UNIVERSIDADE ESTADUAL DE PONTA GROSSA SETOR DE CINCIAS AGRRIAS E DE TECNOLOGIA DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA DE ALIMENTOS

SEME YOUSSEF REDA

ESTUDO COMPARATIVO DE LEOS VEGETAIS SUBMETIDOS A ESTRESSE TRMICO

PONTA GROSSA 2004

SEME YOUSSEF REDA

ESTUDO COMPARATIVO DE LEOS VEGETAIS SUBMETIDOS A ESTRESSE TRMICO

Dissertao apresentada para a obteno do ttulo de mestre na Universidade Estadual de Ponta Grossa, rea de Avaliao Tecnolgica de Matrias-Primas. Orientador: Prof. Dr. Paulo Irajara Borba Carneiro. Co-orientador: Prof. Dr. Egon Schnitzel.

PONTA GROSSA 2004

AGRADECIMENTOS

A Deus que me dotou de razo, inteligncia e vontade, caracteres peculiares de sua natureza imortal! A Prof Dr disponibilidade. A Dr Ivnia Teresinha Albrecht Schuquel (UEM), pelos registros dos espectros de RMN de C13 e H1. A Prof Elenise Sauer Leal (CEFET), pelo registro dos cromatogramas gasosos. Ao Prof. Dr. Jos Caetano Zurita de Silva (UEPG), pelos registros dos espectros de XRD. A Denise Maria de Souza Mendes (Laboratrio de fsico-qumica), pela sua colaborao e disponibilidade. A Ana e Elias por suas presenas sempre animadoras em todos os momentos. A todos os professores do curso de ps-graduao que direta ou indiretamente contriburam para a concluso deste trabalho. Roseli Aparecida Ferrari (UEPG), pelas sugestes e

AGRADECIMENTOS ESPECIAIS

A Deus Senhor dos senhores. Ao Prof. Dr. Paulo Borba pela contribuio com seus conhecimentos e sugestes na orientao desta dissertao.

Ao Prof. Gilvan Wosiacki pela pacincia e disponibilidade em todos os momentos.

A Empresa Cargill do Brasil pela disponibilidade em fornecer os leos para a realizao desse trabalho.

Dedico esse trabalho aos meus filhos Joo Victor e Nathlia que muitas muitas vezes me fizeram companhia nas horas solitrias em frente ao computador.

A dissertao uma descrio da realidade.(Gilvan Wosiacki)

LISTA DE ESQUEMAS

Esquema 1

- Alteraes oxidativas de leos vegetais insaturados em alimentos..................................................................................... 12 - Mecanismo de formao de radicais livres................................. 13 - Mecanismo de formao de um monmero cclico.................... 15 - Produtos da termo-oxidao o cido linolico............................ 17 - Formao de epoxialcenais durante a peroxidao lipdica e reao com aminos para produzir derivados pirrlicos.............. 31 - Mecanismo de halogenao de dienos: 1,2 e 1,4...................... 37 - Termo-oxidao e isomerizao do cido linolico.................... 92 - Deslocalizao eletrnica e a estabilizao dos radicais fenoxil pelos antioxidantes fenlicos...................................................... 21 - Reao de oxidao do colesterol por radicais livres, na presena de cobre (Cu)............................................................. 28 - Clculo da rea de um prton..................................................... 40 - Clculo de prtons olefnicos...................................................... 40 - Clculo do total de prtons......................................................... 41 - Clculo do peso molecular mdio dos triacilgliceris (PM)......... 41 - Clculo do ndice de iodo (I.I.) por RMN H1................................ 41 - Clculo do ndice de iodo (AOCS).............................................. 61 - Clculo da acidez........................................................................ 62 - Clculo do ndice de perxidos................................................... 63 - Clculo da relao Ro,a............................................................... 102

Esquema 2 Esquema 3 Esquema 4 Esquema 5

Esquema 6 Esquema 7 Reao I

Reao II

Equao I Equao II Equao III Equao IV Equao V Equao VI Equao VII Equao VIII Equao IX

LISTA DE ILUSTRAES Figura 1 - Estrutura geral do triacilglicerol....................................................... 4 Figura 2 - Estrutura geral de uma flavonide e do -tocoferol........................ 21 Figura 3 - Estrutura geral da Capsaicina......................................................... 23 Figura 4 - Estrutura molecular do curcuminide............................................. 24 Figura 5 - Estrutura molecular do BHT, cido ctrico e BHA........................... 24 Figura 6 - Estrutura molecular do propil galato e do TBHQ............................ 25 Figura 7 - Espectro RMN genrico de um leo vegetal.................................. 38 Figura 8 - Caracterstica geral do programa PROTEUS................................. 42 Figura 9 - Estruturas tridimensionais da triolena............................................ 50 Figura 10 - Espectro genrico de carbono 13 de leo vegetal......................... 51 Figura 11 - Curva TG/DTA e TG/DSC do cido ftico....................................... 69 Figura 12 - Curva TG/DSC do cido ctrico....................................................... 70 Figura 13 - Curva TG/DSC do BHA.................................................................. 71 Figura 14 - Curva TG/DSC do BHT................................................................... 72 Figura 15 - Curva TG/DSC do eritorbato de sdio............................................ 73 Figura 16 - Curva TG/DSC do propil galato...................................................... 74 Figura 17 - Curva TG/DSC do cido srbico..................................................... 74 Figura 18 - Curva TG/DSC do cido ascrbico................................................. 75 Figura 19 - Curva TG/DSC da SAIB.................................................................. 76 Figura 20 - Espectro de infravermelho do leo de canola em diferentes tempos de aquecimento.................................................................. 78 Figura 21 - Espectro de infravermelho do leo de milho em diferentes tempos de aquecimento.................................................................. 78 Figura 22 - Espectro de infravermelho do azeite de oliva em diferentes tempos de aquecimento.................................................................. 79 Figura 23 - Espectro de infravermelho do leo de soja em diferentes tempos de aquecimento.............................................................................. 79

Figura 24 - Espectro de infravermelho do leo de canola em diferentes tempos de aquecimento.................................................................. 80 Figura 25 - Espectro de infravermelho do leo de milho em diferentes tempos de aquecimento.................................................. 81 Figura 26 - Espectro de infravermelho do azeite de oliva em diferentes tempos de aquecimento.................................................................. 81 Figura 27 - Espectro de infravermelho do leo de girassol em diferentes tempos de aquecimento.................................................................. 82 Figura 28 - Espectro de infravermelho do leo de soja em diferentes tempos de aquecimento.............................................................................. 82 Figura 29 - Fotografia do leo de girassol polimerizado................................... 83 Figura 30 - Espectro por difrao de raios-x do polmero do leo de girassol.. 84 Figura 31 - Espectro UV do leo de canola...................................................... 86 Figura 32 - Espectro UV do leo de milho........................................................ 86 Figura 33 - Espectro UV do azeite de oliva....................................................... 87 Figura 34 - Espectro UV do leo de soja.......................................................... 87 Figura 35 - Espectro UV do leo de canola...................................................... 88 Figura 36 - Espectro UV do leo de milho........................................................ 89 Figura 37 - Espectro UV do azeite de oliva....................................................... 89 Figura 38 - Espectro UV do leo de girassol..................................................... 90 Figura 39 - Espectro UV do leo de soja.......................................................... 90 Figura 40 - Regresso linear entre os mtodos: Wijs e RMN H1 para o ndice de iodo............................................................................................ 99 Figura 41 - Grfico de comparao do ndice de iodo entre os mtodos de Wijs e RMN H1................................................................................ 99 Figura 42 - Espectro integrado RMN H1 do leo de canola sem aquecimento e com 8 horas de auqecimento....................................................... 107 Espectro de RMN de C13 do azeite de oliva desacoplado in Figura 43 - natura no modo DEPT e in natura com 80 horas de aquecimento................................................................................... 111

LISTA DE SIGLAS

A API AVC BHA BHT CAP CG CGMS CLAE DAC DFG DG DNA DSC DTA FTIR HDL LDL PG RMN SAIB SBA

- Comprimento de onda medido em nanmetros - Absorbncia - American Petroleum Institute - Acidente Vacular Cerebral - Butilhidroxi Anisol - Tercbutil-hidrotolueno - Capsaicina - Cromatografia Gasosa - Cromatografia Gasosa Espectrometria de Massa - Cromatografia em Camada Lquida de Alta Eficincia - Doena da Artria Coronria - German Society for Fat Research - Dodecil Galato - cido Desoxi Ribonuclico - Calorimetria Exploratria Diferencial - Anlise Trmica Diferencial - Infravermelho com Transformada de Fourier - Lipoprotena de Alta Densidade - Lipoprotena de Baixa Densidade - Propil Galato - Ressonncia Magntica Nuclear - Acetato Isobutirato de Sacarose - cido Srbico

TBHT TG TOS UV VLDL XRD

- Terc-butilhidroquinona - Termo Gravimetria - Sndrome do leo Txico - Ultravioleta - Lipoprotena de Muito Baixa Densidade - Difrao por Raios-X

LISTA DE TABELAS

Tabela 1

- Composio em cidos graxos dos leos de girassol (Helianthus annus) e de canola (Brassica campestris)....................................... 7 - Teor de gordura saturada e insaturada............................................ 8 - Nomenclatura e propriedades fsicas de alguns cidos graxos....... 8 - Perfil de cidos graxos identificados como steres metlicos dos triacilgliceris do leo de Canola...................................................... 64 - Perfil de cidos graxos identificados como steres metlicos dos triacilgliceris do leo de Girassol (Hellianthus annuus).................. 65 - Perfil de cidos graxos identificados como steres metlicos dos triacilgliceris do leo de Milho (Zea mays)..................................... 65 - Perfil de cidos graxos identificados como steres metlicos dos triacilgliceris do leo de Soja (Glycine max)................................. 66 - Perfil de cidos graxos identificados como steres metlicos dos triacilgliceris do azeite de oliva (Olea europea).............................. 66 - Anlise fsico-qumica do leo de Canola........................................ 95

Tabela 2 Tabela 3 Tabela 4

Tabela 5

Tabela 6

Tabela 7

Tabela 8

Tabela 9

Tabela 10 - Anlise fsico-qumica do leo de Milho........................................... 95 Tabela 11 - Anlise fsico-qumica do azeite de Oliva......................................... 95 Tabela 12 - Anlise fsico-qumica do leo de Soja............................................ 96 Tabela 13 - Anlise fsico-qumica do leo de Canola........................................ 96 Tabela 14 - Anlise fsico-qumica do leo de Milho........................................... 96 Tabela 15 - Anlise fsico-qumica do azeite de Oliva......................................... 97 Tabela 16 - Anlise fsico-qumica do leo de Girassol...................................... 97 Tabela 17 - Anlise fsico-qumica do leo de Soja............................................ 97 Tabela 18 - ndice de iodo determinado por RMN de H1 e pelo mtodo de Wijs em amostras de leos vegetais in natura e sob aquecimento......... 98 Tabela 19 - ndice de iodo determinado por RMN de H1 em amostras vegetais aquecidos em diversos tempos de aquecimento............................. 100

Tabela 20 - Perfil de hidrognios dos triacilgliceris, obtido da curva de 104 integrao do espectro de RMN de H1 do leo de canola............... Tabela 21 - RMN de H1 dos leos vegetais na segunda fase de aquecimento.. 104 Tabela 22 - RMN de H1 de leos vegetais na primeira fase de aquecimento..... 105 Tabela 23 - Deslocamentos qumicos de C13 do leo de leos vegetais sob diferentes tempos de aquecimento.................................................. 109 Tabela 24 - Deslocamentos qumicos de C13 do leo de canola sob diferentes tempos de aquecimento................................................................... 110

RESUMO

Neste trabalho foram estudados os seguintes leos vegetais: canola, milho, oliva, girassol e soja; in natura e sob estresse trmico: 28 horas (4h/dia) e 80 horas (8h/dia) a 180 200C. A qualidade dos leos foi monitorada por tcnicas analticas (determinao dos ndices de acidez, iodo, perxidos e cromatografia gasosa) e espectroscpicas (UVvis, FTIR, RMN de H1 e C13). Tambm foi avaliada a estabilidade trmica dos seguintes antioxidantes: propil galato (PG), acetato isobutirato de sacarose (SAIB), terc-butilhidroxitolueno (BHT), cido ctrico, butil-hidroxianisol (BHA), cido ftico, cido ascrbico, eritorbato de sdio e cido srbico (SBA), por anlise trmica. Os resultados indicaram que os antioxidantes mais termo-resistentes foram o propil galato (PG) e a acetato isobutirato de sacarose (SAIB); a cromatografia gasosa til na determinao do perfil de cidos graxos do triacilglicerol dos leos in natura; os ndices de acidez e perxidos aumentam com a progressiva deteriorao trmica dos leos. A espectroscopia de UV-vis e FTIR so ferramentas importantes na anlise dos leos in natura e sob estresse trmico, pois revelam as alteraes envolvidas. A RMN H1 mostrou-se assencial no controle de qualidade de leos, pois permite determinar o ndice de iodo, o peso molecular (PM) mdio do triacilglicerol, o grau de insaturao e o estado de oxidao do leo in natura e sob qualquer tempo de aquecimento. Igualmente a RMN de C13 mostrou-se muito til no controle de qualidade, pois mostra variaes significativas no perfil dos C13 dos leos in natura e sob estresse trmico. As anlises espectroscpicas revelaram que sob estresse trmico, os leos vegetais mais estveis com aquecimento de 4 horas/dia, por 7 dias foram os leos de soja, milho, canola e oliva. E com aquecimento de 8 horas/dia, por 10 dias, foram os leos de canola, milho, oliva, soja e girassol. Os resultados mostram que as tcnicas espectroscpicas - rpidas, sensveis e precisas so ferramentas imprescindveis no controle de qualidade dos leos vegetais.

Palavraschave: leos vegetais, estresse trmico, oxidao trmica, anlises espectroscpicas

ABSTRACT

In this work the following vegetal oils had been studied: canola, maize, olive, sunflower and soybean; in natura and under stress thermal:28 hours (4h/day) and 80 hours (8h/day) the 180 - 200C. The quality of oils was monitored by analytical techniques (determination of the acid, iodine, peroxides values and gaseous chromatography) and spectroscopic technique (UV-vile, FTIR, RMN H1 and C13). Also the thermal stability of following antirust substances was evaluated: propil galato (PG), sucrose acetate isobutirato (SAI), butil-hidroxitolueno (BHT), citric acid, butil-hidroxianisol (BHA), fitic acid, ascorbic acid, sodium eritorbat and sorbic acid (SBA), for thermal analysis. Our results had indicated that the antirust substances thermal resistant had been the propil galato (PG) and sucrose acetate isobutirato (SAI); the gaseous chromatography is useful in the determination of the profile of triacylglycerol of oils in natura; the acid values and peroxides increase with the progressive thermal deterioration of oils. The FTIR and spectroscopy UV-vile are useful in the analysis of oils in natura and under it stress thermal, therefore they disclose the alterations involved. The results of RMN H1 are extremely useful in the quality control of oils, therefore it allows to determine the iodine index, the molecular weight (PM) average of triacilglicerol, the degree of insaturao and the degree of oxidation of the oil in natura and under any warm up time. Equally the RMN of C13 reveals useful in the quality control, therefore natura shows to significant variations in the profile of the C13 of oils in and under it stress thermal. The spectroscopic analyses had shown that under it stress thermal, the vegetal oils that better resist the heating (lesser deterioration) had been: canola, soybean, maize, olive and sunflower. Our results show that the spectroscopic techniques - fast, sensible and necessary - are powerful tools in the quality control of vegetal oils. Keywords: vegetal oils, stress thermal, thermal oxidization, spectroscopic analyses

SUMRIO 1 22.1 2.1.1 2.1.2 2.1.3 2.1.4 2.1.5 2.2 2.3

INTRODUO................................................................................. 1 REVISO DA LITERATURA........................................................ 4LEO E GORDURAS........................................................................... Composio dos leos e gorduras....................................................... Comportamento dos leos vegetais sob estresse trmico................... Antioxidantes........................................................................................ Fisiopatologia dos leos termo-oxidados............................................. Controle de qualidade dos leos vegetais............................................ OBJETIVO GERAL............................................................................... OBJETIVOS ESPECFICOS................................................................ 4 6 9 19 26 33 55 55

33.1 3.2 3.2.1 3.2.2 3.2.3 3.2.4 3.2.5 3.2.6 3.2.7 3.2.7.1 3.2.7.2 3.2.7.3 3.2.8

MATERIAL E MTODOS.............................................................. 56MATERIAL............................................................................................ MTODOS............................................................................................ Cromatografia gasosa.......................................................................... Anlise trmica..................................................................................... Anlise por espectroscopia de infravermelho....................................... Anlise por espectroscopia de ultravioleta........................................... Anlise por difrao de raios X (XRD).................................................. Ressonncia magntica nuclear de hidrognio-1 e carbono-13.......... Caracterizao fsico-qumica dos leos vegetais................................ Determinao do ndice de iodo.......................................................... Determinao da Acidez....................................................................... Determinao do ndice de Perxido.................................................... Estresse trmico dos leos vegetais.................................................... 56 58 58 59 60 60 60 60 61 61 62 62 63

44.1 4.2 4.3 4.4 4.5 4.6 4.6.1 4.6.2

RESULTADOS E DISCUSSO........................................... 64ANLISE CROMATOGRFICA........................................................... ANLISE TRMICA............................................................................. ANLISE ESPECTROSCPICA DE INFRAVERMELHO.................... ANLISE POR DIFRAO DE RAIOS X............................................. ANLISE ESPECTROSCPICA POR ULTRAVIOLETA-VISVEL...... ANLISE FSICO-QUIMICA DOS LEOS VEGETAIS........................ ndice de Acidez e Perxido................................................................. ndice de Iodo (RMN e Wijs)................................................................. 64 68 77 83 85 93 93 98

5

CONCLUSES..................................................................... 112

REFERNCIAS.............................................................................................. 114 ANEXO A: Publicaes................................................................................. 128

1

1 INTRODUO

Os leos vegetais representam um dos principais produtos extrados de plantas da atualidade (FARIA; LELES; IONASHIRO, et al., 2002) e cerca de dois teros so usados em produtos alimentcios fazendo parte da dieta humana (MALAYSIAN..., 2002). Os lipdeos, juntamente com as protenas e os carboidratos, so fontes de energia, apresentando grande importncia para a indstria, na produo de cidos graxos, glicerina, lubrificantes, carburantes, biodiesel, alm de inmeras outras aplicaes (COSTA NETO, 1993; FERRARI; OLIVEIRA; SCABIO, 2003). Os leos vegetais so constitudos principalmente de triacilgliceris (> 95 %) e pequenas quantidades de mono e diacilgliceris (LEHNINGER, 1995). A obteno do leo vegetal bruto, feita por meio de mtodos fsicos e qumicos sobre as sementes de oleaginosas usando-se um solvente como extrator e prensagem (GONALVES; BATISTA; MEIRELLES, 2002; MORETTO; FETT, 1998; MORETTO; FETT; GONZAGA, et al., 2002). Nesta fase, o leo vegetal contm impurezas como cidos graxos livres, prejudiciais qualidade e estabilidade do produto, sendo necessrio remover estas impurezas, pelos processos de refino que envolve a remoo do solvente, a degomagem, o branqueamento, a desacidificao e a desodorizao (BATISTA; MONNERAT; KATO, et al., 1999). O uso cotidiano dos leos vegetais, consagrados entre a populao, levou a necessidade de se avaliar melhor o seu grau de resistncia, principalmente a sua estabilidade ao armazenamento e estresse trmico. Questes como a que temperatura os leos comestveis se decompem e que produtos so formados quando submetidos ao aquecimento devem ser investigadas.

Na populao em geral, um procedimento comum o consumo de leos e gorduras, mesmo aps terem sido submetidos a altas temperaturas em processos de fritura. Na fritura, observa-se um processo simultneo de transferncia de calor e massa. O calor transferido do leo para o alimento; a gua que evapora do alimento absorvida pelo leo. Assim, os fatores que afetam a transferncia de calor e massa, afetam as propriedades trmicas e fsico-qumicas do leo e do alimento (MONGHARBEL, 2002). O processo de fritura realizado em recipientes abertos, temperatura elevada (180 200C), em contato direto com o ar . Estas condies provocam modificaes fsico-qumicas nos leos (termo-oxidao, rancificao), algumas das quais so visveis como o escurecimento, aumento da viscosidade, formao de espuma e fumaa. Essas transformaes afetam as caractersticas sensoriais do leo em uso e influenciam na aceitabilidade do produto frito, alm de produzirem efeitos txicos como irritao grastrointestinal, inibio de enzimas, destruio de vitaminas e carcinognese, quando da ingesto contnua e prolongada de produtos rancificados (FRITSCH, 1981; DOBARGANES; PEREZ-CAMINO, 1988; STEVENSON; VAISEY-GENSER; ESKIN, 1984). O uso de leos vegetais in natura na culinria vem aumentando entre a populao, que busca nos tempos atuais, hbitos alimentares mais saudveis como o consumo de leos comestveis ricos em triacilgliceris insaturados. Os leos e gorduras constituem os principais componentes dos alimentos insolveis em gua, possuindo poucos stios reativos na molcula, de modo que a ocorrncia de reaes (rancificao) durante o processamento e armazenamento do alimento menos variada que as de compostos solveis em gua como carboidratos e protenas (ARAJO, 1999).

As reaes de rancificao podem ser resumidas como reaes de autooxidao, envolvendo a formao de radicais livres, responsveis pela deteriorao dos leos e gorduras. Em resposta a isso, surgiu uma srie de antioxidantes de diversos tipos com o propsito de prolongar a vida til dos leos vegetais durante o seu armazenamento e prevenir as reaes de rancificao. Com isso, fornecem ao consumidor um alimento seguro e agradvel ao paladar (SHAHIDI;

WANASUNDARA, 1992). Portanto, faz-se necessrio realizar estudos sobre a estabilidade de leos submetidos a estresse trmico prolongado, pois leos de frituras reutilizados deterioram a qualidade dos alimentos e so potencialmente nocivos sade do consumidor.

2 REVISO DA LITERATURA

2.1 LEOS E GORDURAS Os leos e gorduras so substncias insolveis em gua (hidrofbicas), de origem animal ou vegetal, formados predominantemente por steres de

triacilgliceris, produtos resultantes da esterificao entre o glicerol e cidos graxos (MORETTO; FETT, 1998). Os triacilgliceris (Figura 1) so compostos insolveis em gua e a temperatura ambiente, possuem uma consistncia de lquido para slido. Quando esto sob forma slida so chamados de gorduras e quando esto sob forma lquida so chamados de leos (GIESE, 1996; FARIA; LELES ; IONASHIRO, et al., 2002). Alm de triacilgliceris, os leos contm vrios componentes em menor proporo, como mono e diglicerdeos (importantes como emulsionantes); cidos graxos livres; tocoferol (importante antioxidante); protenas, esteris e vitaminas (FARIA; LELES; IONASHIRO, et al, 2002; HIDALGO; ALAIZ; ZAMORA, 2001).

O O R1n n

O O R2

O O

R3

Figura 1 - Estrutura geral de um triacilglicerol [R1, R2, R3 = grupo alquil saturado ou insaturado; podendo ser igual ou diferente].

Segundo Fennema (2000), os leos oriundos de frutos, como o azeite de oliva, so denominados azeites. Denominao que ser empregada neste trabalho. Os leos vegetais, possuem de uma a quatro insaturaes (ligaes duplas) na cadeia carbnica, sendo lquidos temperatura ambiente; as gorduras so slidas temperatura ambiente, devido a sua constituio em cidos graxos saturados (MORETTO; FETT; GONZAGA, et al., 2002). Assim, gorduras animais como a banha, o sebo comestvel e a manteiga, so constitudas por misturas de triacilgliceris, que contm um nmero de saturaes maior do que o de insaturaes, conferindo-lhes maior ponto de fuso (slidos temperatura ambiente) (FENNEMA, 2000). De maneira anloga, os leos por possurem um nmero maior de insaturaes, expressam menor ponto de fuso (lquidos temperatura ambiente) (GIESE, 1996 FARIA; LELES ; IONASHIRO, et al., 2002). A maioria dos cidos graxos de leos comestveis possuem uma cadeia carbnica de 16 a 18 carbonos, embora o leo de cco contenha um alto grau de cido lurico com 12 tomos de carbono na sua constituio (ZALIHA; CHONG; CHEOW, et al., 2003).

2.1.1 Composio dos leos e gorduras

Os leos e gorduras apresentam como componentes, substncias que podem ser reunidas em duas grandes categorias: a) glicerdeos e b) no-glicerdeos. a) glicerdeos: so definidos como produtos da esterificao de uma molcula de glicerol com at trs molculas de cidos graxos. Os cidos graxos so cidos carboxlicos de cadeia longa, livres ou esterificados, constituindo os leos e gorduras (MORETTO; FETT; GONZAGA, et al., 2002). Quando saturados possuem apenas ligaes simples entre os carbonos e possuem pouca reatividade qumica. J os cidos graxos insaturados, contm uma ou mais ligaes duplas no seu esqueleto carbnico; so mais reativos e mais suscetveis a termoxidao (GIESE, 1996). Na Tabela 1, so apresentados os cidos graxos presentes nos leos de girassol e canola; na Tabela 2, o teor de gordura saturada e insaturada e o teor em cidos graxos em alguns leos vegetais estudados neste trabalho e na Tabela 3, a nomenclatura e propriedades fsicas de alguns cidos graxos. b) no-glicerdeos: em todos os leos e gorduras, encontramos pequenas quantidades de componentes no-glicerdeos (MORETTO; FETT, 1998). Os leos vegetais brutos possuem menos de 5% e os leos refinados menos de 2%. No refino, alguns desses componentes so removidos completamente, outros parcialmente. Aqueles que ainda permanecem no leo refinado, ainda que em traos, podem afetar as caractersticas dos leos devido a alguma propriedade peculiar, como apresentar ao pr ou antioxidante, ser fortemente odorfero, ter sabor acentuado ou ser altamente colorido (MORETTO; FETT; GONZAGA, et al., 2002). Alguns exemplos de grupos no-glicerdeos so os

fosfatdeos (lecitinas, cefalinas, fosfatidil inositol); esteris (estigmasterol); ceras (palmitato de cetila); hidrocarbonetos insolveis (esqualeno); carotenides; clorofila; tocoferis (vitamina E); lactonas e metilcetonas (FARIA; LELES ; IONASHIRO, et al., 2002).

Tabela 1 - Composio em cidos graxos dos leos de girassol (Helianthus annus) e de canola (Brassica campestris).

cidos Graxos (%) 12:0 14:0 16:0 16:1 18:0 18:1 18:2 18:3 20:0 20:1 20:2 22:0 24:0 24:1FONTE: FIRESTONE, 1999.

leo de girassol (Helianthus annuus) 0,0 0,1 0,0 0,2 5,0 8,0 0,0 0,3 2,5 7,0 13 40 48 74 0,0 0,3 0,2 0,5 0,0 0,5 0,5 1,3 0,0 0,4

leo de canola (Brassica campestris) 0,1 0,2 1,5 6,0 0,0 3,0 0,5 3,1 8,0 60 11 23 5,0 13 0,0 3,0 3,0 15 0,0 1,0 0,0 2,0 0,0 2,0 0,0 3,0

Tabela 2 - Teor de cidos graxos em leos vegetais.

leos CANOLA GIRASSOL MILHO OLIVA SOJA

cido graxo saturado 6% 11% 13% 14% 15%

cido graxo monoinsaturado 58% 2% 25% 77% 24%

cido graxo poliinsaturado ac. ac. linolico Linolnico 26% 69% 61% 8% 54% 10% 1% < 1% 7%

FONTE: MORETTO; FETT, 1998; Modificado.

Tabela 3 - Nomenclatura e propriedades fsicas de alguns cidos graxos

cido Butrico (butanico) Caprico (hexanico) Caprlico (octanico) Cprico (decanico) Lurico (dodecanico) Mirstico (tetradecanico) Palmtico (hexadecanico) Esterrico (octadecanico) Araqudico (eicosanico) Behnico (docosanico) Lignocrico (tetracosanico) Olico (9(Z)-octadecenico), (-9) Linolico (9(Z),12(Z)-octadecadienico, (-6) Linolnico (9(Z),12(Z),15(Z) - octadecatrienico, (-3)FONTE: UIEARA, 2004

Smbolo 4:0 6:0 8:0 10:0 12:0 14:0 16:0 18:0 20:0 22:0 24:0 18:19 18:26 18:33

Ponto de fuso (oC) - 4,2 - 3,4 16,7 31,6 44,2 54,4 62,9 69,6 75,4 80,0 84,2 16-17 5,0 11,0

2.1.2 Comportamento dos leos vegetais sob estresse trmico

Sabe-se que alimentos contendo leos e gorduras deterioram durante o armazenamento em atmosfera de oxignio, devido auto-oxidao. Mas quando eles so aquecidos a altas ocorrendo reaes de temperaturas, o processo da oxidao acelerado, oxipolimerizao e decomposio termo-oxidativa

(KOVALSKI, 1990; DOBARGANES; REZ-CAMINO; MRQUEZ-RUIZ, 1989). Isto tambm pode ser observado durante as fases de refino dos leos vegetais (GOMES; CAPONIO; DELCURATOLO, 2000). Segundo Helln e Pilar Rueda (1984), as modificaes e alteraes dos leos e gorduras, podem ser classificadas como: a) auto-oxidao: oxidao que ocorre a temperaturas abaixo de 100C; b) polimerizao trmica: oxidao que ocorre a temperaturas que variam entre 200 e 300C, na ausncia de oxignio; c) oxidao trmica: oxidao que ocorre na presena de oxignio a altas temperaturas (oxipolimerizao); d) modificaes fsicas: modificaes que ocorrem nas propriedades fsicas; e) modificaes nutricionais: modificaes nos aspectos fisiolgicos e nutricionais dos leos; f) modificaes qumicas, que podem ser de trs tipos (ARAJO, 1999): hidrlise dos triacilgliceris: resulta na liberao de cidos graxos, glicerina, mono e diglicerdeos; oxidao: ocorre nos cidos graxos com ligaes duplas; polimerizao: extensa condensao de monmeros de cidos graxos polinsaturados a altas temperaturas por perodos prolongados.

H alguns anos, aumentou o interesse sobre os efeitos fisiolgicos que os leos e gorduras aquecidos a elevadas temperaturas, principalmente na presena de ar, exercem sobre o organismo humano (PREZ-CAMINO; MRQUEZRUIZ; SALGADO RAPOSO, et al., 1998). No processo de fritura, o alimento submerso em leo quente, que age como meio de transferncia de calor (HELLN; PILAR RUEDA, 1984). Deve-se ainda considerar que parte do leo utilizado para a transferncia de calor absorvido pelo alimento e torna-se parte da dieta, exigindose leos de boa qualidade no preparo dos alimentos e que permaneam estveis por longos perodos de tempo (VARELA; MAREIRAS-VARELA; RUIZ-ROSO, 1983). Durante o aquecimento do leo no processo de fritura, uma complexa srie de reaes produz numerosos compostos de degradao. Com o decorrer das reaes, as qualidades funcionais, sensoriais e nutricionais se modificam (FARIA; LELES; IONASHIRO, et al., 2002). Quando o alimento submerso no leo quente em presena de ar, o leo exposto a trs agentes que causam mudanas em sua estrutura: gua, proveniente do prprio alimento, que leva a alteraes hidrolticas; oxignio que entra em contato com o leo e a partir de sua superfcie leva a alteraes oxidativas e finalmente, a temperatura em que o processo ocorre, resultando em alteraes trmicas, como isomerizao e reaes de ciso (aldedos e cetonas), formando diversos produtos de degradao, como epxidos e hidroperxidos (MORETTO; FETT, 1998). Portanto, as formas de deteriorao de leos vegetais so a hidrlise, a oxidao, e a polimerizao (MORETTO; FETT; GONZAGA, et al., 2002). Sendo a oxidao a principal causa de deteriorao, ela provoca alteraes do sabor, textura, aroma e da cor nos alimentos, ocasionando perda do valor nutricional e gerando toxidez (FENNEMA, 2000). Um esquema geral sobre estas alteraes mostrado no Esquema 1.

A estabilidade trmica dos leos depende de sua estrutura qumica: leos com cidos graxos saturados so mais estveis do que os insaturados. Como estes leos so muito utilizados na culinria e na indstria, tem-se exigido de pesquisadores e tcnicos especializados, novos mtodos analticos capazes de avaliar as condies de processamento e estocagem, sendo, portanto, de fundamental importncia o conhecimento da estabilidade trmica dos leos vegetais para um rigoroso controle de qualidade (ARAJO, 1999). Segundo a German Society for Fat Research (DGF), por exemplo, o leo de fritura considerado deteriorado se a acidez estiver acima de 1%. O que est de acordo com o proposto por Lima e Gonalves (1995).

Esquema 1 - Alteraes oxidativas de leos vegetais insaturados em alimentos.

R = grupo alquil

DIMINUIO DO VALOR NUTRITIVO

ALDEDOS,

CIDOS, LCOOIS, EPXIDOS,

POLMEROS,

HIDROCARBONETOS, CIDOS GRAXOS CCLICOS, ETC.

FONTE: ARAJO, 1999; Modificado.

Um dos principais fatores que determinam a estabilidade de uma substncia, a sua estrutura molecular (MINN, 1985). Nos leos vegetais, as insaturaes presentes na cadeia carbnica so um alvo de ataque importante de agentes oxidantes como radicais livres, enzimas, metais que atuam como catalisadores de processos oxidativos e da foto-oxidao (MORETTO; FETT,1998). No Esquema 1, o hidrognio allico do fragmento do acido graxo insaturado presente no triacilglicerol (o hidrognio, do carbono vizinho ao carbono da ligao dupla) removido pelo oxignio singlete [1O2], ativado termicamente (fase de induo) (MINN, 1985). Em seguida o radical alila formado (derivado do fragmento do cido graxo insaturado) reage rapidamente com o oxignio formando o radical alquilperoxil que abstrai hidrognio allico de outro fragmento alquil dando seqncia a reao de propagao da cadeia e formando o derivado alquilhidroperxido. Os perxidos e hidroperxidos so clivados, formando compostos de oxidao secundria como aldedos e cetonas (ADHVARYU; ERHAN; LIU, et al., 2000; ESPN; SOLER-RIVAS; WICHERS, 2000), responsveis pelo odor desagradvel (rano) (KUBOW, 1990), como mostrado no Esquema 2.

Esquema 2 - Mecanismo de formao de radicais livres.

1 passo: iniciao

. . RH R. + H.catalizado r

RH + O 2 catalizado r R + OOH

2 passo: propagao

. + O ROO . ROO . + RH ROOH + R .R2

reao em cadeia alto consumo de oxignio rpido aumento do ndice de perxido

3 passo: trmino

. . ROO. + R. ROOR ROO. + ROO. ROOR + OR + R R -RFONTE: LOURY, 1970.

2

Como a reao de oxidao pode ser definida como o processo de adio de oxignio ou remoo de hidrognio ou eltrons, tal reao pode ser acelerada pelo calor, luz (fotoxidao), ionizao, traos de metais (Cu e Fe), metaloprotenas e pela enzima lipoxigenase. Um dos mecanismos mais importantes o da fotoxidao. um mecanismo independente da formao de radicais livres e da presso de oxignio e depende de sensores como a clorofila e a mioglobina. No apresenta perodo de induo e na presena de luz e oxignio, transferem energia para a formao de perxido. Sua principal contribuio alterao dos leos e gorduras, est na mudana da configurao da insaturao de cis para trans (ARAJO, 1999; SCHUCHARDT; SERCHELI; VARGAS, 1998). Contudo, nos leos e gorduras de origem vegetal os ismeros trans esto praticamente ausentes. Exceto uma pequena quantidade residual que permanece durante a fase de hidrogenao, o que inevitvel. Em alguns produtos como margarinas, porm, foram encontrados valores de cidos-trans excessivamente

elevados (~25%) (BARRERA-ARELLANO; BLOCK, 1993). Durante o refino do leo, possvel que traos de resduos indesejveis como os ismeros trans e monmeros cclicos de cidos graxos estejam presentes (Esquema 3). No refino do leo de colza (rico em cido ercico, [22:1]), na fase de desodorizao so produzidos ismeros trans numa porcentagem superior a 5% do total de cidos graxos do leo e uma quantidade de monmeros cclicos de cidos graxos em torno de 650 mg/kg de leo, quando condies severas so usadas (56h a 250C). O principal responsvel pela formao destes monmeros alta concentrao do cido linolnico e que sob aquecimento prolongado e por um perodo de tempo longo, sofre ciclizao por meio da reao de DielsAlder (LAMBELET; GRANDGIRARD; GRAGOIRE, et al, 2003; SOLOMONS,1996).Esquema 3 - Mecanismo de formao de um monmero cclico do cido linolnico.( )6 HO2 H H H L912 15 17

18

L LH

.12 11

.LH12

.9

.16

14

11

14

10

15 10 15 9

. .

16

O OH

( )718

L-H ( )7 HO218

H-L

L12

.12 11

L

.

14

10 10

15 9 16

H O ( )7 HO917

H

( )7 Me HO218

(CH2)xCO2H (CH2)yCH3

FONTE: MELTZER; FRANKEL; BESSLER, et al., 1981; SOLOMONS, 1996.

Os monmeros cclicos so compostos resultantes da oxidao dos leos vegetais e fazem parte dos resduos no-volteis. Os monmeros mais comuns, provm de cidos graxos com 18 carbonos, poliinsaturados, que ciclizam e sofrem uma dupla substituio no anel (MELTZER; FRANKEL; BESSLER, et al., 1981). A formao de monmeros cclicos mais pronunciada nos aquecimentos

intermitentes dos leos vegetais. Dependendo das condies de aquecimento, a concentrao de monmeros cclicos varia de 736 ppm (0,07%) a 1803 ppm (0,18%) no leo aquecido (ROJO; PERKINS, 1987). Outra preocupao a formao de polmeros. H duas classes de polmeros: os polmeros oxidativos e os polmeros trmicos, formados por degradao trmica, que indicam degradao dos leos vegetais (WALTKING; SEERY; BLEFFERT, 1972). Uma outra alterao sensvel, a rancidez hidroltica muito comum durante o armazenamento de alimentos, onde a frao lipdica presente lentamente hidrolisada pela gua temperatura elevada ou por enzimas lipolticas. Tipicamente, cidos graxos contendo de quatro a dez carbonos, conferem reverso do sabor em alimentos, como sabor de sabo, por exemplo, inerente hidrlise dos azeites de coco e dend em alimentos de confeitaria (ARAJO,1999). Alm disso, hidroperxidos so formados em leos vegetais que possuem alto teor de cidos graxos poliinsaturados, durante a estocagem, na presena de traos de oxignio. Isso resultar tambm numa reverso do sabor do leo pela formao de produtos volteis, resultantes do processo de degradao de hidroperxidos termolbeis em radicais alcoxil (Esquema 4).

Esquema 4 - Produtos da termo-oxidao do cido linolico (18:2

9,12

).

O.COOH

CHO

COOH 2

1

.

+O

COOH

OH

.

.OH

OHCHO 4

OHCHO 3

CHO5

OH

.O

.

OCOOH6 7 8 CHO

Legenda: 1 = 2,4decadienal; 2 = cido octanico; 3 = 2,4-nonadienal; 4 = 3nonenal; 5= heptanal; 6 = 2 heptanona; 7 = cido heptanico; 8 = 2 heptenal. FONTE: KESZLER; KRISKA; NMETH, 2000.

Por exemplo, a formao de hidroperxidos e dienos conjugados, est relacionada baixa na concentrao de -tocoferis (DEIANA; ROSA; CAO, et al., 2002). Logo, a formao de hidroperxidos e dienos conjugados, alvos fceis de ataques por radicais livres, formados sob altas temperaturas, deterioram o leo, tornando-o imprprio para o consumo (BRENES; GARCIA; DOBARGANES, et al., 2002). Dentre os fatores que influenciam as alteraes que surgem nos leos durante a fritura, alguns tm maior influncia: a) o efeito da temperatura: em temperaturas superiores a 200C h decomposio mxima dos leos;

b) aquecimento intermitente: onde a formao de perxidos durante o aquecimento e sua decomposio durante o ciclo de resfriamento, produzem muitos radicais livres e por conseguinte, severa deteriorao dos leos; c) efeito da razo superfcie / volume: quanto maior a superfcie de contato do leo com o ar, maior ser a sua deteriorao; d) efeito da adio de leo fresco: ao se colocar leo fresco sobre o leo de fritura, acelera sua decomposio (HELLN; CLAUSSEL; 1984; VARELA; MAREIRAS-VARELA; RUIZ-ROSO, 1983).

2.1.3 Antioxidantes

Os antioxidantes so substncias que impedem ou minimizam a formao de compostos como perxidos, aldedos, cetonas, dmeros e polmeros, produtos formados por termo-oxidao de leos e gorduras, impedindo a etapa inicial da autooxidao, a formao de radicais livres, removendo-os do meio. Com isso, preservam os alimentos, previnem a reverso do sabor e retardam a deteriorao por rancificao e descolorao (FOOD TECHNOLOGY, 1994; SHAHIDI;

WANASUNDARA, 1992; WAYNER; BURTON; INGOLD, et al 1985). Isto se deve propriedade dos antioxidantes - especialmente os derivados fenlicos de estabilizar o radical livre, por deslocalizao eletrnica no anel aromtico (efeito de ressonncia) e assim impedir a propagao de reaes radicalares oxidativas no meio (ESPN; SOLER-RIVAS; WICHERS, 2000; LITWINIENKO; KASPRZYCKA; JAMENEK, 1999). Dentre os principais antioxidantes fenlicos, encontram-se os tocoferis e os flavonides (Figura 2). Ambos os antioxidantes encontram-se distribudos livremente na natureza. Os tocoferis so antioxidantes monofenlicos que ajudam a estabilizar a maioria dos leos vegetais e so classificados em oito diferentes compostos pertencendo a duas famlias distintas: os tocis e os tocotrienis, tendo como prefixos as letras gregas , , e dependendo do nmero e da posio dos grupos metil ligados ao anel aromtico. So chamados de , , ou tocoferis, sendo que a atividade antioxidante decresce do para o -tocoferol (MELO; GUERRA, 2002). Os flavonides so antioxidantes polifenlicos, ocorrendo em clulas vivas, amplamente na natureza, na forma de glicosdeos, sendo considerados potentes antioxidantes. Constituem-se em aceptores de radicais livres, clivam ligaes

hidroperxidos e quelam metais considerados pr-oxidantes como o Zn, Cu e o Fe (SHAHIDI; WANASUNDARA, 1992). Podem ser extrados das mais variadas fontes como do Citrus paradisi, de onde se extrai a naringina, um flavonide presente na casca deste citro (GIANNUZZO; NAZARENO; MISHIMA, et al., 2000). Num estudo feito por Pereira e Das (1990), avaliou-se a ao antioxidante de vrios derivados flavonides (Figura 2), em que a miricetina foi o flavonide mais eficaz. Em relao ao de destruir radicais livres provenientes da peroxidao lipdica, os flavonides so consagrados os mais eficazes (HANASAKI; OGAWA; FUKUI, 1993; HERTOG; FESKENS; HOLLMAN, et al., 1993). De outro lado, diversos antioxidantes sintticos como o BHA, TBHQ, etc., so utilizados na conservao de leos vegetais estocados (SHAHIDI; WANASUNDARA, 1992). Segundo Bors; Heller; Michel, et al., (1990), o BHT (hidroxitolueno butilado), antioxidante sinttico, tem sua ao antioxidante devido a presena de grupos ativadores no anel aromtico, orto e para substitudos, contribuindo para a melhor deslocalizao de eltrons e estabilizao de radicais livres, formados nos processos oxidativos.

a)

CH3 O

CH3 CH3 CH3

CH3 CH3

HO CH3

b)

3' 2' 8 7 6 5 4 4' 5' 6' 3

O

Figura 2 a) estrutura do -tocoferol; b) estrutura geral de um flavonide;

Antioxidantes como os flavonides e tocoferis, apresentam estrutura complexa (LITWINIENKO; KASPRZYCKA; JAMENEK, 1999) e sua atividade antioxidante depende dos grupos hidroxil presentes em sua estrutura. A presena de grupos alquila (ativadores) na posio para no anel aromtico, favorecem a deslocalizao eletrnica e a estabilizao dos radicais fenoxil formados durante a reao (I):

PhOH + LOO . PhO . + LOOHonde: LOOH e LOO = hidroperxidos de lipdeos e radicais perxidos de lipdeos PhOH e PhO = antioxidante fenlico e radical fenoxil formado

(I)

Isto mostra que a estrutura do antioxidante fundamental para a atividade antioxidante (atividade protetora), minimizando os efeitos txicos da decomposio termo-oxidativa de cidos graxos insaturados (LITWINIENKO; KASPRZYCKAGUTTMAN, 1998).

Diversos aspectos da oxidao lipdica tm sido investigados como meio de se estudar mecanismos cada vez mais avanados de anlise e controle de qualidade dos alimentos (WAYNER; BURTON; INGOLD et al 1985). Assim, segundo Shahidi e Wanasundara (1992), os antioxidantes podem ser agrupados da seguinte maneira: a) eliminadores de radicais livres; b) quelantes de ons metlicos; c) clareadores de oxignio: reagem com o oxignio em sistemas fechados;

Mas de acordo com sua natureza, os antioxidantes podem ser classificados como: a) antioxidantes primrios: reagem com radicais lipdicos altamente energticos, convertendo-os em produtos termodinamicamente mais estveis. Ex.: antioxidantes fenlicos; b) antioxidantes secundrios: tambm conhecidos como antioxidantes preventivos, agem por retardar a velocidade de formao da cadeia de iniciao de radicais lipdicos, por destruir os hidroperxidos formados. Ex.: cido tiodipropinico (SNCHEZ-MORENO; LARRAURI; SAURA-CALIXTO, 1998). Embora se tenha a preocupao de adicionar sempre ao alimento substncias antioxidantes, durante toda a vida as pessoas so expostas a diversas fontes de estresses oxidativos potencialmente prejudiciais como: poluio ambiental, fumaa dos cigarros e produtos de radiao ionizante. No obstante, muitos produtos oxidados so gerados endogenamente durante os processos fisiolgicos normais (WHITEHEAD; THORPE; MAXWELL, 1992). Num estudo feito por Wang; Cao e Prior (1996), concluiu-se que a baixa incidncia de cncer e a diminuio da taxa de mortalidade pelas complicaes

advindas daquele tipo de doena, esto associados ao aumento no consumo de antioxidantes, naturalmente presente nos alimentos como tocoferis e flavonides (flavonas, isoflavonas, flavononas, antocianinas, catequinas e isocatequinas), contribuindo para diminuir os riscos de ataques cardacos e de acidente vascular cerebral (AVC), assim como cnceres de pulmo, de pele e do trato digestivo (ANGUELOVA; WARTHESEN, 2000). Alguns antioxidantes so muito eficazes no combate aos processos oxidativos a altas temperaturas, como a Capsaicina (CAP) (Figura 3) que protege o cido olico durante o aquecimento. O rizoma de algumas espcies de gengibre como o Zingiber officinale, demonstraram ter potente ao antioxidante. Isto se deve ao alto teor de curcuminides (Figura 4), cuja ao antioxidante comparvel a do -tocoferol (DOLL, 1990; MALTZMAN; HURT; ELSON, 1989; FOOD TECHNOLOGY, 1994). Extratos de folhas de organo (Origanum vulgare L.) tm atividade antioxidante, em especial quando na preservao de leos vegetais refinados de milho, soja e oliva. A ao antioxidante das folhas de organo, deve-se aos flavonides presentes como: flavona, apigenina, eriodictiol, flavana, dihidroflavonol, etc (DEIANA; ROSA; CAO, et al., 2002).

H3C HO

O CH3 HN O CH3

Figura 3 - Estrutura molecular da capsaicina (CAP).

H 3C HO

O OH O O O CH 3

Figura 4 - Estrutura molecular do curcuminide.

Os antioxidantes sintticos mais utilizados na indstria so: 3,5-di-t-butil-4hidroxitolueno (BHT), cido ctrico, 2 e 3-t-butil-4-metil-metoxifenol (BHA) (Figura 5), propil galato (PG), terc-butilhidroquinona (TBHQ) (Figura 6), dodecil galato (DG), (SHAHIDI; WANASUNDARA, 1992).

a)

OH C(CH3)3

b)

O(CH3)3C

O OH OH

HO

CH3

HO

O

c)

OH

O Me

Figura 5 a) estrutura molecular do BHT; b) estrutura molecular do cido ctrico; c) estrutura molecular do BHA;

a)

O HO HO HO O CH 3

b)

OH1 2

OH

Figura 6 a) estrutura molecular do propil galato (PG); b) estrutura molecular d tercbutil hidroquinona (TBHQ).

Recentemente, estudos mostram que o azeite de oliva possui efeito protetor contra o cncer, devido existncia de muitos compostos antioxidantes como fenis (tirosol e hidroxitirosol) e flavonides, potentes inibidores do oxignio reativo, em sua composio. O oxignio reativo est envolvido com alguns tipos de cnceres relacionado a gorduras, como o cncer de seio e o de colorectum. O mecanismo pelo qual aparece esta espcie de oxignio, est no consumo de cidos graxos poliinsaturados -6, os quais so particularmente sensveis a peroxidao lipdica, levando a adutos1 altamente pr-mutagnicos (OWEN; GIACOSA; HULL, et al., 2000). Em pases como a Grcia e a Itlia, onde a dieta tradicional baseada no alto consumo de azeite de oliva, encontram-se baixos nveis de colesterol plasmtico e de doena da artria coronria (DAC) (GRUNDY, 1986).

1

Adutos: produto da reao de Diels-Alder (SOLOMONS,1996).

2.1.4 Fisiopatologia dos leos termo-oxidados

O consumo de leos termo-oxidados, como verificado na fritura dos mais diversos tipos de alimentos, traz srios riscos sade, pois alm de aumentar muito a saturao dos leos comestveis, os produtos formados pela termo-oxidao, tm atividade biolgica. fato, por exemplo, que a hemaglutinao afetada pelos produtos da oxidao e da degradao trmica do azeite de oliva aquecido, os quais agem como aglutininas, promovendo um aumento da coagulao intravascular (PATRIKIOS; PATSALIS, 2003). Igualmente, o alto consumo de gorduras saturadas na alimentao, vem contribuindo para o aumento da obesidade, verificado na populao norte-americana (ASSIS, 2001). Isto porm, no se verifica nos povos do Mediterrneo, onde o grande consumo de gorduras insaturadas contribui para o baixo nvel de doena arterial coronariana (DAC) (ARMSTRONG; MANN; ADELSTEIN, et al., 1975). Sendo a DAC uma das doenas mais perigosas ao homem, tem sido a principal causa de morte entre os ocidentais (GEY, 1990). O efeito basal do consumo de cidos graxos saturados, presentes em leos vegetais termo-oxidados, o de elevar as fraes de LDL (Lipoprotena de Baixa Densidade), que em excesso no sangue circulante, depositam-se sobre as artrias (aterosclerose) e com o tempo acabam provocando doena coronariana (ASSIS, 2001; GRUNDY, 1986; KANNEL; CASTELLI; GORDON, 1979; MERCK, 1999; STEINBERG, 1990; RIEMERSMA; WOOD; MACINTYRE, 1988). Alguns estudos mostram que dieta rica em cido -6 (presente no azeite de oliva) entre os povos do Mediterrneo, efetivo na preveno de DAC, por diminuir os nveis plasmticos de colesterol (GORINSTEIN; LEOTOWICZ; LOJEK, et al.,

2002). Algumas experincias in vivo e in vitro em animais de laboratrio, demonstraram inibio da oxidao da LDL-colesterol (LDL: Low Density Lipoproteins, Lipoprotena de Baixa Densidade) pelos constituintes do azeite de oliva (PARASASSI; BITTOLO BON; BRUNELLI, et al., 2001). A oxidao da LDLcolesterol (Reao II), resulta em uma partcula com alta afinidade pelas artrias coronrias, com potencial para depositar-se no seu interior (CHANG; ABDALA; SEVANIAN, 1996). O azeite de oliva sendo rico em cido olico e linolico, acreditase que em parte, esta composio seja responsvel pelo aumento do HDL colesterol (HDL: High Density Lipoprotein, Lipoprotena de Alta Densidade), o qual representa um fator de proteo na preveno de DACs. O cido olico tambm reduz a trombognese e a agregao plaquetria, contribuindo para a estabilizao da presso arterial e glicemia; assim como, exerce influncia positiva sobre o crescimento sseo (RANALLI; FERRANTE; DE MATTIA, et al., 1999). Em muitas espcies animais, as respostas s dietas com cidos graxos diferem sensivelmente. Porm, uma dieta contendo 20% de leo de aafro, rico em cido linolico (-6), provoca reduo nos nveis sricos de colesterol, em nveis comparveis ao do azeite de oliva. O aumento no consumo do leo de aafro de 20 para 35%, causa uma baixa significativa do nvel do colesterol srico. Contudo ao se avaliar uma dieta com cido palmtico (cido graxo saturado), observa-se um aumento significativo no nvel do colesterol. E o mesmo efeito observado no consumo de leos ou gorduras ricas em cido eladico (cido graxo insaturado, trans) (KATAN; VAN GASTEL; DE ROVER, et al., 1988). Os cidos graxos de configurao trans contribuem para aumentar os nveis de colesterol, por diminurem as quantidades de HDL, popularmente chamado de bom colesterol e por elevar os valores de LDL, o mau colesterol (MORETTO;

FETT, 1998). Uma dieta baseada no consumo de 250 mg de colesterol, que contenha 20% em cidos graxos insaturados e apenas 10% em cidos graxos saturados, observa-se uma reduo crtica dos nveis de colesterol plasmtico (ASCHERIO; EIMM; GIOVANUCCI, et al., 1992; HEGSTED, 1986; GINSBERG; BARR; GILBERT, et al., 1990).Reao II: Reao de oxidao do colesterol por radicais livres, na presena de cobre (Cu). As setas indicam o local de ataque na molcula de colesterol pelo radial livre inicial.

C8H17

LOH / LOOH

C8H17

(II)3 7 5 6

Cu2+ LO./ LOO.HO

.

HO

Colesterol livreFONTE: CHANG; ABDALA; SEVANIAN, 1996.

Radical alila do colesterol

O colesterol encontra-se no alimento intimamente associado a outros lpides (gorduras saturadas), com os quais pode ser oxidado. A presena de calor, oxignio, radiao e metais de transio desencadeia o processo oxidativo, onde o 7cetocolesterol e o 25hidroxicolesterol atuam como xidos biologicamente ativos, capazes de desencadear processos citotxicos, aterognicos, mutagnicos e cancergenos (KUBOW, 1990; MOURA; TENUTAFILHO, 2002; TAI; CHEN; CHEN, 1999). O mecanismo pelo qual o consumo de cidos graxos saturados eleva o nvel do colesterol plasmtico est relacionado diminuio dos receptores hepticos. Isso reduz a depurao do LDL-colesterol e das lipoprotenas de muito baixa densidade VLDL (VLDL Very Low Density Loprotein, Lipoprotena de Muito

Baixa Densidade) (ASSIS, 2001; MERCK, 1999). O consumo regular de cidos graxos poliinsaturados especialmente os -6 e -3, provoca uma queda nos nveis de LDL-colesterol, principalmente quando a dieta de substituio s gorduras saturadas se baseia no cido linolico (-6). Contudo, sabe-se que o consumo de cidos graxos saturados com 12 ou menos tomos de carbono na cadeia, assim como a dieta rica em cido esterico, tm pouco ou nenhum efeito sobre o colesterol total em homens. O mecanismo de ao parece estar relacionado a um aumento da excreo de colesterol, pelo aumento da formao de cidos biliares, redistribuio do colesterol entre o soro e os tecidos e uma diminuio da capacidade de transporte do colesterol por meio da LDL (ASSIS, 2001; GRUNDY, 1986; KEYS; ANDERSON; GRANDE, 1965). Alm da evidncia de que os leos estressados termicamente podem ter uma funo na acelerao no processo da aterosclerose, existe a forte suspeita de que estes leos possuam atividade mutagnica. Os produtos da peroxidao lipdica, incluindo hidroperxidos (Esquema 1) e epxidos, reagem com o DNA na presena de metais e cido ascrbico (KUBOW, 1990). Espcies radicalares (presentes em leos altamente termo-oxidados), tambm reagem com os lipdios das membranas biolgicas levando a formao de radicais lipdicos, os quais reagem com o oxignio e formam hidroperxidos lipdicos. A clivagem destes hidroperxidos gera diversos compostos carbonlicos solveis em gua, como os hidroxialcenais (aldedos insaturados), que atacam e lesam as membranas biolgicas. Estas reaes so a origem das conseqncias de muitos problemas de sade do mundo industrializado.

Os aldedos derivados do 4,5epoxi-2-alcenais, produtos secundrios da peroxidao lipdica, so produzidos na decomposio dos intermedirios

epoxihidroperxidos, provenientes da oxidao de cidos graxos poliinsaturados (6 e -3, Esquema 5). A reao entre os 4,5epoxi2-alcenais e o grupo amino do aminocido lisina, por exemplo, formam derivados pirrlicos relativamente estveis, sendo encontrados em mais de 20 produtos alimentcios frescos, incluindo carnes e vegetais (ZAMORA; HIDALGO, 2003).

Esquema 5 - Formao de epoxialcenais durante a peroxidao lipdica e reao com aminos para produzir derivados pirrlicos.

.OH .OO2R1 R2 HOO R1 R2 R1 R2

.OHR1 O R2 O ciso

.R3NH2

R1

O

R2 OOH

O2

R1

O

.

R2

R1

O

O H

R1

O

R1

NR3

O-

..

+ N R3

+

R1CHO

..HR1 + N R3 R1

N R3

O

.. -

..N OH R3

R1

..N R1 R3 N R3

R1 N R3 N R3 N R3

R1

R1

R1=pentil; R2= etil; R3=lisina;

Derivado pirrlico polimerizado

FONTE: ZAMORA; HIDALGO, 2003.

certo, porm, que o consumo de flavonides (presentes em alguns leos vegetais) e outros antioxidantes polifenlicos, inibem a oxidao da LDL-colesterol reduzindo a tendncia trombose (HERTOG; FESKENS; HOLLMAN, 1993), assim como o consumo de tocoferol (presente no azeite de oliva), reduz a peroxidao de cidos graxos poliinsaturados e conseqentemente reduz os danos causados ao endotlio vascular e tecido cardaco pelos radicais peroxil (GEY, 1990; LA ROSA; CLEEMAN, 1992). Alm dos efeitos patolgicos causados naturalmente pelo consumo de leos e gorduras saturadas, a adulterao de leos vegetais pode ser muito nocivo sade, podendo conduzir o consumidor sndrome do leo txico (TOS) (Toxic Oil Syndrome). Na Espanha, a venda de leo de colza adulterado, vendido como azeite de oliva, fez com que muitas pessoas apresentassem sintomas como: perda de peso, caquexia, mialgia, falncia respiratria e tromboembolismo. O agente qumico causador da TOS, foi identificado como uma anilida do cido olico, presente no leo de colza adulterado (BELL; KUNTSE; CAPUTO, et al., 2001).

2.1.5 Controle de qualidade dos leos vegetais

Atualmente os estudos da degradao oxidativa dos lipdeos em alimentos so de grande interesse. Diversos mtodos analticos foram desenvolvidos para avaliar a qualidade dos leos e gorduras. Por exemplo, a determinao dos ndices de iodo, perxido e acidez. So tcnicas volumtricas clssicas, processos laboriosos que demandam tempo e sujeitos a dificuldades na visualizao do ponto final da titulao. Os mtodos volumtricos foram os primeiros mtodos a serem utilizados, no controle de qualidade de leos vegetais. Dentre estes mtodos, a determinao da acidez revela o estado de conservao do leo, assim como a decomposio dos triacilgliceris acelerada pelo aquecimento e luz. Mais recentemente, so as tcnicas instrumentais de anlises como a anlise trmica, a espectroscopia de ultravioleta, visvel e infravermelho; a espectrometria de massa e ressonncia magntica nuclear (RMN). Estas tcnicas apresentam muitas vantagens sobre as tcnicas analticas, apesar do custo dos equipamentos. A anlise trmica tem sido empregada para o estudo de leos vegetais e fraes de leos. Como exemplo, citam-se as gorduras, triacilgliceris, leos totais e misturas de leos e gorduras (BERGER; AKEHURST, 1996; DYSZEL, 1982; KOVALSKI, 1990). O estudo do leo de soja epoxidizado como fonte potencial de lubrificantes, a altas temperaturas, por RMN e Espectroscopia de Infravermelho (FTIR), mostrou-se conclusivo na anlise sobre o comportamento trmico, oxidativo e friccional deste leo e sua utilizao como leo lubrificante (ADHVARYU; PEREZ; SINGH, et al., 1998; ADHVARYU; ERHAN, 2001), bem como no estudo da estabilidade termo-

oxidativa de alguns leos do grupo II e III, classificados pela API (American Petroleum Institute) (ADHVARYU; ERHAN; SAHO, et al., 2001). O controle de qualidade dos leos feito por mtodos analticos, classificados em: a) mtodos volumtricos: para a determinao de acidez; teor de perxidos, ndice de iodo e outros parmetros; b) mtodos instrumentais, utilizando-se equipamentos. So mais sensveis e apresentam custos elevados; por exemplo, a anlise trmica, espectroscopia de ultravioleta-visvel, infravermelho, ressonncia magntica nuclear,

espectrometria de massa; cromatografia: CG, CGMS, CLAE, etc.

A rancidez quase sempre acompanhada pela formao de cido graxo livre, denominada de acidez livre do leo vegetal e decorre da hidrlise parcial dos triacilgliceris que perfazem a quase totalidade das molculas que constituem os leos vegetais. Acidez alta, indica a ao de reaes hidrolticas e pode ser definida como a quantidade - em gramas - de cido olico livre para cada 100 g de leo analisado. Na realidade, a expresso do resultado indica uma idia geral de acidez e no uma determinao especfica de cido olico. O que este mtodo acusa a formao em andamento de grupos carboxila (COOH). O ndice ou teor de perxidos um indicador do grau de oxidao do leo ou gordura. A sua presena indcio de deteriorao, que poder ser verificada com a mudana do sabor e do odor caractersticos dos leos. definido em termos de miliequivalentes de perxidos por 1000 g de leo, que oxidam o iodeto de potssio nas condies do teste.

O mtodo convencional usado para determinar o grau de insaturao de leos e gorduras o ndice de iodo. Molculas contendo ligaes duplas carbonocarbono (insaturadas) reagem com iodo, de modo que, quanto maior o nmero de insaturaes, maior a quantidade de iodo consumida, maior o ndice de iodo e maior a probabilidade da ocorrncia de processos oxidativos na molcula do cido graxo insaturado devido aos hidrognios allicos (hidrognios adjacentes ao carbono da ligao dupla). A reao de adio do iodo s ligaes duplas carbono-carbono lenta (30-60 minutos), devendo ser conduzida sem aquecimento e na ausncia de luz, para prevenir ou minimizar as reaes indesejveis de substituio allica - que ocorrem na presena de luz e aquecimento - e assim, elevam o consumo de iodo no processo, conduzindo a resultados errneos. O ndice de iodo no uma medida quantitativa, um nmero emprico que til na definio do grau de insaturao, porm sujeito a erros. Nos mtodos de determinao do ndice de iodo e que utilizam soluo de ICl (Wijs) ou IBr (Hanus), a soluo de iodo (liberado pela adio de KI) e amido, j titulada com soluo de tiossulfato de sdio, deixada em repouso, freqentemente reverte a colorao anterior. O mesmo comportamento observado com os mtodos que utilizam soluo de I2 . Ambos so mtodos empricos, pouco precisos e sujeito a erros. Estas dificuldades limitam a aplicao destas tcnicas. O ndice de iodo a medida do grau de insaturao de um leo, definido pela quantidade de halognio absorvido em 100 g de amostra. Est relacionado com a quantidade de ligaes duplas presentes na amostra e a reduo observada neste ndice se deve quebra de ligaes duplas resultantes de reaes de polimerizao, ciclizao e oxidao, o que aumenta o grau de saturao da amostra, tornando-a por fim, imprpria para o consumo humano. Sob determinadas condies, o iodo

pode ser introduzido quantitativamente nas ligaes duplas dos cidos graxos insaturados dos triacilgliceris e proporciona uma medida do grau de insaturao da amostra. Quanto maior for o ndice, maior ser a insaturao da amostra. Mesmo este mtodo tendo algumas desvantagens, deve ser considerado como um mtodo emprico cujo resultado final d uma idia aproximada da realidade. Isto fica evidente quando se analisa a proposta fundamental do mtodo. Ao se utilizar iodo (halognio) para reagir especificamente com as ligaes duplas, esbarra-se em algumas dificuldades: uma que o iodo sempre vai sofrer alguma interferncia da luz, reduzindo sua participao na reao de halogenao. Outra que a adio devido ligaes duplas isoladas, ou conjugadas podem resultar em algumas ligaes duplas intactas sem a adio do iodo devido adio 1,2 e 1,4 (Esquema 6), resultando em valores menores do que o normal (JOSEPH-NATHAN, 1982). Valores mais consistentes podem ser obtidos por RMN de H1. Neste trabalho foram realizadas algumas determinaes do ndice de iodo pelo mtodo tradicional (Wijs) em leos in natura e aquecidos. Foi determinado o ndice de iodo de dados retirados das curvas de integrao dos espectros de RMN de H 1 dos leos vegetais, cujos resultados so mais consistentes do que aqueles obtidos com a metodologia usual (mtodo de Wijs).

Esquema 6 - Mecanismo de halogenao de dienos: 1,2 e 1,4.

-R

:: 1,4 e/ou 1,2

-

R

I

+

R

I1 2

Duplas no halogenadas

II

1

R

4

I

FONTE: SOLOMONS, 1996.

Em geral, os mtodos analticos oficiais disponveis para a anlise de leos so pouco sensveis, morosos, de baixa confiabilidade e seletividade. pois, necessrio, novas metodologias, tcnicas mais sensveis, rpidas e automatizadas para a determinao adequada do ndice de iodo. A RMN de H1 resolve esta dificuldade. Na Figura 7, mostrado o espectro de RMN de H1 genrico de um leo vegetal para anlise.

LEGENDA: a = prtons metlicos; b = prtons metlicos do cido linolnico; c = prtons metilnicos dos cidos graxos do triacilglicerol; d = prtons -carboxlicos; e = prtons allicos externos; f = prtons -carboxlicos; g = prtons allicos internos; h + i = prtons metilnicos do glicerol; j = prton H-2 metilnico do glicerol; k = prtons olefnicos;

c

a k ih j f e d g b

8,0

7,5

7,0

6,5

6,0

5,5

5,0

4,5

4,0

3,5

3,0

2,5

2,0

1,5

1,0

0,5

0,0 ppm

Figura 7 - Espectro RMN de H genrico de um leo vegetal. A insero mostra os sinais dos prtons H1 da metila do cido linolnico em 0,98 ppm [sinal em b].

1

Do espectro de RMN de H1 integrado, obteve-se a medida direta do grau de insaturao de modo preciso. Todos os hidrognios olefnicos (aqueles conectados diretamente nos carbonos das ligaes duplas carbono-carbono) mostram deslocamento qumico () entre 5,40-5,26 ppm (k). Todos os hidrognios metlicos

parte saturada da molcula mostram deslocamento qumico entre () 0,80 e 1,00 ppm (a + b). Portanto o nmero total de insaturao, em moles, a medida direta da rea dos picos normalizados e integrados, dos hidrognios que geraram aqueles sinais, naquelas regies do espectro de RMN de H1 (MANNINA, 2003). A RMN de H1 uma tcnica extremamente sensvel densidade eletrnica e a populao de hidrognios que gerou o sinal. Hidrognios em ambientes eletrnicos diferentes mostram diferentes deslocamentos qumicos, e a intensidade do sinal estritamente proporcional a quantidade de hidrognios que o gerou. Felizmente, o espectro de RMN de H1 dos triacilgliceris bem resolvido, observando-se sinais distintos, caractersticos, para os prtons olefnicos, do glicerol e alqulicos, que mostram absoro em regies diferentes do espectro. Os prtons olefnicos so observados em () 5,26 5,40 ppm (k); os prtons metilnicos do glicerol em () 4,10 4,32 ppm (i + h) [H-1 e H-3]; H-2 o prton metilnico em () 5,25 ppm (j). Os prtons metlicos so observados em () 0,80 1,00 ppm (a; b). Somente os prtons metlicos do cido linolnico so observados em () 0,98 ppm (b); sua concentrao pode ser diretamente medida a partir do valor da curva de integrao. Prtons allicos internos so observados em () 2,80 2,70 ppm (g). Os prtons allicos externos so observados em () 2,10 1,90 ppm (e). Prtons carboxlicos so observados em () 2,34 2,22 ppm (f). Os prtons -carboxlicos so observados em () 1,70 1,50 ppm (d). Um cluster de picos sobrepostos em () 1,40 1,15 e centrado em 1,2 ppm (c), corresponde aos demais prtons metilnicos dos cidos graxos presentes no triacilglicerol (VIGLI; PHILIPPDIS; SPYROS, et al., 2003). Fortuitamente, porm, a curva de integrao dos prtons olefnicos inclui o prton metlico do glicerol em C-2 e que deve ser considerado nas equaes obtidas

a partir do contido nas curvas de integrao, e que permitam o clculo correto do ndice de iodo por RMN de H1, segundo as equaes:

Clculo da rea de um prton (Equao I):

i+h 4

(I)

Clculo de prtons olefnicos (Equao II):

V=

[k + j ]

[i + h] 4 i+h 4

(II)

onde: (k + j) = representa a populao de prtons vinlicos, obtidos por leitura direta do espectro integrado; (i + h) = os prtons dos dois grupos metilenos do glicerol. O hidrognio metino (H-2) do glicerol aparece em 5,26 ppm sobreposto aos prtons vinlicos na curva de integrao. Portanto a rea relativa a um prton ser (i + h)/4 (JOSEPH-NATHAN, 1982).

Clculo do total de prtons (Equao III):

T=

k + j +i+h+ g + f +e+d +c+b+a i+h 4

(III)

Clculo do peso molecular mdio dos triacilgliceris (PM) (Equao IV):

PM = 119,7 + 7,036T + 5,983V

(IV)

Assim, o ndice de iodo foi determinado a partir do espectro de H1 integrado, conforme a equao (V), descrita por Joseph-Nathan (1982):

I=

126,91 x 100V PM

(V)

onde: I = ndice de iodo V = nmero de prtons vinlicos (olefnicos). PM = peso molecular mdio do triacilglicerol que compe o leo em estudo

O PM mdio determinado por RMN, substitui com vantagem a determinao do ndice de saponificao por volumetria, uma vez que aquele s serve para dar uma idia do tamanho da cadeia de cido graxo que compe o triacilglicerol. O valor numrico do ndice de saponificao inversamente proporcional ao tamanho da

cadeia do cido graxo (se ele tem uma cadeia carbnica maior ou menor do que 12 carbonos). Para agilizar os clculos, desenvolvemos para o ambiente Windows, o programa PROTEUS (Figura 8) para calcular o ndice de iodo por RMN de H1. O programa foi escrito em Visual Basic 5.0, onde os campos de entrada dos dados de (i + h), (k + j), e T correspondem as integrais tiradas dos espectros de RMN de H1. E os campos Prtons olefnicos, Total de prtons e Peso molecular mdio, correspondem aos clculos supracitados para se encontrar o ndice de iodo (I.I.), que calculado automaticamente pela entrada de dados.

Figura 8 Caracterstica geral do programa PROTEUS

A ressonncia magntica nuclear (RMN) tornou-se ao longo de seu desenvolvimento o principal instrumento de avaliao de leos (AZEREDO; COLNAGO; SOUZA, et al., 2003). Ncleos atmicos contendo ncleons (prtons e nutrons) desemparelhados (pelo menos um) so ativos em RMN. Por exemplo, 1D2,1H 1

, 6C13, 7N15 8O17. Sob a ao de um campo magntico constante (Bo) e potente

(MHz) posicionado no eixo z das coordenadas girantes (x, y, z), os ncleons se

comportam como micromagnetos (representveis fisicamente por vetores) e se ordenam a favor e contra o campo magntico. A resultante um alinhamento a favor do campo, responsvel pelo experimento. O experimento consiste em perturbar o equilbrio dos spins por ao de um pulso curto e intenso de radio freqncia (Hz) fornecido por um gerador posicionado no plano x,y de outro campo magntico oscilante (B), ortogonal ao campo constante (Bo). A seqncia de pulsos a intervalos de tempos ( , At) programada por computador. Em conseqncia os vetores de magnetizao dos spins nucleares sofrem um torque, entram em precesso num movimento giratrio semelhante ao de um pio em ngulo de 90, por exemplo, que tende a retornar ao equilbrio (ngulo de 0 com o campo constante). No processo, o componente vetorial no plano x,y gera um sinal (FID) que detectado pelo equipamento como uma onda senoidal radiao no domnio do tempo - que convertida no domnio da freqncia por transformada de Fourier (FT). O grfico (espectro) gerado mostra sinais (picos) cujas intensidades so proporcionais

populao de spins, e cujas freqncias (Hz, ppm) so distribudos numa janela espectral de 0 10 ppm para RMN de H1 e 0 -240 ppm para RMN de C13. Diversas modalidades de espectros de RMN podem ser obtidos de acordo com programao prvia, utilizando-se determinada seqncia de pulsos e pequena quantidade de amostra (10-100 mg). O pulso curto e intenso de radiao eletromagntica no comprimento de onda de radiofreqncia do ncleo atmico da amostra provoca o efeito de rotao (giro de pio) levando um certo tempo para retornar ao repouso. Este tempo denominado de tempo de relaxao. No processo, a energia de radiofreqncia absorvida dissipada como uma onda (FID) que captada pelo espectrmetro e convertida por computador num grfico (espectro) por transformada de Fourier (FT). O espectro de

RMN fornece informaes importantes sobre a estrutura molecular, como o deslocamento qumico (), constantes de acoplamento (J), curvas de integrao (proporcionais populao de ncleos que gerou o sinal). Todos estes parmetros esto relacionados aos diferentes tipos de tomos que constitui a amostra. A RMN sensvel a densidade eletrnica, a efeitos estricos e conformacionais. Como os leos vegetais so formados por molculas pequenas (triacilgliceris), os grficos gerados do boa resoluo. Neste trabalho, utilizou-se RMN de prton (RMN H1) e de carbono 13 (RMN C13), para estudos das alteraes termoxidativas dos leos. Dos espectros integrados de RMN H!, calculou-se o ndice de iodo de todas as amostras de leos vegetais analisadas (sob diferentes tempos de aquecimento), procedimento invivel pelo mtodo tradicional (Wijs). As amostras mais deterioradas, polimerizadas, no podem ser analisadas pelo mtodo de Wijs, nem por cromatografia gasosa (inutilizaria a coluna). Somente a RMN contorna esta dificuldade (GUILLN; RUIZ, 2001). A RMN uma importante ferramenta no estudo dos alimentos como leos e gorduras. RMN de baixa resoluo foi usado por um longo tempo para se determinar o contedo de gordura slida em uma amostra, as curvas do ponto de fuso de gorduras semi slidas, ou a porcentagem em massa de leos nos alimentos. RMN H1 e de C13 de alta resoluo tambm usado no estudo de lipdeos em alimentos. O uso da RMN H1 no estudo dos leos, gorduras e lipdeos nos alimentos aumentou particularmente por causa da grande quantidade de informaes que os instrumentos de RMN de campo alto podem fornecer num curto perodo de tempo. Hoje em dia, a anlise dos leos vegetais dominada pelas determinaes clssicas, tais como acidez, teor de perxido, assim como pelo uso de tcnicas

cromatogrficas em camada delgada, a gs e CLAE. Essas tcnicas so usadas primariamente para medidas quantitativas de compostos. Uma desvantagem destes procedimentos que existem muitas diferenas entre os ensaios para serem plicados na anlise de rotina. Alguns destes mtodos requerem o isolamento e a anlise de componentes menores da matria insaponificvel, por meio de mtodos laboriosos e demorados. Assim, muitos estudos foram realizados no sentido de se aplicar novas tcnicas analticas que, com muito pouco ou sem nenhuma manipulao da amostra, mostrassem resultados similares ou superiores queles obtidos pelos mtodos clssicos. Neste contexto, tcnicas espectroscpicas tm emergido como ferramentas potenciais nos tempo atuais, como a espectrometria de massa e a

espectrofotometria por infravermelho e de Raman (BAETEN; DARDENNE; APARICIO, 2001). Uma das tcnicas espectroscpicas com alto potencial neste campo, a Ressonncia Magntica Nuclear (RMN) de alta resoluo. O espectro de RMN contm uma grande quantidade de informaes que podem ser obtidos num curto perodo de tempo e pode se empregado como uma alternativa aos mtodos clssicos de anlise atuais. Os diferentes sinais presentes no espectro de RMN de H1, do dois tipos de informaes: o deslocamento qumico, de valor qualitativo, relacionado aos diferentes ambientes dos tomos presentes na mostra analisada (KIM; CHEN; MCCARTHY, et al 1999); a intensidade relativa, que prove

informaes quantitativas dos diferentes sinais. Ento ao se aplicar todas essa informaes na anlise de leos, possvel caracterizar sua qualidade e autenticidade.

A RMN de H1 est relacionada aos nveis de energia do ncleo do H1 que resulta quando a amostra colocada no interior de um campo magntico externo. Cada ncleo de H1 em ambiente diferente, blindado diferentemente pelo ambiente eletrnico, afetado e afeta os ncleos vizinhos. Estas interaes magnticas causam pequenas modificaes locais ao campo externo aplicado. O ncleo dos tomos de hidrognio em diferentes ambientes, mostra comportamentos qumicos diferentes, pois apresentam energias diferentes. Essas separaes no nvel de energia podem ser medidas com muita preciso como freqncias usando a transformada de Fourier, a qual monitora a resposta do ncleo aps ele ter sido perturbado do seu equilbrio por um pulso curto e intenso de radiao eletromagntica de radiofreqncia. O espectro de RMN uma srie de sinais agudos cujas freqncias podem ser relacionada natureza qumica dos tomos de hidrognios (grupos metil, metilenos, etc.) e cujas intensidades so diretamente relacionadas ao nmero de hidrognios que produzem o sinal. As caractersticas do instrumento de RMN requerido no estudo dos leos e gorduras dependem do tipo de estudo feito. Os instrumentos usam campo magntico de 60 a 600 MHz. Obviamente, quanto maior o campo magntico, melhor a resoluo da transio das ressonncias e melhor a sensibilidade e qualidade do espectro. A amostra preparada por dissoluo de uma quantidade de leo ou gordura em solvente apropriado, em propores especficas, usualmente 10 100 mg/mL de solvente em um tubo de 5 mm de dimetro. Os solventes mais comuns usados so o clorofrmio deuterado, o tetracloreto de carbono, o dimetilsulfxido deuterado ou metanol deuterado. O espectro realizado normalmente temperatura ambiente ou temperatura controlada entre 20 C e 30 C. O tempo de anlise varia entre 1,28 e 2,7 s. Em molculas de triacilgliceris os prtons metilnicos do grupo

gliceril tm tempo de relaxao (T1) curto, e um tempo maior para os prtons de grupos metil terminal, prximo a 2,2 s. O nmero de scans comumente usados varia de 16 a 64 e o pulso usado fica entre 45 90(GUILLN; RUIZ, 2001). No espectro, tomos de hidrognios sob o mesmo ambiente qumico, produzem sinais na mesma freqncia. A posio do sinal de ressonncia no espectro chamada de deslocamento qumico (). O deslocamento qumico, a intensidade e a multiplicidade dos sinais contm muitas informaes teis sobre cada tipo diferente de ncleo de 1H na amostra. O deslocamento qumico de um tomo ou grupos de tomos medido em relao ao composto de referncia, o tetrametilsilano (TMS). Esse composto usualmente adicionado amostra numa concentrao prxima a 0,03%. Os deslocamentos qumicos so obtidos em partes por milho (ppm) por dividir a diferena da freqncia entre os sinais da amostra e o sinal do TMS, em hertz (Hz), pela freqncia do equipamento em megahertz (MHz). Por esta razo, o deslocamento qumico em ppm, independente da medida da fora do campo, mas a separao em hertz de dois sinais com uma certa diferena de deslocamento qumico, aumenta a linearidade com a fora do campo. Os deslocamentos qumicos de sinais de lipdeos so sempre positivos em relao ao TMS e so caractersticos do comportamento molecular em particular. Os leos comestveis e gorduras so principalmente constitudos de triacilgliceris, com diferentes padres de substituio devido extenso, grau e espcie de insaturao dos grupos acil, e por componentes menores como os mono e diglicerdeos, esteris, vitaminas, cidos graxos, e outros. O grau de insaturao dos leos um importante indicador da provvel desenvolvimento de rancidez nos alimentos e usado para determinar as propriedades qumicas e fsicas dos leos. A determinao tradicional envolve testes

qumicos, relacionados com reaes envolvendo as ligaes duplas existentes na molcula lipdica. Um dos testes mais comuns, consiste na adio de iodo para reagir quantitativamente com as ligaes duplas. Deste tipo de experimento que o valor do ndice de Iodo obtido. Este mtodo, porm, consome tempo em comparao com outros mtodos mais rpidos que podem ser de interesse para a indstria. Os experimentos com RMN H1 permitem a determinao deste parmetro e outros, como: peso molecular mdio, o nmero mdio de ligaes duplas, ndice de saponificao, concentrao de cidos graxos insaturados, rapidamente e de modo simples, usando diferentes abordagens. O ndice de iodo usando-se RMN H1 tem boa reprodutibilidade se comparado com o mtodo tradicional de Wijs (AOCS mtodos Cd 1 25) para um nmero de amostras significativo. No mesmo caminho, est a estimativa de se determinar qual a proporo dos diferentes tipos de grupos acil nos leos comestveis e gorduras, ponto de grande interesse nutricional e tecnolgico. Tambm pelos mtodos tradicionais, h uma demora considervel na determinao e envolve etapas trabalhosas como reaes de transesterficao do leo para produzir steres metlicos de cidos graxos e a subseqente separao, identificao e quantificao deste compostos individualmente por cromatografia gasosa. Esta metodologia envolve problemas relacionados com a oxidao da amostra, com a formao de artefatos durante a transesterificao e com a separao e identificao dos steres metlicos na corrida cromatogrfica. Da mesma forma, a estimativa da proporo de grupos acil poliinsaturados -3 em lipdeos, como o de pescado, por exemplo, de grande importncia, devido a sua influncia na estabilidade oxidativa e sua influncia positiva sobre a sade humana por causa do aumento dos nveis sricos de HDL. Assim, este parmetro o

principal critrio de julgamento, em alguns pases, para a avaliao da qualidade do leo de peixe (GUILLN; RUIZ, 2001). A oxidao dos leos comestveis do maior interesse no s do ponto de vista tecnolgico e econmico, mas tambm da segurana, devido a propriedades indesejveis de alguns compostos produzidos deste modo. Embora outros mecanismos de degradao sejam possveis, o processo de degradao do leo, inicia pela formao de um radical livre alila que oxidado a hidroperxidos, denominados de produtos de oxidao primrios, os quais se degradam em aldedos, cetonas, lcool lactonas, cidos, etc., denominados de produtos de oxidao secundrios (Esquema 1). Para anlise destes compostos resultantes de degradao oxidativa, a RMN de H 1 uma alternativa bastante til s anlises qumicas tradicionais envolvidas. O estudo por RMN dos produtos gerados na oxidao de substncias como a trilinolena (Figura 9), trilinolenina e triolena, podem ser de interesse na sntese de lipdios estruturados, pois prov informaes valiosas a respeito da distribuio e da posio dos grupos acil dos tristeres de glicerol nos leos vegetais, utilizados como substratos pela indstria. Os lipdios estruturados podem ser definidos como triacilgliceris reestruturados ou modificados na sua composio em cidos graxos, tm propriedades fsicas e funcionais modificadas, como por exemplo, alterao do ponto de fuso e reduo do valor calrico, respectivamente. Na prtica, so utilizados na clnica mdica para melhorar o sistema imunolgico, na preveno de cncer, trombose e diminuir a hipercolesterolemia. Na indstria alimentcia, so usados com a finalidade de diminuir o contedo energtico de alimentos como chocolates, laticnios, sorvetes, etc. (DAGOSTINI, 2001; MANNINA; LUCHINAT; EMANUELE, et al., 1999).

Figura 9 - Estruturas tridimensionais da triolena

Na anlise especfica de um leo vegetal por RMN C13 (Figura 10), quatro regies bem distintas no espectro podem ser descritas: 173,3-172,8 ppm (A) regio dos carbonos dos grupos carboxilas; 132,0-127,1 ppm (B), regio dos carbonos olefnicos; 69,1-61,6 ppm, regio dos carbonos do glicerol (C) [C1 e C2]; e 34 ppm (D), onde esto presentes os carbonos alifticos saturados. Quando se analisa a regio dos grupos carboxlicos, os substituintes nas posies 1 e 2 do glicerol podem ser distinguidos, porque mostram intensidades diferentes. leos deteriorados termicamente, mostram reduo do nmero de carbonos olefnicos; 34 ppm correspondem aos grupos -metilnicos em relao carboxila; os grupos CH2 saturados encontram-se em 30,0-28,5 ppm; os CH2 allicos externos C=C, esto em 27,5 ppm; os CH2 olefnicos internos, so observados em 26,0-25,0 ppm; os

carbonos -carbonlicos so observados em 25,0 ppm e as metilas podem ser observadas em 14,0 ppm.Legenda: A = grupos COOH; B = carbonos olefnicos; C = carbonos do glicerol (C1 e C2); D = carbonos alifticos saturados.

H O H C O C R1 O H C O C R2 H C O C R3 O HC B A

D

200 190 180 170 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10

0

ppm

Figura 10 - Espectro genrico de RMN de carbono 13 de leo vegetal.

Os mtodos instrumentais apresentam grande vantagem sobre os tradicionais (volumtricos) pela sua capacidade em necessitar apenas de quantidades mnimas de amostra e terem uma extrema sensibilidade e reprodutibilidade nas anlises, alm de serem mais precisos e exatos. A anlise trmica utiliza como fundamento os princpios da termogravimetria, em que uma quantidade de amostra (5 10 mg) colocada num cadinho de alumina e aquecida progressivamente num intervalo de tempo pr-estabelecido, sob

condies de atmosfera controlada (ar ou nitrognio). No final, gerado um grfico mostrando as respectivas perdas de massa sob diferentes temperaturas. Assim possvel determinar com preciso, por exemplo, a que temperatura uma amostra mudou de estado fsico, deteriorou ou entrou em ignio. Todos os mtodos espectroscpicos, baseiam-se nos efeitos da radiao sobre a matria. Na espectroscopia de ultravioleta (UV) se utiliza radiao de baixo comprimento de onda ( 200 400 nm) e alta energia. A resposta analisada por aparelhos chamados espectrofotmetros. A amostra para ser observvel deve apresentar estrutura molecular adequada: presena de ligaes insaturadas, ligaes (ligaes duplas ou triplas). A radiao na freqncia do UV, ao incidir sobre a amostra, excita os eltrons das ligaes , fazendo que estes eltrons saltem de um orbital de menor energia para outro de maior energia, levando-os com isso, a um estado ativado. Este fenmeno corresponde a absoro de certa quantidade de energia pela amostra. O retorno dos eltrons ao estado fundamental libera a energia absorvida sob a forma de radiao, detectada pelo

espectrofotmetro que gera um grfico (o espectro) da quantidade de radiao absorvida (absorbncia) pelo comprimento de onda em nanmetros (nm). Assim, quando uma amostra possui ligaes , o aparelho gera um grfico cujo pico mximo de absorbncia pelo comprimento de onda, caracterstico daquela amostra em particular. Isto possvel porque os leos vegetais possuem intrinsecamente uma constituio molecular homognea, de triacilgliceris (Figura 1) e cidos graxos insaturados (Tabelas 1 e 2). Assim, quando o leo sofre qualquer tipo de alterao, como oxidao, por exemplo, o espectro gerado mostra um deslocamento de banda (efeito batocrmico) e aumento da intensidade da absoro (A), acusando de imediato que o leo no est no seu estado mais puro. Este efeito foi observado

neste trabalho. A espectroscopia UV-VIS utiliza comprimento de onda na regio de 200 a 800 nm. Outra anlise importante a espectroscopia de infravermelho (FTIR) que utiliza radiao de freqncia de maior comprimento de onda (menor energia). Esta radiao de baixa energia no capaz de fazer eltrons saltarem de um orbital para outro, porm provoca vibraes entre as ligaes de tomos nas molculas da amostra sob anlise. Estas vibraes correspondem aos estiramentos (simtricos e assimtricos) e deformaes angulares (no plano, fora do plano). Estas alteraes nas ligaes qumicas - mais pronunciadas em molculas assimtricas e com significativo momento de dipolo - so captadas pelo equipamento, que gera um grfico (espectro) de transmitncia ou absorbncia (intensidade da absoro) pelo nmero de ondas ( , cm-1), em concordncia com a presena de grupos funcionais na amostra. Os leos vegetais tambm so sensveis a este tipo de anlise por possurem grupos funcionais possveis de serem analisados no infravermelho. Na anlise por infravermelho dos diversos leos neste trabalho, foi possvel observar as alteraes provocadas pelo aquecimento sucessivo das amostras, principalmente da banda de 3.500 a 3.000 cm-1 (regio dos grupos hidroxilados), mostrando que possvel se fazer uma anlise qualitativa dos leos, principalmente quando estes apresentam grau de acidez aumentado, como resultado dos processos oxidativos. Na cromatografia gasosa, o leo a ser analisado (1-10ml), primeiramente esterificado e injetado (1 l) no cromatgrafo a uma temperatura entre 200-220 C, para ser vaporizado e poder ser dividido em seus vrios constituintes. A amostra (fase gasosa mvel), passa por uma fase estacionria, levada por um gs de arraste inerte, geralmente o Hlio. Seus vrios constituintes, geram grficos que so

comparados com um padro interno para que sua composio seja determinada (SILVERSTEIN; WEBSTER, 1998; VOGEL, 1992).

2.2 OBJETIVO GERAL

2.2.1 Investigar as alteraes ocorridas em leos vegetais sob estresse trmico, por mtodos analticos e espectroscpicos e contribuir para o controle de qualidade de leos vegetais;

2.3 OBJETIVOS ESPECFICOS

2.3.1 Determinar o perfil de cidos graxos das amostras de leo in natura por cromatografia gasosa; 2.3.2 Submeter amostras de diferentes leos vegetais estresse trmico durante 28 horas, 4 horas/dia e 80 horas, 8 horas/dia, num intervalo de temperatura de 180 200 C; 2.3.3 Determinar o teor de acidez e perxidos das amostras de leo in natura e sob diferentes temperaturas de aquecimento; 2.3.4 Monitorar o perfil dos espectros de FTIR dos leos sob estresse trmico em diferentes tempos de aquecimento; 2.3.5 Determinar o perfil dos espectros UV-Vis dos leos sob estresse trmico, em diferentes tempos de aquecimento; 2.3.6 Avaliar a estabilidade trmica de alguns antioxidantes; 2.3.7 Determinar o ndice de iodo das amostras de leos in natura e sob diferentes tempos de aquecimento por RMN H1; 2.3.8 Estabelecer o perfil de RMN de C13 dos leos sob diferentes tempos de aquecimento.

3 MATERIAL E MTODOS

3.1 MATERIAL:

3.1.1 Reagentes e solventes: os reagentes e solventes eram de grau de pureza PA e foram utilizados sem qualquer purificao.

3.1.2 leos veg