dissertaÇÃo envelhecimento cutÂneo

Universidade do Vale do Paraíba

Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento

João Paulo Alves do Couto

“Análise comparativa da terapia com LED (640±20 nm) e laser (660 nm) sobre o processo de reparação cutânea em ratos idosos”

São José dos Campos, SP 2009

João Paulo Alves do Couto


Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Bioengenharia da Universidade do Vale do Paraíba, como complementação dos créditos necessários para obtenção do título de Mestre em Engenharia Biomédica.

Orientador: Profª. Dra. Renata Nicolau Amadei Co-Orientador: Prof. Dr. Landulfo Silveira Júnior

São José dos Campos, SP

2009

Í

JOÃO PAULO ALVES DO COUTO

"ANÁLISE coMpARATtvA DÂ TERAPIA coM LED (640t20NM) E LASER (660N14) soBRE

O PROCESSO DE REPARACÃO CTJTÂNEA EM RATOS IDOSOS''

Dissertação aprovada como requisito parcial

Biomédica, do Programa de Pós-GÉduação

Desenvolvimento da Universidade do Vale do

banca examinadora:

Prof. Dr. NEWTON SOARES DA SILVA (LINIVAP)

Prof. Dra. RENATA AMADEI NICOLAU (UNIVAP)

Prof. Dr. MIGUEL ANCEL CASTILLO SALGADO (UNESP)

Prof. Dra. Sandra Maria Fonsecâ da Costa

Dirctor do lP&D Univap

São José dos Campos, l7 de março de 2009.

à obtenção do grau de Meste em Engenharia

em Bioengeúaria. do Institulo de Pesquisa e

Paraíba, São José dos CaÍrpos, SP, pela seguinte

DEDICATÓRIA

Este trabalho é dedicado as pessoas mais importantes e mais amadas

de minha vida. Sem eles a realização deste trabalho não seria possível.

AGRADECIMENTOS

Em primeiro lugar, agradeço a Deus, por me guiar e dar forças nos

momentos difíceis de minha vida.

Agradeço aos meus pais pelo alto investimento em meus estudos; e

acima de tudo pelo amor, confiança, apoio e dedicação em todos os momentos

de minha vida.

Agradeço a minha namorada Priscila que esteve ao meu lado auxiliando

e me apoiando em todos os estágios deste trabalho.

Agradeço a minha sogra Ademilde, meu sogro Ponciano e aos

funcionários da UnisulBahia pelo apoio e incentivo

Agradeço a Profª. Dra. Renata Amadei Nicolau pela confiança, paciência

e principalmente pelos ensinamentos passados ao longo do desenvolvimento

deste trabalho.

E a todos aqueles que de alguma forma colaboraram para a elaboração

deste trabalho e não foram citados nominalmente.


RESUMO

O envelhecimento é um processo dinâmico e progressivo, no qual há modificações morfológicas, fisiológicas e bioquímicas. Observa-se uma menor adesão entre as camadas derme e epiderme, diminuição na taxa de renovação celular e reparação, elevação do tempo de cicatrização de feridas. Atualmente, tem se enfatizado o emprego de novas tecnologias voltadas à geriatria, com vistas à melhoria de qualidade de vida de indivíduos. A fototerapia tem sido uma das áreas de destaque nos avanços tecnológicos, principalmente a aplicação da terapia laser de baixa potência (TLBP) com o objetivo de otimizar o processo de cicatrização tecidual. Os LEDs atualmente são alternativas de baixo custo para as terapias que utilizam luz, contudo poucas pesquisas foram conduzidas até o momento neste sentido. O objetivo do presente estudo foi analisar comparativamente os efeitos da TLBP (660 nm) versus terapia com LED (640±20 nm) sobre o processo de reparação de feridas cutânea em ratos idosos. Foram utilizados 54 ratos albinos, machos da linhagem Wistar, com 14 meses de idade, os quais foram submetidos à retirada da pele no dorso do animal. Os animais foram divididos em nove grupos (n=6 cada); sendo três grupos como controle, três grupos tratados com laser e três grupos tratados com LED. O tratamento com o laser e o LED foi iniciado no pós-operatório com dose de 6 J/cm2 a cada 48 horas, totalizando 3 sessões. Os animais foram sacrificados em 144, 312 e 480 horas após a cirurgia. Os animais controle tiveram simulação da aplicação da terapia com luz, com o aparelho desligado (placebo). Após o sacrifício as amostras de tecido foram submetidas à análise histológica quantitativa e variação clínica macroscópica da ferida. Os resultados mostraram diferenças estatisticamente significantes na contagem de células inflamatórias, vasos sanguíneos, fibroblastos e colágeno, demonstrando que o LED e o Laser melhoram a qualidade da cicatriz de animais idosos. Nenhuma diferença estaticamente significante foi encontrada ao se avaliar o tempo de cicatrização. Palavras-Chave: Epitélio, Laser, LED (Light Emitting Diode), Reparação

tecidual.

“Comparative analisys of therapy with LED (640 ± 20 nm) and Lazer (660 nm) over the process of cutaneous reparation in aging rats”

ABSTRACT

The effect of aging is a dynamic and progressive process in which there are morphological, physiological and biochemical modifications. We perceived a minor adherence between the derm and epidermis with reduction in the renovation cellular rate and reparation raising time of cicatrization of wounds. Actually emphasis in the use of new technologies turned into geriatrics aiming to better quality of life of individuals. The phototherapy has been one of the areas of prominence in the technological advances, especially an applied of Low Level Laser Therapy – LLLT with the objective of creating better conditions of the process of regeneration tissues. The LEDs actually are alternatives of low cost for therapies that uses light, however few researches were conducted until now in this field. The objective of this study was to analyze comparatively the LLLT effects – 660nm versus therapy with LED (640 ± 20 nm) over the process of tissue regeneration in aging rats. There were utilized 54 albine rats, male of Wistar race, with 14 month of age, which were submitted to tenotomy in the dorsum of the animals. These animals were divided in nine groups (n = 6 each) being three groups as of controls. Three groups treated with laser three groups treated with LED. The treatment with laser and the LED was initiated in the post- operating with dosage of 6 J/cm2 every 48 hours, totaling 3 sections. The animals were sacrificed in 144, 312 and 480 hours after surgery. These animals control had simulation of the infliction of therapy with light, with equipment off (placebo). After the sacrifice the specimen’s tissues were submitted to analysis histological quantitative. The results showed differences statically significant in the counting of inflammatory cells, blood arteries, fibroblasts and collagen, demonstrating that the LED and of laser improved the quality of healing of aging animals. No significant statistical differences were found in the evaluation of time healing.

Key Words: Epithelium Laser, LED (Light Emitting Diode), wound healing.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Estrutura esquemática da pele............................................................4

Figura 2: Luz Emissora de Diodo......................................................................25

Figura 3: Aplicação do Laser (A) e do LED......................................................32

Figura 4: Cálculo da área da lesão pelo programa Image J.............................34

Figura 5: Contagem de células inflamatórias, vasos, fibroblastos pelo programa

Image J..............................................................................................................35

Figura 6: Indicação do padrão usado na contagem de células inflamatórias,

fibroblastos, e neovasos ...................................................................................36

Figura 7: Cálculo da área de colágeno pelo programa Image J 1,42d.............36

Figura 8: Área da ferida dos diferentes grupos no decorrer dos 480 horas.....38

Figura 9: Fotomicrografias de derme superficial dos grupos controle (A), grupo

tratado com laser (B) e grupo tratado com LED (C), nos diferentes momentos

de reparação (144, 312 e 480 horas). H&E, 40X.............................................. 40

Figura 10: Fotomicrografias de derme profundal dos grupos controle (A), grupo

tratado com laser (B) e grupo tratado com LED (C), nos diferentes momentos

de reparação (144, 312 e 480 horas). H&E, 40X...............................................42

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Resultado da contagem de células inflamatórias encontradas em

144, 312 e 480 horas.........................................................................................39

Tabela 2 - Resultado da contagem de vasos sangüíneos encontradas em 7°,

144, 312 e 480 horas.........................................................................................41

Tabela 3 - Resultado da contagem de fibroblastos encontrado em 144, 312 e

480 horas...........................................................................................................42

Tabela 4 - Resultado da contagem da quantidade de colágeno encontradas em

144, 312 e 480 horas.........................................................................................43

LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS

UV – Ultravioleta

MMP – Matriz metaloproteinase

DNA – Ácido desoxirribonucléico

RNA – Ácido Ribonucléico

GP – Glicoproteína

ADP– Adenosinadifosfato

ATP– Adenosinatrifosfato

PAF – Fator de ativação plaquetária

TxA2 – Tromboxano A2

TGF – Tumor growth factor ou Fator de crescimento tumoral

TGF β – Transforming growth factor beta ou Fator de crescimento de

transformação Beta

PDGF – Platelet-derived growth factor ou Fator de crescimento plaquetário

CTAP – Peptídeo ativador de tecido conjuntivo

LLLT – Low Level Laser Therapy ou Terapia com laser de baixa potência

TLBP – Terapia laser de baixa potência

HeNe – Hélio Neônio

GaAs – Arseneto de Gálio

GaAlAs – Arseneto de Gálio Alumínio

LED – Light Emitting Diodes ou luz emissora de diodo

IC – injeções de carga

TE – transferência de elétrons

RC – recombinação de carga

VET – volta do elétron transferido

FET – fotoindução da eletrotransferência

J – joules

Hz – hertz

H&E – Hematoxilina e Eosina

PO – Pós-operatório

nm – nanometros

W – watts

mW – milliwatts

KCl – cloreto de potássio

α – alfa

λ – comprimento de onda

µm - micrometro

µm²- micrometro quadrado

“n” – nêutron

“p” – próton

P - probabilidade

TIFF - Tagged Image File Format

SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO 15

2 REVISÃO DA LITERATURA 17

2.1 Envelhecimento 17

2.1.1 Envelhecimento Cutâneo 18

2.1.1.1 Envelhecimento Intrínseco da Epiderme 21

2.1.1.2 Envelhecimento Extrínseco da Epiderme 22

2.1.1.3 Envelhecimento Intrínseco da Derme 23

2.1.1.4 Envelhecimento Extrínseco da Derme 25

2.1.1.5 Envelhecimento Intrínseco da Hipoderme 26

2.2 Reparação tecidual 26

2.2.1 Fase de homeostasia 27

2.2.2 Fase de Inflamatória 29

2.2.3 Fase de Proliferativa 30

2.2.1 Fase de Remodelação 34

2.3 Terapia Laser de baixa potência 36

2.4 Light Emitting Diode (LED) 38

3 OBJETIVO 43

3.1 Objetivo geral 43

3.2 Objetivos específicos 43

4 MATERIAL E MÉTODOS 44

4.1 Procedimentos Éticos 44

4.2 Modelo experimental 44

4.3 Procedimento cirúrgico 45

4.4 Terapia com LED e Laser 45

4.5 Sacrifício dos animais 46

4.6 Técnica histológica 47

4.7 Análise da área da lesão 47

4.8 Histomorfometria 48

4.9 Análise estatística 51

5. RESULTADOS 52

5.1 Análise Macroscópica 52

5.1.1Cálculo da área 52

5.2 Análise Microscópica 53

5.2.1 Contagem do número de Células Inflamatórias 53

5.2.2 Contagem do número de vasos 55

5.2.3 Contagem do número de Fibroblastos 56

5.2.4 Análise do Colágeno 57

6 DISCUSSÃO 59

7 CONCLUSÕES 64

REFERÊNCIAS 65

Anexo A – Certificado do Comitê de Ética e Pesquisa 72

Anexo B – Tabela de dados da área da lesão dos diferentes grupos experimentais

73

Anexo C – Gráficos do número de células inflamatórias em derme profunda e superficial

74

Anexo D – Gráficos do número de vasos sanguíneos em derme profunda e

superficial

75

Anexo E – Gráficos do número de fibroblastos em derme profunda e superficial

76

Anexo F – Gráficos da quantidade de colágeno em derme profunda e superficial

77

15

1 INTRODUÇÃO

No Brasil, entre as décadas de 40 e 60, ocorreu uma redução

significativa da mortalidade da população e a fecundidade se manteve

constante. A partir da segunda metade da década de 60 essa situação se

manteve levando às alterações da faixa etária da população brasileira1.

Entre os anos 1970 a 2000 a taxa de fecundidade diminuiu em 60% e

somadas à diminuição da taxa de mortalidade fez com que o Brasil

envelhecesse rapidamente. Processo esse que demorou 6 décadas em países

Europeus e no Brasil ocorreu em um quarto de século. Com isso foi observado

que a expectativa de vida, que era em torno de 33,7 anos em 1950/1955,

passou para 50,99 em 1990, chegou até 66,25 em 1995 e deverá alcançar

77,08 em 2020/20252.

Esse envelhecimento cronológico vem acompanhado do envelhecimento

biológico que traz consigo alterações próprias em todos os órgãos e sistemas,

alterando suas estruturas e funcionamento. Alterações essas determinadas por

forças ambientais intrínsecas e extrínsecas3. Uma das alterações mais visíveis

é o envelhecimento da pele que faz com que a mesma se torne mais fraca e

tornando o idoso mais suscetível a lesões dérmicas ao mínimo trauma4,5.

Nas últimas décadas tem-se constatado a eficácia da terapia com laser

operando em baixa potência (TLBP) sobre o processo cicatricial. A energia

depositada nos tecidos pela TLBP é transformada imediatamente dentro da

célula promovendo efeitos biológicos. Estes efeitos podem estar relacionados à

aceleração de reações bioquímicas, contribuindo significantemente no

processo de cicatrização tecidual6,7.

A terapia com LEDs (Light Emitting Diodes ou luz emissora de diodo)

tem sido investigada, não somente pelos efeitos positivos sobre o processo de

reparação tecidual atestados, mas também pelo custo reduzido dos

equipamentos de LED comparados aos equipamentos de laserterapia. Autores

têm observado que a terapia com LEDs pode apresentar resultados superiores

à terapia com laser8,9.

Considerando que, o envelhecimento acarreta mudanças no processo

de cicatrização, e que não foram observados estudos envolvendo o emprego

16

da fototerapia sobre o processo de reparação de feridas em organismos

idosos, novos estudos se fazem necessários neste sentido.

17

2 REVISÃO DA LITERATURA 2.1 Envelhecimento

O termo envelhecimento é definido como um evento dinâmico e

progressivo, onde há modificações morfológicas funcionais, bioquímicas e

psicológicas, que determinam a perda gradual da capacidade adaptativa do

indivíduo ao meio ambiente3,5.

O envelhecimento é o acúmulo de diversas alterações deletérias nas

células e tecidos com o avançar da idade. As alterações da idade podem ser

atribuídas de acordo com o desenvolvimento e defeitos genéticos, meio

ambiente, processos patológicos e processos naturais10.

Rebelatto e Morelli11 relatam que várias são as teorias que tentam

explicar o mecanismo pelo qual ocorre o envelhecimento, mas nenhuma delas

consegue por inteiro explicar esse mecanismo, o que reflete a dificuldade de

entender todo o processo. Acredita-se que o envelhecimento seja um processo

dinâmico e progressivo, caracterizado por alterações morfológicas, fisiológicas,

bioquímicas e psicológicas que podem determinar maior vulnerabilidade.

As teorias de fundo biológico tendem a focalizar os problemas que

afetam a precisão do sistema orgânico durante o processo de envelhecimento,

sejam eles de origem genética, metabólica, celular ou molecular. Pode-se

dividí-las em duas categorias: as de natureza genético-desenvolvimentista e as

de natureza estocástica. No primeiro caso, o envelhecimento é visto como um

processo controlado geneticamente e, talvez, programado. Algumas correntes

associam essa possível programação a um desequilíbrio neuroendócrino,

levando a uma diminuição de integração funcional dos sistemas orgânicos. As

teorias estocásticas trabalham com a hipótese de que o envelhecimento

dependeria do acúmulo de agressões ambientais que atingem um nível

incompatível com a manutenção das funções orgânicas e da vida. Alguns

exemplos são as correntes que defendem a existência de mutações genéticas

somáticas progressivas ou erros da cadeia de síntese protéica em virtude da

influência de radiação ou substâncias específicas. Todas essas teorias

carecem de comprovação definitiva, nenhuma delas tendo condições de

sobrepor-se às outras. Há, portanto, muitas dúvidas sobre a real influência das

18

causas por elas apontadas no processo global de envelhecimento biológico,

assim como sobre a forma pela qual poderiam interagir12.

2.1.1 Envelhecimento Cutâneo

A pele é o maior órgão do corpo humano e também o de maior peso.

Além destas características, a pele é o órgão que nos limita do meio exterior.

Sendo desta forma a interface entre os seres humanos e seu meio ambiente,

que protege os outros órgãos do corpo de alterações excessivas de

temperatura, lesão mecânica, irradiação ultravioleta, substâncias químicas

tóxicas, patógenos de origem microbiana13. Moi4 relata em sua dissertação que a pele é caracterizada por três

camadas superpostas: “epiderme” parte externa constituído por um aglomerado

de células dispostas em camadas, não contem vasos sanguíneos, estando em

renovação constante; “derme” camada intermediária composta de fibras de

colágeno e elastina, sendo irrigada por inúmeros vasos sanguíneos e linfáticos

e onde se localizam as terminações nervosas; “hipoderme” camada constituída

por tecido gorduroso (interno) que desempenha importante função de proteção

de órgãos internos contra traumas e perda de calor.

Figura 1: Estrutura esquemática da pele.

Fonte: Guaratini, Medeiros e Colepicolo14.

Todos os tecidos passam por mudanças de acordo com a idade, e na

pele essas alterações são mais facilmente reconhecidas. Durante o processo

19

de envelhecimento a pele sofre alterações, de composição, organização e

tamanho15, 16.

As alterações encontradas na pele do idoso decorrem basicamente da

ação da constituição genética, fatores ambientais, da repercussão cutânea do

envelhecimento de outros órgãos e de efeito de outras doenças cutâneas e

sistêmicas. Assim pode-se classificar o envelhecimento cutâneo em: intrínseco

e extrínseco17, 18.

O envelhecimento intrínseco corresponde ao conjunto de alterações

decorrentes da idade. Apresenta fatores cronológicos (genéticos) e

patológicos19. Hargreaves20 complementa dizendo que o envelhecimento

humano se traduz na pele pelas mais diversas modificações. Surgem então

alterações estruturais que fazem a pele adquirir características próprias no

decorrer da idade. A essas alterações próprias do tempo, denominamos de

envelhecimento intrínseco. O envelhecimento intrínseco é imutável e não

depende de cuidados ou terapias. As suas nuances inter-individuais têm um

componente de penetrância fenotípica própria, o que diferencia entre uma

pessoa e outra em relação a maiores ou menores sinais de envelhecimento.

Papaléo Neto e Borgonovi5 relatam que o envelhecimento é universal,

gradual e inevitável atribuído à passagem do tempo, resultando em alterações

funcionais e da aparência do indivíduo, evidentemente associadas com a idade

avançada.

A exposição aos raios ultravioletas (UV) leva ao envelhecimento

extrínseco da pele caracterizando o fotoenvelhecimento21. O

fotoenvelhecimento afeta todas as camadas da pele, mas a sua maior ação

ocorre no tecido conjuntivo 22,18,23.

Uma vez que nem todas estas alterações são puramente intrínsecas, a

pele é vulnerável a uma série de alterações do meio ambiente, principalmente

da radiação ultravioleta. A exposição crônica e prolongada ao sol leva ao

fotoenvelhecimento. A ação cumulativa da luz do sol promove alterações macro

e microscópicas caracterizadas em parte pela formação de rugas, alterações

na pigmentação e perda de tônus da pele. Estas alterações não são universais

e geralmente podem ser evitadas5.

20

A luz ultravioleta interage com várias células localizadas em diferentes

regiões, dependendo do comprimento da onda. A onda mais curta (280-320

nm) é absorvida na epiderme e afeta os queratinócitos, já a onda mais longa

(320-400 nm) interage com os queratinócitos e os fibroblastos da derme24.

O fator ambiental que acelera o envelhecimento da pele é a radiação

ultravioleta vinda do sol. O fotoenvelhecimento é um processo acumulativo que

depende do sol e o tipo de pele. O componente genético intrínseco do

envelhecimento não é afetado no fotoenvelhecimento, mas os eventos resultam

do acúmulo excessivo de danos celulares (estresse oxidativo). A aceleração do

envelhecimento tecidual causada pela exposição da pele ao sol envolve a

presença no tecido de cromóforos absorvendo radiação ultravioleta, dos raios

solares de comprimento de onda entre 280 a 400 nm, em particular a radiação

UVB (280 a 320nm)25.

Oriá et al.15 explica que para estudar os mecanismos envolvidos no

envelhecimento, portanto, é necessário compreender melhor as mudanças

estruturais e funcionais que ocorrem com o avançar da idade, distinguindo as

alterações que possam representar um processo intrínseco daquelas que

refletem efeitos patológicos cumulativos ou agressões ambientais externas.

Convém ainda considerar que, independente da idade do indivíduo, a

espessura total da pele, espessura relativa da epiderme e derme, distribuição e

fenótipo da população celular na derme, presença de anexos cutâneos e

densidade microvascular e de nervos variam conforme a região do corpo.

Parece claro que muitas mudanças da pele, que são comumente vistas

na velhice, podem não ser resultado do envelhecimento por si só. As

mudanças da pele que são comumente observadas na velhice são melhores

referidas como “associadas a” do que “causadas por” envelhecimento26.

A pele envelhecida frente a fatores intrínsecos apresenta diminuição de

fibras elásticas, com sua fragmentação e desintegração destas, a partir dos 60

anos de idade. Já na pele envelhecida frente a fatores extrínsecos, ocorre

aumento do material elástico da derme, com deterioração e homogeneização

do colágeno4.

Para explicar as alterações visíveis a olho nu, Accursio27 reporta em seu

artigo que os achados histológicos e as funções da pele se encontram

diminuídas nesta faixa etária. Observa-se uma menor adesão entre as

21

camadas derme e epiderme, o que explica a pobre resistência da pele do idoso

a pequenos traumas. Essa alteração também confere uma menor transferência

de nutrientes de uma camada a outra da pele e uma modificação na absorção

de substâncias pela pele do idoso, assim sendo, sabe-se que ocorre uma

diminuição de absorção de substâncias lipofílicas pela pele do idoso. A

diminuição na taxa de renovação celular (30% a 50% entre a terceira e oitava

década de vida) e reparação de pele elevam o tempo de cicatrização das

feridas que pode chegar a duas ou três vezes mais do que o de uma pessoa

jovem.

2.1.1.1 Envelhecimento Intrínseco da Epiderme

A alteração mais evidente e constante é o achatamento da junção

dermo-epidérmica, com o desaparecimento de ambas as papilas dérmicas e as

redes terminais epidérmicas. Em relação à ultra-estrutura, existe também uma

redução nas projeções das vilosidades citoplasmáticas das células basais

epidérmicas no interior da derme. Isto resulta em uma superfície contígua,

consideravelmente menor, entre os dois compartimentos, presumivelmente

uma redução na “comunicação” e passagem dos nutrientes e menos

resistência a força de corte28.

Sauerman et. al.29 complementa descrevendo que a diminuição do

número das papilas dérmicas é um reflexo do aplainamento da junção dermo-

epidérmica, em particular isso não é demonstrado na altura da papila dérmica.

Nascimento30 diz que a zona dermo-epidérmica, de transição entre a

epiderme desprovida de vasos e a derme ricamente vascularizada, é palco de

importantes transformações - aplainamento dos cones interpapilares,

mudanças das lâminas lúcidas e densas, alterações das integrinas e lamininas.

O colágeno do tipo IV, sintetizado pelos fibroblastos, garante estabilidade e

bom funcionamento da junção dermo-epidérmica; nas fibrilas de ancoragem, o

colágeno do tipo VII participa da adesão entre a epiderme e a derme. A perda

da adesão causa diminuição da firmeza e aparecimento de rugas e sulcos. Há

diminuição qualitativa e quantitativa de mucopolissacarídeos

(glicosaminoglicanas), do sulfato de controitina, do ácido hialurônico

(hialunorato), este último muito reduzido ou ausente aos 60 anos de idade. As

22

variações dos diversos tipos de colágeno acontecem durante as várias fases

de degradação da pele fotoexposta ou caduca. Silva e Carneiro 24 afirmam

ainda que junção dermo-epidérmica está achatada e o número células

diminuída, mas a sua estrutura continua a mesma

Oria et al.15 descreve que a avaliação qualitativa dos preparados

histológicos demonstrou acentuada redução da espessura da epiderme na pele

senil e ausência do arranjo compacto dos queratinócitos, especialmente ao

longo do estrato de Malpighi. Além disso, observaram um arranjo

desorganizado e achatamento das células basais, com menor acúmulo de

melanossomas e menor densidade de melanócitos no grupo senil quando

comparado com o grupo jovem ou intermediário. Detectaram ainda redução da

sinuosidade do trajeto da epiderme ao longo do comprimento da superfície

dérmica, ilustrado por uma disposição grosseiramente linear da junção

epidermo-dérmica quando comparado com o grupo jovem. A membrana basal

apareceu mais bem definida na pele senil.

Silva e Carneiro24 explicam que a redução do número de queratinócitos

da epiderme, muda em associação com a idade envolvendo o aplainamento da

região inferior. A redução do número de células Langerhans, o número de

melanócitos e a síntese de melanosomas reduzem a pigmentação.

Já Sauermann et al.29 relatam que não houve alteração da espessura

camada em seu estudo, confirmando achados de estudos preliminares como

os de Kligman em 1986 e o de Grove em 1983. As alterações mínimas na

espessura da epiderme foram consideradas como parte do débito das

alterações encontradas na epiderme. Nos resultados do seu estudo a

espessura da epiderme, imediatamente sobre a papila dermal, pode continuar

consistente com o decréscimo da espessura da epiderme achada por métodos

histológicos, se a diminuição da altura da junção dermo-epidérmica for maior

que duas vezes o decréscimo da espessura da epiderme.

O número de melanócitos enzimaticamente ativos diminui

progressivamente, tornado a barreira de proteção contra a radiação ultravioleta

extremamente prejudicada17, 27.

2.1.1.2 Envelhecimento Extrínseco da Epiderme

23

Histologicamente, a pele fotoenvelhecida apresenta maior compactação

do estrato córneo, aumento da espessura da camada granulosa e menor

concentração de mucina na epiderme. Embora o número de melanócitos esteja

reduzido, as áreas com melanose solar e lentigo apresentam hipertrofia dessas

células no paciente fotoenvelhecido21.

Silva e Carneiro24 complementam explanando que as alterações da

epiderme causadas pelo fotoenvelhecimento são caracterizadas por alterações

na pigmentação associado com hipertrofia ou atrofia da epiderme, e deposição

de fragmentos de fibras elásticas.

2.1.1.3 Envelhecimento Intrínseco da Derme

No envelhecimento cutâneo as maiores alterações são vistas ao nível da

derme. Há uma redução dos fibroblastos e a espessura das fibras colágenas

diminui. Após os 60 anos, o colágeno torna-se rígido e menos elástico em

razão das alterações da substancia fundamental amorfa pela redução dos

mucopolissacarídeos (glicosaminoglicanos) e alterações químicas. As fibras

elásticas mostram alterações químicas na elastina. Há alterações no conteúdo

de hidratos de carbono, lipídeos, ácido glutâmico e lisina. As fibras reticulares

apresentam alterações similares às das fibras colágenas. Há redução de cerca

de 50% na quantidade de mastócitos na pele idosa19.

Oriá et al. 15 confirmam e complementam mostrando em seu artigo que

em toda extensão da derme do grupo senil foi detectada fragmentação

acentuada das fibras elásticas coradas em negro pela coloração de fucsina-

resorcina de Weigert em contraste com o aspecto contínuo das fibras elásticas

dos espécimes do grupo jovem. As fibras elásticas, nos preparados de pele do

grupo dos idosos, apresentavam-se mais frouxamente dispersas e com uma

diminuição no entrançamento em relação às fibras colágenas, conforme

demonstração pelo contraste fluorescente diminuído. Além disso, ao longo das

rasas papilas dérmicas, foi confirmada a deficiência do mecanismo de

ancoragem em ângulo reto das fibras elásticas, ao longo do contorno em

campânula do ápice papilar nos preparados dos indivíduos idosos em contraste

com o arranjo das fibras elásticas dos espécimes do grupo jovem. No grupo

senil, os feixes colágenos estavam menos compactados e ondulados na região

24

média da derme, e o aparelho colágeno-elástico reticular mostrou-se mais

susceptível à dispersão. Contudo, um arranjo mais compacto e espesso do

aparelho colágeno pode ser visto na derme profunda do grupo senil. No grupo

senil, a derme superficial exibiu redução em sua celularidade e extensão em

alça da microvasculatura papilar, revelada pelo discreto declínio da

fluorescência local.

O envelhecimento tecidual está associado com a atrofia da derme, tão

quanto às mudanças na arquitetura e organização. Há uma diminuição na

síntese da matriz na derme e aumento da enzima que degrada a matriz do

colágeno. Radicais livres causam dano no tecido conectivo que compõe a

derme, em particular o colágeno, que aparentemente influencia a interação

com a célula matriz31. A derme papilar perde sua característica morfológica de

cristas onduladas e adquire aspecto plano, acompanhando o desenho da

epiderme superficial, onde os corneócitos passam a apresentar naturalmente

menor interadesão 20.

Ultraestruturalmente, o colágeno diminui 1% ao ano, e as fibras

colágenas remanescentes tornam-se desorganizadas, compactas e

granulosas, modificando a cicatrização da pele do idoso. As fibras colágenas

decrescem em número e em diâmetro, além de apresentarem fragmentação e,

ocasionalmente, calcificação progressiva. Após a sétima década de vida, o

colágeno torna-se mais rígido e menos elástico devido às alterações da

substância fundamental pela diminuição dos mucopolissacarídeos

(glicosaminoglicanas), alterando adversamente o turgor cutâneo. Tais

alterações modificam as propriedades mecânicas cutâneas com perda

progressiva da elasticidade e aumento do tempo necessário para a pele

retornar a sua espessura prévia após traumas21,20.

Essas alterações fazem que a pele perca sua elasticidade retardando a

recuperação de sua forma quando tensionada. A desidratação tissular e a

perda da compressibilidade da pele ocorrem pela diminuição de

glicosaminoglicanos que leva menor capacidade retentora de água na derme.

Assim a derme envelhecida se torna um tecido rígido, inelástico e irresponsível

à tensão, com menor capacidade de resposta ao estresse19.

Silva e Carneiro24 afirmam que imagens computadorizadas no

envelhecimento intrínseco mostraram que as artérias e veias possuem a

25

mesma densidade, mas em ambos os calibres estão diminuídos, se bem que

com o envelhecimento da pele há perda progressiva da vascularização da

derme e do calibre vascular da mesma.

2.1.1.4 Envelhecimento Extrínseco da Derme

As características histológicas mais marcantes do fotoenvelhecimento

são a elastose, representada por acúmulos nodulares de material amorfo,

geralmente na junção da derme papilar e reticular. Há substituição das fibras

colágenas maduras por colágeno com aparência basofílica, formando um

material constituído de elastina degradada e proteínas microfibrilares ligadas à

fibronectina, uma glicoproteína ligada a matriz dérmica. O ácido hialurónico

(Hialuronato), um mucopolissacarídeo (glicosaminoglicano), envolvido na

manutenção do volume e elasticidade da derme diminui com o envelhecimento

da pele, isso pode ser explicado pela diminuição receptor do fator de

crescimento na epiderme, ativado pelos raios UV, e subseqüente inibição do

sistema de hialuronato20, 21,32.

A inicialização da matriz metaloproteinase (MMP) toca a principal regra

na patogênese do fotoenvelhecimento. Existem grupos de enzimas, subfamília

das proteinases, responsáveis pela degradação do colágeno. A luz ultravioleta

modifica a matriz dermal, proteínas e induz a uma ampla variedade de

crescimento da família dos MMPs com atividade proteolítica para degradar a

matriz protéica. Cada MMP degrada diferentes componentes da matriz protéica

dermal, por exemplo, MMP-1 quebra o colágeno I, II e III e MMP-9 degrada

colágeno tipo IV e V 24.

Há diminuição do lúmen vascular, dos capilares na derme com um

número menor de formações glômicas, além de alterações de esclerose dos

vasos. A diminuição do fluxo circulatório cutâneo contribui para menor

intensidade das reações inflamatórias e para menor depuração de substâncias

endógenas ou exógenas depositadas na pele. Os vasos sanguíneos se

rompem com facilidade, promovendo extravasamento de hemácias na pele,

levando a manhas púrpuras facilmente visíveis na superfície19, 33.

26

2.1.1.5 Envelhecimento Hipoderme

Na hipoderme o tecido subcutâneo em geral está diminuído com as

células gordurosas mostrando-se frequentemente com menor volume e

número. O enrugamento cutâneo é também causado por alterações no tecido

subcutâneo e nos tecidos musculares17,27.

2.2 Reparação Tecidual

A capacidade auto-regenerativa é um fenômeno universal nos

organismos vivos. Nos organismos unicelulares, está restrita à presença de

enzimas responsáveis pela recuperação de elementos estruturais (como os

constituintes do citoesqueleto, membranas e paredes celulares) e de moléculas

de alta complexidade (como proteínas de elevada complexidade estrutural,

RNAs e o DNA). Em organismos superiores, além destes, também ocorre o

reparo de tecidos que pode se dar de duas formas: pela regeneração com a

recomposição da atividade funcional do tecido ou pela cicatrização com

restabelecimento da homeostasia do tecido com perda da sua atividade

funcional pela formação de cicatriz fibrótica34.

Segundo Polacow et al.35, o processo de reparo de uma ferida é

complexo e apresenta três fases que se sobrepõem, num processo contínuo:

inflamatória, proliferativa e remodelação. A reepitelização tem por objetivo a

restituição da superfície da pele como uma barreira funcional, onde os

queratinócitos respondem, inicialmente, migrando a partir dos bordos livres da

ferida 12 horas após a lesão. Tal mecanismo favorece o progressivo avanço da

camada epitelial e o fechamento do defeito tecidual.

Eming, Krieg e Davidson36 complementam dizendo que a reparação

tecidual é um processo dinâmico, de ação recíproca à lesão do tecido

envolvendo uma complexa interação entre vários tipos de células, moléculas de

matriz extracelular, mediadores solúveis e citocinas. Porém relatam que o

processo de cicatrização é divido em quatro fases, homeostasia, inflamação,

formação de tecido de granulação (proliferativa) e remodelação.

27

Li, Chen e Krisner37 correlaciona Eming, Krieg e Davidson36 com

Polacow et al.35 explicando que a cicatrização é um processo complexo que

grosseiramente pode ser dividido em três fases sobrepostas: a fase

inflamatória, proliferativa e de remodelação. A fase inflamatória envolve

resposta vascular caracterizada pela coagulação sanguínea e homeostasia

conforme os eventos celulares, incluindo infiltração de leucócitos com uma

variedade de funções antimicrobianas e liberação de citocinas, o qual inicia a

fase proliferativa da reparação da ferida. Alguns autores têm dividido o

processo de reparação tecidual e quatro fases, com o primeiro estágio

começado pela homeostasia elevando a importância da resposta vascular.

Durante a fase proliferativa existe a formação de epitélio para cobrir a

superfície da ferida que acompanha o crescimento do tecido de granulação de

acordo com o espaço da lesão. A formação do tecido de granulação envolve a

proliferação de fibroblastos, deposição de colágeno e outras substâncias

extracelulares da matriz e desenvolvimento de novos vasos sanguíneos. Uma

vez que o novo tecido da lesão foi formando, a fase de remodelação tem inicio

para refazer a integridade estrutural do tecido e sua competência funcional.

2.2.1 Fase de Homeostasia

Segundo Li, Chen e Krisner37 a ruptura dos vasos sanguíneos leva ao

extravasamento do sangue ou apenas perda do plasma para o tecido

adjacente. O primeiro passo para a cicatrização é a homeostasia. Esta fase

consiste em dois processos: o desenvolvimento do coágulo e a coagulação. As

plaquetas são as primeiras células a aparecer após a lesão e ativam a cascata

de coagulação.

Quase concomitante ao estímulo lesivo, e devido à influência nervosa

(descargas adrenérgicas) e ação de mediadores oriundos da degranulação de

mastócitos, ocorre vasoconstrição como primeira resposta. A lesão do

endotélio (ruptura, fissura ou erosão) dispara uma sequência de eventos,

iniciando-se com a deposição das plaquetas, prosseguindo com sua ativação e

posterior recrutamento de novas plaquetas. O resultado é a formação de um

trombo rico em plaquetas, que provisoriamente tampona a lesão endotelial.

Esse trombo rico em plaquetas (trombo branco) é rapidamente infiltrado pela

28

fibrina, transformando-se em um trombo fibrinoso. Logo após, os eritrócitos são

capturados por essa rede fibrinosa e forma-se então o trombo vermelho

principal responsável pela oclusão do vaso sanguíneo rompido. Este, além de

limitar a perpetuação da perda de constituintes circulatórios para os interstícios

celulares, fornece uma matriz preliminar, que alicerçará a migração das células

responsáveis pelo desencadeamento do processo de reparo. A adesão inicial

das plaquetas à superfície lesada ocorre pelas proteínas de adesão presentes

na sua membrana. As principais delas são os receptores da glicoproteína

IIb/IIIa (GP IIb/IIIa). Esse receptor possui sítios de ligação para o fibrinogênio,

fator de Von Willebrand, vitronectina, fibronectina e trombospondina. Em

seguida, as plaquetas são ativadas por um grande número de substâncias

presentes na matriz subendotelial e na corrente sanguínea. O colágeno

subendotelial exposto pela ruptura do vaso e a trombina gerada pelos

processos de coagulação participam da ativação e agregação plaquetárias.

Além disso, a plaqueta ativada aumenta a ação da protrombinase, que

promove maior produção da trombina, a partir da protrombina, criando assim,

condições para a amplificação da adesão plaquetária. O ADP liberado das

hemácias e grânulos densos das próprias plaquetas é outro elemento

amplificador da agregação das plaquetas. Este induz nelas a exposição do

receptor glicoproteína IIb/IIIa ao fibrinogênio e fator de Von Willebrand.

Contribuindo também para a agregação plaquetária, o ácido araquidônico da

membrana das plaquetas em processo de agregação, é convertido em TxA2

pelas enzimas ciclooxigenase e tromboxane sintetase. O TxA2, além de forte

agonista da agregação plaquetária, é um potente vasoconstritor e, também,

indutor da exposição dos sítios de ligação da glicoproteína IIb/IIIa ao

fibrinogênio e fator de Von Willebrand. Outro importante derivado do

araquidonato, que é liberado por macrófagos e mastócitos, plaquetas e outras

células ativadas, é o PAF. Este é um ativador importante de plaquetas e indutor

da sua agregação. Como agonistas da agregação plaquetária, podem também

ser citadas a noradrenalina e a serotonina. Esses mediadores estimulam

diferentes cascatas de ativação plaquetária, porém, a via final comum a todos é

a ativação do receptor da glicoproteína IIb/IIIa que pela interação com o fator

de Von Willebrand e o fibrinogênio é o verdadeiro efetor da agregação e

ativação plaquetária formando assim o coagulo e parando o sangramento38,39.

29

Na segunda fase o fibrinogênio plasmático que está extravasando da

área lesada do vaso e o fibrinogênio plaquetário são induzidos a polimerizar

através das vias intrínsecas e extrínsecas da coagulação. O fator Hageman

ativa via intrínseca e a lipoproteína ativa a via extrínseca da coagulação O gel

extra vascular que ocupa a fenda criada pela lesão é composto de material

proveniente do sangue e por uma matriz extracelular fraca formada de

fibrinogênio, fibronectina e fator Von Willebrand. As plaquetas ativadas liberam

fatores de crescimento como o TGF β e o PDGF, quimiocinas como o CTAP-III

e também outras proteínas como fibrinogênio, fibronectina e tromboplastina

que são encontradas em seus grânulos. A interação das proteínas dos

grânulos plaquetários com proteínas da matriz extracelular somados à massa

de corpos plaquetários agregados, ao se estabilizarem, formam uma matriz

provisória. Esta se torna mais consistente à medida que a fibrina se polimeriza

pelas vias intrínsecas ou extrínsecas da coagulação35.

2.2.2 Fase Inflamatória

Os estímulos necessários para o início da reação inflamatória são

proporcionados logo após o fim a lesão do vaso. A resposta celular à fase

inflamatória é caracterizada pelo influxo de leucócitos para a área lesada. No

inicio da fase inflamatória, neutrófilos e monócitos são as células mais

importantes no local da lesão. Logo após a lesão, neutrófilos e monócitos

começam a emigrar dos capilares para o ferimento, com os neutrófilos sendo

os primeiros a chegar em grande número tendo como função principal neste

processo a eliminação de possíveis microrganismos pela fagocitose.

Posteriormente o número de neutrófilos diminui e os macrófagos, derivados

dos monócitos, passam a predominar com o papel de auxiliar os neutrófilos na

eliminação de microrganismos pela fagocitose. Desta forma, a fagocitose

destas células atua como elo entre o sistema imune inato e o adaptativo. Além

disso, é a célula mais eficiente na eliminação de fragmentos teciduais inclusive

removendo pela fagocitose os neutrófilos que perderam função40.

Os neutrófilos e monócitos são recrutados para o ferimento por um

gradiente de mediadores liberados durante a homeostasia. Os mediadores

gerados durante o processo de coagulação servem para regular a aderência

30

intercelular. A histamina, protease, lecotrienos e citocinas, representam uma

fonte adicional do sinal de recrutamento dos leucócitos. Os fatores de

crescimento PDGF e TGF β são também importantes mediadores para os

leucócitos, uma vez no local da lesão integram os receptores na superfície

celular dos neutrófilos elevando a interação com a matriz celular. A infiltração

de neutrófilos normalmente ocorre em poucos dias, mas a presença de

contaminação no ferimento pode prolongar a permanência dos neutrófilos na

lesão e pode atrasar o processo de cura41,42.

Li, Chen e Krisner37 dissertam que a migração dos monócitos para o

espaço tecidual e a transformação destes em macrófagos, torna este tipo

celular predominante na fase tardia da fase inflamatória. Inicialmente os

monócitos são atraídos para o local do ferimento pelas mesmas substâncias

quimiotáticas que atraem os neutrófilos, e eles são recrutados continuamente

através de sinais deixados pelas substâncias quimiotáticas dos monócitos

específicos, assim como as proteínas quimiotáticas dos monócitos e proteínas

inflamatórias dos macrófagos. A degradação da matriz extracelular produz

fragmentos de colágeno, fragmentos de fibronectina e trombina e também as

substâncias quimiotáticas dos monócitos. Os macrófagos são considerados as

células mais importantes na reação inflamatória. Os macrófagos digerem os

organismos patogênicos; eliminam fragmentos teciduais; e destroem os

neutrófilos remanescentes. Após as células, os tecidos e os microrganismos

serem fagocitados, estes serão destruídos através da liberação de

intermediários biologicamente ativos de oxigênio e proteínas enzimáticas. Todo

este processo é realizado pelos monócitos/macrófagos permitindo a

angiogênese e a formação do tecido de granulação.

2.2.3 Fase Proliferativa

Balbino, Pereira e Curi38, descrevem que a presença local de

macrófagos derivados de monócitos e a produção e liberação dos mediadores

químicos produzidos por eles, a migração e ativação de fibroblastos é

intensificada. Essas células são os principais componentes do tecido de

granulação e após a influência dos fatores de crescimento e demais

mediadores, derivados principalmente dos macrófagos, são ativadas e migram

31

das periferias para o centro da ferida. Isto se dá pela matriz provisória formada

e seguindo a orientação do gradiente químico de substâncias quimiotáticas.

Com o aumento do número de fibroblastos ativados para a produção de

colágeno no local, a matriz extracelular começa a ser substituída por um tecido

conjuntivo mais forte e mais elástico. Este processo é denominado de

fibroplasia e para a sua eficiência é necessária que ocorra em paralelo da

formação de novos vasos sanguíneos, ou seja, é necessária uma “nova

vascularização” da região. Além da ação direta de fatores de crescimento sobre

as células dos vasos, a indução da angiogênese é, em parte, creditada à baixa

tensão de oxigênio.

Com o início da fibroplasia ocorre a formação do tecido de granulação

(por volta do quarto dia) composto por macrófagos, fibroblastos e vasos

neoformados que estão suportados por uma matriz frouxa de fibronectina,

ácido hialurônico (hialunorato) e colágeno tipos I e III. Este tecido é edematoso

e caracterizado pela presença de muitos espaços vazios, devido à imaturidade

dos vasos, os quais são extremamente exudativos e sangram com facilidade. A

“nova vascularização” é essencial neste estágio porque permite a troca de

gases e a nutrição das células metabolicamente ativas. Sob estímulo de fatores

de crescimento e de outros mediadores, as células endoteliais do interior de

capilares intactos nas margens da ferida passam a secretar colagenase e o

ativador do plasminogênio. Essas substâncias promovem aberturas na

membrana basal e permitem a migração das células endoteliais que,

atravessando a parede do vaso e utilizando como substrato a matriz

extracelular provisoriamente produzida, seguem em direção à região da lesão.

Uma vez na região externa do vaso, elas passam pelo processo de

diferenciação para aquisição da capacidade de formação de novos tubos

capilares. As células endoteliais migratórias formam no exterior do vaso um

broto capilar que em seguida une-se ao capilar de onde eram originárias para o

restabelecimento do fluxo sanguíneo 37.

Todo processo lesivo promove a perda de massa do tecido. A área de

uma ferida aberta necessita ser preenchido e para isto são operadas duas

estratégias diferentes. Na primeira, a própria natureza anatômica da lesão

proporciona um estímulo para a migração e proliferação das células (células

epiteliais e fibroblastos) a partir das suas margens. As células basais próximas

32

à região da lesão, ao perderem a interação com as células adjacentes, são

ativadas, adquirem propriedades mitóticas e proliferam em direção ao centro da

lesão. Na segunda, mesmo quando o espaço da lesão está preenchido por

tecido de granulação, as margens se movem uma em direção à outra, como se

houvesse uma força de tração invisível. Isto ocorre devido à diferenciação de

alguns fibroblastos das margens da ferida para miofibroblastos, portanto, para

fibroblastos com capacidade contrátil37, 43.

Balbino, Pereira e Curi38 relatam que com a evolução do processo, a

matriz extracelular, que inicialmente era composta principalmente por proteínas

derivadas de plaquetas e do plasma, passa por modificações em sua

composição. A migração e ativação de macrófagos e fibroblastos para a região,

somada à presença de vasos neoformados, permitem que os componentes da

nova matriz extracelular passem a ser localmente produzidos principalmente

por estas células. Os fibroblastos passam a depositar grandes quantidades de

fibronectina que, embora seja substrato que desempenha outras funções,

basicamente serve para a fixação da própria célula. Outra substância produzida

em grande quantidade neste segundo estágio é o ácido hialurônico, um

polissacarídeo glicosaminoglicano não sulfatado com facilidade de se ligar à

água, que auxilia na resistência do tecido à compressão. Estas duas

substâncias predominam na matriz durante as primeiras fases do reparo, pois

esta combinação propicia um micro ambiente eficiente para a movimentação

das células, necessárias nesta etapa. À medida que o processo de maturação

da ferida avança, a concentração de ácido hialurônico diminui e aumenta a

síntese de proteoglicanos ou glicosaminoglicanos sulfatados. Essa modificação

na composição da matriz extracelular favorece a fixação e imobilidade das

células favorecendo a diferenciação delas para fenótipos mais maduros. As

células endoteliais dos vasos neoformados se diferenciam em células de

revestimento e os vasos neoformados assumem as características funcionais

de capilares. Os fibroblastos são as células que passam por mudanças de

fenótipo mais acentuadas. Do fenótipo de células imaturas migratórias e

replicativas no início do processo, passam para fenótipo característico de

células ativamente engajadas na síntese protéica, ou seja, o seu citoplasma se

torna volumoso e apresenta um retículo endoplasmático rugoso abundante.

Com isto, eles passam a secretar grandes quantidades de colágeno. Este aos

33

poucos substitui os proteoglicanos e a fibronectina até se tornar o principal

componente da cicatriz em formação.

A tensão de oxigênio é um importante mecanismo de regulação do

processo de reparo. No início do processo, a baixa tensão serve como estímulo

ao macrófago para a produção de fatores de crescimento, para a migração e

proliferação centrípeta das células das margens da ferida e faz a indução da

angiogênese. Nesta etapa, é necessária uma alta tensão de oxigênio para a

hidroxilação dos resíduos de prolina e lisina nas cadeias polipeptídicas do

colágeno montadas no citoplasma dos fibroblastos. Isto é proporcionado pela

rede capilar neoformada44,45.

Durante a fixação dos fibroblastos e seu amadurecimento para células

produtoras de colágeno, o processo de contração da ferida alcança a sua

eficiência máxima. Isto ocorre devido à mudança dos fibroblastos das margens

da ferida para miofibroblastos. Os fibroblastos destas regiões marginais

começam a exibir características funcionais similares às células do músculo

liso. Os miofibroblastos são encontrados alinhados ao redor de depósitos da

nova matriz extracelular, fazendo uniões celulares e gerando força de tensão.

Auxilia também no processo de contração da ferida o ressecamento da sua

crosta superficial que durante a desidratação diminui de tamanho e arrasta o

tecido a ela aderido36.

O processo de reepitelização da ferida se inicia imediatamente após a

lesão. Células primitivas da camada basal do tecido epidermal possuem

potencial mitótico latente. Em tecidos normais, este se encontra inibido pelo

contato existente entre as células pela "inibição por contato". Com a ocorrência

de uma lesão, este mecanismo inibitório desaparece e as células entram

imediatamente em processo mitótico. A ineficiência e dificuldade de

constatação do processo mitótico destas células nas etapas iniciais são

devidas à, ainda, inexistência de um substrato adequado para isto na região da

ferida. Este somente é fornecido quando o tecido de granulação alcança o nível

da epiderme. Quando ativadas, as células da epiderme retraem os

tonofilamentos intracelulares, ocorrendo à dissolução dos desmossomas

intercelulares e nas margens do interior da célula se formam filamentos de

actina. Estas alterações permitem sua movimentação em direção ao centro da

ferida. As células migram sobre a matriz celular provisória e, durante sua

34

trajetória, segue depositando quantidades significativas de fibronectina. A

superfície da ferida umedecida e oxigenada é um fator que acelera o processo

de migração. Quando estas células encontram uma crosta recobrindo a região

lesada, promovem uma dissecação entre esta e a matriz, porém, à custa de um

retardo de velocidade de migração. À medida que a região da lesão vai sendo

coberta pelas células epidermais é acionado o mecanismo de "inibição por

contato". As células voltam a apresentar o fenótipo original, a membrana basal

é refeita e os hemidesmossomos e desmossomos são reconstituídos46.

Segundo Balbino, Pereira e Curi38, ao final desta etapa, o leito da ferida

está totalmente preenchido pelo tecido de granulação, a circulação é

restabelecida pela nova vascularização e a rede linfática está passando por

regeneração. Lentamente o tecido de granulação é enriquecido com mais fibras

colágenas o que começa a dar à região lesada a aparência de cicatriz devido

ao acúmulo de massa fibrosa.

2.2.4 Fase de Remodelação

Conforme Li, Chen, Krisner37 comentam a fase de remodelação tem

início por volta do décimo dia, o leito da ferida está totalmente preenchido pelo

tecido de granulação, com uma rede capilar atravessado-a, com a rede linfática

em regeneração. O tecido de granulação vai sendo enriquecido com mais

fibras de colágeno e começa a adquirir a aparência de massa fibrótica

característica da cicatriz. Nesta etapa, surgem as primeiras fibras de colágeno

tipo I. Com a evolução do processo, acentua-se a deposição de colágeno e a

maioria das células desaparecem formando finalmente a cicatriz. É consenso

atualmente, que a resolução completa de uma ferida, somente pode ser

considerada depois de concluída a maturação e remodelagem da matriz

extracelular. Este processo ocorre lentamente levando muitos meses ou às

vezes anos.

Os eosinófilos aparecem nas últimas fases da reparação e presumi-se

que podem estar relacionados à produção de fatores de crescimento. Quando

a ferida completou o seu fechamento e os microrganismos foram eliminados,

os linfócitos constituem o subsistema leucocitário mais abundante em feridas

humanas. Os linfócitos não somente são efetores imunes, mas também,

35

produtores de fatores de crescimento. De forma notável, nesta etapa, eles são

atraídos para a região da ferida em igual número que os monócitos e, a partir

do décimo quarto dia, são os leucócitos que predominam na região38.

Segundo Carvalho39 a resistência de uma cicatriz é dada pela

quantidade de colágeno depositada e pela forma com que as fibras estão

organizadas. Quanto maior o número de ligações covalentes transversais,

maior a resistência da cicatriz. Quando secretado na forma de tropocolágeno,

as ligações transversais das fibras se dão por pontes de hidrogênio. No

processo de amadurecimento da fibra, as lisinas, hidroxilisinas e lisinas

glicosiladas constituintes da molécula de tropocolágeno são oxidadas até

aldeídos pela enzima lisiloxidase. Estes, após a oxidação, se ligam

covalentemente com outros grupos aldeídos ou com lisinas não oxidadas, o

que aumenta a resistência da fibra.

O processo de remodelamento da cicatriz envolve etapas sucessivas de

produção, digestão e orientação das fibrilas de colágeno. Ocorrendo uma

transformação dos tipos de colágenos onde há uma degradação do colágeno

tipo III e aumento da síntese do colágeno tipo I. Este processo de conversão da

derme é consumado através de um controlado sistema de produção de

colágeno e lisina do velho colágeno. A deposição de colágeno é feita a

princípio de maneira aleatória tendo como orientação a organização da

fibronectina e dependente da natureza e direção das tensões aplicadas ao

tecido. Essas fibras são subsequentemente digeridas pela colagenase,

sintetizadas, rearranjadas de acordo com a organização das fibras do tecido

conjuntivo adjacente e lateralmente ligadas por ligações covalentes. Essas

ligações são formadas entre moléculas de tropocolágeno no âmbito da fibrila e

entre as próprias fibrilas. Repetições sucessivas da lise, síntese,

redirecionamento e novas ligações formam fibras maiores de colágeno e

resultam numa configuração mais regular da cicatriz. Isso aumenta a sua

resistência devido à organização das fibras acompanhando as forças

mecânicas a que o tecido está sujeito durante a atividade normal37, 47.

Ao final desta etapa, os anexos da pele, como folículos pilosos e

glândulas sofrem regeneração limitada e a coloração da cicatriz permanece

pálida, pois a regeneração dos melanócitos é deficiente e as cicatrizes são

hipovascularizadas devido ao desaparecimento dos “novos capilares”38.

36

2.3 Terapia Laser de Baixa Potência (TLBP)

Conforme Rosa, Hammerschmitt e Souza 48 os laseres são classificados

em duas famílias, conforme sua potência e capacidade de interação com os

tecidos, sendo divididos em: laseres de baixa potência (< 500 mW) e laseres de

alta potência. A TLBP deve seguir os parâmetros de comprimento de onda,

densidade de energia, densidade de potência, tipo de operação do laser,

freqüência do pulso, número de sessões, características ópticas do tecido

(coeficiente de absorção e espalhamento).

Posten et al. 49 explica que TLBP é definida por vários parâmetros. O

primeiro é a energia de 10-3 a 10-1 W. Outros parâmetros importantes são: o

comprimento de onda (600 a 1000 nm); o pulso que pode ser de 0 (contínuo)

para 5000 Hz; duração do pulso que vai de 1 a 500 milissegundos; o intervalo

entre os pulsos que também varia de 1 a 500 milissegundos; o tempo total de

irradiação que varia de 10 a 3000 segundos; densidade de potência que pode

oscilar entre 10-2 a 100 mW/cm2 e a dose (tempo de energia irradiada/ área

irradiada que pode variar de 10-2 a 20 J/cm2).

Hawkins e Abrahamse 6 elucidam que os efeitos celulares da fototerapia

podem ser classificados em primário (indução da luz), secundários (ocorre em

resposta ao efeito primário) e o efeito terciário. As primeiras reações são

geralmente restritas à absorção do fóton. Os efeitos secundários são em uma

quantidade menor que os efeitos primários. Os efeitos terciários são os de

menor prognóstico

Na resposta primária, os fótons emitidos pelo laser alcançam a

mitocôndria e a membrana celular assim como também os fibroblastos e

queratinócitos aonde a energia foi absorvida e convertida em energia química e

cinética no interior da célula. Esses efeitos modificam a permeabilidade de

membranas, aumentando a formação de óxido nítrico. O aumento do

metabolismo oxidativo pode culminar em aumento da síntese de ATP, o qual

conduz para normalização da função celular 7,50. Hawkins e Abrahamse 6

comentam que reação secundária leva para a amplificação da fotorreação

primária. A cascata de efeitos metabólicos resulta em várias alterações

fisiológicas em nível celular conforme as alterações na permeabilidade das

37

membranas da célula. Cálcio é liberado das mitocôndrias dentro do citoplasma.

Com as alterações nos níveis intracelulares deste íon há o estímulo do

metabolismo celular e regularização do mesmo, sinalizando o caminho

responsável para os eventos necessários na reparação da lesão da mesma

forma que guia a migração celular, a síntese de RNA e DNA, síntese de

proteínas e proliferação celular. O terceiro efeito é produzido em células

distantes. Alguns efeitos são os mesmo efeitos que os secundários. Células

irradiadas ou energizadas comunicam-se umas com as outras e com células

não irradiadas, através do aumento dos níveis de citocinas ou fatores de

crescimento resultando em comunicação intercelular. Existe uma elevação na

resposta imune, com ativação dos linfócitos T e macrófagos, um aumento na

endorfina e diminuição da bradicinina resultando em alivio da dor 51,7.

Segundo Rosa e Hammerschitt52 os fotorreceptores celulares são

sensíveis a certos comprimentos de onda, absorvem os fótons desencadeando

as reações químicas. Assim acelera a síntese de ATP (glicólise e fosforilação

oxidativa) em curto prazo e em longo prazo acelera a transcrição e replicação

de DNA, além de promover os efeitos sistêmicos53. Hawkins e Abrahamse54

explicam que a TLBP na região do vermelho é bastante absorvida por

componentes da cadeia respiratória. Fótons penetram o tecido e são

absorvidos em nível de mitocôndrias e membranas celulares52. A energia dos

fótons é convertida em energia química dentro das células, em forma de ATP,

para a qual conduz para a normalização da função celular. A permeabilidade

da membrana celular se altera e alterações fisiológicas ocorrem. Pequenas

doses de luz intensificam o gradiente protônico na mitocôndria, seguido de

aumento da liberação de Cálcio no citoplasma. Este processo dá início a vários

processos biológicos como síntese de DNA e RNA, mitose celular e células de

proliferação. Altas doses podem liberar muito cálcio, podendo sobrecarregar as

células e inibir o metabolismo celular.

Posten et al.49 descreve que vários elementos têm sido usados para

estabelecer parâmetros para a TLBP. Pesquisas iniciais usaram laseres

baseados em gases inativos (inertes), incluindo Helio-Neônio (He-Ne; 632,8

nm), rubi (694 nm) Argônio (488 e 514 nm). Estudos subsequentes usaram

laseres semicondutores de diodo, incluindo Arseneto de Gálio (GaAs, 904 nm)

e Arseneto de Gálio-Aluminio (GaAlAs; 600 e 1000 nm). A maioria dos estudos

38

da TLBP, possivelmente devido ao custo e a utilidade de uso, tem utilizado o

laser na região visível do espectro eletromagnético. Rosa, Hammerschmitt e

Souza48 afirmam que estes comprimentos de onda têm sido bastante usado

como finalidade terapêutica devido à boa absorção pelos tecidos biológicos.

O laser 660 nm é um laser de baixa potência (radiação eletromagnética

coerente na região do vermelho). O efeito térmico associado com a irradiação

laser de baixa de potência ocorre antes de um minuto, os efeitos fisiológicos

são conferidos diretamente a biomodulação das células expostas. Estudos têm

revelado que a radiação coerente na região visível do espectro eletromagnético

estimula a proliferação celular, atua sobre o sistema imune e estimula a síntese

de colágeno. É observado também que os níveis de ATP celular aumentam em

quase o dobro após a irradiação com laser de He-Ne (632,8 nm) quando

absorvida por células em cultura. Uma possibilidade pode ser que a energia

laser é absorvida pelos cromóforos intracelulares e convertidos em energia

metabólica55, 48.

A radiação eletromagnética coerente na região do vermelho tem efeito

sobre o processo de cicatrização. Estudos com linfócitos mostram que a TLBP

pode levar a um aumento da secreção de imunoglobulinas, liberação de

citocinas, atividade fagocitária e leucocitária. Estudos com macrófagos

demonstraram um aumento na atividade dos lisossomos e fosfatases,

estimulando a liberação de fatores de crescimento e aumentando a atividade

fagocitária55, 57.

Segundo Say et al.58 culturas de linfócitos irradiados com laser na região

do vermelho apresentam aumento na capacidade de fagocitose, incremento da

superfície de contato, bem como afinidade do organismo invasor. Dessa forma

se pode concluir que este tipo de estimulação eleva o reconhecimento de

antígenos por acréscimo na atividade linfocitária.

2.4 Light Emitting Diodes (LED)

Há algum tempo vêm sendo apresentado no mercado aparelhos que têm

sua luz emitida por diodos (light emitting diodes), gerando radiação

eletromagnética não coerente, tanto na região visível quanto infravermelha do

39

espectro eletromagnético, com faixa estreita de emissão (variação na faixa de

20 nm) e alta intensidade (50 a 100 mW)8,9 (figura 2).

Figura 2: Luz Emissora de Diodo, disponível em:

electronics.howstuffworks.com/led3.htm59 acesso em 21 fev. 2008

Medeiros60 confirma relatando que o LED trata-se de um diodo emissor

de luz, que quando energizado emite luz, monocromática e não coerente. É

uma luz com alto grau de pureza. São semicondutores, tendo como

característica principal, conduzir corrente elétrica em um único sentido.

Os LEDs são pequenos meios feitos de material semicondutor,

constituídos por cristais que incluem a combinação de dois ou três elementos.

Esta combinação única de elementos tem uma estrutura cristalina que pode

acomodar ambos os elétrons negativamente alterados e elétrons alterados

vagamente positivos, os quais são separados por um espaço (junção P-N). Os

materiais semicondutores chamados de periféricos possuem um tipo de orbital

“n” que tem um excesso de carga negativa (elétrons) e um tipo de “orbital” “p”

que possui um excesso de carga positiva (espaço), Quando uma transferência

de energia é aplicada nessas estruturas o elétron move-se através da interface

P-N e enche o espaço no lado p, seguindo em direção ao nível de energia

baixa. Idealmente, o excesso de energia da transmissão de cada elétron

resulta em emissão espontânea de fótons 59,61.

Para Namai et al.62 os LEDs são um meio de luminescência artificial que

utiliza ambas injeções de carga (IC) transferência de elétrons (TE),

recombinação de carga (RC) e volta do elétron transferido (VET) em um

40

mecanismo ligado ao envolvimento do processo bioquímico e

eletroquimioluminescência. Uma combinação do TE e VTE está envolvida na

reação de foto indução da eletro transferência (FET) de substratos orgânicos

O processo de emissão de luz pela aplicação de uma fonte elétrica é

denominado “eletroluminescência”. A luz se dá devido ao diodo (junção P-N)

energizado62.

A termoluminescência é um termo dado à emissão de luz,

desencadeada pela atividade térmica. Usualmente a termoluminescência

ocorre quando um estado único de excitação eletrônica de um substrato é

formado pelo VET entre um radical cátion e um radical anion, formado pela

simultânea oxidação e redução do substrato promovido pelo uso de um número

de diferentes métodos de irradiação. Conforme as reações FET da

termoluminescência e eletroluminescência dos LED em tecidos orgânicos

envolvem a TE (ou IC) e VET (ou RC), são os passos chaves do mecanismo. A

maior diferença entre o FET é que as energias deficientes provenientes do VET

para as reações FET causam produção de estados básicos, para onde a

energia suficiente VET ou RC para a termoluminescência ou

eletroluminescência do LED no tecido orgânico podendo estimular a formação

do estado excitado62, 63.

Uma característica observada nesta radiação é a monocromacidade, ou

seja, um único comprimento de onda ou variável em um comprimento estreito.

A cor da radiação LED depende da pastilha do material semicondutor64.

Apesar desse tipo de luz estar presente em nosso cotidiano

(principalmente em eletrônico) já há algum tempo, somente recentemente ele

vem sendo utilizado em e investigado na área biológica60. Em um estudo

recente Faria65 relata que após a utilização do LED na região visível do

espectro eletromagnético em animais tenotomizados foi observado nitidamente

um quadro de hipercelularidade associado à presença de fibras colágenas e

esparsas, já apresentando aspectos morfológicos indicativos de formação das

fibras colágenas com angulação de até 25º comparado ao tecido integro.

Notou-se uma diminuição da presença de substância fundamental amorfa e de

células inflamatórias crônicas e células fagocitárias. O autor observou

resultados superiores atribuídos à terapia com LED quando comparada à

terapia com laser.

41

Outras características interessantes são: a maior seletividade da luz,

maior tempo de vida útil do aparelho e menor custo de energia66. A variação

térmica presente nos aparelhos de LED é incapaz de causar maiores danos

quando o aparelho é usado em tempos prolongados. Em vista dessas

vantagens alem do baixo custo e praticidade os aparelhos de LED vem

conquistando o mercado, assim como sendo cada vez mais estudados67.

Segundo Califano64 a terapia com luz de baixa potência

(fotobiomodulação) consiste da utilização da luz na faixa do vermelho e

infravermelho próximo (600 a 1000nm) para modular várias funções celulares.

Karu68 explica que a fotobiomodulação ocorre devido a luz

monocromática proveniente dos laseres e LEDs que agem diretamente nos

organismos a nível molecular, nos fotorreceptores primários. O mecanismo

fotobiológico universal de ação da luz inicia na cadeira respiratória nos

fotorreceptores, gerando respostas celulares específicas.

A absorção natural da luz de baixa potência por tecidos biológicos é

puramente não coerente (fotobiológica), devido ao espalhamento de luz nas

primeiras camadas de tecido. No nível celular, as respostas biológicas são

determinadas pela absorção da luz nos fotorreceptores moleculares. A

coerência da luz laser e a não coerência dos LEDs, com o mesmo

comprimento de onda, intensidade e dose fornece respostas biológicas

semelhantes64.

Trelles e Calderhead 69 relatam que em seu estudo que a terapia com

LED no vermelho 633 nm, possui uma variedade de efeitos, assim como

atenuação da dor, cicatrização e propriedades anti-virais.

Takezak et al.70 descreve que em nível dos fibroblastos, seus resultados

usando um LED 633 nm demonstram uma elevação do nível de metabolismo,

devido ao acréscimo abundante de mitocôndrias quando comparado como

fibroblastos não irradiados. O aumento no número de mitocôndrias nas células

são indicativos da grande demanda de energia, diretamente relacionada com o

aumento do metabolismo.

Vink et al.71 comenta em seu estudo que a biomodulação positiva da

cicatrização é frequentemente vista com ceticismo. Os benefícios reais da

terapia LED, podem somente ser estabelecidos por investigação histológica e

clínica realizada sobre protocolos controlados. Aplicação LED em feridas

42

cutâneas, em pele humana, pode ser assumida pela aplicação de parâmetros

dosimétricos, mas futuras investigações são necessárias para explicar o

mecanismo de biomodulação e fornecer protocolos para o uso efetivo de

parâmetros de tratamento com LED72.

43

3 OBJETIVO

3.1 Objetivo Geral

Análise comparativa da terapia com LED (640±20 nm) e laser (660 nm)

sobre o processo de reparação de feridas cutânea em ratos idosos.

3.2 Objetivos Específicos

Avaliar quantitativamente:

- O número de fibroblastos;

- O número de células inflamatórias;

- O número de vasos;

- O número de colágeno;

- A área da lesão durante o processo.

44

4 MATERIAL E MÉTODOS

4.1 Aspectos Éticos

Está pesquisa está de acordo com os princípios Éticos seguindo as

diretrizes nacionais e internacionais da pesquisa envolvendo animais.

Protocolo n°A94/CEP/2007 (anexo A).

4.2 Modelo Experimental

Foram utilizados 54 ratos albinos machos idosos, linhagem Wistar; com

o peso corporal médio de 500g e idade de 14 meses, provenientes do Biotério

da W.C. LirioME (Animais de Laboratório) da cidade de Vitória do Estado do

Espírito Santo

Os animais foram mantidos no Biotério da UnisulBahia Faculdades

Integradas em gaiolas apropriadas de polietileno padrão, em grupos aleatórios

de 6 animais por gaiola, com acesso a água e ração ad libitum, passando por

um período de adaptação de cinco dias. A sala foi mantida com as condições

de iluminação controlada em ciclos de 12 horas claro/12 horas escuro.

Os 54 animais foram aleatoriamente divididos em nove grupos com n=6:

- Grupo Controle 144: animais sem tratamento, sacrificados após 144

horas do procedimento cirúrgico.





- Grupo Laser 144: animais tratados com Laser, sacrificados após 144






- Grupo LED 144: animais tratados com LED, sacrificados após 144


45





4.3 Procedimento Cirúrgico

O procedimento cirúrgico foi realizado no laboratório de Fisiologia da

UnisulBahia Faculdades Integradas. Todos os animais receberam por via

subcutânea, um pré-tratamento com atropina (relaxante muscular), na dose de

0,04 ml para cada 100 g de peso corpóreo, aguardando 15 minutos para o

procedimento anestésico79. As drogas anestésicas foram cloridrato de

Ketamina10% (Syntec), 0,1 ml /100 g de peso corpóreo com xilazina 2%

(Syntec), 0,1 ml / 100 g, por via intramuscular, utilizando-se seringa de insulina

de 1 ml. Após anestesia os animais foram tricotomizados na região dorsal,

realizando a anti-sepsia da região com álcool iodado 2%. Foi realizado uma

incisão circular com um punch 0,8 cm de diâmetro (instrumento estéril para

biópsia) na região tricotomizada, com profundidade de aproximadamente 1

mm.

4.4 Terapia com Laser e LED

Os equipamentos utilizados no estudo foram: laser de escala industrial

(Bio Wave LLLT Dual – Kondortheck, referência em equipamentos

odontológicos) com comprimento de onda de 660 nm, com potência de 30 mW,

área de 0,5 cm2 em contato direto com a pele do animal. O tempo empregado

foi de 100 segundos, obtendo-se uma dose final de 6 J/cm2 por aplicação

pontual. O LED utilizado foi construído no Instituto de Pesquisa e

Desenvovimento (IP&D) da UNIVAP no comprimento de onda de 640±20 nm

com potência de 54 mW, área de 0,5 cm2 em contato direto com a pele do

animal. O tempo empregado foi de 60 segundos, obtendo-se uma dose final de

6 J/cm2 por aplicação pontual. Antes do inicio da terapia, a potência dos

equipamentos foi medida empregando-se um medidor de potência (Broadband

Power/Energy Meter, Modelo 13 PEM 001/J) no IP&D da UNIVAP.

46

O procedimento terapêutico teve início 30 minutos após a lesão

(irradiação única) e se repetiu a cada 48 horas, num total de 3 aplicações.

Todos os animais receberam a mesma manipulação.

Para o procedimento terapêutico, os animais foram posicionados em

uma mesa, em decúbito ventral, imobilizados manualmente. As regiões

lesionadas receberam a aplicação do laser ou LED em contato direto com a

ferida de forma pontual, formando um anglo de 90° em relação à ferida (figura

3) na dosagem de 6 J/cm² durante 100 segundos para o laser e 60 segundos

para o LED. Os equipamentos foram protegidos com filme plástico para evitar

contaminação. A área de lesão dos animais foi fotografada diariamente para

posterior análise métrica por análise de imagem (programa ImageJ).

Figura 3: Aplicação do Laser (A) e do LED (B).

4.5 Sacrifício dos Animais

O sacrifício dos animais e o procedimento terapêutico seguiram o esquema abaixo:

Sacrifício Sacrifício Sacrifício

0 24 48 72 96 120 144 168 192 216 240 264 288 312 336 360 384 408 432 456 480

3ª aplicação

2ª aplicação

Cirurgia e 1ª aplicação

A B

47

Os animais foram sacrificados em 144, 312 e 480 horas após a cirurgia,

sendo três grupos com 144 horas, três grupos com 312 horas e três grupos

com 480 horas após a lesão. Foi utilizado o mesmo procedimento anestésico

empregado para a cirurgia. Depois de anestesiados os animais receberam

cloreto de potássio a 10% (KCl, 1ml) por via intracardíaca. A região da incisão

circular dos ratos foi removida e fixada em solução de formol a 10% por vinte e

quatro horas e posteriormente foi submetida à processamento histológico.

4.6 Técnica Histológica

Após a fixação, as amostras de pele foram enviadas ao laboratório

Histotec na cidade de São Paulo onde foram desidratadas e inclusas em

paraplast, em seguida foram confeccionados os blocos para serem cortados

em micrótomo, de forma semi-seriada com secções de 5 µm de espessura.

Foram obtidos 8 cortes por animal, sendo 4 cortes corados com Hematoxilina e

Eosina e 4 cortes corados com Tricrômico de Masson.

4.7 Análise da área da lesão

Para a análise da área da lesão a série de comandos utilizados após a

calibração foi: brush selection para demarcar toda a circunferência da lesão,

em seguida o comando mensure para obter a área da lesão (Figura 4).

48

Figura 4: Cálculo da área da lesão pelo programa Image J 1,42d.

4.8 Histomorfometria

As lâminas histológicas foram submetidas à análise por microscópica

óptica e a captura digital no laboratório de laser de alta potência do Instituto de

Desenvolvimento e Pesquisa da Universidade do Vale do Paraíba. A captura

das imagens foi efetuada através de uma câmara digital da marca Leica®, com

resolução de 1280 X 1024 pixels e acoplada a um microscópio trinocular. As

fotomicrografias foram obtidas em aumentos de 40, 100 e 200 vezes e

armazenadas no formato TIFF (Tagged Image File Format).

Os cortes forma representativos da região mediana da amostra do tecido

e para a quantificação da quantidade de células inflamatórias,

49

neovascularização, fibroblastos e colágeno, forma digitalizadas quatro campos

por corte, sendo 4 cortes por lâmina, duas lâminas por animal. Todas as

imagens foram digitalizadas através do programa Leica® Qwin, foram também

padronizadas quanto à intensidade da luz do microscópio e altura do

condensador com a objetiva de 40 x. Houve a obtenção de valores médios para

cada corte e depois para cada animal e ao final a média do grupo (controle,

laser ou LED nas diferentes horas pós-operatórias).

O programa utilizado para realizar a contagem das células inflamatórias,

fibroblasto, vasos neoformados e quantidade de colágeno presente na imagem

foi o programa Image J 1,42d. As imagens foram adquiridas através das

seguintes ordens de comando: File, open e o arquivo desejado. Para a

contagem das células a série de comandos utilizados foi: Plugins, Analyze, Cell

Counter, Initialyze e Type (figura 5). Onde type 3 correspondia à contagem de

células inflamatórias (figura 7), type 5 correspondia à contagem de fibroblastos

(figura 6) e type 7 correspondia à contagem de neovasos (figura 6), que foram

contados manualmente. Para medir a quantidade de colágeno, em µm2, o

procedimento foi a sequência de comandos: Image, Type, 8-Bit, em seguida

voltando em Image, Adjust, Threshold. Realizava-se a marcação e clicava-se

em Aply. Para finalização da mensuração da área de colágeno clicava-se em

Messure (figura 7).

Figura 5: Contagem de células inflamatórias, vasos, fibroblastos pelo programa Image J

1,42d.

50

Figura 6: Indicação do padrão usado na contagem de células inflamatórias (3),

fibroblastos (5), e neovasos (7).

Figura 7: Cálculo da área de colágeno pelo programa Image J 1,42d. Seguindo a

sequência A, B, C, D, E e F

3

5

7

A B C

D E F

51

4.9 Análise estatística

Os dados foram avaliados quanto ao coeficiente de variação e a

distribuição amostral para determinação do teste estatístico considerando o

nível de significância estatística de 5% (p<0,05)53. Empregou-se o teste de

ANOVA com pós-teste de Bonferroni.

52

5 RESULTADOS

5.1 Análise macroscópica

5.1.1 Cálculo de área

A análise da área das feridas está cronologicamente representada na

figura 8.

Figura 8. Área da ferida dos diferentes grupos no decorrer de 480 horas. Valores expressos

em média ± erro padrão, * p<0,05.

A área da ferida do grupo irradiado com LED em 96 horas (4 dias) foi

significativamente menor em relação à contração da lesão que o grupo controle

(p<0,001) e o grupo laser (p<0,05), O grupo controle e laser obtiveram redução

da ferida em 50% e 37%, respectivamente, ao passo o grupo LED obteve

53

redução de 26% somente neste período. Este percentual reduzido de

contração da ferida no grupo LED (96 horas) foi compensado em 144 horas em

relação aos outros grupos. Observa-se que após 312 horas os animais já

apresentavam completa oclusão da ferida (anexo B).

5.2 Análise microscópica

Para a contagem de vasos, fibroblastos, células inflamatórias, e

quantidade de colágeno; foram selecionadas duas regiões da derme,

superficial e profundo, sendo os resultados expressos nas tabelas 1 a 4 e

anexos C a F.

5.2.1 Contagem de Células inflamatórias

O resultado da contagem de células inflamatórias está expresso na

tabela 1.

Tabela 1 - Resultado da contagem de células inflamatórias encontradas 144, 312 e 480 horas

pós-lesão, nos grupos controle, laser e LED.

CÉLULAS INFLAMATÓRIAS (n°/área 55.492 µm2) Controle Laser LED

Horas Superficial Profundo Superficial Profundo Superficial Profundo 144 127,0±22,4 110,9±8,0a,b 163,2±21,2a,b 97,0±14,8a,b 219,9±73,9a,b 68,5±5,5b,e 312 48,9±6,2 45,1±3,3 45,1±4,4 60,0±5,3c 56,8±12,2 42,7±3,4 480 34,5±3,4 37,3±2,5 19,5±2,4 23,7±6,3 14,3±2,3 16,1±1,7 Dados expressos em médias e erro padrão. Resultado considerado significativamente quando p<0,05 (a- 144 vs 312, b- 144 vs 480, c- 312 vs 480, d- controle vs laser, e- controle vs LED, f- laser vs LED).

Na avaliação intragrupos as células inflamatórias presentes na derme

superficial do grupo laser 144 foram estatisticamente superiores aos grupos

laser 312 e 480, p<0,05 e p<0,01 respectivamente. O mesmo pode ser

verificado para o grupo LED 144, o qual foi estatisticamente superior aos

grupos LED 312 e 480, p<0,001 para ambos. Na análise intergrupo não foram

observadas diferenças estatisticamente significativas (p>0,05).

54

A maior concentração de células inflamatórias foi encontrada nos grupo

tratado com LED 144 em derme superficial, quando comparado aos demais

grupos (figura 9).

Figura 9. Fotomicrografias de derme superficial dos grupos controle (A), grupo tratado com

laser (B) e grupo tratado com LED (C), nos diferentes momentos de reparação (144, 312 e 480

horas). H&E, 40X.

O grupo tratado com LED, na região da derme superficial, foi o que

apresentou maior redução do número de células inflamatórias ao final do

estudo.

Na avaliação intragrupo, no que se refere à derme profunda, as células

inflamatórias do grupo controle 168 foram estatisticamente superiores aos

grupos controle 312 e 480, p<0,001 para ambos. O mesmo ocorreu para o

grupo laser 144 vs 312 (p<0,05). Nos intragrupos laser 144 vs laser 480; laser

144 vs laser 480 a diferença estatisticamente significativa respectivamente foi

A144 B144 C144

C312 A312 B312

A480 B480 B480

55

de p<0,001 e p<0,05, sendo laser 504 inferior. O grupo LED 144 foi

significativamente superior ao grupo 480 (p<0,001).

Na análise intergrupo do número de células inflamatórias em derme

profunda o grupo LED 144 foi superior (p<0,01) ao controle 144.

5.2.2 Contagem do número de vasos

Nas avaliações intragrupos (comparação entre diferentes períodos de

tratamento no mesmo grupo) e intergrupos (comparação entre os diferentes

grupos) não observou-se diferença estatística significativa quanto ao número

de vasos (p>0,05, tabela 2).

Tabela 2 - Resultado da contagem do número de vasos sanguíneos encontradas 144, 312 e

480 horas pós-lesão, nos grupos controle, laser e LED.

VASOS SANGUÍNEOS (nº/área 55492 µm2) Controle Laser LED

Horas Superficial Profundo Superficial Profundo Superficial Profundo 168 1,8±0,6 3,2±0,7 1,3±0,7 1,3±0,4 1,0±0,4 2,5±0,4 336 1,4±0,4 2,3±0,5 1,7±0,4 3,6±0,3 1,5±0,5 3,1±0,6 504 1,8±0,5 1,9±0,3 2,1±0,5 2,3±0,6 0,9±0,3 2,2±0,7

Dados expressos em médias e erro padrão. Resultado considerado significativamente quando

p<0,05 (a- 144 vs 312, b- 144 vs 4804, c- 312 vs 480, d- controle vs laser, e- controle vs LED, f-

laser vs LED)

Analisando-se os diferentes dias de tratamento os menores valores

foram encontrados no grupo tratado com LED em nível de derme superficial,

principalmente em 480 horas após a lesão.

Observa-se, que o grupo controle apresentou um número mais

expressivo de vasos em derme profunda aos 144 horas. Nos grupos tratados a

concentração maior de vasos ocorre aos 312 horas após a lesão, em nível de

derme profunda.

No grupo tratado com laser, sacrificado aos 312 horas, observou-se uma

maior quantidade de vasos em região de derme profunda, quando comparado

aos demais grupos (Figura 10).

56

Figura 10. Fotomicrografias de derme profunda dos grupos controle (A), grupo tratado com

laser (B) e grupo tratado com LED (C), nos diferentes momentos de reparação (144, 312 e 480

horas). H&E, 40X.

5.2.3 Contagem de número de fibroblastos

A tabela 3 mostra os dados obtidos na contagem de fibroblastos nos

grupos controle, laser e LED.

Tabela 3 - Resultado da contagem de fibroblastos encontrados 144, 312 e 480 horas pós-

lesão, nos grupos controle, laser e LED

FIBROBLASTOS (n°/área 55.492 µm) Controle Laser LED

Horas Superficial Profundo Superficial Profundo Superficial Profundo 144 104,8±19,2d 92,1±5,9b,c,d 39,4±10,0 44,6±2,4 100,2±28,4 106,7±11,4a,b,f

312 85,5±9,2 66,3±4,3 101,1±11,3a 78,3±8,3 99,1±5,1 73,8±5,7 480 56,4±6,4 33,4±3,5 71,6±5,7 61,4±3,8 52,1±6,5 48,6±4,5

Dados expressos em médias e erro padrão. Resultado considerado significativamente quando p<0,05 (a- 144 vs 312, b- 144 vs 480, c- 312 vs 480, d- controle vs laser, e- controle vs LED, f-laser vs LED)

A144 B144 C144

A312 B312 C312

A480 B480 C480

57

Na análise intragrupos o número de fibroblastos na derme superficial

apresentou diferenças significativas (p<0,05) entre os grupos laser 144 horas e

laser 312 horas, sendo superior neste último. Na análise intergrupo, aos 168

horas, o grupo controle foi superior (p<0,05) ao grupo laser, quanto ao número

de fibroblastos em derme superficial (figura 9).

Em derme profunda, na análise intragrupo, os animais controle e

tratados com LED apresentaram diferença estatisticamente significativa. Não

foram observadas diferenças estatísticas entre os diferentes períodos de

estudo do grupo laser. No grupo controle o número de fibroblastos foi superior

aos 144 horas (p<0,01) e aos 312 horas (p<0,05) quando comparados ao

período de 480 horas. O mesmo ocorreu com o grupo LED (144 vs 312 p<0,05

e 144 vs 480 p<0,001). Na avaliação intergrupos em derme profunda observou-

se diferença estatística significante entre os grupos controle 144 vs laser 144

(p<0,001) e laser 144 vs LED 144 (p<0,001), sendo que o grupo laser

apresentou-se inferior a ambos os grupos nesta fase inicial de análise. O grupo

controle apresentou menor número de fibroblastos em 480 horas, tanto na

análise intra como inter grupos. O maior número de fibroblastos foi encontrado

no grupo tratado com LED aos 144 horas, em derme profunda (Figura 10).

5.2.4 Análise do Colágeno

Os dados referentes à quantidade de colágeno em µm2 estão

apresentados na tabela 4.

Tabela 4 - Resultado da quantidade de colágeno 144, 312 e 480 horas pós-lesão, nos grupos

controle, laser e LED

Dados expressos em médias e erro padrão. Resultado considerado significativamente quando p<0,05 (a- 144 vs 312, b- 144 vs 480, c- 312 vs 480, d- controle vs laser, e- controle vs LED, f-laser vs LED)

QUANTIDADE DE COLÁGENO (em µm2 /área 55492 µm2) Controle Laser LED

Horas Superficial Profundo Superficial Profundo Superficial Profundo 144 33775,0±904,6a,b 36976,2±767,4 41785,4±626,8d 39871,0±1.405,4 45747,6±1.613,0e 47257,0±1.291,0e,f 312 40287,2±1768,9 40999,3±1.261,5 46271,1±548,5d 45022,5±943,2 48611,0±1.015,1e 46169,3±1.987,6 480 44264,1±755,7 41998,2±1.785,6 47025,7±610,5 45346,2±829,1 49711,66±247,5e 45790,1±1.627,8

58

O resultado da avaliação intragrupos em derme superficial demonstrou

que a porcentagem de colágeno nos grupos controles 312 e 480 horas são

significativamente maiores (p<0,05 e p<0,001 respectivamente), que o grupo 7

dias.

Na avaliação intergrupo (derme superficial) observou-se diferença

estatisticamente significativa entre o grupo controle 144 e os grupos laser 144

(p<0,01) e grupo LED 144 (p<0,001). Observou-se que o grupo controle 312 foi

significativamente menor que os grupos laser 336 (p<0,01) e grupo LED 336

(p<0,001). O grupo controle 480 se apresentou inferior somente ao grupo LED

480 (p<0,05). Os grupos laser e LED foram superiores ao grupo controle em

todos os tempos observados.

Na derme profunda a análise intragrupos demonstrou ausência de

diferença estatística nos diferentes grupos (p>0,05). Na análise intergrupos

observou-se superioridade no percentual de colágeno para o grupo LED 144

quando comparado ao grupo controle (p<0,001) e ao grupo laser (p<0,05).

Os animais controle, nos diferentes tempos avaliados, apresentaram

menor percentual de colágeno que os animais tratados, principalmente o grupo

144 horas em derme superficial.

Os grupos tratados com LED obtiveram maiores valores quando

comparados aos demais grupos, sendo que o grupo LED 480 apresentou maior

quantidade de colágeno.

59

6 DISCUSSÃO

Segundo Balbino, Pereira e Curi38 a divisão do processo de reparo da

lesão é feita em três fases, sendo considerados, prioritariamente, os aspectos

macroscópicos e histológicos predominantes em cada uma delas. Nessa forma

a visão e a descrição do processo, torna-se secundário as características

assumidas pela lesão, ao longo de sua evolução, resultam da sucessão ou

sobreposição de eventos celulares e tissulares resultantes da ativação celular

por mediadores químicos.

Com o envelhecimento ocorre uma redução das funções corporais em

todos os níveis, bem como a diminuição da velocidade nas reações corporais,

assim levando à diminuição da cicatrização, tendo em vista uma diminuição da

mitose e da vascularização tecidual21.

A primeira fase da cicatrização é chamada de fase inflamatória e é

caracterizada por aumento do fluxo sanguíneo, alterações da

microvascularização, migração de células inflamatórias e acúmulo destes no

local lesão 38,73. Os resultados obtidos no presente estudo demonstraram que

os grupos tratados apresentaram maior concentração de células inflamatórias

no sítio de lesão em nível superficial no estágio inicial de reparação,

principalmente do grupo LED em relação ao grupo controle. Esta proporção é

inversamente proporcional na fase final do estudo (480 horas após a lesão,

fase de síntese eminente). Estes dados corroboram com estudos anteriores,

que empregaram a radiação eletromagnética coerente na região do vermelho

(laseres) para a estimulação do processo de reparo tecidual em feridas

cutâneas em fase inflamatória 54,08. Poucos estudos foram realizados

empregando a terapia com LED que relatam este aumento no número de

células inflamatórias, sendo todos os estudos realizados em animais jovens ou

com um fator agravante e nenhum estudo foi realizado em animais idosos 70,

72,73. A celularidade pró-inflamatória observada nos grupos tratados sugere a

presença de um efeito de quimiotaxia, já descrita na TLBP 49,56, 57, 58, porém não

salientado anteriormente com terapia LED. Esta intensa presença de células

inflamatórias, evidenciadas no grupo LED pode propiciar áreas mais reativas a

processos sépticos, conforme apontam estudos prévios realizados com

radiação eletromagnética no vermelho56, 57. Em nível profundo, as lesões

60

apresentaram-se com menos celularidade nos grupos tratados, inferindo sobre

a normalização de reatividade do tecido, como melhoria do pH, redução de

produção de prostaglandinas, aumento da atividade mitocondrial, aumentando

os radicais oxidantes, que estimulam a cadeia respiratória e a produção de

ATP, que levam a síntese de DNA e RNA, consequentemente acarretando

mitoses e proliferação celular 74, 75. Estes dados apontam para uma otimização

do início do processo de reparo tecidual (fase inflamatória) em organismos

idosos, onde este processo é naturalmente mais lento em relação a

organismos jovens.

Na fase proliferativa de um processo de reparação ocorre formação de

epitélio para recobrir a superfície da ferida. Neste processo estão envolvidos

mecanismos de proliferação de fibroblastos, deposição de colágeno e outras

matrizes extracelulares e desenvolvimento de novos vasos sanguíneos35, 36, 37,

38, 76. A análise da concentração de vasos sanguíneos é extremamente

dificultosa em técnicas histológicas convencionais, considerando as

características topográficas dos vasos. Erros podem ocorrer em suas

contagens, conduzindo a falsos resultados quanto à quantidade de vasos

presentes em um tecido. No presente estudo a contagem do número de vasos

foi empregada com o intuito de, em conjunto com os demais parâmetros de

análise, permitir uma observação sobre a formação de um tecido de granulação

em tecidos tratados com fototerapia. Não foram observadas diferenças

estatisticamente significantes entre os grupos tratados e controle, o que pode

sugerir ausência de estímulo de neoformação vascular com os parâmetros

empregados tanto com a terapia Laser como com a LED. Estes dados vão de

encontro aos resultados encontrados por Rabelo et al. 76 verificou que animais

diabéticos e não diabéticos tratados com laser demonstraram diminuição do

número de vasos durante a primeira semana de reparo tecidual, porém o

número de vasos foi menor nos animais tratados com laser. Na avaliação do

número de vasos no presente estudo observou-se a angiogênse em todos os

grupos sendo expressiva na derme profunda nos grupos tratados em fases

subseqüentes. De forma similar Silva77 observou a presença de angiogênse em

região profunda de animais controle, levemente superior em comparação aos

grupos tratados com luz.

61

Segundo Li, Chen e Kirsner37 a formação de novos vasos ocorrem

devido à pré-existência de vasos adjacentes à lesão. Em resposta à lesão as

células endoteliais iniciam o processo de angiogênse.

Na análise do número de fibroblastos, em fase proliferativa (312 horas),

observou-se ausência de diferença estatística entre os grupos de estudo, o

mesmo ocorrendo nos estudos de Rabelo76 para feridas de animais saudáveis

tratados com radiação eletromagnética coerente na região do vermelho (632,8

nm). Entretanto diferenças significativas do número de fibroblastos foram

observadas no grupo LED 144 horas em relação ao grupo laser em 144 horas,

corroborando com estudos de base realizados por Vinck et al.71. Os autores

verificaram que em 144 horas a radiação eletromagnética não coerente na

região do visível promove aumento do número fibroblastos quando comparados

grupos LED no infravermelho e laser. Ainda que fora da fase proliferativa estes

dados são fundamentais para a compreensão dos resultados obtidos na área

de colágeno obtida na fase de síntese para os grupos tratados com luz.

O fibroblasto desempenha um papel crucial na cicatrização da ferida, a

maioria dos estudos publicados na literatura sobre a TLBP examinaram os

seus efeitos sobre fibroblasto, crescimento celular, migração, e produção de

colágeno52. Autores como Hawkins e Abrahamse6 e Takezai et al. 70

demonstraram aumento do metabolismo celular, com presença de maior

número de mitocôndrias no citoplasma de fibroblastos de animais irradiados em

comparação aos animais controle. O aumento do número de mitocôndrias foi

indicativo de aumento de demanda energética, o que pode ter acarretado a

elevação do número de fibroblastos e/ou aumentado síntese de colágeno.

Esses dados vão ao encontro dos resultados da pesquisa em questão, pois os

grupos controle e LED apresentaram os maiores números de fibroblastos em

144 horas enquanto o grupo tratado com laser apresentou a maior quantidade

de fibroblasto em 312 e 504 horas quando comparado com os outros dois

grupos. Ambos os grupos tratados apresentaram quantidade de colágeno

superior (estatisticamente significantes) ao controle, demonstrando ao aumento

do metabolismo dos fibroblastos como sugerido por Hawkins e Abrahamse6,

Takezai et al.70 e Posten49.

Considerando os efeitos antiinflamatórios da radiação eletromagnética

no vermelho é razoável supor que a radiação laser poderia influenciar a

62

produção de mediadores inflamatórios, como citocinas. O TGF β é uma

importante citocina que age durante o processo de cicatrização, ativando a

proliferação celular. É possível que o laser atue sobre os macrófagos na cadeia

respiratória, reforçando a produção TGF β, o que inibe a diapedese dos

macrófagos no tecido conjuntivo. Este mecanismo pode explicar o reduzido

número de macrófagos e edema na derme irradiada em comparação com a

derme controle. O TGF β tem um elevado número de efeitos biológicos, como a

indução da diferenciação de fibroblastos em miofibroblastos e a angiogênese e

a estimulação da síntese de colágeno 78. Yasukawa79 continua explicando que

observações histológicas demonstraram que após a saída do excesso de

células inflamatórias aumenta a formação de fibras colágenas e retoma a

continuidade do tecido. Em contra mão há indícios que a inflamação leva a

uma pobre formação de fibras colágenas e descontinuidade do tecido

Corroborando os achados desse estudo, onde no grupo tratado com radiação

eletromagnética no vermelho apresentou na fase inicial (144 horas) maior

número de células inflamatórias na derme superficial quando comparado com

os demais grupos e apresentando diferença na quantidade de colágeno sendo

que os maiores depósitos foram observados nos grupos tratados com LED,

seguido do grupo tratado com Laser.

A fase de remodelação é a ultima da fase de cicatrização e é nela que

ocorre a reorganização do colágeno e que levará a uma maior força tensil77.

Ferreira80 diz ainda que por meio da leitura dos cortes histológicos houve

melhor cicatrização do tecido lesado nos grupos tratados, com ênfase no grupo

idoso. A pesquisa em questão confirma os achados de Ferreira80 através da

quantidade de colágeno na área da lesão, pois nos grupos tratados houve uma

quantidade maior de colágeno que nos grupos não tratados, sendo que o grupo

tratado com LED foi mais evidente, seguido pelo grupo tratado com laser.

Inúmeras pesquisas foram feitas com utilização da radiação

eletromagnética no vermelho com o intuito de ver sua ação no processo de

reparação tecidual 49,51,56,60,74,81. O processo de cicatrização por ser um

processo temporal, tem tentado analisar se TLBP acelera cicatrização de

feridas. Estes estudos tentam quantificar a área da superfície de uma ferida

aberta e suas mudanças com o tempo49. Pesquisas, com animais não idosos,

têm mostrado que o tempo de cicatrização é menor nos animais que foram

63

tratados com radiação eletromagnética no vermelho do que os animais que não

utilizaram esse tipo de terapia 49,80,82. Esses dados não são concordantes aos

dados obtidos nessa pesquisa, pois todos tanto os grupos tratados como os

grupos controles tiveram o mesmo tempo de cicatrização. A única diferença

observada em 96 horas após o procedimento cirúrgico, onde os grupos

controle e os grupos tratados com laser tinham uma área de ferida menor que o

grupo tratado com LED, mas após 144 horas do processo cirúrgico não havia

diferença estatisticamente significante no tamanho da lesão entre os três

grupos. Posten et al.49 explica que os efeitos da cicatrização em muitas vezes

são dependente de fatores intrínsecos, tais como a localização e as tensões

sobre a ferida, como muito sobre como a terapia em si. Ferreira80 complementa

relatando dizendo que há atrasos na reepitelização, tanto em humanos quanto

em animais idosos e que este atraso se deve mais ao processo sistêmico do

que ao próprio processo de envelhecimento.

Vários estudos foram realizados visando à melhoria do processo de

reparação da pele através da luz Laser, mas a dificuldade é observada ao

tentar estabelecer os parâmetros que serviram de guias para a pesquisa, visto

os diferentes padrões de utilização da radiação Laser. Recentemente as

pesquisas científicas têm-se voltado para a os efeitos da terapia com LED no

tecido biológico e por esse motivo ainda há uma escassez de pesquisas sobre

seus efeitos. Outro ponto a ser levantado é a grande variedade de parâmetros

e padrões na utilização do LED, o que dificulta estabelecer um padrão para o

tratamento das lesões de pele. Muitos artigos têm como objetivo a melhora da

reepitelização depois de uma lesão, mas são raros aqueles que falam do

assunto no idoso, visto que a população mundial vem envelhecendo. Com isso

faz-se necessário mais pesquisas sobre o assunto aqui abordado.

64

7 CONCLUSÕES

Com os resultados obtidos verificou-se que o tratamento com a Luz

coerente e não coerente favoreceram o processo de reparação epitelial dos

ratos idosos, sendo que os animais tratados com a luz não coerente (LED) no

comprimento de onda do 640±20 nm apresentaram melhores resultados

quando comparados com a luz coerente (Laser) no comprimento de onda no

660nm.

65

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72

Anexo A – Certificado do Comitê de Ética e Pesquisa

73

Anexo B – Tabela de dados da área da lesão dos diferentes grupos experimentais

Grupos 0h 48h 96h 144h 192h 240h 288h 336h 384h 432h 480

Controle 0,5 0,34±0,01 0,17±0,03 0,09±0,01 0,04±0,01 0,006±0,004 0,0015±0 0 0 0 0 Laser 0,5 0,30±0,01 0,19±0,01 0,12±0,01 0,02±0,01 0,003±0,001 0 0 0 0 0

LED 0,5 0,35±0,02 0,26±0,01* 0,13±0,01 0,05±0,01 0,001±0 0 0 0 0 0

74

Anexo C – Gráficos do número de células inflamatórias em derme profunda e superficial

75

Anexo D – Gráficos do número de vasos sanguíneos em derme profunda e superficial

76

Anexo E – Gráficos do número de fibroblastos em derme profunda e superficial

77

Anexo F – Gráficos da quantidade de colágeno em derme profunda e superficial

dissertaÇÃo envelhecimento cutÂneo

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