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DANIELLI BARRETO MACIEL
GENE DE PATOGENICIDADE cap20 EM
ISOLADOS DE Colletotrichum gloeosporioides.
RECIFE/PE – 2008
DANIELLI BARRETO MACIEL
GENE DE PATOGENICIDADE cap20 EM
ISOLADOS DE Colletotrichum gloeosporioides.
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Biologia de Fungos do
Departamento de Micologia da Universidade
Federal de Pernambuco, como parte dos requisitos
exigidos para a obtenção do título de Mestre em
Biologia de Fungos na Área de Fungos de Interesse
Agronômico.
ORIENTADORA: Profa. Dra. Neiva Tinti de Oliveira
RECIFE/PE – 2008
Maciel, Danielli Barreto
Gene de patogenicidade cap20 em isolados de Colletotrichum
gloeosporioides / Danielli Barreto Maciel. – Recife: O Autor, 2008.
viii, 58 folhas : il., fig., tab.
Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de Pernambuco.
CCB. Biologia de Fungos, 2008.
Inclui bibliografia.
1. Biologia de Fungos 2. Gene – patogenicidade 3.
Colletotrichum gloeosporioides 4. Antracnose I. Título
582.2 CDU (2.ed.) UFPE
589.2 CDD (22.ed.) CCB – 2008 - 137
DEDICO
Aos meus pais, MACIEL e ELZA,
irmãos MICHELE, JÚNIOR e RAFAEL,
pelo amor, confiança e incentivo.
OFEREÇO
Ao meu namorado, Denis Filho,
pelo incentivo e compreensão durante todos
os momentos.
ii
AGRADECIMENTOS
A Deus, sem o qual nada seria possível, e através dele venci mais uma etapa de minha
vida.
À Pós-graduação em Biologia de Fungos, em especial ao Departamento de Micologia,
pelos recursos oferecidos e oportunidades concedidas para realização deste curso.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pela
concessão da bolsa de estudo.
À Profª Drª Neiva Tinti de Oliveira, pela orientação, confiança e apoio durante a
realização deste trabalho.
À Profª Drª Elaine Malosso, pela atenção, colaboração e por suas valiosas sugestões.
Ao Prof. Dr. Sidney T. G. Bastos, pela amizade, apoio e por suas valiosas sugestões.
À Profª Sílvia T. Barros, pela amizade, atenção e apoio.
À Universidade Federal Rural de Pernambuco, em especial ao Departamento de
Fitopatologia, pela concessão dos isolados fúngicos.
À Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”, em especial ao Departamento de
Fitopatologia, pela concessão dos isolados fúngicos.
À Drª Meiriana Vila Nova, pela amizade, atenção e valiosas contribuições para
realização deste trabalho.
Aos professores e funcionários do Departamento de Micologia, pelo apoio e pelos
ensinamentos transmitidos.
Aos professores e funcionários da Micoteca, pela concessão dos isolados fúngicos.
Às amigas do Laboratório de Biologia Molecular de Fungos, Lílian Medeiros, Vívian
Medeiros, Mariele Porto, Susane Chang, Marília Maciel e Liana, pela valiosa amizade,
pelo agradável convívio, troca de idéias e sugestões.
Às amigas, Nereida Neri e Valderez Neri, pelo apoio, atenção, incentivo e amizade.
iii
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS
LISTA DE TABELAS
RESUMO
ABSTRACT
1. INTRODUÇÃO......................................................................................................... 1
2. REVISÃO DE LITERATURA................................................................................ 3
2.1. Taxonomia Tradicional do Gênero Colletotrichum............................................... 3
2.2. Antracnose Causada por Colletotrichum gloeosporioides..................................... 3
2.3. Morfogênese Apressorial e Processo de Infecção em Fungos Filamentosos......... 5
2.4. Genes Envolvidos na Formação do Apressório..................................................... 8
2.5. Marcadores Moleculares Baseados na Técnica de PCR........................................ 11
2.5.1. Região ITS do DNA Ribossomal...................................................................... 12
2.5.2. Intron Splice Site Primer (ISSP)....................................................................... 14
2.6. Ferramentas Moleculares no Estudo da Diversidade Genética de Colletotrichum 15
3. MATERIAL E MÉTODOS...................................................................................... 19
3.1. Local e Realização dos Experimentos.................................................................... 19
3.2. Obtenção e Manutenção dos Isolados de Colletotrichum...................................... 19
3.3. Obtenção de Micélio para Extração de DNA......................................................... 20
3.4. Extração de DNA Genômico.................................................................................. 20
3.5. Quantificação de DNA Genômico e Revelação dos Géis...................................... 21
3.6. Amplificação da Região ITS do rDNA ................................................................. 21
3.7. Amplificação do RFLP-ITS................................................................................... 21
3.8. Amplificação da região Intron Splice Site Primer (ISSP)...................................... 22
3.9. Análise Estatística.................................................................................................. 23
3.10. Desenho dos Oligonucleotídeos para o Gene cap20 e Otimização da Reação.... 23
3.11. Digestão Enzimática dos Produtos de Amplificação do Gene cap20 com a
Enzima MspI...................................................................................................................
24
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO.............................................................................. 25
iv
4.1. Extração e Quantificação do DNA......................................................................... 25
4.2. Região ITS do rDNA.............................................................................................. 26
4.3. RFLP-ITS............................................................................................................... 27
4.4. Intron Splice Site Primer (ISSR)……………………………………………….... 32
4.5. Amplificação do Gene cap20................................................................................. 35
4.6. Análise dos Fragmentos de Amplificação do Gene cap20 Digeridos com a
Enzima de Restrição MspI...............................................................................................
36
5. CONCLUSÕES......................................................................................................... 37
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.................................................................... 38
7. NORMAS DA REVISTA.......................................................................................... 55
LISTA DE FIGURAS
1 Acérvulo; B, conidióforos; C, conídio; D, T.S. peritécio; E, asco; F, ascósporos; G, formação de apressório a partir da hifa.........................................................................................................pag. 4
2 Esquema dos ciclos de PCR: (1) desnaturação a 94°C; (2) anelamento a 54°C e (3) extensão a 72°C...............................................................pag. 11
3 Estrutura do cluster (agregado) gênico que codifica RNA ribossômico........................................................................................pag. 13
4 Esquema indicando as regiões amplificadas pelos oligonucleotídeos EI e LA. As seqüências dos oligonucleotídeos EI1 e EI2 foram baseadas na seqüência consenso GTATGT dos 59 exon-intron splice site. As seqüências dos oligonucleotídeos LA1 e LA2 foram baseadas na seqüência consenso TACTAAC. Fonte: Barros Lopes et al (1996)................................................................................................pag. 15
5 Quantificação de DNA de isolados de Colletotrichum spp. As amostras A, B, C e D são os marcadores do DNA λ nas concentrações de 50, 100, 150, 200 ng/µL, respectivamente; as amostras de 1 a 20 são DNAs dos isolados URM4626, URM4627, URM4628, URM4629, URM4894, URM4896, URM4900, URM4905, URM4908, URM4852, URM4854, URM4856, URM4857, URM4858, URM4859, Ci, PI 13, PI 15, Acu e Sub, respectivamente.................................................................................pag. 25
6 Quantificação de DNA de isolados de Colletotrichum spp. As amostras A, B, C e D são os marcadores do DNA λ nas concentrações de 50, 100, 150, 200 ng/µL, respectivamente; as amostras de 1 a 8 são DNAs dos isolados (CFMM1633, C. gloeosporioides “Esalq”, C. boninense “Esalq”, C. coccodes “Esalq”, CFMM1245, CFMM1023, CFMM1041 e CFMM1147), respectivamente..........................................................pag. 26
7 Perfis de amplificação da região ITS do rDNA obtidos com os oligonucleotídeos ITS4 e ITS5. A amostra M, marcador de peso molecular 100-pb; as amostras de 1 a 20 são DNAs dos isolados URM4626, URM4627, URM4628, URM4629, URM4894, URM4896, URM4900, URM4905, URM4908, URM4852, URM4854, URM4856, URM4857, URM4858, URM4859, Ci, PI 13, PI 15, Acu e Sub, respectivamente.................................................................................pag. 26
8 Perfis de restrição com enzimas de restrição DraI (A), MspI (B) e HaeIII (C) do fragmento de ITS de 20 isolados de Colletotrichum spp. A amostra M, marcador de peso molecular 100-pb; as amostras de 1 a 20 são DNAs dos isolados (URM4626, URM4627, URM4628, URM4629, URM4894, URM4896, URM4900, URM4905, URM4908, URM4852, URM4854, URM4856, URM4857, URM4858, URM4859, Ci, PI 13, PI 15, Acu e
v
Sub), respectivamente........................................................................pag. 28
9 Dendrograma construído pelo método de UPGMA, utilizando o coeficiente de Jaccard (J) a partir dos perfis de restrição dos produtos de amplificação da região ITS do rDNA com as enzimas DraI, MspI e HaeIII obtidos de 20 isolados de Colletotrichum
spp......................................................................................................pag. 29
10 Perfis de amplificação da região de splicing do intron com o oligonucleotídeo EI1 de 20 isolados de Colletotrichum spp. A mostra M, marcador de peso molecular 100-pb; as amostras de 1 a 20 são DNAs dos isolados URM4626, URM4627, URM4628, URM4629, URM4894, URM4896, URM4900, URM4905, URM4908, URM4852, URM4854, URM4856, URM4857, URM4858, URM4859, Ci, PI 13, PI 15, Acu e Sub, respectivamente.........................................................................pag. 32
11 Dendrograma construído pelo método de UPGMA, utilizando o coeficiente de Jaccard (J) a partir dos perfis de amplificação dos produtos com o primer EI1 obtidos de 20 isolados de Colletotrichum
spp......................................................................................................pag. 33
12 Perfis de amplificação do gene de patogenicidade cap20 de 28 isolados de Colletotrichum spp. obtidos com os oligonucleotídeos P1 e P2. A amostra M, marcador de peso molecular 1-Kb; as amostras de 1 a 19 são DNAs dos isolados de C. gloeosporioides (URM4626, URM4627, URM4628, URM4629, URM4894, URM4896, URM4900, URM4905, URM4908, URM4852, URM4854, URM4856, URM4857, URM4858, URM4859, Ci, PI 13, CFMM 1633 e C. gloeosporioides “Esalq”); as amostras de 20 a 21 são DNAs dos isolados de C. acutatum (PI 15 e Acu); as amostras de 22 a 28 são DNAs dos isolados de C. boninense (C. boninense “Esalq”), C. coccodes (C. coccodes “Esalq”), C. capsici (CFMM1245), C. sublineolum (Sub), C. dematium (CFMM1023), C. graminicola
(CFMM1041) e de C. gossypii var. cephalosporioides (CFMM1147), respectivamente.................................................................................pag. 35
13 Perfis de restrição dos produtos de amplificação do gene cap20 com enzima de restrição MspI (A e B). A amostra M, marcador de peso molecular 1-Kb; as amostras de 1 a 10 (A) são DNAs dos isolados de C. gloeosporioides (URM4626, URM4627, URM4628, URM4629, URM4894, URM4896, URM4900, URM4905, URM4908 e URM4856, respectivamente) e as amostras de 1 a 3 (B) são DNAs dos isolados de C. gloeosporioides (Ci, PI 13 e C. gloeosporioides “Esalq”, respectivamente)................................................................................pag. 36
LISTA DE TABELAS
1 Origem dos isolados de Colletotrichum.........................................pag. 19
2 Oligonucleotídeos ITS4, ITS5 e EI1 utilizados no estudo..............................................................................................pag. 22
3 Comprimento da região ITS e dos fragmentos de restrição ITS..................................................................................................pag. 27
vi
GENE DE PATOGENICIDADE cap20 EM ISOLADOS DE
Colletotrichum gloeosporioides.
Danielli Barreto Maciel
RESUMO
O primeiro evento para a penetração em algumas espécies de Colletotrichum, inicia com a adesão do conídio e germinação na superfície da planta hospedeira, produzindo tubo germinativo e então formando o apressório, que penetra diretamente na cutícula. Estudos anteriores têm identificado em Colletotrichum gloeosporioides, genes denominados cap, que são unicamente expressos durante a formação do apressório depois de 4 horas de exposição do conídio à presença da cera da cutícula do abacate (Persea gratissima). O objetivo deste trabalho foi amplificar o gene da patogenicidade cap20 e analisar a variação deste gene intraespecificamente em isolados de C. gloeosporioides provenientes de diferentes hospedeiros. A variabilidade genética foi acessada usando marcadores de RFLP-ITS e intron (primer EI1) e pelo método de agrupamento UPGMA. Primers para o gene cap20 foram construídos a partir de seqüências selecionadas do GenBank (National Center of Biotechnology Information, http://www.ncbi.nlm.nih.gov) utilizando o programa Primer 3. A análise dos dendrogramas revelou que o marcador RFLP-ITS foi capaz de separar as espécies C. gloeosporioides, C. acutatum e C. sublineolum. Em outra mão, esses resultados também mostraram que o primer EI1 de Intron Splice Site evidenciou maior variabilidade genética que o RFLP-ITS, porém não separou as espécies. Os primers construídos nomeados P1 e P2 para o gene cap20 foram eficientes para amplificar C. gloeosporioides (exceto para cinco isolados de manga e um isolado de pimentão), C. boninense, C. dematium, C. capsici e C.gossypii var. cephalosporioides, mas não houve amplificação para C. graminicola, C. acutatum, C. sublineolum e C. coccodes, indicando que este gene pode apresentar diferenças na estrutura entre os isolados de C. gloeosporioides relacionada ao hospedeiro e que este gene também está presente nas outras espécies citadas de Colletotrichum. A digestão com a enzima MspI para os isolados de C. gloeosporioides que apresentaram amplificação não evidenciou diferenças na estrutura do gene cap20.
Palavras-chave: gene cap20, Colletotrichum gloeosporioides, patogenicidade
vii
cap20 GENE PATHOGENICITY IN Colletotrichum gloeosporioides
OF THE ISOLATES.
Danielli Barreto Maciel
ABSTRACT
The early event for the penetration in some Colletotrichum species, iniciates with conidium adesion and germination on the surface of the host plant, producing germinative tube and then forming the apressorium, wich penetrates directly in the cuticle. Previous studies have identified in Colletotrichum gloeosporioides genes called cap, wich are only expressed during the apressorium formation after 4 hours of conidium exposition to waxes present on the cuticle of avocado (Persea gratissima). The objective of this work was to amplify the pathogenicity cap20 gene and to analyze the variation of this gene in isolates of C. gloeosporioides from different hosts. The genetic variability was accessed using RFLP-ITS and Intron (to primer EI1) markers and grouping by UPGMA method. Primers for cap20 gene were constructed from selected sequences of the GenBank (National Center of Biotechnology Information, http://www.ncbi.nlm.nih.gov) using the Primer 3 program. The analysis of the dendrograms showed that the RFLP-ITS marker was able to separate the species C. gloeosporioides, C. acutatum and C. sublineolum. On the other hand, these results also showed that the primer EI1 of Intron Splice Site evidenced greater genetic variability than the RFLP-ITS, however did not separate the species. The constructed primers named P1 and P2 for cap20 gene had been efficient to amplify C. gloeosporioides (except for five mango isolates and one chili isolate), C boninense, C. dematium, C. capsici and C.gossypii var. cephalosporioides, but did not amplifyd C. graminicola, C. acutatum, C. sublineolum and C. coccodes, suggesting that this gene can present structure differences among C. gloeosporioides isolates related to the host and that this gene is also present in the other cited species of Colletotrichum. The digestion with MspI enzime for isolates of the C. gloeosporioides that presented amplification did not evidence cap20 gene structure differences.
Key words: cap20 gene, Colletotrichum gloeosporioides, pathogenicity
viii
1. INTRODUÇÃO
A antracnose, causada por espécies de Colletotrichum, provoca prejuízo no
campo e na pós-colheita de diversas culturas e seus produtos. Os sintomas típicos da
doença são lesões arredondadas, grandes, necróticas e bordos ligeiramente elevados
com o centro dos tecidos deprimidos, onde são produzidas massas de conídios de
coloração alaranjada (Bailey et al., 1992), podendo ocorrer uma podridão-mole nos
frutos, prejudicando a sua comercialização (Lima et al., 1993).
O gênero Colletotrichum compreende alguns dos fungos mais importantes
economicamente por serem patógenos destrutivos de plantas, tais como C. acutatum
Simmonds (teleomorfo – Glomerella acutata Guerber et Correll), C. fragariae
Brooks e C. gloeosporioides [teleomorfo – G. cingulata (Stoneman) Spauld. Et
Schrenk] (Martínez – Culebras et al., 2000).
A taxonomia de Colletotrichum é baseada tradicionalmente em critérios
morfológicos, e centenas de espécies foram descritas para este gênero com base
nesses critérios (Arx, 1957 a, b). Porém, como os fatores ambientais influenciam a
estabilidade das características morfológicas e existem formas intermediárias, os
critérios morfológicos nem sempre são confiáveis para diferenciar as espécies de
Colletotrichum (Sutton, 1962; Sutton, 1980; Simmonds, 1965; Nag Raj, 1973).
O gênero Colletotrichum apresenta duas estratégias principais de infecção na
planta hospedeira: a colonização subcuticular ou intramural e a intracelular. Em
ambos os grupos de patógenos o conídio adere e germina na superfície da planta,
produz tubos germinativos e forma o apressório que penetra diretamente na cutícula
(O’Connell et al., 1985).
Muitos outros fungos desenvolveram mecanismos mais elaborados para a
invasão no hospedeiro com a formação de apressório. O apressório pode diferenciar-
se imediatamente depois da germinação do esporo em alguns fungos, entretanto,
outros produzem longos tubos germinativos (Maeda, 1970). Um número grande de
genes foi isolado que afetam a função e a diferenciação do apressório. A maioria
Maciel, D.B. Gene de patogenicidade cap20 em isolados de Colletotrichum...
2
destes genes foi isolada de espécies que formam apressório como Magnaporthe
grisea e Colletotrichum sp. (Kamakura et al., 2002).
Estudos mostraram que diversos transcritos designados genes cap foram
expressos durante a formação do apressório de C. gloeosporioides induzidos pela
cera do abacate (Persea americana Mill) (Hwang et al.,1995). O gene cap20 que
codifica uma proteína de 20 kDa, pode apresentar papel importante na função
apressorial e mostra homologia com as proteínas da parede celular. Mutantes com
deleção em cap20 não são patogênicos e mutações em outros genes cap não
apresentaram efeito na patogenicidade.
A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR – Polymerase Chain Reaction) é
uma técnica molecular que possibilita a identificação de genes através da
amplificação de fragmentos específicos de DNA. A técnica de PCR permitiu o
desenvolvimento de outras técnicas para a obtenção de diagnósticos moleculares em
muitas espécies de fungos, entre elas, a análise da região ITS (Internal Transcribed
Spacers) do rDNA e de Intron Splice Site Primer.
O objetivo deste trabalho foi amplificar o gene de patogenicidade cap20 e
analisar a variação deste gene intraespecificamente em isolados de C.
gloeosporioides provenientes de diferentes hospedeiros.
3
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1. Taxonomia Tradicional do Gênero Colletotrichum
A taxonomia de Colletotrichum é baseada tradicionalmente em critérios
morfológicos. Outros critérios suplementares incluem o tipo de dano causado no
hospedeiro e a própria identidade do hospedeiro. Centenas de espécies foram
descritas neste gênero com base nesses critérios. O micologista Arx (1957 a, b)
reduziu para apenas onze espécies, com base nos caracteres morfológicos. Dentre as
11 espécies, C. gloeosporioides, com mais de 600 sinônimos foi selecionada para
representar o anamorfo de Glomerella cingulata. No entanto, o modo de reprodução
na maioria das populações de Colletotrichum é exclusivamente somático, sendo o
teleomorfo desconhecido para a maioria das espécies (Bezerra, 2007).
As células conidiogênicas das espécies de Colletotrichum geralmente são
agregadas em conidiomas (acérvulos) in vivo, mas podem ser formadas diretamente
nas hifas in vitro. As setas e células conidiogênicas parecem ser homólogas, podendo
as mesmas em determinadas condições, produzirem conídios na sua extremidade
(Menezes, 2006). Os conídios são envolvidos por uma matriz gelatinosa alaranjada,
constituída de polissacarídeos e proteínas solúveis em água que os protege da
dissecação.
As espécies de Colletotrichum apresentam variações quanto à morfologia da
colônia, forma dos conídios, presença e forma das setas e apressórios, pigmentação,
sensibilidade aos fungicidas, patogenicidade e outras características. No entanto, a
morfologia provavelmente continuará a ser a base primária para a separação entre
espécies ou grupos de espécies (Katan, 2000). Porém, como os fatores ambientais
influenciam a estabilidade das características morfológicas e existem formas
intermediárias, os critérios morfológicos nem sempre são confiáveis para diferenciar
as espécies de Colletotrichum. À medida que os conceitos de espécies vão sendo
reavaliados, o número de taxa bem caracterizado tem aumentado gradualmente
(Sutton, 1962; Sutton, 1980; Simmonds, 1965; Nag Raj, 1973).
2.2. Antracnose Causada por Colletotrichum gloeosporioides
4
A antracnose causada por espécies de Colletotrichum é a principal doença de
frutos como banana, caju (Anacardium occidentale L.), manga (Mangifera indica
L.), mamão (Carica papaya L.) e maracujá (Passiflora edulis f. flavicarpa Deg.) nas
regiões tropicais e subtropicais do mundo (Benato, 1999; Peres et al., 2002).
O gênero Colletotrichum compreende alguns dos fungos mais importantes
economicamente por serem patógenos destrutivos de plantas, tais como C. acutatum,
C. fragariae e C. gloeosporioides (Martínez – Culebras et al., 2000).
Colletotrichum gloeosporioides é um fungo filamentoso, que está
posicionado na classe Ascomycetes, ordem Phyllachorales, teleomorfo Glomerella
cingulata (Sutton, 1992). C. gloeosporioides forma acérvulos nas áreas lesionadas,
geralmente setosos, às vezes glabros, com formato arredondado, alongado ou
irregular. As setas de tamanho variável com 1 a 4 septos, coloração marrom,
apresentando leve alargamento na base e ápice pontiagudo. Os conídios são
cilíndricos, às vezes levemente elipsóides, com ápice arredondado e trucado na base,
hialinos, unicelulares e uninucleados. Os conidióforos são unicelulares, hialinos ou
levemente pigmentados, cilíndricos e fialídicos. G. cingulata forma peritécios,
solitários ou agregados, globosos ou obpiriformes em várias partes do hospedeiro,
coloração marrom escura a negra, com ostíolo levemente papilado, circular, provido
de perífises. Os ascos apresentam oito ascosporos, intercalados por paráfises,
formando grupos na base do peritécio, de formato clavado a cilíndrico, com ápice
mais delicado. Os ascosporos apresentam forma oval, cilíndrica, fusiforme ou
levemente curvada, unicelular, hialina ou até fracamente escurecida e uniseptados
antes da germinação (Bailey et al., 1992 a) (Figura 1).
Figura 1. A, T.S. acérvulo; B, conidióforos; C, conídio; D, T.S. peritécio;
E, asco; F, ascósporos; G, formação de apressório a partir da
5
O sintoma típico da doença é caracterizado por lesões arredondadas, grandes,
necróticas e bordos ligeiramente elevados com o centro dos tecidos deprimidos, onde
são produzidas massas de conídios de coloração alaranjada (Bailey et al., 1992),
podendo ocorrer uma podridão-mole nos frutos, prejudicando a sua comercialização
(Lima et al.,1993).
Colletotrichum gloeosporioides pode se desenvolver em muitos hospedeiros
incluindo vários frutos tropicais, sendo favorecido por temperaturas e umidade
relativa elevadas. Os conídios geralmente são transportados pela chuva e pelo vento
ou ao entrar em contato com insetos, e outros animais. Os conídios de C.
gloeosporioides podem germinar com 95% de umidade relativa, porém a
porcentagem de germinação dos conídios e formação dos apressórios incrementa
quando a umidade relativa se aproxima de 100%. Em alguns experimentos, são
demonstrados que os conídios de certos isolados de C. gloeosporioides mantêm sua
viabilidade mesmo depois de haver estado em condições de umidade baixa, como por
exemplo, 62% por quatro semanas. Esta habilidade para sobreviver em períodos
longos de seca pode estar relacionada à presença e função da matriz extraconidial
que protege os conídios (Dodd et al., 1992).
2.3. Morfogênese Apressorial e Processo de Infecção em Fungos Filamentosos
Os patógenos que causam antracnose infectam plantas pelos tecidos
subcuticulares colonizando intramuralmente, ou estabelecendo-se intracelularmente
(Bailey et al., 1992). Os estágios da pré-infecção de ambos são muito similares; o
conídio adere e germina na superfície da planta, produz tubos germinativos e forma o
apressório que penetra na cutícula diretamente.
A penetração do tecido é favorecida pela ação de enzimas pectinolíticas,
secretadas no tecido hospedeiro, bem como pela força mecânica exercida pelo
apressório sobre o peg (gancho) de penetração (Agrios, 2005). Após a penetração,
patógenos que colonizam a região intramural abaixo da cutícula, invadem de maneira
necrotrófica e espalham-se rapidamente em todos os tecidos (O’Conell et al., 1985;
Latunde-Dada, 1996). Não há estágio biotrófico detectável na forma de parasitismo.
A maioria das espécies de Colletotrichum exibe uma estratégia biotrófica de infecção
6
inicialmente colonizando entre o plasmalema e a parede da célula intracelularmente.
Após o estado biotrófico, que varia em duração, as hifas intracelulares colonizam
uma ou duas células e subseqüentemente desenvolvem as hifas necrotróficas
secundárias (Latunde-Dada et al., 1996; O’Conell et al., 1985). Conseqüentemente,
estes patógenos são considerados hemibiotróficos ou biotróficos facultativos. C.
gloeosporioides infecta abacate, pimenta, pimentão e citros através desses modos de
colonização, produzindo hifas biotróficas intracelularmente no estágio adiantado e
forma hifas necrotróficas intramurais simultaneamente ou logo mais tarde
(O’Connell et al., 2000).
Os fungos desenvolveram estratégias para romper a parede da cutícula e de
células epidermais para ganhar o acesso aos tecidos subjacentes. As infecções
causadas por determinados fungos fitopatogênicos, conhecidas como necrotróficas
são realizadas com a secreção de quantidades de enzimas degradadoras da parede
celular e das toxinas (Kolattukudy, 1985; Schafer, 1994; Walton, 1996). Muitos
fungos, além dos fitopatogênicos, desenvolveram mecanismos mais elaborados para
a invasão no hospedeiro, com a formação de estruturas especializadas denominadas
de apressórios, das quais emergem as hifas de penetração.
Os apressórios são definidos como estruturas empregadas pelos patógenos
fúngicos para forçar e atacar à superfície da planta na preparação para a infecção
(Hawksworth et al., 1995). Freqüentemente, os apressórios são estruturas
diferenciadas nas pontas dos tubos germinativos.
Muitos fungos biotróficos não penetram diretamente através da cutícula, mas
formam preferivelmente o apressório sobre os estômatos. Após entrar na cavidade
substomatal, a hifa de penetração incha e forma uma vesícula substomatal. A
vesícula continua a elongar-se e em contato com uma célula mesófila diferencia-se
em uma célula-mãe haustorial de parede densa. Seguindo a formação de um septo, a
célula-mãe do haustório penetra na célula do hospedeiro e se desenvolve num
haustório, um instrumento de nutrição sofisticada da célula (Dean, 1997).
A habilidade de produzir o apressório é altamente variável mesmo dentro de
uma dada espécie (Armentrout et al., 1987; Murray, 1982). O apressório pode
diferenciar-se imediatamente depois da germinação do esporo em alguns fungos,
visto que outros produzem longos tubos germinativos (Maeda, 1970). O apressório
7
pode ou não ser delimitado dos tubos germinativos por um septo. Quando o
apressório é separado por um septo, como em Uromyces spp., Magnaphorte grisea e
Colletotrichum spp., o tubo germinativo e os esporos são freqüentemente destituídos
de citoplasma. A parede das células do apressório produzida por Colletotrichum spp.,
M. grisea e outros é mais densamente, multiestratificada e altamente melanizada,
mas em relação à planta, a parede celular parece menos modificada e um tanto mais
fina (Kubo & Furusawa, 1991).
A superfície da folha libera uma variedade de sinais químicos tais como
açúcares, fenóis, lipídeos e vários metabólitos voláteis que os fungos são capazes de
reconhecer. O gás etileno estimula o amadurecimento da fruta climatérica e tem
também um sinal de infecção por certos fungos (Flaishman & Kolattukudy, 1994).
Os conídios de C. gloeosporioides e de C. musae germinam e produzem múltiplos
apressórios quando expostos aos níveis de etileno tipicamente produzido pelo
amadurecimento de frutos de abacate ou de banana, respectivamente. Frutos
transgênicos de tomate (Lycopersicon esculentum) foram incapazes de produzir
etileno, e não houve estímulo para a germinação e a formação do apressório a menos
que sejam expostos ao etileno (Padila et al., 1993).
Padila et al (1993) e Kolattukudy et al (1995) verificaram a indução química
da germinação do conídio de C. gloeosporioides em abacate. A germinação dos
conídios e a formação do apressório são seletivamente estimuladas por um lipídeo
(cera) presente na superfície do fruto de abacate. É um sinal específico, uma vez que
outros lipídeos de outras plantas não estimulam a germinação.
Os esporos fúngicos usam sinais físicos ou químicos da superfície da planta
para a indução da germinação e a diferenciação do apressório, necessário para a
infecção no hospedeiro (Emmet et al., 1975; Aist, 1976; Staples et al., 1987).
Diversas espécies do gênero Colletotrichum produzem apressório em resposta aos
sinais físicos específicos e a topografia da superfície da folha (Staples et al., 1980),
incluindo C. capsici (Parberry, 1963), C. trifolii (Miehle et al., 1972), C.
lindemuthianum (Mercer et al., 1975), C. truncatum (Staples et al., 1976), C.
graminicola (Lapp et al., 1978), e C. lagenarium (Suzuki et al., 1982). Em outras, a
formação do apressório parece envolver sinais químicos da planta, tais como, ácido
clorogênico em C. musae (Swinburne, 1976; Harper et al., 1979) e fenólicos em C.
acutatum (Parberry et al., 1978). Há também uma evidência de que esses
8
componentes cuticulares da superfície foliar estão envolvidos no controle da
diferenciação fúngica (Macko, 1981; Trione, 1981).
2.4. Genes Envolvidos na Formação do Apressório
Foram isolados inúmeros genes que afetam a função e a diferenciação do
apressório em diferentes espécies de fungos fitopatogênicos. Genes relacionados com
a formação do apressório podem ser divididos em três grupos: 1) genes que operam
antes da formação do apressório e são necessários para a sua formação; 2) genes que
são expressos unicamente no apressório ou contribuem significativamente para as
características específicas da estrutura do apressório; 3) genes que controlam e
afetam a formação e função do apressório e o peg de penetração no hospedeiro
(Kamakura et al., 2002).
Os genes do grupo 1 incluem mpg1 e pth11 de M. grisea e genes chip de C.
gloeosporioides (Kamakura et al., 2002). O gene mpg1 que codifica hidrofobina foi
expresso diferencialmente durante a conidiação e nos estágios que antecedem o
processo de infecção (Talbot et al., 1993). A deleção do gene mpg1 reduziu a
hidrofobicidade da superfície da célula e a habilidade de formar o apressório. Ainda
em M. grisea, o gene pth11 codifica uma proteína transmembrana nova. Mutantes
pth11 não são patogênicos devido a um defeito na diferenciação do apressório,
sugerindo que a proteína codificada por PTH11 possui um efeito na diferenciação do
apressório em resposta às barreiras físicas na superfície do hospedeiro (DeZwaan et
al., 1999). Genes expressos no conídio de C. gloeosporioides durante o contato com
a cutícula foram isolados por dispositivos diferenciais. Um deles, o chip1, codifica
uma enzima conjugada a ubiquitina (Liu et al., 1997). A expressão desse gene media
a degradação de uma proteína dependente de ubiquitina associada com a germinação
e a formação do apressório. Outro gene, o chip6, codifica uma enzima, esterol
glicosil transferase e os mutantes para este gene apresentaram drástica redução na
virulência (Kim et al., 2002).
Componentes gerais de sinalização como a subunidade α de proteínas
heterotriméricas G, adenilato ciclase, proteína quinase A e as subunidades
regulatórias e catalíticas podem também afetar a diferenciação do apressório,
9
entretanto, estes elementos conservados estão envolvidos em muitos outros
processos.
Os nucleotídeos cíclicos possuem um papel central na indução do apressório
em determinados fungos. Os níveis celulares de cAMP são regulados pelas enzimas
adenilato ciclase e fosfodiesterase responsáveis pela sua síntese e degradação,
respectivamente (Epstein et al., 1989). cAMP exerce principalmente seus efeitos na
ativação da proteína quinase dependente de cAMP (PKA) (Taylor et al., 1993; Walsh
et al., 1994). Em M. grisea, a atividade de PKA é detectável na germinação de
conídios e aumenta durante a formação do apressório (Lee et al., 1994). Utilizando
oligonucleotídeos específicos que amplificam domínios altamente conservados, um
gene que codifica a subunidade catalítica de PKA (cpkA) foi clonado de M. grisea
(Mitchell et al., 1995). A deleção do gene cpkA resultou em uma perda da atividade
detectável de PKA e teve um efeito dramático na formação do apressório e na
patogenicidade (Lee et al., 1994). Choi et al (1997) clonaram o gene, mac1, que
codifica uma adenilato ciclase em M. grisea. A deleção deste gene resultou na
redução do crescimento vegetativo, conidiação e germinação conidial.
Transformantes que faltam mac1 foram incapazes de formar apressório em uma
superfície indutiva e foram incapazes de penetrar em folhas suscetíveis de arroz
(Oryza sativa), e a formação do apressório foi restaurada na presença de derivativos
exógenos de cAMP.
Em fungos filamentosos, as proteínas triméricas G regulam os processos de
desenvolvimento e a patogenicidade (Choi et al., 1995; Yu et al., 1996). Três genes
(magA, magB e magC) que codificam a subunidade-α foram clonados de M. grisea
(Liu et al., 1997). A deleção do gene magA não causou efeito observável no
crescimento, na esporulação ou na formação vegetativa do apressório. A deleção de
magC resultou em uma formação ligeiramente reduzida da taxa e do crescimento dos
conídios, mas nenhum efeito na formação do apressório. Em contrapartida, a perda
de magB resultou em efeitos fenotípicos drásticos (Choi et al., 1995; Yu et al.,
1996).
Já os grupos 2 e 3 incluem genes da biosíntese da melanina, e genes
específicos do apressório, respectivamente. Genes da biosíntese da melanina foram
isolados de C. lagenarium (pks1, scs1, thr1) e de M. grisea (rsy, buf). As linhagens
10
mutantes em ambas as espécies são albinas e incapazes de infectar plantas
hospedeiras (Perpetua et al., 1996). Além disso, transformação de mutantes
deficientes em melanina de M. grisea com genes da biosíntese de melanina de
Alternaria alternata restauraram completamente a patogenicidade (Kawamura et al.,
1997).
A melanização do apressório parece ser essencial para os fungos como M.
grisea e Colletotrichum spp. (Wheeler et al., 1988; Kubo et al., 1991). O tratamento
dos conídios com produto químico, tal como triciclazol, que inibe a melanização
resulta na produção de apressório não-melanizado, não-funcional e, portanto, não
ocorre penetração (Woloshuk et al., 1982). Similarmente, mutantes deficientes em
melanina não infectam, mas não são inteiramente virulentos quando inoculados
diretamente no tecido da folha (Kubo et al., 1985; Howard et al., 1989; Chumley &
Valent, 1990). Um cDNA calmodulina quinase (CaMK) foi clonado de C.
gloeosporioides e a inibição desta enzima reduziu a germinação, a formação do
apressório e a melanização (Kim et al., 1998). Evidências sugerem que cAMP,
proteína-quinases e calmodulina estão envolvidos nos passos de sinalização durante a
diferenciação das estruturas de infecção de Colletotrichum, entretanto a seqüência
precisa ainda não é conhecida (Perfect et al., 1999).
Não há muitos genes conhecidos que possam ser classificados no grupo 03,
que são genes que afetam a formação do apressório e o peg de penetração. Dois
genes específicos do apressório de M. grisea, gas1 e gas2 são expressos
exclusivamente no apressório e estão localizados no citoplasma. Mutantes com
deleção nestes genes tiveram o crescimento e a conidiação normais e formaram
apressório normal, mas foi reduzido na penetração apressorial e na formação da lesão
(Xue et al., 2002).
Por RT-PCR foi possível detectar diversos transcritos designados genes cap
expressos durante a formação do apressório induzida pela cera do abacate de C.
gloeosporioides. O screening diferencial revelou 04 clones de cDNA representando
transcritos encontrados apenas em conídios que formaram o apressório. Dois destes
clones, cap3 e cap5, codificaram polipeptídios de 26 e 27 aminoácidos,
respectivamente, ricos em cisteína, que mostraram alguma homologia a
11
metalotioninas. Dois outros genes foram unicamente expressos durante a formação
depois de 4 horas de exposição do conídio a lipídeos da cutícula do abacate. O gene
cap22 codifica uma proteína de 22 kDa que provavelmente é glicolisada, e o gene
cap20, que codifica uma proteína de 20 kDa, pode ter um papel na função
apressorial. Dois desses peptídeos (CAP20 e CAP22) mostraram homologia com as
proteínas da parede celular e podem fazer parte da parede do apressório. Mutantes
com deleção no gene cap20 foi incapaz de expressar a proteína de 20 kDa e
apresentou drástica redução na virulência em frutos de abacate e tomate (Hwang et
al., 1995).
2.5. Marcadores Moleculares Baseados na Técnica de PCR
Várias técnicas moleculares são utilizadas em estudos de fungos
fitopatogênicos. A reação em cadeia da polimerase (PCR – Polymerase Chain
Reaction) é uma importante técnica molecular de estudo genético em diversos
organismos. O desenvolvimento do processo de amplificação via PCR (Mullis et al.,
1987), permitiu a obtenção de outras classes de marcadores moleculares que têm
revolucionado a genética molecular, tanto na pesquisa visando o entendimento de
processos biológicos fundamentais, quanto nas áreas aplicadas envolvendo
diagnósticos e melhoramento genético de plantas e animais domésticos. A PCR
consiste na amplificação in vitro de uma determinada seqüência de DNA, a partir da
utilização da enzima DNA polimerase termorresistente, cofatores,
desoxirribonucleotídeos trifosfatos (dNTP´s) e oligonucleotídeos que flanqueiam a
região alvo e pareiam-se às fitas opostas (Figura 2). A mistura destes componentes,
mais o DNA molde são colocados em um termociclador, e os produtos da
amplificação são observados, após a eletroforese, geralmente em géis de agarose.
Figura 2. Esquema dos ciclos de PCR: (1) desnaturação a 94°C; (2) anelamento a 54°C e (3) extensão a 72°C.
12
A possibilidade de se gerar grandes quantidades de fragmentos de DNA de
segmentos específicos do genoma foi um dos aspectos fundamentais da revolução
causada pela PCR. Todavia, esta técnica ainda apresentava uma limitação
significativa na obtenção de marcadores moleculares anônimos distribuídos pelo
genoma: a construção de oligonucleotídeos para a amplificação via PCR dependia
essencialmente do conhecimento prévio das seqüências de nucleotídeos que
flanqueavam a seqüência de DNA de interesse. Para se conhecer estas seqüências é
necessária a clonagem e sequenciamento da região. Em vista disso, com exceção de
alguns genes de seqüência conhecida, a PCR apresentou, de início, um uso limitado
como técnica para a obtenção de marcadores moleculares (Ferreira & Grattapaglia,
1998).
Diversas técnicas moleculares são largamente utilizadas para a identificação
de espécies, linhagens e formae speciales de diferentes fungos fitopatogênicos. Estas
técnicas são ferramentas úteis e importantes para se estudar a filogenia, as variações
genéticas intraespecíficas nestes grupos e até no entendimento da relação patógeno-
hospedeiro, auxiliando no processo de controle dos fungos fitopatogênicos e na
aplicação das regras fitossanitárias (Azevedo, 1998; Paccola-Meirelles, 1998; Driver
et al, 2000; Stummer et al., 2000).
A PCR pode também ser aplicada para analisar regiões do espaço transcrito
interno do DNA ribossomal (ITS – Internal Transcribed Spacer) possibilitando
comparações de diferentes gêneros e espécies (Fungaro, 2000) e de regiões não-
codificadoras denominadas intron, utilizadas na caracterização genética intra e
interespecífica em fungos fitopatogênicos (De Barros Lopes et al., 1996; Pataro et
al., 2000).
2.5.1. Região ITS do DNA Ribossomal
Os RNAs ribossômicos (rRNAs) são componentes essenciais na fisiologia
celular. Estes componentes interagem de modo específico com as proteínas
ribossômicas para formar as subunidades dos ribossomos que atuam na síntese de
proteínas. Os rRNAs são o principal produto da transcrição em qualquer célula,
13
constituindo geralmente de 80 a 90% da massa de RNA total dos procariontes e
eucariontes.
As seqüências que codificam para rRNA são reiteradas, ocorrendo em
número variável nos diversos organismos estudados. Nos eucariontes, essas cópias
estão organizadas in tandem e agrupadas em uma ou mais regiões cromossômicas.
Os RNAs ribossômicos são classificados conforme seu coeficiente de sedimentação
sob campo centrífugo, que depende tanto do tamanho, quanto da densidade da
molécula, nas unidades Svedberg (de símbolo S). De forma geral, cada unidade de
repetição do rDNA eucarionte possui uma organização conservada (Figura 3),
consistindo de: (1) um espaçador externo (ETS, External Transcribed Spacer),
transcrito em uma seqüência que contém a extremidade 5’ da molécula precursora do
rRNA, esta com alto coeficiente de sedimentação (até 45S); (2) uma região que
codifica para rRNA 18S; (3) um espaçador interno que é transcrito (ITS, Internal
Transcribed Spacer) e que contém a região que codifica para rRNA 5,8S; e (4) uma
região que codifica para rRNA 25-28S e um espaçador externo (NTS, Transcribed
Spacer), que não é transcrito (Lewin, 2001).
Os genes são separados por regiões denominadas ITS1 e ITS2, as quais são
transcritas e processadas para dar origem ao RNA ribossômico maduro. O cluster
gênico que codifica para rRNA aparece repetido centenas de vezes no genoma
fúngico (Fungaro, 2000). Essa região está entre os genes 18S e 28S do rRNA e
contém dois espaços não codificados variáveis e o gene 5.8S do rRNA, apresentando
seqüências altamente conservadas e outras variáveis, permitindo discriminar
Figura 3. Estrutura do cluster (agregado) gênico que codifica RNA ribossômico.
14
diferentes níveis taxonômicos entre gêneros e espécies afins (Figura 1) (Lodolo et
al., 1993, Edel et al., 1996; Jae-Wook et al., 1998). Esta característica tem sido
utilizada para detectar polimorfismo de comprimento de fragmento nos loci de rDNA
através do uso de enzimas de restrição (RFLP – Restriction Fragment Lenght
Polymorphism). As enzimas de restrição cortam o DNA em sítios específicos, onde
cada enzima reconhece uma seqüência característica de nucleotídeos. Entretanto,
quando existe variação entre indivíduos na posição dos sítios de corte e no
comprimento do DNA entre eles, resulta em fragmentos polimórficos (Johnston et
al., 1997). A combinação da amplificação da região ITS e a restrição dos produtos de
amplificação (RFLP-ITS) podem ser úteis para identificar a maioria dos fungos ao
nível de espécie ou grupo de espécies.
2.5.2. Intron Splice Site Primer (ISSP)
As regiões de leitura aberta (ORF, Open Reading Frames) da maioria dos
genes eucariontes são compostas por seqüências codificantes chamadas exons e não-
codificantes chamadas introns. Assim, os RNA mensageiros (mRNAs) precursores
requerem um processamento complexo chamado splicing para a remoção dos introns
e permitir a exportação do mRNA maduro para o citoplasma, onde serão traduzidos
(Woolford, 1989). Exceto os sítios que são bastante conservados para o
reconhecimento pelo spliceossomo, as seqüências nucleotídicas dos introns são
altamente variáveis. Estas mudanças nos introns incluem substituição, deleções e
inserções de nucleotídeos (De Barros Lopes et al., 1996).
Existem cinco classes de introns cada uma com características distintas e,
portanto, com mecanismos de splicing diferenciados: introns GT-AG são os mais
encontrados nos genes nucleares; intron autoprocessante, encontrado nos genes de
rRNA de alguns protozoários; introns AT-AC, também encontrados em genes
nucleares, porém menos comuns que os introns GT-AG; introns do grupo II,
presentes nos genes ribossomais e introns de RNA transportador (tRNA),
encontrados nos genes de tRNA (Brown, 1998).
Os oligonucleotídeos dos sítios de remoção dos introns têm sido utilizados na
caracterização genética intra e interespecífica em fungos (De Barros Lopes et al.,
15
1996; Pataro et al., 2000). Existem alguns oligonucleotídeos que são bastante
utilizados na amplificação destes marcadores em todo o genoma, como, EI1
(CTGGCTTGGTGTATGT), EI2 (CTGGCTTGCTACATAC), LA1
(GCGACGGTGTACTAAC) e LA2 (CGTGCAGGTGTTAGTA), entre outros. A
Figura 4 apresenta um esboço das regiões amplificadas utilizando estes
oligonucleotídeos (De Barros Lopes et al., 1996).
Suga et al (2000 b) detectaram a seqüência do intron do tipo I na região 3’ da
subunidade menor do rDNA (gene 18S) de diferentes Formae speciales de Fusarium
solani. Segundo estes autores, o polimorfismo das seqüências do intron encontra-se
dentro do gene 18S, embora esta região pudesse evoluir lentamente entre os
organismos distantemente relacionados.
2.6. Ferramentas Moleculares no Estudo da Diversidade Genética de
Colletotrichum
EXON 1 INTRON EXON 2
GTATGT TACTAAC
EI1 LA1
EI2 LA2
Figura 4. Esquema indicando as regiões amplificadas pelos oligonucleotídeos EI e LA. As seqüências dos oligonucleotídeos EI1 e EI2 foram baseadas na seqüência consenso GTATGT dos 59 exon-intron splice site. As seqüências dos oligonucleotídeos LA1 e LA2 foram baseadas na seqüência consenso TACTAAC. Fonte: Barros Lopes et al (1996).
16
A aplicação de diferentes técnicas para a caracterização de diferentes espécies
e populações de C. gloeosporioides e C. acutatum começou no inicio da década de
90, no século passado. Várias técnicas foram utilizadas por diferentes autores,
incluindo: RFLP e hibridização DNA-DNA (Liyanage et al., 1992; Bernstein et al.,
1995; Brown et al., 1996), RFLP de rDNA e DNA mitocondrial (mtDNA)
(Sreenivasaprasad et al., 1992; Alahakoon et al., 1994 a e b; Hodson et al., 1993;
Buddie et al., 1999; Talhinhas et al., 2002), RAPD (Alahakoon et al., 1994a, Mills et
al., 1992; Kuramae-Izioka, 1997; Lardner, 1999), PCR com oligonucleotídeos
espécie-específicos (Mills et al., 1992; Martínez-Culebras, 2003), análise de
fragmentos ricos em A+T (Freeman et al., 1993; Freeman & Rodrigues, 1995;
Freeman & Katan, 1997), sequenciamento da região do gene 28S do rRNA (Sheriff,
1994; Bailey, 1996; Johnston et al., 1997), sequenciamento da região ITS1 do rDNA
(Sreenivasaprasad et al., 1992; Sreenivasaprasad et al., 1996 a e b; Saha, 2002) e
AFLP (O’Neil, 1997).
A existência de oligonucleotídeos espécie-específicos, baseados em
seqüências de nucleotídeos da região ITS1 do rDNA, tornaram a PCR uma poderosa
ferramenta que auxilia na identificação de espécies de Colletotrichum. A título de
exemplo, pode ser citados os oligonucleotídeos CaInt2 e CgInt, desenvolvidos
respectivamente para C. acutatum e C. gloeosporioides (Brown et al., 1996). Estes
oligonucleotídeos já foram utilizados em inúmeros trabalhos envolvendo
identificação e caracterização de isolados de Colletotrichum nas mais variadas
culturas, como citros, mamão, pêssego, maracujá, abacate, manga, goiaba, morango e
solanáceas (Brown et al., 1996; Adaskaveg et al., 1997; Peres et al., 2002; Afanador-
Kafuri et al., 2003; Bueno, 2005; Tozze Júnior et al, 2004; Andrade et al., 2007).
Oligonucleotídeos para outras espécies de Colletotrichum também estão disponíveis,
como o par Cc1NF1/Cc2NR1, específicos para C. coccodes (Cullen et al., 2002) e o
CcInt, para C. capsici (Avrdc, 2003).
O polimorfismo de comprimento de fragmentos de restrição (RFLP) também
é outra técnica útil no processo de caracterização de isolados de Colletotrichum.
(Mills et al, 1992; Freeman et al, 1996). Nos estudos com Colletotrichum, os dados
moleculares têm se concentrado em seqüências mitocondriais e ribossomais. As
análises utilizando seqüências da região ITS, que são mais variáveis, são utilizadas
para diferenciação de taxa ao nível intra-específico enquanto que as seqüências das
17
regiões 18S e 28S, mais conservadas, são utilizadas ao nível interespecífico (Sherriff,
1994; Sherriff & Bailey, 1995; Sreenivasaprasad et al., 1994; Sreenivasaprasad et al.,
1996a; Johnston & Jones, 1997; Moriwaki et al., 2002).
As seqüências da região ITS1 mostraram-se informativas para separar
espécies de Colletotrichum e foram utilizadas para inferir relações filogenéticas entre
espécies (Sreenivasaprasad et al., 1994; Sreenivasaprasad et al., 1996a). No caso de
algumas espécies, como C. coccodes, os grupos filogenéticos baseados em
seqüências da região ITS1 estão em concordância com as características
morfológicas (Sreenivasaprasad et al., 1996 a; b), no entanto, no caso de C. acutatum
e C. gloeosporioides, a morfologia algumas vezes está em contradição com os dados
moleculares (Sreenivasaprasad et al., 1996a; Yang & Sweetingham, 1998; Nirenberg
et al., 2002). Portanto, outras técnicas moleculares foram utilizadas para
complementar os dados de sequenciamento da região ITS (Martín & Gárcia, 1999;
Talhinhas, 2002). Vinnere (2002) usou seqüências de múltiplos loci para caracterizar
os isolados de C. acutatum e C. gloeosporioides.
Guthrie et al (1992) estudaram populações de C. graminicola utilizando a
técnica de RAPD e verificaram uma correlação entre o padrão de amplificação com a
origem geográfica, sugerindo uma outra aplicação do método. Longo (1996) estudou
a variabilidade de isolados endofíticos de C. musae utilizando RAPD, os quais
mostraram um alto grau de similaridade sugerindo que endofíticos típicos e
fitopatogênicos são semelhantes. Vilarinhos et al (1995) e Alzate-Marin et al (1997)
avaliaram também por RAPD a diversidade genética de linhagens de C.
lindemuthianum e não observaram a correlação entre os grupos patótipos com a
origem geográfica.
Swart (1999) estudou vários isolados de C. gloeosporioides por RAPD de
abacate, manga e citrus, e conseguiu distinguir os isolados de acordo com os
hospedeiros, constatando que houve relação entre o grau de agressividade e
agrupamentos. O autor verificou que os oligonucleotídeos OPA02, OPC08 e OPB14
possibilitaram a distinção entre os isolados da manga e citrus, mas o OPB12 foi o
que permitiu a distinção dos isolados de citrus dos demais. Também relatou que os
perfis dos isolados da manga e do abacate foram semelhantes. Com a mesma
finalidade, Assunção (1997) estudou a diversidade genética de seis isolados de C.
gloeosporioides de cebola (Allium cepa L.), procedentes de Juazeiro-BA, utilizando
18
RAPD, e verificou a formação de três grupos distintos, sendo que o isolado menos
agressivo foi diferenciado. Assis (2001) visou obter informações sobre a
variabilidade genética de seis isolados de C. gloeosporioides provenientes de manga
rosa e manga espada adquiridas em diferentes locais da cidade de Recife-PE por
meio de RAPD, e verificou que houve um alto grau de homologia entre os seis
isolados, constatando que dois isolados obtidos de variedades diferentes eram
geneticamente mais próximos que os demais.
19
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1. Local e Realização dos Experimentos
Este trabalho foi realizado nos Laboratórios de Fitopatologia e Biologia
Molecular de Fungos da Pós-Graduação em Biologia de Fungos, do Departamento de
Micologia da Universidade Federal de Pernambuco (UFPE).
3.2. Obtenção e Manutenção dos Isolados de Colletotrichum
Dos 28 isolados das diferentes espécies de Colletotrichum utilizados, 15
foram obtidos da Coleção de Cultura da Micoteca - URM (Universidade de Recife –
Micologia) do Departamento de Micologia da Universidade Federal de Pernambuco,
08 foram obtidos da Coleção de Cultura do Departamento de Fitopatologia da Escola
Superior de Agricultura Luís de Queiroz (ESALQ/USP) e 05 foram obtidos da
Coleção de Cultura do Departamento de Fitopatologia da Universidade Federal Rural
de Pernambuco (Tabela 1). Os isolados fúngicos foram mantidos em tubos de ensaio
contendo meio de cultura Batata-Dextrose-Ágar durante 07 dias a 27°C.
Fungo N° de Acesso Origem Geográfica Substrato ou Hospedeiro URM46261 Brejão/PE pedúnculo de cebola URM46271 Belém de S. Francisco/PE folha de cebola URM46281 Brejão/PE inflorescência de cebola URM46291 Petrolina/PE folha de cebola URM48941 Brejão/PE folha de caju URM48961 Garanhuns/PE folha de caju URM49001 São João/PE folha de caju URM49051 Igarassu/PE folha de caju URM49081 Igarassu/PE inflorescência de caju URM48521 Garanhuns/PE folha de manga espada
C. gloeosporioides URM48541 Itambé/PE folha de manga espada URM48561 Igarassu/PE folha de manga rosa URM48571 Igarassu/PE folha de manga espada URM48581 Brejão/PE folha de manga rosa URM48591 Recife/PE folha de manga rosa Ci2 São Paulo/SP folha de ciclâmen PI 132 São Paulo/SP fruto de pimentão CFMM16333 Bragança Paulista/SP fruto de pimentão C. gloeosporioides “Esalq”2 Bragança Paulista/SP fruto de pimentão
C acutatum
PI 152
Acu2
São Paulo/SP São Paulo/SP
fruto de pimentão fruto de pêssego
C. boninense C. boninense “Esalq”2 Caxias do Sul/RS fruto de pimentão C. coccodes C. coccodes “Esalq”2 Caxias do Sul/RS fruto de pimentão C. capsici CFMM12453 Mamanguape/PB fruto de mamão
C. sublineolum Sub2 São Paulo/SP folha de sorgo C. dematium CFMM10233 Balsas/MA caule de soja C. graminicola CFMM10413 Recife/PE folha de milho C. gossypii var.
cephalosporioides
CFMM11473 Montevidéu/GO folha de algodão
Tabela 1. Origem dos isolados de Colletotrichum.
Número de acesso1 da coleção de cultura do Departamento de Micologia da Universidade Federal de Pernambuco. Número de acesso2 da coleção de cultura do Departamento de Fitopatologia da Escola Superior de Agricultura Luís Queiroz (ESALQ/USP). Número de acesso3 da coleção de cultura do Departamento de Fitopatologia da Universidade Federal Rural de Pernambuco.
20
Para avaliar a variabilidade genética, foram utilizados 20 isolados, sendo 17
de C. gloeosporioides, dois de C. acutatum e um de C. sublineolum, estes últimos
utilizados como grupos externos. Para análise da presença e variação do gene cap20,
foram avaliados 28 isolados, sendo 19 de C. gloeosporioides e 09 de outras espécies de
Colletotrichum.
3.3. Obtenção de Micélio para Extração de DNA
Suspensão de conídios (106 conídios/mL) dos isolados de Colletotrichum sp.
foram suspensos em 3 mL de solução Tween 20 a 0,1% (v/v) em tubos de ensaio e
transferidos para frascos de Erlenmeyer de 250 mL contendo 100 mL de Meio
Mínimo líquido. Após a inoculação, estes frascos foram mantidos sob agitação a 27
rotações por minuto (rpm) por 120 horas a 27ºC para o crescimento do fungo.
Posteriormente, a massa micelial foi coletada por filtração a vácuo, lavada em água
destilada esterilizada, determinada a massa úmida e estocada a - 20°C até o momento
de uso para extração de DNA.
3.4. Extração de DNA Genômico
A extração de DNA genômico a partir do micélio de Colletotrichum sp. foi
realizada conforme a técnica descrita por Kuramae-Izioka (1997). A massa micelial
foi triturada em almofariz com auxílio de um pistilo na presença de nitrogênio
líquido. Um grama de micélio triturado foi colocado em microtubos, preenchendo
aproximadamente um terço do volume total. Foram adicionados 700µL do tampão de
extração (Tris-HCl 1M pH 8,0; NaCl 5M; EDTA 0,5 mM pH 8,0; Dodecil Sulfato de
Sódio 10%) previamente aquecido a 65°C. A seguir, as amostras foram incubadas a
65°C por 30 minutos, sendo agitadas levemente a cada 10 minutos. Após esse tempo,
adicionou-se 500µL de acetato de potássio 5M, procedendo-se homogeneização,
incubação a 4ºC por 30 minutos e centrifugação a 12000 rpm por 10 minutos.
Transferiu-se o sobrenadante para um novo microtubo e a este, adicionou-se um
volume da solução CIA (clorofórmio/álcool isoamílico) 24:1, seguida de
centrifugação a 12000 por 10 minutos. Após a centrifugação, o sobrenadante foi
transferido para um novo microtubo, ao qual foi adicionado um volume de
isopropanol absoluto resfriado a 4°C. Após inversão do tubo por várias vezes, o
mesmo foi centrifugado a 12000 rpm por 10 minutos, descartando-se em seguida, o
21
sobrenadante. Ao pellet obtido foi adicionado 1 mL de etanol a 70%, e centrifugado
a 12000 rpm por 10 minutos. O sobrenadante foi descartado e o pellet foi seco a
temperatura ambiente. Posteriormente, adicionou-se ao pellet 70µL de tampão TE
pH 8,0 (Tris-HCl 1M e EDTA 0,5 mM) para ressuspender o DNA, e em seguida,
armazenado a -20°C até o momento do uso.
3.5. Quantificação de DNA Genômico e Revelação dos Géis
Para quantificar e avaliar a qualidade do DNA extraídos de isolados de
Colletotrichum sp., 10µL foram aplicados em gel de agarose a 0,8% (p/v) em tampão
Tris-Borato-EDTA (TBE) 0,5X a 3 V/cm durante 30 minutos. Após a eletroforese, o
gel foi corado com brometo de etídeo (0,5 µg/mL - Sambrook et al., 1989),
visualizado em transiluminador de luz ultravioleta e fotografado usando máquina
digital. DNA de fago lambda λ (Invitrogen), em diferentes concentrações conhecidas,
foi utilizado como marcador.
3.6. Amplificação da Região ITS do rDNA
As reações de amplificação foram efetuadas para um volume final de 25µL
contendo: tampão de PCR 1X (Tris-HCl 20 mM pH 8,4; KCl 50 mM); MgCl2 1,5
mM; dNTP 0,2 mM; oligonucleotídeo 0,2 µM; Taq DNA polimerase 0,04U
(Invitrogen Life Technologies) e 25 ng de DNA. Para amplificação da região ITS foi
utilizado o termociclador Techne TC-512, com os oligonucleotídeos descritos na
Tabela 2. O ciclo de amplificação utilizado seguiu uma desnaturação inicial a 95°C
por 5 minutos; 40 ciclos envolvendo desnaturação final a 95°C por 30 segundos;
anelamento a 50°C por 30 segundos e extensão inicial a 72°C por 1 minuto e trinta
segundos. Os produtos de amplificação da região ITS do rDNA foram separados por
eletroforese em gel de agarose 1,4% a 3 V/cm em tampão de corrida TBE 0,5X pH
8,0, utilizando-se marcador de peso molecular de 100-pb (Invitrogen Life
Tecnologies), corados em solução de brometo de etídeo por 30 minutos, visualizados
em transiluminador de luz ultravioleta e fotografados com máquina digital.
3.7. Amplificação do RFLP-ITS
A digestão enzimática foi realizada pela mistura de 4µL dos produtos de
amplificação das regiões ITS do rDNA com 20µL do mix de restrição contendo 0,1U
22
das enzimas de restrição e tampão específico (1X). Foram utilizadas as enzimas de
restrição MspI, HaeIII e DraI (Invitrogen Life Tecnologies). A reação foi incubada
por 30 minutos a 37°C e os fragmentos resultantes foram separados por eletroforese
em gel de agarose 1,5% utilizando-se o marcador de peso molecular 100-pb
(Invitrogen Life Tecnologies), imersos em tampão de corrida TBE 0,5X pH 8.0. Os
fragmentos de restrição foram corados em solução de brometo de etídeo (0,5 µg/mL)
por 30 minutos, visualizados em transiluminador de luz ultravioleta e fotografados
com máquina digital Sony.
3.8. Amplificação da Região Intron Splice Site Primer (ISSP)
As reações de amplificação foram realizadas num volume final de 25µL nas
seguintes condições: tampão de PCR 1X (Tris-HCl 20mM pH 8,4; KCl 50 mM);
MgCl2 1,5 mM; dNTP 0,25 mM; oligonucleotídeo 0,5 µM; Taq DNA polimerase
0,04U (Invitrogen Life Tecnologies) e 25 ng de DNA. Para amplificação da região
intron foi utilizado o termociclador Techne TC-512), utilizando o oligonucleotídeo
descrito na Tabela 2. O seguinte ciclo de amplificação foi utilizado: desnaturação
inicial a 95°C por 5 minutos; 40 ciclos envolvendo desnaturação final a 95°C por 30
segundos; anelamento a 45°C por 30 segundos; extensão inicial a 72°C por 1 minuto
e 30 segundos e extensão final a 72°C por 5 minutos. Os produtos amplificados
foram separados por eletroforese em gel de agarose 1,0 %, a 3 V/cm em tampão de
corrida TBE 0,5X (pH 8,0), utilizando-se o marcador de peso molecular de 100-pb
(Invitrogen Life Technologies). Em seguida, o gel foi corado em solução de brometo
de etídeo (0,5 µg/mL) por 30 minutos, visualizados em transiluminador de luz
ultravioleta e fotografados com máquina digital.
Oligonucleotídeo
Seqüência (5’-3’)
Marcador Molecular
Referência
ITS4 TCCTCCGCTTATTGATATGC ITS White et al (1990)
ITS5 GGAAGTAAAAGTCGTAACAA ITS White et al (1990)
EI1 CTGGCTTGGTGTATGT INTRON De Barros Lopes et al (1996)
Tabela 2. Oligonucleotídeos ITS4, ITS5 e EI1 utilizados no estudo.
23
3.9. Análise Estatística
Os dados obtidos com as amplificações com os marcadores RFLP-ITS e ISSP
foram analisados pelo programa Numerical Taxonomy System of Multivarite
Programs – NTSYS-PC (Rohlf, 1988; Bussad et al., 1990), ), segundo metodologia
de Fungaro, 1994.
Resumidamente, as etapas serão descritas a seguir: os resultados obtidos
pelos marcadores moleculares foram transformados para uma matriz utilizando
variáveis binárias, ou seja, o número 1 (um) para presença de banda e número 0
(zero), ausência. O coeficiente de Jaccard foi utilizado para a construção de uma
matriz de similaridade.
O dendograma foi gerado utilizando o método de agrupamento UPGMA
(Unweighted Pair Group Method With Arithmetical Average).
3.10. Desenho dos Oligonucleotídeos para o Gene cap20 e Otimização da Reação
Inicialmente, seqüências de nucleotídeos que codificam para o gene cap20
em C. gloeosporioides (Acesso U18061) foram selecionadas do GenBank (National
Center of Biotechnology Information, http://www.ncbi.nlm.nih.gov), utilizando a
ferramenta BLAST. Essas seqüências selecionadas foram utilizadas para o desenho
dos oligonucleotídeos no programa Primer 3 (Rozen et al., 1998). As seqüências
desenhadas para amplificar o gene cap20 em C. gloeosporioides foi denominado P1,
oligonucleotídeo foward, (5’ GCAACATCTCGTCCGCTCT 3’) e o
oligonucleotídeo reverse, denominado P2 (5’ TGAAGTGGGGAGAAGGGAA 3’).
J = A
(P – D)
Onde:
A = número de concordâncias positivas (variáveis presentes);
P = número total de variáveis;
D = número de concordâncias negativas (variáveis ausentes)
24
A otimização da reação de PCR, principalmente quanto à temperatura de
anelamento dos oligonucleotídeos, mostrou que as temperaturas entre 47°C e 50°C
foram ideais. As reações de amplificação foram realizadas num volume final de
25µL nas seguintes condições: tampão de PCR 1X (Tris-HCl 20mM pH 8,4; KCl
50mM), MgCl2 1,5 mM, dNTP 0,3 mM, 0,2 µM de cada oligonucleotídeo, Taq DNA
polimerase 0,04U (Invitrogen Life Tecnologies) e 25 ng de DNA. O ciclo de
amplificação utilizado seguiu os seguintes passos: um inicial de desnaturação (95°C
por 5 minutos), seguido de 10 ciclos envolvendo desnaturação a 95°C por 30
segundos; anelamento a 50°C por 30 segundos e extensão a 72°C por 30 segundos;
um segundo passo com 30 ciclos envolvendo desnaturação a 95°C por 30 segundos;
anelamento a 47°C por 30 segundos e extensão a 72°C por 30 segundos. Todas as
reações foram repetidas quatro vezes (4x) para confirmação dos resultados gerados.
Os produtos de amplificação do gene cap20 foram separados por eletroforese
em gel de agarose 1,0%, com corrida eletroforética em Tampão TBE 0,5X,
utilizando-se marcador de peso molecular 1-Kb (Invitrogen Life Tecnologies). Em
seguida, o gel foi corado em solução de brometo de etídeo (0,5 µg/mL) por 30
minutos, visualizados em transiluminador de luz ultravioleta e fotografados com
máquina digital.
3.11. Digestão Enzimática dos Produtos de Amplificação do Gene cap20 com a
enzima MspI
A digestão enzimática foi realizada pela mistura de 6µL dos produtos de
amplificação do gene cap20 com 20µL do mix de restrição contendo 0,1U da enzima
de restrição MspI (Invitrogen Life Tecnologies) em tampão de restrição específico
(1X). Após a incubação de uma hora a 37°C, os fragmentos resultantes foram
separados por eletroforese em gel de agarose 1,5% utilizando-se o marcador de peso
molecular 1 Kb (Invitrogen Life Tecnologies), a 3 V/cm-1 de distância entre os
eletrodos, imerso em tampão TBE 0,5X pH 8,0. Os fragmentos de restrição foram
corados em solução de brometo de etídeo por 30 minutos, visualizados em
transiluminador de luz ultravioleta e fotografados com máquina digital.
25
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1. Extração e Quantificação do DNA
A quantificação de DNA é uma etapa fundamental para a eficiência da reação
de PCR. Uma técnica bastante simples utilizada na quantificação de DNA é a análise
comparativa de amostras coradas com brometo de etídeo em géis de agarose que
possui a grande vantagem de possibilitar também a verificação da qualidade do
DNA. Com o protocolo de extração de DNA utilizado, foi possível obter
aproximadamente de 100 a 150 ng/µL nos diferentes isolados de Colletotrichum sp.
(Figuras 5 e 6).
A B C D 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Figura 5. Quantificação de DNA de isolados de Colletotrichum sp. As amostras A, B, C e D são os marcadores do DNA λ nas concentrações de 50, 100, 150, 200 ng/µL, respectivamente; as amostras de 1 a 20 são DNAs dos isolados (URM4626, URM4627, URM4628, URM4629, URM4894, URM4896, URM4900, URM4905, URM4908, URM4852, URM4854, URM4856, URM4857, URM4858, URM4859, Ci, PI 13, PI 15, Acu e Sub), respectivamente.
26
4.2. Região ITS do rDNA
Os produtos de amplificação da região ITS do rDNA utilizando os
oligonucleotídeos ITS4 e ITS5, revelaram fragmentos em torno de 600-pb para os 20
isolados de Colletotrichum sp. (Figura 7), não sendo possível diferenciar as espécies.
Diversos pesquisadores trabalhando com os oligonucleotídeos ITS1 e ITS2 da
região ITS, observaram que a maioria de seus isolados, supostamente identificados
600 pb
A B C D 1 2 3 4 5 6 7 8
Figura 6. Quantificação de DNA de isolados de Colletotrichum sp. As amostras A, B, C e D são os marcadores do DNA λ nas concentrações de 50, 100, 150, 200 ng/µL, respectivamente; as amostras de 1 a 8 são DNAs dos isolados (CFMM1633, C. gloeosporioides “Esalq”, C. boninense “Esalq”, C. coccodes“Esalq”,CFMM1245,CFMM1023,CFMM1041 e CFMM1147), respectivamente.
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Figura 7. Perfis de amplificação da região ITS do rDNA obtidos com os oligonucleotídeos ITS4 e ITS5. A amostra M, marcador de peso molecular 100-pb; as amostras de 1 a 20 são DNAs dos isolados de Colletotrichum sp. (URM4626, URM4627, URM4628, URM4629, URM4894, URM4896, URM4900, URM4905, URM4908, URM4852, URM4854, URM4856, URM4857, URM4858, URM4859, Ci, PI 13, PI 15, Acu e Sub), respectivamente.
27
como C. gloeosporioides, apresentaram um único fragmento com cerca de 590-600
pb (Abang, 2002; Martínez-Culebraz et al., 2000; Saha, 2002).
4.3. RFLP- ITS
Os resultados da digestão dos produtos de amplificação da região ITS do
rDNA com as enzimas DraI, MspI e HaeIII são mostradas na Figura 8. A enzima
DraI gerou um fragmento de tamanho em torno de 400-pb para todos os isolados de
Colletotrichum sp., enquanto a enzima MspI gerou três fragmentos distintos em
tamanho de 300, 150 e 100-pb para os isolados URM4626, URM4627, URM4628,
URM4629, URM4894, URM4896, URM4905, URM4908, URM4852, URM4854,
URM4856, URM4857, URM4858, URM4859, Ci e PI 13 de C. gloeosporioides;
fragmentos de 350, 150 e 100-pb para o isolado URM4900 de C. gloeosporioides;
fragmentos de 300, 170 e 100-pb para os isolados PI 15 e Acu de C. acutatum e
fragmentos de 300, 130 e 100-pb para o isolado Sub de C. sublineolum. O perfil de
restrição dos produtos amplificados com a enzima HaeIII gerou três fragmentos de
280, 180 e 150-pb para todos os isolados de C. gloeosporioides e C. acutatum, e
fragmentos de 300, 180 e 170-pb para o isolado Sub de C. sublineolum (Tabela 3).
Isolados
ITS (pb)
DraI
Fragmentos (pb)
MspI
HaeIII
URM4626
URM4627
URM4628
URM4629
URM4894
URM4896
URM4900
URM4905
URM4908
URM4852
URM4854
URM4856
URM4857
URM4858
URM4859
Ci
PI13
PI15
Acu
Sub
600
600
600
600
600
600
600
600
600
600
600
600
600
600
600
600
600
600
600
600
400
400
400
400
400
400
400
400
400
400
400
400
400
400
400
400
400
400
400
400
300, 150 e 100
300, 150 e 100
300, 150 e 100
300, 150 e 100
300, 150 e 100
300, 150 e 100
350, 150 e 100
300, 150 e 100
300, 150 e 100
300, 150 e 100
300, 150 e 100
300, 150 e 100
300, 150 e 100
300, 150 e 100
300, 150 e 100
300, 150 e 100
300, 150 e 100
300, 170 e 100
300, 170 e 100
300, 130 e 100
280, 180 e 150
280, 180 e 150
280, 180 e 150
280, 180 e 150
280, 180 e 150
280, 180 e 150
280, 180 e 150
280, 180 e 150
280, 180 e 150
280, 180 e 150
280, 180 e 150
280, 180 e 150
280, 180 e 150
280, 180 e 150
280, 180 e 150
280, 180 e 150
280, 180 e 150
280, 180 e 150
280, 180 e 150
300, 180 e 170
Tabela 3. Comprimento da região ITS e dos fragmentos de restrição.
28
A
B
C
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Figura 8. Perfis de restrição com as enzimas DraI (A), MspI (B) e HaeIII (C) do fragmento do ITS de 20 isolados de Colletotrichum sp. A amostra M, marcador de peso molecular 100-pb; as amostras de 1 a 20 são DNAs dos isolados (URM4626, URM4627, URM4628, URM4629, URM4894, URM4896, URM4900, URM4905, URM4908, URM4852, URM4854, URM4856, URM4857, URM4858, URM4859, Ci, PI 13, PI 15, Acu e Sub), respectivamente.
600 pb
400 pb
300 pb
130 pb
170 pb
600 pb
300 pb 280 pb
180 pb 170 pb 150 pb
600 pb
100 pb
350 pb
150 pb
29
Figura 9. Dendrograma construído pelo método de UPGMA, utilizando o coeficiente de Jaccard (J) a partir dos perfis de restrição dos produtos de amplificação da região ITS do rDNA com as enzimas DraI, MspI e HaeIII de 20 isolados deColletotrichum sp..
30
A digestão com a enzima DraI não permitiu a diferenciação das espécies de
Colletotrichum, gerando apenas um fragmento do mesmo tamanho para todos os
isolados testados. A enzima MspI gerou padrões de bandas semelhantes para todos os
isolados de C. gloeosporioides, exceto para o isolado URM4900, e diferenciou as
espécies C. acutatum e C. sublineolum testadas. A enzima HaeIII gerou padrões de
bandas semelhantes para todos os isolados de C. gloeosporioides e C. acutatum, e
padrões diferentes para o isolado de C. sublineolum.
A análise de agrupamento gerado pelo resultado da técnica RFLP-ITS
utilizando as três enzimas permitiu a construção de um dendrograma, onde se
observa dois grupos distintos, ao nível de similaridade de 85%. O primeiro grupo
contém todos os isolados de C. gloeosporioides com 100% de similaridade entre si,
exceto o isolado URM4900, e o segundo grupo com dois isolados de C. acutatum
também com 100% de similaridade entre si. O isolado URM4900 apresentou
similaridade de tamanho de fragmentos com os dois grupos em torno de 73%. Os
dados gerados possibilitaram a diferenciação entre C. gloeosporioides, C. acutatum e
C. sublineolum (Figura 9).
Vila Nova (2004), trabalhou com 15 isolados de C. gloeosporioides de
diferentes hospedeiros e regiões geográficas utilizando a técnica de amplificação da
região ITS do rDNA, e observou apenas um fragmento de aproximadamente 600-pb
para todos os isolados. A análise dos perfis dos fragmentos de restrição dos produtos
de amplificação da região ITS com as enzimas DraI e MspI em conjunto, gerou um
dendrograma que evidenciou três grupos distintos, sendo possível observar a
variabilidade genética intraespecífica. No presente trabalho, também foi possível
verificar a variação intraespecífica utilizando as mesmas enzimas, tendo-se
diferenciado o isolado URM4900, obtido de caju da região de São João do Estado de
Pernambuco dos demais isolados de C. gloeosporioides de diferentes hospedeiros e
regiões geográficas distintas, além de ser possível diferenciar as espécies C.
acutatum e C. sublineolum.
Abang (2002) utilizou a amplificação da região ITS1-5.8S-ITS2 do rDNA
com digestão dos produtos com cinco diferentes enzimas de restrição, dentre elas a
HaeIII e MspI para verificar a variabilidade genética de isolados de Colletotrichum
spp. de inhame (Dioscorea spp.). De acordo com os perfis de restrição foi possível
diferenciar os diversos isolados, entretanto, os perfis de restrição das espécies C.
31
musae, C. gloeosporioides e C. kahawae foram idênticos, não podendo ser separadas
somente por essa técnica. Martínez-Culebras et al (2000), estudando a variabilidade
genética de isolados de Colletotrichum spp. de morango, foram capazes de separar os
isolados de C. gloeosporioides das demais espécies analisadas pelos padrões de
restrição da região ITS do rDNA obtidas com nove enzimas de restrição, cujo padrão
específico de C. gloeosporioides foi observado com a enzima MvnI. Martínez-
Culebras (2003) estudando 80 espécies do gênero Colletotrichum por ITS1 e ITS2 da
região 5.8S do rDNA, puderam diferenciar todas as espécies, constatando que os
isolados de C. acutatum da mesma região geográfica pertenciam ao mesmo grupo.
Saha (2002) empregando as técnicas de RAPD e de ITS, encontraram
compatibilidade entre os grupos formados por ambas as técnicas para os isolados de
C. gloeosporioides de Hevea brasiliensis, confirmando a eficácia das duas técnicas
para análise da variabilidade genética intraespecífica para um mesmo tipo de
hospedeiro. Vinnere (2002), utilizando padrão de restrição dos fragmentos da região
ITS, conseguiram distinguir as espécies de C. acutatum, C. gloeosporioides e C.
dematium entre os isolados identificados da forma clássica como sendo C.
gloeosporioides.
Brasileiro et al (2004) analisaram os isolados de F. solani pela análise da
região ITS e não foi observada digestão com a enzima de restrição DraI. As enzimas
MspI e HaeIII mostraram polimorfismo no número e no comprimento dos
fragmentos resultantes, suportando a idéia da existência de diversidade genética
intraespecífica entre os isolados diferentes de F. solani.
Genes ribossomais e suas regiões têm sido largamente usados para
identificação de espécies (Martínez-Culebras et al., 2000) na taxonomia (Driver et
al., 2000), análise filogenética (Rakotonirainy et al., 1994; Hajek et al., 2003) e
diversidade genética (Kiss, 1997). Segundo White et al (1990), as técnicas baseadas
na análise dos padrões de digestão de DNA tanto genômico quanto mitocondrial,
também estão sendo muito utilizadas pela grande estabilidade e conservação dos
sítios de restrição naquela determinada região do genoma do organismo alvo. A
região que compreende entre os genes que codificam os rRNAs 18S e 26S é muito
usada neste sentido. Esta região contém as seqüências internas transcritas1 (ITS1), o
gene que codifica o rRNA 5.8S e a seqüência interna transcrita 2 (ITS2), a qual é
comumente chamada de ITS1-5.8S-ITS2. Para permitir a distinção entre eles utiliza-
32
se uma série de enzimas de restrição separadas ou em conjunto e o padrão de
restrição deve discriminar as espécies. Mesmo assim, duas espécies muito próximas
podem também apresentar o mesmo perfil de digestão, sugerindo que eles se
diferenciaram muito recentemente.
4.4. Intron Splice Site Primer (ISSP)
Os perfis de amplificação da região do intron, utilizando o oligonucleotídeo
EI1 para os 20 isolados de Colletotrichum sp. e o dendrograma gerado estão
ilustrados nas Figuras 10 e 11, respectivamente.
Figura 10. Perfis de amplificação da região de Splicing do intron com o oligonucleotídeo EI1 de 20 isolados de Colletotrichum sp. A amostra M, marcador de peso molecular 100-pb; as amostras de 1 a 20 são DNAs dos isolados (URM4626, URM4627, URM4628, URM4629, URM4894, URM4896, URM4900, URM4905, URM4908, URM4852, URM4854, URM4856, URM4857, URM4858, URM4859, Ci, PI 13, PI 15, Acu e Sub), respectivamente.
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
33
Figura 11. Dendrograma construído pelo método de UPGMA, utilizando o coeficiente de Jaccard (J) a partir dos perfis de amplificação dos produtos com o oligonucleotídeo EI1 obtidos de 20 isolados deColletotrichum sp.
34
O dendrograma gerado evidenciou a formação de três grupos distintos, ao
nível de 85% de similaridade de tamanho de fragmentos, evidenciando a grande
diversidade genética inter e intraespecífica. O primeiro grupo é representado por
quatro isolados de C. gloeosporioides provenientes de cebola: URM4626,
URM4627, URM4628 e URM4629; o segundo grupo compreende dois isolados de
C. gloeosporioides provenientes de manga: URM4852 e URM4858, e o terceiro
grupo é representado por três isolados provenientes de manga (URM4854,
URM4857 e URM4859) de C. gloeosporioides. Todos os grupos formados
apresentaram 100% de similaridade de tamanho de fragmentos para os isolados entre
si. Os isolados URM4894, URM4896, URM4900, URM4905, URM 4908,
URM4856, Ci e PI13 de C. gloeosporioides não formaram grupos, indicando serem
mais distantes geneticamente dos demais isolados. Houve uma certa tendência de
agrupamento por hospedeiro, mas não houve agrupamento por espécies.
Brasileiro et al (2004) analisaram o oligonucleotídeo EI1 para detectar o
polimorfismo intraespecífico em isolados de F. solani. Estes autores relataram que
alguns isolados de F. solani formaram o grupo I - EI1, podendo representar uma
linhagem clonal, além disso, outros isolados da mesma espécie mostraram
divergência genética elevada para o oligonucleotídeo EI1 detectada também pela
análise da região ITS.
De acordo com Muniz et al (1998), a variabilidade de isolados de C.
gloeosporioides (Penz) Penz & Sacc. sugere a existência de grupos de especialização
patogênica. Assim, numerosos casos são reportados, nos quais as espécies e os
biotipos de Colletotrichum spp. estão associados a um único hospedeiro (Smith et al.,
1990).
Até o momento, este é o primeiro relato da utilização do oligonucleotídeo EI1
para análise genética de espécies de Colletotrichum que facilitam a identificação
mais adequada das mesmas.
35
4.5. Amplificação do Gene cap20
A amplificação dos fragmentos referentes ao gene cap20, utilizando os
oligonucleotídeos específicos P1 e P2 para os isolados de C. gloeosporioides, C.
acutatum, C. boninense, C. coccodes, C. capsici, C. dematium, C. graminicola e C.
gossypii var. cephalosporioides, está ilustrada na Figura 12.
Entre os isolados de C. gloeosporioides, os testes com os oligonucleotídeos
desenhados indicaram uma variação na estrutura do gene cap20, pois 12 isolados
amplificaram um fragmento de 950-pb e o isolado URM4905 de C. gloeosporioides
proveniente de caju (URM4905) apresentou consistentemente duas bandas em todas
as repetições da reação, uma idêntica aos demais isolados de C. gloeosporioides
(950-pb) e outra de tamanho menor (700-pb) semelhante à banda gerada em C.
boninense, C. capsici e C. dematium. Além disso, todos os isolados de manga
(exceto o URM4856) e o isolado CFMM1633 proveniente de pimentão de C.
gloeosporioides, não apresentaram amplificação. Também pode ser observada
variação na estrutura do gene entre as espécies, pois C. boninense, C. capsici e C.
dematium apresentaram bandas de tamanhos diferentes da maioria dos isolados de C.
gloeosporioides.
Hwang et al. (1995) evidenciaram o gene cap20 em C. gloeosporioides como
um gene funcional de apressório cuja expressão é claramente induzida pela cera
presente nos frutos de abacate, e sua deleção causou drástica redução na
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 M
Figura 12. Perfis de amplificação do gene de patogenicidade cap20 de 28 isolados de Colletotrichum sp. obtidos com os oligonucleotídeos P1 e P2. A amostra M, marcador de peso molecular 1-Kb; as amostras de 1 a 19 são DNAs dos isolados URM 4626, URM4627, URM4628,URM 4629, URM4894, URM4896, URM4900, URM4905, URM4908, URM4852, URM4854, URM4856, URM4857, URM4858, URM4859, Ci, PI 13, CFMM1633 e C. gloeosporioides “Esalq” de C. gloeosporioides ; as amostras de 20 a 21 são DNAs dos isolados PI 15 e Acu de C. acutatum; as amostras de 22 a 28 são DNAs dos isolados C. boninense “Esalq”(C. boninense), C. coccodes “Esalq” (C. coccodes), CFMM1245 (C. capsici), Sub (C. sublineolum), CFMM1023 (C. dematium), CFMM1041 (C. graminicola) e CFMM1147 (C. gossypii var. cephalosporioides), respectivamente.
36
patogenicidade para este fruto. Ainda, os mesmos autores relataram que nesta espécie
o gene cap20 apresenta uma única cópia no genoma.
Neste trabalho, foi evidenciada a amplificação do gene cap20 em isolados
de C. gloeosporioides provenientes de outros hospedeiros e nas espécies C.
boninense, C. capsici, C. dematium e C. gossypii var. cephalosporioides, e ausência
em C. sublineolum, C. graminicola, C. acutatum e C. coccodes. A maioria dos
isolados de C. gloeosporioides oriundos de manga não apresentaram amplificação
com os oligonucleotídeos testados. Este fato pode sugerir que os oligonucleotídeos
desenhados evidenciaram uma diferença estrutural muito grande nos isolados deste
hospedeiro ou que os oligonucleotídeos não foram adequados para a amplificação de
todos os isolados.
Não foram encontrados na literatura consultada, estudos sobre o gene cap20
em isolados de C. gloeosporioides provenientes de outros hospedeiros, exceto o
abacate, e nem em outras espécies de Colletotrichum.
4.5. Análise dos Fragmentos de Amplificação do Gene cap20 Digeridos com a
Enzima de Restrição MspI
Os produtos de amplificação do gene cap20 dos isolados de C.
gloeosporioides que amplificaram com os oligonucleotídeos P1 e P2 foram
submetidos à digestão com a enzima MspI. A digestão gerou dois fragmentos de
tamanho de aproximadamente de 500 e 250-pb para todos os isolados de C.
gloeosporioides (Figura 13), não evidenciando diferenças na seqüência deste gene.
M 1 2 3 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Figura 13. Perfis de restrição dos produtos de amplificação do gene cap20com enzima de restrição MspI (A e B). A amostra M, marcador de peso molecular 1 Kb; as amostras de 1 a 10 (A) são DNAs dos isolados de C. gloeosporioides (URM4626, URM4627, URM4628, URM4629, URM4894, URM4896, URM4900, URM4905, URM4908 e URM4856, respectivamente) e as amostras de 1 a 3 (B) são DNAs dos isolados de C. gloeosporioides (Ci, PI 13 e C. gloeosporioides “Esalq”, respectivamente).
A B
500 pb 250 pb
37
5. CONCLUSÕES
• A região ITS do rDNA mostrou-se informativa para separar as espécies de
Colletotrichum;
• A técnica RFLP-ITS utilizando a enzima MspI discrimina as espécies C.
gloeosporioides (com exceção do isolado URM4900), C. acutatum e C. sublineolum;
• A técnica RFLP-ITS utilizando a enzima HaeIII distingue apenas a espécie C.
sublineolum e o uso da enzima DraI não diferencia as espécies;
• O ISSP evidencia grande diversidade genética separando os isolados de C.
gloeosporioides;
• A amplificação do DNA dos isolados de Colletotrichum sp. para o gene cap20 com
os oligonucleotídeos P1 e P2, indica que este gene apresenta variações dentro da espécie
C. gloeosporioides relacionada ao hospedeiro, e que também está presente nas espécies
C. boninense, C. capsici, C. dematium e C. gossypii var. cephalosporioides;
• A digestão dos produtos do gene cap20 com a enzima MspI não evidenciou
diferenças na estrutura desse gene entre os isolados de C. gloeosporioides.
38
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7. NORMAS DA REVISTA
Objetivo
Brazilian Archives of Biology and Technology - BABT publica artigos originais de pesquisa, notas curtas e artigos de revisão em Inglês em áreas interdisciplinares das ciências biológicas e de engenharia/tecnologia.
Preparação de manuscritos
A submissão dos artigos implica que não tenha sido publicado ou seja considerado para publicação em outra revista. Cuidados devem ser tomados para preparar um manuscrito compacto com apresentação precisa, o que ajudará os avaliadores na hora de sua aceitação. Todos os artigos estão sujeitos à revisão pelos pares.
MANUSCRITO
Devendo ser enviadas três cópias do manuscrito digitado com espaço simples (máximo de 12 páginas), em papel tamanho A-4 (210x297mm), com margens (2,5 mm esquerda, direita 2,0 mm, superiores e inferior 3,0 mm), sendo preparados com a seguinte disposição de cabeçalhos: ABSTRACT (SUMÁRIO), INTRODUÇÃO, MATERIAIS E MÉTODOS, RESULTADOS E DISCUSSÃO, AGRADECIMENTO, RESUMO, REFERÊNCIAS. Estes cabeçalhos devem ser digitados com letras maiúsculas e em negrito (fonte 12). Para artigos de revisão, os autores devem fazer seus próprios cabeçalhos juntamente com o Resumo e Introdução.
TÍTULO
O título (fonte 18, negrito), iniciais em maiúscula do artigo deve refletir claramente seu conteúdo. Devendo ser seguido pelo nome completo do autor com as iniciais em maiúsculas (fonte 12, negrito) e o endereço (fonte 10, itálico) da instituição onde o trabalho foi executado.
ABSTRACT
Cada trabalho deve ser fornecido com um abstract (itálico) de 100-150 palavras, descrevendo brevemente o propósito e os resultados do estudo. Deve ser o mais conciso possível.
PALAVRAS -CHAVE
Os autores devem fornecer três a seis palavras-chave que serão usadas na
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indexação do trabalho.
INTRODUÇÃO
Deve descrever a base da pesquisa e as informações relevantes sobre o trabalho. Deve indicar também o objetivo do trabalho.
MATERIAIS E MÉTODOS
Os autores devem tomar cuidado quanto ao fornecimento de detalhes suficientes para que outros possam repetir o trabalho. Procedimentos padronizados não precisam ser descritos em detalhes.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os resultados e discussões podem ser apresentados separadamente ou de forma conjunta (autores podem optar pela forma mais fácil). Trabalhos preliminares ou resultados menos relevantes não devem ser descritos. A reprodução dos resultados, incluindo o número de vezes que o experimento foi conduzido e o número de amostras replicadas devem ser expressados claramente.
RESUMO
Todo artigo deve possuir um resumo do em Português e posicionado antes da lista de Referências. Autores de outros países da América Latina podem procurar por ajuda na Editoração da revista, para preparar o resumo em Português de seus artigos.
REFERÊNCIAS
Referências no texto devem ser citadas no local apropriado pelo(s) nome(s) do(s) autor(es) e ano (p. ex.: Raimbault & Roussos, 1996; Raimbault et al., 1997). Uma lista de referências, em ordem alfabética (fonte 10), deve aparecer no final do manuscrito. Todas as referências na lista devem ser indicadas em algum ponto no texto e vice versa. Resultados não publicados não devem ser incluídos na lista. Exemplos de referências são fornecidas abaixo:
Jornais:
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Teses:
Chang, C. W. (1975), Effect of fluoride pollution on plants and cattle. PhD Thesis, Banaras Hindu University, Varanasi, India.
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Livros:
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Pandey, A. (1998), Threads of Life. National Institute of Science Communication, New Delhi.
Conferências:
Davison, A. W. (1982), Uptake, transport and accumulation of soil and airborne fluorides by vegetation. Paper presented at 6th International Fluoride Symposium, 1-3 May, Logan, Utah.
TABELAS E FIGURAS
Tabelas e figuras, numeradas consecutivamente com numerais arábico devem ser inseridas no local apropriado no corpo do texto. Devendo ser utilizados somente para apresentar estes dados, os quais não podem ser descritos no texto.
UNIDADES E ABREVIATURAS
O sistema SI deve ser usado para todos dados experimentais. No caso de outras unidades serem usadas, estas devem ser adicionadas em parênteses. Somente as abreviaturas padrões para as unidades devem ser usadas. Pontos não devem ser incluídos nas abreviaturas (por exemplo: m, e não m. ou rpm, e não r.p.m.), também devem ser usados '%' e '/' no lugar de 'porcento' e 'per'.
LAY-OUT DO MANUSCRITO
Sugere-se que os autores sempre consultem a última edição da revista para ver o estilo e lay-out. Com exceção do título, abstract e palavras-chave, todo o texto deve ser disposto em duas colunas em todas as páginas. No rodapé da primeira página (fonte 8) deve estar sendo indicado o autor para correspondência. Todo o manuscrito deve ser preparado na fonte "Times New Roman", tamanho 11 (exceto na lista de referências, que deve ser em tamanho 10).
ESPAÇAMENTO
Deve ser deixado um espaço entre o título do artigo e o nome dos autores, e entre o cabeçalho e o texto, entre as colunas deixar espaçamento de 0,6 cm. Não deixar espaços entre os parágrafos do texto.
ENVIO ELETRÔNICO
O manuscrito deve estar acompanhado de um disquete indicando o nome e
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versão do programa editor de texto usado (usar somente MS Word 6/7 ou compatível).
PARES
Ao submeter o manuscrito, solicitamos ao autor sugerir até três pares, fornecendo: nome completo, endereço e quando possível e-mail. Os autores podem solicitar que certos revisores sejam excluídos da revisão de seus manuscritos, caso sintam que estes revisores possam ser tendencialmente desfavoráveis. Contudo, a escolha final dos referees permanecerá com o Editor.
TARIFAS POR PÁGINAS E SEPARATAS
Não há tarifas por páginas. As separatas deverão ser solicitadas sob a aceitação do artigo.
O manuscritos e toda correspondência deve ser enviada ao Editor, Prof. Dr. Carlos R. Soccol, no endereço abaixo.
© 2001-2007 Tecpar
R. Prof. Algacyr Munhoz Mader, 3775 - CIC 81350-010 Curitiba PR Brasil
Tel.: +55 41 3316-3012 / 3316-3052 Fax: +55 41 247-0844