dissertação de galyleia meneses cavalcante · Área de concentração: clínica odontológica....
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁFACULDADE DE FARMÁCIA, ODONTOLOGIA E ENFERMAGEM
PROGRAMA DE PÓSMESTRADO EM CLÍNICA ODONTOLÓGICA
GALYLÉIA MENESES CAVALCANTE
ESTUDO DA IMUNOEXPRESSÃO DOS SISTEMASCCL21 E Ki-67 NO CARCINOMA DE CÉLULAS ESCAMOSAS ORAL E SUA ASSOCIAÇÃO COM INDICADORES
UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ FACULDADE DE FARMÁCIA, ODONTOLOGIA E ENFERMAGEM
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ODONTOLOGIAMESTRADO EM CLÍNICA ODONTOLÓGICA
GALYLÉIA MENESES CAVALCANTE
XPRESSÃO DOS SISTEMAS CXCR4-CXCL12/SDFNO CARCINOMA DE CÉLULAS ESCAMOSAS ORAL E SUA
ASSOCIAÇÃO COM INDICADORES CLÍNICOPATOLÓGICOS, LINFONODAL E SOBREVIDA
FORTALEZA
2013
FACULDADE DE FARMÁCIA, ODONTOLOGIA E ENFERMAGEM GRADUAÇÃO EM ODONTOLOGIA
CXCL12/SDF-1, CCR7-NO CARCINOMA DE CÉLULAS ESCAMOSAS ORAL E SUA
CLÍNICOPATOLÓGICOS, METÁSTASE
GALYLÉIA MENESES CAVALCANTE
ESTUDO DA IMUNOEXPRESSÃO DOS SISTEMAS CXCR4-CXCL12/SDF-1, CCR7-CCL21 E Ki-67 NO CARCINOMA DE CÉLULAS ESCAMOSAS ORAL E SUA ASSOCIAÇÃO COM INDICADORES CLÍNICOPATOLÓGICOS, METÁSTASE
LINFONODAL E SOBREVIDA
Dissertação submetida à Coordenação do Programa de Pós Graduação em Odontologia da Universidade Federal do Ceará como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Odontologia
Área de concentração: Clínica Odontológica
Orientadora: Prof. Dra. Ana Paula Negreiros Nunes Alves
FORTALEZA
2013
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação Universidade Federal do Ceará Biblioteca de Ciências da Saúde
C364e Cavalcante, Galyléia Meneses.
Estudo da imunoexpressão dos sistemas CXCR4-CXCL12/SDF-1, CCR7-CCL21 e Ki-67 no carcinoma de células escamosas oral e sua associação com indicadores clínicopatológicos, metástase linfonodal e sobrevida/ Galyléia Meneses Cavalcante. – 2013.
55 f. : il.
Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Farmácia, Odontologia e Enfermagem. Programa de Pós-graduação em Odontologia, Fortaleza, 2013.
Área de concentração: Clínica Odontológica. Orientação: Profa. Dra. Ana Paula Negreiros Nunes Alves.
1. Quimiocinas. 2. Receptores CXCR4. 3. Quimiocina CXCL12. 4. Receptores CCR7. 5. Quimiocina CCL21. 6. Metástase Neoplásica. 7. Neoplasias Bucais. 8. Sobrevida. I. Título.
CDD 616.99431
GALYLÉIA MENESES CAVALCANTE
ESTUDO DA IMUNOEXPRESSÃO DOS SISTEMAS CXCR4CCL21 E Ki-67 NO CARCINOMA DE CÉLULAS ESCAMOSAS ORAL E SUA ASSOCIAÇÃO COM INDICADORES
Aprovada em 16/07/2013
Profa. Dra. Ana Paula Negreiros Nunes Alves (Orientadora)
Universidade Estadual do Ceará
GALYLÉIA MENESES CAVALCANTE
XPRESSÃO DOS SISTEMAS CXCR4-CXCL12/SDFNO CARCINOMA DE CÉLULAS ESCAMOSAS ORAL E SUA
ASSOCIAÇÃO COM INDICADORES CLÍNICOPATOLÓGICOS, LINFONODAL E SOBREVIDA
Dissertação submetida à Coordenação do Programa de Pós Graduação em Odontologia da Universidade Federal do Ceará como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em OdontologiaConcentração: Clínica Odontológica.
BANCA EXAMINADORA
Profa. Dra. Ana Paula Negreiros Nunes Alves (Orientadora)
Universidade Federal do Ceará - UFC
Prof. Dr. Mário Rogério Lima Mota
Universidade Federal do Ceará – UFC
Profa. Dra. Alana de Freitas Pires
Universidade Estadual do Ceará - UECE
CXCL12/SDF-1, CCR7-NO CARCINOMA DE CÉLULAS ESCAMOSAS ORAL E SUA
CLÍNICOPATOLÓGICOS, METÁSTASE
Dissertação submetida à Coordenação do Programa de Pós Graduação em Odontologia da Universidade Federal do Ceará como
arcial para obtenção do título de Mestre em Odontologia. Área de Concentração: Clínica Odontológica.
Profa. Dra. Ana Paula Negreiros Nunes Alves (Orientadora)
AGRADECIMENTOS
A Deus, por ser Aquele que me fortalece, me guia, me ampara e me ilumina
sempre. Quem confia em ti não teme as derrotas.
Aos meus pais, Elício e Eleonora, minha base maior, obrigada por todo carinho, dedicação, amor, palavras de sabedoria, ensinamentos e, principalmente, por serem exemplos de caráter, dignidade e força. Obrigada por SEMPRE respeitarem e apoiarem meus sonhos e ideais. Amo vocês!
Ao meu esposo, Leonardo, muito obrigada por todo amor, carinho e apoio incondicional. Tenho muita sorte de tê-lo ao meu lado e sei que com você posso sempre ir mais longe. Te amo, hoje e sempre!
A minha irmã, Gabryela, meu cunhado, Samuel e meu sobrinho Ítalo Gabriel, por todos os ótimos momentos vividos juntos.
A família do meu esposo, que sempre me receberam muito bem. Em especial minha sogra, Dalila, que me tem como uma filha! Adoro vocês.
A minha orientadora, Dra Ana Paula, muito obrigada pela oportunidade de ingressar no meio científico e assim expandir meus conhecimentos.
Ao amigo, Paulo Goberlânio, grande companheiro nessa jornada, sempre presente na hora e no momento certo. Com certeza sentirei falta dos nossos almoços e conversas.
As amigas, Carolina Teófilo e Malena Freitas, duas grandes amigas que ganhei nesse mestrado e tenho certeza que vamos levar essa amizade por bons e longos tempos. Obrigada pelo companheirismo, disponibilidade e dedicação nessa jornada.
Ao aluno de graduação, Felipe Carneiro, que muito me ajudou na fase de levantamento de dados. Sempre muito compromissado e interessado. Continue na batalha pelo aprendizado, você vai longe.
Ao Prof Fabrício Bitu, por ter abertos as portas do Hospital Haroldo Juaçaba e ter proporcionado um convívio agradável com pessoas tão maravilhosas. Obrigada pela convivência, atenção e paciência.
Ao Prof Mário Mota, pelos ensinamentos e prestatividade. Muito obrigada por todos os conhecimentos transmitido.
As técnicas do Laboratório de Imunohistoquímica do Hospital Haroldo Juaçaba, Manuela Sales e Monalisa Monteiro pela atenção, carinho e cuidado dispensados durante a fase laboratorial deste trabalho.
A Márcia Lima, Representante de Suporte Técnico da Dako, muito obrigada pela imensa contribuição na padronização dos anticorpos. Sem sua ajuda essa tarefa teria sido bem mais difícil.
A Dra Patty Saldanha pelo apoio na revisão histológica dos casos e durante a
execução da imunohistoquímica.
A funcionária do Banco de Tumores, Shirley, sempre muito disposta a ajudar, facilitando demais meu trabalho.
A estagiária do Banco de Tumores, Samara, sempre muito prestativa.
Ao técnico do Laboratório de Patologia Bucal, Alceu, sempre muito rápido e atencioso aos meus pedidos.
A atendente da Clínica de Estomatologia, Soninha, que é nossas pernas e braços durante os atendimentos clínicos. Obrigada pelo carinho e respeito, principalmente, com os pacientes.
A todos os alunos de graduação e pós-graduação do Laboratório de Patologia Bucal com quem tive o um bom convívio durante esse período de mestrado.
“A mente que se abre a uma nova ideia jamais voltará ao seu tamanho original”
Albert Einstein
RESUMO As quimiocinas são citocinas quimiotáticas responsáveis pela migração direcionada de
leucócitos, coordenando o movimento celular durante a inflamação e o transporte de células
hematopoiéticas. Além dos leucócitos, os receptores de quimiocinas também são encontrados
em células neoplásicas e em tumores associados com células estromais. Dentre as
quimiocinas, os sistemas CXCR4/CXCL12 e CCR7/CCL21 têm sido demonstrado no
envolvimento de metástases linfonodais ou à distância em diferentes tipos de câncer. Dessa
forma, foi objetivo desse trabalho avaliar a expressão de CXCR4, CXCL12, CCR7, CCL21 e
Ki-67 em carcinoma de células escamosas orais (CEC) e correlacionar estes marcadores com
indicadores clínicopatológicos, metástase linfonodal e sobrevida. Realizou-se um
levantamento de laudos e blocos parafinados de biopsias excisionais de pacientes portadores
de CEC tratados no Hospital Haroldo Juaçaba (2001 a 2009). Foram coletados dados sobre
localização anatômica da lesão, sexo, idade, sobrevida do paciente, grau de diferenciação
histopatológica do tumor, estadiamento tumoral e presença ou ausência de metástase
linfonodal, invasão linfovascular e perineural, grau nuclear e profundidade de invasão. Para
reação de imunohistoquímica, seguiu-se a técnica da estreptavidina-biotina-peroxidase,
utilizando os anticorpos anti-CXCR4, anti-CXCL12, anti-CCR7, anti-CCL21 e Ki-67. As
secções histológicas foram fotomicrografadas em 10 campos escolhidos aleatoriamente e
quantificadas quanto ao número de células tumorais marcadas e determinado o percentual de
marcação de cada anticorpo. A marcação de CXCR4 foi detectada em citoplasma e núcleo,
CXCL12, CCR7 e CCL21 tiveram marcação apenas citoplasmática, sendo observada suas
expressões em 18 (60%), 8 (22,66%), 16 (53,3%) e 3 (12%) casos, respectivamente.
Encontrou-se uma associação significativa positiva entre a invasão linfovascular e a
imunomarcação do CXCR4 (p=0.007) e CCR7 (p=0.01) e dentre esses casos a metástase
esteve presente em 62,5% e 37,5%, respectivamente. Quando em associação com o Ki67,
encontrou-se uma correlação positiva significante entre o CXCR4 (p=0.0086), CXCL12
(p=0.036) e CCR7 (p=0.04). Dentre os pacientes CXCR4+, ao longo de 111 meses, apenas
38,4% estavam vivos (p=0.845), ao passo que tanto para pacientes CCR7+ (p = 0.398),
quanto CXCR4+ e CCR7+ (p = 0.441), após 62 meses, todos haviam ido a óbito. Conclui-se
que essas quimiocinas estão associadas com a invasão linfovascular e proliferação celular,
talvez favorecendo o desenvolvimento de metástases e um pior prognóstico.
Palavras-chave: Quimiocinas. Receptores CXCR4. Quimiocina CXCL12. Receptores CCR7. Quimiocina CCL21. Metástase Neoplásica. Neoplasias Bucais. Sobrevida.
ABSTRACT
Chemokines are responsible for the directed migration of leukocyte chemotactic cytokines,
coordinating cell movement during inflammation and the transport of hematopoietic cells. In
addition to leukocytes, chemokine receptors are also found in neoplastic cells and tumors
associated with stromal cells. Among chemokines, and the CXCR4/CXCL12 CCR7/CCL21
systems have been shown the involvement of lymph node metastases or distant metastases in
different cancers. Thus, aim of this study was to evaluate the expression of CXCR4, CXCL12,
CCR7, CCL21 and Ki-67 in oral squamous cell carcinoma (SCC) and to correlate these
markers with clinicopathological indicators, lymph node metastasis and survival. We
conducted a survey of reports and paraffin blocks of excisional biopsies of patients with SCC
treated at the Hospital Haroldo Juaçaba (2001-2009). Data on anatomic location of the lesion,
sex, age, patient survival, degree of histological differentiation of the tumor, tumor stage and
presence or absence of lymph node metastasis, lymphovascular and perineural invasion,
nuclear grade and depth of invasion were collected. For immunohistochemical analysis,
followed by the technique of streptavidin-biotin-peroxidase using the anti-CXCR4, anti-
CXCL12, anti-CCR7, anti-CCL21 and Ki-67 antibody. Histological sections were
photomicrographed in 10 fields chosen randomly and measured for the number of labeled
tumor cells and determined the percentage of each labeling antibody. The marking of CXCR4
was detected in the cytoplasm and nucleus, CXCL12, CCR7 and CCL21 were only
cytoplasmic, their expression was observed in 18 (60%) 8 (22.66%) 16 (53.3%) and 3 (12%)
cases, respectively. We found a significant positive association between lymphovascular
invasion and immunostaining of CXCR4 (p = 0.007) and CCR7 (P = 0.01) and among these
cases metastasis was present in 62.5% and 37.5%, respectively. When in combination with
Ki67, we found a significant positive correlation between CXCR4 (p = 0.0086), CXCL12 (p =
0.036) and CCR7 (p = 0:04). Among patients CXCR4 + over 111 months, only 38.4% were
alive (p = 0.845), whereas both patients CCR7 + (p = 0.398) as well as CXCR4 +, and CCR7
+ (p = 0.441) after 62 months, everyone had already died. We conclude that these chemokines
are associated with lymphovascular invasion and cell proliferation, perhaps favoring the
development of metastasis and poor prognosis.
Keywords: Chemokines. Receptors CXCR4. Chemokine CXCL12. Receptors CCR7. Chemokine CCL21. Neoplasm Metastasis. Mouth Neoplasms. Survivorship.
SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO GERAL.............................................................................. 9
2 PROPOSIÇÃO.............................................................................................. 14
2.1 Objetivo geral................................................................................................ 14
2.2 Objetivos específicos..................................................................................... 14
3 CAPÍTULO................................................................................................... 15
3.1 Capítulo 1...................................................................................................... 16
4 CONCLUSÕES GERAIS............................................................................ 38
REFERÊNCIAS........................................................................................... 39
ANEXO A – Aceite do Comitê de Ética em Pesquisa Humana............... 41
ANEXO B – Manual de normalização para defesa de dissertação de mestrado e tese de doutorado no formato alternativo do Programa de Pós-graduação em Odontologia Universidade Federal do Ceará.............
42
ANEXO C – Normas do periódico Anticancer Research.......................... 50
9
1 INTRODUÇÃO GERAL
O câncer de cabeça e pescoço constitui aproximadamente 15% de todos os
cânceres e, dentre esses, cerca de 30% ocorrem em boca (EL-NAAJ, 2011). De acordo com o
Instituto Nacional do Câncer, a estimativa atual aponta cerca de 14.170 novos casos de câncer
por ano, sendo desses 9.990 em homens e 4.180 em mulheres. Na região Nordeste, as
neoplasias malignas de cavidade oral apresentam-se como o quarto grupo mais frequente
entre os homens e o oitavo entre as mulheres, sem considerar os tumores de pele não
melanoma (BRASIL, 2012). Dentro desse grupo, o carcinoma espinocelular é o tipo mais
comum e representa mais de 90% dos casos (WHO, 2005).
O carcinoma espinocelular oral também chamado de carcinoma de células
escamosas (CEC) é causado por uma combinação de fatores intrínsecos (susceptibilidade
genética) e extrínsecos (radiação solar, tabaco, álcool, agentes infecciosos) que atuam em
conjunto durante um período de tempo para o início de uma neoplasia (MARTINEZ et al.,
2011). Alterações genéticas têm sido implicadas na carcinogênese oral, incluindo alterações
que amplificam a ação de oncogenes como: myc, erb-B, genes para o receptor do fator de
crescimento epidermal (EGFR) e ciclina D1, além de mutações, deleções e hipermetilações
que afetam genes supressores tumorais como o p16 e p53 (MEHROTRA; VASSTRAND;
IBRAHIM, 2004).
As localizações preferenciais do carcinoma espinocelular oral são língua, assoalho
de boca e lábio inferior; entretanto, pode ocorrer em qualquer parte da cavidade oral
(MEHROTRA; VASSTRAND; IBRAHIM, 2004). Clinicamente, a lesão tende a assumir um
aspecto proliferativo ou de uma ulceração endurecida, assintomática, com bordas elevadas,
que não cicatriza (WHO, 2005).
O aspecto histopatológico é caracterizado por ilhas e cordões de células epiteliais
malignas que invadem os tecidos adjacentes, apresentando graus variados de pleomorfismo
celular e nuclear, produção de pérolas de ceratina e inflamação. Essa variação determina a
gradação histopatológica do tumor em: bem diferenciado, moderadamente diferenciado e
pobremente diferenciado (WHO, 2005; LOURENÇO et al., 2007).
A carcinogênese está associada ao efeito cumulativo de alterações genéticas em
um processo de reações em cadeia. Sabe-se que nas neoplasias, a proliferação celular é
excessiva e autônoma em decorrência de danos no DNA, bem como falhas no seu reparo
durante o ciclo celular (NAGPAL; BIBHU, 2003).
10
A proliferação celular pode ser definida como o aumento do número de células,
resultante da complementação do ciclo celular. Este engloba uma cascata de eventos,
processados de maneira ordenada, assegurando a duplicação fiel dos componentes celulares e
a divisão em duas células-filhas (SANTOS-GARCIA et al., 2005). A proliferação celular
também é considerada um dos mecanismos biológicos fundamentais na oncogênese e a
detecção de marcadores da fração de crescimento celular, como o anticorpo Ki-67, tem sido
usado como fator prognóstico em vários tumores (RODRIGUES et al., 2008). O anticorpo Ki-
67 reconhece um antígeno que está associado ao núcleo celular e que, em células
continuamente ciclizantes, é expresso em todas as fases do ciclo celular, exceto em G0,
alcançando um pico nas fases G2 e M. Além disso, sua expressão nuclear num período
definido do ciclo celular pode representar uma vantagem em relação ao seu emprego como
marcador biológico (RAVI et al., 2001).
A aplicação de marcadores de proliferação celular assegura, não só uma medida
mais acurada da quantidade de células em proliferação como também a possibilidade de
investigação prognóstica das neoplasias de maneira simplificada, rápida e pouco dispendiosa
(RAVI et al., 2001).
Além disso, outro fator prognóstico importante é a presença ou não da invasão
vascular ou acometimento ganglionar linfático regional. Estes fatores são evidenciados em
fase tardia da doença, enfatizando a necessidade da detecção precoce. É necessário
compreender os mecanismos de progressão tumoral e identificar novos marcadores preditivos
e prognósticos que possam formar a base para alvos terapêuticos. A metástase de células
tumorais é um processo multi-passo complexo que envolve diversos mediadores entre as
células tumorais e o seu microambiente circundante (HADAD, 2008). Apesar de muito
estudado, os mecanismos determinantes das metástases ganglionares ainda são pouco claros.
Desta forma, existem três teorias básicas que tentam explicar a formação de metástases em
sítios anatômicos específicos: a primeira teoria propõe que as células tumorais saiam para a
corrente sanguínea e linfática e, consequentemente, para todos os órgãos e se multiplicam
somente naqueles que possuem fatores de crescimento apropriados; de acordo com a segunda
teoria, as células endoteliais dos vasos sanguíneos dos órgãos-alvo expressam moléculas de
adesão que fazem com que as células tumorais que estão presentes na circulação parem nestes
órgãos, produzindo a metástase específica; finalmente, a teoria da quimioatração propõe que
as células tumorais possuam receptores de quimiocinas e migrem para diferentes órgãos,
dependendo da produção de quimiocinas por esses órgãos (LIOTTA, 2001).
11
As quimiocinas são citocinas quimiotáticas responsáveis pela migração
direcionada de leucócitos, podendo coordenar o movimento celular durante a inflamação,
assim como o transporte homeostático das células hematopoiéticas, linfócitos e células
dendríticas. São induzidas por citocinas inflamatórias, fatores de crescimento e estímulos
patogênicos (BALKWILL, 2004).
Essas quimiocinas possuem receptores com sete domínios transmembranares,
sendo a porção extracelular constituída pela região N-terminal e por três alças extracelulares
que atuam na ligação à quimiocina. A região intracelular é formada pela região C-terminal e
por três alças intracelulares que intervêm na transdução do sinal. Os receptores das
quimiocinas pertencem à superfamília dos receptores acoplados a proteínas G. Uma vez que
as quimiocinas se ligam à proteína G, ocorre uma sinalização em cascata, fazendo com que
as células migrem para sítios específicos (GUERREIRO et al., 2011).
As quimiocinas são classificadas em quatro subfamílias: CXC, CC, C e CX3C,
sendo que C representa cisteína e X ou X3 representam um ou três aminoácidos entre as
cisteínas, respectivamente. Assim, os receptores podem designar-se de CXCR1 a CXCR6,
CCR1 a CCR10, XCR1 e CX3CR1. De igual modo, a classificação dos ligantes dos
receptores de quimiocinas é construída a partir da classe a que pertencem, seguida de “L”
para ligante e um número (GUERREIRO et al., 2011).
A migração direcionada de células que expressam o receptor de quimiocina
apropriado ocorre ao longo de um gradiente de concentração de ligantes, conhecido como
gradiente de quimiocina. Isso permite que as células se movam para locais onde a
concentração desses ligantes seja mais elevada (BALKWILL et al., 2004).
Embora originalmente identificados em leucócitos, os receptores de quimiocinas
também são encontrados em células neoplásicas e em tumores associados com células
estromais. É sabido que a migração de células tumorais e as metástases compartilham muitas
semelhanças com o recrutamento de leucócitos. Estudos demonstram que as células tumorais
expressam receptores de quimiocinas funcionalmente ativos e a expressão desses receptores
parece regular funções celulares relacionadas com o processo de metástase (BALKWILL,
2004). Existem relatos na literatura que demonstram que as células tumorais podem expressar
moléculas sinalizadoras para invasão, migração e metástase, incluindo as quimiocinas e seus
receptores (ROSENKILDE; SCHWARTZ, 2004).
A interrupção desses eventos poderia determinar regimes terapêuticos eficazes no
tratamento das neoplasias (YAN et al., 2006).
Expressões de receptores de quimiocinas também têm sido investigadas em
12
carcinoma de células escamosas oral. Quando comparada ao epitélio normal, a expressão de
CXCR4 em carcinoma de células escamosas oral está associada à progressão tumoral e pior
prognóstico (DELILBASE et al., 2004; ISHIKAWA et al., 2006). Adicionalmente, ao
comparar a expressão desse receptor com o tamanho do tumor, metástase linfonodal e
recorrência do tumor, verificou-se uma maior invasão nos linfonodos e recidiva tumoral
(ALMOFTI et al., 2004).
Outro estudo comparando a expressão de receptores de quimiocinas em linhagem
de células de carcinoma espinocelular oral constatou que o CCR6 é seletivamente expresso
em tumores primários, enquanto que o CCR7 parece ser signifcativamente regulado no
processo mestastático (WANG et al., 2004).
Ao analisar ligantes de quimiocinas, Shintani et al. (2004) verificaram que
CXCL1 foi abundante em 40% dos casos examinados em carcinomas orais, sendo sua
expressão relacionada com a angiogênese do tumor, infiltração de leucócitos e metástase
nodal. Em outro estudo utilizando análise de microarray, os ligantes de quimiocinas CXCL5
e CXCL8 foram significativamente encontrados regulando o processo metastático de
carcinoma de células escamosas (MIYAZAKI et al., 2006a). A ação de anti-CXCL5 nessas
células, utilizando RNA de interferência, resultou na diminuição da proliferação celular,
inibindo a formação de tumor, sugerindo o envolvimento de CXCL5 nas propriedades
tumorigênicas (MIYAZAKI et al., 2006b).
Dentre os receptores e ligantes de quimiocinas, os sistemas CXCR4/CXCL12 e
CCR7/CCL21 tem sido demonstrado no envolvimento de metástases linfonodais ou a
distânica em diversos tipos de câncer. Pelo menos vinte e três diferentes tipos de câncer
expressam o receptor CXCR4 e respondem ao seu ligante CXCL12, incluindo mama, ovário,
próstata, rim, cérebro, pulmão, colo-retal, melanoma e tumores de cabeça e pescoço
(BALKWILL et al., 2004; MENG et al., 2010).
Diversos estudos demonstram associação entre a expressão do CXCR4/CXCL12-
SDF1 e os fatores clínico-patológicos. Almofti et al. (2004), observaram a expressão do
CXCR4 em 57% dos pacientes portadores de carcinoma de células escamosas oral, estando
correlacionado com a metástase linfonodal e a recorrência do tumor. Nesse mesmo estudo,
verificou-se um pior prognóstico em pacientes com imunomarcação positiva, apresentando
uma taxa de sobrevivência de apenas 56.8% após 5 anos de observação. Além disso, essa
associação foi encontrada também em lesões potenciamente malignas. Através de análise
imunohistoquímica, Xia et al. (2012) verificaram uma associação significativa positiva da
expressão do CXCR4 e do CXCL12/SDF-1 em leucoplasias, em 37.5% e 33.3% dos casos,
13
respectivamente. Adicionalmente, um estudo da participação do CXCR4 e CXCL12 na
metástase de câncer de língua verificou que a expressão de CXCR4 está correlacionada com o
tamanho do tumor e invasão perineural, enquanto que a expressão de CXCL12, não se
correlacionou com nenhuma das variáveis clínicas-patológicas avaliadas (ALBERT et al.,
2012).
Em estudo com culturas de células, a sinalização de CXCR4 e CXCL12/SDF-1
também foi associada com a indução da transição epitelial-mesenquimal, um evento crítico
observado antes da invasão tumoral, por meio do qual as células adquirem um fenótipo mais
agressivo, exibindo uma reduzida adesão célula-célula e aumento da motilidade (ONOUE et
al., 2006).
Ao associar a expressão do receptor CCR7 com a metástase linfonodal em
carcinoma de células escamosas orais, Shang, Liu e Shao (2009), verificaram correlação
positiva significativa com a metástase linfonodal, sendo sua imunomarcação expressa em
65.9% dos casos estudados. Dado esse confirmado no mesmo estudo, no qual, utilizando
ensaio de migracão in vitro, observou-se que células CCR7 positivas mostraram grande
capacidade de adesão ao linfonodo quando comparadas com as células CCR7 negativas.
Dessa forma, é importante o estudo dessas quimiocinas e sua interação com o
microambiente tumoral, visto que estas moléculas promovem o crescimento, angiogênse,
invasão e progressão tumoral. Nesse sentido, a compreensão do comportamento destas
moléculas nos tumores de cabeça e pescoço podem contribuir no melhor entendimento do
processo metastático, bem como favorecer indícios para desenvolvimento de terapias
preventivas antimetastáticas.
14
2 PROPOSIÇÃO 2.1 Objetivo geral
Avaliar a expressão dos sistemas CXCR4/CXCL12, CCR7/CCL21 e o Ki-67 no
carcinoma de células escamosas oral e a sua associação com os indicadores clínicopatológico,
metástase linfonodal e sobrevida.
2.2 Objetivos específicos
1. Avaliar o padrão de expressão do CXCR4, CXCL12, CCR7 e CXCL21 em carcinoma de células escamosas orais;
2. Associar a expressão do CXCR4, CXCL12, CCR7 e CCL21 com os parâmetros clinicos (idade, sexo, localização anatômica) e histopatológicos (diferenciação histopatológica, invasão linfovascular e perineural, grau nuclear e profundidade de invasão);
3. Correlacionar a expressão do CXCR4, CXCL-12, CCR7 e CXCL21 com a presença
(pN) ou ausência (pN-) de comprometimento linfonodal;
4. Associar a expressão do CXCR4, CXCL-12, CCR7 e CCL21 com o estadiamento
tumoral (sistema de estadiamento metástase-tumor-nodo);
5. Correlacionar a expressão de Ki-67 com a expressão de CXCR4, CXCL12, CCR7,
CCL21;
6. Avaliar a sobrevida dos pacientes com imunomarcação positiva para CXCR4,
CXCL12, CCR7 e CCL21.
15
3 CAPÍTULO
Esta dissertação está baseada no Artigo 46 do Regimento Interno do Programa de
Pós-Graduação em Odontologia da Universidade Federal do Ceará, que regulamenta o
formato alternativo para dissertações de Mestrado e teses de Doutorado e permite a inserção
de artigos científicos de autoria ou co-autoria do candidato. Por se tratar de pesquisas
envolvendo seres humanos, ou parte deles, o projeto de pesquisa foi submetido à apreciação
do Comitê de Ética em Pesquisa, tendo sido aprovado (Anexo 1).
Capítulo 1
“ESTUDO DA IMUNOEXPRESSÃO DOS SISTEMAS CXCR4-CXCL12/SDF-1, CCR7-CCL21 E Ki-67 NO CARCINOMA DE CÉLULAS ESCAMOSA S ORAL E SUA ASSOCIAÇÃO COM INDICADORES CLÍNICOPATOLÓGICOS, METÁ STASE LINFONODAL E SOBREVIDA”
Cavalcante, GM; Alves, APNN
Este artigo será submetido à publicação no periódico Anticancer Research.
16
3.1 Capítulo 1
Título: ESTUDO DA IMUNOEXPRESSÃO DOS SISTEMAS CXCR4-CXCL12/SDF-1, CCR7-CCL21 E Ki-67 NO CARCINOMA DE CÉLULAS ESCAMOSAS ORAL E SUA
ASSOCIAÇÃO COM INDICADORES CLÍNICOPATOLÓGICOS, METÁSTASE LINFONODAL E SOBREVIDA
“Associação dos receptores e ligantes de quimiocinas com indicadores clínicopatológicos, metástase linfonodal e sobrevida no câncer oral”
Estudo retrospectivo
Autores
Galyléia Meneses Cavalcante1
Ana Paula Negreiros Nunes Alves2
1. Aluna do curso de Pós-graduação em Odontologia pela Faculdade de Farmácia, Odontologia e Enfermagem da Universidade Federal do Ceará.
2. Professora Associada da Disciplina de Patologia Bucal do Curso de Odontologia da Universidade Federal do Ceará.
Correspondência para: Alves, APNN.
Rua Monsenhor Furtado s/n, Rodolfo Teófilo.
Curso de Odontologia
Departamento de Clínica Odontológica.
Fortaleza-Ceará-Brasil
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Palavras-chave: Quimiocinas, CXCR4, CXCL12, CCR7, CCL21, Metástase, Carcinoma de células escamosas oral, Sobrevida.
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Resumo
Introdução: As quimiocinas são citocinas quimiotáticas responsáveis pela
migração direcionada de leucócitos, podendo também ser encontradas em células neoplásicas.
Dentre as quimiocinas, os sistemas CXCR4/CXCL12 e CCR7/CCL21 têm sido demonstrado
no envolvimento de metástases linfonodais ou à distância em diversos tipos de câncer. É
objetivo desse trabalho avaliar a expressão de CXCR4, CXCL12, CCR7, CCL21 e Ki-67 em
carcinoma de células escamosas orais e correlacionar estes marcadores com os indicadores
clínicopatológicos, metástase linfonodal e sobrevida. Materiais e métodos: Realizou-se
levantamento de laudos e blocos parafinados de biopsias excisionais de pacientes portadores
de carcinoma de células escamosas orais tratados no Hospital Haroldo Juaçaba (2001-2009).
Coletou-se dados sobre localização anatômica da lesão, sexo, idade, sobrevida do paciente,
grau de diferenciação histopatológica do tumor, estadiamento tumoral e presença ou ausência
de metástase linfonodal, invasão linfovascular e perineural, grau nuclear e profundidade de
invasão. A expressão do CXCR4, CCL21, CCR7 e CCL21 foi estudada por
imunohistoquímica (tecnica da estreptavidina-biotina-peroxidase), quantificadas e
determinado o percentual de marcação. A marcação de CXCR4 foi detectada em citoplasma e
núcleo, CXCL12, CCR7 e CCL21 tiveram marcação citoplasmática, sendo observada suas
expressões em 18 (60%), 8 (22,66%), 16 (53,3%) e 3 (12%) casos, respectivamente.
Encontrou-se uma associação positiva significativa entre a invasão linfovascular e a
imunomarcação do CXCR4 (p=0.007) e CCR7 (p=0.01) e dentre esses casos a metástase
esteve presente em 62,5% e 37,5% dos casos, respectivamente. Encontrou-se uma correlação
positiva significante entre o Ki67 e o CXCR4 (p=0.0086), CXCL12 (p=0.036) e CCR7
(p=0.04). Dentre os pacientes CXCR4+, ao longo de 111 meses, apenas 38,4% estavam vivos
(p=0.845), enquanto que para CCR7+, após 62 meses, todos haviam ido a óbito (p=0.398) e
pacientes CXCR4+ e CCR7+, após 62 meses todos haviam ido a óbito (p=0.441). Essas
quimiocinas estão associadas com a invasão linfovascular e proliferação celular, talvez
favorecendo o desenvolvimento de metástases e um pior prognóstico.
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Introdução
Anualmente, são diagnosticados cerca de 6,4 milhões de casos de tumores
malignos no mundo e o câncer de cabeça e pescoço constitui aproximadamente 15% de todos
os cânceres e cerca de 30% destes ocorrem em cavidade oral (1).
A carcinogênese está associada ao efeito cumulativo de alterações genéticas em
um processo de reações em cadeia. Sabe-se que nas neoplasias, a proliferação celular é
excessiva e autônoma em decorrência de danos no DNA, bem como falhas no seu reparo
durante o ciclo celular, este processo é fundamental na oncogênese, assim marcadores da
fração de crescimento celular como o anticorpo Ki-67 tem sido usado como fator prognóstico
em vários tumores (2).
As quimiocinas são citocinas quimiotáticas de baixo peso molecular (8-12kDa),
responsáveis pela migração direcionada de leucócitos, podendo coordenar o movimento
celular durante a inflamação, assim como o transporte homeostático das células
hematopoiéticas, linfócitos e células dendríticas (3).
A importância dos receptores e ligantes de quimiocinas tem sido destacada na
iniciação e progressão do câncer. Dentre esses receptores e ligantes, os sistemas
CXCR4/CXCL12 e CCR7/CCL21 tem sido demonstrado no envolvimento de metástases
linfonodais ou a distânica em diferentes tipos de câncer. Pelo menos 23 tipos de câncer
expressam o receptor CXCR4 e respondem ao seu ligante CXCL12, incluindo mama, ovário,
próstata, rim, cérebro, pulmão, coloretal, melanoma e câncer de cabeça e pescoço (3).
Além disso, alguns estudos demonstram a associação entre a expressão do sistema
CXCR4/CXCL12 e o processo de metástase em carcinoma de células escamosas oral. Almofti
et al. (2004) (4) observaram a expressão do CXCR4 em 57% dos pacientes portadores de
carcinoma de células escamosas oral, estando este marcador correlacionado com a metástase
linfonodal e a recorrência do tumor. Essa associação foi encontrada também em lesões
potencialmente malignas. Através de análise imunohistoquímica, Xia et al. (2012) (5)
verificaram uma associação positiva significativa da expressão do CXCR4 e do
CXCL12/SDF-1 em leucoplasias, em 37.5% e 33.3% dos casos, respectivamente.
Adicionalmente, um estudo da participação do CXCR4 e CXCL12 na metástase em câncer de
língua, observou que a expressão de CXCR4 está correlacionada com o tamanho do tumor e
invasão perineural, enquanto que a expressão de CXCL12 não se correlacionou com nenhuma
das variáveis clínicas patológicas avaliadas (6).
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Ao associar a expressão do receptor CCR7 com a metástase linfonodal em
carcinoma de células escamosas oral, Shang et al., em 2009 (7), verificaram correlação
significativa positiva com a metástase linfonodal, sendo sua imunomarcação expressa em
65.9% dos casos estudados. Dado esse reforçado no mesmo estudo, no qual, utilizando ensaio
de migracão in vitro, observou-se que células CCR7 positivas mostraram grande capacidade
de adesão ao linfonodo quando comparadas com as células CCR7 negativas.
Dessa forma, foi objetivo desse trabalho avaliar a expressão de CXCR4, CXCL12,
CCR7, CCL21 e Ki-67 em carcinoma de células escamosas orais e correlacionar com os
indicadores clinicopatológicos, metástase linfonodal e sobrevida.
Materiais e Métodos
Trata-se de um estudo retrospectivo, quantitativo e observacional realizado por
meio de levantamento de laudos e de blocos parafinados de biopsias excisionais de pacientes
portadores de carcinoma de células escamosas orais tratados no Hospital Haroldo Juaçaba –
Instituto do Câncer do Ceará.
Esta pesquisa foi submetida e aprovada pelo Comitê de Ética em Pesquisa (CEP)
do Hospital Haroldo Juaçaba, sob processo nº 003/2012.
Coleta de dados
Foram selecionados randomicamente um total de 30 pacientes portadores de
carcinoma de células escamosas de cavidade oral tratados no Hospital Haroldo Juaçaba –
Instituto do Câncer do Ceará durante o período de 2001 a 2009. No entanto, para o anticorpo
CCL21, por razões técnicas, foram utilizados somente 25 pacientes, não sendo observado
prejuízo na análise final. Pacientes que foram submetidos a tratamento cirúrgico,
quimioterapia ou radioterapia prévia não foram incluídos no estudo.
Dados sobre localização anatômica da lesão, sexo, idade, sobrevida do paciente,
grau de diferenciação histopatológica do tumor, estadiamento tumoral e presença ou ausência
de acometimento linfonodal foram devidamente coletados dos prontuários e laudos
histopatológicos, excluindo-se aqueles que não tenham sido completamente preenchidos. Para
a graduação tumoral as lesões foram agrupadas em: pouco diferenciado, moderadamente
diferenciado e bem diferenciado, segundo classificação histopatológica de malignidade da
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OMS (8). Todas as lâminas foram devidamente revisadas por um patologista para seleção dos
casos. Dados histopatológicos como invasão vascular e perineural, grau nuclear de Fuhrman e
profundidade de invasão foram determinados durante a revisão dos casos.
A invasão vascular ou linfática foi considerada quando as células tumorais
estavam invadindo os vasos sanguíneos ou linfáticos. A invasão perineural, por sua vez, foi
constatada quando o espaço perineural ou epineuro havia sido invadido pelo tumor (9).
Com relação ao grau nuclear, foi utilizada a classificação de Fuhrman, que
classifica os tumores quanto ao grau de atipia nuclear, variando de 1 a 4, conforme descrito
abaixo (10):
GRAU DESCRIÇÃO 1 Células com núcleos pequenos, ovais e uniformes, nucléolos inconspícuos ou
ausentes. 2 Núcleos maiores e irregulares, com nucléolos evidentes ao grande aumento
microscópico. 3 Núcleos maiores e nucléolos grandes e proeminentes, mesmo em pequeno
aumento microscópico. 4 Neoplasias exibindo núcleos bizarros e multilobulados.
Por fim, a profundidade de invasão foi demarcada a partir do ponto de origem do
tumor até a invasão ou proximidade dos canais linfovasculares (9).
Reação de Imunohistoquímica
Os blocos parafinados referentes aos laudos selecionados foram utilizados para
identificação dos receptores e ligantes de quimiocina e do Ki67 por meio de
imunohistoquímica. Estes foram seccionados com 3µm de espessura e dispostos em lâminas
silanizadas Dako, seguindo-se a técnica de estreptavidina-biotina-peroxidase padrão, descrito
por Hsu (11,12) com modificações.
Para o processo de diafanização, reidratação e recuperação do epítopo (induzida
por calor) utilizou-se o módulo de pré-tratamento Dako PT LinkTM e Tampão Tris/EDTA pH
6,0. A reação foi realizada na estação automatizada Autostainer Link 48TM Dako, na qual
ocorre o bloqueio da peroxidase endógena com o reagente Peroxidase-Blocking (R&D
Systems), incubação com o anticorpo primário anti-CXCR4 (R&D Systems Inc.,
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Minneapolis, USA, diluição 1:100), anti-CXCL12/SDF-1 (R&D Systems Inc., Minneapolis,
USA, diluição 1:100), anti-CCR7 (R&D Systems Inc., Minneapolis, USA, diluição 1:100),
anti-CCL21 (R&D Systems Inc., Minneapolis, USA, diluição 1:100) e Ki-67 (Dako,
Denmark, diluição 1:100).
Após lavagem, foi adicionado o anticorpo secundário biotinilado seguido do
complexo estreptavidina-peroxidase, sendo revelado com o cromógeno diaminobenzidina
(DAB, R&D System). Após a revelação as lâminas foram contra-coradas com Hematoxilina
de Harrys (EnVision™ FLEX Hematoxylin).
Para controle negativo da reação de imunohistoquímica, foi suprimido o anticorpo
primário e, como positivo, utilizou-se o timo para o CXCR4 e o linfonodo para o CXCL12,
CCR7, CCL21 e Ki-67.
Imagens digitais dos preparos histológicos foram capturadas, em aumento de
200x, de forma padronizada, utilizando-se uma câmera fotográfica (ICC50HD) acoplada a um
microscópio de luz (LEICA DM1000). Foram selecionados aleatoriamente 10 campos com
aproximadamente 500 células tumorais. As imagens foram ajustadas com o auxílio do
programa LAS Analysis Imagem, sendo armazenado no formato Tagged Image File Format
(TIFF).
A imunoreatividade para o CXCR4 e CCR7, foi considerada positiva nos casos
onde se verificou uma marcação membranar, citoplasmática e/ou nuclear. Para o CXCL12 e
CCL21 considerou-se positivas as marcações citoplasmáticas. O Ki67, por sua vez, possui
marcação nuclear. A contagem de células positivas se deu por meio do programa ImageJ
(Image Processing and Analysis in Java). Foram considerados positivos apenas os casos de
CXCR4, CXCL12, CCR7 e CCL21 que tiveram uma porcentagem de células positivas maior
ou igual a 10% (13).
Análise Estatística
As análises foram realizadas no software Statistica Packcage for the Social
Sciences (SPSS) versão 15.0 para Windows e considerou-se uma confiança de 95% para todas
as avaliações. Na análise da associação do CXCR4, CXCL12, CCR7 e CCL21 com os fatores
clínico-patológicos, utilizou-se o teste exato de Fisher ou Qui-quadrado. A existência de
correlação entre a imunomarcação das quimiocinas e Ki-67 foi investigada através do
coeficiente de correlação de Pearson. A associação entre o CXCR4, CXCL12, CCR7 e
CCL21 e a invasão linfovascular e perineural foram avaliados através do Teste “t” student.
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Para a avaliação da sobrevida dos pacientes realizou-se categorização segundo marcação para
CXCR4 e CCR7 por meio de curvas de Kaplan-Meier associado ao teste de LongRank
Mantel-Cox. Em todos os casos foram considerados uma resposta estatisticamente
significante para valores de p<0.05.
Resultados
Descrição das amostras
A amostragem do presente estudo constituiu-se de 30 pacientes cadastrados no
Hospital Haroldo Juaçaba – Instituto do Câncer do Ceará, durante o período de 2001 a 2009,
sendo 24 homens (80%) e 6 mulheres (20%), com idade variando entre 34 e 83 anos, com
diagnóstico de carcinoma de células escamosas oral entre a quinta e sexta década de vida e
média de 52.4 anos. Os sítios anatômicos mais acometidos foram língua (30%), base de
língua (26.66%), assoalho de boca (23.33%) e palato (13.33%). O tamanho do tumor teve um
predomínio pelo estadiamento clínico T4 (43.33%) e T2 (40%), seguido do T1 (10%) e do T3
(6.66%).
A metástase linfonodal esteve presente em 46.66% dos casos, sendo a gradação
histológica moderadamente diferenciado predominante (83.33%), seguido do bem e do pouco
diferenciado, com 10% e 6.66% respectivamente (Tabela I).
Na revisão histopatológica dos casos, verificou-se presença de invasão
linfovascular (80%) e perineural (53,33%). A alteração nuclear mais frequente foi a de grau 2
(96.66%), sendo a profundidade de invasão de 2 a 10mm mais prevalente com 63.33% dos
casos, seguido do grupo com variações de 11 a 15mm com 20% e >15mm com 16.66%
(Tabela II).
Expressão de CXCR4 e CXCL12 em carcinoma de células escamosas oral
A marcação de CXCR4 foi detectado nos compartimentos nucleares e
citoplasmáticos e o CXCL12/SDF-1 foi encontrado no citoplasma, sendo a expressão do
CXCR4 observada em 18 (60%) dos 30 casos em estudo e para o CXCL12/SDF-1 em 8
(22,66%) casos do total da amostra (Figura 1).
Ao se associar a expressão dos 18 casos positivos do receptor CXCR4 com os
fatores clínico-patológicos, verificou-se que a faixa etária mais acometida foi com idade
inferior ou igual a 65 anos, ocorrendo em 55,5% casos. O sexo masculino (77,7%) foi o mais
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acometido e as localizações anatômicas predominantes foi língua (28%), seguido de assoalho
de boca e base de língua, ambos com 22% dos casos cada. O tamanho tumoral predominante
foi os estágios de T2 (50%) e T4 (38,89%) e a presença de metástase linfonodal ocorreu em
44,44% dos casos. A gradação histopatológica mais evidenciada foi o moderadamente
diferenciado (77,7%), não sendo observado, no entanto, significância estatística em nenhum
dos fatores clínico-patológicos citados.
A expressão do receptor CXCR4 também foi associada com a invasão
linfovascular e perineural. A invasão linfovascular esteve presente em 24 (80%) casos e
desses, 12 (50%) expressavam o CXCR4, sendo estatisticamente significante (p = 0.007).
Dentre esses 12 casos com positividade para CXCR4 e presença de invasão linfovascular,
verificou-se presença de metástase linfonodal em 7 (58,33%) casos. Quanto à invasão
perineural, esta foi diagnosticada em 16 (53,33%) casos e desses, 8 (50%) estavam
expressando o CXCR4, no entanto, não se observou significância estatística (p = 0.57).
Dentre os 8 casos positivos para CXCR4 e presença de invasão perineural, a metástase
linfonodal esteve presente em 5 (62,5%) casos (Tabela III).
Quanto à sobrevida dos pacientes com marcação positiva ou negativa para o
receptor CXCR4, verificou-se que ao longo dos 89 meses de avaliação 60,6% dos pacientes
que não expressavam CXCR4 ainda estavam vivos, ao passo que ao longo de 111 meses
apenas 38,4% dos pacientes positivos para CXCR4 estavam vivos (p=0.845)(Figura 3).
Associando a expressão dos 8 casos positivos do ligante de quimiocina CXCL12,
com os fatores clinicopatológicos, observou-se que a faixa etária predominante foi a de idade
inferior ou igual a 65 anos (75%), sendo o sexo masculino o mais acometido (75%). As
localizações com maior frequência foram língua (50%) e assoalho de boca (37,5%). O
tamanho tumoral prevalente foi T4 (50%). A presença de metástase linfonodal foi verificada
em 62,5% dos casos, entretanto, com relação a esses fatores supracitados não se verificou
significância estatística. Com relação a gradação histopatológica dos casos positivos para
CXCL12, os carcinomas de células escamosas orais com diagnóstico moderadamente
diferenciado foram observados em 75% dos casos, havendo significância estatística (p = 0.04)
em relação às demais gradações histopatológicas.
Expressão de CCR7 e CCL21 em carcinoma de células escamosas oral
A marcação de CCR7 e CCL21 foram detectados ambos no compartimento
citoplasmático, sendo a expressão do CCR7 encontrada em 16 (53,3%) dos 30 casos em
estudo e para o CCL21 em 3 (12%) dos 25 casos (Figura 2).
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A análise da expressão dos 16 casos positivos do receptor CCR7 com os fatores
clínico-patológicos, verificou-se que a faixa etária com idade inferior ou igual a 65 anos foi a
mais prevelente (56,25%) e o sexo masculino foi o mais acometido (81,25%). As localizações
anatômicas predominantes foram língua (56,25%), assoalho de boca e palato, estes com
18,75% cada. O tamanho tumoral predominante foi os estágios de T2 (56,25%) e T4 (25%) e
a presença de metástase linfonodal ocorreu em 50% dos casos. A gradação histopatológica
mais evidenciada foi o moderadamente diferenciado (75%). Dentre esses fatores acima
citados, observou-se diferença significante apenas quanto ao sexo (p = 0.033).
A expressão do receptor CCR7 também foi associada com a invasão linfovascular
e perineural. Dentre os 24 (80%) casos em que ocorreram invasão linfovascular, 12 (50%)
expressavam o CCR7, sendo estatísticamente significante (p = 0.01) Dentre esses 12 casos
com positividade para CCR7 e presença de invasão linfovascular, a metástase linfonodal
esteve presente em 4 (33,3%) casos. A invasão perineural foi diagnosticada em 16 (53,33%)
casos e desses, 8 (50%) expressavam o CCR7, todavia, não foi verificado significância
estatística (p = 0.17). Dentre esses 8 casos em que haviam positividade para o CCR7 e
presença de invasão perineural, a metástase linfonodal ocorreu em 3 (37,5%) casos (Tabela
III).
Com relação a sobrevida dos pacientes com marcação positiva ou negativa para o
CCR7, verificou-se que em 111 meses de avaliação 66,1% dos pacientes que não
expressavam o receptor estavam vivos, entretanto em 62 meses todos os pacientes que
apresentaram marcação positiva para o CCR7 haviam ido a óbito (p = 0.398) (Figura 3).
Para o ligante CCL21 houve apenas 3 casos positivos, onde a faixa etária
predominante foi a de idade inferior ou igual a 65 anos (100%), sendo o sexo masculino o
mais acometido (66,6%) e o assoalho de boca a localização mais prevalente (100%). O grupo
de tamanho tumoral mais comum foi o T2 (100%), com presença de metástase linfonodal em
66,6% dos casos e gradação histopatológica moderadamente diferenciado em todos os casos.
Expressão simultânea de CXCR4 e CCR7 em carcinoma de células escamosas
oral
Quando se avaliou os casos positivos para ambos os receptores CXCR4 e CCR7,
foram encontrados 12 casos em comum. Dentre estes 12 casos, verificou-se presença de
25
invasão vascular em 8 (66,6%) casos, invasão perineural em 5 (41,66%) e metástase em 6
(50%).
Ao longo de 89 meses de avaliação 71,4% dos pacientes que não expressavam
nenhum dos receptores estavam vivos. Após uma análise de 62 meses, contudo, todos os
pacientes que expressavam ambos os receptores haviam ido a óbito (p = 0.441) (Figura 3).
Expressão de Ki-67 associada aos sistemas CXCR4/CXCL12 e CCR7/CCL21 em
carcinoma de células escamosas oral
O marcador de proliferação celular Ki-67 foi detectado nos núcleos das células do
carcinoma de células escamosas oral, sendo expresso em 15 (83.3%) dos 18 casos positivos
para o CXCR4 e em 7 (87.5%) dos 8 casos positivos para o CXCL12. Comparando a
imunomarcação dessas quimiocinas com o marcador de proliferação celular Ki-67, verificou-
se em ambos o casos uma correlação positiva significante para o CXCR4 (p = 0.0086 e r =
0.74) e CXCL12 (p = 0.036 e r = 0.73). Dentre os 15 casos positivos para CXCR4 e Ki-67, 9
(60%) apresentavam invasão linfovascular e 8 (53,33%) metástase linfonodal. Quanto aos 7
casos positivos para CXCL12 e Ki-67, em 4 (50%) foram diagnósticados invasão
linfovascular e 5 (62,5%) metástase linfonodal (Tabela IV).
Para o sistema CCR7/CCL21 o Ki-67 foi expresso em 13 (81,25%) dos 16 casos
positivos para o CCR7 e em 100% dos casos positivos para CCL21. Ao correlacionar a
imunomarcação do CCR7 com o Ki-67, verificou-se uma correlação significante (p = 0.04 e r
= 0.74) (Tabela IV). Dentre os 13 casos positivos para CCR7 e Ki-67, 9 (69,23%)
apresentavam invasão linfovascular e 6 (46,15%) metástase linfonodal.
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Figura 1: Fotomicrografias de carcinoma de células escamosas oral (CEC). (A) Marcação positiva do CXCR4 em núcleo em CEC moderadamente diferenciado e (B) negatividade do CXCR4 em CEC pouco diferenciado; (C) Imunomarcação citoplasmática positiva e (D) negativa para o CXCL12 em CEC moderadamente diferenciado.
27
Figura 2: Fotomicrografias de carcinoma de células escamosas oral (CEC). (A) Marcação citoplasmática positiva do CCR7 em CEC bem diferenciado e (B) negativa no CEC moderadamente diferenciado; (C) Imunomarcação citoplasmática positiva do CCL21 e (D) negativa em CEC moderadamente diferenciado.
A B
50 µm 50 µm
50 µm
C D
50 µm
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Figura 3: Curva de sobrevida segundo marcação positiva ou negativa para CXCR4 e/ou CCR7 por meio de curvas de Kaplan-Meier associado ao teste de LonkRank Mantel-Cox. A)Curva de sobrevida para marcação positiva ou negativa para CXCR4 (p=0.845). B) Curva de sobrevida para marcação negativa ou positiva para CCR7(p=0.398). C) Curva de sobrevida para marcação positiva ou negativa para ambos receptores CXCR4 e CCR7 (p = 0.441).
0 12 24 36 48 60 72 84 960
20
40
60
80
100CXCR4+ CCR7+CXCR4- CCR7-
Sobrevida (meses)
Po
rcen
tage
m d
e S
obr
evid
a (%
)
0 12 24 36 48 60 72 84 96 108 1200
20
40
60
80
100CXCR4+CXCR4-
Sobrevida (meses)
Per
cen
tual
de
So
bre
vid
a (%
)
A
B
C
29
Discussão
O câncer ainda apresenta muitos aspectos desconhecidos, principalmente em
relação a seu comportamento e prognóstico. A agressividade desses tumores está relacionada
a diversos fatores, dentre os quais vale ressaltar o grau histológico de malignidade, tamanho
da lesão, grau de comprometimento dos tecidos vizinhos, localização anatômica do tumor e
presença de metástase (14)
De acordo com a análise dos prontuários, o presente estudo obteve resultados
coerentes com dados epidemiológicos disponíveis na literatura quanto ao carcinoma de
células escamosas orais, sendo o sexo masculino o mais acometido, principalmente em
pacientes com idade inferior a 65 anos, com lesões primordialmente em língua, gradação
histopatológica moderamente diferenciado e tamanho tumoral mais frequente o T4 (8).
Além disso, a incidência de invasão linfovascular, perineural e grau nuclear tipo
2, foram 80,0%, 53,3% e 96,7%, respectivamente. Estudos mostram que esses dados
normalmente estão relacionados com um risco de recorrência local, uma taxa maior de
metástases e consequente diminuição da sobrevida dos pacientes (15,16).
A liberação de fatores de crescimento associados a fatores quimioatrativos geram
um microambiente capaz de modificar o comportamento biológico das células malignas
através de processos de feedback positivos. As células epiteliais cancerígenas produzem
elevados níveis de certas quimiocinas, quando comparadas com as células epiteliais normais.
Essas quimiocinas estabelecem, então, um microambiente promotor de tumor, facilitando a
angiogênese e metástase (17).
No presente estudo o receptor CXCR4 foi detectado tanto em núcleo quanto em
citoplasma, enquanto que o CCR7 e os ligantes CXCL12 e CCL21 foram encontrados apenas
em citoplasma. A internalização e tráfego desses receptores para o citoplasma são
dependentes dos resíduos de lisina, que são ubiquitinados após a interação dos receptores com
seus respectivos ligantes (18). Uma vez ativados, esses receptores aumentam os níveis
intracelulares de cálcio e induz uma cascata de fosforilação, controlada por Src ou Akt. Uma
vez fosforilada, a Akt modula a reorganização das fibras de actina na célula e, a partir disso,
começa a formar protrusões na membrana plasmática e consequente emissão de pseudópodos.
Acredita-se que, as células tumorais utilizem dessa cascata para uma provável migração
celular para outros tecidos; assim, células malignas positivas tanto para CXCR4 e CCR7
migram por um gradiente de concentração gerado por seus ligantes, seja de forma autócrina
30
ou parácrina (19).
Através deste gradiente de concentração, as células podem se deslocar dos
tumores primários, atravessar a membrana basal e transmigrar para os vasos linfáticos ou
sanguíneos através das células endoteliais (18). No presente estudo, verificou-se uma
associação positiva entre os receptores CXCR4 e CCR7 com a invasão linfovascular, o que
pode sugerir a participação desses receptores no processo de metástase local e linfonodal,
pois, segundo Schanz et al. (2011) (20) níveis moderados de CXCL12 (~2ng/ml) induzem
migração celular para linfonodos e órgãos, mostrando que esse mecanismo de invasão e
migração de células tumorais podem ser reguladas por receptores e ligantes de quimiocinas.
Dentre os casos positivos para CXCR4 e CCR7, no qual se observou a invasão
linfovascular, a metástase linfonodal esteve presente em 58,3% e 33,3% dos casos,
respectivamente. Tsuzuki et al. (2006) (21), observaram que a expressão de CCR7 em
carcinoma de células escamosas oral (CEC), apresentou uma significante relação entre sua
imunoexpressão e metástase linfonodal. Seus ligantes CCL21 e CCL19 foram
abundantemente expressos nos linfonodos, sugerindo que células de CEC oral positivas para
CCR7 podem migrar de forma direcionada para estes sítios anatômicos.
No estudo de Shang et al. (2009) (7) o CCR7 mostrou associação com a metástase
linfonodal e com o tamanho do tumor. Ainda no mesmo estudo utilizando cultura de células,
os mesmos autores verificaram que o aumento da expressão de CCL21 estimula a adesão
celular aos linfonodos, sugerindo que a interação do sistema CCR7/CCL21 pode estar
associado com a invasão tecidual e metástase linfonodal em CEC oral.
Em ensaio de migração analisando o envolvimento do sistema CXCR4/CXCL12
na metástase linfonodal em CEC oral, observou-se que as células migravam para o ligante
CXCL12 de forma dose-dependente, e que o bloqueio do receptor com um anticorpo anti-
CXCR4 interrompia esse gradiente (6).
Esse mecanismo justifica parcialmente o alto poder de invasão local do CEC oral
e sua grande probabilidade de desenvolver metástases para linfonodos cervicais,
influenciando diretamente no controle da doença e na sobrevida do paciente (22). Nos
resultados do presente estudo, apenas 38,4% dos pacientes positivos para CXCR4 estavam
vivos ao longo de 111 meses de análise; por sua vez, todos os pacientes positivos para CCR7,
todos haviam ido a óbito após 62 meses de estudo. Este fato sugere que ambos os receptores,
principalmente o CCR7, possa ser associado como um possível determinante de sobrevida
para estes pacientes.
Em estudos com câncer de mama quando o CXCR4 é encontrado tanto no
31
citoplasma quanto no núcleo da célula tumoral, está associado a um pior prognóstico, além
das metástases linfonodais (23). Assim, é possível ainda, que quando translocado para o
núcleo, o CXCR4 adquira diferentes funções e possa regular a transcrição de genes
envolvidos na invasão celular, migração e transição epitelial mesenquimal, estando
relacionado também com um pior prognóstico (24).
Similar ao observado nesse estudo, Tsuzuki et al. (2006) (21) verificando a
expressão de CCR7, observaram que em 5 anos de acompanhamento apenas 43,4% dos
pacientes positivos para CCR7 apresentavam-se vivos, ao passo que, para o mesmo período,
79,1% dos pacientes negativos para CCR7 estavam vivos, evidenciando a participação desse
receptor na redução da sobrevida provavelmente por uma via dependente de metástase
linfonodal. Adicionalmente Alevizos et al. em 2014 (25) verificaram que os pacientes que
expressavam este receptor, além de desenvolverem metástases linfonodais tiveram uma
diminuição da sobrevida em 7 anos.
Além desses fatores, o presente estudo mostrou que houve uma associação
significativa entre os receptores (CXCR4 e CCR7) e a invasão linfovascular. Tal invasão é
associada também a um pior prognóstico, visto que é sabido que CECs orais que infiltram
mais de 5mm para os tecidos subjacentes são mais propensos a metástases (14).
A expressão imunohistoquímica do Ki-67 mostrou correlação significante com os
receptores CXCR4 e CCR7 e o ligante CXCL12. Wang et al. em 2013 (16), verificaram que
essas quimiocinas estão diretamente associadas na mudança de atipia celular para carcinoma
in situ em displasias orais, fato que norlmamente é acompanhado de um aumento na
proliferação celular.
Além do Ki-67, o antígeno nuclear de proliferação celular (PCNA) tem mostrado
correlação significativa com a imunoexpressão de CCR7, mostrando que, durante a
sinalização celular através de seu respectivo ligante, há aumento da atividade proliferativa das
células que estão expressando este receptor (21).
As quimiocinas parecem, ainda, facilitar a carcinogênese por promover uma
prolongada inflamação no microambiente tumoral. Promovendo também a angiogênese,
interação leucócito-tumor, transformação tumoral, sobrevivência e crescimento celular,
invasão e metástase (3).
Portanto, a interação dos sistemas CXCR4/CXCL12 e CCR7/CCL21
desempenham papel em um possível mecanismo para indução de invasão tecidual e talvez na
metástase linfonodal de CEC oral, podendo, provavelmente, acarretar em uma diminuição da
sobrevida dos pacientes positivos para esses sistemas, além de estar potencialmente envolvido
32
no incremento de proliferação celular.
TABELAS Tabela I – Distribuição da amostra segundo as variáveis clínicopatológicas, dos pacientes portadores de carcinoma de células escamosas orais cadastrados no Hospital Haroldo Juaçaba, durante o período de 2001 a 2009.
Caracterização da amostra n (%) Número total 30 Idade <65 16(53.33) ≥65 14(46.66) Sexo Masculino 24 (80) Feminino 6 (20) Localização Assoalho de boca 7 (23.33) Base de Língua 8 (26.66) Língua 9 (30) Palato 4 (13.33) Outros 2 (6.66) Tamanho do tumor T1 3 (10.00) T2 12(40.00) T3 2 (6,66) T4 13(43.33) Metastase linfonodal Presente 14(46.66) Ausente 16(53.33) Gradação histopatológica Pouco diferenciado 2 (6.66) Moderadamente diferenciado 25(83.33) Bem diferenciado 3 (10)
33
Tabela II – Distribuição das variáveis histopatológicas nos casos analisados de carcinoma de células escamosas oral, cadastrados no Hospital Haroldo Juaçaba, durante o período de 2001 a 2009.
Características histopatológicas n (%)
Invasão linfovascular Presente 24 (80) Não detectado 6 (20) Invasão perineural Presente 16 (53.33) Não detectado 14 (46.66) Grau Nuclear Grau 1 0 (0) Grau 2 29 (96.66) Grau 3 1 (3.33) Profundidade de invasão (mm) 2 a 10 19 (63.33) 11 a 15 6 (20) >15 5 (16.66)
34
Tabela III - Associação entre as variáveis histopatológicas (invasão linfovascular e perineural) e a expressão de CXCR4 ou CCR7 e a presença de metástase linfonodal nos casos de carcinoma de células escamosas orais dos pacientes cadastrados no Hospital Haroldo Juaçaba, durante o período de 2001 a 2009.
Anticorpo Invasão linfovascular
(%)
Invasão linfovascular + Metástase (%)
Invasão perineural
(%)
Invasão perineural +
Metástase (%) CXCR4 12 (50%)a 7 (58,33%) 8 (50%)c 5 (62,5%) CCR7 12 (50%)b 4 (33,3%) 8 (50%)d 3 (37,5%)
Análise estatística realizada utilizando o teste “t”de Student com p<0.05. a (p = 0.007), b (p = 0.01), c (p = 0.57) e d (p = 0.17).
35
Tabela IV – Correlação entre a imunomarcação do CXCR4 e Ki-67, CXCL12/SDF-1 e Ki-67e entre CCR7 e Ki-67 e a presença de invasão linfonodal e metástases nos casos de carcinoma de células escamosas orais dos pacientes cadastrado no Hospital Haroldo Juaçaba , durante o período de 2001 a 2009.
Anticorpo Casos positivos (%) Invasão linfovascular (%) Metástase (%)
CXCR4 + Ki-67 15 (83,3% )a 9 (60%) 8 (53.33%)
CXCL12 + Ki-67 7 (87,5% )b 4 (50%) 5 (62,5%)
CCR7 + Ki-67 13 (81,25%) c 9 (69,23%) 6 (46,15%)
Análise estatística realizada utilizando o Coeficiente de Correlação de Pearson(r), associando os receptores ou ligantes de quimiocinas com Ki-67, com p<0.05. a (p = 0.0086, r = 0.74); b (p = 0.036, r = 0.73); c (p = 0.04, r = 0.74).
36
Referências
1. El-Naaj IA, Leiser Y, Shveis M, et al.: Incidence of oral cancer occult metastasis and
survival of T1-T2N0 oral cancer patients. J Oral Maxillofac Surg 69:2674, 2011.
2. Rodrigues RB, Motta RR, Machado SM, et al.: Prognostic value of the
immunohistochemistry correlation of Ki-67 and p53 in squamous cell carcinomas of
the larynx. Braz J Otorhinolaryngol, 74: 855-859, 2008.
3. Balkwill F: Cancer and the chemokine network. Nat Rev Cancer 4: 540-550, 2004.
4. Almofti A, Uchida D, Begum NM, et al.: The clinicopathological significance of the
expression of CXCR4 protein in oral squamous cell carcinoma. Int J Oncol 25: 65-71,
2004.
5. Xia J, Chen N, Hong Yun, et al.: Expressions of CXCL12/CXCR4 in Oral
Premalignant and Malignant Lesions. Mediators of Inflammation Article ID 516395, 5
pages, 2012.
6. Albert S, Hourseau M, Halimi C, et al.: Prognostic value of the chemokine receptor
CXCR4 and epithelial-to-mesenchymal transition in patients with squamous cell
carcinoma of the mobile tongue. Oral Oncology 48: 1263–1271, 2012.
7. Shang ZJ, Liu K and Shao Z: Expression of chemikine receptor CCR7 is associated
with cervical lymph node metastasis of oral squamous cell carcinoma. Oral Oncology
45: 480-485, 2009.
8. WHO – World Health Organization Classification of Tumours -Pathology and genetics of
head and neck tumours. Lyon, 2005.
9. Iwasa S, Yanagawa T, Fan J and Katon R: Expression of CXCR4 and its Ligand SDF-1
in Intestinal-type Gastric Cancer Is Associated with Lymph Node and Liver Metastasis.
Anticancer Research 29: 4751-4758, 2009.
10. Fuhrman SA, Lasky LC and Lima C: Prognostic significance of morphologic
parameters in renal cell carcinoma. The American Journal of Surgical Pathology 6:
655-663, 1982.
11. Hsu SM, Raine L and Fanger H: The use of antiavidin antibody and avidin-biotin-peroxidase complex in immunoperoxidase technics. American journal of clinical pathology 75: 816-821, 1981a.
12. Hsu SM, Raine L and Fanger H: Use of avidin-biotin-peroxidase complex (ABC) in immunoperoxidase techniques: a comparison between ABC and unlabeled antibody (PAP) procedures. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society 29: 577-80, 1981b.
13. Ishikawa T, Nakashiro K, Hara S, Klosek SK, Li C, Shintani S, et al.: CXCR4
expression is associated with lymph-node metastasis of oral squamous cell carcinoma.
Int J Oncol 28(1): 61–66, 2006.
37
14. Feller L and Lemmer J: Oral Squamous Cell Carcinoma: Epidemiology, clinical
presentation and treatment. Journal of Cancer Therapy 3: 263-268, 2012.
15. Goodman M et al.: Invasion Characteristics of Oral Tongue Cancer. Cancer 1: 4010-
4020, 2009.
16. Wang J, He Q, Shao YG, Ji M: Chemokines fluctuate in the progression of primary
breast cancer. European Review for Medical and Pharmacological Sciences 17: 596-
608, 2013.
17. Keeley EC, Mehrad B and Strieter RM: CXC Chemokines in cancer angiogenesis and
Metástases. Adv Cancer Res 106: 91-111, 2010.
18. Hattermann K, Mentlein R: The chemokine CXCL12 and its receptors CXCR4 and
CXCR7 in tumor biology. Annals of Anatomy 195: 103-110, 2013.
19. Ramsey DM, McAlpine SR: Halting metastasis through CXCR4 inhibition. Bioorganic
& Medicinal Chemistry Letters 23: 20-25, 2013.
20. Schanz A, Win VD, Fischer SJ et al: Pre-eclampsia is associated with elevated
CXCL12 levels in placental syncytiotrophoblasts and maternal blood. Eur. J. Obstet.
Gynecol. Reprod. Biol 157: 32-37, 2011.
21. Tsuzuki H, Takahashi N, Kojima A et al: Oral and oropharyngeal squamous cell
carcinomas expressing CCR7 have poor prognoses 33: 37-42, 2006.
22. Larsen SR, Johansen J, Sorensen JA and Krogdahl A: The Prognostic Significance of
Histological Features in Oral Squamous Cell Carcinoma. Journal of Oral Pathology and
Medicine 38(8): 657-662, 2009.
23. Xu TP, Shen H, Liu LX, Shu YQ: The impact of chemokine receptor CXCR4 on breast
cancer prognosis: A meta-analysis. Cancer Epidemiology 37: 725-731, 2013.
24. Meng X, Wuyi L, Yuhong X and Xinming C: Expression of CXCR4 in oral squamous
cell carcinoma: correlations with clinicopathology and pivotal role of proliferation. J
Oral Pathol Med 39: 63-68, 2010.
25. Alevios L, Kataki A, Derventzi A, Gomatos I et al: Breast cancer nodal metastasis
correlates with tumour and lymphnode methylation profiles of Caveolin-1 and CXCR4.
Clin Exp Metastasis 31: 511-520.
38
4 CONCLUSÕES GERAIS
Pode-se então concluir que:
O CXCR4 foi expresso em 60% dos casos de câncer de boca, o CXCL12 em
22,6%, o CCR7 em 53,3% e o CCL21 em 12,0%. Os receptores mostraram associação
significante com a invasão linfovascular, o qual pode configurar um mecanismo de atração de
células tumorais para os linfonodos e favorecer o desenvolvimento de metástases e,
provavelmente, acarretar em uma diminuição da sobrevida dos pacientes positivos para esses
sistemas.
O CCR4, CCR7 e o CXCL12 também se correlacionaram positivamente com o
marcador de proliferação Ki67, evidenciando que diante de uma multiplicação celular
desordenada, maiores quantidades de receptores e ligantes poderão ser expressos no tumor
primário.
A utilização desses marcadores podem ser ferramentas importantes tanto para
predizer o prognóstico do paciente, quanto ser fonte de pesquisa de inibidores dessa interação
receptor-ligante, a fim de que se evite a progressão tumoral e consequente desenvolvimento
de metástases regionais ou à distância.
39
REFERÊNCIAS ALBERT, S. et al. Prognostic value of the chemokine receptor CXCR4 and epithelial-to-mesenchymal transition in patients with squamous cell carcinoma of the mobile tongue. Oral Oncol., v. 48, p. 1263–1271, 2012. ALMOFTI, A. et al. The clinicopathological significance of the expression of CXCR4 protein in oral squamous cell carcinoma. Int. J. Oncol., v. 25, p. 65-71, 2004. BALKWILL, F. Cancer and the chemokine network. Nat. Rev. Cancer, v. 4, p. 540-550, 2004. DELILBASI, C. B. et al. Investigation of CXCR4 in squamous cell carcinoma of the tongue. Oral Oncol., v. 40, p. 154-157, 2004. EL-NAAJ, I. A. et al. Incidence of oral cancer occult metastasis and survival of T1-T2N0 oral cancer patients. J. Oral Maxillofac. Surg, v. 69, p. 2674-2679, 2011. GUERREIRO, R. et al. As quimiocinas e seus receptores: Características e Funções Fisiológicas. Acta Med. Port., v. 24, p. 967-976, 2011. HADAD, R.I. Recent advances in Head and Neck Cancer. N. Engl. J. Med., v. 359, p. 1143– 1154, 2008. INCA. Incidência de Câncer no Brasil: Estimativas 2012. Rio de Janeiro, 2012. Disponível em:< http://www.inca.gov.br/estimativa/2012/>. Acesso em: 2 jul. 2014. ISHIKAWA, T. et al. CXCR4 expression is associated with lymph-node metastasis of oral squamous cell carcinoma. Int. J. Oncol., v. 28, p. 61-66, 2006. LIOTTA, L. A. An atractive force in metastasis. Nature, v. 241, p. 24-25, 2001. LOURENÇO, S. Q. C. et al. Histological Classifications of Oral Squamous Cell Carcinoma: a Review of the Proposed Systems. Rev. Bras. Cancerol., v. 53, n. 3, p. 325-333, 2007. MARTINEZ, A. B. et al. Epidemiological study of oral cancer patients in Alava province, Spain. Exp. Therap. Med., v. 2, p. 937-940, 2011. MEHROTRA, R.; VASSTRAND, E. N.; IBRAHIM, S. O. Recent advances in understanding carcinogenicity of oral squamous cell carcinoma: From basic molecular biology to latest genomic and proteomic findings. Cancer Gen. Proteom., v. 1, p. 283-292, 2004. MENG, X. et al. Expression of CXCR4 in oral squamous cell carcinoma: correlations with clinicopathology and pivotal role of proliferation. J. Oral Pathol. Med., v. 39, p. 63-68, 2010. MIYAZAKI, H. et al. Down-regulation of CXCL5 inhibits squamous carcinogenesis. Cancer Res., v. 66, p. 4279-4284, 2006b. MIYAZAKI, H. et al. Growth factor-sensitive molecular targets identified in primary and metastatic head and neck squamous cell carcinoma using microarray analysis. Oral Oncol., v. 42, p. 240–256, 2006a.
40
NAGPAL, J. K.; BIBHU, R. D. Oral cancer: reviewing the presente understanding of its molecular mechanism and exploring the future directions for its effective management. Oral Oncol., v. 39, p. 213-221, 2003. ONOUE, T. et al. Epithelial-mesenchymal transition induced by the stromal cell-derived factor-1/CXCR4 system in oral squamous cell carcinoma cells. Int. J. Oncol., v. 29, p. 1133–1138, 2006. RAVI, D. K. et al. Apoptosis, angiogenesis and proliferation: trifunctional meassure of tumor response to radiotherapy for oral câncer. Oral Oncol., v. 37, p.164-171, 2001. RODRIGUES, R. B. et al. Prognostic value of the immunohistochemistry correlation of Ki-67 and p53 in squamous cell carcinomas of the larynx. Braz. J. Otorhinolaryngol., v. 74, p. 855-859, 2008. ROSENKILDE, M. M.; SCHWARTZ, T. W. The chemokine system – a major regulator of angiogenesis in health and disease. APMIS, v. 112, p. 481–495, 2004. SANTOS-GARCIA, A. et al. Proteic expression of p53 and cellular proliferation in oral leukoplakias. Med. Oral Patol. Oral Cir. Bucal, v. 10, n.1, p.5-8, 2005. SHANG, Z. J.; LIU, K.; SHAO, Z. Expression of chemikine receptor CCR7 is associated with cervical lymph node metastasis of oral squamous cell carcinoma. Oral Oncol., v. 45, p. 480-485, 2009. SHINTANI, S. et al. Growth-regulated oncogene-1 expression is associated with angiogenesis and lymph nodemetastasis in human oral cancer. Oncology, v. 66, p. 316–322, 2004. WANG, J. et al. Expression pattern of chemokine receptor 6 (CCR6) and CCR7 in squamous cell carcinoma ofthe head and neck identifies a novel metastatic phenotype. Cancer Res., v. 64, p. 1861–1866, 2004. WHO. Pathology and genetics of head and neck tumours. Lyon, 2005. XIA, J. et al. Expressions of CXCL12/CXCR4 in Oral Premalignant and Malignant Lesions. Mediat. Inflamm ., v. 2012, 2012. YAN, L. et al. Therapeutic potential of cytokine and chemokine antagonists in cancer therapy. Eur. J. Cancer, v. 42, n. 6, p. 793-802, 2006.
41
ANEXO A - Aceite do Comitê de Ética em Pesquisa Humana
42
ANEXO B – Manual de normalização para defesa de dissertação de mestrado e tese de doutoradono formato alternativo do Programa de Pós-graduação em Odontologia Universidade Federal do Ceará ESTRUTURA DO TRABALHO As teses e dissertações apresentadas ao Programa de Pós-Graduação em Odontologia da
Universidade Federal do Ceará poderão ser produzidas em formato alternativo ou
tradicional de acordo com o artigo 46 do Regimento Interno do Programa de Pós-
Graduação em Odontologia da Universidade Federal do Ceará. O formato alternativo
estabelece: a critério do orientador e com a aprovação da Coordenação do Programa, que
os capítulos e os apêndices poderão conter cópias de artigos de autoria ou co-autoria do
candidato, publicados ou ainda não submetidos para publicação em periódicos científicos,
escritos no idioma exigido pelo veículo de divulgação. §1º - O orientador e o candidato deverão verificar junto às editoras a possibilidade de
inclusão dos artigos na dissertação ou tese, em atendimento à legislação que rege o direito
autoral, obtendo, se necessária, a competente autorização, devendo assinar declaração de
que não estão infringindo o direito autoral transferido à editora. O formato padrão e alternativo das dissertações de mestrado e teses e doutorado da UFC
deverão obrigatoriamente conter: a) capa – cobertura externa de material flexível ou rígido que oferece melhor proteção ao
trabalho. Usa-se a cor preta para dissertações e teses com os caracteres dourados. Nela
devem constar, na seguinte ordem: - nome da instituição, seguido do centro ou faculdade, departamento e curso, todos
centralizados a partir da primeira linha do texto, em letras maiúsculas; - nome do autor, centralizado e colocado após o cabeçalho inicial, em letras maiúsculas; - título em letras maiúsculas e centralizado, colocado após o nome do autor; - subtítulo (se houver) em letras maiúsculas, separado por dois pontos do título; - número de volumes (se houver) centralizado e colocado logo após o título ou o subtítulo; - local (cidade) da instituição onde vai ser apresentado o trabalho, em letras maiúsculas, na
margem inferior e centralizado na penúltima linha; - ano de entrega, seguindo o local, na margem inferior e centralizado na última linha.
43
b) lombada (opcional) - de acordo com a NBR 12225/1992, é a parte da publicação que
reúne as margens internas ou dobras das folhas, sejam elas costuradas, grampeadas, coladas
ou mantidas juntas de outra maneira: - último sobrenome do autor e título do trabalho escrito longitudinalmente e legível do
alto para o pé da lombada. Dessa forma, possibilita a leitura quando a publicação estiver
no sentido horizontal, com a face voltada para cima; - ano de publicação colocado logo após o título; - quando necessário, identifica-se com outros elementos alfanuméricos, por exemplo: v. 2. c) folha de rosto (obrigatório) – contém elementos essenciais que identificam o trabalho: O anverso da folha de rosto deve conter, na seguinte ordem: - nome do autor, responsável intelectual do trabalho, centralizado na primeira linha do
texto, em letras maiúsculas; - título principal do trabalho em letras maiúsculas e centralizado, colocado após o nome
do autor; - subtítulo (se houver) em letras maiúsculas, separado por dois pontos do título; - número de volumes (se houver mais de um, deve constar em cada folha de rosto)
centralizado e colocado logo após o título ou o subtítulo acompanhado da respectiva
especificação; - nota explicativa contendo a natureza e objetivo do trabalho, nome da instituição e área de
concentração, transcrita em espaço simples e em letras normais, alinhada a partir do centro da
folha em tipo menor que o usado para o texto; - nome do orientador e do co-orientador (se houver) iniciando e finalizando nas mesmas
margens da nota explicativa, distante desta por uma linha em branco; - local (cidade) da instituição onde vai ser apresentado o trabalho, em letras maiúsculas e
centralizado na penúltima linha; - ano de entrega, seguindo o local, na margem inferior e centralizado na última linha. O verso da folha de rosto deve conter: - ficha catalográfica no tamanho 7,5 cm x 12,5 cm, elaborada de acordo com o Código de
Catalogação Anglo-Americano vigente e localizada na parte inferior da folha. A ficha deve
ser feita pelo(a) bibliotecário(a) da biblioteca que serve ao curso em questão. d) errata (de acordo com a necessidade) – constituída pela referência do trabalho e pelo texto
da errata. Pode ser apresentada em papel avulso ou encartado acrescido ao trabalho depois da
44
impressão do mesmo. Deve ser inserida após a folha de rosto. e) folha de aprovação (obrigatório para teses e dissertações) – colocada em folha distinta logo após a folha de rosto, contém: - autor, centralizado na primeira linha do texto, em letras maiúsculas; - título por extenso e subtítulo (se houver), centralizados e em letras maiúsculas, colocados
logo após o autor; - o subtítulo deve ser separado do título por dois pontos; - nota explicativa contendo a natureza e objetivo do trabalho, nome e área de concentração,
transcrita em espaço simples e em letras normais, alinhada a partir do centro da folha em tipo
menor que o usado para o texto; - data de aprovação, colocada logo após a nota; -nome, titulação e assinatura dos componentes da banca examinadora e instituição a que
pertencem, ocupando a metade inferior da folha. Os trabalhos defendidos em formato
alternativo têm como exigência mínima: em revista científica com classificação Qualis A Nacional ou superior; revista científica com classificação Qualis C Internacional ou superior.
Obs.: A lista Qualis válida é a mais recente disponível no site da CAPES
http://qualis.capes.gov.br/webqualis/ConsultaListaCompletaPeriodicos.
Em formato alternativo: Capa Folha de rosto (primeira folha interna) Ficha catalográfica (verso da folha de rosto) Folha de aprovação Dedicatória (Opcional) Agradecimentos (Opcional) Epígrafe (Opcional) Resumo Abstract Lista de Abreviaturas e Siglas (Opcional)
45
Sumário 1. Introdução Geral
2. Proposição 3. Capítulos 4. Conclusão Geral
Referências
Bibliografia
(Opcional)
Glossário
(Opcional)
Apêndice
(Opcional) Anexo
(Opcional)
RESUMO O Resumo é a síntese dos pontos relevantes do documento, em linguagem clara, concisa e
direta. Ele transmite informações e fornece elementos para decidir sobre a consulta do texto
completo. Seis itens são essenciais para a elaboração de um resumo: a) situar o trabalho; b)
expor os objetivos; c) descrever a metodologia utilizada; d) expor a própria experiência; e)
apresentar os resultados obtidos; f) conclusão. Usar, de preferência, a terceira pessoa do
singular e empregar o verbo na voz ativa. Localizado em folha separada, limita-se a um
parágrafo. Deve ter no mínimo 250 e no máximo 500 palavras. Logo abaixo do resumo,
indicam-se as palavras-chave. Deve obrigatoriamente estar relacionado a todos os capítulos
do trabalho sejam eles experimentais ou não.
ABSTRACT É a tradução fiel do resumo para a língua inglesa, desta forma segue a mesma orientação do
resumo. Logo abaixo do abstract, devem ser indicadas as key-words.
SUMÁRIO É a indicação do conteúdo do documento, refletindo as principais divisões e seções na mesma
ordem e grafia em que se apresentam no texto. O sumário deve oferecer ao leitor uma visão
global do estudo realizado, e deve:
46
• Ser localizado após todos os elementos pré-textuais, e não devem constar no sumário. • Ser transcrito em folha distinta, com o título centrado. • O título do capítulo ou seção deve aparecer no sumário com o mesmo tipo de letra utilizado no texto. • Cada parte é seguida pelo número da página em que se inicia. • Usa-se o termo "sumário" (e. não a palavra índice ou lista) para designar esta parte. 1 INTRODUÇÃO GERAL Parte inicial do texto, a introdução apresenta a formulação clara e simples do tema
investigado; deve constar a delimitação do assunto tratado, sua justificativa, objetivos da
pesquisa, rápida referência a trabalhos anteriormente realizados e outros elementos
necessários para situar o tema do trabalho. A introdução, como primeira seção do texto,
receberá o indicativo 1 (um), não sendo aconselhada a inclusão de figuras e/ou tabelas.
2. PROPOSIÇÃO
Trata-se da descrição dos objetivos da investigação – o propósito da pesquisa científica.
Constitui a segunda parte do texto, recebendo o indicativo 2. Nesta parte será(ão)
apresentado(s) o(s) objetivo(s) da pesquisa que será(ão) concernente(s) ao(s) capítulo(s)
apresentado(s) subseqüentemente.
3. CAPÍTULOS Deve(m) ser inserida(s) a(s) cópia(s) de artigo(s) de autoria ou co-autoria do candidato, já
publicado(s) em periódicos científicos ou ainda não publicado(s). Cada capítulo deve conter
sua indicação, seguido do número (em arábico) correspondente. Ex.: Capítulo 1, Capítulo 2 e
assim sucessivamente e deverá informar o nome do periódico onde o artigo foi submetido
para publicação. O idioma e as normas de referências e de escrita devem ser as da revista na
qual o artigo foi submetido para publicação.
4. CONCLUSÃO GERAL Podendo ser apresentada de forma dissertativa ou de tópicos, a conclusão é a parte final do
texto na qual se apresenta o fechamento das idéias correspondentes aos objetivos, tentando
responder às hipóteses formuladas. A conclusão deve ser apresentada de maneira lógica, clara
e objetiva, fundamentada nos resultados e na discussão. Portanto, não é permitida inclusão de
47
dados novos neste capítulo. Não deve ser uma repetição dos resultados, deve constar o que
foi resolvido, comprovado, justificado, atingido, dificuldades encontradas, mudanças que se
fizeram necessárias, novas indagações que surgiram durante o transcorrer do trabalho, que
contribuições esse trabalho trouxe e sugestões de novas pesquisas. Devem ser referentes a
todos os capítulos apresentados.
PÓS-TEXTUAIS São elementos complementares que têm relação com o texto, mas que, para torná-los menos
densos e não prejudicá-los, costumam vir apresentados após a parte textual.
REFERÊNCIAS GERAIS Consistem numa listagem de todo material bibliográfico utilizado para a produção da parte
geral do trabalho, permitindo a identificação de publicações, no todo ou em parte. Inclui
apenas referências das citações utilizadas no texto e não indicadas em nota de rodapé. Esta
lista permite ao leitor comprovar fatos ou ampliar conhecimentos, mediante consulta as fontes
referenciadas. As comunicações pessoais não fazem parte da lista de referências, sendo
colocadas apenas em nota de rodapé. É válido ratificar que não devem ser inseridas as
referências já relacionadas nos trabalhos apresentados nos capítulos, apenas deve conter as
referências usadas na introdução geral e na discussão geral. As referências nos trabalhos
apresentados à FFOE/UFC deverão ser baseadas nas normas apresentadas no Guia para
Normalização de Trabalhos Acadêmicos da Biblioteca Universitária.
APRESENTAÇÃO GRÁFICA
Formato a) papel branco, formato A4 (210 mm x 297 mm); b) digitação em fonte tamanho 12 para o texto (Times New Roman ou Arial); c) digitação em fonte tamanho 10 (Times New Roman ou Arial) para citações longas, notas de
rodapé, paginação, legendas de ilustrações e tabelas; d) a digitação é feita no anverso da folha com exceção para a folha de rosto; e) opcionalmente pode-se digitar no anverso e no verso da folha dependendo do tipo de papel
utilizado; f) a digitação é feita na cor preta;
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g) o projeto gráfico é de responsabilidade do autor do trabalho.
Margem
a) margens esquerda e superior de 3 cm; b) direita e inferior de 2 cm; c) parágrafo inicial de 2 cm a partir da margem esquerda; d) a citação longa é destacada com recuo de 4 cm da margem esquerda. Espacejamento
a) todo o texto deve ser digitado com 1,5 cm de entrelinhas; b) as citações longas, as notas, os resumos, as referências, as legendas das ilustrações e
tabelas, a ficha catalográfica, a natureza do trabalho, o objetivo, o nome da instituição e a área
de concentração devem ser digitados em espaço simples; c) as referências ao final do trabalho devem ser separadas entre si por espaço duplo; d) os títulos das seções e subseções devem ser separados do texto que os precede ou os sucede
por um espaço duplo ou dois espaços simples; e) as notas de rodapé devem ser digitadas dentro das margens, separadas do texto por um
espaço simples de entrelinhas e por filete de 3 cm, a partir da margem esquerda; f) na folha de rosto e na folha de aprovação, a natureza do trabalho, o objetivo, o nome da
instituição e a área de concentração devem ser alinhados do centro da folha para a margem
direita.
Indicativos de seção a) indicativo numérico de uma seção antecede seu título, alinhado à esquerda, separado por
um espaço de caractere; b) os títulos sem indicativo numérico, como errata, agradecimentos, resumo, listas de
ilustrações, listas de abreviaturas e siglas, lista de símbolos, sumário, glossário, apêndices,
anexos e índices devem ser centralizados conforme a NBR 6024/1989.
Paginação
a) todas as folhas do trabalho são contadas a partir da folha de rosto, seqüencialmente; b) a numeração é colocada, a partir da primeira folha da parte textual;
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c) a numeração é em algarismos arábicos, no canto superior direito da folha a 2 cm da borda superior, ficando o último algarismo a 2 cm da borda direita da folha, em tamanho menor que o do texto;
d) em caso de digitação no anverso e verso da folha, a numeração das páginas deve ser em
algarismos arábicos no canto superior esquerdo (para páginas pares) e no canto superior
direito (para páginas ímpares); e) para trabalhos em mais de um volume, deve ser dada uma numeração seqüencial das folhas
do primeiro ao último volume;
f) a numeração de apêndices e anexos, quando utilizados, deve ser contínua à do texto principal.
Numeração progressiva, de acordo com a NBR 6024/1989
a) evidencia e sistematiza o conteúdo do trabalho em seções; b) as seções são partes em que se divide o texto de um documento, que contêm as matérias
consideradas afins na exposição ordenada do assunto; c) as seções primárias são as principais divisões do texto de um documento, e devem iniciar
em folha distinta; d) as seções primárias podem ser divididas em seções secundárias; as secundárias, em
terciárias; as terciárias, em quaternárias; e assim por diante; e) os títulos das seções são destacados gradativamente, usando-se racionalmente os recursos
de negrito, itálico ou grifo, caixa alta ou maiúsculas etc., conforme a NBR 6024, no sumário e
de forma idêntica, no texto; f) quando uma seção tem título, este é colocado na mesma linha do respectivo indicativo, e a
matéria da seção pode começar na linha seguinte da própria seção ou em uma seção
subseqüente;
g) o título da seção primária deve aparecer em destaque (maiúsculas e negrito); as seções
secundárias, aparecem em letras normais e em negrito; as demais seções, terciárias,
quaternárias e assim por diante aparecem em letras normais, sem destaque, todas alinhadas à
margem esquerda.
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ANEXO C - Normas periódico Anticancer Research Instructions to Authors
General Policy ANTICANCER RESEARCH (AR) will accept original high quality works and reviews on all aspects of experimental and clinical cancer research. The Editorial Policy suggests that priority will be given to papers advancing the understanding of cancer causation, and to papers applying the results of basic research to cancer diagnosis, prognosis, and therapy. AR will also accept the following for publication: (a) Abstracts of scientific meetings on cancer, following consideration and approval by the Editorial Board; (b) Announcements of meetings related to cancer research; (c) Short reviews (of approximately 120 words) and announcements of newly received books and journals related to cancer, and (d) Announcements of awards and prizes. The principal aim of AR is to provide prompt publication for original works of high quality, generally within 1-2 months from final acceptance. Manuscripts will be accepted on the understanding that they report original unpublished works on the cancer problem that are not under consideration for publication by another journal, and that they will not be published again in the same form. All material submitted to AR will be subject to review, when appropriate, by two members of the Editorial Board and by one suitable outside referee. The Editors reserve the right to improve manuscripts on grammar and style. The Editors and Publishers of AR accept no responsibility for the contents and opinions expressed by the contributors. Authors should warrantee due diligence in the creation and issuance of their work. NIH Open Access Policy The journal acknowledges that authors of NIH funded research retain the right to provide a copy of the final manuscript to the NIH four months after publication in ANTICANCER RESEARCH, for public archiving in PubMed Central. Copyright Once a manuscript has been published in ANTICANCER RESEARCH, which is a copyrighted publication, the legal ownership of all published parts of the paper has passed from the Author(s) to the journal. Material published in the journal may not be reproduced or published elsewhere without written consent of the Managing Editor. Format Two types of papers may be submitted: (i) Full papers containing completed original work, and (ii) short papers. Additionally, the Editors may invite review articles concerning fields of recognisable progress. Papers should contain all essential data in order to make the presentation clear. Reasonable economy should be exercised with respect to the number of tables and illustrations used. Papers should be written in clear, concise English. Spelling should follow that given in the "Shorter Oxford English Dictionary".
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Manuscripts Submitted manuscripts should not exceed fourteen (14) pages (approximately 250 words per double - spaced typed page), including abstract, text, tables, figures, and references (corresponding to 4 printed pages). Papers exceeding four printed pages will be subject to excess page charges. All manuscripts should be divided into the following sections: (a) First page including the title of the presented work [not exceeding fifteen (15) words], full names and full postal addresses of all Authors, name of the Author to whom proofs are to be sent, key words, an abbreviated running title, an indication "clinical", "epidemiological", or "experimental" study, and the date of submission. (Note: The order of the Authors is not necessarily indicative of their contribution to the work. Authors may note their individual contribution(s) in the appropriate section(s) of the presented work.) (b) Abstract not exceeding 150 words, organized according to the following headings: Background/Aim - Materials and Methods/Patients and Methods - Results - Conclusion (c) Introduction (d) Materials and Methods/Patients and Methods (e) Results (f) Discussion (g) Acknowledgements (h) References All pages must be numbered consecutively. Footnotes should be avoided. Review articles may follow a different style according to the subject matter and the Author's opinion. Review articles should not exceed 35 pages (approximately 250 words per double-spaced typed page) including all tables, figures, and references. Figures All figures (whether photographs or graphs) should be clear, high contrast, glossy prints of the size they are to appear in the journal: 8.00 cm (3.15 in.) wide for a single column; 17.00 cm (6.70 in.) for a double column; maximum height: 20.00 cm (7.87 in.). Graphs must be submitted as photographs made from drawings and must not require any artwork, typesetting, or size modifications. Symbols, numbering and lettering should be clearly legible. The number and top of each figure must be indicated on the reverse side. Original karyotypes and photographs should be provided wherever possible, and not photographic copies. Colour plates are charged. Tables Each table should be submitted on a separate page, typed double-spaced. Tables should be numbered with Roman numerals and should include a short title. Nomenclature and Abbreviations Nomenclature should follow that given in "Chemical Abstracts", "Index Medicus", "Merck Index", "IUPAC –IUB", "Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology", The CBE Manual for Authors, Editors and Publishers (6th edition, 1994), and MIAME Standard for Microarray Data. Human gene symbols may be obtained from the HUGO Gene Nomenclature Committee (HGNC) (http://www.gene.ucl.ac.uk/). Approved mouse nomenclature may be obtained from
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http://www.informatics.jax.org/. Standard abbreviations are preferable. If a new abbreviation is used, it must be defined on first usage. References Citations for the reference sections of submitted works should follow the standard form of "Index Medicus" and must be numbered consecutively. In the text, references should be cited by number. Examples: 1 Sumner AT: The nature of chromosome bands and their significance for cancer research. Anticancer Res 1: 205-216, 1981. 2 McGuire WL and Chamnes GC: Studies on the oestrogen receptor in breast cancer. In: Receptors for Reproductive Hormones (O' Malley BW, Chamnes GC (eds.). New York, Plenum Publ Corp., pp 113-136, 1973. Clinical Trials Authors of manuscripts describing clinical trials should provide the appropriate clinical trial number in the correct format in the text. For International Standard Randomised Controlled Trials (ISRCTN) Registry (a not-for-profit organization whose registry is administered by Current Controlled Trials Ltd.) the unique number must be provided in this format: ISRCTNXXXXXXXX (where XXXXXXXX represents the unique number, always prefixed by 'ISRCTN'). Please note that there is no space between the prefix 'ISRCTN' and the number. Example: ISRCTN47956475. For Clinicaltrials.gov registered trials, the unique number must be provided in this format: NCTXXXXXXXX (where XXXXXXXX represents the unique number, always prefixed by 'NCT'). Please note that there is no space between the prefix 'NCT' and the number. Example: NCT00001789. Submission of Manuscripts Follow the Instructions to Authors regarding the format of your manuscript and references. There are 3 ways to submit your article (NOTE: PLEASE USE ONLY ONE OF THE ABOVE OPTIONS. DO NOT SUBMIT YOUR ARTICLES TWICE . IN CASE YOUR SUBMISSION IS NOT COMPLETE, YOU WILL BE NOTIFIED ACCORDINGLY.): 1. To submit your article online please visit: IIAR-Submissions. 2. You can send your article via e-mail to [email protected]. Please remember to always indicate the name of the journal you wish to submit your paper. The text should be sent as a Word document (*doc) attachment. Tables, figures and cover letter can also be sent as e-mail attachments. 3. You can send the manuscript of your article via regular mail in a USB stick, DVD, CD or floppy disk (including text, tables and figures) together with three hard copies of your manuscript to the following address: John G. Delinasios International Institute of Anticancer Research (IIAR) Editorial Office of ANTICANCER RESEARCH, IN VIVO, and
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CANCER GENOMICS & PROTEOMICS 1st km Kapandritiou-Kalamou Road P.O. Box 22, GR-19014 Kapandriti, Attiki GREECE Submitted articles will not be returned to Authors upon rejection. Galley Proofs Unless otherwise indicated, galley proofs will be sent to the first-named Author of the submission. Corrections of galley proofs should be limited to typographical errors. Reprints Reprints, PDF files and/or activation of open access may be ordered after the acceptance of the paper. Requests should be addressed to the Editorial Office. Specific information about publishing in Anticancer Research and additional instructions to Authors. 1. Anticancer Research (AR) closely follows the new developments in all fields of experimental and clinical cancer research by (a) inviting reviews on topics of immediate importance and substantial progress in the last three years, and (b) providing the highest priority for rapid publication to manuscripts presenting original results judged to be of exceptional value. Theoretical papers will only be considered and accepted if they bear a significant impact or formulate existing knowledge for the benefit of research progress. 2. Anticancer Research will consider the publication of conference proceedings and/or abstracts provided that the material submitted fulfills the quality requirements and instructions of the journal, following the regular review process by two suitable referees. 3. An acknowledgement of receipt, including the article number, title and date of receipt is sent to the corresponding author of each manuscript upon receipt. If this receipt is not received within 20 days from submission, the author should call or write to the Editorial Office to ensure that the manuscript (or the receipt) was not lost in the mail. 4. Each manuscript submitted to AR is sent for review in confidence to two suitable referees with the request to return the manuscript with their comments to the Editorial Office within 12 days from receipt. If reviewers need a longer time or wish to send the manuscript to another expert, the manuscript may be returned to the Editorial Office with a delay. All manuscripts submitted to AR, are treated in confidence, without access to any person other than the Managing Editor, the journal's secretary, the reviewers and the printers. 5. All accepted manuscripts are peer-reviewed and carefully corrected in style and language, if necessary, to make presentation clear. (There is no fee for this service). Every effort is made (a) to maintain the personal style of the author's writing and (b) to avoid change of meaning. Authors will be requested to examine carefully manuscripts which have undergone language correction at the pre-proof or proof stage.
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6. Authors should pay attention to the following points when writing an article for AR:
• The Instructions to Authors must be followed in every detail. • The presentation of the experimental methods should be clear and complete in every
detail facilitating reproducibility by other scientists. • The presentation of results should be simple and straightforward in style. Results and
discussion should not he combined into one section, unless the paper is short. • Results given in figures should not be repeated in tables. • Figures (graphs or photographs) should be prepared at a width of 8 or 17 cm with
legible numbers and lettering. • Photographs should be clear glossy prints of high contrast, presenting the actual
observation described in the legend and in the text. Each legend, should provide a complete description, being self-explanatory, including technique of preparation, information about the specimen and magnification.
• Statistical analysis should be elaborated wherever it is necessary. Simplification of presentation by giving only numerical or % values should be avoided.
• Fidelity of the techniques and reproducibility of the results, should be points of particular importance in the discussion section. Authors are advised to check the correctness of their methods and results carefully before writing an article. Probable or dubious explanations should be avoided.
• Authors should not cite results submitted for publication in the reference section. Such results may be described briefly in the text with a note in parenthesis (submitted for publication by... authors, year).
• The Reference section should provide as complete a coverage of the literature as possible including all the relevant works published up to the time of submission.
• By following these instructions, Authors will facilitate a more rapid review and processing of their manuscripts and will provide the readers with concise and useful papers.
7. Following review and acceptance, a manuscript is examined in language and style, and galley proofs are rapidly prepared. Proofs of articles accepted for urgent publication may be sent to Author(s) without pre-correction, thus they may contain a higher than usual number of printing errors. Second proofs are not sent unless required. 8. Authors should correct their galley proofs very carefully and preferably twice. An additional correction by a colleague always proves to be useful. Particular attention should be paid to chemical formulas, mathematical equations, symbols, medical nomenclature etc. Any system of correction marks can be used in a clear manner, preferably with a red pen. Additions or clarifications are allowed provided that they improve the presentation but do not bring new results (no fee). 9. Articles submitted to AR may be rejected without review if:
• they do not fall within the journal's policy. • they do not follow the instructions to authors. • language is unclear. • results are not objectively based on valid experiments. • they repeat results already published by the same or other authors before the submission
to AR. • Rejection rate (2002): 64%
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Submitted articles will not be returned to Authors upon rejection. 10. Authors who wish to prepare a review should contact the Managing Editor of the journal in order to get confirmation of interest in the particular topic of the review and to allow programming of space availability. The expression of interest by the Managing Editor does not necessarily imply acceptance of the review by the journal. 11. Authors may inquire information about the status of their manuscript(s) by calling the Editorial Office at +30-22950-53389, Monday to Friday 9.00-16.00 (Athens time), or by sending an e-mail to [email protected]. 12. Reprints of published articles are usually delivered to the corresponding Author, within 1 month after publication. 13. Authors who wish to edit a special issue on a particular topic should contact the Managing Editor. 14. Authors, Editors and Publishers of books are welcome to submit their books for immediate review in AR. There is no fee for this service. (This text is a combination of advice and suggestions contributed by Editors, Authors, Readers and the Managing Editor of AR).