Arapongas 2014

CENTRO DE PESQUISA EM CIÊNCIAS AGRÁRIAS MESTRADO EM SAÚDE E PRODUÇÃO DE RUMINATES

SAMUEL GUEMRA

EFEITO DA QUERCETINA SOBRE A PRODUÇÃO IN VITRO DE EMBRIÕES BOVINOS

Arapongas 2014

SAMUEL GUEMRA EFEITO DA QUERCETINA SOBRE A PRODUÇÃO IN VITRO

DE EMBRIÕES BOVINOS

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Saúde e Produção de Ruminantes (Programa Associado entre Universidade Estadual de Londrina - UEL e Universidade Norte do Paraná - UNOPAR), como requisito parcial à obtenção do título de Mestre em Saúde e Produção de Ruminantes. Orientador: Prof. Dr. Paulo Roberto Adona

AUTORIZO A REPRODUÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.

Dados Internacionais de catalogação-na-publicação Universidade Norte do Paraná

Biblioteca Central Setor de Tratamento da Informação

Guemra, Samuel G961e Efeito da quercetina sobre a produção in vitro de embriões bovinos / Samuel

Guemra. Arapongas: [s.n], 2014. xiv; 85f. Dissertação(Mestrado em Saúde e Produção de Ruminantes) - Saúde e Produ -

ção de Ruminantes. Universidade Norte do Paraná e Universidade Estadual de Londrina.

Orientadora: Profº. Drº. Paulo Roberto Adona 1- Medicina veterinária – dissertação de mestrado – UNOPAR/UEL 2-

Reprodução de ruminantes 3- Antioxidantes 4- Bovino 5- Embrião 6- Quercetina 7- Oócitos I- Adona, Paulo Roberto; orient. II- Universidade Norte do Paraná. III- Universidade Estadual de Londrina

CDU 619:636.2

ii

SAMUEL GUEMRA

EFEITO DA QUERCETINA SOBRE A PRODUÇÃO IN VITRO DE EMBRIÕES BOVINOS

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Saúde e Produção de Ruminantes (Programa Associado entre Universidade Estadual de Londrina - UEL e Universidade Norte do Paraná - UNOPAR), como requisito parcial à obtenção do título de Mestre em Saúde e Produção de Ruminantes.

BANCA EXAMINADORA

____________________________________ Prof. Orientador

Dr. Paulo Roberto Adona Universidade Norte do Paraná

____________________________________ Prof. Componente da Banca

Dr. Paulo Sergio Monzani Universidade Norte do Paraná

____________________________________ Prof. Componente da Banca

Dr. Otávio Mítio Ohashi Universidade Federal do Para

Arapongas, 21 de março de 2014.

iii

DICATÓRIAS.

Dedico este trabalho primeiramente a Deus

pela saúde, fé e perseverança que tem me

dado.

A minha esposa Wolneya e minhas filhas

Bianca e Geovana que tiveram paciência nas

minhas ausências e não mediram esforços

para que eu completasse mais esta fase da

minha vida.

iv

AGRADECIMENTOS

Em especial agradeço primeiramente a Deus pelo dom da vida.

Ao Prof. Dr. Paulo Roberto Adona não só pela constante orientação

neste trabalho, mas, sobretudo pelas oportunidades que tem me oferecido, o qual

serei eternamente grato.

Aos Profs. Drs. Paulo Sergio Monzani e Otávio Mítio Ohashi pelos

ensinamentos fundamentais para a execução deste projeto e, sobretudo pela

amizade e companheirismo.

A Agropecuária Laffranchi e a Universidade Norte do Paraná por

conceder à infraestrutura e apoio financeiro ao projeto.

Aos colegas de classe, pela paciência, carinho, alegria, amizade,

trocas de experiências, trabalhos e estudos intermináveis.

A todos os professores que formam a equipe do mestrado de Saúde

e Produção de Ruminantes, em especial ao Prof. Dr. Werner Okano, todo meu

agradecimento, pois esta minha experiência acadêmica será lembrada para o resto

da minha vida.

Aos meus pais, Moises e Clarice pelo incentivo e por ter depositado

em mim muita confiança.

A esposa Wolneya pela paciência nas minhas ausências e pelas

palavras de apoio, pois esta pessoa foi magnífica para que este projeto pudesse ser

concluído.

v

A minhas filhas, Bianca e Geovana, estas são a razão de tudo.

Aos colegas da fazenda Renato, Tobias, Nadelson, Marcos, Eriko,

enfim, a todos os funcionários, pela troca de experiência e convívio em harmonia

durante a execução deste projeto.

Enfim, agradeço a todos que estiveram presentes nesta minha

trajetória acadêmica.

Muito obrigado!!!

vi

“Insanidade é continuar fazendo sempre a mesma coisa e esperar resultados diferentes”.

Albert Einstein

vii GUEMRA, Samuel. Efeito da quercetina sobre produção in vitro de embriões bovinos. 2014. 85 p. Dissertação de Mestrado Acadêmico Saúde e Produção de Ruminantes (Mestrado de Saúde e Produção de Ruminantes) – Universidade Norte do Paraná, Arapongas, 2014.

RESUMO

A técnica de produção in vitro (PIV) de embriões permite que embriões viáveis para serem transferidos sejam gerados por oócitos imaturos, possibilitando assim, o aumento do número de descendentes de animais com alto valor genético em um intervalo menor de tempo. Embriões cultivados em sistemas contendo 20% de O2 estão predispostos a maior formação de espécies reativas de oxigênio (EROs). As EROs, quando em grande quantidade, são prejudiciais ao desenvolvimento embrionário. O presente estudo teve por objetivo melhorar a qualidade e a quantidade de embriões bovinos durante a PIV através da suplementação dos meios de cultivo embrionários com substâncias antioxidantes. As análises estatísticas foram realizadas pelo programa BioEstat 5.0 e, em seguida, pela análise de variância (ANOVA). Os oócitos recuperados de ovários provenientes de abatedouro foram maturados, fecundados e cultivados in vitro, em gota de 100 μL a 38,5ºC e atmosfera gasosa com 5% de CO2. Nos experimentos da maturação in vitro (MIV), os oócitos foram maturados em grupos contendo 0,4, 2, 10 e 50 M de quercetina, 100 M de cisteamina e na ausência dos antioxidantes. Os resultados mostraram variação significativa (p<0,05) no percentual de blastocisto nos grupos tratados com 0,4, 2, 10 e 50 M de quercetina (56,9%, 59,5%, 53,6% e 49,6%, respectivamente) e com 100 M de cisteamina (50,4%) em comparação ao grupo controle (42,3%). Os experimentos do cultivo in vitro (CIV), foram realizados utilizando 10 μM de quercetina (Q10), insulina-transferrina-selênio (ITS), Q10 + ITS (QITS) e controle sem oxidante. As taxas de clivagem entre os grupos foram similares (P>0,05), com média de 83,2%. O desenvolvimento embrionário variou entre os tratamentos, sendo estatisticamente superiores nos grupos Q10 (46,1%), ITS (47,1%) e QITS (45,0%) quando comparado ao grupo controle (38,3%) e não diferiram (p>0,05) entre si. As taxas de eclosão e de células totais dos embriões também foram similares (P>0,05) entre os grupos, com média de 52,8% e 208 células por embrião, respectivamente. Em conclusão, a quercetina, quando utilizada na MIV, foi superior à cisteamina, a qual, por sua vez, foi superior ao controle. A suplementação dos meios de cultivo com os antioxidantes quercetina e/ou ITS aumentou a produção de blastocistos quando comparada ao controle. Palavras-chave: Antioxidante, Bovino, Embrião, Quercetina, Oócitos.

viii GUEMRA, Samuel. Effect of quercetin on in vitro production of bovine embryos 2014. 85 p. Dissertação de Mestrado Acadêmico Saúde e Produção de Ruminantes (Mestrado de Saúde e Produção de Ruminantes) – Universidade Norte do Paraná, Arapongas, 2014.

ABSTRACT

The technique of in vitro production (IVP) of embryos allows immature oocytes to generate viable embryos for transfer, thus enabling the increased number of animal descendants with high genetic value in a shorter time. Embryos, when cultured on systems containing 20% O2, are predisposed to an increased formation of reactive oxygen species (ROS). ROS, when in large quantities, are harmful to the embryonic development. This study aimed to improve the quality and quantity of cattle embryos during IVP, through the supplementation of embryo culture media with antioxidants. Statistical analyses were performed using the BioEstat 5.0 software followed by analysis of variance (ANOVA). Oocytes recovered from ovaries obtained in slaughterhouses were matured, fertilized and cultured in vitro, in 100 μL drop at 38.5ºC and gaseous atmosphere with 5% CO2. In the experiments of in vitro maturation (IVM), oocytes were matured in groups containing 0, 4, 2, 10 and 50 M quercetin, 100 M cysteamine and in the absence of antioxidants. The results showed significant variation (p <0.05) in the percentage of blastocyst in the groups treated with 0, 4, 2, 10 and 50 M quercetin (56.9, 59.5, 53.6 and 49.6%, respectively) and 100 M cysteamine (50.4%) compared with the control group (42.3%). The experiments of in vitro culture (IVC) were performed using 10 M quercetin (Q10), insulin-transferrin-selenium (ITS), Q10 + ITS (QITS) and control without oxidant. Cleavage rate were similar between groups (P> 0.05), averaging 83.2%. The embryonic development varied between treatments, and it was statistically higher in Q10 (46.1%), ITS (47.1%) and QITS (45.0%) groups compared with the control group (38.3%), and it did not differ (p> 0.05) between the groups. Hatching rate and total cell rate of embryos were also similar (P> 0.05) between groups, with a mean of 52.8% and 208 cells per embryo, respectively. In conclusion, quercetin, when used in IVM, performed greater than cysteamine, which in turn was superior to the control. Supplementation of culture media with quercetin and/or ITSs antioxidants increased blastocyst production compared with the control.

Key words: Antioxidant, bovine, embryo, quercetin and oocyte.

ix

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1 – Participação do Brasil no total de embriões bovinos produzidos

in vitro no mundo na ultima década (2001 – 2010). ................................................. 14

Figura 2 – Estrutura química básica dos flavonóides e relação estrutura

atividade da quercetina. ........................................................................................... 25

Figura 3 – Formação de espécies reativas de oxigênio e mecanismo

antioxidante nos sistemas biológicos. ...................................................................... 26

Figura 4 - Níveis de glutationa (GSH) intracelular em oócitos bovinos

avaliado com Cell Tracker Blue. ............................................................................... 32

Figura 5 - Coloração com Hoechst para avaliação da maturação e do

número de células dos embriões .............................................................................. 32

Figura 6 - Imagens fotomicrográficas de epifluorescência de embriões in

vitro bovinos. ............................................................................................................ 53

Figura 7 - Uso de quercetina e ITS no cultivo de embriões bovinos in vitro

e seus efeitos sobre a expressão gênica dos genes GPX1 e SOD2. ....................... 54

x

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 – Efeitos da quercetina e da cisteamina sobre a maturação in

vitro de oócitos bovinos. ........................................................................................... 31

Tabela 2 – Uso da quercetina e da cisteamina na maturação in vitro e seu

efeito para a competência do desenvolvimento embrionário. .................................. 32

Tabela 3 - Primers utilizados nas análises da expressão genética relativa. ............ 52

Tabela 4 - Suplementação dos meios de CIV com diferentes

concentrações de quercetina e o seu efeito sobre o desenvolvimento

embrionário. ............................................................................................................ 52

Tabela 5 - Avaliação do uso de quercetina e ITS e seus efeitos sobre o

desenvolvimento embrionário ................................................................................... 52

xi

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

‘g’ Constante de gravitação universal

μg Micrograma

μM Micromolar

ANOVA Análise de variância

BME Meio basal de eagle

bp Pares de bases

BSA Albumina sérica bovina

CAT Catalase

cDNA Ácido desoxirribonucleico complementar

CIV Cultivo in vitro

CMF2HC 4-chloromethyl-6,8-difluoro-7-hydroxycoumarin

CO2 Dióxido de carbono

Cu Cobre

D Dia

DCFDA 2’,7’ –dichlorofluorescein diacetate

dmp Desvio padrão médio

DNA Ácido desoxirribonucleico

epm Erro padrão médio

EROs Espécies reativas de oxigênio

Fe Ferro

FIV Fecundação in vitro

FSH Hormônio folículo estimulante

GAPDH Gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase

GPx Glutationa peroxidase

GR Glutationa redutase

GSH Glutationa reduzida

GSSH Glutationa oxidada

H+ Hídrón (cátion hidrogênio)

H2O2 Peroxido de hidrogênio

ITS Insulina, transferrina e selênio

LH Hormônio luteinizante

Max. Máxima

xii MEM Meio mínimo essencial

Min. Mínima

MIV Maturação in vitro

mL Mililitro

mm Milímetro

mM Milimolar

NaCl Cloreto de sódio

NADPH Nicotinamida adenina dinucleótido fosfato

O2̇ ˉ Radical superóxido

O2 Oxigênio

OH ̇ Radical hidroxila

P Probabilidade

PBS Tampão fosfato-salino

PCR Reação em cadeia da polimerase

PIV Produção in vitro

Prx Peroxirredoxinas

PVA Álcool polivinil

Q Quercetina

QITS Quarcetina + insulina, transferrina e selênio

qPCR Reação em cadeia da polimerase quantitativa

RVG Rompimento de vesícula germinativa

Se Selênio

SFB Soro fetal bovino

-SH Sulfidrilas

SOD Superóxido dismutase

SOFaa Fluído sintético de oviduto + aminoácidos

-SS Ponte dissulfeto

Tab. Tabela

TALP Tyrodes, albumina, lactato e piruvato

TCM 199 Meio de cultivo de tecidos

UV Ultravioleta

VG Vesícula germinativa

xiii

SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO ...................................................................................................... 14

2. HIPÓTESE ............................................................................................................ 15

3. OBJETIVO ............................................................................................................ 15

3.1. OBJETIVO GERAL .................................................................................................. 15

3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ....................................................................................... 16

4. REVISÃO DE LITERATURA ................................................................................. 17

4.1. PRODUÇÃO IN VITRO DE EMBRIÕES BOVINOS ........................................................... 17

4.1.1. Maturação in vitro (MIV) .................................................................................. 17

4.1.2. Cultivo in vitro (CIV)......................................................................................... 18

4.3. ESPÉCIES REATIVAS DE OXIGÊNIO .......................................................................... 19

4.4. ANTIOXIDANTES .................................................................................................... 21

4.5. ANTIOXIDANTES UTILIZADOS NA PIV DE EMBRIÕES BOVINOS ...................................... 22

4.5.1. Cisteamina ...................................................................................................... 22

4.5.2. Insulina-transferrina-selênio (ITS) ................................................................... 23

4.6. CARACTERÍSTICAS BIOQUÍMICAS E FUNÇÕES DOS FLAVONÓIDES (QUERCETINA) .......... 24

5. ARTIGOS .............................................................................................................. 27

5.1. ARTIGO 1 (PUBLICADO NO PERIÓDICO - ARQUIVO BRASILEIRO DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA). ............................................................................................................. 27

5.1. ARTIGO 2 (ARTIGO SUBMETIDO PARA PUBLICAÇÃO NO PERIÓDICO SEMINA: CIÊNCIAS AGRÁRIAS, UEL). ........................................................................................................ 36

6. CONCLUSÃO GERAL .......................................................................................... 55

7. REFERÊNCIAS ..................................................................................................... 55

8. ANEXOS ............................................................................................................... 62

ANEXO A - Carta de aprovação do comitê de ética em pesquisa com animais........ 63

ANEXO B - Normas de formatação do periódico arquivo brasileiro de medicina veterinária e zootecnia - ABMVZ. .............................................................................. 64

ANEXO C – Carta de recomendação para publicação .............................................. 70

ANEXO D – Normas de formatação do periódico Semina: Ciências Agrárias .......... 71

ANEXO E – Protocolos de meios para PIV de embriões bovinos ............................. 77

14

1. INTRODUÇÃO

O Brasil, na última década, alcançou uma marca histórica na produção in

vitro (PIV) de embriões bovinos (Tab. 1). Em 2011, foi registrada uma produção

de 350.762 embriões, dos quais 90,7% seriam provenientes de PIV,

representando um crescimento de 15% em relação ao ano de 20101.

Figura 1. Participação do Brasil no total de embriões bovinos produzidos in vitro no mundo na última década (2001 – 2010).

Adaptado de VIANA, 20121.

A biotécnica de PIV de embriões dispõe de algumas vantagens na

produção do rebanho bovino, tal como a diminuição do intervalo entre a

geração e a produção de um grande número de embriões/vaca/ano. Apesar

dos benefícios, essa técnica ainda possui algumas limitações, as quais têm

demandado um enorme esforço no sentido de melhorar a eficiência da PIV de

embriões2; 3; 4. Apenas 35% a 40% dos oócitos bovinos maturados in vitro

desenvolvem-se até o estádio de blastocisto5; 6; 7 e desses, somente 30%

chegam a termo após a transferência3; 7. Os embriões bovinos, quando

0.000

50.000

100.000

150.000

200.000

250.000

300.000

350.000

400.000

450.000

500.000

2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010

Prod

ução

de

Em

briõ

es

Ano

Brasil

Mundo

15

produzidos in vitro, apresentam qualidade inferior aos que se desenvolveram in

vivo8. Tal fato pode estar relacionado à qualidade dos meios de cultura

utilizados na PIV de embriões, pois esses exercem fortes influências sobre o

desenvolvimento embrionário, uma vez que são mantidos nos meios de cultura

por vários dias9. Contudo, os conhecimentos adquiridos em relação aos meios

para PIV de embriões bovinos parecem ainda não controlar totalmente alguns

fatores relacionados aos oócitos e embriões, tais como o ambiente atmosférico

e a deficiência ou excesso de componentes químicos10; 11; 12.

Durante a PIV de embriões, ocorre um aumento de produção das

espécies reativas de oxigênio (EROs) proveniente da alta tensão de oxigênio,

da exposição à luz e do excesso de manipulação13. As EROs, quando em

baixas concentrações, atua na promoção da competência do oócito e do

desenvolvimento do embrião13; 14. Porém, quando em grande quantidade, as

EROs podem provocar efeitos prejudiciais nas funções das células, conduzindo

a danos oxidativos dos componentes intracelulares, os quais podem induzir a

apoptose12; 13; 15. Neste contexto, faz-se necessária a suplementação dos meios

de cultivo com drogas antioxidantes, buscando reduzir a quantidade de EROs

durante a PIV de embriões bovinos15; 16; 17.

2. HIPÓTESE

A suplementação com quercetina dos meios de PIV de embriões bovinos

diminui o estresse oxidativo e melhora a eficiência da produção in vitro.

3. OBJETIVO 3.1. OBJETIVO GERAL

16

Melhorar a qualidade e a quantidade de embriões bovinos durante a PIV,

por meio da suplementação dos meios de cultivo embrionários, com

substâncias antioxidantes.

3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

(i) Estudar os efeitos da suplementação dos meios de MIV com

quercetina, no que tange à taxa de maturação nuclear, à clivagem, ao

desenvolvimento embrionário, à eclosão e ao número total de células dos

blastocistos.

(ii) Avaliar a taxa de clivagem, o desenvolvimento embrionário, a eclosão

e o número total de células dos embriões cultivados em meio SOFaa,

suplementados com quercetina e/ou ITS.

(iii) Analisar a concentração de GSH intracelular dos oócitos maturados

em meio de MIV suplementado com quercetina.

(iv) Determinar o efeito da adição de quercetina e/ou ITS em meio

SOFaa, no que se refere ao nível de GSH e EROs intracelular dos embriões,

três dias após a fecundação in vitro.

(v) Estudar a expressão relativa dos genes GPX1 e SOD2 dos embriões

cultivados em meio SOFaa, tratados com quercetina e/ou ITS.

17

4. REVISÃO DE LITERATURA

4.1. PRODUÇÃO IN VITRO DE EMBRIÕES BOVINOS

As fêmeas bovinas possuem, por ocasião da puberdade,

aproximadamente 70.000 oócitos em seus ovários18. Durante todo o período de

desenvolvimento, desde a formação e o crescimento dos oócitos e dos folículos

até o período de dominância folicular, os oócitos bovinos permanecem em

estádio de prófase I. Quando o animal entra na fase reprodutiva, alguns

folículos são recrutados e os oócitos começam a crescer e maturar. No

entanto, de todo esse potencial in vivo, somente um oócito será ovulado, e o

restante sofrerá atresia19. Deste modo, a técnica de PIV de embriões tem o

potencial de resgatar os oócitos imaturos ainda no ovário e cultivá-los in vitro

até o estádio de blastocisto, quando estarão aptos à transferência a receptoras

previamente sincronizadas8.

4.1.1. Maturação in vitro (MIV)

Os oócitos bovinos, quando imaturos, permanecem na fase de prófase da

primeira meiose (prófase I). Durante a MIV, os oócitos passam por uma

complexa sequência de modificações nucleares (maturação nuclear) e

citoplasmáticas (maturação citoplasmática)20, estimuladas principalmente pela

ação dos hormônios gonadotróficos21. A maturação nuclear é marcada pelo

reinício do ciclo celular. Os oócitos, sob influência hormonal, progridem da fase

de prófase I, passando pelos estádios de metáfase I, anáfase I, telófase I

(término da primeira divisão meiótica) e até pelo estádio de metáfase da

segunda divisão meiótica22. A competência de desenvolvimento do oócito em

embrião no estádio de blastocisto é dependente de modificações bioquímicas,

moleculares e estruturais do citoplasma. Essas modificações relacionadas à

18

maturação citoplasmática são processos altamente complexos, que envolvem

vários eventos simultâneos – tais como sintese de proteínas e modificações

ultraestruturais –, tanto no que se refere à morfologia quanto à redistribuição de

organelas no citoplasma8; 23.

O sucesso da MIV dos oócitos bovinos depende de atmosfera gasosa,

da temperatura, de suplementação proteica e de fatores de crescimento, todos

em condições ideais ao sistema biológico dos oócitos24. Vários experimentos

têm sido realizados para maximizar a MIV, tais como: adição de fatores de

crescimento, soro fetal bovino, soro de fêmea em estro, hormônios, líquido

folicular25; 26; 27 e, ainda, a suplementação dos meios de maturação com

substâncias antioxidantes4; 16; 17. Entretanto, os resultados de MIV são

inferiores àquele apresentado in vivo23; 28; 29. Deste modo, a elucidação dos

mecanismos relacionados à maturação in vitro é fundamental para o

desenvolvimento e o aperfeiçoamento dessa técnica30.

4.1.2. Cultivo in vitro (CIV)

O cultivo in vitro corresponde à etapa de desenvolvimento do oócito

fertilizado até o estádio de blastocisto. Neste período, os zigotos passam por

modificações importantes – tais como: (i) ativação do genoma embrionário

(transição materno-zigótica), (ii) divisão celular (clivagem), (iii) compactação

dos blastômeros no estádio de mórula, (iv) início da diferenciação embrionária

(células do tofoblasto, que darão origem à placenta e aos anexos fetais, e

células da massa celular interna, que formarão o feto propriamente dito), com a

formação da blastocele24.

A qualidade do meio de cultura e as condições de cultivo exercem forte

influência sobre a qualidade dos embriões9, uma vez que são mantidos nesse

sistema por até sete dias. Nas últimas décadas, várias investigações têm sido

desenvolvidas sobre o sistema de cultivo in vitro de embriões bovinos31; 32; 33,

uma vez que a qualidade dos embriões produzidos in vitro pode ser

19

influenciada pelo ambiente atmosférico34.

O oxigênio constitui um componente essencial para a manutenção da

viabilidade e para o desenvolvimento embrionário35. No entanto, quando os

embriões são cultivados in vitro, em um ambiente atmosférico de 20% de O2,

tem-se maior formação de espécies reativas de oxigênios (EROs)15; 34 se

comparado ao desenvolvimento in vivo, cuja concentração de O2 na tuba

uterina varia entre 5% a 8%36. Neste contexto, o uso de antioxidante é

considerado indispensável no sistema de CIV10; 34, pois visa a balancear a

formação de EROs e manter as funções fisiológicas dos embriões, contrapondo

o aumento indiscriminado de EROs no sistema de CIV15.

4.3. ESPÉCIES REATIVAS DE OXIGÊNIO

As espécies reativas são compostos químicos altamente reativos que

apresentam pelo menos um elétron não compartilhado na camada de valência,

sendo, portanto, eletronicamente instáveis, com acapacidade de reagir com um

grande número de compostos. Essas espécies podem agir como agentes

oxidantes, atuando como receptores de elétrons ou como redutores, doando

elétrons37. Quando são formadas a partir do oxigênio, são chamadas de EROs.

No entanto, outros tipos de espécies reativas podem surgir do nitrogênio, do

carbono ou do enxofre38. As de maior relevância são as EROs, pois são

produzidas pelo metabolismo fisiológico dos embriões13; 38, sendo a mitocôndria

o principal local de produção39. Essas espécies são produzidas, ainda, por

outras reações redoxes, como aquelas envolvidas em mecanismos de defesa

contra patógenos (por exemplo, o caso da oxidase NADPH)40. As três

principais EROs envolvidas na PIV de embriões bovinos são: (i) superóxido

(O2-), (ii) peróxido de hidrogênio (H2O2) e (iii) hidroxila (OH ̇)15.

Superóxido (O2

-)

O ânion superóxido é um radical livre formado pela adição de um elétron

20

à molécula de oxigênio (O2)41. Sua formação ocorre de forma espontânea em

quase todas as células aeróbicas, especialmente na membrana mitocondrial,

tendo como principal característica pouca reatividade biológica e desenvolve

sua ação somente no local onde são produzidos, sem interagir com

membranas lipídicas42.

Peróxido de hidrogênio (H2O2)

Nos sistemas biológicos, o peróxido de hidrogênio é formado pela ação

da enzima superóxido dismutase, a qual transforma o radical O2- em H2O2. Essa

molécula não é um radical livre pela ausência de elétrons livres na camada de

valência, mas sim uma espécie reativa extremamente deletéria aos sistemas

biológicos. Essa apresenta um longo tempo de meia vida, sendo capaz de

atravessar membranas biológicas e participar da reação que produz o radical

OH ̇ 41; 42; 43. Hidroxila (OH ̇)

É um radical livre que, quando no sistema biológico, possui alta

reatividade e grande capacidade de causar danos à célula. Sua formação

ocorre a partir do peróxido de hidrogênio, em uma reação catalisada por íons

metais (Fe++ ou Cu++), denominada reação de Fenton42; 43. Quando o radical for

formado próximo ao DNA, e nesse estiver fixado um metal, poderão ocorrer

modificações de base, levando à mutação ou à inativação do DNA. Além disso,

o radical hidroxila é capaz de inativar diversas proteínas (enzimas) ao oxidar os

grupos sulfidrilas (-SH) e ponte dissulfeto (-SS)41. Também é capaz de

provocar a oxidação de lipídios, comprometendo principalmente as membranas

celulares (lipoperoxidação)44.

Quando em baixas concentrações, as EROs desempenham importante

papel fisiológico na PIV de embriões, como a promoção das competências dos

oócitos e do desenvolvimento embrionário13; 14. Porém, quando em excesso,

podem ocasionar danos ao DNA, às proteínas e aos lipídios (peroxidação

21

lipídica)38. A peroxidação lipídica induz alterações na estrutura e na

permeabilidade da membrana celular, acarretando a perda da seletividade

iônica, a liberação do conteúdo de organelas e a formação de produtos

citotóxicos, culminando com a morte da célula41; 45.

A formação de EROs em excesso pode ser favorecida por algumas

particularidades do sistema de PIV de embriões, tais como o excesso de

manipulação, a exposição à luz e a alta tensão de O2, ocasionando o

desequilíbrio no mecanismo de oxido-redução15. Esse desequilíbrio pode levar

ao bloqueio ou retardo do desenvolvimento embrionário13, comprometendo,

assim, a viabilidade dos embriões31. Isso, considerando que embriões de

mamíferos, quando em estádios iniciais de desenvolvimento, são mais

sensíveis às injúrias provocadas pelas EROs46.

Neste sentido, os estudos relacionados ao estresse oxidativo durante a

PIV de embriões têm como objetivo diminuir a formação de espécies reativas

ou fornecer condições para combatê-las.

4.4. ANTIOXIDANTES

Tendo em vista que o fluido folicular e a tuba uterina são locais ricos em

substâncias antioxidantes47, quando os oócitos ou embriões são cultivados in

vitro, acabam sendo coibidos deste sistema natural de defesa contra o estresse

oxidativo15; 34. Por isso, faz-se necessário o uso de substâncias antioxidantes

durante a PIV de embriões.

Em geral, antioxidantes podem ser definidos como qualquer substância

que, quando presente em baixas concentrações, comparada àquela do

substrato oxidável, retarda ou previne, significativamente, a oxidação daquele

substrato45. Os antioxidantes, quando em concentrações adequadas e

condições normais no meio de PIV de embriões, atuam prevenindo a

superprodução das espécies reativas e, consequentemente, diminuindo os

danos causados pelas EROs ao sistema biológico15.

22

Basicamente, existem dois sistemas antioxidantes: (i) sistema

enzimático e (ii) sistema não enzimático.

O sistema enzimático é conhecido por antioxidantes naturais que

garantem uma proteção intrínsica ao sistema biológico contra os danos

oxidativos48. Por meio de uma cooperação sinérgica das enzimas superóxido

dismutase (SOD), catalase (CAT), peroxirredoxinas (Prx), glutationa redutase

(GR), glutationa peroxidase (GPx) e NADPH-quinona oxidoredutase, os

organismos mantêm a concentração de EROs dentro dos limites fisiológicos15;

49. O não enzimático, por sua vez, é conhecido por antioxidantes sintéticos ou

suplementos da dieta. A proteção antioxidante desse sistema é realizada por

moléculas que protegem os alvos biológicos contra o processo oxidativo. Para

tal, essas moléculas devem apresentar pelo menos uma das três propriedades:

(i) inibir a formação de radicais livres (quelar íons metais ou suprimir enzimas

geradoras de radicais livres), (ii) eliminar ou inativar radicais livres, formando

um produto estável, ou (iii) participar do processo de reparo48. Esse grupo é

composto por várias substâncias, tais como ácido ascórbico (vitamina C), a-

tocoferol (vitamina E), selênio, ubiquinonas (coenzima Q), ácido úrico, ácido α-

lipóico42, zinco, taurinas, hipotaurinas, glutationas, betacaroteno, caroteno43,

cistina, β-mercaptoetanol50, flavonóides, L-cisteína, clorofilina curcumina e

proteínas do plasma49.

4.5. ANTIOXIDANTES UTILIZADOS NA PIV DE EMBRIÕES BOVINOS

Dentre os antioxidantes (não enzimáticos) citados na seção anterior, alguns

são rotineiramente utilizados como suplemento no meio de PIV de embriões

bovinos. Nesse sentido, torna-se relevante uma breve descrição de seus

mecanismos antioxidantes, especialmente frente ao estresse oxidativo durante

a PIV de embriões.

4.5.1. Cisteamina

23

A cisteamina é o mais simples aminotiol estável, originado da

degradação do aminoácido cisteína. Essa molécula (cisteamina), quando no

sistema biológico, possui a capacidade de clivar ligações dissulfeto. Desse

modo, a sua relação com a síntese de glutationa reduzida (GSH) durante a PIV

de embriões tem sido estudada por alguns pesquisadores17; 51; 52.

A GSH é uma importante molécula no processo de defesa das células

contra as espécies reativas. Na PIV de embriões, a síntese de GSH é

dependente da disponibilidade de cisteína presente nos meios de cultura52.

Entretanto, a molécula de cisteína, quando em ambiente extracelular, é

instável, sendo auto-oxidada à cistina52. O potencial da cisteamina em quebrar

ligações dissulfeto reduz a cistina à cisteína, proporcionando, assim, maior

disponibilidade de cisteína no meio de PIV de embriões e, consequentemente,

o aumento na síntese de GSH53, o qual melhora a taxa de desenvolvimento dos

blastocistos in vitro17; 50; 52.

4.5.2. Insulina-transferrina-selênio (ITS)

O complexo insulina-transferrina-selênio (ITS) é uma pré-mistura

disponível comercialmente e que pode ser utilizada como suplemento exógeno

durante a PIV de embriões16; 54; 55. Apesar da pré-mistura de ITS não ser um

antioxidante direto, a transferrina é fundamental no transporte de ferro aos

embriões56, podendo, também, atuar como quelante de radical hidroxila,

diminuindo, assim, o estresse oxidativo54. O selênio, quando em quantidade

adequada, possui importantes funções ao sistema antioxidante enzimático, tais

como a incorporação em selenoproteínas (proteínas que contêm selênio sob a

forma de selenocisteína, uma estrutura química semelhante à cisteína, exceto

por um átomo de selênio no lugar do enxofre)55. No sistema biológico, existem

várias proteínas que pertencem ao grupo das selenoproteínas. Podemos citar,

por exemplo, a glutationa peroxidase57.

24

A enzima GPx é crucial para a PIV de embriões por atuar catalisando os

peróxidos de hidrogênio e outras espécies reativas, sendo, portanto,

considerada a responsável pela proteção das membranas celulares contra os

danos oxidativos41; 42.

4.6. CARACTERÍSTICAS BIOQUÍMICAS E FUNÇÕES DOS FLAVONÓIDES (QUERCETINA)

Os flavonóides são uma classe de compostos naturais de baixo peso

molecular que diferem entre si por sua estrutura química e por características

particulares. Esse grupo de substâncias compartilha uma estrutura química

básica comum, sendo um esqueleto com dois anéis benzênicos (A e B) ligados

a um anel pirano (C), formando um difenilpirano. As modificações que ocorrem

no anel C (padrão) resultam em diferentes classes de flavonóides, tais como:

flavonas, flavonóis, flavanonas, dihidroflavonóis, flavonóis, flavonodióis,

chalconas, auronas e antocianidinas. Substituições dos anéis A e B originam

diferentes compostos dentro da mesma classe58.

Os flavonóides possuem várias propriedades farmacológicas, tais como:

anti-inflamatória59, anticarcinogênica60, cardiovascular61 e antioxidante59; 62; 63. A

atividade antioxidante dos flavonóides depende da propriedade redox de seus

grupos hidroxifenólicos64. Assim, para que desempenhe ao máximo sua ação

antioxidante, é necessário que tenha um grupo orto-dihidroxi (catecol) no anel

B, uma dupla conjugada com a função 4-oxo e grupos hidroxilo nas posições 3,

5 e 7 presentes em sua estrutura química básica64; 65. Dentre os flavonóides, a

molécula da quercetina é a que melhor atende aos requisitos químicos para o

exercício antioxidante60; 61; 66 por possuir substituinte hidroxila nas posições 3,

5, 7, 3’, 4’ (Fig. 2).

A quercetina, ultimamente, tem recebido maior atenção quanto aos seus

benefícios, principalmente como antioxidante59; 62; 63; 67. Sua capacidade de

combater espécies reativas é cinco vezes maior se comparada com o ácido

ascórbico (vitamina C) e o tocoferol (vitamina E)68. Ensaios in vitro mostraram

25

que a quercetina possui hidrosolubilidade semelhante à do tocoferol e, quando

associada à vitamina C, tem seu efeito antioxidante potencializado. Isso porque

o ácido ascórbico age como um redutor da oxidação da quercetina,

prolongando, assim, o seu efeito antioxidante69.

Estudos in vitro, utilizando quercetina como antioxidante em

osteoblastos humanos67, espermatozóides de camundongo70 e hepatócitos de

camundongos63 foram eficientes quanto à remoção de radicais livres. A

suplementação do meio de maturação com quercetina também foi capaz de

diminuir o estresse oxidativo em oócitos de suínos, melhorando, inclusive, a

capacidade de desenvolvimento embrionário62. A ação antioxidante da

quercetina ocorre pela interação direta desta molécula com o radical

superóxido, o peróxido de hidrogênio, e por quelar íons metálicos (Figura 3)62;

71. A capacidade da quercetina em quelar íons de metais parece positiva para

os sistemas biológicos, uma vez que essa interação é capaz de diminuir a

formação de espécie reativa, em especial do radical livre hidroxila, que é

catalisado pelos íons Fe++ 72. Inibir a formação das espécies reativas e manter

o equilíbrio de óxido redução durante a PIV de embriões é fundamental para

diminuir os danos ao DNA73 e a apoptose celular15, causadas pelo estresse

oxidativo.

Figura 2. Estrutura química básica dos flavonóides e relação estrutura-atividade da quercetina.

Legenda: em azul – numeração dos átomos de carbono; em vermelho – substituintes importantes à atividade antioxidante; em verde – substituintes menos importantes à atividade antioxidante (adaptado de SCOTTI, 2007)74.

26

Figura 3. Formação de espécies reativas de oxigênio e mecanismo antioxidante no sistema biológico.

O O2 é convertido em superóxido (O2̇ˉ) por enzimas oxidativas da mitocôndria, membrana plasmática e citosol. O O2 ̇ ˉ é transformado em H2O2 pela enzima superóxido-dismutase (SOD), e em OH ̇ quanto catalisada por Fe++ (reação de Fenton). As enzimas catalase (CAT) e glutationa-peroxidade (GPx) atuam sobre o H2O2, transformando-o em H2O, mantendo, assim, o equilíbrio de óxido redução. O selênio favorece o desempenho da enzima GPx e a cisteamina aumenta a concentração de GSH. A quercetina atua quelando os íons de ferro, neutralizando o peróxido de hidrogênio e o radical superóxido. As espécies reativas OH ̇, O2̇ ˉ e H2O2, quando em excesso, acarretam várias formas de lesão celular (adaptado de FERREIRA, 1997)41.

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5. ARTIGOS

5.1. ARTIGO 1 (PUBLICADO NO PERIÓDICO - ARQUIVO BRASILEIRO DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA).

Maturação in vitro de oócitos bovinos em meios suplementados com quercetina e seu efeito sobre o desenvolvimento embrionário

[In vitro maturation of bovine oocytes in medium supplemented with quercetin, and its

effect on embryonic development]

S. Guemra1,3, P.S. Monzani1,3, E.S. Santos1, R. Zanin1, O.M. Ohashi2, M.S. Miranda2, P.R. Adona1,3*

1Agropecuária Laffranchi Tamarana, PR 2Universidade Federal do Pará Belém, PA

3Universidade Norte do Paraná Londrina, PR

RESUMO A quercetina é um flavonoide, amplamente encontrada em frutas, vegetais, grãos, flores, com elevada concentração no vinho tinto, e tem sido caracterizada funcionalmente pela atividade antioxidante. Para avaliação da maturação nuclear e do desenvolvimento embrionário bovino, os oócitos foram maturados por 22h na presença de quercetina (0,4, 2, 10 e 50 M), cisteamina (100 M) e na ausência dos antioxidantes. Os oócitos maturados foram corados com Hoechst para avaliação da maturação in vitro. Para avaliação do desenvolvimento embrionário, os oócitos foram fertilizados e cultivados in vitro, as taxas de desenvolvimento embrionário foram determinadas no sétimo dia de cultivo e o percentual de eclosão e o número de células dos embriões no oitavo dia. Os níveis de glutationa (GSH) dos oócitos foram mensurados por emissão de fluorescência com CMF2HC. A porcentagem de maturação nuclear (±89%) não diferiu entre os grupos. O desenvolvimento embrionário variou entre os tratamentos, o percentual de blastocisto foi superior (P<0,05) nos grupos tratados com 0,4, 2, 10 e 50 M de quercetina (56,9, 59,5, 53,6 e 49,6%, respectivamente) e com 100 M de cisteamina (50,4%) em relação ao grupo controle (42,3%). Na comparação entre os dois antioxidantes, a quercetina (0,4 e 2μM) foi superior na produção de embriões (56,9 e 59,5%, respectivamente) em comparação com cisteamina (50,4%). As taxas de embriões eclodidos foram similares (P>0,05) entre os grupos (±63,0%). O número médio de células dos embriões também foi similar entre os grupos (±233). Os níveis intracelulares de GSH foram superiores nos oócitos maturados com cisteamina, mas similares entre os oócitos tratados com quercetina e o controle. A suplementação da maturação in vitro com antioxidantes melhora as taxas de blastocistos. A quercetina foi superior à cisteamina, que, por sua vez, foi superior ao controle. Mas os níveis de GSH foram superiores somente nos oócitos tratados com cisteamina. Palavra-chave: antioxidante, bovino, embrião, quercetina e oócito

ABSTRACT

Recebido em 16 de maio de 2012 Aceito em 5 de maio de 2013 *Autor para correspondência (corresponding author) E-mail: paulo_adona@yahoo.com.br

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Quercetin is a flavonoid widely found in fruit, vegetables, grains and flowers, with a high concentration in red wine, and has been functionally characterized by its antioxidant activity. For assessment of nuclear maturation and bovine embryo, oocytes were matured for 22h in the presence of quercetin (0.4, 2, 10 and 50μM), cysteamine (100μM) and in the absence of antioxidants. The matured oocytes were stained with Hoechst to evaluate the in vitro maturation. To assess embryonic development, oocytes were fertilized and cultured in vitro and rates of embryo development were obtained in the seventh day of culture and the percentage of hatching and the number of cells on eighth day embryos. The levels of glutathione (GSH) of the oocytes were measured by fluorescence emission with CMF2HC. The percentage of nuclear maturation (±89%) did not differ between groups. Embryonic development varied between treatments, the percentage of blastocyst was higher (P<0.05) in the groups treated with 0.4, 2, 10 and 50 M of quercetin (56.9, 59.5, 53.6 and 49.6%, respectively) and 100 M cysteamine (50.4%) compared to the control group (42.3%). Comparing the two antioxidants, quercetin (0.4 to 2μM) was superior in embryo production (56.9 and 59.5% respectively) compared with cysteamine (50.4%). The rates of hatched embryos were similar (P>0.05) between groups (±63.0%). The average number of embryo cells was also similar in both groups (±233). The intracellular GSH levels were higher in oocytes matured with cysteamine, but similar between the oocytes treated with quercetin and control. The supplementation of matured in vitro with antioxidants improves blastocyst rates. Quercetin was greater than cysteamine, which in turn was superior to the control. However, GSH levels were higher in oocytes treated only with cysteamine. Keywords: Antioxidant, bovine, embryo, quercetin and oocyte

INTRODUÇÃO As condições de maturação in vitro (MIV) dos oócitos bovinos são essenciais para a produção de embriões. A MIV é influenciada por diferentes fatores, como atmosfera gasosa, meio de cultivo, temperatura, suplementação proteica e fatores de crescimento (Santos et al., 2002; Sutton-McDowall et al., 2012). Avanços significantes foram obtidos modificando-se os meios de cultivo embrionários, o que resultou no aumento da taxa na produção in vitro (PIV) de embriões. No entanto, vários trabalhos têm sido realizados visando à maior eficiência da técnica (De Matos et al., 2002; Schwarz et al., 2010; Adona et al., 2011; Dey et al., 2012), visto que a capacidade de fecundação e de desenvolvimento embrionário depende da maturação nuclear e citoplasmática do oócito (Ferreira et al., 2008). A maturação dos oócitos é caracterizada por uma série de transformações bioquímicas e estruturais no núcleo e citoplasma, sendo essenciais para o processo da fecundação e subsequente desenvolvimento embrionário. Durante a PIV de embriões, ocorre a geração das espécies reativas de oxigênios (EROs), oriundas da tensão de oxigênio, exposição à luz e excesso de manipulação (Guerin et al., 2001). O aumento na produção de H2O2 em embriões de camundongos foi observado, quando expostos à luz por mais de cinco minutos (Goto et al.,

1992). A presença equilibrada das EROs e antioxidantes tem impacto positivo para a PIV de embriões (Guerin et al., 2001; Andrade et al., 2010). Portanto, o uso de antioxidantes em sistemas de alta concentração de oxigênio (20% de O2) é considerado um fator importante para a PIV de embriões, devido às suas ações na diminuição dos efeitos danosos causados pelas EROs. As EROs são espécies químicas, tais como átomos, moléculas ou fragmento de moléculas, que apresentam pelo menos um elétron não compartilhado na camada de valência. Quando as espécies reativas são formadas a partir do oxigênio, elas são chamadas de EROs, no entanto outros tipos de espécies reativas podem surgir do nitrogênio, carbono ou enxofre (Silva et al., 2011). As espécies reativas de maior relevância são as EROs, pois são produzidas pelo metabolismo fisiológico dos embriões (Guerin et al., 2001; Silva et al., 2011). Quando em baixas concentrações, as EROs desempenham importante papel fisiológico in vitro, como a promoção das competências dos oócitos e do desenvolvimento do embrião (Blondin et al., 1997; Guerin et al., 2001). Quando uma quantidade excessiva de EROs é liberada, ocorre o estresse oxidativo (Andrade et al., 2010). A abundância das EROs pode ter efeitos deletérios sobre a função celular, conduzindo aos danos oxidativos dos componentes intracelulares, os

29

quais podem induzir a apoptose (Yang et al., 1998; Guerin et al., 2001). O uso de antioxidantes visa balancear a formação das EROs e manter as funções fisiológicas dos oócitos, contrapondo o aumento indiscriminado das EROs na MIV. A quercetina é um flavonoide do grupo dos compostos polifenólicos, amplamente encontrado nas frutas, vegetais, grãos, flores, com elevada concentração no vinho tinto, e que apresenta ação antioxidante. O seu desempenho terapêutico no combate ao estresse oxidativo tem sido mencionado por vários autores (Peres et al., 2000; Behling et al., 2004; Liu et al., 2010) e se dá em três etapas diferentes: na iniciação pela interação com íons superóxido, na formação de radicais hidroxila por quelar íons de ferro e na peroxidação lipídica por reagir com radicais peróxido de lipídeos (Afanas'ev et al., 1989). O radical hidroxila e o ânion superóxido estão envolvidos no dano tecidual por iniciarem a peroxidação lipídica e a disrupção da matriz intersticial (Silva et al., 2011). Vários trabalhos utilizando a quercetina foram realizados com o intuito de identificar os efeitos fisiológicos e as atividades biológicas desse flavonoide para fins terapêuticos em humanos, no entanto não há informação disponível sobre os efeitos da quercetina sobre a maturação in vitro de oócitos bovinos. Neste estudo, foi investigado o uso da quercetina durante a fase de maturação in vitro e o seu efeito sobre a taxa de produção de blastocisto e os níveis de glutationa nos oócitos maturados.

MATERIAL E MÉTODOS Os produtos para PIV de embriões foram adquiridos da Sigma Chemical Company, St Louis, MO, EUA, a menos que especificados de outro modo. Os ovários de fêmeas bovinas foram coletados no frigorífico logo após o abate e transportados em solução fisiológica estéril (NaCl 0,9%) acrescida de 50 g/mL de gentamicina a 30°C. No laboratório, os ovários foram lavados em NaCl 0,9%, e os folículos com diâmetro de 2 – 8mm foram aspirados com auxílio de uma agulha (1,20 X 40mm) conectada a uma seringa descartável de 10mL. O líquido folicular contendo os oócitos foi depositado em tubos

cônicos de 50mL e mantido em repouso para decantação por cinco minutos. O pellet contendo os oócitos foi adicionado a 5mL de meio H199 (Meio 199 com 25mM de hepes acrescido de 50 g/mL de gentamicina e 5% de soro fetal bovino - SFB) em uma placa de Petri, para a seleção dos oócitos sob estereomicroscópio. Somente oócitos classificados como graus I e II, contendo mais de três camadas de células do cumulus e citoplasma uniforme, foram utilizados para os experimentos. A quercetina (Sigma, Q4951) foi preparada em solução estoque de 50mg/mL em hidróxido de sódio 1M, e a cisteamina (Sigma, C8397) foi preparada em solução estoque de 100mg/mL em H2O, aliquotadas em microtubos e estocadas a -20ºC. Maturação in vitro (MIV): Após a classificação, os oócitos foram transferidos para o meio de maturação, constituído pelo Meio 199 (Sigma, M4530) suplementado com 10% de SFB, 5,0μg/mL de LH (Lutropin-v, Vetrepharm), 0,5μg/mL de FSH (Folltropin-v, Vetrepharm), 0,2 M de piruvato e 50 g/mL de gentamicina. Os oócitos foram cultivados separadamente na presença de quercetina (0,4, 2, 10 e 50 M), cisteamina (100 M) e na ausência dos antioxidantes (controle) durante 22 horas, em gotas de 100μL de meio de maturação sob óleo mineral, montadas em placa de Petri, a 38,5ºC e atmosfera de 5% de CO2. Cada gota continha aproximadamente 20 oócitos. Avaliação da MIV: Os oócitos foram desnudados (remoção das células do cumulus) em tubo de 5mL, com 0,3mL de PBS (Nutricell) acrescida de 1% de SFB, e agitados no “vortex” por quatro minutos. Os ovócitos desnudos foram expostos ao corante Hoechst (33342), na concentração de 1μg/mL em PBS, e incubados por cinco minutos, protegidos da luz. Após este período, foram lavados por três vezes em PBS e fixados entre lâmina e lamínula para avaliação quanto à taxa de MIV no microscópio de epifluorescência (Eclipse Ti Nikon - filtro UV-2A, com comprimento de onda de 330-380/420-700nm de absorção/emissão). Os níveis de glutationa (GSH) intracelular nos oócitos bovinos foram determinados com marcador de fluorescência Cell Tracker Blue - CMF2HC (4-clorometil-6, 8 - difluoro-7-

30

hidroxicumarina, Life Technologies, C12881). Para as avaliações, os oócitos foram desnudados em PBS-PVA (Álcool polivinílico, 0,05%) e corados com 10 M de CMF2HC em PBS-PVA por 30 minutos em estufa de CO2 a 38,5ºC. Após coloração, os oócitos foram lavados três vezes e colocados em uma lâmina com 10 L de PBS-PVA. A emissão de fluorescência foi capturada automaticamente (cinco segundos) com auxílio da câmera Infinity após a exposição na luz ultravioleta (filtro UV-2A) do microscópio Eclipse Ti Nikon. As imagens registradas foram analisadas usando-se o programa de análises de imagens da câmera Infinity (software V6.2.0). Fecundação in vitro (FIV): Foi utilizado sêmen congelado de um mesmo touro (raça Nelore) e da mesma partida, o qual foi preparado segundo a técnica de gradiente de Percoll. Em um tubo de microcentrífuga, foram adicionados 400 L de Percoll 90% e, em seguida, 400 L de Percoll 45%. O sêmen foi descongelado a uma temperatura de 37°C por 30 segundos, adicionado na porção superior do gradiente de Percoll e centrifugado por cinco minutos a 800 “g”. Após a retirada do sobrenadante, foi adicionado 1mL de meio TALP (Parrish et al., 1988), e uma nova centrifugação de dois minutos a 200 “g” foi realizada para remover o excedente do Percoll. A FIV foi feita em TALP com 2μM de penicilamina, 1μM de hipotaurina, 250μM de epinefrina, 20μg/mL de heparina e 6mg/mL de albumina sérica bovina (BSA Sigma, A8806). Os espermatozoides (2x106 espermatozoides/ mL) e os oócitos foram coincubados em gotas de 100μL de meio sob óleo mineral, montadas em placa de Petri, por um período de 18 horas. Após a FIV, os oócitos foram desnudados com auxílio de um micropipetador de 50μL e transferidos para o meio de cultivo in vitro (CIV) fluido de oviduto sintético (SOF), suplementado com aminoácidos essenciais (BME) e não essenciais (MEM), 0,34mM de sódio tricitrato, 2,77mM de mioinositol (Holm et al., 1999), 3% de SFB, 4mg/mL de BSA, ITS (insulina 5μg/mL, transferrina 5μg/mL e selênio 5ng/mL) e aminoácidos (glicina 0,75mg/mL, alanina 0,15mg/mL e glutamina 0,09mg/mL), em gotas de 100μL de meio com monocamada de células somáticas (cumulus). O cultivo in vitro foi feito em estufa de CO2, a 38,5ºC, em atmosfera de 5% de CO2 em ar.

Para avaliação do número de células dos embriões eclodidos no oitavo dia após fecundação, os embriões foram expostos ao corante Hoechst como descrito na avaliação dos oócitos. Após o método de coloração, os embriões foram fotografados (Infinity câmera - software V6.2.0) no microscópio de epifluorescência para contagem do número de células. Experimento I. Avaliação do efeito dos antioxidantes sobre a maturação nuclear. Os oócitos foram maturados separadamente na presença de quercetina (0,4, 2, 10 e 50 M), cisteamina (100 M) e na ausência dos antioxidantes (controle) durante 22h e avaliados quanto ao estádio de maturação nuclear. Experimento II. Avaliação do efeito dos antioxidantes na maturação in vitro sobre o desenvolvimento embrionário. Os oócitos foram cultivados separadamente na presença de quercetina (0,4, 2, 10 e 50 M), cisteamina (100 M) e controle durante 22h. Após a MIV, os oócitos foram submetidos à FIV (18h) seguida pelo CIV. As taxas de clivagem foram determinadas no segundo dia de cultivo (D2), o desenvolvimento dos embriões em estádio de blastocistos foi determinado no sétimo dia (D7) do CIV, e a eclosão e o número de células dos embriões no oitavo dia (D8). Todos os sistemas de cultivo foram feitos em estufa de CO2, a 38,5ºC, e em atmosfera de 5% de CO2. Experimento III. Avaliação dos níveis glutationa (GSH) intracelular em oócitos imaturos e maturados in vitro com marcador de fluorescência Cell Tracker Blue. Os oócitos em estádio de vesícula germinativa (VG) e maturados na presença de quercetina (2 M), cisteamina e na ausência dos antioxidantes (MIV) foram corados com Cell Tracker Blue para avaliação dos níveis de GSH. Para controle da técnica, um grupo de oócitos imaturos e outro maturado foram expostos a 0,009% de peróxido de hidrogênio (H2O2) por 30 minutos junto ao corante e avaliados quanto aos níveis de GSH. As análises estatísticas foram realizadas com o programa BioEstat 2. Para os resultados significativos nas análises de variância, foi utilizado o Bonferroni como procedimento de comparações múltiplas entre os tratamentos. O

31

nível de significância adotado foi de 5% para evidenciar diferenças entre os tratamentos.

RESULTADOS No experimento I, foram utilizados 512 oócitos, distribuídos em sete tratamentos e três repetições (Tab. 1). O percentual de oócitos em vesícula germinativa (VG) após aspiração folicular

foi de 100% para o controle zero hora (Fig. 2A), e o percentual de oócitos que completaram a maturação nuclear (metáfase II) foi de aproximadamente 89,0% para os grupos tratados com quercetina (0,4, 2, 10 e 50μM), cisteamina (100μM) e controle (22h), não havendo variação significativa (P>0,05) nas taxas de maturação nuclear.

Tabela 1. Efeitos da quercetina e da cisteamina sobre a maturação in vitro de oócitos bovinos

Tratamentos Oócitos N°

VG N° (%±dpm)

RVG N° (%±dpm)

Metáfase II N° (%±dpm)

Quercetina 0,4 μM 78 0 (0,0±0,0)b 7 (9,0±6,0)a 71 (91,0±6,0)a Quercetina 2μM 71 0 (0,0±0,0)b 7 (9,8±7,3)a 64 (90,1±7,3)a Quercetina 10μM 78 0 (0,0±0,0)b 11 (14,1±12)a 67 (85,8±12)a Quercetina 50μM 72 0 (0,0±0,0)b 10 (13,9±11)a 62 (86,1±11)a Cisteamina 71 0 (0,0±0,0)b 6 (8,5±7,1)a 65 (91,5±7,1)a Controle (22 horas) 67 0 (0,0±0,0)b 7 (10,4±7,5)a 60 (89,5±7,5)a Controle (0 hora) 75 75 (100±0,0)a 0 (0,0±0,0)b 0 (0,0±0,0)b Letras diferentes na mesma coluna indicam diferença (P<0,05) entre tratamentos. Desvio-padrão médio (dpm) de três repetições. Oócitos em vesícula germinativa (VG), rompimento da VG (RVG) e maturados (metáfase II). Para a realização do experimento II, foram utilizados 1.684 oócitos, distribuídos em seis tratamentos e sete repetições, os quais estão descritos na Tab. 2. Pelas análises dos resultados, as taxas de clivagem foram similares (P>0,05) entre os grupos, obtendo-se uma porcentagem média de aproximadamente 80,0% para os oócitos tratados com quercetina, de 76,3% para os tratados com cisteamina e de 76,6% para os do grupo controle. O desenvolvimento embrionário variou entre os tratamentos (Tab. 2), o percentual de blastocisto D7 foi superior (P<0,05) nos grupos tratados com 0,4, 2, 10 e 50 M de quercetina (56,9, 59,5, 53,6 e 49,6%, respectivamente) e com 100 M de cisteamina (50,4%) em relação ao grupo controle (42,3%). Na comparação entre os dois antioxidantes, a quercetina (0,4 e 2μM) foi superior (P<0,05) na produção de embriões (56,9 e 59,5%, respectivamente) em comparação com a cisteamina (50,4%), mas as concentrações de 10μM (53,6%) e 50μM (49,6%) de quercetina foram similares (P>0,05) às encontradas com a cisteamina (50,4%). Nas comparações entre as concentrações de quercetina, a dose de 2μM (59,5%) foi similar (P>0,05) à dose de 0,4μM (56,9), mas diferiu (P<0,05) das concentrações de 10μM (53,6%) e 50μM (49,6%), que foram similares entre si. As concentrações de 0,4μM (56,9) e 10μM (53,6%) de quercetina também apresentaram similaridade (P>0,05) na produção

de embriões. As taxas de embriões eclodidos no dia oito após a FIV (Tab. 2) foram similares (P>0,05) entre os grupos, obtendo-se um percentual médio de aproximadamente 64,0% de eclosão com quercetina, 56,2% com cisteamina e 64,4% no grupo controle. O número de células dos embriões eclodidos (Tab. 2) também foi similar (P>0,05) entre os grupos, a média aproximada de células (Fig. 2A) foi de 238 com quercetina, de 223 com cisteamina e de 225 no grupo controle. No experimento III, foram utilizados 210 oócitos, distribuídos em seis tratamentos e três repetições (Fig. 1). Os oócitos imaturos VG/H2O2 (0,86) e VG (1,00) apresentaram emissão de fluorescência inferior (P<0,05) aos oócitos submetidos à maturação MIV/H2O2 (1,31) e MIV (1,67). Na comparação entre os grupos controle (MIV), quercetina (2μM) e cisteamina, o nível de GSH intracelular avaliado pela emissão de fluorescência (Fig. 2B) não diferiu significativamente (P>0,05) entre o controle (1,67) e a quercetina (1,64), mas ambos diferiram (P<0,05) do grupo com cisteamina (1,76).

32

Tabela 2. Uso da quercetina e da cisteamina na maturação in vitro e seu efeito para a competência do desenvolvimento embrionário

Tratamentos Oócitos Nº

Clivagem D2 Nº (%±dpm)

Blastocisto D7 Nº (%±dpm)

Eclosão D8 Nº (%±dpm)

Células D8 Nº (Mín-Máx±dpm)

Q 0,4μM 295 241 (81,6±10) 168 (56,9±3,3)ab 100 (59,5±33) 224 (108-477±71) Q 2μM 287 246 (85,7±5,4) 171 (59,5±1,9)a 114 (66,6±18) 246 (110-432±65) Q 10μM 287 222 (77,3±3,5) 154 (53,6±4,9)bc 99 (64,2±20) 249 (108-419±77) Q 50μM 294 226 (76,8±8,4) 146 (49,6±3,1)c 95 (65,0±18) 232 (114-443±78) Cisteamina 268 210 (76,3±4,4) 135 (50,4±3,8)c 76 (56,2±22) 223 (106-415±74) Controle 253 194 (76,6±7,9) 107 (42,3±4,2)d 69 (64,4±13) 225 (108-425±79) Letras diferentes na mesma coluna indicam diferença (P<0,05) entre tratamentos. Desvio-padrão médio (dpm) de sete repetições. Número mínimo e máximo (Mín-Máx) de célula dos embriões eclodidos. Diferentes concentrações de quercetina (Q).

Figura 1. Níveis de glutationa (GSH) intracelular em oócitos bovinos avaliado com Cell Tracker Blue. Os oócitos em vesícula germinativa (VG/H2O2) e maturados (MIV/H2O2) foram tratados com 0,009% de peróxido de hidrogênio por 30 minutos. As barras com letras (a-e) diferentes indicam diferença (P<0,05) entre tratamentos. Resultados de três repetições. (A) (B) Figura 2. Coloração com Hoechst para avaliação da maturação e do número de células dos embriões (A). Oócito em vesícula germinativa (a), estádio intermediário (b), metáfase II (c), liberação do 1º corpúsculo polar (d), embrião com ±110 células (e) e embrião com ±360 células (f). Intensidade de fluorescência do nível GSH intracelular em oócitos avaliados com Cell Tracker Blue (B). Oócitos VG/H2O2 (a) VG (b) MIV/H2O2 (c) MIV (d) quercetina (e) e cisteamina (f).

a b c

d e f

a b c

d e f

33

DISCUSSÃO Durante a PIV de embriões, os oócitos e embriões são expostos a concentrações maiores de oxigênio do que aqueles produzidos in vivo. Esta maior exposição ao oxigênio faz com que ocorra uma produção de radicais livres. Altos níveis de radicais livres causam danos celulares, levando à perda de suas funções (Yang et al., 1998). Os radicais livres gerados in vitro, como o superóxido, o peróxido de hidrogênio e a hidroxila, reagem com as proteínas celulares, os lipídeos e o DNA, resultando na inativação enzimática, na peroxidação lipídica da membrana e em alterações do DNA (Andrade et al., 2010; Silva et al., 2011). A PIV de embriões em sistema com alta concentração de oxigênio atmosférico requer que os oócitos sejam protegidos contra o estresse oxidativo. A adição de antioxidante no meio de maturação na PIV de embriões visa reduzir os danos celulares causados pelo estresse oxidativo, durante a maturação oocitária, resultando no aumento das taxas de desenvolvimento embrionário. Os antioxidantes da classe dos flavonoides têm despertado um amplo interesse científico devido a suas propriedades sequestrantes de radicais livres (Behling et al., 2004). A quercetina é um flavonoide que tem propriedades quelantes e de sequestro de radicais de oxigênio, como o superóxido e a hidroxila, e também atua na inibição da enzima xantina oxidase e na peroxidação lipídica (Behling et al., 2004; Liu et al., 2010). O radical hidroxila e o ânion superóxido estão envolvidos no dano tecidual por iniciarem a peroxidação lipídica (Silva et al., 2011). Várias propriedades terapêuticas da quercetina têm sido estudadas nas últimas décadas (Formica e Regelson, 1995; Larson et al., 2012), destacando-a como potencial antioxidante (Behling et al., 2004). O uso da quercetina na PIV de embriões bovinos e seu efeito sobre a maturação oocitária não se encontram reportados na literatura. No presente estudo, foi analisada a suplementação de diferentes concentrações (0,4, 2, 10 e 50 M) de quercetina, durante a MIV, no intuito de investigar o potencial benefício na PIV de embriões. Paralelamente, foram delineados outros dois grupos experimentais: sem suplementação de antioxidante e outros

suplementados com 100 M cisteamina, um antioxidante descrito na literatura para PIV de embriões (De Matos et al., 2002; Deleuze e Goudet, 2010), o qual é utilizado rotineiramente no laboratório. No presente estudo, a suplementação dos meios de maturação com (quercetina e cisteamina) ou sem antioxidantes não provocou diferença nas taxas de maturação nuclear e de clivagem, o que sugere que não seria necessária a suplementação dos meios de maturação com os referidos antioxidantes. No entanto, a literatura descreve que a presença de antioxidante é essencial para a maturação de oócitos, particularmente para a maturação citoplasmática, necessária para o desenvolvimento embrionária (Furnus et al., 2008; Silva, et al., 2011). A maturação citoplasmática está diretamente relacionada com a taxa de desenvolvimento embrionário (Rizos et al., 2002), portanto, quando os oócitos foram tratados com os respectivos antioxidantes, obtiveram-se maiores taxas de desenvolvimento (Tab. 2). Estes resultados sugerem que a maturação suplementada com quercetina ou cisteamina pode afetar positivamente a proporção de blastocistos formados, mas não sua qualidade, visto que os embriões não apresentaram diferença (P>0,05) nas taxas de eclosão e nem no número de células dos blastocistos. De acordo com a literatura, a porcentagem de produção de embriões in vitro é afetada pela qualidade intrínseca dos oócitos e pela composição dos meios de maturação, e a qualidade dos embriões (blastocistos) é afetada pelo sistema de cultivo in vitro (Rizos et al., 2002; Sananmuang et al., 2011). O uso de antioxidante no processo de MIV pode também influenciar negativamente o desenvolvimento de blastocistos (Guerin et al., 2001), pois a formação equilibrada de EROs exerce papel importante nos processos metabólicos da maturação oocitária e no desenvolvimento dos blastocistos (Sabatini et al., 1999). Neste estudo, foi observado que maior concentração de quercetina (50μM) apresentou a menor taxa (49,7%) na produção de embriões em comparação com 2μM (59,6%), porém foi superior (42,3%) à não adição de antioxidantes. Isto mostra que a suplementação equilibrada de antioxidante é fundamental para a PIV de embriões, em sistema de alta concentração de oxigênio atmosférico. E a concentração de

34

antioxidante deve ser ajustada no sentido de manter o equilíbrio entre os benefícios na redução das EROs, bem como permitir que os processos de oxirredução dos oócitos sejam mantidos. As prováveis causas do benefício na produção de embriões podem estar correlacionadas com a redução do estresse oxidativo durante o processo de MIV. Experimentos in vitro e in vivo demonstraram que quercetina e cisteamina são capazes de reduzir os danos celulares causados pelo estresse oxidativo (Liu et al., 2010; Deleuze e Goudet, 2010). A suplementação dos meios de maturação com cisteamina foi utilizada como padrão de antioxidante no sistema de produção, pois a cisteamina, quando adicionada no meio de maturação in vitro, estimula a síntese de glutationa (GSH) e melhora as taxas de desenvolvimento embrionário (De Matos et al., 2002). Esse aumento nos níveis de GSH também foi constatado neste estudo nos oócitos suplementados com cisteamina, sendo que a glutationa fornece a primeira linha de defesa contra as EROs em oócitos. Como já mencionado, a quercetina é capaz de reduzir os radicais livres (Braun et al., 2011), mas esse atributo da quercetina (2μM) não propiciou aumento ou redução nos níveis de GSH nos oócitos em relação ao grupo controle. A quercetina não é precursora da síntese de GSH e, portanto, não aumentaria diretamente sua síntese. Os níveis de GSH podem ser alterados (↑↓) na presença de quercetina, dependendo do sistema de cultivo ou do tipo de estresse sofrido pelos oócitos. O sistema de maturação foi similar entre os grupos, e somente a cisteamina proporcionou aumento nos níveis de GSH, por ser precursora da síntese de GSH (De Matos et al., 2002), enquanto os cultivos com quercetina ou na ausência dos antioxidantes mantiveram níveis similares de GSH. Essa similaridade pode ser pela disponibilidade de aminoácidos precursores de GSH no meio de MIV e pode atuar estimulando a síntese de GSH. Segundo Furnus et al. (2008), a concentração de GSH aumenta em oócitos bovinos durante o processo da MIV decorrente dos aminoácidos disponíveis nos meios de maturação. Estudos mais aprofundados serão necessários para entender melhor as relações entre quercetina e a PIV de

embriões e os níveis de GSH em oócitos bovinos.

CONCLUSÃO A suplementação do meio de maturação in vitro com os antioxidantes quercetina ou cisteamina, em um sistema de alta concentração de oxigênio atmosférico, aumenta as taxas de produção de blastocistos. A suplementação de 2μM de quercetina apresentou a maior taxa de produção de blastocisto, sendo superior àquelas encontradas para a cisteamina e o controle. A cisteamina proporcionou aumento nos níveis de GSH, enquanto a quercetina manteve o mesmo nível encontrado no controle.

AGRADECIMENTOS À Universidade Norte do Paraná (Unopar) e à Agropecuária Laffranchi, pelo apoio financeiro ao projeto.

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36

5.1. ARTIGO 2 (ARTIGO SUBMETIDO PARA PUBLICAÇÃO NO PERIÓDICO SEMINA: CIÊNCIAS

AGRÁRIAS, UEL).

Uso de quercetina e ITS no cultivo in vitro de embriões bovinos e seus efeitos sobre o

desenvolvimento embrionário.

Use of ITS and quercetin on in vitro culture of bovine embryos and its effects on embryonic

development.

Samuel Guemra1,2, Paulo Sergio Monzani1,2, Otávio Mítio Ohashi1,3, Paulo Roberto Adona1,2*.

1 Central Avançada em Biotecnologia da Reprodução Animal, Agropecuária Laffranchi, Tamarana,

PR, Brasil. 2 Centro de Ciências Biológicas e da Saúde, Universidade Norte do Paraná, Londrina, PR, Brasil. 3 Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal do Pará, Belém, PA, Brasil.

* paulo_adona@yahoo.com.br

Resumo

O sistema de cultivo in vitro (CIV) de embriões bovinos exerce forte influência sobre a

quantidade e a qualidade dos blastocistos. Neste sentido, foram avaliados os efeitos da adição de

quercetina e/ou insulina-transferrina-selênio (ITS) em meio SOFaa sobre a taxa de desenvolvimento

embrionário, os níveis intracelular de glutationa (GSH) e de espécie reativa de oxigênio (EROs), além

das expressões relativas dos genes glutationa peroxidase 1 (GPX1) e superóxido dismutase 2 (SOD2).

A análise do desenvolvimento embrionário foi realizada em diferentes grupos suplemtentados com 10

μM de quercetina (Q10), ITS, Q10 + ITS (QITS) e o grupo controle sem oxidante. As taxas de

clivagem entre os grupos foram similares (P>0,05), com média de 83,2%. O desenvolvimento

embrionário variou entre os tratamentos, sendo estatisticamente superiores nos grupos Q10 (46,1%),

ITS (47,1%) e QITS (45,0%), quando comparado ao grupo controle (38,3%), e não diferiram (p>0,05)

entre si. As taxas de eclosão e de células totais dos embriões também foram similares (P>0,05) entre

os grupos, com média de 52,8% e 208, respectivamente. Os níveis intracelulares de EROs variaram

entre os tratamentos (p<0,05), apresentando os menores níveis nos embriões cultivados na presença de

quercetina (Q10 e QITS). O menor nível intracelular de GSH foi encontrado no grupo Q10, com

diferença significante (p<0,05) comparado ao grupo controle e não diferindo de ITS e QITS. A

expressão relativa do gene SOD2 foi similar (p>0,05) entre todos os grupos. A expressão relativa do

gene GPX1 foi similar (p>0,05) entre os grupos controle e Q10 e entre os grupos ITS e QITS, porém,

37

ITS e QITS apresentaram as maiores expressões em relação aos grupos controle e Q10 (p<0,05). A

suplementação dos meios de cultivo com os antioxidantes quercetina e/ou ITS aumentou a produção

de blastocistos quando comparado ao controle. O uso de quercetina associado ao ITS aumentou a

expressão relativa do gene GPX1 em relação ao grupo controle, sugerindo uma melhora na qualidade

dos embriões.

Palavras chave: embrião, GPX1, ITS, quercetina e SOD2

Abstract

The system of in vitro culture (IVC) of bovine embryos strongly influences the quantity and

quality of blastocysts. The effects of the supplementation of quercetin and/or insulin-transferrin-

selenium (ITS) in SOFaa medium about embryonic development rates, intracellular levels of

glutathione (GSH) and reactive oxygen species (ROS), and the gene expression of glutathione

peroxidase 1 (GPX1) and superoxide dismutase 2 (SOD2) were evaluated. The embryonic

development analysis was performed in different groups supplemented with 10 μM of quercetin

(Q10), ITS, ITS + Q10 (QITS) and in the control group without oxidant. Cleavage rates were similar

between groups (P>0.05), averaging 83.2%. The embryonic development varied between treatments in

which the groups for Q10 (46.1%), ITS (47.1%) and QITS (45.0%) were statistically higher when

compared to the control group (38.3%), and it was not observed difference (p>0.05) between them.

Hatching rates and total number of cells embryo were similar (P>0.05) between groups, with a mean

of 52.8% and 208, respectively. Intracellular levels of ROS varied between treatments (p<0.05), the

lower levels were observed in the embryos cultured in the presence of quercetin (Q10 and QITS). It

was verified the lower intracellular level of GSH in the Q10 group, with significant difference

(p<0.05) to the control group and it was not observed difference when compared with ITS and QITS

groups. The relative expression of the SOD2 gene was similar (p>0.05) among all groups. The relative

expression of GPX1 gene was similar (p>0.05) between the control group and Q10 and between the

ITS and QITS groups. However, the ITS and QITS groups showed the highest expression when

compared to control groups and Q10 (p<0.05). The supplementation of quercetin and/or ITS in culture

media increased the blastocyst production when compared to control group. Association of quercetin

and ITS in medium culture increased the relative expression of GPX1 gene compared to control group,

suggesting an improvement in the quality of the embryos.

Key-words: embryo, GPX1, ITS, quercetin and SOD2

38

1. Introdução

O cultivo in vitro (CIV) corresponde ao intervalo de desenvolvimento desde a fase de oócito

fertilizado até o estádio de blastocisto. Neste período, os embriões passam por modificações

importantes, tais como, divisão celular, ativação do genoma embrionário, compactação dos

blastômeros, início da diferenciação embrionária e a formação da blastocele (Garcia, Avelino e

Vantini, 2004). Todas estas etapas de desenvolvimento podem ser influenciadas pelas condições de

cultivo (Lonergan et al., 2000) e, portanto, o CIV interfere diretamente na qualidade e produção de

embriões.

Os efeitos do ambiente atmosférico sobre a qualidade dos embriões têm sido avaliados

(Blondin, Coenen e Sirard, 1997; Clark et al., 2006; Silva et al., 2010). O oxigênio constitui um

componente essencial para a manutenção da viabilidade e desenvolvimento embrionário (Clark et al.,

2006). No entanto, o CIV de embriões em ambiente de alta tensão de O2, em torno de 20%,

proporciona maior formação de espécies reativas de oxigênio (EROs) (Andrade et al., 2010; Silva et

al., 2010), quando comparado ao desenvolvimento in vivo, cuja concentração de O2 na tuba uterina

varia de 3% a 9% (Mastroianni e Jones, 1965; Harvey, 2007).

As espécies reativas compreendem átomos, moléculas ou fragmento de moléculas que

apresentam pelo menos um elétron não compartilhado na camada de valência. Quando as espécies

reativas são formadas a partir do oxigênio, elas são chamadas de EROs. Outros tipos de espécies

reativas podem ser formados a partir do nitrogênio, carbono ou enxofre (Silva et al., 2011). As EROs

são produzidas pelo metabolismo fisiológico dos embriões (Guerin, El Mouatassim e Menezo, 2001;

Silva et al., 2011) e quando em baixas concentrações, desempenham importantes papeis na

competência do desenvolvimento embrionário (Blondin, Coenen e Sirard, 1997; Guerin, El

Mouatassim e Menezo, 2001). O excesso de EROs pode ocasionar danos ao DNA, proteínas e lipídios,

causando estresse oxidativo que compromete o desenvolvimento embrionário (Silva et al., 2011). Para

eliminar ou minimizar os efeitos danosos das EROs, o embrião possui seu próprio mecanismo de

defesa, constituído por enzimas especializadas (Setiadi et al., 2003), sendo: a superóxido dismutase

(SOD) que participa da doação do O2- ao H2O2, a catalase que converte H2O2 em oxigênio e água

(Fridovich, 1995) e a glutationa peroxidase (GPX) que desempenha o papel mais importante no

controle celular da oxidação o qual constitui o mecanismo primário na remoção de H2O2 (Higuchi,

2003). Alterações nas concentrações de EROs dos embriões durante o cultivo in vitro apresentam

mudanças nos perfis de transcritos de genes das enzimas envolvidas no sistema de defesa contra o

estresse oxidativo (Balasubramanian et al., 2007; Takahashi, 2012). O controle da produção excessiva

de EROs durante o desenvolvimento embrionário in vitro tem sido realizado pela redução da tensão de

oxigênio (Karja et al., 2004; Iwamoto et al., 2005) ou pela adição de antioxidantes nos meios de

cultivo (Ali, Bilodeau e Sirard, 2003; Das et al., 2013).

39

A quercetina (3,3′,4′,5,6-pentahydroxyflavone) é um flavonoide de origem vegetal que

apresenta propriedades anti-inflamatória (Guazelli et al., 2013), anticarcinogênica (Lopez-Lazaro,

2002) e antioxidante (Braun et al., 2011; Li et al., 2013). A atividade antioxidante ocorre devida as

suas propriedades químicas que permitem eliminar radicais livres e quelar íons de ferro (Naderi et al.,

2003). O uso de quercetina em cultura de osteoblastos humano (Braun et al., 2011) e na maturação de

oócitos suíno (Kang et al., 2013), apresentou efeitos antioxidantes, atuando sobre o estresse oxidativo

gerado durante o cultivo. O uso de quercetina na maturação de oócitos bovinos foi avaliado quanto à

produção de embriões (Guemra et al., 2013), porém ainda não há relatos de seu uso na CIV de

bovinos.

A suplementação do meio de maturação in vitro (MIV) com insulina, transferrina e selênio

(ITS) melhora a taxa de desenvolvimento embrionário de várias espécies de mamíferos, incluindo

humano, rato, bovino e suíno (Nasr-Esfahani e Johnson, 1992; Jeong et al., 2008; Córdova et al.,

2010; Hu et al., 2011). O mecanismo pelo qual a ITS melhora o desenvolvimento embrionário ainda

não é claro. Estudos anteriores têm relatado que o selênio (Sneddon et al., 2003; Uhm et al., 2007) e

transferrina a (Aleshire et al., 1989; Nasr-Esfahani e Johnson, 1992) são necessários para garantir a

síntese de proteínas e do metabolismo celular, bem como para prevenir os danos da oxidação causadas

pelas EROs. A ação da insulina nos embriões bovinos facilita o transporte de glicose e aminoácidos

através das membranas celulares (Augustin et al., 2003), além de estimular a síntese de proteínas

(Harvey e Kaye, 1988), exercendo função na nutrição embriotrófica.

No presente estudo, foi comparado os efeitos da suplementação de quercetina e ITS,

separadamente e associados, nos meios de CIV de embrião bovino, sobre a taxa de produção de

blastocisto, nos níveis intracelulares de EROs e glutationa (GSH), e nas expressões relativas dos genes

glutationa peroxidase 1 (GPx1) e superóxido dismutase 2 (SOD2).

2. Material e Método

2.1 Coleta de oócitos:

Os ovários de fêmeas bovinas foram coletados no frigorifico logo após o abate e transportados

em solução fisiológica estéril (NaCl 0,9%) acrescida de 50 g/mL de gentamicina (Sigma, G-1397) a

30°C. No laboratório, os ovários foram lavados em NaCl 0,9% e os folículos com diâmetro de 2-8 mm

foram aspirados com auxílio de uma agulha (1,20 X 40 mm) conectada a uma seringa descartável de

10 mL. O líquido folicular contendo os oócitos foi depositado em tubos cônicos de 50 mL e mantido

em repouso para decantação por 5 minutos. O pellet contendo os oócitos foi adicionado a cinco mL de

meio TCM-HEPES 199 (Sigma, M-7528) acrescido de 50 g/mL de gentamicina e 5% de soro fetal

bovino (SFB) em uma placa de Petri, para a seleção dos oócitos sob estereomicroscópio. Somente

40

oócitos classificados como graus I e II, contendo mais de três camadas de células do cumulus e

citoplasma uniforme, foram utilizados para os experimentos.

2.2 Preparo de estoque:

A quercetina (Sigma, Q4951) foi preparada na concentração de 50 mg/mL em solução de

hidróxido de sódio 1 M e a mistura de ITS (Sigma, I1884) foi preparada na concentração de 2,5

mg/mL de insulina, 2,5 mg/mL de transferrina e 2,5 μg/mL de selênio de sódio em solução aquosa. As

soluções de estoque foram aliquotadas em microtubos e armazenadas a -20ºC.

2.3 Maturação e fecundação in vitro:

Os oócitos foram selecionados e aqueles de grau 1 e 2 foram transferidos para o meio de

maturação, constituído pelo meio 199 (Sigma, M4530) suplementado com 10% de SFB, 5,0 μg/mL de

LH (Lutropin-v, Vetrepharm), 0,5 μg/mL de FSH (Folltropin-v, Vetrepharm), 0,2 μM de piruvato e 50

μg/mL de gentamicina. Os oócitos foram cultivados durante 22 horas, em gotas de 100 μL de meio de

maturação sob óleo mineral, montadas em placa de Petri, a 38,5ºC e atmosfera de 5% de CO2. Cada

gota continha aproximadamente 20 oócitos. Para a fecundação in vitro (FIV), foi utilizado sêmen

congelado de um mesmo touro (raça Nelore) e da mesma partida, o qual foi preparado segundo a

técnica de gradiente de Percoll. Em um tubo de microcentrífuga, foram adicionados 400 μL de Percoll

90% e, em seguida, 400 μL de Percoll 45%. O sêmen foi descongelado a uma temperatura de 37°C por

30 segundos, adicionado na porção superior do gradiente de Percoll e centrifugado por cinco minutos a

800× g. Após a retirada do sobrenadante, foi adicionado 1 mL de meio TALP (Parrish et al., 1988), e

centrifugado durante dois minutos a 200× g para remoção do excedente do Percoll. A fertilização in

vitro foi realizada utilizando 2x106 espermatozoides/mL e cerca de 20 oócitos em gotas de 100 μL de

meio TALP, montadas em placa de Petri sob óleo mineral, contendo 2 μM de penicilamina, 1 μM de

hipotaurina, 250 μM de epinefrina, 20 μg/mL de heparina e 6 mg/mL de albumina sérica bovina (BSA

- Sigma, A8806), por um período de 18 horas, a 38,5ºC e atmosfera de 5% de CO2.

2.4 Cultivo in vitro:

Os oócitos fertilizados foram desnudados com auxílio de um micropipetador e transferidos

para gotas de 100 μL de meio de cultivo in vitro fluido de oviduto sintético (SOF), com monocamada

de células somáticas (cumulus), contendo aminoácidos essenciais (BME) e não essenciais (MEM),

0,34 mM de citrato trissódico, 2,77 mM de mioinositol (Holm et al., 1999), 3% de SFB, 4 mg/mL de

BSA, 0,75 mg/mL de glicina, 0,15 mg/mL de alanina e 0,09 mg/mL de glutamina. O cultivo in vitro

foi feito em estufa de CO2, a 38,5ºC, em atmosfera de 5% de CO2 em ar.

41

2.5 Avaliação do número de células:

Os blastocistos eclodidos no oitavo dia de cultivo foram corados com Hoechst (Sigma, B-

1155), na concentração de 1 μg/mL diluído em meio PBS (Nutricell, Campinas, Brasil) e incubados

por 5 minutos, na ausência de luz. Após este período foram lavados por três vezes em PBS e fixados

entre lâmina e lamínula. Após o procedimento de coloração, os embriões foram fotografados (Infinity

câmera - software V6.2.0) utilizando um microscópio de epifluorescência (Eclipse Ti Nikon - filtro

UV-2A) e realizada a contagem do número de células.

2.6. Determinação dos níveis intracelular de EROs e GSH nos embriões:

Os níveis intracelular de EROs nos embriões de 4 a 16 células foram mensurados por ensaio

de fluorescência utilizando 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetato (DCFDA), segundo (Das et al.,

2013). Os embriões foram incubados na ausência de luz em meio PBS contendo 0,1% de álcool

polivinílico (PVA) e 10 μM de DCFDA, durante 15 minutos a aproximadamente 30°C.

Posteriormente, os embriões foram lavados três vezes em tampão PBS-PVA e transferidos para gotas

de 10 μL do mesmo tampão, sobre uma lâmina de vidro. Após a exposição por 5 segundos em luz

ultravioleta (UV), a emissão de fluorescência foi capitada com o uso do microscópio Eclipse Ti Nikon,

equipado com o filtro G-2 E/C.

Os níveis de GSH intracelular nos embriões de 4 a 16 células foram determinados utilizando o

marcador de fluorescência Cell Tracker Blue - CMF2HC (4-clorometil-6,8-difluoro-7-

hidroxicumarina, Life Technologies). Os embriões foram corados com 10 M de CMF2HC em PBS-

PVA, durante 30 minutos, em estufa a 5% de CO2 a 38,5ºC. Para determinar os níveis de GSH nos

embriões, utilizou-se os mesmos equipamentos e procedimentos empregados na determinação de

EROs.

Os níveis de EROs e GSH foram relacionados com as intensidades de fluorescência

registradas nas imagens. As fotografias foram obtidas com o uso do programa Infinity V6.2.0 e as

fluorescência avaliadas pelo programa Adobe Photoshop CS6.

2.8. Armazenamento do material, extração de RNA e síntese de cDNA.

Os embriões no estádio de blastocisto, no sétimo dia após a fecundação, foram armazenados

em microtubos de poliestireno contendo de 1 a 5 μL de solução de PBS contendo 0,1% de polivinil-

pirrolidina (PVP) e 100 U/mL de inibidor de RNase (RNase OUT, Invitrogen Inc.). As amostras

contendo cerca de 10 embriões foram armazenadas a -80°C até a extração do RNA total, a qual foi

realizada utilizando o micro kit RNeasy (Qiagen), de acordo com as instruções do fabricante. A

42

transcrição reversa foi realizada utilizando transcriptase reversa M-MLV (Sigma, M-1302) conforme

as instruções do fabricante. O cDNA foi sintetizado usando oligo (dT) e o Kit Impron II (Promega),

segundo as recomendações do fabricante. O cDNA foi armazenado a -20°C até a análise de PCR em

tempo real.

2.9. Análise Expressão gênica.

A reação em cadeia da polimerase em tempo real (qPCR) foi realizada utilizando o PCR

StepOnePlus (Applied Biosystems). Os primers e sondas (Tabela 1) foram desenhados usando

software Primer Premier (Premier Biosoft Int'l , Palo Alto, CA, EUA), nas junções éxon-éxon dos

genes bovinos GPX1 (NM_174076.3) e SOD2 (NM_201527.2). O gene GAPDH (NM_001034034.2)

foi usado como controle endógeno e manufaturado pela Applied Biosystems. As reações de

amplificação eram constituídas de 7,5 μL de TaqMan Fast Universal PCR Master Mix (2x) (Applied

Biosystems), 1,0 μL da mistura de primers/sonda e 6,5 μL da amostra de cDNA diluída 1:10. Foram

utilizadas as seguintes condições de ciclagem: 50°C por 2 minutos, 95°C durante 10 minutos e 40

ciclos de 95°C durante 15 segundos e 60°C durante 1 minuto. As diferenças na expressão dos genes

transcritos foram calculados usando o método da curva padrão, utilizando cinco diluições de amostra

de cDNA em série 1:10 (Livark e Schmittgen, 2001).

2.10 Delineamento experimental:

Experimento I. Determinação da concentração ideal de quercetina no meio de CIV para o

desenvolvimento embrionário.

Inicialmente foi determinada a concentração de quercetina no meio de CIV que apresentava as

melhores taxas de desenvolvimento embrionário em relação ao grupo controle sem quercetina. Para

isto, os oócitos foram maturados por 22 horas, posteriormente fecundados por 18 horas e cultivados

separadamente na presença de 0,4, 2,0, 10 e 50 M de quercetina por sete dias. As taxas de clivagem e

da produção de blastocisto foram avaliadas no segundo dia (D2) e no sétimo dia após FIV (D7),

respectivamente. Os dados foram comparados com o grupo controle, sem a adição de quercetina.

Experimento II. Avaliação do uso de quercetina e ITS e seus efeitos sobre o desenvolvimento

embrionário.

Os oócitos maturados e fecundados foram cultivados separadamente na presença de 10 M de

quercetina (Q10), na combinação de 5,0 μg/mL de insulina, 5,0 μg/mL de transferrina e 5,0 ng/mL de

selênio de sódio (ITS), na associação de 10 M de quercetina com ITS (QITS) e na ausência de

quercetina e ITS (controle), durante oito dias. A taxa de clivagem foi avaliada no D2, a taxa de

blastocistos no D7, e a taxa de eclosão e o número de células no dia oito após a FIV (D8).

43

Experimento III. Avaliação do nível intracelular de EROs e GSH por marcador de

fluorescência.

Os embriões no estágio de 4 a 16 células, oriundos dos diferentes grupos experimentais, Q10,

ITS, QITS e controle, conforme descrito no experimento II, foram subdivididos aleatoriamente em

dois grupos, sendo um corado com DCFDA, e outro com Cell Tracker Blue para determinar os níveis

de EROs e GSH, respectivamente.

Experimento IV. Avaliação da expressão gênica relativa nos diferentes grupos experimentais. Os

embriões nos estádio de blastocisto (D7) cultivados nos diferentes grupos experimentais, Q10, ITS,

Q10ITS e controle, conforme descrito no experimento II, foram avaliados por qPCR, quanto à

expressão dos genes GPX1 e SOD2 em relação ao gene GAPDH.

2.11 Análise estatística:

As análises estatísticas foram realizadas com o uso do programa BioEstat 5.3. Os dados foram

analisados pelo teste de normalidade de Shapiro Wilk. Para os dados com distribuição normal utilizou-

se o teste one way ANOVA seguido do pós-teste Bonferroni. Os dados com distribuição não normal

foi analisado pelo teste de Kruskal-Wallis com pós-teste de Dunn. Todos os experimentos foram

realizados em triplicata, o nível de significância adotado foi de 5% e os resultados foram expressos

como média ± erro padrão.

3. Resultados

Na análise da concentração ideal de quercetina no CIV de embriões foi observado que a

percentagem de aproximadamente 77% na clivagem, para os grupos tratados com quercetina e

controle, não apresentou diferença significativa (P>0,05). As maiores taxas de produção de blastocisto

(p<0,05) foram obtidas na presença de 0,4, 2,0, 10 μM de quercetina, com as respectivas taxas de

blastocistos 47,0, 47,4 e 53,6%, quando comparado ao grupo controle que apresentou a percentagem

de 38,0%. A suplementação com 50 μM de quercetina apresentou a taxa de 44,8% na produção de

blastocisto, sendo similar ao grupo controle e aos suplementados com 0,4, 2,0 μM de quercetina. No

entanto, o grupo contendo 50 μM de quercetina apresentou diferença significativa no desenvolvimento

embrionário (p<0,05) em relação ao tratamento com 10 μM de quercetina.

Os resultados no experimento II sobre as taxas de clivagem foram similares (P>0,05) entre os

grupos experimentais, sendo obtida porcentagem média de 83,2% (controle), 84,7% (Q10), 83,0%

(ITS) e 82,2% (QITS). O desenvolvimento embrionário apresentou variação entre os grupos (Tabela 3)

quanto ao percentual de blastocisto. Os grupos Q10, ITS e QITS apresentaram as maiores taxas de

desenvolvimento (p<0,05), sendo o percentual de 46,1%, 47,1% e 45,0%, respectivamente, enquanto o

44

grupo controle apresentou o percentual de 38,3%. Os grupos Q10, ITS e QITS não diferiram entre si

(p>0,05) quanto à taxa de produção de blastocisto. As taxas de embriões eclodidos (Tabela 3) foram

similares (P>0,05) entre os grupos, sendo obtido percentual médio no controle, Q10, ITS e QITS de

53,3%, 48,6%, 54,2% e 55,4%, respectivamente. O número de células nos embriões eclodidos (Tabela

3) também foi similar (P>0,05) entre os grupos e a média para o controle, Q10, ITS e QITS foi de 200,

212, 222 e 199, respectivamente.

Os embriões dos grupos Q10 (0,84) e QITS (0,87) apresentaram os menores (p<0,05) níveis

intracelulares de EROs em comparação ao grupo controle (1,0). No grupo ITS (0,90), os embriões

apresentaram os níveis intracelulares de EROs similares (p>0,05) a aqueles dos grupos Q10, QITS e

controle (Figura 1). Os níveis intracelulares de GSH nos embriões foram similares (p>0,05) entre os

grupos ITS (0,93), QITS (0,94) e controle (1,0). O grupo Q10 (0,84) apresentou os menores (p<0,05)

níveis de GSH, em comparação ao grupo controle. Quando comparado os grupos Q10, ITS e QITS,

quanto ao nível de GSH (Figura 1), não foi observada diferença significante entre si (p>0,05).

A expressão relativa do gene SOD2 não apresentou diferença significativa (p>0,05) entre os

grupos controle, Q10, ITS e QITS, sendo observada 0,93±0,13, 1,18±0,08, 1,09±0,07 e 0,98±0,02,

respectivamente.

A quantificação relativa de transcritos do gene GPX1 foi similar (p>0,05) entre os grupos

controle e Q10, sendo de 0,65±0,03 e 0,86±0,03, respectivamente. Os grupos ITS e QITS não

diferiram (p>0,05) entre si, apresentando a expressão relativa de 1,42±0,08 e 1,40±0,07,

respectivamente. No entanto, os grupos ITS e QITS apresentaram maior quantidade de transcritos do

gene GPX1 (p<0,05) que os grupos controle e Q10.

4. Discussão

A PIV de embriões no sistema de cultivo com 20% de O2 submete os embriões à alta tensão de

oxigênio, quando comparada à tensão na tuba uterina, que varia de 3% a 9% (Mastroianni e Jones,

1965). Esta maior exposição dos embriões ao oxigênio faz com que a produção de espécies reativas de

oxigênio seja potencializada (Takahashi, 2012), requerendo a adição de substâncias antioxidantes nos

meios de CIV que visa diminuir a produção indiscriminada de EROs.

O interesse em conhecer os efeitos da quercetina tem aumentado gradativamente devido a suas

propriedades terapêuticas, principalmente como a de antioxidante (Braun et al., 2011; Kang et al.,

2013; Li et al., 2013). A quercetina possui propriedades quelante e de sequestro de radicais de

oxigênio, como o superóxido e a hidroxila. Ela também é capaz de inibir a enzima xantina oxidase e a

peroxidação lipídica (Behling et al., 2004; Liu et al., 2010). No entanto, algumas informações sobre a

quercetina permanecem controversas, principalmente quanto a sua farmacocinética e de

disponibilidade sistêmica. Quando derivada de alimentos, os valores de biodisponibilidade variam de

45

0% a 52% (Graefe, Derendorf e Veit, 1999; Ader, Wessmann e Wolffram, 2000) para animais e seres

humanos (Santini et al., 2009).

No presente estudo foi avaliado o efeito de diferentes concentrações de quercetina sobre a taxa

de blastocisto. As concentrações de 0,4, 2,0, 10, e 50 μM foram utilizadas tendo como referência o

trabalho realizado em células da granulosa suína (Santini et al., 2009). A suplementação de 10 μM de

quercetina foi a que apresentou os melhores resultados quanto a PIV de embriões, mostrando que o

excesso de quercetina, tal como 50 μM, diminuiu a taxa de produção de blastocisto, sugerindo que o

excesso de quercetina deve ser prejudicial ao desenvolvimento. Esses dados estão em concordância

com os encontrados por Kang e colaboradores (Kang et al., 2013), os quais verificaram que altas

concentrações de quercetina proporcionam diminuição da taxa de produção de blastocisto em suínos.

Os dados indicam que a suplementação de antioxidante é fundamental para a PIV de embriões, em

sistema de alta concentração de oxigênio atmosférico, porém o uso excessivo torna-se prejudicial ao

desenvolvimento. As concentrações de antioxidantes devem ser ajustadas visando o equilíbrio entre os

benefícios da redução das EROs e a manutenção do funcionamento dos processos de oxido-redução

dos embriões. As EROs quando em concentrações adequadas, desempenham importantes funções

fisiológicas reprodutivas, como na maturação oocitária, na esteroidogênese ovariana, na ovulação, na

implantação, na formação de blastocisto, na manutenção do corpo lúteo, na gestação e na luteólise

(Ishikawa, 1993; Sabatini et al., 1999; Behrman et al., 2001). Os embriões cultivados na ausência de

quercetina e ITS apresentaram as menores taxas de blastocisto. Este resultado corrobora com os dados

descritos na literatura, em que a suplementação dos meios de PIV de embriões com substâncias

antioxidantes melhora as taxas de desenvolvimento embrionário (Ali, Bilodeau e Sirard, 2003; Das et

al., 2013; Kang et al., 2013). O uso de 10 μM de quercetina no meio de cultivo proporcionou aumento

na taxa de produção de blastocisto, quando comparado ao grupo sem antioxidante. O aumento na

produção de embriões pode esta relacionada com a redução do estresse oxidativo durante o processo

de cultivo embrionário, em alta tensão de oxigênio. Esta hipótese é reforçada pelo fato que o uso de 10

μM de quercetina foi capaz de reduzir significativamente os níveis intracelulares de EROs nos

embriões no estádio de 4 a 16 células. Dados similares mostraram que o uso de quercetina no cultivo

de células humanas (Braun et al., 2011) e em embriões suínos (Kang et al., 2013) foi capaz de reduzir

os níveis intracelulares de EROs, sugerindo que a quercetina apresenta atividade antioxidante quando

utilizada em cultivo celular e embrionário. Outros experimentos in vitro relataram que a quercetina

pode atuar contra os danos ao DNA, causados por H2O2 (Musonda e Chipman, 1998; Blasiak et al.,

2002; Peng e Kuo, 2003). Esta proteção ao DNA tem sido atribuída à atividade antioxidante da

quercetina. Além disso, a quercetina pode eliminar radical hidroxila (OH•) que é altamente reativo,

podendo causar danos a qualquer molécula biológica (Spencer et al., 1995).

Apesar de a quercetina ser capaz de neutralizar radicais livres, neste trabalho foi constatada a

diminuição dos níveis intracelulares de GSH, quando os embriões de 4 a 16 células foram tratados

com 10 μM de quercetina. O GSH é uma molécula essencial no sistema de defesa contra as espécies

46

reativas (De Matos e Furnus, 2000). Durante o processo de ação antioxidante da quercetina são

formados novos produtos de oxidação, tal como a quercetina–quinona, que é altamente reativa com

agrupamentos tióis (Boots et al., 2007). Essa interação entre quercetina–quinona e tióis ocorre

preferencialmente com GSH (Boots et al., 2003), o qual pode conduzir a perca da função de enzimas

importantes ao sistema de defesa contra o estresse oxidativo (Boots et al., 2002). O uso de 10 μM de

quercetina conduziu ao aumento da taxa de desenvolvimento embrionário em relação ao grupo

controle, e a diminuição dos níveis de GSH. A quercetina pode estar interferindo no sistema de defesa

contra o estresse oxidativo, porém estes efeitos não são verificados quanto à taxa de blastocisto, uma

vez que não ocorre diferença entre a produção quando utilizado quercetina, ITS ou a associação de

ambas.

A pré-mistura de ITS tem sido estudada como suplemento na PIV de embriões, especialmente

na fase de maturação (Jeong et al., 2008; Córdova et al., 2010; Hu et al., 2011). Os efeitos

metabólicos e sobre a taxa de blastocisto quando ITS é utilizado no cultivo embrionário bovino tem

sido pouco explorado. Gilardi e colaboradores (Gilardi et al., 2004) constataram que a adição de ITS

associada com vitaminas nos meios de cultivo embrionário não melhorou a taxa de blastocistos. Os

resultados aqui apresentados diferiram daqueles obtidos por Gilardi e colaboradores (2004), sendo que

os embriões cultivados na presença de ITS apresentou maior taxa de produção de blastocisto quando

comparado ao grupo controle. Os possíveis benefícios do uso de ITS na produção de embrião podem

estar relacionados aos seus efeitos nos sistemas biológicos. A insulina quando presente no meio de

cultura de embriões atua sinergicamente com os aminoácidos em prol do desenvolvimento

embrionário (Matsui et al., 1995). A transferrina tem a função de transportar ferro (Aleshire et al.,

1989) e pode atuar como quelante de radicais hidroxilas (Nasr-Esfahani e Johnson, 1992). O selênio

auxilia na modulação da glutationa peroxidase (GPX), uma proteína importe do sistema antioxidante

natural (De Matos e Furnus, 2000).

Quando os embriões foram cultivados na associação de ITS e quercetina, os níveis de EROs

foram reduzidos, mantendo-se os níveis de GSH. Esses dados sugerem que a quercetina foi capaz de

realizar sua atividade antioxidante que resultou na redução de EROs e o seu efeito colateral de

diminuir os níveis de GSH foi compensado pela ação do ITS, cujo selênio é um cofator da enzima

GPX. A GPX é responsável pela detoxificação de peróxidos orgânicos e inorgânicos. A associação de

antioxidante com ITS pode ser uma estratégia interessante, visto que o uso de antioxidante tende a

utilizar o GSH intracelular para neutralizar os produtos gerados das reações de oxido-redução dos

antioxidantes suplementados ao sistema. O cultivo in vitro de embriões bovinos em ambiente

atmosférico contendo 20% de oxigênio possibilita que uma maior quantidade de EROs seja formada

no interior da célula. Para controlar a formação excessiva de EROs, as células utilizam-se do sistema

antioxidante enzimático, o qual se inclui as enzimas SOD2 e a GPX1. Alterações no estado redox das

células proporcionam modificações no perfil de expressão gênica destas enzimas (Balasubramanian et

al., 2007; Handy et al., 2009), visto que elas convertem o radical hidroxila e o peroxido de hidrogênio

47

em água. Estudos anteriores têm mostrados alterações no perfil de expressão gênica quando embriões

são cultivados na presença de selênio (Uhm et al., 2007) e flavonóides (Choi et al., 2013). Em nosso

trabalho o nível de expressão do gene GPX1 e SOD2 não foi afetado pela presença de Q10, sugerindo

que este flavonóides não influencia diretamente na expressão dos referidos genes. No entanto, quando

os embriões foram cultivados na presença de ITS e QITS, o nível transcrito para o gene GPX1 foi

significativamente maior quando comparado ao grupo controle. Tal efeito pode estar relacionado à

presença do selênio no meio de cultura de embriões, uma vez que, o selênio é incorporado nas seleno-

proteínas tais como a GPX, uma enzima que protege a célula contra o estresse oxidativo.

5. Conclusão

O cultivo de embriões em alta tensão de oxigênio propicia a geração de EROs que em excesso

provoca danos moleculares e afetam o desenvolvimento embrionário. O uso de 10 μM de quercetina

no meio de cultivo foi capaz de diminuir os níveis intracelulares de EROs e aumentar a produção de

blastocisto em relação ao grupo controle sem a adição de antioxidante. O uso de ITS no meio de

cultivo não foi capaz de diminuir significativamente os níveis de EROs, mas resultou no aumento da

produção de blastocisto em relação ao controle. O uso de quercetina no meio de cultivo diminuiu os

níveis intracelulares de GSH que atuam no sistema de defesa contra o estresse oxidativo, enquanto que

com ITS os níveis permaneceram mais elevados. A produção de blastocisto para os grupos Q10, ITS e

QITS não apresentaram diferenças significativas. Na associação de quercetina e ITS os níveis de

EROs foram diminuídos aos níveis similares aos encontrados para o grupo Q10, e a os níveis

intracelulares GSH foram similares ao grupo ITS, sem diminuir a taxa de produção de blastocisto. A

expressão gênica relativa do gene SOD2 não sofreu variação entre os diferentes grupos, no entanto, a

expressão do gene GPX1 foi aumentada nos grupos ITS e QITS em relação ao controle e Q10. Estes

dados sugerem que a adição de 10 μM de quercetina e ITS no meio de cultivo são capazes de diminuir

os níveis intracelulares de EROs, manter os níveis intracelulares de GSH, proporcionar alta taxa de

desenvolvimento embrionário e aumentar a expressão do gene GPX1.

Agradecimentos

À UNOPAR e Agropecuária Laffranchi, pelo apoio financeiro ao projeto.

6. Referência ADER, P.; WESSMANN, A.; WOLFFRAM, S. Bioavailability and metabolism of the flavonol quercetin in the pig. Free Radical Biology and Medicine, v. 28, n. 7, p. 1056-1067, 2000. ISSN 0891-5849.

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52

Tabela 1. Primers utilizados nas análises da expressão genética relativa.

Gene-symbol Sequence (5´- 3´) Product size (bp)

GHPDH

Forward:5 CGACTTCAACAGCGACACTCA Reverse:5 AGCCAAATTCATTGTCGTACCA probe:5 CACTTTGTCAAGCTCATT

107

GPX1

Forward:5 AGTTTGGGCATCAGGAAAACG Reverse::5 GAGCATAAAGTTGGGCTCGAA probe:5 CTGAAGTACGTCCGACCAG

95

SOD2

Forward:5 CGCTGGAGAAGGGTGATGTT Reverse::5 TGTCCAGAAGATGCTGTGATTGA probe:5 CAGCTCAGATAGCTCTG

95

Tabela 2. Suplementação dos meios de CIV com diferentes concentrações de quercetina e o seu efeito sobre o desenvolvimento embrionário.

Concentração de quercetina

Oócitos Nº

Clivagem D2 Nº (% ± epm)

Blastocistos D7 Nº (% ± epm)

0,0 μM 310 252 (81,6±1,5)a 117 (38,0±3,7)c

0,4 μM 302 233 (77,3±2,2)a 141 (47,0±3,7)ab

2,0 μM 305 234 (76,8±2,3)a 144 (47,4±1,8)ab

10 μM 306 233 (76,3±1,8)a 164 (53,6±2,0)a

50 μM 303 232 (76,6±1,6)a 136 (44,8±3,5)bc

Letras (a-c) diferentes na mesma coluna indicam diferença (p<0,05) entre os tratamentos. Erro padrão médio (epm).

Tabela 3. Avaliação do uso de quercetina e ITS e seus efeitos sobre o desenvolvimento embrionário.

Tratamentos Oócitos Nº

Clivagem D2 Nº (%±epm)

Blastocistos D7

Nº (%±epm)

Eclosão D8 Nº (%±epm)

Células D8 M (Mín-Máx±epm)

Controle 796 662 (83,2±1,5)a 309 (38,3±2,1)b 165 (53,3±3,6)a 200 (87-299±8,1)a

Q10 727 615 (84,7±2,1)a 323 (46,1±2,2)a 157 (48,6±3,4)a 212 (89-411±11,1)a

ITS 750 623 (83,0±1,7)a 345 (47,1±2,4)a 187 (54,2±5,2)a 222 (82-301±9,8)a

QITS 761 625 (82,2±1,7)a 332 (45,0±2,3)a 184 (55,4±4,9)a 199 (88-356±9,3)a

Letras (a-b) diferentes na mesma coluna indicam diferença (p<0,05) entre os grupos experimentais. Erro padrão médio (epm). Média aritmética (M). Número mínimo e máximo (Mín-Máx) de célula dos embriões eclodidos.

53

Figura 1. Imagens fotomicrográficas de epifluorescência de embriões in vitro bovinos. (A) As letras representam os diferentes grupos. (a) controle, (b) Q10, (c) ITS e (d) QITS utilizadas na determinação dos níveis intracelulares de EROs. (e) controle, (f) Q10, (g) ITS e (h) QITS, utilizados na determinação dos níveis intracelulares de GSH. (B) Efeito do uso de quercetina e ITS sobre os níveis intracelulares de EROs e GSH dos embriões bovinos. A intensidade de fluorescência foi relacionada com o nível intracelular de EROs e GSH. Letras (a-b) da mesma análise indica diferença (p<0,05) entre tratamentos. As barras de erro representam o erro padrão médio de três réplicas de fluorescência.

(A)

(B)

a c d b

e g h f

0.3

0.6

0.9

1.2

ROS GSH

CONTROL Q10 ITS QITS

a a

b ab

b ab

b

ab

Rel

ativ

e le

vel (

fluor

esce

nce/

embr

yo)

54

Figura 2. Uso de quercetina e ITS no cultivo de embriões bovinos in vitro e seus efeitos sobre a expressão gênica dos genes GPX1 e SOD2. Diferentes letras (a-b) em cada gene denotam diferenças significativas (p <0,05) entre os grupos experimentais. As barras de erro representam o erro padrão da média de três réplicas da quantificação da expressão relativa.

0.0

0.6

1.2

1.8

2.4

GPX1 SOD2

CONTROL Q10 ITS QITS

Rel

ativ

e ex

pres

sion

b b

b b

b b

c c

55

6. CONCLUSÃO GERAL

A partir deste estudo, pode-se concluir que a suplementação do

meio de maturação in vitro com os antioxidantes quercetina ou cisteamina, em um

sistema de alta concentração de oxigênio atmosférico, aumenta as taxas de

produção de blastocistos. O uso de 10 μM de quercetina no meio de cultivo foi capaz

de diminuir os níveis intracelulares de EROs e aumentar a produção de blastocisto

em relação ao grupo controle sem a adição de antioxidante. O uso de ITS no meio

de cultivo não foi capaz de diminuir significativamente os níveis de EROs, mas

resultou no aumento da produção de blastocisto em relação ao controle. A produção

de blastocisto para os grupos Q10, ITS e QITS não apresentaram diferenças

significativas. A expressão gênica relativa do gene SOD2 não sofreu variação entre

os diferentes grupos, no entanto, a expressão do gene GPX1 foi aumentada nos

grupos ITS e QITS em relação ao controle e Q10. Estes dados sugerem que a

adição de 10 μM de quercetina e ITS no meio de cultivo são capazes de diminuir os

níveis intracelulares de EROs, manter os níveis intracelulares de GSH, melhorar a

taxa de desenvolvimento embrionário e aumentar a expressão do gene GPX1.

Contudo, novos estudos serão necessários para compreender

melhor o comportamento da quercetina durante a PIV de embriões e seus efeitos

sobre a implantação do embrião no útero e desenvolvimento do feto.

7. REFERÊNCIAS 1 VIANA, J. H. Levantamento estatístico da produção de embriões bovinos no

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kinase inhibitors in bovine oocytes and its effects on maturation and embryo development. Zygote, v. 12, n. 3, p. 197-204, 2004. ISSN 0967-1994 1469-8730.

24 GARCIA, J.; AVELINO, K.; VANTINI, R. Estado da arte da fertilização in

Vitro em bovinos. Annals of the First International Symposium on Animal Reproduction Applied: 14-16 October 2004; Londrina, 2004. 223-230 p.

25 BRACKETT, B.; YOUNIS, A.; FAYRER-HOSKEN, R. Enhanced viability after

in vitro fertilization of bovine oocytes matured in vitro with high concentrations of luteinizing hormone. Fertility and sterility, v. 52, n. 2, p. 319, 1989. ISSN 0015-0282.

26 DAS, K. et al. Direct positive effect of epidermal growth factor on the

cytoplasmic maturation of mouse and human oocytes. Fertility and sterility, v. 55, n. 5, p. 1000, 1991. ISSN 0015-0282.

27 KIM, K. et al. The effects of follicular fluid on in vitro maturation, oocyte

fertilization and the development of bovine embryos. Theriogenology, v. 45, n. 4, p. 787-799, 1996. ISSN 0093-691X.

58

28 HASHIMOTO, S. et al. Bovine immature oocytes acquire developmental competence during meiotic arrest in vitro. Biology of reproduction, v. 66, n. 6, p. 1696-1701, 2002. ISSN 0006-3363.

29 OYAMADA, T.; IWAYAMA, H.; FUKUI, Y. Additional effect of epidermal growth

factor during in vitro maturation for individual bovine oocytes using a chemically defined medium. Zygote, v. 12, n. 2, p. 143-150, 2004. ISSN 0967-1994.

30 SANTOS, S. D. S. D. et al. Cinética da maturação nuclear in vitro de oócitos

bubalinos. Braz J Vet Res Anim Sci, v. 39, n. 5, p. 266-270, 2002. ISSN 1413-9596.

31 OLSON, S.; SEIDEL, G. Culture of in vitro-produced bovine embryos with

vitamin E improves development in vitro and after transfer to recipients. Biology of reproduction, v. 62, n. 2, p. 248-252, 2000. ISSN 0006-3363.

32 SHARMA, A. K. et al. Purification of heparin binding oviduct specific proteins

and its effect on in vitro embryo development in cattle. Indian Journal of Experimental Biology, v. 51, n. 5, p. 347-351, 2013. ISSN 0019-5189.

33 CEBRIAN SERRANO, A.; SALVADOR, I.; SILVESTRE, M. Beneficial Effect of

Two Culture Systems with Small Groups of Embryos on the Development and Quality of In Vitro Produced Bovine Embryos. Anatomia, histologia, embryologia, 2013. ISSN 1439-0264.

34 SILVA, C. et al. Influência da tensão de oxigênio na maturação oocitária e

cultivo in vitro de folículos e embriões. Rev Bras Reprod Anim, v. 34, n. 4, p. 233-242, 2010. ISSN 0102-0803.

35 CLARK, A. et al. Mathematical modelling of oxygen concentration in bovine

and murine cumulus–oocyte complexes. Reproduction, v. 131, n. 6, p. 999-1006, 2006. ISSN 1470-1626.

36 HARVEY, A. J. The role of oxygen in ruminant preimplantation embryo

development and metabolism. Animal reproduction science, v. 98, n. 1, p. 113-128, 2007. ISSN 0378-4320.

37 AGARWAL, A.; GUPTA, S.; SHARMA, R. K. Role of oxidative stress in female

reproduction. Reprod Biol Endocrinol, v. 3, n. 28, p. 1-21, 2005. 38 SILVA, G. et al. Papel dos antioxidantes no cultivo in vitro de células

ovarianas. Revista Brasileira de Reprodução Animal, v. 35, n. 3, 2011. ISSN 0102-0803.

39 BARJA, G. Mitochondrial oxygen consumption and reactive oxygen species

production are independently modulated: implications for aging studies. Rejuvenation research, v. 10, n. 2, p. 215-224, 2007. ISSN 1549-1684.

59

40 DOWLING, D. K.; SIMMONS, L. W. Reactive oxygen species as universal constraints in life-history evolution. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences, v. 276, n. 1663, p. 1737-1745, 2009. ISSN 0962-8452.

41 FERREIRA, A.; MATSUBARA, L. Radicais livres: conceitos, doenças

relacionadas, sistema de defesa e estresse oxidativo. Revista da Associação Médica Brasileira, v. 43, n. 1, p. 61-68, 1997. ISSN 0104-4230.

42 NORDBERG, J.; ARNER, E. S. Reactive oxygen species, antioxidants, and

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43 MAIA, M. Viabilidade espermática e geração de metabólitos reativos do

oxigênio (ROS) no sêmen ovino criopreservado em diluidor aditivado de lauril sulfato de sódio (OEP), trolox-c e catalase. 2006. 147 f. 2006. Dissertação (Doutorado em Medicina Veterinária)–Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Botucatu

44 HALLIWELL, B.; GUTTERIDGE, J. Oxygen free radicals and iron in relation to

biology and medicine: some problems and concepts. Archives of Biochemistry and Biophysics, v. 246, n. 2, p. 501-514, 1986. ISSN 0003-9861.

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fluid catalase to mammalian spermatozoa. Biology of reproduction, v. 58, n. 3, p. 747-753, 1998. ISSN 0006-3363.

48 RIBEIRO, S. M. R. et al. A formação e os efeitos das espécies reativas de

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49 BIANCHI, M. D. L. P.; ANTUNES, L. M. G. Radicais livres e os principais

antioxidantes da dieta. Rev Nutr, v. 12, n. 2, p. 123-30, 1999. 50 DE MATOS, D.; FURNUS, C. The importance of having high glutathione

(GSH) level after bovine in vitro maturation on embryo development: effect of β-mercaptoethanol, cysteine and cystine. Theriogenology, v. 53, n. 3, p. 761-771, 2000. ISSN 0093-691X.

51 DE MATOS, D. G. et al. Effect of cysteamine on glutathione level and

developmental capacity of bovine oocyte matured in vitro. Molecular reproduction and development, v. 42, n. 4, p. 432-436, 1995. ISSN 1098-2795.

60

52 DE MATOS, D. G.; FURNUS, C. C.; MOSES, D. F. Glutathione synthesis during in vitro maturation of bovine oocytes: role of cumulus cells. Biology of reproduction, v. 57, n. 6, p. 1420-1425, 1997. ISSN 0006-3363.

53 ISSELS, R. D. et al. Promotion of cystine uptake and its utilization for

glutathione biosynthesis induced by cysteamine and< i> N</i>-acetylcysteine. Biochemical pharmacology, v. 37, n. 5, p. 881-888, 1988. ISSN 0006-2952.

54 NASR-ESFAHANI, M.; JOHNSON, M. How does transferrin overcome the in

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55 JEONG, Y. W. et al. Effects of insulin–transferrin–selenium in defined and

porcine follicular fluid supplemented IVM media on porcine IVF and SCNT embryo production. Animal reproduction science, v. 106, n. 1, p. 13-24, 2008. ISSN 0378-4320.

56 ALESHIRE, S. et al. Localization of transferrin and its receptor in ovarian

follicular cells: morphologic studies in relation to follicular development. Fertility and sterility, v. 51, n. 3, p. 444, 1989. ISSN 0015-0282.

57 FORSTROM, J. W.; ZAKOWSKI, J. J.; TAPPEL, A. L. Identification of the

catalytic site of rat liver glutathione peroxidase as selenocysteine. Biochemistry, v. 17, n. 13, p. 2639-2644, 1978. ISSN 0006-2960.

58 HOLLMAN, P. C. H.; KATAN, M. Dietary flavonoids: intake, health effects and

bioavailability. Food and Chemical Toxicology, v. 37, n. 9, p. 937-942, 1999. ISSN 0278-6915.

59 GUAZELLI, C. F. et al. Quercetin-loaded microcapsules ameliorate

experimental colitis in mice by anti-inflammatory and antioxidant mechanisms. J Nat Prod, v. 76, n. 2, p. 200-8, Feb 22 2013. ISSN 1520-6025 (Electronic) 0163-3864 (Linking). Disponível em: < http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23347547 >.

60 BEHLING, E. et al. Flavonóide quercetina: aspectos gerais e ações

biológicas. Alimentos e Nutrição Araraquara, v. 15, n. 3, p. 285-292, 2008. ISSN 2179-4448.

61 RUSSO, R. O.; SPERANZA SÁNCHEZ, M. Los flavonoides en la terapia

cardiovascular. Revista Costarricense de Cardiología, v. 8, n. 1, p. 13-18, 2006. ISSN 1409-4142.

62 KANG, J.-T. et al. Quercetin improves the in vitro development of porcine

oocytes by decreasing reactive oxygen species levels. Journal of veterinary science, v. 14, n. 1, p. 15-20, 2013. ISSN 1229-845X.

63 LI, Y. et al. Quercetin protects rat hepatocytes from oxidative damage induced

by ethanol and iron by maintaining intercellular liable iron pool. Human & experimental toxicology, 2013. ISSN 0960-3271.

61

64 BORS, W. et al. [36] Flavonoids as antioxidants: Determination of radical-

scavenging efficiencies. Methods in enzymology, v. 186, p. 343-355, 1990. ISSN 0076-6879.

65 SEKHER PANNALA, A. et al. Flavonoid B-ring chemistry and antioxidant

activity: fast reaction kinetics. Biochemical and Biophysical Research Communications, v. 282, n. 5, p. 1161-1168, 2001. ISSN 0006-291X.

66 MARTÍNEZ-FLÓREZ, S. et al. Los flavonoides: propiedades y acciones

antioxidantes. Nutr Hosp, v. 17, n. 6, p. 271-278, 2002. ISSN 0212-1611. 67 BRAUN, K. F. et al. Quercetin protects primary human osteoblasts exposed to

cigarette smoke through activation of the antioxidative enzymes HO-1 and SOD-1. The Scientific World Journal, v. 11, p. 2348-2357, 2011.

68 MERCK, S. Industrias químicas. Bioflavonoides: Quercetina y rutina.

Informe a profesionales, 2000. 69 PACE-ASCIAK, C. R. et al. The red wine phenolics< i> trans</i>-resveratrol

and quercetin block human platelet aggregation and eicosanoid synthesis: Implications for protection against coronary heart disease. Clinica Chimica Acta, v. 235, n. 2, p. 207-219, 1995. ISSN 0009-8981.

70 BEN ABDALLAH, F.; ZRIBI, N.; AMMAR KESKES, L. Antioxidative potential of

Quercetin against hydrogen peroxide induced oxidative stress in spermatozoa in vitro. Andrologia, v. 43, n. 4, p. 261-265, 2011. ISSN 1439-0272.

71 AFANAS' EV, I. B. et al. Chelating and free radical scavenging mechanisms

of inhibitory action of rutin and quercetin in lipid peroxidation. Biochemical pharmacology, v. 38, n. 11, p. 1763-1769, 1989. ISSN 0006-2952.

72 COOK, N.; SAMMAN, S. Flavonoids—chemistry, metabolism, cardioprotective

effects, and dietary sources. The Journal of Nutritional Biochemistry, v. 7, n. 2, p. 66-76, 1996. ISSN 0955-2863.

73 BARCELOS, G. R. M. et al. Protective properties of quercetin against DNA

damage and oxidative stress induced by methylmercury in rats. Archives of toxicology, v. 85, n. 9, p. 1151-1157, 2011. ISSN 0340-5761.

74 SCOTTI, L. et al. Modelagem molecular aplicada ao desenvolvimento de

moléculas com atividade antioxidante visando ao uso cosmético. Brazilian Journal of Pharmaceutical Sciences, v. 43, n. 2, p. 3-12, 2007.

62

8. ANEXOS

63

ANEXO A - Carta de aprovação do comitê de ética em pesquisa com animais

64

ANEXO B - Normas de formatação do periódico arquivo brasileiro de medicina

veterinária e zootecnia - ABMVZ.

65

66

67

68

69

70

ANEXO C – Carta de recomendação para publicação

71

ANEXO D – Normas de formatação do periódico Semina: Ciências Agrárias

.Normas editoriais para publicação na Semina: Ciências Agrárias, UEL.

A partir de 01 de abril de 2014, os artigos poderão ser submetidos em português ou inglês,mas somente serão publicados em inglês. Os artigos submetidos em português, após o aceite, deverão ser obrigatoriamente traduzidos para o inglês.

Os artigos enviados para a revista até esta data e que estão em tramitação poderão ser publicados em português, entretanto, se traduzidos para o inglês terão prioridade na publicação.

Todos os artigos, após o aceite deverão estar acompanhados (como documento suplementar) do comprovante de tradução ou correção de um dos seguintes tradutores:

American Journal Experts Editage Elsevier http://www.proof-reading-service.com http://www.academic-editing-services.com/ http://www.publicase.com.br/formulario.asp

O autor principal deverá anexar no sistema o documento comprobatório dessa correção na página de submissão em “Docs. Sup.”

OBSERVAÇÕES:

1) Os manuscritos originais submetidos à avaliação são inicialmente apreciados pelo Comitê Editorial da Semina: Ciências Agrárias. Nessa análise, são avaliados os requisitos de qualidade para publicação na revista, como: escopo; adequação às normas da revista; qualidade da redação; fundamentação teórica; atualização da revisão da literatura; coerência e precisão da metodologia; contribuição dos resultados; discussão dos dados observados; apresentação das tabelas e figuras; originalidade e consistência das conclusões. Se o número de trabalhos com manuscrito ultrapassar a capacidade de análise e de publicação da Semina: Ciências Agrárias é feita uma comparação entre as submissões, e são encaminhados para assessoria Ad hoc, os trabalhos considerados com maior potencial de contribuição para o avanço do conhecimento cientifico. Os trabalhos não aprovados nesses critérios são arquivados e os demais são submetidos a análise de pelo menos dois assessores científicos, especialistas da área técnica do artigo, sem a identificação do(s) autor(es). Os autores cujos artigos forem arquivados, não terão direito à devolução da taxa de submissão. 2) Quando for o caso, deve ser informado que o projeto de pesquisa que originou o artigo foi executado obedecendo às normas técnicas de biosegurança e ética sob a aprovação da comissão de ética envolvendo seres humanos e/ou comissão de ética no uso de animais (nome da Comissão, Instituição e nº do Processo).

NÃO SERÃO ACEITOS MANUSCRITOS EM QUE:

a) O arquivo do artigo anexado do trabalho contenha os nomes dos autores e respectiva afiliação; b) Não tenha sido realizado o cadastro completo de todos os autores nos metadados de submissão; c) Não tenha sido incluído no campo COMENTÁRIOS PARA O EDITOR, um texto que aponte a relevância do trabalho (importância e diferencial em relação a trabalhos já existentes), em até 10 linhas; d) Não estejam acompanhados de documento comprobatório da taxa de submissão, em documento suplementar “Docs. Sup.” no ato da submissão; e) Não estejam acompanhados dos seguintes documentos suplementares: gráficos, figuras, tabelas, fotos e outros, EM VERSÃO ORIGINAL.

72

RESTRIÇÃO POR ÁREA:

PARA A ÁREA DE VETERINÁRIA

a) A publicação de relatos de casos é restrita e somente serão selecionados para tramitação àqueles de grande relevância ou ineditismo, com real contribuição ao avanço do conhecimento para a área relacionada.

Categorias dos Trabalhos

a) Artigos científicos: no máximo 20 páginas incluindo figuras, tabelas e referências bibliográficas;

b) Comunicações científicas: no máximo 12 páginas, com referências bibliográficas limitadas a 16 citações e no máximo duas tabelas ou duas figuras ou uma tabela e uma figura;

b) Relatos de casos: No máximo 10 páginas, com referências bibliográficas limitadas a 12 citações e no máximo duas tabelas ou duas figuras ou uma tabela e uma figura;

c) Artigos de revisão: no máximo 25 páginas incluindo figuras, tabelas e referências bibliográficas.

Apresentação dos Trabalhos

Os originais completos dos artigos, comunicações, relatos de casos e revisões podem ser escritos em português ou inglês no editor de texto Word for Windows, em papel A4, com numeração de linhas por página, espaçamento 1,5, fonte Times New Roman, tamanho 11 normal, com margens esquerda e direita de 2 cm e superior e inferior de 2 cm, respeitando-se o número de páginas, devidamente numeradas no canto superior direito, de acordo com a categoria do trabalho.

Figuras (desenhos, gráficos e fotografias) e Tabelas serão numeradas em algarismos arábicos e devem ser incluídas no final do trabalho, imediatamente após as referências bibliográficas, com suas respectivas chamadas no texto. Alem disso, as figuras devem apresentar boa qualidade e deverão ser anexadas nos seus formatos originais (JPEG, TIF, etc) em “Docs Supl.” na página de submissão. Não serão aceitas figuras e tabelas fora das seguintes especificações: Figuras e tabelas deverão ser apresentadas nas larguras de 8 ou 16 cm com altura máxima de 22 cm, lembrando que se houver a necessidade de dimensões maiores, no processo de editoração haverá redução para as referidas dimensões.

Observação: Para as tabelas e figuras em qualquer que seja a ilustração, o título deve figurar na parte superior da mesma, seguida de seu número de ordem de ocorrência em algarismo arábico, ponto e o respectivo titulo.

Indicar a fonte consultada abaixo da tabela ou figura (elemento obrigatório). Utilizar fonte menor (Times New Roman 10).

Citar a autoria da fonte somente quando as tabelas ou figuras não forem do autor.

Ex: Fonte: IBGE (2014), ou Source: IBGE (2014).

Preparação dos manuscritos

Artigo científico:

Deve relatar resultados de pesquisa original das áreas afins, com a seguinte organização dos tópicos: Título; Título em inglês; Resumo com Palavras-chave (no máximo seis palavras, em ordem alfabética); Abstract com Key words (no máximo seis palavras, em ordem alfabética); Introdução; Material e Métodos; Resultados e Discussão com as conclusões no final da discussão ou Resultados; Discussão e Conclusões separadamente; Agradecimentos; Fornecedores, quando houver e Referências Bibliográficas. Os tópicos devem ser destacados em negrito, sem numeração, quando houver a necessidade de subitens dentro dos tópicos, os mesmos devem ser destacados em itálico e se houver dentro do subitem mais divisões, essas devem receber números arábicos. (Ex. Material e Métodos...Áreas de estudo...1. Área rural...2. Área urbana).

73

O trabalho submetido não pode ter sido publicado em outra revista com o mesmo conteúdo, exceto na forma de resumo em Eventos Científicos, Nota Prévia ou Formato Reduzido.

A apresentação do trabalho deve obedecer à seguinte ordem:

1.Título do trabalho, acompanhado de sua tradução para o inglês.

2.Resumo e Palavras-chave: Deve ser incluído um resumo informativo com um mínimo de 200 e um máximo de 400 palavras, na mesma língua que o artigo foi escrito, acompanhado de sua tradução para o inglês (Abstract e Key words).

3.Introdução: Deverá ser concisa e conter revisão estritamente necessária à introdução do tema e suporte para a metodologia e discussão.

4.Material e Métodos: Poderá ser apresentado de forma descritiva contínua ou com subitens, de forma a permitir ao leitor a compreensão e reprodução da metodologia citada com auxílio ou não de citações bibliográficas.

5. Resultados e Discussão: Devem ser apresentados de forma clara, com auxílio de tabelas, gráficos e figuras, de modo a não deixar dúvidas ao leitor, quanto à autenticidade dos resultados e pontos de vistas discutidos. Opcionalmente, as conclusões podem estar no final da discussão.

6. Conclusões: Devem ser claras e de acordo com os objetivos propostos no trabalho.

7. Agradecimentos: As pessoas, instituições e empresas que contribuíram na realização do trabalho deverão ser mencionadas no final do texto, antes do item Referências Bibliográficas.

Observações:

Notas: Notas referentes ao corpo do artigo devem ser indicadas com um símbolo sobrescrito, imediatamente depois da frase a que diz respeito, como notas de rodapé no final da página.

Figuras: Quando indispensáveis figuras poderão ser aceitas e deverão ser assinaladas no texto pelo seu número de ordem em algarismos arábicos. Se as ilustrações enviadas já foram publicadas, mencionar a fonte e a permissão para reprodução.

Tabelas: As tabelas deverão ser acompanhadas de cabeçalho que permita compreender o significado dos dados reunidos, sem necessidade de referência ao texto.

Grandezas, unidades e símbolos:

a) Os manuscritos devem obedecer aos critérios estabelecidos nos Códigos Internacionais de cada área.

b) Utilizar o Sistema Internacional de Unidades em todo texto.

c) Utilizar o formato potência negativa para notar e inter-relacionar unidades, e.g.: kg ha-1. Não inter-relacione unidades usando a barra vertical, e.g.: kg/ha.

d) Utilizar um espaço simples entre as unidades, g L-1, e não g.L-1 ou gL-1.

e) Usar o sistema horário de 24 h, com quatro dígitos para horas e minutos: 09h00, 18h30.

8. Citações dos autores no texto

Deverá seguir o sistema de chamada alfabética seguidas do ano de publicação de acordo com os seguintes exemplos:

a) Os resultados de Dubey (2001) confirmaram que .....

b) De acordo com Santos et al. (1999), o efeito do nitrogênio.....

74

c) Beloti et al. (1999b) avaliaram a qualidade microbiológica.....

d) [...] e inibir o teste de formação de sincício (BRUCK et al., 1992).

e) [...]comprometendo a qualidade de seus derivados (AFONSO; VIANNI, 1995).

Citações com dois autores

Citações onde são mencionados dois autores, separar por ponto e vírgula quando estiverem citados dentro dos parênteses.

Ex: (PINHEIRO; CAVALCANTI, 2000).

Quando os autores estiverem incluídos na sentença, utilizar o (e)

Ex: Pinheiro e Cavalcanti (2000).

Citações com mais de dois autores

Indicar o primeiro autor seguido da expressão et al.

Dentro do parêntese, separar por ponto e vírgula quando houver mais de uma referência.

Ex: (RUSSO et al., 2000) ou Russo et al. (2000); (RUSSO et al., 2000; FELIX et al., 2008).

Para citações de diversos documentos de um mesmo autor, publicados no mesmo ano, utilizar o acréscimo de letras minúsculas, ordenados alfabeticamente após a data e sem espacejamento.

Ex: (SILVA, 1999a, 1999b).

As citações indiretas de diversos documentos de um mesmo autor, publicados em anos diferentes, separar as datas por vírgula.

Ex: (ANDRADE, 1999, 2000, 2002).

Para citações indiretas de vários documentos de diversos autores, mencionados simultaneamente, devem figurar em ordem alfabética, separados por ponto e vírgula.

Ex: (BACARAT, 2008; RODRIGUES, 2003).

9. Referências: As referências, redigidas segundo a norma NBR 6023, ago. 2000, e reformulação número 14.274 de 2011 da ABNT, deverão ser listadas na ordem alfabética no final do artigo. Todos os autores participantes dos trabalhos deverão ser relacionados, independentemente do número de participantes. A exatidão e adequação das referências a trabalhos que tenham sido consultados e mencionados no texto do artigo, bem como opiniões, conceitos e afirmações são da inteira responsabilidade dos autores.

Observação: Consultar os últimos fascículos publicados para mais detalhes de como fazer as referências do artigo.

As outras categorias de trabalhos (Comunicação científica, Relato de caso e Revisão) deverão seguir as mesmas normas acima citadas, porém, com as seguintes orientações adicionais para cada caso:

Comunicação científica

Uma forma concisa, mas com descrição completa de uma pesquisa pontual ou em andamento (nota prévia), com documentação bibliográfica e metodologias completas, como um artigo científico regular. Deverá conter os seguintes tópicos: Título (português e inglês); Resumo com Palavras-chave; Abstract com Key words; Corpo do trabalho sem divisão de tópicos, porém seguindo a sequência - introdução,

75

metodologia, resultados (podem ser incluídas tabelas e figuras), discussão, conclusão e referências bibliográficas.

Relato de caso

Descrição sucinta de casos clínicos e patológicos, resultados inéditos, descrição de novas espécies e estudos de ocorrência ou incidência de pragas, microrganismos ou parasitas de interesse agronômico, zootécnico ou veterinário. Deverá conter os seguintes tópicos: Título (português e inglês); Resumo com Palavras-chave; Abstract com Key words; Introdução com revisão da literatura; Relato do (s) caso (s), incluindo resultados, discussão e conclusão; Referências Bibliográficas.

Artigo de revisão bibliográfica

Deve envolver temas relevantes dentro do escopo da revista. O número de artigos de revisão por fascículo é limitado e os autores somente poderão apresentar artigos de interesse da revista mediante convite de membro(s) do comitê editorial da Revista. No caso de envio espontâneo do autor (es), é necessária a inclusão de resultados relevantes próprios ou do grupo envolvido no artigo, com referências bibliográficas, demonstrando experiência e conhecimento sobre o tema.

O artigo de revisão deverá conter os seguintes tópicos: Título (português e inglês); Resumo com Palavras-chave; Abstract com Key words; Desenvolvimento do tema proposto (com subdivisões em tópicos ou não); Conclusões ou Considerações Finais; Agradecimentos (se for o caso) e Referências Bibliográficas.

Outras informações importantes

1. A publicação dos trabalhos depende de pareceres favoráveis da assessoria científica "Ad hoc" e da aprovação do Comitê Editorial da Semina: Ciências Agrárias, UEL.

2. Não serão fornecidas separatas aos autores, uma vez que os fascículos estarão disponíveis no endereço eletrônico da revista (http://www.uel.br/revistas/uel).

4. Transferência de direitos autorais: Os autores concordam com a transferência dos direitos de publicação do referido artigo para a revista. A reprodução de artigos somente é permitida com a citação da fonte e é proibido o uso comercial das informações.

5. As questões e problemas não previstos na presente norma serão dirimidos pelo Comitê Editorial da área para a qual foi submetido o artigo para publicação.

6. Numero de autores: Não há limitação para número de autores, mas deverão fazer parte como co-autores aquelas pessoas que efetivamente participaram do trabalho. Pessoas que tiveram uma pequena participação no artigo deverão ser citadas no tópico de Agradecimentos, bem como instituições que concederam bolsas e recursos financeiros.

Condições para submissão

Como parte do processo de submissão, os autores devem verificar a conformidade da submissão em relação a todos os itens listados a seguir. As submissões que não estiverem de acordo com as normas serão rejeitadas e aos autores informados da decisão.

1. Os autores devem informar que a contribuição é original e inédita, e não está sendo avaliada para publicação por outra revista; caso contrário, deve-se justificar em "Comentários ao Editor".

2. Devem informar ainda que o material está corretamente formatado e que os Documentos Suplementares estão anexados, ESTANDO CIENTE que a formatação incorreta importará na SUSPENSÃO do processo de avaliação SEM AVALIAÇÃO DE MÉRITO.

3. Devem ser preenchidos dados de autoria de todos os autores no campo Metadados durante o processo de submissão.

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Semina: Ciências Agrárias Londrina - PR

ISSN 1676-546X E-ISSN 1679-0359

semina.agrarias@uel.br

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ANEXO E – Protocolos de meios para PIV de embriões bovinos

I) ESTOQUES

Meios para MIV, FIV e CIV

1) Penicilina/estreptomicina Volume

H2O 100 mL 20,0 mL

Penicilina (100 UI/mL) Sigma/P-7794 6,1 g 1,22 g

Estreptomicina (100 g/mL) Sigma/S-9137 5,0 g 1,0 g Filtrar/estocar no freezer (validade seis messes)

2) Gentamicina sulfato Volume

NaCl 0,9 % 10,0 mL

Gentamicina (10 mg/mL) Sigma/G-1272 0,1 g Filtrar/estocar no freezer (validade seis messes)

3) LH 5.0 g/mL

Diluição em TCM-199 ou NaCl 0,9% lutropin-v BIONICHE Filtrar/estocar no freezer (validade seis messes)

4) FSH 0,5 g/mL

Diluição em TCM-199 ou NaCl 0,9% Folltropin-v BIONICHE Filtrar/estocar no freezer (validade seis messes)

5) Estradiol-17 1,0 g/mL

(freezer) Estocar no freezer

6) Ácido piruvico

H2O 5 mL Piruvato (2mM) Sigma/P-5280 Filtrar/estocar no freezer (validade seis messes)

7) Solução Salina Volume

H2O 50,0 mL

NaCl (0,9%) 0,45 g Filtrar e estocar na geladeira por duas semanas.

8) Hipotaurina

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Volume NaCl 0,9% 10,0 mL

Hipotaurina (1 mM) Sigma/H-1384 0,0011 g Filtrar e fazer alíquotas

9) Epinefrina (Proteger da luz) Volume

H2O 40,0 mL

Acido lático (60%) 104 L

Metabissulfito (Na2S2O5) Sigma/S-9000 0,04 g

Corrigir o pH para 4,0 com HCl (1M) Acrescentar a Epinefrina (250 mM) Sigma/E-1635 0,00183 g Filtrar e fazer alíquotas

10) Penicilamina

Volume NaCl 0,9 % 10,0 mL

Penicilamina (2 mM) Sigma/P-4875 0,003 g Filtrar e fazer alíquotas

11) PHE (Proteger da luz) Volume

NaCl (0,9%) 8,0 mL

Penicilamina 5,0 mL

Hipotaurina 5,0 mL

Epinefrina 2,0 mL Estocar em alíquotas de 250 L no freezer por seis meses (proteger da luz).

12) Heparina Volume

NaCl 0,9 % 10,0 mL

Heparina (3 mg/mL) USB/CAS:9041-08-1 0,03 g Filtrar/estocar no freezer alíquotas de 30 L (validade seis messes)

13) CaCl2.2H2O

Volume H2O 5,0 mL

CaCl2.2H2O 0,155 g Filtrar/estocar na geladeira (validade seis messes)

14) Sodium tri citrate

Volume H2O 5,0 mL

Sodium tri citrate (1000X) Merck/1.06448.1000 0,5 g Filtrar/estocar no freezer (validade seis messes)

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15) Hemi cálcio–lactato Volume H2O 3,0 mL

Hemi cálcio–lactato (100X) 0,164 g Filtrar/estocar no freezer (validade seis messes)

16) Aminoácidos (AA) Volume H2O 6,0 mL

Glicina (50X) Sigma/G-8790 0,225 g

Alanina (50X) Sigma/A-7627 0,045 g

Glutamina (50X) Sigma/G-8540 0,027 g Filtrar/estocar no freezer (validade seis messes)

17) TALP – Fec

(TALP - Tyrode’s Albumin lactate Pyruvate) mM Volume H20 50,0 mL

NaCl Sigma/S-9625 0,333 g

NaH2P04 Sigma/S-5515 0,002 g

NaHCO3 Sigma/S-5461 0,105 g

KCl Sigma/P-5405 0,012 g

MgCl2.6H20 Sigma/M-2393 0,005 g

CaCl2.2H2O Sigma/C-7902 0,015 g

Acido lático (60%) Sigma/L-7900 72 L

Phenol red Sigma/P-3552 0,001 g

Piruvato Sigma/P-5280 0,0011 g

Antibióticos estoque 50 L pH: 7,8. Filtrar e estocar na geladeira por duas semanas. mOsm. 285

18) TALP – SP (10X)

80

Volume H20 10,0 mL

NaCl 0,584 g

NaH2P04 0,0035 g

KCl 0,0232 g

Acido lático (60%) 310 L

Hepes Sigma/H-4034 0,238 g

NaHCO3 0,21 g

Phenol red 0,0001 g

CaCl2.2H2O --

MgCl2.6H20 0,008 g

Piruvato 0,011 g

Antibióticos estoque 100 L pH: 7,3. Filtrar e estocar na geladeira por duas semanas. mOsm. 285

19) Solução SOF (10X) Volume H2O 10,0 mL

NaCl 0,628 g

KCl 0,0532 g

NaHCO3 0,22 g

KH2PO4 Sigma/P-5655 0,0162 g

MgSO4 Sigma/M-2643 0,009 g

CaCl2.2H2O ---

Acido láctico (60%) 62 L

Fenol 0,001 g

Antibióticos 100 L Filtrar/estocar na geladeira (validade duas semanas)

20) Solução CR2 (10X)

Volume H2O 25,0 mL

NaCl 1,58 g

KCl 0,056 g

NaHCO3 0,55 g

Antibióticos 250 L Filtrar/estocar na geladeira (validade duas semanas)

21) Solução final CR2

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Volume H2O 4,0 mL CR2 10X 500 L

Hemi cálcio–lactato 50 L

AA 100 L

Piruvato 5 L

MEM (100X) 50 L

BEM (50X) 100 L

SFB (5%) 250 L

BSA 0,005 g Validade uma semana

II) MEIOS DE ROTINA (MIV, FIV e CIV)

22) Meio de manipulação de ovócitos (H)

Volume TCM-199/Hepes Sigma/12350-039 49,0 mL

Piruvato 50 L

Antibióticos 50 L

Soro (2% SFB) 1,0 mL Para uso diário

23) MIV final (B) Volume

TCM-199 Gibco/11150-067 2,7 mL 4,5 mL

FSH (0,5 μg/mL) 30 L 50 L

LH (5,0 μg/mL) 30 L 50 L

Piruvato 3 L 5 L

Antibióticos 3 L 5 L

Soro (10% SFB) 300 L 500 L

Estradiol-17 Opcional 3 L 5 L Estabilizar na estufa por 3 h antes de adicionar os ovócitos na gota (Gotas de 100 L 25 ovócitos).

24) FIV final Volume

TALP-Fec 4,5 mL

Heparina 15 L

PHE 200 L

BSA (Sigma/A-6003) 0,03 g Estabilizar na estufa por 3 h antes de adicionar os ovócitos na gota (Gotas de 100 L 25 ovócitos).

25) CIV Final (SOF) Volume

H20 7,3 mL

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SOF estoque (10X) 1 mL

Myo-inositol 100 L

MEM (100X) Gibco/11140-050 100 L

BME (50X) Gibco/11130-051 200 L

AA (opcional) 200 L

Sodium tri citrate 10 L

Piruvato 10 L

CaCl2.2H2O 82 L

SFB (10%) 1 mL

BSA (opcional) Sigma/A-6003 -- Corrigir o pH: 7,2. (Validade uma semana)

III) Preparação do Gradiente de percoll

26) TALP-sp Volume H2O 4,5 mL

TALP – sp (10X) 500 L

CaCl2.2H2O 50 L

BSA Sigma/A9647 0,03 g

27) Preparação do percoll 90%

Volume Percoll comercial Amersham B./17-0891-01 1,5 mL

TALP – sp (10X) 167 L

28) Preparação do percoll 45%

Volume Percoll 90% (nº 27) 500 L

TALP – sp (nº 26) 500 L

29) Preparação do gradiente de percoll

Volume Percoll 45% (nº 28) 1,0 mL

Percoll 90% (nº 27) 1,0 mL Colocar o percoll 45% em um tubo e, em seguida adicionar no fundo tubo o percoll 90% - Estabilizar por uma hora.

30) Preparação do sêmen pela técnica do percoll

- Descongelar o sêmen 37ºC por 30 segundos;

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- Adicionar lentamente o sêmen na parte superior do gradiente;

- Centrifugar a 650 G por 10-12 minutos;

- Retirar o sobrenadante com cuidado e adicionar 4 mL de TALP-sp (nº 26)

sobre o pellet;

- Centrifugar novamente a 150 G por 1-2 minutos;

- Retirar o sobrenadante, fazer a concentração e a fecundação.

31) Cálculo para concentração de espermatozóides (spz) - Prepara um micro tubo com 190 L de água;

- Retira-se uma amostra de 10 L Spz para concentração;

- Homogeneizar bem;

- Fazer a contagem de Spz na câmara de Neubauer;

- Contar 5 quadrante de cada lado da câmara;

- Somar o nº de Spz contados nos dois lados da câmara e fazer à média;

- Fazer os cálculos - CI . VI = CF . VF;

- CI = concentração inicial – nº de Spz contado na câmara (média ex. ~46);

- VI = volume inicial –?;

- CF = concentração/final Spz/mL utilizado na fecundação (2,0 .106 Spz/mL);

- VF = volume final – volume da gota de FIV (Ex. Gota de 100 L);

- Fazer os cálculos para saber o volume há ser utilizado na FIV;

- Exemplo. VI = CF . VF VI = 2,0 .106 . 100

CI ~46.106

- VI = ~4,3 L Volume de Spz utilizado para inseminação dos ovócitos.

IV) Meios para coloração

34) Solução de PBS pH - 7.4 – filtrar/estocar na geladeira (validade dois messes) volume

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H2O (q.s.p.) 500 mL

NaCl 4.0 g

Na2HPO4 7H2O Nuclear/3168 (Obs: Na2HPO4 = 0,575g) 1,08 g

D-glicose Sigma/G-7021 0.5 g

KCl 0.1 g

KH2PO4 0.1 g

MgCl2 6H2O 0.05 g

Piruvato de sódio 0.018 g

Estreptomicina 0.025 g

Penicilina 0.029 g

Vermelho fenol 0.002 g

CaCl2.2H2O 0.066 g

40) Recomendações gerais

- Usar produtos de marcas de confiança (Sigma e Gibco etc.);

- Usar Substâncias “embryo tested” preferencialmente;

- Usar água testada para PIV de embriões;

- Filtrar sempre;

- Deixar os meios de MIV, FIV e CIV estabilizando em overnight;

- Reduzir um pouco incidência de luz na sala de trabalho;

- As manipulações devem ser as mais rápidas possíveis;

- Se possível não usar material de vidro ou plástico reciclado;

- Cuidado com oscilações de temperatura durante os procedimentos, se necessário

usar placa aquecedora;

- Atenção com o pH dos meios – pH entre 7,2 e 7,4;

- Ajustar a osmolaridade – mOsm entre 280 – 290.

Para corrigir o pH usar 1M HCl ou 1M NaOH

Para corrigir a osmolaridade usar NaCl ( mOsm) ou H2O ( mOsm)

Créditos: Prof. Dr. Paulo Roberto Adona