dessa resina

e 0,75 mL do lisado celular a 5% de biomassa, foram transferidos para microtubos. A mistura

foi incubada em shaker, durante duas horas, a 25 °C e 100 rpm. Em seguida, o sobrenadante foi

retirado e a quantidade de proteína total não ligada foi determinada pelo método de Lowry. Para

o antígeno 503 realizou-se a eletroforese para posterior quantificação utilizando o software

Image J. A quantidade de antígeno adsorvido na fase sólida foi determinada de acordo com a

Equação (6). Esse procedimento foi realizado em triplicata para cada íon analisado.

q=V(C0-C)

Vads (6)

Em que, q corresponde a quantidade de antígeno adsorvido na resina (mg/mL) , V o

volume de extrato bruto (mL), C0 o valor de concentração de antígeno inicial (mg/mL), c indica

a concentração da proteína de interesse no equilíbrio (mg/mL) e Vads o volume de adsorvente

utilizado (mL).

49

4. Metodologia


4.2.5 Isoterma de adsorção

De início foram realizadas diferentes diluições do extrato bruto contendo o antígeno 503

em um tampão de lise (100,0 Mm NaH2PO4, 10,0 mM Tris-HCl, 8,0 M ureia, pH 8,0),

determinado através da seção 4.2.3.3.

Em Erlenmeyers de 50,0 mL foi adicionado 5,0 mL de cada diluição, juntamente com

0,1 g do adsorvente ligado ao íon metálico selecionado no item 4.2.4, essa mistura foi mantida

em shaker, a 25 °C e 100 rpm, durante duas horas, para assegurar o equilíbrio entre as fases

sólida e líquida. Em seguida, a fase líquida foi recolhida, para a quantificação de proteínas, e a

concentração de antígeno 503 adsorvida foi quantificada por um balanço de massa. O

comportamento de equilíbrio de adsorção foi avaliado pelo modelo de isoterma de Langmuir,

de acordo com a Equação (7). A regressão não linear dos dados foi realizada utilizando o

software Statistica 7.0 (StatSoft) (Sousa Junior et al., 2015).

q=q

máxc

kd+c (7)

Sendo q a quantidade de proteína alvo adsorvida na resina, c representa a concentração

de equilíbrio da proteína alvo não adsorvida, 𝑞𝑚á𝑥 indica a capacidade de ligação máxima, e

𝑘𝑑 é a constante de dissociação, que pode ser derivada a partir da regressão linear do gráfico de

Langmuir.

4.2.6 Purificação do antígeno 503 e remoção de LPS utilizando ALE

Para purificação do antígeno 503 e simultânea remoção do LPS utilizando ALE,

aproximadamente 27,0 mL da resina Streamline Chelating carregada com o íon metálico

selecionado foi vertida na coluna de ALE para dar uma altura de leito sedimentado igual a 5,0

cm, conforme descrito por Sousa Junior et al. (2015). Primeiramente, o adsorvente foi

equilibrado com o tampão de equilíbrio (20,0 mM NaH2PO4, 2,4 M NaCl e 10,0 mM imidazol,

pH 8,0) a uma velocidade linear de 150 cm/h, obtendo um grau de expansão de

aproximadamente 2,0. Em seguida, 100,0 mL do homogeneizado de E. coli M15 foi bombeado

para a coluna com uma velocidade linear do fluido de 150 cm/h, no sentido ascendente.

Posteriormente, a resina foi lavada com 50,0 mL de um tampão mantido em um banho

refrigerado a 4 °C, composto por: 20,0 mM NaH2PO4, 10,0 mM imidazol, 2,4 M NaCl, 10,0%

glicerol e Triton X-114. Destaca-se que foram analisadas três concentrações de Triton X-114:

50

4. Metodologia


0,01%, 0,05% e 0,1%, durante essa etapa de lavagem visando a remoção do LPS. Ainda nessa

etapa de lavagem, foram adicionados 100,0 mL do tampão de lavagem, cuja composição é: 20,0

mM NaH2PO4, 10,0 mM imidazol, 1,625 M NaCl e 10,0% glicerol, pH 8,0. A seguir, a etapa

de eluição foi realizada de forma isocrática conforme otimizado por Sousa Junior et al. (2015)

e em degrau, com o leito sedimentado e uma velocidade de 50 cm/h. Os tampões utilizados

apresentam a seguinte composição: 20,0 mM NaH2PO4, 1,0 M NaCl, pH 7,0, variando a

concentração de imidazol, conforme segue na Tabela 7. Em cada etapa foram recolhidas

amostras de 10,0 mL, para uma posterior análise de concentração de proteína total e do antígeno

503. Por fim, a resina Streamline Chelating utilizada foi regenerada de acordo com Amersham

Pharmacia Biotech (1997), utilizando NaOH 1,0 M, durante um tempo de contato de 1 hora,

seguido pela aplicação de 250,0 mL de uma solução contendo EDTA (20,0 mM NaH2PO4, 0,5

M NaCl, 50,0 mM EDTA, pH 7,4) para remoção do íon metálico e por último a resina foi lavada

com 250,0 mL de água destilada.

Tabela 7- Condições de eluição para purificação do antígeno 503.

Ensaios Eluição Concentração de imidazol (mol/L)

1 Isocrática 0,6

2 Degrau 0,6 – 1 mol/L

3 Degrau 0,3 – 0,6 mol/L

4.2.7 Determinação da concentração de proteínas totais

A quantificação das proteínas totais nas amostras foi realizada pelo método de Lowry

(Lowry et al., 1951). O princípio desse método baseia-se numa mistura do reagente Folin-

Ciocalteau, que sofre uma redução quando reage com proteínas, na presença do catalisador

cobre (II), resultando em uma coloração azul esverdeada intensa e esse composto apresenta

absorção máxima em 750 nm (Zaia et al., 1998). A proteína albumina de soro bovino (BSA)

foi usada como padrão na concentração de 0,01 a 0,1 (mg/mL).

51

4. Metodologia


4.2.8 Eletroforese em gel de poliacrilamida

Todas as amostras foram avaliadas quanto à presença do antígeno 503 por eletroforese

em gel de poliacrilamida a 12% conforme metodologia descrita por Laemmli (1970).

As amostras foram inicialmente dialisadas em membranas com poro de 12,0 kDa contra

4 L de água deionizada, a 4 °C por 18 horas. Para cada ponto foi utilizada a concentração de 40

µg/µL, concentrados no aparelho Centrivap Concentrator (Labconco, EUA). Imediatamente

antes de aplicadas no gel, as alíquotas foram ressuspensas em tampão de amostra (0,06 mM

Tris-HCl, 10,0 % glicerol, 2,0 % SDS, 5,0 % 2-mercaptoetanol e 0,4 % azul de bromofenol,

pH=6,8) e desnaturadas por aquecimento a 90 ºC por 5 minutos em banho Maria. Preparou-se

um gel de poliacrilamida a 12% e a separação eletroforética foi realizada utilizando uma cuba

vertical MiniVE (GE Healthcare, Suécia) contendo tampão de corrida (25,0 mM Tris-HCl,

192,0 mM Glicina, 0,1 % SDS, pH= 8,3) a uma voltagem de 150 V. Após o término da corrida,

o gel obtido foi revelado pela coloração com nitrato de prata. Em todos os géis utilizou-se o

marcador de baixa massa molecular (GE Healthcare, Suécia) contendo a mistura de seis

proteínas: α-lactalbumina (14,4 kDa), inibidor de tripsina (20,1 kDa), anidrase carbônica (30,0

kDa), ovalbumina (45,0 kDa), albumina (66,0 kDa) e fosforilase b (97,0 kDa).

4.2.9 Determinação da concentração de antígeno 503

A concentração do antígeno 503 foi determinada por densitometria das bandas de

proteínas separadas por eletroforese em gel de poliacrilamida (Seção 4.2.8) utilizando-se o

software Image J, no qual a imagem digitalizada do gel foi processada gerando curvas, cujos

picos são proporcionais a largura e a intensidade de coloração das bandas presentes. O programa

utilizou integrações simples para transformar as áreas sob as curvas em valores numéricos.

Somando-se as áreas de todos os picos obtidos foi possível obter o valor numérico

correspondente à concentração de proteínas totais observadas no gel (APT). Quantificando

apenas a área sob a curva correspondente à proteína recombinante de interesse (API) obteve-se

o valor numérico representativo do antígeno 503 e a partir destes dois valores calculou-se a

fração relativa da proteína recombinante.

A concentração do antígeno 503(Ca503

)é dada pela Equação 8:

Ca503=API

APT*CPT (8)

52

4. Metodologia


Onde, 𝐶𝑃𝑇 é a concentração de proteínas totais (mg/mL), estimada pelo método de

Lowry.

4.2.10 Determinação de LPS

A concentração de LPS em amostras de proteína foi medida por um método

cromogênico cinético usando o Kit de LAL cinético-QCL®, conforme manual do fabricante

Lonza (2011) e Sousa Junior (2015).

Para preparo da curva de calibração, a endoxina padrão liofilizada foi reconstituída com

1,0 mL água apirogênica, tendo uma concentração final de 50,0 EU/mL. Após a reconstituição,

agitou-se vigorosamente por 15 minutos em vórtex. A partir da endotoxina padrão reconstituída,

preparou-se diluições seriadas, a fim de se obter as concentrações de endotoxina com 25,0

EU/mL, 5,0 EU/mL, 0,5 EU/mL, 0,05 EU/mL e 0,005 EU/mL.

O reagente LAL foi reconstituído com 2,6 mL de água apirogênica, imediatamente antes

de seu uso e agitado suavemente para evitar a formação de bolhas. Para realização do teste,

após a diluição, 100,0 µL de cada amostra, padrões, controle negativo (água apirogênica) e

controle positivo (endotoxina 25,0 EU/mL) foram aplicados em duplicata em microplaca de 96

orifícios. Em seguida, com auxílio de uma pipeta de 8 canais, adicionou-se 100,0 µL do

reagente LAL e a microplaca foi incubada e monitorada em intervalos de 2,0 minutos até o

aumento da DO (λ = 405 nm) em 0,2 em relação ao valor inicial. Uma concentração padrão de

LPS 25,0 EU/mL foi usada como controle positivo e os resultados dos testes foram

considerados válidos quando o valor de concentração de LPS foi recuperado entre 50 e 200%.

A água e as ponteiras utilizadas nas diluições dos padrões e das amostras foram apirogênicas e

a toda a vidraria utilizada nas diluições foi previamente despirogeneizada a 250 ºC por duas

horas.

4.2.11 Cálculos

A pureza do antígeno 503, o rendimento (%) e o fator de purificação (FP) foram

determinados de acordo com as equações (9), (10) e (11), respectivamente.

Pureza do antígeno 503=Quantidade de antígeno 503 recuperado

Quantidade de proteína total (9)

53

4. Metodologia


Rendimento (%)=Quantidade de antígeno 503 recuperado

Quantidade de antígeno 503 no extrato bruto*100% (10)

Fator de purificação = Pureza do antígeno 503

Pureza do antígeno 503 no extrato bruto (11)

CAPÍTULO V

RESULTADOS E DISCUSSÕES

55

5. Resultados e Discussões



Neste capítulo são exibidos e discutidos os resultados para a melhor técnica de lise celular,

avalia-se o íon que proporciona maior capacidade de adsorção do antígeno 503 através da

triagem realizada, apresentando também a isoterma de adsorção, bem como os resultados

obtidos ao realizar os ensaios de ALE.

5.1 Escolha do método para o rompimento celular

De acordo com o que foi apresentado na seção 4.2.3, os planejamentos fatoriais

completos 22 foram realizados para avaliar quatro métodos de rompimento celular de E. coli,

buscando-se determinar qual estratégia possibilita a maior liberação de proteínas intracelulares,

como o antígeno 503 recombinante. Os resultados adquiridos para cada planejamento são

apresentados nas Tabelas 8, 9, 10 e 11. As maiores respostas de concentração de proteínas totais

(CPT) e de antígeno 503 (Ca503) obtidas para cada método de rompimento encontram-se em

destaque nas tabelas abaixo.

Tabela 8 - Resultados de concentração de proteína total e antígeno 503 para o método de lise

enzimática (lisozima).

Ensaios X1 X2 CPT (mg/mL) Ca503 (mg/mL)

1 -1 -1 0,423 ± 0,011 0,018 ± 0,001

2 +1 -1 0,822 ± 0,004 0,063 ± 0,003

3 -1 +1 0,467 ± 0,009 0,023 ± 0,001

4 +1 +1 0,883 ± 0,009 0,068 ± 0,001

5* 0 0 0,861 ± 0,004 0,065 ± 0,001

6* 0 0 0,770 ± 0,013 0,060 ± 0,002

* Ponto Central.

Tabela 9 - Resultados de concentração de proteína total e antígeno 503 para o método pérolas

de vidro.


1 -1 -1 0,376 ± 0,007 0,013 ± 0,002

2 +1 -1 0,458 ± 0,002 0,018 ± 0,001

3 -1 +1 0,506 ± 0,004 0,026 ± 0,002

4 +1 +1 0,475 ± 0,004 0,021 ± 0,002

5* 0 0 0,480 ± 0,002 0,023 ± 0,001

6* 0 0 0,506 ± 0,004 0,027 ± 0,002 * Ponto Central.

56



Tabela 10 - Resultados de concentração de proteína total e antígeno 503 para o método da

ureia.


1 -1 -1 0,683 ± 0,005 0,030 ± 0,003

2 +1 -1 1,575 ± 0,006 0,140 ± 0,001 3 -1 +1 0,675 ± 0,002 0,029 ± 0,002

4 +1 +1 1,566 ± 0,007 0,130 ± 0,002

5* 0 0 1,090 ± 0,003 0,071 ± 0,002

6* 0 0 0,987 ± 0,007 0,074 ± 0,005

* Ponto Central.

Tabela 11 - Resultados de concentração de proteína total e antígeno 503 para o método de

EDTA - Mg2+.


1 -1 -1 0,532 ± 0,004 0,027 ± 0,002

2 +1 +1 0,510 ± 0,002 0,025 ± 0,002

3 -1 -1 0,545 ± 0.002 0,029 ± 0,003

4 +1 +1 0,558 ± 0,002 0,029 ± 0,001 5* 0 0 0,506 ± 0,002 0,022 ± 0,002

6* 0 0 0,493 ± 0,002 0,019 ± 0,002

* Ponto Central.

Ao comparar os resultados obtidos nos quatro planejamentos experimentais, observou-

se que o método para rompimento celular de E. coli utilizando a ureia foi o mais eficiente, uma

vez que forneceu as maiores concentrações de proteína total e do antígeno 503 no sobrenadante.

De acordo com Burden (2012), a ureia é um agente caotrópico que age interrompendo

as interações fracas entre as moléculas, como as ligações de hidrogênio e interações

hidrofóbicas entre as proteínas. Altas concentrações desse agente caotrópico solubilizam os

corpos de inclusão e, por outro lado, baixa concentração de ureia não desnatura completamente

as moléculas de proteínas solubilizadas (SINGH et al., 2015).

Nesse caso, como destacado na Tabela 10, os maiores valores obtidos corresponderam

aos ensaios 2 e 4, sendo os do segundo ensaio de 1,575 mg/mL e 0,140 mg/mL para

concentração de proteína total e concentração de antígeno 503, respectivamente, e para o ensaio

4 de 1,566 mg/mL para concentração de proteína total e 0,130 mg/mL para concentração de

antígeno, estes valores foram obtidos ao se utilizar a maior concentração de ureia (8,0 mol/L).

Observa-se ainda que o segundo melhor método de rompimento, que favoreceu a liberação do

antígeno 503, foi o método enzimático utilizando lisozima.

57



E. coli é uma bactéria Gram-negativa e, deste modo, menos sensível a lisozima. Logo,

observou-se que a lisozima por si só não é um método eficiente para o rompimento dessa

bactéria. Estudos mostram que para obter melhores resultados com esse método de lise

enzimática, este é normalmente combinado com um dos métodos mecânicos de ruptura de

células (Peternel & Komel, 2010; Haddad et al., 2015).

Destaca-se também que os métodos de rompimento com pérolas de vidro e EDTA -

Mg2+ apresentaram resultados semelhantes para concentração de proteína total e do antígeno

503. E em ambos, a liberação do antígeno de interesse pareceu pouco influenciado pelos fatores

avaliados neste trabalho (concentração/razão e tempo).

Para o método que utilizou pérolas de vidro, as maiores respostas foram alcançadas na

condição do ponto central, utilizando 0,55 g pérolas/mL de suspensão e um tempo de agitação

em vórtex de 7,5 minutos. Numanoglu & Sungurl (2004) estudaram a extração de β-

galactosidase de Kluyveromyces lactis ATCC8583 utilizando esse mesmo método e observaram

que acima de 0,60 g pérolas de vidro/mL de suspensão celular, para extrair a enzima, não houve

aumento na atividade enzimática. Isso também foi verificado no presente trabalho, em que o

maior nível avaliado no planejamento (1,0 g pérolas/mL de suspensão) não produziu aumento

nas concentrações de proteína total e antígeno 503.

Os resultados de concentração de proteína total e antígeno 503 mostrados nas Tabelas

8, 9, 10 e 11 foram analisados através dos diagramas de Pareto e gráficos de superfície de

resposta, com auxílio do software Statistica 7.0 (StatSoft).

As Figuras 8 e 9 ilustram o diagrama de Pareto e as superfícies de resposta para o

planejamento utilizando o método de lise enzimática. Através dos diagramas de Pareto (Figuras

8a e 9a), para um nível de significância (ou confiança) de 95%, percebe-se que os fatores

concentração de lisozima (X1), tempo (X2) e a interações entre esses dois fatores (X1X2) não

apresentaram efeito significativo para nenhuma das respostas (Cpt e Ca503). E as superfícies de

resposta para ambas as respostas apresentaram comportamento semelhante, os valores máximos

são alcançados à medida que ocorre o aumento na concentração de lisozima. Além disso,

alterações na variável tempo não resultaram em diferenças consideráveis nas respostas, como

pode ser observado nas Figuras 8b e 9b.

58



a) b)



concentração de proteína total obtida.

a) b)



concentração de antígeno 503 obtida.

A análise estatística dos métodos que utilizaram pérolas de vidro e EDTA - Mg2+ para

o rompimento celular mostrou comportamento semelhante ao de lise enzimática. Em que os

fatores analisados em cada método e as suas interações, para o mesmo nível de confiança (95%),

não apresentaram efeito significativo sobre as respostas proteína total e antígeno 503, como

pode ser visto nos diagramas de Pareto representados pelas Figuras 10a e 11a, para o método

de pérolas de vidro, e as Figuras 12a e 13a para a lise utilizando o EDTA - Mg2+. Analisando

as superfícies de respostas do planejamento com pérolas de vidro (Figuras 10b e 11b) observa-

se que a concentração de proteína total é maior à medida que o tempo aumenta e que a variável

razão de g pérolas/mL de suspensão não apresenta diferenças significativas. Para a resposta em

59



termos de concentração de antígeno 503 maiores valores são alcançados com a diminuição da

razão de g pérolas/mL de suspensão e aumento da variável tempo. As Figuras 12b e 13b ilustram

as superfícies de respostas para o método de ruptura utilizando EDTA - Mg2+ e tem-se que a

concentração de proteína total e do antígeno 503 aumentam com o acréscimo do tempo,

enquanto que a variação na concentração de EDTA não influenciam de maneira significativa

nas respostas.

Como os três métodos citados anteriormente não apresentaram efeito significativo nas

suas respostas não serão apresentadas as equações do modelo para estes planejamentos.

a) b)

Figura 10 -(a) Diagrama de Pareto para a concentração de proteína total e (b) superfície de


tempo (X2) na concentração de proteína total obtida.

a) b)



tempo (X2) na concentração de antígeno 503 obtida.

60



a) b)




a) b)

Figura 13 - (a) Diagrama de Pareto para a concentração de antígeno e (b) superfície de



As Figuras 14 e 15 mostram o diagrama de Pareto e a superfície de resposta para o

planejamento que utilizou a ureia, tendo como resposta a concentração de proteínas totais e do

antígeno 503, respectivamente. Analisando os diagramas de Pareto (Figuras 14a e 15a) observa-

se que, para um nível de confiança de 95%, apenas a concentração de ureia influencia a resposta,

ou seja, apenas a concentração de ureia apresenta efeito significativo sobre as variáveis

resposta, com efeito positivo, o que implica dizer que maiores concentrações de proteína total

e do antígeno de interesse são obtidas na maior concentração de ureia. O tempo e a interação

61



entre as variáveis não apresentaram efeito significativo. As superfícies de resposta para ambos

os modelos apresentaram comportamento semelhante, em que maiores respostas são alcançadas

à medida que ocorre o aumento na concentração de ureia e a variação nos níveis da variável

tempo não resulta em diferenças consideráveis. Conforme pode ser visto nas Figuras 14b e 15b.

a) b)




a) b)




Os resultados mostram que a concentração de ureia utilizada para a lise celular deve ser

de 8 M. Estudos realizados por Vaz et al. (2011) e Sousa Junior et al. (2015), relatam o

62



rompimento celular da E. coli utilizando tampão de lise com essa mesma concentração (8 M)

de ureia para liberação do antígeno 503. Falconer et al. (1996), em seu estudo analisaram a lise

celular da E. coli, utilizando no tampão uma combinação do agente quelante EDTA com a ureia,

variando a concentração de ureia em 0, 2, 4, e 6 M, e perceberam que as maiores concentrações

de ureia, no caso estudado 6 M, é eficaz para a liberação de proteínas intracelulares.

Vaz et al. (2011) ao utilizarem a E. coli M15 expressando o mesmo antígeno relatam

que as células foram homogeneizadas juntamente com o tampão de lise no vórtex por um tempo

de 15 a 60 minutos. Dessa forma, conforme apresentado no diagrama de Pareto pode-se

observar que a variável tempo não apresenta influência significativa sobre as respostas

estudadas, o que significa dizer que o tempo correspondente a 15 minutos é o suficiente para

romper a célula da E. coli fornecendo valores elevados de proteína total e antígeno 503. Assim,

passou-se a utilizar a estratégia de rompimento celular com ureia 8 M sob agitação em vórtex

por 15 minutos em todas etapas seguintes deste trabalho.

Baseado no planejamento fatorial completo 22 para o método utilizando a ureia obteve-

se as Equações (12) e (13) do modelo de primeira ordem para ambas as respostas, as quais

expressam a concentração de proteína total (mg/mL) e a concentração do antígeno 503 (mg/mL)

em função da concentração de ureia (X1) e do tempo (X2).

Cpt=1,0960+0,4458X1-0,0043X2-0,0002X1X2 (12)

Ca503=0,0790+0,0527X1-0,0027X2-0,0022X1X2 (13)

Através da análise de variância (ANOVA), percebe-se que os modelos estatísticos para

concentração de proteína total e concentração de antígeno 503, a um nível de significância de

95 %, apresentaram coeficiente de regresssão (R2) de 98,12 % e 98,84 %, respectivamente.

Com base no teste F, os modelo apresentado através da Equação 12 é estatisticamente

significativo, pois a razão entre o Fcal (34,82) e o Ftab (19,16), para variação de regressão e

resíduos, foi maior do que 1, e é preditivo, uma vez que, considerando o erro puro e a falta de

ajuste, a razão entre o Fcal (1,87) e o Ftab (161,40) foi menor do que 1. Da mesma forma, o

modelo representado pela Equação 13 também é significativo e preditivo. Com estes dados

obtidos pela ANOVA pode-se concluir que os modelos descrevem bem os dados experimentais

estabelecidos.

A Figura 16 ilustra a eletroforese com gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) 12,0 %

contendo as amostras de proteínas obtidas com o rompimento utilizando ureia, a coloração foi

63



obtida com o nitrato de prata. Cada coluna correspondente a um ensaio do planejamento fatorial

realizado. Vale ressaltar que o antígeno 503 apresenta uma massa molecular de 56 kDa (Martins

et al., 2006; Vaz et al., 2011; Sousa Junior et al., 2015). As colunas 2 e 4, referem-se aos ensaios

que resultaram em menores concentrações de proteínas totais e de antígeno 503,

correspondendo aos ensaios 1 e 3 do rompimento celular, em que a menor concentração de

ureia (2,0 M) foi aplicada.

Figura 16 - Gel de eletroforese (SDS-PAGE) mostrando o perfil protéico apresentado para

cada ensaio do planejamento. Coluna 1: Padrão de massa molecular; Coluna 2: Ensaio 1 (2,0

M e 15 min); Coluna 3: Ensaio 2 (8,0 M e 15 min); Coluna 4: Ensaio 3 (2,0 M e 60 min);

Coluna 5: Ensaio 4 (8,0 M e 60 min); Coluna 6 e 7: Ensaios 5 e 6 (5,0 M e 37,5 min).

5.2 Triagem do íon metálico

Conforme descrito na seção 4.2.4, avaliou-se o íon imobilizado na resina que apresentou

maior capacidade de adsorção (q) do antígeno 503 com a resina Streamline chelating. Dentre

os cinco íons analisados, o cobre foi o que apresentou valores mais elevados de adsorção, sendo

de 0,102, 0,128 e 0,111 mg/mL de adsorvente, para as concentrações de 0,1, 0,5 e 0,8 M,

respectivamente. Para determinar a concentração do íon a ser usada para carregar a resina nos

ensaios de coluna operando em leito expandido, os resultados obtidos foram analisados no

software Statistica 7.0 (StatSoft), por meio do Teste de Tukey, o qual corresponde a um teste

de comparação de média. De acordo com este teste observou-se que os valores de adsorção do

antígeno para o íon Cu2+ não apresenta diferença significativa para as três concentrações

kDa

97.0

66.0

45.0

30.0

20.1

1 2 3 4 5 6 7

64



analisadas, então a de 0,1 M foi utilizada nos próximos ensaios. A Figura 17 apresenta os

valores de adsorção para cada íon estudado.

Figura 17 - Capacidade de adsorção do antígeno 503 para os íons estudados.

Através desse gráfico é possível estabelecer uma ordem da capacidade de adsorção:

Cu2+ > Ni2+ > Fe3+ > Zn2+ > Co2+.

Essa ordem pode ser correlacionada ao potencial de redução dos íons metálicos

analisados. Sabe-se que o potencial de redução é a tendência que uma espécie química tem de

ganhar elétrons, e dessa maneira ser reduzida no processo.

De acordo com a tabela do potencial de redução que tem como referência o eletrodo

padrão de hidrogênio (Anexo I), percebe-se que os íons metálicos estudados apresentam a

seguinte ordem de potencial de redução: Fe3+ > Cu2+ > Ni2+ > Co2+ > Zn2+. Logo, percebe-se

que a ordem da capacidade de adsorção dos íons avaliados, apresentou uma similaridade à

ordem do potencial de redução, com exceção dos íons Fe3+ e Co2+. Vale a pena ressaltar que

além do potencial de redução, outros fatores como a eletronegatividade, tipos de ligações

(iônica ou covalente), polarizabilidade das espécies envolvidas, disponibilidade do doador de

elétrons, pH, força iônica e tipo de sal utilizado podem ter influência nessas interações (Bresolin

et al., 2009).

Em IMAC a adsorção de proteínas é baseada na coordenação entre um ión metálico

imobilizado e grupos doadores de eletróns a partir da superfície da proteína, os quais agem

65



como base de Lewis. Os íons mais comumente utilizados são os ións de metais de transição

Cu2+, Ni2+, Zn2+, Co2+ e Fe3+ e estes atuam como ácidos de Lewis, ou seja, aceptores de pares

de elétrons (Gaberc-Porekar & Menart, 2001).

Segundo Chaga (2001), espera-se que cerca de 50% das proteínas provenientes de

amostras biológicas podem ser retidas em Cu2+ imobilizado, sendo que esse número cai

significativamente se Ni2+, Co2+e Zn2+ são utilizados, pois estes últimos apresentam requisitos

mais rigorosos para os locais de ligação.

Gaberc-Porekar & Menart (2001) citam que quando se trata de resina com o ligante

Ácido Iminodiacético (IDA), como é o caso da Streamline chelating utilizada nesse estudo, a

afinidade de muitas proteínas retidas apresenta a seguinte ordem: Cu2+ > Ni2+ > Zn2+ ≥ Co2+.

Portanto, quando se analisa os quatro íons citados anteriormente observa-se que o antígeno 503

apresenta essa mesma ordem de afinidade.

Dalal et al. (2008) realizaram um estudo para purificar uma proteína recombinante

com cauda de histidina expressa em E. coli e analisaram o carregamento da resina Streamline

chelating, com 0,1 M da solução de sulfato de três metais diferentes: Cu2+, Ni2+ e Zn2+. De

maneira semelhante ao obtido neste trabalho, o cobre foi o íon que apresentou maior capacidade

de adsorção para a proteína e a capacidade de adsorção assumiu a seguinte ordem: Cu2+ > Ni2+>

Zn2+.

Em outro estudo, Clemmitt & Chase (2000) avaliaram a seletividade e a capacidade de

adsorção de 0,05 M dos íons metálicos Cu2+, Ni2+ e Zn2+ na resina Streamline chelating, para a

purificação de uma enzima intracelular, β-galactosidase, recombinante expressa em E. coli.

Eles observaram que o Cu2+ apresentou maior capacidade de adsorção, porém um grande

número de proteínas contaminantes também se ligaram a resina reduzindo assim a purificação.

O Ni2+, por sua vez, também adsorveu a enzima de interesse, mas por outro lado proporcionou

uma menor quantidade de adsorção de proteínas totais, tornando possível uma purificação mais

elevada. O Zn2+ foi o que apresentou uma menor quantidade de adsorção da proteína de

interesse. Então, nesse caso o Ni2+ mostrou-se mais seletivo e foi escolhido para ser carregado

na Streamline chelating.

66



5.3 Isoterma de adsorção

A isoterma foi realizada conforme a metodologia descrita no item 4.2.5 e representa

graficamente a quantidade de antígeno 503 adsorvido por unidade de massa de adsorvente como

uma função da concentração de equilíbrio do antígeno 503 no tampão de lise, como ilustrado

na Figura 18.

Figura 18 - Isoterma de adsorção para o antígeno 503 na resina Streamline Chelating.

Observando a Figura 18 percebe-se que o modelo de Langmuir se ajustou bem aos

dados experimentais, com R2 = 0,9885. A capacidade máxima de adsorção (qmáx

) do antígeno

503 à resina Streamline chelating foi de 3,07 mg de proteína/g de adsorvente, e a constante de

dissociação (kd) foi de 0,13 mg/mL.

Estudos realizados por Sousa Junior et al. (2015), mostram que os dados também se

ajustaram relativamente bem ao modelo de Langmuir e apresentam, para a adsorção do mesmo

antígeno de interesse (503) usando o íon metálico Ni2+ acoplado à mesma resina (Streamline

chelating), a capacidade máxima de adsorção foi de 1,95 mg de proteína/g de adsorvente. Dessa

forma, comparando-se esse valor com o de 3,07 mg de proteína/g de adsorvente obtido neste

trabalho ratifica que o Cu2+ permite uma maior capacidade de ligação máxima para a proteína

de interesse. Outros estudos, como o realizado por Dalal et al. (2008) também mostram que, de

maneira semelhante ao obtido neste trabaho, a isoterma de adsorção da proteína de interesse na

resina Streamline – Cu2+ pode ser representado pelo modelo de Langmuir.

67



O modelo de Langmuir tem sido utilizado com frequencia para avaliar o

comportamento de adsorção de proteínas quando utiliza-se cromatografia por afinidade (Jiang

& Hearn, 1996).

5.4 Remoção de LPS

Na indústria biotecnológica o principal problema relacionado com a produção de

proteínas recombinantes em Escherichia coli é a presença de lipopolissacarídeos (LPS), já que

o LPS é derivado da membrana celular de bactérias Gram-negativas. Devido ao efeito tóxico

sobre seres humanos, é essencial remover LPS de preparações de produtos biológicos e

farmacêuticos (Magalhães et al., 2007).

Estudos realizados por Pestch & Anspach (2000), Wilson et al. (2001), Reichelt et al.

(2006), Cheng et al. (2008) e Sousa Junior (2015) demonstraram que Triton X-114 pode ser

aplicado para remoção de concentrações elevadas de LPS. Nesse contexto, foi avaliado a

quantidade mínima de tensoativo, Triton X-114 necessária para remoção do LPS e o tensoativo

foi aplicado durante a etapa de lavagem do ensaio de ALE, conforme o item 4.2.6. A

determinação de LPS foi realizada segundo o procedimento descrito na seção 4.2.10.

A temperatura e o volume do tampão de lavagem contendo o Triton-X 114, de 4,0 ºC e

50,0 mL, respectivamente, foram determinados de acordo com estudo realizado por Sousa

Junior (2015), no qual observou que para a remoção de LPS essas variáveis foram

estatisticamente significativas, influenciando de forma negativa no processo. Mostrando que

50,0 mL de tampão com Triton X-114 seguido por lavagem com 100 mL de tampão sem

tensoativo foi ligeiramente mais eficaz na remoção de endotoxinas e que executando o

procedimemento a 4,0 °C obteve-se uma boa eliminação de LPS.

Segundo Pestch & Anspach (2000) e Reichelt et al. (2006), o ponto de turvação desse

tensoativo é 22 °C e abaixo dessa temperatura o Triton X-114 dissocia de maneira eficiente

endotoxinas de proteínas.

As concentrações de Triton X-114 avalidas foram estimadas de acordo com estudos

relatados na literuratura. Reichelt et al. (2006), Zimmerman et al. (2006) e Sousa Junior (2015),

mostraram que a aplicação de apenas 0,1% de Triton X-114 na etapa de lavagem foi bem

sucedida para redução de endotoxina, removendo mais de 99 % do LPS inicial. Dessa forma,

concentrações de 0,01 %, 0,05% e 0,1 % de Triton X-114 foram aplicadas no tampão de

68



lavagem visando avaliar a quantidade mínima necessária para remoção de LPS e para isso foram

realizados três ensaios operando em coluna de leito expandido. Os valores obtidos para cada

ensaio estão apresentados na Tabela 12.

Tabela 12 - Percentagem de remoção de LPS nos ensaios de ALE.

Carga (UE/mL) Eluição (UE/mL) % Remoção LPS

Ensaio 1 (0,01 %) 5,48 x 105 1628,55 99,70

Ensaio 2 (0,05 %) 8,84 x 104 389,39 99,56

Ensaio 3 (0,1 %) 7,02 x 105 1628,55 99,77

De acordo com a Tabela 12, observa-se que para as três condições analisadas o

percentual de remoção de LPS foi elevado e que para a concentração mínima utilizada (0,01 %)

já foi obtida uma remoção de 99,70 %. Esses resultados confirmam o que já foi obtido em outros

estudos citados anteriormente, que a adição de baixas concentrações de Triton X-114 durante a

etapa de lavagem de processos cromatográficos é eficiente para remover mais de 99,0 % de

LPS. Portanto, o uso do tensoativo utilizado é eficaz na dissociação de endotoxinas fortemente

ligadas a proteínas recombinantes.

No entanto, mesmo após uma remoção de 98,0 a 99,0 % do LPS, a concentração residual

deste contaminante ainda pode ser elevada. O limite estabelecido para as quantidades de

endotoxinas permitidas em produtos farmacológicos injetáveis para humanos é de 5,0 UE por

kg de peso corporal por hora (Lopes et al., 2010). Nesse estudo, o terceiro ensaio, por exemplo,

apresentou uma maior remoção de endotoxinas (99,77 %), no qual o homogeneizado de E. coli

(carga) possuía inicialmente 7,02 x 105 EU/mL, e mesmo após 99,0 % de remoção a eluição

ainda apresentou uma concentração de LPS de 1628,55 UE/mL, o que pode representar uma

quantidade significativa, uma vez que tem-se como objetivo obter um produto para uso

intravenoso, tornando necessária uma etapa adicional para remoção do LPS residual. De

qualquer forma, uma estratégia que integra em apenas uma etapa os processos de clarificação,

recuperação, purificação e redução significativa de LPS a partir de um extrato não clarificado,

como a utilizada neste trabalho, parece ser muito vantajosa.

69



5.5 Purificação do antígeno 503 e remoção de LPS utilizando ALE

Para a purificação do antígeno 503 a partir do homogeneizado de E. coli não clarificado

utilizando uma coluna operando em leito expandido foi realizado o procedimento descrito na

seção 4.2.6. No primeiro ensaio a etapa de eluição foi realizada de forma isocrática, com a

concentração de imidazol de 0,6 M, conforme otimizado por Sousa Junior et al. (2015)

Realizou-se o ensaio com a concentração de Triton X-114 de 0,01 % no tampão de

lavagem, de acordo com o que foi apresentado anteriormente. A Figura 19 ilustra o

cromatograma obtido para esse ensaio de purificação e a Tabela 13 apresenta o balanço de

massa.

Figura 19 - Cromatograma do perfil de purificação do antígeno 503 a partir do

homogeneizado de E. coli não clarificado utilizando 0,01 % de Triton X-114 na etapa de

lavagem e a eluição isocrática.


clarificado para o ensaio com a eluição isocrática.

Etapas Volume

(mL)

Proteína

total (mg)

Antígeno 503

(mg)

Pureza do

antígeno 503

Rendimento

(%)

Fator de

Purificação

Homogeneizado

Celular 100 180,0 14,0 0,080 100,0 1,0

Passante 100 95,14 6,14 - - -

Lavagem 150 67,37 2,89 - - -

Eluição 100 19,65 0,42 0,021 3,0 0,26

70



Analisando a Tabela 13, observa-se que na etapa de carga foi perdido 95,14 mg de

proteína total e 6,14 mg de antígeno 503, isso implica dizer que, em relação ao que foi aplicado

teve-se uma perda de 52,85% e 43,85%, referente a massa de proteína total e antígeno 503,

respectivamente. Com os dados obtidos nessa tabela foi possível calcular a capacidade de

adsorção dinâmica do Cu2+ e foram obtidos valores de 4,37 mg proteína total/g de adsorvente e

0,82 mg antígeno 503/g de adsorvente. Comparando a capacidade de adsorção dinâmica obtida

nesse estudo com a obtida por Sousa Junior et al. (2015), que foram de 7,66 mg/g de adsorvente

e 1,14 mg/g de adsorvente, para proteína total e antígeno 503, respectivamente, usando o Ni2+,

conclui-se que o Cu2+ é um pouco mais seletivo que o Ni2+, mas a capacidade dinâmica desse

último confere ao mesmo melhor vantagem. Estudos realizados por Camprubí et al. (2006),

avaliaram também a purificação de uma proteína recombinante em E. coli, nesse caso a

estreptolisina O (SLO), utilizando para os ensaios de ALE uma coluna preenchida com a resina

Streamline chelating – Ni2+. Foi possível analisar que a perda de proteína total foi

correspondente a 77,86%, mostrando que grande parte dos contaminantes não foram adsorvidos

na resina, e que apenas 26,05% foi equivalente à perda da proteína de interesse, podendo-se

concluir que para essa proteína o Ni2+ mostrou-se seletivo.

Durante a etapa de lavagem, espera-se que ocorra a remoção de partículas, células,

detritos celulares e proteínas que ficaram fracamente adsorvidas no adsorvente (Anspach et al.

1999). De acordo com a Figura 19, é notório que a concentração de proteína total e,

consequentemente, a de antígeno 503 vai decrescendo à medida que aumenta o volume do

tampão de lavagem, até que estas concentrações se tornam constantes. Esse perfil na etapa de

lavagem confirma a remoção das proteínas que apresentaram uma interação fraca com a resina

em estudo.

Seguida da etapa de lavagem tem-se a eluição, assim como descrito na metodologia,

essa etapa foi realizada com o leito empacotado. Segundo Chase (1994), essa forma é mais

eficiente, uma vez que, reduz-se o volume de eluente utilizado e resulta em uma concentração

mais elevada do produto eluído. A eluição pode ser alcançada pela introdução de um agente

competidor que age deslocando a proteína, no presente estudo foi utilizado o imidazol. De

acordo com a Tabela 11, observa-se que a eluição com o tampão contendo 0,6 mol/L de

imidazol recuperou apenas 3,0% do antígeno 503, com um fator de purificação de 0,26, e esses

resultados obtidos não foram satisfatórios quando comparados, por exemplo, aos resultados

obtidos por Sousa Junior et al. (2015) para a eluição do mesmo antígeno 503 para mesma resina

71



com o metal Ni2+. Esses autores obtiveram uma recuperação e um fator de purificação de 59,2%

e 6,0, respectivamente.

A Figura 20 mostra o comportamento do antígeno 503 no ensaio de ALE analisado em

SDS-PAGE 12%. Dessa forma, é possível observar que nas condições usadas no ensaio de ALE

o protocolo de purificação não apresentou bons resultados, como pode ser observado pelo perfil

eletroforético de proteínas.


homogeneizado de E. Coli usando 0,01 % de Triton X-114 na etapa de lavagem da ALE.

Coluna 1: Padrão de massa molecular; Coluna 2: Homogeneizado de E. coli; Coluna 3: Carga;

Coluna 4: Lavagem; Coluna 5: Eluição.

Destaca-se que, como se trata de outro metal pode existir interações secundárias

adicionais envolvendo forças iônicas ou hidrofóbicas, sendo necessárias novas estratégias de

eluição para obtenção de uma pureza aumentada, como variações no pH e na concentração de

imidazol. Tampões de pH baixos (< 6) na maioria das vezes são suficiente para eluir a proteína

alvo, embora isso possa levar a desnaturação da mesma (Clemmitt & Chase, 2000). No caso de

proteínas sensíveis a pH mais baixo, um pH neutro é mais favorável. Em estudos realizados por

Yap et al. (2010), o pH variou de 6,0 a 8,0 e a concentração de imidazol de 50,0 a 500,0 mM,

observando que a quantidade eluída da proteína de interesse aumentou gradativamente com o

aumento na concentração de imidazol e radicalmente com o aumento do pH. A fim de melhorar

os resultados aqui obtidos, outra alternativa seria utilizar mais de um passo de eluição, em uma

estratégia conhecida como eluição em degrau, na qual utiliza-se primeiramente um tampão com

uma concentração mais baixa de imidazol a fim de eluir as proteínas contaminantes fracamente

ligadas ao adsorvente, e em seguida, emprega-se um tampão contendo uma concentração mais

kDa 97.0 66.0

45.0

30.0

20.1

1

2

3

4

5

72



alta do agente competitivo, com a finalidade de eluir o antígeno 503. Esta estratégia foi estudada

por Campubrí et al. (2006), que utilizou 50,0 e 500,0 mM de imidazol, Clemmitt & Chase

(2000), onde as etapas de eluição foram realizadas utilizando concentrações de imidazol de 6,0

mM e 60,0 mM, e ainda por Tan et al. (2006) que aplicaram a eluição em duas etapas, usando

50,0 e 350,0 mM do imidazol. Observa-se que para todos esses estudos a estratégia foi eficiente

e foram obtidos resultados satisfatórios na eluição da proteína de interesse.

Deste modo, com o objetivo de melhorar a recuperação do antígeno 503, a estratégia de

eluição em degrau foi empregada, uma vez que trabalhos encontrados na literatura sugerem que

a utilização de uma baixa concentração de imidazol pode ser utilizada para eluir algumas

proteínas contaminantes.

Primeiramente, baseado na concentração de imidazol aplicada na eluição isocrática (0,6

mol/L), foram utilizados dois passos de eluição com 0,6 e 1,0 mol/L de imidazol, com a

finalidade que a proteína de interesse seja eluída no segundo passo (1,0 mol/L). O

cromatograma adquirido para esse ensaio de purificação está ilustrado na Figura 21 e a Tabela

14 apresenta o balanço de massa.



lavagem e a eluição em degrau com 0,6 e 1,0 mol/L.

73




clarificado para o ensaio com a eluição em degrau com dois passos.

Etapas Volume

(mL)

Proteína total

(mg)

Antígeno

503 (mg)

Pureza

do antígeno 503

Rendimento

(%)

Fator de

Purificação

Homogeneizado

Celular 100 168,0 7,30 0,043 100,0 1,0

Passante 100 61,39 3,13 - - -

Lavagem 150 54,36 1,28 - - -

Eluição 1 50 13,23 0,37 0,028 5,07 0,65

Eluição 2 50 8,34 0,04 0,005 0,55 0,12

Através da Figura 21 perecebe-se que a etapa de eluição, mesmo com dois passos,

apresentou perfil semelhante a etapa de eluição do cromatograma realizado com eluição

isocrática (Figura 20), podendo-se concluir que essa estratégia não foi eficiente para eluir o

antígeno 503.

Por meio da Tabela 14 pode-se observar que o segundo passo de eluição (Eluição 2)

utilizando 1,0 mol/L de imidazol resultou em uma recuperação e fator de purificação da proteína

de de interesse de apenas 0,55 e 0,12, respectivamente. Quando comparado ao teste anterior

realizado com eluição isocrática, observa-se que houve uma diminuição na recuperação e fator

de purificação. Logo, esses passos de eluição não foram satisfatórios para eluição do antígeno

503, o que pode ser confirmado através da Figura 22, a qual ilustra o perfil eletroforético das

proteínas. Essa Figura mostra que a biomolécula de interesse foi eluída com concentração de

imidazol inferior a 1,0 mol/L. Com isso, uma outra estratégia seria utilizar um passo de eluição

com a concentração de imidazol abaixo de 0,6 mol/L, com a finalidade de que as proteínas

contaminantes sejam eluídas nessa concentração inferior e o antígeno 503 eluído com 0,6

mol/L.

74




homogeneizado de E. coli usando 0,01 % de Triton X-114 na etapa de lavagem da ALE.

Coluna 1: Padrão de massa molecular; Coluna 2: Homogeneizado de E. coli; Coluna 3: Carga;

Coluna 4: Lavagem; Coluna 5: Eluição 0,6 mol/L; Coluna 6: Eluição 1,0 mol/L.

Portanto, essa nova estratégia foi empregada e o ensaio foi realizado novamente com

dois passos de eluição, nesse caso sendo utilizados 0,3 mol/L e 0,6 mol/L de imidazol. O

cromatograma obtido para esse ensaio de purificação segue na Figura 23 e a Tabela 15 apresenta

o balanço de massa.



lavagem e a eluição em degrau com 0,3 e 0,6 mol/L.

1 2 3 4 5 6 kDa

97.0

66.0

45.0

30.0

20.1

75




clarificado para o ensaio com a eluição em degrau com dois passos.

Etapas Volume

(mL)

Proteína

total (mg)

Antígeno

503 (mg)

Pureza

do antígeno 503

Rendimento

(%)

Fator de

Purificação

Homogeneizado

Celular 100 164,0 7,0 0,043 100,0 1,0

Passante 100 79,46 4,04 - - -

Lavagem 150 55,54 0,98 - - -

Eluição 1 50 13,97 0,46 0,033 6,57 0,77

Eluição 2 50 8,20 1,05 0,128 15,00 2,98

Analisando a Figura 23 e a Tabela 15, observa-se o antígeno 503 foi eluído no segundo

passo de eluição (Eluição 2), com 0,6 mol/L de imidazol, apresentando uma recuperação de

15,0% do antígeno 503 e um fator de purificação de, aproximadamente, 3,0.

A Figura 24 ilustra o comportamento do antígeno 503 no ensaio de ALE analisado em

SDS-PAGE 12% e demonstra que a proteína de interesse eluída apresenta um peso molecular

de, aproximadamente, 56 kDa. Percebe-se ainda que uma pequena quantidade de proteína com

peso inferior a 56 kDa foi detectada no eluato. Da mesma forma, Wizemann & von Brunn

(1999) e Tan et al. (2006) durante a purificação relataram a presença de proteína com peso

molecular abaixo da proteína de interesse no eluato e consideraram que estas impurezas podem

ser proteínas contaminantes que não foram removidas durante a etapa de eluição prévia com

uma concentraçao de imidazol inferior, ou podem ser ainda produtos de degradação da proteína

alvo.

76



Figura 24 – Gel de eletroforese (SDS – PAGE) do antígeno 503 recuperado a partir do

homogeneizado de E. coli usando 0,01 % de Triton X-114 na etapa de lavagem da ALE.

Coluna 1: Padrão de massa molecular; Coluna 2: Homogeneizado de E. coli; Coluna 3:

Passante; Coluna 4: Lavagem; Coluna 5: Eluição 0,3 mol/L; Coluna 6: Eluição 0,6 mol/L.

Assim como nos estudos realizados por Clemmitt & Chase (2000), Campubrí et al.

(2006) e Tan et al. (2006), o tampão de eluição contendo uma concentração mais baixa de

imidazol, nesse estudo sendo de 0,3 mol/L (Eluição 1), eluiu a maioria das proteínas

contaminantes fracamente ligadas e a proteína de interesse foi eluída a partir da aplicação de

um tampão (Eluição 2) contendo uma concentração de imidazol mais elevada (0,6 mol/L).

Os resultados obtidos nesse último ensaio foram satisfatórios quando comparado com

os obtidos no ensaio utilizando eluição isocrática, mostrando que a estratégia de utilizar a

eluição em degrau foi eficiente para purificar o antígeno 503 a partir do homogeneizado de E.

coli não clarificado.

1 2 3 4 5 6 kDa

97.0

66.0

45.0

30.0

20.1

CAPÍTULO VI

CONCLUSÕES

78

6. Conclusões


6. Conclusões

• O melhor método de rompimento celular da E. coli foi o da ureia, apresentando

valores mais elevados na liberação de proteínas totais e antígeno 503. Através

da análise do planejamento fatorial completo 22 observou-se que a única variável

significativa foi a concentração de ureia (mol/L) tendo influenciado

positivamente, portanto sendo definida em 8 mol/L. O tempo como não

apresentou efeito significativo nas respostas obtidas foi fixado em 15 minutos,

otimizando assim o processo de ruptura utilizando esse método.

• Com a triagem do íon metálico tem-se que o Cu2+ foi o que apresentou maior

capacidade de adsorção do antígeno 503 e que as concentrações avaliadas (0,1;

0,5; 0,8 mol/L) não apresentaram diferença significativa, sendo então

determinada que a resina Streamline Chelanting tinha de ser carregada com uma

solução de 0,1 mol/L Cu2+. A isoterma de adsorção do antígeno 503 mostrou

bom ajuste ao modelo de Langmuir (R=0,9885).

• A adição do tensoativo não-iônico, Triton X-114, à etapa de lavagem da ALE,

na menor concentração avaliada (0,01%) proporcionou um elevado valor de

remoção do LPS (99,70%). Logo, esse processo que integra em uma única etapa

os processos de clarificação, recuperação, purificação e redução significativa de

LPS a partir de um extrato não clarificado é bastante promissor.

• Para recuperação e purificação do antígeno 503 usando Cu2+ imobilizado na

resina Streamline chelanting por ALE, a estratégia de eluição em degrau com as

concentrações de 0,3 e 0,6 mol/L de imidazol foi a mais eficiente no processo

de purificação, com uma recuperação de 15,0% e um fator de purificação de,

aproximadamente, 3,0.

• A IMAC operando em coluna de leito expandido mostrou-se como uma boa

alternativa para a purificação do antígeno 503 a partir do homogeneizado de E.

coli não clarificado. A combinação da clarificação, concentração e purificação

de biomoléculas em uma única etapa reduz o tempo e os custos de operação.

REFERÊNCIAS

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80

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http://www.who.int/leishmaniasis/en

APÊNDICE

94

Apêndice


Apêndice 1

Resultados do planejamento fatorial 22 para o rompimento utilizando ureia.

Tabela 1 – Análise de variância (ANOVA) para variável concentração de proteína total.

Fonte de

variação

Soma

quadrática

Graus de

liberdade

Média

quadrática Fcal Ftab

Regressão 0,79484 3 0,26495 34,82 19,16

Resíduos 0,01522 2 0,00761

Falta de

ajuste 0,00992 1 0,00992

1,87 161,40

Erro puro 0,00530 1 0,00530

Total 0,81006 5

Tabela 2 – Análise de variância (ANOVA) para variável concentração de antígeno 503.

Fonte de

variação

Soma

quadrática

Graus de

liberdade

Média

quadrática Fcal Ftab

Regressão 0,01118 3 0,00373 57,38 19,16

Resíduos 0,00013 2 0,00006

Falta de

ajuste 0,00013 1 0,00013

26,00 161,40

Erro puro 0,000005 1 0,000005

Total 0,81006 5

ANEXOS

96

Anexo


ANEXO 1

Tabela 1: Potencial de redução.

Fonte: Atkins & Jones (2012).

dissertação de mestrado · streamline chelating para purificação do antígeno 503 de leishmania...

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