dissertação final da mestranda verbena carvalho alves

MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO – MEC UNIVERSIDADE FEDERAL DO PIAUÍ – UFPI

PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO – PRPPG CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE – CCS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ALIMENTOS E NUTRIÇÃO – PPGAN

VERBENA CARVALHO ALVES

ASPECTOS MICOLÓGICOS E MICOTOXICOLÓGICOS DE PÃES TIPO HOT-DOG

INFLUENCIADOS PELA QUALIDADE DA FARINHA DE TRIGO

Teresina

2014



INFLUENCIADOS PELA QUALIDADE DA FARINHA DE TRIGO.

Dissertação apresentada ao Programa de

Pós-Graduação em Alimentos e Nutrição

da Universidade Federal do Piauí, como

requisito parcial à obtenção do título de

Mestre em Alimentos e Nutrição.

Área: Qualidade de Alimentos.

Orientadora: Drª. Maria Christina Sanches

Muratori.

Teresina

2014



INFLUENCIADOS PELA QUALIDADE DA FARINHA DE TRIGO

Dissertação apresentada ao Programa de

Pós-Graduação em Alimentos e Nutrição

do da Universidade Federal do Piauí,

como requisito parcial à obtenção do título

de Mestre em Alimentos e Nutrição.

Área: Qualidade de Alimentos.

Orientadora: Drª. Maria Christina Sanches

Muratori.

Aprovada em:____/____/____

BANCA EXAMINADORA

___________________________________________________________________

Orientadora/Presidente: Profª. Drª. Maria Christina Sanches Muratori – UFPI

___________________________________________________________________

1º Examinador: Prof. Dr. Luiz Antonio Moura Keller – UFF

___________________________________________________________________

2º Examinador: Prof. Dr. Rodrigo Maciel Calvet – IFMA

AGRADECIMENTOS

Agradeço a Deus, por cada momento vivido, pelas oportunidades

proporcionadas, pela proteção, amparo e força para vencer cada etapa e as

adversidades da vida.

Aos meus pais, Raimundo Nonato e Maria de Jesus, pelo amor incondicional

e por todo o apoio e educação que me proporcionaram.

Às minhas irmãs, Valéria e Viviane e a todos os meus familiares pelo carinho

e por sempre torcerem pelo meu sucesso e felicidade.

Ao Fábio, meu namorado, obrigada por seu amor, carinho, paciência e

pensamentos positivos.

À minha orientadora Prof.ª Dr.ª Maria Christina Sanches Muratori, pela

grande oportunidade, pelos ensinamentos, amizade e confiança na minha

capacidade de conduzir este estudo.

Aos professores Dr. João Batista e Drª. Maria Marlúcia Gomes Pereira,

membros da banca examinadora da qualificação do projeto, obrigada pelas

preciosas contribuições oferecidas.

Aos professores Dr. Luiz Antônio Moura Keller, Dr. Rodrigo Maciel Calvet,

agradeço pela solicitude em fazerem parte da minha banca examinadora, além das

valiosas sugestões apresentadas.

À Profª. Drª. Waleska Albuquerque por ter contribuído com a realização

desta pesquisa ao ceder gentilmente o laboratório de para execução das análises.

Aos amigos conquistados ao longo do curso de Pós-Graduação, em especial

aos “amadinhos”: Aline Dourado, Carla Cristina, Thiago Hipólito, Marília Marques,

Cecília Muniz e Rocilda, por todo o período em que convivemos juntos, dividindo

momentos de angústias, de alegrias, mas principalmente de muita descontração!

Às minhas eternas companheiras de laboratório e da vida: Raizza Escórcio,

Josyanne Araújo, Cristiane Evangelista, Julliet Teixeira, Juliana Abreu. Agradeço

imensamente pelo apoio na realização das coletas e das análises laboratoriais desta

pesquisa e principalmente pela amizade, companheirismo e por todos os momentos

de alegrias que passamos juntas. Tenho vocês no meu coração pra vida toda!

À Universidade Federal do Piauí, por meio do Programa de Pós-Graduação

de Mestrado em Alimentos e Nutrição, pelo apoio necessário à realização do curso

em particular à Coordenação do Programa de Pós-Graduação de Mestrado

Alimentos e Nutrição pelo competente trabalho que exercem, fornecendo subsídios

necessários para a conclusão do curso.

Ao corpo docente do Programa de Pós-Graduação em Alimentos e Nutrição,

pelo conhecimento transmitido.

À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES),

pela bolsa de estudos concedida.

Aos funcionários do Núcleo de Estudos, Pesquisas e Processamento dos

Alimentos (NUEPPA) que de forma direta ou indireta colaboraram na condução da

pesquisa.

Aos proprietários e funcionários das panificadoras onde foram realizadas as

coletas amostrais pela contribuição para que o trabalho fosse concretizado.

Enfim, a todos que de alguma forma contribuíram para a realização deste

trabalho!

“

“É muito melhor lançar-se em

busca de conquistas

grandiosas, mesmo expondo-

se ao fracasso, do que

alinhar-se com os pobres de

espírito, que nem gozam

muito nem sofrem muito,

porque vivem numa

penumbra cinzenta, onde não

conhecem nem vitória, nem

derrota.”

(Theodore Roosevelt)

RESUMO

O pão está presente na vida do homem desde os seus primórdios. De uma

forma geral, tem presença expressiva na mesa dos brasileiros, até mesmo como

refeição principal. Muitos ingredientes usados no preparo de pães oferecem riscos

de contaminação por fungos. Dentre eles, a farinha pode disseminar conídios

fúngicos no ambiente industrial, que em condições ideais de umidade e temperatura,

podem produzir micotoxinas com propriedades imunossupressoras, alergênicas,

teratogênicas, mutagênicas e carcinogênicas. Os principais gêneros contaminantes

de alimentos produtores de micotoxinas são: Aspergillus, Penicillium e Fusarium. O

estudo objetivou verificar os aspectos micológicos e micotoxicológicos de pães tipo

hot-dog influenciados pela qualidade da farinha de trigo. Semanalmente, foram

efetuadas coletas de farinha de trigo e pães do tipo hot-dog (elaborados com a

mesma farinha de trigo que foi amostrada) em duas panificadoras de Teresina, PI.

Este procedimento foi repetido por 15 semanas em cada estabelecimento

pesquisado, com 30 amostras de farinha e 30 de pães, totalizando 60 unidades

experimentais. As variáveis avaliadas foram: umidade relativa do ar (URA);

temperatura ambiental; atividade de água (aw); contagem de fungos filamentosos e

leveduras; isolamento e identificação de gêneros micotoxigênicos; perfil toxígeno de

espécies fúngicas por cromatografia de camada delgada (CCD); e detecção de

aflatoxina B1 (AFB1) e ocratoxina A (OTA) por cromatografia líquida de alta

eficiência (CLAE). As contagens de fungos filamentosos e leveduras das amostras

de farinha de trigo e de pães tipo hot-dog da panificadora “A” foram semelhantes

(P>0,05), entretanto, na panificadora “B” a contaminação fúngica dos pães foi maior

que a da farinha de trigo. Das amostras analisadas, foram isoladas 66 cepas de

fungos filamentosos pertencentes a oito gêneros e, pode-se constatar que a

variedade de fungos foi maior na farinha de trigo do que nos pães. Não foram

detectadas cepas de Aspergillus das seções Flavi e Nigri com potencial capacidade

para produção de AFB1 e OTA. Das 60 amostras analisadas de pão tipo hot-dog e

farinha de trigo não foi detectada AFB1 e OTA. Concluiu-se que a qualidade da

farinha de trigo influencia os aspectos micológicos e micotoxicológicos dos pães

produzidos e que os produtos são seguros para o consumo por não apresentarem

AFB1 e OTA.

Palavras-chaves: Panificação. Fungos. Aflatoxina B1. Ocratoxina A. CLAE.

ABSTRACT

The bread has been present in the life of men since its beginnings. In a

general manner, it has an expressive presence in tables of Brazilians, even as a

main meal. Many ingredients used to prepare breads offer contamination risks by

fungi. Among them, the flour can disseminate fungal conidia in the industrial

environment. In ideal conditions of humidity and temperature, it can produce

mycotoxins with immunosuppressant, allergenic, teratogenic, mutagenic and

carcinogenic proprieties. The main genus contaminants of food which produce

mycotoxins are: Aspergillus, Penicillium and Fusarium. The purpose of this study was

to verify mycological and mycotoxicological aspects of hot dog breads influenced by

wheat flour quality. Collection of wheat flour and hot dog breads (made with the same

wheat flour samples) at two bakeries in Teresina, PI was made weekly. This

procedure was repeated during 15 weeks in each establishment researched, with 30

samples of flour and 30 breads, in a total of 60 experimental units. The variables

evaluated were: ambient temperature, air relative humidity (RH), water activity (aw);

filamentous fungi and yeasts plate counts; isolation and identification of

mycotoxigenic genres; toxigenic profile of fungal species by thin layer

chromatography (TLC), and detection of aflatoxin B1 (AFB1) and ochratoxin A (OTA)

by high performance liquid chromatography (HPLC). Cell count of filamentous fungi

and yeast from the wheat flour and hot dog breads from bakery “A” were similar

(P>0,05).However, at bakery “B” the fungal contamination of breads was higher than

of wheat flour. From the analyzed samples, 66 strains of filamentous fungi were

isolated belonging to eight genus. It was observed that the variety of fungi was higher

in the wheat flour than in breads. There was no detection of strains of

Aspergillusfrom the Flavi and Nigrisections with potential capacity for production of

AFB1 and OTA. From the 60 samples analyzed from the hot dog breads and wheat

flour AFB1 and OTA were not detected. In conclusion, the quality of wheat flour

influences mycological and mycotoxicological aspects of breads produced and that

the other products are safe for consumption, as they do not present AFB1 and OTA.

Keywords: Bakery. Fungi. Aflatoxin B1. Ochratoxin A. HPLC.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1 Estruturas químicas das principais

aflatoxinas.....................................................................................

27

Figura 2 Estrutura química da ocratoxina

A....................................................................................................

29

Figura 3 Esquema de inoculação e incubação das cepas do gênero

Aspergillus nos meios CYA, MEA e CY20S em duas condições

de temperaturas (25 e 37 °C)........................................................

34

Figura 4 Esquema de inoculação e incubação das duas cepas do gênero

Penicillium a serem identificadas nos meios CYA, MEA e G25N

em três regimes de temperatura (5, 25 e 37°C)............................

35

Figura 5 Esquema de incubação das cepas de gênero Fusarium nos

diferentes meios de cultivo até sua identificação final...................

36

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 Principais espécies fúngicas toxigênicas e micotoxinas de

importância mundial...................................................................... 25

Tabela 2 Classificação das micotoxinas em grupos conforme a potencial

carcinogênico em seres humanos................................................ 26

Tabela 3 Valores médios de atividade de água em farinha de trigo e pães

tipo hot-dog produzidos em duas panificadoras de Teresina,

PI...................................................................................................

40

Tabela 4 Contagem média de fungos filamentosos e leveduras em farinha

de trigo e pão tipo hot-dog adquiridos em panificadoras de

Teresina, PI...................................................................................

41

Tabela 5 Ocorrência (%) de fungos filamentosos isolados em amostras

de farinha de trigo e pão tipo hot-dog adquiridas em

panificadoras de Teresina, PI........................................................

42

Tabela 6 Densidade relativa das espécies de Aspergillus, Penicillium

e Fusarium isoladas em amostras de farinha de trigo e pães

tipo hot-dog adquiridos em panificadoras de Teresina,

PI............................................................................................. 44

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

a.C Antes de Cristo

aw Atividade de Água

ABIP Associação Brasileira da Indústria de Panificação e Confeitaria

AF Aflatoxinas

AFB1 Aflatoxina B1

AOAC Association of Analytical Communities

ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária

BDA Agar Batata Dextrose

BLA Agar Folhas de Bananeira

CCD Cromatografia de Camada Delgada

CLAE Cromatografia Líquida de Alta Eficiência

CL-EM Cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas

CV Coeficiente de variação

CO2 Gás carbônico

CY20S Extrato de Levedura Czapek 20% Sacarose

CYA Agar Extrato de Levedura Czapek

DON Deoxinivalenol

DRBC Dichloran Rose Bengal Cloranfenicol

ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay

FAO Food and Agriculture Organization of the United Nations

FIB Food Ingredients Brasil

g Grama

G25N Ágar Glicerol Nitrato 25%

IARC Agência Internacional Para Pesquisa Sobre o Câncer

IBGE Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística

kg Quilograma

LMT Llimites Máximos Tolerados

LOD Limite de detecção

MEA Ágar Extrato de Malte

mg Miligrama

mL Mililitro

ng Nanograma

nm Nanômetro

NUEPPA Núcleo de Estudos, Pesquisas e Processamento de Alimentos

OPAS Organización Panamericana de la Salud

OTA Ocratoxina A

OTB Ocratoxina B

OTC Ocratoxina C

RDC Resolução de Diretoria Colegiada

SENAI Serviço Nacional de Aprendizagem Industrial

SNA Agar Spezieller Nalvistoffarmer

T2 Toxina T-2

UFC Unidade Formadora de Colônia

UFPI Universidade Federal do Piauí

URA Umidade Relativa do Ar

UV Ultravioleta

ZEA Zearalenona

μL Microlitros

% Percentual

°C Grau Celcius

λ Comprimento de onda

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO.................................................................................................. 14

2 OBJETIVOS......................................................................................................

16

2.1 Objetivo Geral................................................................................................

2.2 Objetivos Específicos.....................................................................................

16

3 REVISÃO DE LITERATURA............................................................................ 17

3.1 Pão................................................................................................................. 17

3.1.1 Histórico do pão.......................................................................................... 17

3.1.2 Consumo de pães no Brasil........................................................................ 18

3.1.3 Tipos de pães.............................................................................................. 19

3.1.4 Ingredientes da panificação........................................................................ 19

3.1.4.1 Ingredientes essenciais............................................................................ 20

3.1.4.2 Ingredientes não essenciais..................................................................... 21

3.1.5 Interferência do trigo na micobiota dos pães............................................. 22

3.2 Fungos e micotoxinas.................................................................................... 23

3.2.1 Aflatoxinas................................................................................................... 26

3.2.2 Ocratoxinas................................................................................................. 28

3.3 Análise de micotoxinas em alimentos............................................................ 29

3.4 Legislação para micotoxinas.......................................................................... 31

4 MATERIAL E MÉTODOS................................................................................. 32

4.1 Coleta das amostras...................................................................................... 32

4.2 Temperatura ambiental e umidade relativa do ar (URA)................................ 32

4.3 Análise da atividade de água (aw)................................................................. 32

4.4 Contagem de fungos filamentosos e leveduras............................................. 33

4.5 Isolamento e identificação fúngica................................................................. 33

4.6 Detecção e quantificação de AFB1 e OTA por Cromatografia Líquida de

Alta Eficiência (CLAE) ......................................................................................... 36

4.6.1 Extração e purificação dos extratos............................................................ 36

4.6.2 Condições cromatográficas para determinação e quantificação de 37

AFB1....................................................................................................................

4.6.3 Condições cromatográficas para determinação e quantificação de

OTA.................................................................................................................... 38

4.7 Análise Estatística.......................................................................................... 38

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO........................................................................ 39

6 CONCLUSÃO................................................................................................... 46

REFERÊNCIAS.................................................................................................... 47

14

I INTRODUÇÃO

O pão (do latim “panis”) está presente na vida do homem desde os seus

primórdios, é um produto bastante consumido, especialmente pelas populações

ocidentais. Basicamente, é resultado do cozimento da massa feita com farinha de

trigo, água, fermento e sal.

Ao longo do tempo, o preparo de pães foi aperfeiçoado, ganhando novas

formulações, formas e processos, com acréscimo de ingredientes que melhoraram

as características da massa e a qualidade do produto final. Para estas finalidades,

podem ser acrescentados os seguintes ingredientes: gorduras vegetais, açúcares,

ovos, emulsificantes, agentes oxidantes, enzimas, frutas, doces e especiarias

conforme a criatividade do panificador. Deste modo, os pães são muito apreciados

devido à sua aparência, aroma, sabor, preço e disponibilidade, considerando-se os

hábitos alimentares observados entre as diferentes culturas e religiões.

Por ser rico em carboidratos, esse alimento serve como fonte de energia,

sendo consumido por quase todas as classes sociais, desde complemento alimentar

nas populações com maior poder aquisitivo até como única fonte de alimento, nas

famílias de menor renda. De uma forma geral, tem presença expressiva na mesa

dos brasileiros no café da manhã, sendo também muito consumido em lanches ou

até mesmo como refeição principal.

A maior parcela de produção e venda dos pães concentra-se em padarias ou

panificadoras. Essas empresas fazem parte da história e cultura da humanidade e

difundiram-se no Brasil a partir da colonização, quando portugueses e espanhóis

trouxeram hábitos alimentares da Europa. De um modo geral, as padarias

caracterizam-se por serem empreendimentos de pequeno porte com sistemas de

produção artesanais, o que pode favorecer a contaminação dos produtos no

ambiente de processamento.

Muitos ingredientes usados no preparo de pães conferem riscos de

contaminação por fungos filamentosos nos produtos de panificação. Dentre eles, a

farinha pode estar disseminando conídios fúngicos no ambiente industrial. A

princípio o processo de cocção dos pães seria suficiente para eliminar os micro-

organismos presentes na massa, entretanto, pode-se observar que certos pães

apresentam desenvolvimento de fungos após estocagem prolongada. Em grande

parte a contaminação posterior ao cozimento pode ocorrer pela exposição indevida

15

às condições ambientais da panificadora durante o resfriamento, fatiamento e

embalagem, sendo este o principal ponto crítico de contaminação do produto, porém

os conídios fúngicos podem resistir à temperatura de cocção e nas condições

adequadas se desenvolverem. Assim, os fungos quando se desenvolvem nos pães

causam alterações sensoriais e prejuízos pelo consumo de nutrientes essenciais.

Convém ressaltar que os efeitos deletérios da elevada população fúngica

encontrada no interior das padarias não se restringem apenas à deterioração de

seus produtos, mas também à saúde dos trabalhadores do estabelecimento, pelo

desenvolvimento de afecções bronco pulmonares de risco alérgico e infeccioso, pela

exposição à poeira da farinha. Ademais, quando os fungos micotoxígenos presentes

em alimentos encontram condições ideais de umidade e temperatura, podem

produzir micotoxinas que têm propriedades imunossupressoras, alergênicas,

teratogênicas, mutagênicas e carcinogênicas.

Deste modo, o controle de fungos e seus metabólitos tóxicos deve ser

realizado eficazmente desde a farinha até a expedição dos pães, visto que a maioria

das micotoxinas são compostos termorresistentes, podendo permanecer ativas

mesmo após a cocção, expondo os consumidores a enfermidades quando ingerem

esse alimento.

16

2 OBJETIVOS

2.1 Objetivo Geral

Verificar os aspectos micológicos e micotoxicológicos de pães tipo hot-dog

influenciados pela qualidade da farinha de trigo.

2.2 Objetivos Específicos

Efetuar a contagem dos fungos filamentosos e leveduras presentes em

farinhas de trigo e pães tipo hot-dog;

Isolar e identificar espécies do gênero Aspergillus, Penicillium e

Fusarium presentes em farinhas de trigo e pães tipo hot-dog;

Caracterizar o perfil toxígeno das espécies fúngicas isoladas;

Detectar e quantificar aflatoxina B1 (AFB1) e ocratoxina A (OTA) em

farinhas de trigo e pães tipo hot-dog.

17

3 REVISÃO DE LITERATURA

3.1 Pão

A Resolução RDC nº 263, de 23 de setembro de 2005 da Agência Nacional

de Vigilância Sanitária define o pão como: “o produto obtido da farinha de trigo e/ou

outras farinhas, adicionados de líquido, resultantes do processo de fermentação ou

não e cocção, podendo conter outros ingredientes, desde que não descaracterizem

os produtos. Podem apresentar cobertura, recheio, formato e textura diversos”

(BRASIL, 2005a). A Resolução determina ainda que “os produtos também possam

ser designados por denominações consagradas pelo uso”, deste modo, o pão tipo

hot-dog no Brasil também é denominado como: “pão doce comum”, “pão careca” ou

“pão para lanches” e no Piauí é conhecido como “pão massa fina”.

3.1.1 Histórico do pão

A história do pão, praticamente acompanhou a evolução do homem, pois

desde que deixou de ser nômade o pão passou a ser um de seus principais víveres

e foi o primeiro alimento processado por mãos humanas a partir de matéria-prima

natural. Estima-se que o pão tenha surgido na pré-história há cerca de 10.000 anos

a.C e que a princípio fosse uma simples mistura de grãos e água que era cozida em

pedras quentes. Como na época não havia fermento para fazê-la crescer e melhorar

suas características sensoriais, os pães eram achatados, com consistência dura por

fora e macia por dentro (SENAI, 2008).

Cerca de 6.000 anos a.C, os egípcios descobriram acidentalmente o

processo da fermentação, a qual tornava o pão mais semelhante ao consumido

atualmente. Presume-se que um pedaço de massa contendo farinha e água tenha

sido exposta ocasionalmente ao ambiente e tenha sido fermentado por bactérias

oportunistas, acarretando incremento do volume da massa, tornando o pão mais

macio (CANELLA-RAWALS, 2005).

Por volta de 250 a.C, as trocas comerciais beneficiaram a chegada do pão à

Europa, e na mesma época surgiam às primeiras padarias como estabelecimentos

comerciais na Grécia. No século II d. C., o pão transformou-se em um dos principais

alimentos da Roma Antiga. Após este período, a indústria de “padarias públicas”

18

progrediu e o hábito de consumir pães se amplificou pela maior parte da Europa

(BAUMGARTEN, 2007).

Na Idade Média, com a queda do Império Romano, as padarias públicas

fecharam e a produção de pães voltou a ser caseira. Assim, as pessoas voltaram a

consumir pão sem fermento. No século XII, as atividades foram retomadas na

França, e no século XVII o país se destacou mundialmente na fabricação de pães, a

partir do aprimoramento das técnicas e receitas de panificação (BAUMGARTEN,

2007). A técnica de fermentação biológica foi utilizada exclusivamente na fabricação

de pães até o século XIX, posteriormente foram também utilizados fermentos

químicos para preparação de produtos de panificação.

No Brasil o consumo de pães ocorreu desde o início da colonização no

século XVI, devido aos hábitos alimentares dos portugueses. Todavia, foi apenas no

século XX que os imigrantes italianos se encarregaram de expandir a panificação no

território nacional (QUEIROZ; LOPES, 2007), especialmente em São Paulo.

No Brasil e em outras partes do mundo, a produção de trigo se expandiu

juntamente com a urbanização e na década de 1950, houve um grande impulso à

indústria de derivados do trigo, fortalecendo ainda mais o hábito de consumo de

pães. A partir da década de 1990 as padarias se modernizaram e muitas delas estão

em estágio de transição, procurando se adaptar à nova realidade do consumo

variado de produtos panificados (SENAI, 2008).

Em 2012, a panificação brasileira foi um dos setores mais crescentes da

economia, permanecendo entre os seis maiores segmentos industriais do Brasil.

Sua participação no setor industrial de produtos alimentícios foi de 36,2%, e na

indústria de transformação 7,0%. Incorporam em torno de 63 mil panificadoras em

todo o país que atendem em média 44 milhões de pessoas por dia. Além disso, em

2012 os negócios neste setor geraram 802 mil empregos diretos e 1,85 milhões de

empregos indiretos (ABIP, 2012).

3.1.2 Consumo de pães no Brasil

O consumo brasileiro de pães estimado de 2008 a 2009 foi de 53,4

kg.habitante-1.ano-1, (IBGE, 2011). Rotineiramente os brasileiros consomem: pão

doce, pão de hot-dog, pão de leite, pão de hambúrguer, pão sovado e bisnaguinhas.

A preferência por estes pães é devida a maciez e facilidade de mastigação,

19

associado ao uso de recheios cremosos como: manteiga, requeijão, maionese,

margarinas, patês, geléias e outros (ESTELLER et al., 2004).

Os pães são bem aceitos por pessoas de qualquer faixa etária e diferentes

classes sociais, são nutritivos (CATANHO; MACIEL, 2005), principalmente pelos

carboidratos, além disso, fornecem lipídeos, proteínas, minerais e vitaminas: B1, B2,

C, E, D, A e K (GUTKOSKI et al., 2007).

3.1.3 Tipos de pães

Devido à ampla variedade de hábitos culturais e alimentares, foram

desenvolvidas preparações e apresentações diversificadas de pães, criando uma

diversidade de massas, receitas e formulações, que foram classificadas por Costa

(2009) em quatro grupos principais de massa:

Salgada ou de sal: É a massa utilizada no preparo de: pão francês,

italiano, bisnagas e baguetes. São crocantes, possuem volume extenso e miolo

macio. Pode ainda receber temperos diversos no interior da massa ou apenas na

superfície.

Doce: é a massa usada no preparo de pão doce, pão de leite, tipo hot-

dog e tipo hambúrguer. Possui casca fina e marrom, miolo macio e denso, com

sabor levemente adocicado e aroma característico.

Massa para confeitar: É a massa típica das roscas, panetones e

chineques, que podem incorporar frutas em seu interior ou superfície e apresentar

coberturas de sabores variados.

Massa especial: É a massa das broas e dos pães de forma. São

confeccionados em assadeiras especiais e exigem grande mão de obra. Pode ser

preparada com diversos tipos de farinha ou produtos similares, apresentando como

aspectos principais as dimensões e o formato, crosta levemente crocante e miolo

bem firme.

3.1.4 Ingredientes da panificação

Os produtos obtidos da panificação são compostos por ingredientes

diversificados, que exercem funções distintas no processo de formação da massa.

Esses constituintes estão distribuídos em diferentes proporções de acordo com o

20

tipo de pão que está sendo produzido ou da finalidade da formulação da massa. De

um modo geral, para fabricação de pães, os ingredientes podem ser divididos em

dois grupos: os essenciais: farinha de trigo; água; fermento e sal e os não

essenciais: açúcar; gordura; leite; ovos; dentre outros (WALLY, 2007).

3.1.4.1 Ingredientes essenciais

A farinha de trigo é amplamente utilizada para elaboração de diversos

alimentos, tais como: pães, biscoitos, bolos e massas em geral, sendo definida

como: “produto elaborado com grãos de trigo (Triticum aestivum L.) ou outras

espécies de trigo do gênero Triticum, ou combinações por meio de trituração ou

moagem e outras tecnologias ou processos” (BRASIL, 2005b).

No Brasil, o consumo da farinha de trigo distribui-se entre panificação (55%),

consumo doméstico (11%), indústria de massas (17%), indústria de biscoitos

(13,0%), e outros segmentos (4,0%) (COSTA, 2009). São disponibilizadas para

consumo em diversos tipos de apresentações: farinhas refinadas brancas e

amarelas (especiais), farinhas integrais (grossa e fina), farelo, fibra, gérmen, flocos,

grão inteiro, triguilho (grão triturado). A legislação brasileira classifica a farinha de

trigo em: “Tipos 1, Tipo 2 e Integral”, conforme a granulometria e os teores de: cinza,

proteína e umidade (BRASIL, 2005b).

A qualidade da farinha de trigo depende das seguintes características do

grão: composição centesimal, propriedades estruturais e microbiota (MOUSIA et al.,

2004). De um modo geral, a farinha é composta por: carboidrato (70,0 a 75,0%),

água (12,0 a 14,0%), proteínas (8,0 a 16,0%), lipídeos (2,0%), cinzas (1,0%) e

outros constituintes menores como polissacarídeos não amiláceos (2,0 a 3,0%).

Essa composição pode variar de acordo com a cultivar e grau de extração do grão

de trigo (MATUDA, 2008).

O principal carboidrato presente na farinha de trigo é o amido, constituído de

76% de amilopectina e 24% de amilose. O amido é importante para formação do

miolo dos pães e apresenta-se em forma de grânulos, sendo seu tamanho e formato

característicos da origem botânica. Sob a ação da amilase são formados açúcares

que servem de substrato para as leveduras durante o processo de fermentação

(AQUINO, 2012).

As proteínas da farinha de trigo têm papel fundamental à formação da massa

21

do pão, sendo a maior porcentagem destas compostas pelo glúten (MATUDA, 2008)

que é formado quando as proteínas da farinha entram em contato com a água. O

glúten confere viscoelasticidade da massa, ajuda na formação da estrutura do miolo

(GALLAGHER et al., 2004) e favorece a retenção do gás que aumenta o volume da

massa (DEMIRKESEN et al., 2010). Essas proteínas podem ser classificadas como

solúveis e insolúveis. As primeiras, albumina e globulina, representam 15% do total e

não formam o glúten; e as segundas, gliadina e gluteína, que constituem 85% das

proteínas conferem as propriedades de panificação da farinha. A glutenina é

responsável pela coesão e elasticidade da massa e a gliadina pela extensibilidade e

viscosidade (ESTELLER, 2004; MATUDA, 2008).

Para formação da massa dos produtos de panificação é imprescindível a

utilização de água, visando hidratar as proteínas da farinha de trigo para a formação

da rede de glúten. Este ingrediente favorece a homogeneização dos componentes

da massa, permitindo que durante o processo de cocção, ocorra a gelatinização do

amido e consequente aumento do volume do pão (LÉON; ROSELL, 2007).

O fermento biológico a base da levedura Saccharomices cerevisiae é o mais

utilizado em panificação para produzir gás carbônico (CO2) a partir da conversão de

açúcares, acarretando o incremento da massa. Além de produzir CO2, o fermento

também exerce influência sobre as propriedades reológicas da massa, tornando-a

mais elástica e porosa, permitindo maior incorporação de nutrientes após o

cozimento. Outro ingrediente importante é o sal que contribui para acentuar o sabor

melhorar a aparência do pão, aumentar a estabilidade da rede de glúten, controlar a

atividade de água (aw) da massa e conservar o produto final por sua ação

bactericida (FIB, 2009).

3.1.4.2 Ingredientes não essenciais

A adição de açúcar na massa favorece a retenção da umidade, facilita a

adaptação das leveduras ao processo de fermentação; acentua o sabor e o aroma e

desenvolve coloração característica à crosta. Geralmente é empregada a sacarose,

podendo também ser usado xarope de milho ou açúcar invertido (GUERREIRO,

2006).

Geralmente, as gorduras hidrogenadas têm sido mais utilizadas para o

preparo da massa de pães, pois são manuseadas com facilidade, são mais estáveis

22

e conferem melhores características tecnológicas para os produtos de panificação

(PEREIRA, et al., 2004). As gorduras atuam como lubrificante da massa, conferindo

maciez e umidade ao pão. Contribuem para realçar características sensoriais: sabor,

cor e textura, além de auxiliar como aerador de produtos mais cremosos, permitindo

a incorporação de ar na massa e favorecem a manipulação da massa por reduzir a

viscosidade. Os ovos contribuem para conferir aspectos sensoriais ao produto final,

tendo as seguintes funções tecnológicas: participar da formação estrutural da

massa, incorporar ar, fornecer nutrientes diversos e emulsionar gordura com

ingredientes líquidos, distribuindo uniformemente a textura e o sabor nos produtos.

(FIB, 2009).

Em panificação geralmente o leite desengordurado e desidratado é usado

para favorecer a absorção de água na farinha, melhorar a estrutura do miolo e da

textura do pão, prolongar a vida de prateleira e aumentar o valor nutricional

(GUERREIRO, 2006).

3.1.5 Interferência do trigo na micobiota dos pães

A produção brasileira do trigo encontra-se em maior parte nas regiões Sul,

Sudeste e Centro-Oeste (BRASIL, 2014). No entanto, esta produção é insuficiente

para atender as exigências nacionais, ocasionando a importação de trigo. Os

principais fornecedores responsáveis por suprir a demanda de trigo do Brasil em

2013 foram os EUA, Argentina, Paraguai, Uruguai e Canadá, respectivamente

(ABITRIGO, 2013), que são regiões concentradas em zonas de clima temperado,

onde excesso de chuvas, aliado a temperaturas elevadas, favorece afecções e

pragas aos grãos (COLLARES, 2008), tornando-os mais vulneráveis à contaminação

por fungos.

Neste contexto, grãos de trigo são facilmente contaminados no campo, antes

mesmo da colheita ou durante o armazenamento, podendo prevalecer essa

contaminação em seus subprodutos após o processamento (SIEGEL; BABUSCIO,

2011), uma vez que o processo de moagem do grão de trigo favorece a

contaminação ambiental por fungos na farinha resultante com valores que podem

variar entre 102 e 104 UFC/g (ABDULLAH, et al, 1998; WEIDENBÖRNER, et a.,

2000, BERGHOFER et al, 2003; USUOGE et al., 2011; VICTOR et al., 2013).

Assim, condições inadequadas de armazenamento podem propiciar o

23

desenvolvimento fúngico e a síntese de micotoxinas na farinha (ALDRED; MAGAN,

2004).

Deste modo, a farinha é um dos principais veículos de contaminação do

produto final, bem como podem conferir risco aos trabalhadores que lidam com esta

matéria prima (BAATJIES et al., 2010), pois a introdução de conídios fúngicos no

ambiente das panificadoras, podem também contaminar os pães. O monitoramento

inadequado destas matérias-primas pode permitir que uma contaminação prévia por

micotoxinas na cadeia produtiva, chegue ao consumidor final (CRUZ, 2010;

DUARTE, et al., 2010, BOEIRA, 2012).

Ressalta-se que o processo de fermentação e a cocção podem não ser

eficientes para a inativação de micotoxinas que possam estar presentes no pão, pois

grande parte das micotoxinas tem um grau de termoestabilidade, bem como, durante

o processo de fermentação, as enzimas dos micro-organismos utilizados são

insuficientes para inativar as toxinas presentes (VALLE-ALGARRA et al., 2009).

3.2 Fungos e micotoxinas

Fungos são organismos eucarióticos cujos núcleos são dispersos em um

micélio continuo ou septado e nutrição obtida por absorção. São organismos

saprofíticos, parasitas facultativos ou biotróficos, podem ser unicelulares (leveduras)

ou multicelulares (fungos filamentosos). Localizam-se em abundância no solo, na

água e nos vegetais e se reproduzem por meios de ciclos teleomorfos e anamorfos

(TRABULSI et al., 2008). A maioria dos fungos é aeróbia estrita, contudo alguns

degradadores de grãos armazenados podem crescer em atmosfera contendo

somente 0,1 a 0,2% de oxigênio, ou em atmosfera contendo mais de 80% de dióxido

de carbono (TANIWAKI et al., 2009).

Esses micro-organismos desempenham papel significativo na vida humana

atuando como biodegradadores naturais no ambiente, no preparo de alimentos e

bebidas, na fabricação de antibióticos, e como fontes de álcoois, acetona e enzimas.

Todavia, podem ser indesejáveis quando colonizam os alimentos no campo

(fitopatogênicos) ou durante o armazenamento (saprófitos). Nesses momentos os

fungos liberam enzimas nos tecidos vegetais alterando as estruturas básicas e

formando produtos metabólicos que modificam características sensoriais. Algumas

espécies fúngicas têm capacidade de produzir e secretar compostos de baixo peso

24

molecular referidos como "metabólitos secundários" ou "micotoxinas" (BHAT et al.,

2010) que têm potencial toxicológico, podendo causar doenças ou morte quando

ingeridas ou inaladas pelo homem e os animais (BENETT; KLICH, 2003).

Os principais gêneros de fungos toxigênicos de campo são: Fusarium,

Alternaria e Cladosporium e os de armazenamento, Aspergillus e Penicillium

(ROGRÍGUEZ, 2010; DRUMMOND, 2012). É importante ressaltar que a presença do

fungo toxigênico em um substrato não implica necessariamente a presença de

micotoxinas, visto que apenas uma pequena porcentagem de cepas fúngicas possui

a capacidade genética de sintetizar micotoxinas e também a produção destes

metabólitos ocorre somente sob estritas condições ambientais (RODRÍGUEZ, 2010).

Embora não haja correlação direta entre o crescimento fúngico e a síntese

de micotoxinas, a prevenção do crescimento de fungos conduz eficazmente a

prevenção do acúmulo desses metabólitos tóxicos (GARCIA et al., 2009), uma vez

que elevadas contagens fúngicas são consideradas indicativo da presença de

micotoxinas no alimento (FAO, 2004).

O crescimento de fungos em alimentos e a produção de micotoxinas são

influenciados por fatores físicos, químicos e biológicos: atividade de água (aw),

temperatura, umidade relativa do ar, presença do patógeno em culturas sensíveis,

integridade física dos grãos, estresse causado na planta por condições climáticas

extremas, presença de invertebrados, composição do substrato e as condições de

armazenagem inadequadas (PRANDINI et al., 2009; GIMENO; MARTINS, 2011).

Dentre esses fatores, aw, umidade relativa do ar e temperatura são os principais

determinantes do crescimento fúngico (BOURAS et al., 2009; GARCIA et al., 2011).

Existem mais de 100 espécies fúngicas micotoxígenas, que podem produzir

mais de 500 diferentes tipos de micotoxinas, sendo algumas espécies produtoras de

mais de um tipo de toxina, que podem ser encontradas simultaneamente em um

único produto, assim como uma mesma micotoxina pode ser produzida por

diferentes espécies fúngicas. Os principais gêneros contaminantes de alimentos

produtores de micotoxinas são: Aspergillus, Penicillium e Fusarium (PEREIRA et al.,

2005; ROSA et al., 2006; SIMAS et al., 2007; SKRBIC et al., 2011) e podem ser

observados na Tabela 1.

25

Tabela 1 – Principais espécies fúngicas toxigênicas e micotoxinas de importância mundial.

Espécie de fungo Micotoxinas

Aspergillus parasiticus Aflatoxinas B1, B2, G1 e G2, Aflavininas, Ácido aspergílico, Ácido Kójico

Aspergillus flavus Aflatoxinas B1 e B2, Ácido ciclopiazônico, , Aflavininas, Ácido aspergílico, Ácido Kójico, Paspalininas

Aspergillus ochraceus Ochratoxina A, Ácido penicílico, Xantomegnina, Viomeleina, Ácido Kójico

Aspergillus candidus Candidulina, Terfenilina, Xantoacina, Ácido Kójico

Aspergillus terreus Citreoviridina, Citocalasina, Citrinina, Patulina, Ácido terréico, Citreoviridina

Penicillium verrucosum Ochratoxina A, Citrinina

Penicillium roqueforti Patulina, Ácido penicílico, Roquefortina

Penicillium citrinum Citrinina

Penicillium viridicatum Xantomegnina, Viomeleim, Vioxantina

Fusarium verticillioides Fumonisina, Bovericina

Fusarium graminearum Deoxinivalenol, Zearalenona

Fusarium moniliforme Fumonisina B1

Fusarium proliferatum Fumonisina, Moniliformina, Bovericina, Fusaproliferina

Fonte: Pitt; Hocking, 2009; Algarra, 2010.

As micotoxinas mais frequentemente estudadas e de maior toxidade são:

aflatoxinas (AF), ocratoxina A (OTA), fumonisinas, deoxinivalenol (DON),

zearalenona (ZEA), toxina T-2 (T2) e outros tricotecenos (LAZICKA;

ORZECHOWSKI, 2010; SALEM; AHMAD, 2010; GIMENO; MARTINS, 2011), que

possuem certa estabilidade durante a maior parte das etapas de processamento

térmico de alimentos (FERRAZ et al., 2010; MANDA et al., 2009).

Entre as micotoxinas, as AF e OTA possuem maior preocupação, devido à

frequente ocorrência em alimentos e seus efeitos severos sobre a saúde humana e

animal (COPETTI et al., 2012). Alimentos com alto teor de carboidratos são mais

susceptíveis à multiplicação fúngica com produção de micotoxinas (IAMANAKA et

al., 2010), dentre eles o trigo, milho, arroz, aveia, nozes, leite, queijo, amendoim e

algodão (SOLEIMANY et al., 2012; SIEGEL; BABUSCIO, 2011).

O consumo de alimentos contaminados com micotoxinas tem sido associado

à micotoxicoses (GARCIA et al., 2011), devido as propriedades: imunossupressoras,

alergênicas, teratogênicas, mutagênicas e carcinogênicas (GARCIA et al., 2009;

KHOMUTOV et al., 2011). Os efeitos tóxicos dependerão da micotoxina ingerida, em

concentrações que variam de micrograma a miligrama por quilo (ONO et al., 2004).

26

A Agência Internacional para a Pesquisa do Câncer (IARC, 1993) classifica as

micotoxinas quanto à carcinogenicidade em três grupos, demonstrados na Tabela 2.

Tabela 2 – Classificação das micotoxinas em grupos conforme a potencial carcinogênico em seres humanos.

Grupo Micotoxina

1 Carcinogênicas Aflatoxinas

2B Possivelmente carcinogênicas Ocratoxina A e fumonisinas

3 Não carcinogênicas Tricotecenos e zearalenona

Fonte: IARC (1993)

3.2.1 Aflatoxinas

Os estudos sobre as AF iniciaram-se na Inglaterra em 1960, a partir da

ocorrência de surtos epizoóticos, com óbito de aproximadamente: 100.000 perus,

20.000 patos e centenas de outras aves de criações domésticas. Inicialmente

quadro clínico foi denominado “Doença X dos Perus” por ter causa desconhecida, no

entanto, após análises microbiológicas e químicas, foi detectada a presença de

Aspergillus flavus no amendoim procedente do Brasil utilizado na ração das aves e

posteriormente foi constatado que esta espécie fúngica produzia um grupo de

compostos designados por aflatoxinas (BHAT et al., 2010; PAIVA, 2013).

Desde então, a partir de outras pesquisas científicas, considerou-se que as

AF seriam metabólitos tóxicos produzidos por cepas de fungos do gênero

Aspergillus, principalmente pelas espécies A. flavus, A. parasiticus e A. nomius

(KLICH; PITT, 1988; PITT, 1993; KLICH, 2007), que podem se desenvolver em

alimentos tais como: milho, amendoim, trigo, feijão, arroz, algodão, sorgo, frutas e

também em rações para animais (FACCA; DALZOTO, 2010; SCHMIDT-HEYDT,

2010). As espécies de Aspergillus: A. bombycis, A. arachidicola e A. pseudotamarii

também foram descritas como produtoras de AF (CALDERARI et al., 2013).

As AF consistem em um grupo com aproximadamente 20 substâncias,

classificadas na fluorescência sob luz ultravioleta a 365 nm e na sua mobilidade

durante a realização de cromatografia de camada delgada (CCD) em: B1 e B2 (blue-

azul) ou G1 e G2 (green-verde). Ainda pertencem a este grupo as aflatoxinas M1 e

27

M2 que são metabólitos hidroxilados das aflatoxinas B1 e B2, podendo estar

presentes no leite e produtos derivados obtidos de animais que ingeriram ração

contaminada com estas aflatoxinas (IAMANAKA et al., 2010).

São compostos tóxicos de natureza cristalina, termoestáveis, que podem

tolerar temperaturas até 200ºC, não sendo acometidas pelo frio. São relativamente

instáveis quando expostas à luz, particularmente à radiação ultravioleta. Além disso,

estas toxinas são solúveis em solventes polares, como clorofórmio e metanol e

insolúveis em gorduras e óleos, sendo destruídas na presença de amônia ou

hipoclorito (OPAS, 1983). As estruturas químicas das AF são muito semelhantes

entre si, por serem compostos químicos simples e de baixo peso molecular,

apresentando um núcleo central cumarínico ligado a uma estrutura bi-furanóide

(Figura 1) (KAWASHIMA, 2004; DRUMMOND, 2012).

Fonte: Zain, 2011.

Figura 1 – Estruturas químicas das principais aflatoxinas.

Dentre os efeitos tóxicos causados pelas AF, destaca-se a supressão do

sistema imunológico, por conseguinte, a diminuição da resistência a outras

enfermidades (TESSARI; CARDOSO, 2012). Devido à capacidade de ligar-se a

ácidos nucléicos e nucleoproteínas celulares, essas toxinas possuem elevada

toxicidade aguda e crônica, resultando em efeitos deletérios sobre a síntese de

proteína celular. A AFB1 é uma das substâncias mais tóxicas e sua ingestão por

humanos e animais pode causar hepatite tóxica, hemorragia, edema,

28

imunossupressão, carcinoma hepático e consequentemente a morte (NAKAI et al.,

2008; IDRIS et al., 2010; ZORZETE et al., 2011).

3.2.2 Ocratoxinas

A OTA foi isolada e identificada pela primeira vez em 1970, em amostras de

milho africano e está frequentemente relacionada a doenças renais de equinos e

suínos (MORGAVI; RILEY, 2007). Este metabólito secundário tóxico é produzido por

espécies de fungos filamentosos dos gêneros Aspergillus e Penicillium (ABREU et

al., 2011), podendo afetar seriamente o desempenho e bem-estar dos animais, além

de ocasionar efeitos deletérios em humanos, devido a suas propriedades

nefrotóxicas (MULLER et al., 2004). A toxina é produzida pelos fungos: A.

ochraceus, A. alliaceus, A. mellus, A. niger e outras espécies do gênero Aspergillus.

Espécies do gênero Penicillium também podem produzir OTA, como: P. verrucosum,

P. viridicatum, P. cyclopium e P. variable (DRUMMOND, 2012).

Comumente encontrada em produtos armazenados, a ocratoxina já foi

detectada em diversos tipos de alimentos e bebidas, como: milho, cevada, trigo e

derivados, feijão, amendoim, grãos de café, vinho, grãos de soja, centeio, arroz,

sorgo, castanha do Pará, cacau e chocolate (KUMAGAI et al, 2008; GIMENO;

MARTINS, 2011; TURCOTTE; SCOTT, 2011; COPETTI et al., 2013).

A estrutura química da OTA é um derivado diidro-isocumarínico ligado pelo

grupo 7-carboxílico à L-β-fenilalanina por um grupo amida, como pode ser

observado na Figura 2 (RINGOT et al., 2006). Esta toxina é bastante solúvel em:

solventes orgânicos polares e solução aquosa de bicarbonato de sódio, sendo

fracamente solúvel em água (ABRUNHOSA, 2008). São classificadas como

Ocratoxina A (OTA), Ocratoxina B (OTB) e Ocratoxina C (OTC), sendo estas duas

últimas com menor poder de toxicidade, a qual está relacionada com molécula de

cloro na fórmula química.

29

Fonte: Freire et al., 2007.

Figura 2 – Estrutura química da ocratoxina A.

A fluorescência refletida pelas ocratoxinas quando expostas à luz ultravioleta

a 365 nm é usada para a revelação em cromatografia de camada delgada (CCD) e

para quantificação por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE)

(ABRUNHOSA, 2008). Neste contexto, a OTA e a OTC refletem fluorescência verde,

e a OTB reflete azulada (EFSA, 2006).

A OTA é um composto de fácil absorção e lenta eliminação pelo organismo,

persistindo por longos períodos na corrente sanguínea, devido à elevada afinidade

por proteínas do plasma, como a albumina (BOZZA, 2010). Dentre os efeitos

nocivos à saúde, a OTA destaca-se como nefrotoxina com ação imunosupressora,

genotóxica, teratogênica e neurotóxica, sendo classificada pela Agência

Internacional para Pesquisa do Câncer como um possível carcinogênico para

humanos (IARC, 1993).

Embora seja inviável eliminar totalmente a presença das micotoxinas nos

alimentos, é necessário um monitoramento eficaz para reduzir seus teores na

alimentação humana e animal. O conhecimento e controle da contaminação por

micotoxinas e sua distribuição é alvo de produtores, fabricantes e órgãos

investigadores e regulamentadores, devido ao impacto econômico e à necessidade

de melhorar a segurança alimentar e a saúde humana (CHELI et al., 2008).

3.3 Análise de micotoxinas em alimentos

As micotoxinas encontram-se nos alimentos em concentrações bastante

variadas, podendo ocorrer em concentrações traço, assim exigem métodos

analíticos com boa sensibilidade e especificidade, para adequada detecção e

30

quantificação (IAMANAKA et al., 2010). As principais técnicas para a determinação

de micotoxinas são divididas em métodos de triagem e métodos quantitativos.

Os métodos de triagem geralmente são baseados em técnicas mais

sensíveis e menos específicas, quando comparadas às metodologias padrão,

propostas pela AOAC. São exemplos de técnicas de triagem a cromatografia de

camada delgada (CCD) ou técnicas imunoquímicas como ELISA (Enzyme-Linked

Immunosorbent Assay) (TURNER, 2009). Estes métodos têm por característica

serem rápidos, confiáveis, de fácil execução e viáveis economicamente. A CCD é

uma técnica na qual é possível analisar qualitativamente vários compostos

simultaneamente, podendo também ser empregada como método semi-quantitativo

(IAMANAKA et al., 2010). O método ELISA visa identificar um antígeno

desconhecido, por meio de kits que disponibilizam um anticorpo específico que se

ligará ao antígeno (toxina), gerando uma coloração de intensidade relacionada à

concentração de micotoxina presente (SILVA, 2009). Vale ressaltar que, para

propósitos legais, resultados positivos de um teste imunoquímico, devem ser

confirmados por um método de referência (AOAC, 2012).

As metodologias analíticas empregadas para determinação quantitativas de

micotoxinas em alimentos geralmente são compostas pelas etapas de extração,

purificação, separação, detecção, quantificação e confirmação (TURNER, 2009). As

principais técnicas quantitativas utilizadas são cromatografia líquida de alta eficiência

(CLAE), e mais recentemente a cromatografia líquida acoplada à espectrometria de

massas (CL-EM).

A CLAE utiliza colunas de fase normal ou fase reversa, usadas para

separação e purificação da toxina, dependendo da sua polaridade. Os principais

espectros de detecção utilizados são radiação ultravioleta (UV) e fluorescência. A

utilização da fluorescência natural de algumas micotoxinas, como as AF, OTA e

citrinina, permitem alta especificidade e sensibilidade para detecção das mesmas

(CIGIĆ; PROSEN, 2009). A CL-EM é uma técnica preconizada, pois além de

oferecer maior confiabilidade, minimiza o chamado efeito de matriz, na análise de

micotoxinas. Este método possibilita a análise simultânea de várias micotoxinas,

implementação dos chamados métodos multi-toxinas, minimizando a necessidade

de várias etapas na preparação da amostra (IAMANAKA et al., 2010). Contudo,

qualquer que seja o método escolhido, esse deve ser reprodutível e apresentar

31

baixo limite de detecção (LOD), visto que os limites máximos permitidos para tais

compostos tóxicos são muito baixos (ROCHA et al., 2008).

3.4 Legislação para micotoxinas

A preocupação com alimentos contaminados por micotoxinas é considerada

um problema global, e se caracteriza como um risco que afeta diretamente a

segurança dos alimentos. Para proteger os consumidores dos efeitos nocivos

causados pelas micotoxinas em alimentos in natura e processados, e até mesmo em

rações para animais de abate e de estimação, vários países criaram legislações

estabelecendo limites considerados seguros para diversos produtos que estão

predispostos a contaminação de micotoxinas. Aspectos científicos, tais como a

disponibilidade de informações toxicológicas, conhecimento acerca da distribuição

das micotoxinas nos alimentos, além da metodologia analítica são fatores que

acarretam à elaboração dessas legislações. Também, devem ser considerados os

aspectos políticos e econômicos, principalmente com relação aos interesses

comerciais e aos impactos na disponibilidade da oferta de alimentos (FREIRE et al.,

2007).

Os contaminantes de alimentos vêm sendo avaliados pelos comitês dos

órgãos mundiais desde 1970. As resoluções adotadas a partir destas comissões

estabelecem os níveis a serem seguidos pela comunidade internacional para o

comércio dos seus produtos (RIBEIRO, 2007). Informações coligidas até o ano de

2003 evidenciam que cerca de 100 países já dispõem de legislação para

regulamentar os limites de micotoxinas em alimentos e rações (FAO, 2003).

Em 2011, foi publicada no Diário Oficial da União, a Resolução RDC nº 7,

pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) que dispõe sobre limites

máximos tolerados (LMT) para micotoxinas em matérias-primas e alimentos prontos

para o consumo. Segundo essa legislação, em cereais e produtos de cereais, como

é o caso da farinha de trigo e do pão, o limite máximo tolerado de aflatoxina B1, B2,

G1 e G2, é de 5,0 μg.kg-1. Referente à OTA, esse limite corresponde a 20,0 μg.kg-1. A

legislação estabelece ainda o LMT de DON para farinha de trigo e produtos de

panificação (1250 μg.kg-1) e de zearalenona em trigo para posterior processamento

(400 μg.kg-1) (BRASIL, 2011).

32

4 MATERIAL E MÉTODOS

4.1 Coleta das amostras

As amostras de farinha de trigo e pão tipo hot-dog foram adquiridas em duas

panificadoras (“A” e “B”) localizadas no município de Teresina, PI. Esses

estabelecimentos foram selecionados aleatoriamente a partir do grupo de

panificadoras de médio porte cujos proprietários assinaram Termo de Aceite para

participação da pesquisa em questão. O pão tipo hot-dog foi selecionado para este

estudo, por ser um alimento de preço acessível à população, consumido diariamente

por pessoas de qualquer faixa etária em, pelo menos, uma das refeições.

Semanalmente, foi coletada assepticamente uma amostra com 300 g de

farinha de trigo retirada da embalagem que estavam em uso pela panificadora e

também, uma amostra com 300 g de pães tipo hot-dog que foram elaborados com a

mesma farinha de trigo que foi amostrada. Este procedimento foi repetido por 15

semanas em cada estabelecimento pesquisado, com 30 amostras de farinha e 30 de

pães, totalizando 60 unidades experimentais.

As amostras foram recolhidas, individualmente, e encaminhadas ao

Laboratório de Análise de Alimentos, do Departamento de Farmacologia do Centro

de Ciências da Saúde e ao Laboratório de Controle Microbiológico de Alimentos do

Núcleo de Estudos, Pesquisas e Processamento de Alimentos (NUEPPA) do Centro

de Ciências Agrárias (CCA) da Universidade Federal do Piauí (UFPI), para

realização das análises.

4.2 Temperatura ambiental e umidade relativa do ar (URA)

No início e no final das coletas, foram efetuadas medições da temperatura

ambiente e da umidade relativa do ar (URA) utilizando um termohigrômetro digital

Inconterm®.

4.3 Análise da atividade de água (aw)

Para análise foram realizadas em triplicata as análises da atividade de água

(aw) das amostras por meio de equipamento portátil, modelo PawKit digital, marca

33

Decagon®, previamente calibrado. De cada amostra foram retiradas porções

individuais com aproximadamente 10 g que foram transferidas para depósito plástico

próprio do aparelho. Em seguida, após acoplamento do depósito e estabilização, foi

realizada a leitura direta no painel, conforme instruções do fabricante.

4.4 Contagem de fungos filamentosos e leveduras

A contagem de fungos filamentosos e de leveduras, expressa em unidades

formadoras de colônias por grama de alimento (UFC.g-1), foi realizada segundo

metodologia de diluição decimal seriada em placas (PITT; HOCKING, 2009). No

laboratório, foi retirada assepticamente uma porção com 25,0 g de cada amostra

que, em seguida foi homogeneizada em 225,0 mL de água peptonada a 0,1%,

previamente esterilizada, para o preparo da diluição 10-¹. A partir desta foi retirada

uma alíquota de 1,0 mL para adicionar em 9,0 mL de solução salina formando a

diluição de 10-2 e depois, preparou-se a diluição de 10-3.

De cada diluição foi transferida uma alíquota com 0,1 mL para placas de

Petri, com meio de cultivo agar Dicloran Rosa de Bengala Cloranfenicol (DRBC) com

auxílio de alça de Drigalski esterilizada (KING et al., 1979). Em seguida, as placas

com DRBC foram incubadas a 25°C durante sete dias em estufas microbiológicas

com controle eletrônico de temperatura. Transcorrido tal período, todas as placas

foram observadas, sendo selecionadas para contagem aquelas que continham de 10

a 100 UFC.g-1 (DALCERO et al., 1997; DALCERO et al., 1998).

4.5 Isolamento e identificação fúngica

A identificação dos gêneros fúngicos foi realizada segundo Samson et al.

(2000), de acordo com suas características macrocroscópicas e microscópicas. As

colônias identificadas como Aspergillus spp. e Penicillium spp. foram subcultivadas

em tubos inclinados contendo Agar Extrato de Malte (MEA) e as de Fusarium spp.

foram repicadas em tubos com Agar Spezieller Nalvistoffarmer (SNA) e Agar Batata

Dextrose (BDA) para a posterior identificação das espécies.

As colônias do gênero Aspergillus spp. foram identificadas utilizando as

chaves de identificação descritas por Klich (2002) baseada na semeadura padrão

34

dos meios: Agar Extrato de Levedura Czapek (CYA) a 25°C e 37°C; Agar Extrato de

Levedura Czapek 20% Sacarose (CY20S) a 25°C e MEA a 25°C (Figura 3)

Posteriormente, em microtubos previamente esterilizados, preparou-se uma

suspensão de conídios em 0,5 mL de meio ágar semi-sólido constituído de 0,2% de

ágar-ágar e 0,05% de Tween® 80. Na sequência, uma agulha foi introduzida na

suspensão e o inóculo foi distribuído em três pontos equidistantes nas placas com

os diferentes meios e posteriormente foram incubadas por sete dias (PITT;

HOCKING, 2009). Em seguida, foram observadas as estruturas micromorfológicas e

as características macroscópicas das colônias fúngicas (diâmetro, textura, forma,

aspecto da superfície e do reverso, pigmentação dos conídios e pigmento solúvel,

produção e cor de exsudado) visando à identificação das espécies.

Fonte: Adaptado de Klich (2002).

Figura 3 – Esquema de inoculação e incubação das cepas do gênero Aspergillus nos meios CYA, MEA e CY20S em duas condições de temperaturas (25 e 37°C).

As colônias fúngicas pertencentes ao gênero Penicillium spp. foram

identificadas utilizando as chaves de identificação descritas por Pitt (2004),

baseadas na semeadura em três meios básicos: Agar Extrato de Levedura Czapek

(CYA) a 25°C, a 5°C e a 37°C; Agar Extrato de Malte (MEA) a 25°C; e Agar Nitrato

de Glicerol 25% (G25N) a 25°C (Figura 4). Para maior eficiência e aproveitamento

do sistema, inoculou-se as placas de Petri com duas cepas diferentes a serem

testadas; a preparação da suspensão de conídios e inoculação nos meios de cultivo

foi igual à utilizada para Aspergillus spp.

1 1

1

1 1

1

1 1

1

1 1

1

CYA 25ºC CYA 37ºC MEA 25ºC CY20S 25ºC

35

Fonte: Adaptado de Pitt (2004).

Figura 4 – Esquema de inoculação e incubação das duas cepas do gênero Penicillium a serem identificadas nos meios CYA, MEA e G25N em três regimes de temperatura (5, 25 e 37°C).

As colônias fúngicas isoladas pertencentes ao gênero Fusarium spp. foram

identificadas pelo método de diluição em placa recomendado por Booth (1971). Após

subcultivo em meio BDA, realizou-se o cultivo monospórico que consiste em recolher

pequena quantidade de micélio da colônia subcultivada e agitá-lo em tubo com cerca

de 10 mL de água destilada esterilizada. A suspensão é então vertida sobre placa de

Petri contendo ágar-ágar 1,5% e homogeneizado em movimentos em forma de “8”

sobre a bancada. O sobrenadante é descartado e a placa é incubada a temperatura

ambiente inclinada em ângulo aproximado de 45°.

Após período de 16 a 18 horas, as placas são examinadas por microscopia

(x 30) em busca de conídios germinados isolados. Um único conídio por vez é então

recortado e transferido para o meio Agar Batata Dextrose (BDA) e também para o

meio Agar Folhas de Bananeira (BLA), modificando a metodologia original que

emprega o meio Agar Folhas de Cravo (CLA), conforme Keller (2009). Após

incubação por sete a 14 dias (foto período de 12 horas de luz branca e 12 horas de

luz negra), (Figura 5) as colônias foram identificadas usando critérios microscópicos

e macroscópicos segundo a chave taxonômica de Nelson et al. (1983).

37 ºC

CYA

25ºC

1 1

1

CYA

25ºC

1 1

1

MEA 5ºC

CYA

1

2 2

1

2 2

2

MEA 2 2

2

G25N

1

2 2

1

CYA 1

2 2

1

36

Fonte: Adaptado de Nelson et al. (1983) e Keller (2009).

Figura 5 – Esquema de incubação das cepas de gênero Fusarium nos diferentes meios de cultivo até sua identificação final.

4.6 Detecção e quantificação de AFB1 e OTA por Cromatografia Líquida de Alta

Eficiência (CLAE)

4.6.1 Extração e purificação dos extratos

A extração e purificação dos extratos foram realizadas de acordo com a

metodologia descrita por Soares e Rodriguez-Amaya (1989) e modificada por

Teixeira et al. (2008). Para extração foram utilizados 25,0 g de amostra, na qual se

adicionaram 70,0 mL de metanol e 10,0 mL de solução de cloreto de potássio 4,0%.

Em seguida a amostra foi submetida à agitação em liquidificador doméstico por

cinco minutos. Após a homogeneização foram adicionados 75,0 mL de solução

clarificante (sulfato de amônio 30%) e 7,5 g de celite. Posteriormente, a amostra foi

submetida novamente a agitação por cinco minutos, seguido de repouso de 20

minutos. Em seguida, o extrato resultante foi filtrado com auxílio de papel de filtro

Whatman n° 4 (Whatman, Inc., Clifton, New Jersey, E.U.A.).

Do filtrado foi retirada uma alíquota de 50 mL para um frasco tipo Becker,

seguida de adição de 50 mL de água destilada, essa mistura foi transferida para um

balão de decantação com capacidade para 500 mL, ao qual foram adicionados 20

Subcultivo em meio BDA

Cultivo Monospórico

BLA BDA

Classificação

Incubação: 7 a 14 dias (24°C) Luz branca: 12 h Luz negra: 12h

Colônia crescida NSA

37

mL de clorofórmio, em seguida agitou-se manualmente por cinco minutos. Decorrido

esse tempo, foi aberta a torneira do balão para retirada do líquido decantado que foi

recolhido para um frasco tipo Erlenmeyer com capacidade para 50 mL, depois foram

adicionados 20 mL de clorofórmio ao balão e procedeu-se mais uma agitação

manual com posterior retirada do líquido decantado, de forma a obter 35 mL da fase

clorofórmica no frasco tipo Erlenmeyer.

Em seguida, o solvente foi evaporado em banho-maria a 60 °C por 15

minutos. O extrato seco resultante foi suspenso em 1,0 mL de clorofórmio e depois

homogeneizado em agitador tipo Vortex. Após, a suspensão foi acondicionada em

frasco âmbar com capacidade de 4,0 mL para posterior evaporação do solvente em

capela de fluxo laminar. O extrato seco resultante foi armazenado em freezer

doméstico (-18°C) até o momento da análise de AFB1 e OTA.

4.6.2 Condições cromatográficas para detecção e quantificação de AFB1

A detecção e quantificação de AFB1 dos extratos foram realizadas por

CLAE, em um cromatógrafo SHIMADZU® modelo Prominence com detector de

fluorescência (excitação: 360 nm e emissão: 460 nm) modelo RF-10AXL SUPER,

loop de 20 µL, de acordo com a metodologia proposta por Trucksess et al. (1994).

As separações cromatográficas foram realizadas por uma coluna de fase reversa de

sílica gel (150 x 4,6 mm id., 5,0 μm de tamanho de partículas, VARIAN®, Inc. Palo

Alto, EUA).

Inicialmente o extrato seco foi ressuspendido com 1000 µL de acetonitrila,

homogeneizado em agitador tipo Vortex, e filtrado com filtro Millex em polietileno

com membrana PTFE 0,22 µm de poro e 13 mm de diâmetro (MILLIPORE®). Em

seguida, foi retirada uma alíquota de 200 µL do extrato filtrado e acrescido de 700 µL

de solução derivatizante composta de ácido trifluoracético: ácido acético glacial:

água (20:10:70 v/v/v). A fase móvel utilizada foi acetonitrila: metanol: água (17:17:66

v/v/v) a uma vazão de 1,5 mL.min-1. A curva padrão foi construída em diferentes

níveis de padrão de AFB1: 5,0 ng/mL, 10,0 ng/mL, 20,0 ng/mL e 50 ng/mL (Sigma

Aldrich® Co., St. Louis, MO USA, pureza > 99%). O limite de detecção do método

analítico foi de 0,4 ng.g-1 e o limite de quantificação foi estabelecido como sendo três

vezes o limite de detecção (1,2 ng.g-1).

38

4.6.3 Condições cromatográficas para detecção e quantificação de OTA

A detecção e quantificação de OTA foram realizadas por CLAE em um

cromatógrafo SHIMADZU®, modelo Prominence com detector de fluorescência

(excitação: 330 nm e emissão: 440 nm) modelo RF-10AXL SUPER, loop de 20 µL,

conforme metodologia proposta por Scudamore e Mcdonald (1998). As separações

cromatográficas foram realizadas por uma coluna de fase reversa de sílica gel (150 x

4,6 mm id., 5,0 μm de tamanho de partículas, VARIAN®, Inc. Palo Alto, EUA).

Inicialmente o extrato seco foi ressuspendido com 1000 µL de metanol,

agitado em Vortex e filtrado com filtros Millex em polietileno com membrana PTFE

0,22 µm de poro e 13 mm de diâmetro (MILLIPORE®). A fase móvel utilizada foi

acetonitrila: água: ácido acético (57:41:2 v/v) a uma vazão de 1,0 mL.min-1. A curva

padrão foi construída em diferentes níveis de OTA: 5,0 ng/mL, 10,0 ng/mL, 20,0

ng/mL e 50 ng/mL (Sigma Aldrich® Co., St. Louis, MO USA, pureza > 99%). O limite

de detecção do método analítico foi de 0,02 ng.g-1 e o limite de quantificação foi

estabelecido como sendo três vezes o limite de detecção (0,06 ng.g-1).

4.7 Análise estatística

O delineamento experimental utilizado foi inteiramente ao acaso, com dois

tratamentos (farinha de trigo e pão tipo hot-dog) e 15 repetições caracterizadas por

semanas em que foram realizadas as coletas.

Os resultados das contagens de fungos filamentosos e leveduras foram

transformados em log10(x+1). As médias dos resultados quantitativos foram testadas

quanto a normalidade, em seguida foram submetidas à análise de variância e teste

de Wilcoxon Mann-Whitney pelo pacote estatístico SigmaStat® v.3,5 (Systat

Software, San Jose, CA, 2005) com significância de 5,0%.

39

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO

Para o preparo dos pães foi verificado que as duas panificadoras

pesquisadas utilizavam a mesma marca de farinha de trigo, envasadas em saco de

algodão com 25 kg. Durante o processamento, a farinha utilizada permanecia na

embalagem original acondicionada sob estrados de madeira em temperatura

ambiente na área de produção. Para a formulação dos pães tipo hot-dog as

panificadoras utilizavam como ingredientes: farinha de trigo, água, açúcar, fermento,

cloreto de sódio, ovos, margarina e leite em pó, em proporções diferenciadas.

Os teores médios da temperatura ambiente nas panificadoras “A” e “B”

foram respectivamente: 32,6°C ± 2,7 e 31,1°C ± 2,5; e da umidade relativa do ar:

43,6% ± 17,6 e 44,3% ± 11,4. Temperaturas entre 25ºC a 30ºC e umidade ambiental

superior a 75% contribuem para a multiplicação de fungos deterioradores de

alimentos (SINGH; CHAUHAN, 2013). Deste modo, embora os teores médios da

temperatura ambiente verificados nas duas panificadoras fossem favoráveis para

multiplicação fúngica, a umidade relativa do ar registrada nas mesmas pode ter sido

um dos fatores limitantes para o crescimento dos fungos presentes nas amostras.

Outro fator que influencia no desenvolvimento fúngico é atividade de água

presente no alimento. Nas panificadoras “A” e “B” os valores de aw das amostras de

farinha de trigo e dos pães foram semelhantes (P>0,05) (Tabela 3). Os menores

valores de aw que favorecem o desenvolvimento de fungos filamentosos xerofílicos

e de leveduras osmofílicas são: 0,65 e 0,60, respectivamente (FRANCO;

LANDGRAF, 2008).

Neste contexto, nas amostras de farinha de trigo os teores médios de aw

verificados não foram propícios à germinação fúngica, porém, seus conídios podem

estar inativos (LIMA et al., 2007; GASHGARI et al., 2010) e por isso, sobreviver nas

baixas concentrações de aw encontradas. Caso essas farinhas venham a ser

armazenadas em ambientes que favoreçam o aumento da umidade relativa do ar em

1,0%, os conídios inativos podem germinar e ocorrer a proliferação de fungos

presentes e dependendo do caso, a síntese de micotoxinas (CABAÑAS et al., 2008;

GASHGARI et al., 2010).

40

Tabela 3 – Valores médios de atividade de água em farinha de trigo e pães tipo hot-dog produzidos em duas panificadoras de Teresina, PI.

a letras iguais em colunas e linhas, resultados semelhantes (P>0,05) pelo teste de Mann-Whitney.

Produtos de panificação com valores elevados de aw podem favorecer a

multiplicação por fungos que estejam presentes na massa ou adquiridos pela

exposição ao ambiente durante a comercialização (FREIRE, 2011). Portanto, os

teores médios obtidos nos pães tipo hot-dog produzidos nas panificadoras “A” e “B”

(Tabela 3) possibilitariam o desenvolvimento dos fungos presentes nas amostras.

As contagens de fungos filamentosos e leveduras das amostras de farinha

de trigo e de pães tipo hot-dog da panificadora “A” foram semelhantes (P>0,05),

entretanto, na panificadora “B” a contaminação fúngica dos pães foi maior que a da

farinha de trigo (Tabela 4).

De um modo geral, células bacterianas vegetativas, fungos filamentosos e

leveduras são destruídos durante o processamento térmico do pão (FREIRE, 2011),

porém, apesar dos pães amostrados terem sido assados no forno das panificadoras,

as contagens observadas, especialmente na padaria “B”, podem ter ocorrido por

contaminação posterior causada por: contato dos pães com os conídios fúngicos em

suspensão provenientes da farinha de trigo no interior dos estabelecimentos

pesquisados; manipulação inadequada durante o resfriamento (FREIRE, 2011),

utensílios mal higienizados e pela resistência ao tratamento térmico

(WEIDENBÖRNER et al., 2000). Além disso, nas panificadoras pesquisadas os pães

ficavam expostos a venda em temperatura ambiente no interior de vitrines que

permitiam acesso a moscas, que são considerados como veículos de conídios.

Panificadoras/

Amostras

Atividade de água (aw)

Farinha de trigo (n=15) Pão tipo hot-dog (n=15)

A 0,52b ± 0,04 0,83a ± 0,03

B 0,50b ± 0,03 0,84a ± 0,01

41

Tabela 4 – Contagem média de fungos filamentosos e leveduras em farinha de trigo e pão tipo hot-dog adquiridos em panificadoras de Teresina, PI.

Panificadoras/ Amostras

Contagem média de fungos filamentosos e leveduras

(UFC.g-1 em log10(x+1))

Farinha de trigo

CV% Pão tipo hot-

dog CV%

A 2,34b ± 1,15 0,49 2,39b ± 1,33 0,56

B 2,14b ± 1,24 0,58 3,78a ± 1,79 0,47

a letras iguais em coluna e linhas, resultados semelhantes (P>0,05) pelo teste de Mann-Whitney.

UFC.g-1

em log10(x+1)

= unidades formadoras de colônias por grama, em logaritmos da base dez, acrescentados de uma unidade.

A Legislação brasileira vigente (BRASIL, 2001), não possui padrões

referentes ao limite de fungos filamentos e leveduras na categoria de farinhas e

produtos de panificação, no entanto, esta análise é relevante, visto que esses micro-

organismos são considerados indicadores da qualidade higiênica dos alimentos

(ZANATTA et al., 2010). A quantidade de fungos filamentosos e leveduras é um

parâmetro que deve ser observado pelas empresas alimentícias. Esses micro-

organismos quando se desenvolvem interferem na qualidade sensorial dos produtos

pelas alterações das características organolépticas e nutricionais. De uma forma

mais grave, certas espécies de fungos filamentosos em condições favoráveis de

umidade e temperatura podem produzir micotoxinas nas farinhas, e a presença

dessas substâncias tóxicas pode prevalecer em seus derivados, podendo causar

alterações biológicas prejudiciais à saúde do consumidor.

No total das amostras analisadas foram isoladas 66 cepas de fungos

filamentosos pertencentes a oito gêneros e, pode-se constatar que a variedade de

fungos foi maior na farinha de trigo do que nos pães (Tabela 5), provavelmente pela

ação do tratamento térmico dos pães. Porém, os gêneros isolados nas amostras de

pão também estavam presentes na farinha de trigo. Os gêneros mais comumente

encontrados em pães brasileiros são: Aspergillus, Chrysonilia, Cladosporium,

Curvularia, Eurotium, Fusarium, Penicillium, Rhizopus e Mucor, sendo as espécies

Aspergillus, Cladosporium e Penicillium as mais frequentes (FREIRE, 2011). A

maioria dos gêneros citados também foi isolada nas amostras de farinha de trigo

utilizadas nas panificadoras piauienses. De um modo geral, os panificadores

42

brasileiros adquirem essa matéria-prima das regiões: Sul, Sudeste e Centro-Oeste,

caracterizando certa uniformidade da micobiota presente nos ambiente de cultivo.

Tabela 5 – Ocorrência (%) de fungos filamentosos isolados em amostras de farinha de trigo

e pão tipo hot-dog adquiridas em panificadoras de Teresina, PI.

Farinha de trigo Pão tipo hot-dog

Gêneros fúngicos Números

de isolados

Ocorrência (%)

Números de

isolados

Ocorrência (%)

Cladosporium spp. 14 31,8 17 77,3

Aspergillus spp. 10 22,7 2 9,1

Penicillium spp. 12 27,3 2 9,1

Fusarium spp. 2 4,5 - -

Eurotium spp. 3 6,8 - -

Mucor spp. 1 2,3 - -

Byssoclamys spp. 1 2,3 1 4,5

Chrysonilia spp. 1 2,3 - -

Total 44 100 22 100

A presença de Aspergillus spp. e Penicillium spp. em gêneros alimentícios

variados, constitui um fator de risco à saúde humana por serem fungos

potencialmente toxigênicos, que podem produzir micotoxinas em condições

favoráveis de umidade e temperatura. A frequência de isolamento desses gêneros

nas amostras de farinha de trigo (Tabela 5) pode ser atribuída a manipulação

inadequada da matéria-prima ao longo da cadeia alimentar (VICTOR et al., 2013),

portanto, o conhecimento dos tipos de fungos contaminantes pode indicar em que

condições o produto está estocado, fornecendo subsídios na orientação da

estratégia adequada de armazenamento (TANIWAKI; SILVA 2001).

Embora o Fusarium spp. seja um gênero com prevalência significativa em

pesquisas com trigo e seus derivados (BERGHOFER et al., 2003; MALAKER et al.,

2008; GARCIA JÚNIOR et al., 2008; KOBAYASTI; PIRES, 2011; JOSHAGHANI et

al., 2013), foram isoladas apenas duas cepas (8,3%) de F. graminearum (Tabela 6)

nas amostras de farinha de trigo, apesar de ser um fungo de campo.

A baixa infecção de F. graminearum em trigo também foi observada em

pesquisas realizadas por outros autores (CARNEIRO, 2003; GARCIA, 2006;

43

ALMEIDA, 2006; ARINGOLI et al., 2012). Apesar da baixa incidência de Fusarium

spp. nas amostras estudadas, não se pode desconsiderar a hipótese destes fungos

terem colonizado os grãos de trigo antes da colheita e terem sido eliminados por

competição (FURLONG et al., 1995), uma vez que houve uma elevada porcentagem

de fungos do gênero Cladosporium spp., que competem com o Fusarium pela

superfície do substrato a ser colonizado, pelo alimento e umidade do ar (GARCIA

JUNIOR et al., 2008).

F. graminearum está frequentemente associado à giberela ou fusariose nos

grãos de trigo (CALORI-DOMINGUES et al., 2007), que além de causar danos à

cultura, os grãos infectados podem apresentar contaminação por micotoxinas (DON,

ZEA e T2), podendo ser tóxicas tanto para o homem quanto para os animais

(IAMANAKA et al., 2010, DRUMMOND, 2012).

Em relação aos demais gêneros fúngicos isolados, a incidência de

Cladosporium spp. foi a mais prevalente (Tabela 5). O crescimento desse fungo é

favorecido quando a umidade ambiental está elevada, associada com aumento do

fluxo de ar, visto que são facilmente disseminados pelo vento (ZOPPAS et al., 2011).

Neste contexto, apesar de terem sido isolados nas amostras em maiores

quantidades, a umidade relativa média das panificadoras (panificadora “A”: 43,6% ±

17,6 e panificadora “B”: 44,3% ± 11,4) durante o período do estudo, não favoreceu o

desenvolvimento desse fungo.

Cladosporium spp. é considerado um dos mais comuns e importantes

patógenos causadores de alergias em humanos (ALINGORI et al., 2012) e elevadas

concentrações de seus esporos podem provocar alergia crônica, rinite e asma pela

exposição prolongada. Além do mais, são capazes de produzir ácido

epicladospórico, podendo causar imunossupressão (ZENG, 2005; MAXIM, 2013).

A densidade relativa das espécies dos gêneros Aspergillus, Penicillium e

Fusarium isoladas em amostras de farinha de trigo e pães tipo hot-dog adquiridos

em panificadoras de Teresina, PI, são observadas na Tabela 6. As espécies A.

caespitosus e P. corylophilum, foram isolados na farinha de trigo e nos pães tipo hot-

dog (Tabela 6). A ocorrência de fungos, com destaque para o P. rugulosum isolado

apenas no pão pode ter sido proveniente de contaminações por conídios fúngicos

presentes no ambiente e pela presença de moscas nas panificadoras que poderiam

veiculá-los aos pães expostos.

44

Tabela 6 – Densidade relativa das espécies de Aspergillus, Penicillium e Fusarium isoladas em amostras de farinha de trigo e pães tipo hot-dog adquiridos em panificadoras de Teresina, PI.

Espécies

Farinha de trigo Pão tipo hot-dog

Número de

isolados

Frequência (%)

Número de

isolados

Frequência (%)

A. candidus 3 12,5 - -

A. caespitosus 2 8,3 1 33,3

A. oryzae 2 8,3 - -

A. terreus 2 8,3 - -

A. versicolor 1 4,2 - -

P. corylophilum 6 25,0 1 33,3

P. fellutanum 2 8,3 - -

P. lividum 2 8,3 - -

P. decumbens 1 4,2 - -

P. paxilli 1 4,2 - -

P. rugulosum - - 1 33,3

F. graminearum 2 8,3 - -

Total 24 100 3 100

Nas amostras, não foram detectadas cepas de Aspergillus das seções Flavi

e Nigri com potencial capacidade para produção de AFB1 e OTA, embora esta

produção já tenha sido relatada em pesquisas com trigo e derivados (SOLIMAN,

2003; EFUNTOYE, 2004; CABAÑAS et al., 2008).

Não foram detectadas AFB1 e OTA nas amostras analisadas, portanto estão

de acordo com os limites máximos toleráveis recomendados pela legislação

(BRASIL, 2011). Porém farinhas de trigo que contenham micotoxinas podem

apresentar o risco destas também estarem presente nos pães, apesar das perdas

que podem ocorrer pela fermentação da massa, pelo processamento térmico

(SAMAR et al., 2001; PACIN et al., 2010) e pela diluição da concentração das

toxinas presentes devido a adição de outros ingredientes não contaminados à

massa (COPETTI et al., 2013).

45

Importante salientar que a presença de fungos micotoxigênicos no alimento

não implica obrigatoriamente na produção de micotoxinas (DINIZ, 2002; PEREIRA et

al., 2002; MURPHY et al., 2006; GARCIA et al., 2009), visto que, as condições para

a produção desses metabólitos tóxicos são mais restritivas que aquelas para o

crescimento de fungos (MAGNOLI et al., 2007). Neste contexto, a síntese de

micotoxinas por fungos do gênero Aspergillus é favorecida quando a umidade

relativa do ar é superior a 85% (QUEIROZ et al., 2006) e essa produção é muito

baixa ou inexistente quando os valores de atividade de água são inferiores a 0,85

(GIMENO; MARTINS, 2011). Assim, os teores médios de umidade relativa do ar

registrados nas panificadoras, bem como os valores médios de atividade de água

obtidos para farinha de trigo e pão tipo hot-dog (Tabela 3) eram desfavoráveis à

síntese desses metabólitos tóxicos. Dessa forma, sob os pontos micotoxicológicos

analisados tanto a farinha de trigo quanto os pães tipo hot-dog eram seguros para

consumo.

O conhecimento da micobiota fúngica e suas micotoxinas nos alimentos é

importante para obter informações inerentes à qualidade do produto e realizar ações

preventivas desde a produção até o armazenamento. Assim, para que haja o

controle dos fungos filamentosos e de seus metabólitos, é necessária a realização

de métodos que minimizem a multiplicação e também, utilização de técnicas para

detoxificar o susbtrato, reduzindo ou minimizando a níveis indetectáveis de

contaminação por micotoxinas nos alimentos.

Portanto, pode-se sugerir que a farinha de trigo utilizada para produção dos

pães tipo hot-dog era de boa procedência, e provavelmente foi produzida com o

sistema de boas práticas de fabricação na sua origem desde o campo até sua

distribuição.

46

6 CONCLUSÃO

A qualidade da farinha de trigo influencia os aspectos micológicos e

micotoxicológicos dos pães produzidos, na quantidade de fungos filamentosos e

leveduras e também na variabilidade das espécies fúngicas isoladas.

Foram identificados os gêneros Cladosporium spp., Penicillium spp. e

Aspergillus spp. na farinha de trigo e nos pães tipo hot-dog. Apenas na farinha

também foram isolados Fusarium spp., Mucor spp., Byssoclamys spp. e Chrysonilia

spp. Não foram isoladas cepas de Aspergillus das seções Flavi e Nigri

potencialmente toxigênicas.

A farinha de trigo e os pães tipo hot-dog não apresentaram AFB1 e OTA,

portanto são seguros para consumo sob o aspecto micotoxicológico analisado.

47

REFERÊNCIAS

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dissertação final da mestranda verbena carvalho alves

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