PIBIC-UFU, CNPq & FAPEMIG Universidade Federal de Uberlândia Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós-Graduação DIRETORIA DE PESQUISA

DISCUSSÃO DE UM PROTOCOLO EXPERIMENTAL PARA ESTUDOS DE CARDIOFISIOLOGIA EM CAMUNDONGOS

Sarah Soares de Castro Faculdade de Engenharia Elétrica – Universidade Federal de Uberlândia. FEELT/UFU – Av. João Naves de Ávila, 2121 – Santa Mônica – Uberlândia (MG) – Brasil – CEP 38400-902 sarah_ufu@hotmail.com Márcia Artiaga Colantoni marcinhamelv@yahoo.com.br

Resumo: O objetivo deste trabalho é descrever de forma completa o estudo de cardiofisiologia

realizado em camundongos pelas primeiras autoras, que visa relacionar os resultados obtidos aos

seres humanos por meio de fisiologia comparada. O estudo consiste no monitoramento do estado

cardiofisiológico do animal utilizando um eletrocardiógrafo que capta os sinais elétricos cardíacos

durante a admissão de drogas intravenosas. O resultado final é obtido por análise espectral que

possibilita a visualização das mudanças ocorridas na atividade cardíaca após a injeção de cada

droga. Esses resultados permitem estudar as respostas neurocardiovasculares do camundongo às

drogas aplicadas.

Palavras-chave: fisiologia comparada, eletrocardiograma, análise espectral, cardiofisiologia

animal, camundongo.

1. INTRODUÇÃO

Historicamente, uma grande parte das pesquisas cardiovasculares foi realizada em animais de

laboratório. Um enorme número de modelos animais foi desenvolvido para imitar as enfermidades humanas e, assim, investigar os processos fisiológicos e patológicos envolvidos.

É importante destacar que os camundongos são os vertebrados mais utilizados nas pesquisas científicas. Este fato deve-se às semelhanças entre as espécies, uma vez que 99% dos genes humanos foram mapeados em camundongos, o que permite o estabelecimento de mecanismos envolvidos nas desordens genéticas das espécies. O camundongo é a espécie geneticamente modificada mais utilizada nas pesquisas, com cerca de 97% do total. Milhões de animais são ainda usados para buscar a cura de doenças e o desenvolvimento de novos produtos, vacinas, medicamentos ou cosméticos (Chorilli et all, 2007).

Devido a essas características, o estudo cardiofisiológico em camundongos permite o acompanhamento de todas as etapas do processo que envolve o registro eletrocardiográfico, desde a preparação cirúrgica do animal, até a análise dos dados obtidos com esse registro. Após este último, deve-se corrigi-lo para se fazer uma análise de tempo e freqüência do mesmo, que retornará dados estatísticos de extrema importância para comparação fisiológica.

O estudo discutido por este artigo visa, através dos dados gerados, chegar a uma conclusão de como as drogas utilizadas durante o registro interferem no controle dos batimentos cardíacos, implicando talvez a participação do Sistema Nervoso Autônomo. Pode-se cogitar a extrapolação dos dados obtidos com as cobaias, em termos do funcionamento neurocardiovascular, para o contexto humano. _____________________________________________________________________________ 1 – Acadêmicas do Curso de Graduação em Engenharia Biomédica 2 – Orientadores: João Batista Destro Filho e Maria Elizabeth Roza Pereira

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2. DESENVOLVIMENTO DO TRABALHO

2.1. Materiais e Métodos

2.1.1 Fabricação dos eletrodos

Processo de montagem: Primeiro, corta-se os dentes de eletrodo três a três. Com três tiras de fio, isolado por poliestireno, de tamanhos diferentes, e desencapados nas pontas, faz-se a adesão das mesmas em cada terminal do eletrodo utilizando o ferro de solda e a pasta de solda (facilita a junção dos dois metais).

Os fios são conectados aos terminais, do maior para o menor, conforme na Figura 1. Testa-se se o eletrodo está funcionando conectando os terminais do multímetro a cada terminal do

eletrodo. Para isolar o encaixe dos terminais com os fios, colocam-se três gomas de borracha vedadas por

calor do ferro de solda. Normalmente, é feito dez eletrodos por vez.

Figura 1: Montagem de um eletrodo

Dificuldades: Todas as vezes que se conectam os fios ao eletrodo, é necessário verificar se ficaram bem encaixados. Isso se faz puxando cada fio separadamente; se uma tira se soltar – o que ocorre em 90% das vezes – é necessário conectá-la novamente.

Finalidade: O eletrodo, que é implantado cirurgicamente no camundongo, promove a coleta do sinal eletrocardiográfico do camundongo.

2.1.2. Fabricação de cânulas (extensão e/ou conectora e difusão)

Processo de montagem: As cânulas são montadas a partir de pequenos tubos que vêm em rolos. Para a cânula de extensão, corta-se três tubos. Um com capacidade volumétrica de 37µl e 30 cm

de comprimento, no qual será inserido um fio de comprimento maior, para evitar colabação. Outro tubo, de pequeno comprimento e de diâmetro maior que o anterior, será encaixado em uma das pontas da cânula (onde será injetada a droga). Por último, outro tubo de diâmetro menor do que os outros dois anteriores é conectado a outra ponta, onde será conectado com a cânula de difusão conforme a Figura 2.

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Figura 2: Montagem da cânula de extensão

Para a cânula de difusão, corta-se em torno de 8 cm do tubo e se curva uma das pontas com o

calor do ferro de solda como na Figura 3.

Figura 3: Montagem da cânula de difusão

A seguir tem-se a montagem da cânula de difusão com a conectora juntamente com a seringa,

mostrados na Figura 4.

Figura 4: Cânulas de difusão acoplada a seringa.

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Dificuldades: Em ambos os tipos de cânulas, faz-se necessário tomar cuidado na hora de se utilizar o ferro de solda para que não ocorra colabação das paredes do tubo, entupindo o fio e inviabilizando seu uso.

Finalidade: Cânulas de extensão (ou cânulas conectoras) são utilizadas nas cânulas de difusão inseridas por meio cirúrgico no camundongo para injetar medicamentos.

2.1.3. Preparação de drogas a serem utilizadas durante o processo cirúrgico e durante o registro

Prepara-se solução de quetamina que é usada como anestésico e é administrada no camundongo

durante o ECG. Também há a preparação de atropina que é administrada no animal (1 mg/ml) durante o registro. Essas drogas são preparadas em concentrações maiores do que as utilizadas devido à facilidade de preparação.

A quetamina causa bradicardia (diminuição dos batimentos cardíacos), e a atropina é um bloqueador do parassimpático e causa taquicardia (aumento dos batimentos) (Irnaten et all, 2002; Han et all, 2002).

2.1.4. Realização da cirurgia

Procedimento: Escolhem-se os possíveis camundongos para cirurgia. O critério de escolha é pelos camundongos mais calmos para que a aplicação da anestesia seja mais fácil e o efeito seja mais imediato.

Em seguida, prepara-se a mesa para a cirurgia bem como o camundongo. O camundongo, após a aplicação da anestesia, é imobilizado numa pequena mesa e tem os pêlos

da região que irá ser operada retirados, como na Figura 5.

Figura 5: Preparação do camundongo para a cirurgia de implantação do eletrodo e da cânula de

difusão.

O corte é feito no peito na região da jugular (lado direito) para se localizar e isolar a mesma e, após uma pequena incisão feita com o auxílio do microscópio, é inserida a cânula de difusão na veia. A cânula é transpassada pelo peito do animal com o auxílio de um trocater até chegar às costas para que ele não a roa.

Em seguida o eletrodo é colocado no dorso do camundongo e cada terminal do eletrodo é inserido sob sua pele. Sutura-se a cirurgia conforme a Figura 6.

Finalmente o camundongo é colocado em um pequeno viveiro sob uma lâmpada incandescente para aquecimento, ficando por observação por dois dias.

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Figura 6: Cânula e eletrodo transplantado no animal.

Dificuldades: Cada aluno tem seu próprio lote de camundongos para realização de procedimentos cirúrgicos. Dentro das gaiolas, os camundongos podem ferir um ao outro, inviabilizando seu uso.

É necessário que os camundongos estejam calmos para que a anestesia tenha um bom efeito. O prazo da idade dos camundongos para procedimento cirúrgico é de dois a quatro meses (nem

muito novos nem tão velhos), e que sejam machos (sem interferência de ciclo hormonal; fêmeas são usadas apenas para treinamento cirúrgico e reprodução), e por isso, nem sempre se tem animais disponíveis.

Finalidade: Depois do período de observação, é realizado o ECG.

2.1.5. Registro

Procedimento: São realizados dois registros. Primeiramente coloca-se a cânula de extensão (ou conectora) na cânula de difusão posta no camundongo cirurgicamente. Depois se coloca o camundongo na Gaiola de Faraday e conecta-se o cabo do aparelho que irá medir o ECG no eletrodo inserido nele por meio cirúrgico, mostrados na Figura 7.

Ativa-se o programa CyberControl para que ele escaneie os canais. Prepara-se o canal em que será medido o ECG no software WinDak e inicia-se o programa, ajustando-o até começar a fazer a leitura.

Então se prepara a droga que será administrada (40 µl de quetamina) em 260µl de soro fisiológico. Inicia-se a contagem de tempo para a medição do sinal ECG e após 10 minutos injeta-se 30µl da solução preparada pela cânula conectora. Em seguida injeta-se 40µl de solução salina como lavagem. O tempo de duração total do ECG é 40 minutos.

No segundo registro, é injetado primeiramente atropina e depois quetamina e o procedimento é basicamente o mesmo, mudando apenas o tempo de administração de cada droga.

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Figura 7: Gaiola de Faraday, Amplificador e Conversor de sinal analógico/digital utilizados na

captação do ECG do animal.

Dificuldades: Durante o registro, caso haja algum problema no fio que é conectado ao eletrodo, a qualidade do mesmo pode ser afetada.

Também é preciso que o animal esteja calmo e quieto para que não haja interferências no registro nem ruídos, dificultando assim a visualização da onda cardíaca.

O animal pode retirar o eletrodo. Por isso o ambiente a qual se faz o registro tem que ser silencioso e é preferível fazê-lo durante o período matutino, visto que o camundongo é um animal noturno e durante a manhã ele já está cansado e mais propenso a dormir.

Finalidade: Dois registros são feitos para se ter controle de condições basal e pós- administração endovenosa de drogas que alteram o controle neural autonômico cardíaco. Mas apenas o segundo registro é utilizado na Análise Espectral.

2.1.6. Correção de registro

Depois de feito, dentro do próprio programa, faz-se uma cópia de todo o registro. O registro original está no canal 1, enquanto que a cópia pode estar no canal 2, 3,4... A partir da cópia do arquivo, é feita a marcação de ondas R (picos) ou de ondas S(vales).

O software não é totalmente eficaz, sendo necessário que se faça correções manuais nos picos e/ou vales marcados pelo próprio software, inserindo ou apagando as marcações.

Caso o registro estiver com muito ruídos, às vezes se torna impossível identificar a onda R.

2.1.7. Análise Espectral

Procedimento: Depois de se corrigir o registro utilizando-se o software WinDak, exporta-se a duração de cada intervalo para o Excel e gera uma planilha. Nessa planilha, serão criadas várias colunas, mas a única de interesse é a do tempo (em segundos).

O software utilizado para a análise espectral é o LA24, portanto é necessário converter o arquivo que contém a planilha do formato do Excel para o formato deste programa. Para isso, salva-se a planilha no Excel no formato “*.txt” e posteriormente utiliza-se o software UTIL para converter do formato ASCII (1 coluna, *.txt) para o formato LA, e enfim converter de LA para LA24. Essa conversão apresentará a planilha de dados do eletrocardiograma na extensão “t24.PRE” a partir do qual faz-se a análise de tempo e freqüência.

Em seguida abre-se o software LA24.EXE, que é acessado em ambiente DOS e possui diferentes métodos de análise espectral:

• Análise Espectral a partir de Séries de Fourier • Análise Espectral Autoregressiva • Análise Espectral Autoregressiva de Bivariavéis • Análise Tempo-Freqüência

A Análise por Séries de Fourier consiste em decompor o sinal em senóides e co-senóides de modo a mostrar a freqüência de maior variância presente no sinal. Um espectro consiste em mudar o eixo de análise do sinal, feito anteriormente no eixo do tempo, para o eixo da freqüência de modo

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que tenhamos no eixo “Y” a Densidade Espectral de Freqüência (Power Spectrum Dense – PSD) e no eixo “X” a Freqüência.

A maior dificuldade encontrada nessa forma de análise espectral é a presença de ruídos que aparecem em qualquer faixa de freqüência prejudicando a precisão do resultado final. O resultado é apresentado na tela em forma de gráfico com os valores de: Variância, Média IRR, VLF, LF e HF.

Na Análise Autoregressiva ou também denominada Paramétrica, faz-se um modelo ideal do sinal, eliminando-se o ruído e mantendo uma boa estacionalidade através de remoções de tendência, como por exemplo, por Regressão Linear. Por meio dessa análise é possível a determinação de uma freqüência central de oscilação, porém, devido à exclusão do erro (ruído) é de baixa precisão. Para melhorar o método utiliza-se a modelagem do sinal seccionado de forma que metade da primeira secção é analisada duas vezes, ou seja, se o sinal for divido em seguimentos de 300 pontos a modelagem do sinal será realizada em intervalos de 150 pontos para que se obtenha uma modelagem o mais próximo possível do sinal. A partir de duas modelagens, o software opta pela que mais se aproxima do sinal original para ser incluída nos resultados finais.

A Análise Autoregressiva de Bivariáveis utiliza um método parecido com a Análise Autoregressiva, porém nesse método entra-se com dois dados distintos (duas variáveis) e obtém-se a correlação entre eles. O método não é utilizado para o trabalho em questão.

O método que foi utilizado para analisar os espectros do eletrocardiograma de camundongos é o da Análise Tempo-Freqüência, também denominado Análise 24-horas, que consiste em analisar o sinal ao longo do tempo de registro do mesmo. Analisam-se espectros gerados a partir de tempos específicos nos quais o animal que foi registrado teve alguma droga injetada na corrente sanguínea, ou seja, o software gera três espectros diferentes:

• 1° na atividade basal; • 2° na injeção de atropina; • 3° na injeção de quetamina.

Essa análise também utiliza a geração de modelos que representam o sinal coletado, e o software possibilita a escolha de qual método realizará a modelagem. Escolhemos o método de Akaike que irá gerar equações necessárias para o processo. Devem-se especificar no software os intervalos das bandas de VLF, LF e HF que variam de acordo com a espécie do animal em que se está fazendo a aquisição dos sinais. Para os camundongos temos:

• VLH < 0,1 Hz; • LF – de 0,1 a 1 Hz; • HF – de 1 a 5 Hz. Nos resultados finais temos gráficos de espectros de IRR, Variância, VLF, LF, LF(nu), HF e

HF(nu), além de um espectro total do eletrocardiograma completo. Dificuldades: A grande quantidade de passos para se converter o arquivo bem como a

manipulação de dados até se chegar ao resultado final pode gerar uma grande quantidade de erros. Finalidade: O objetivo da Análise Espectral é detectar a variabilidade do sinal bem como ter o

retorno das médias dos valores de IRR, Variância, VLF, LF, Lf(nu), HF, HF(nu), LF/HF de todo o registro.

Esses dados são gerados em um arquivo “*.rep” que é aberto no Excel e que tem seus dados copiados para uma planilha com o nome de espectrotaco (molde que devolve os valores médios de cada dado fornecido pela análise). A partir destes dados para cada IRR calcula-se a variância, médias VLF, LF, LF(nu), HF, HF(nu), LF/HF de todo o registro. Esses dados serão novamente exportados para uma tabela em um software chamado Origin onde serão analisados todos os valores de todos os animais (média e variância do banco de dados) (Tikkanen, 1999).

2.2 Resultados e Conclusões A partir dos valores obtidos com a Análise Espectral de Tempo e Freqüência e posterior

manipulação de dados no Excel, é possível trabalhar com esses resultados de forma a se visualizar uma tendência do valor de cada variável.

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O principal efeito observado nos cinco primeiros minutos após a administração de quetamina (10 mg/kg) foi uma redução da variância de 40,3 para 24,9 ms² (n=10; p=0,02) mostrada na Figura 8, do componente LF de 7,8 para 2,1 (p=0,002), ilustrada na Figura 9, e da razão LF/HF de 0,8 para 0,25 expressa na Figura 10.

Figura 8: Gráfico que ilustra a redução da Variância após a administração da quetamina.

Figura 9: Gráfico que ilustra a redução da componente LF após a administração da quetamina.

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Figura 10: Gráfico que ilustra a redução da razão LF/HF após a administração da quetamina.

O pré-tratamento com atropina (1 mg/ kg, n=6) reduziu acentuadamente a variância, o

componente LF, o componente HF, na Figura 11, e também a razão LF/HF. A atropina bloqueou o efeito da quetamina reduzindo a variância (controle 2,5 ms² e quetamina 2,4 ms²) e o componente LF (0,2 e 0,004 ms²).

Figura 11: Gráfico que ilustra a redução da componente HF após os cinco primeiros minutos de

administração da quetamina.

A intenção desse estudo é fazer um banco de dados de vários animais, e a partir da análise feita para o registro de cada um, calcular a média e o desvio padrão das variáveis.

Em cima desses resultados, será feito um estudo comparativo do comportamento cardiofisiológico entre humanos e camundongos.

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3. AGRADECIMENTOS Os autores agradecem ao programa Programa Institucional de Bolsas do Ensino de Graduação –

PIBEG/UFU, pelo financiamento do trabalho e aos integrantes do Departamento de Ciências Biológicas da Universidade Federal do Triângulo Mineiro, UFTM, Uberaba – MG, pela possibilidade de concretização do trabalho.

4. REFERÊNCIAS Chorilli M., Michelin D.C., Salgado H.R.N., 2007, “Animais de laboratório: o camundongo”. Revista de Ciências Farmacêuticas Básica e Aplicada - Journal of Basic and Applied

Pharmaceutical Sciences, v. 28, n.1, p.11-23. Han J., Kim N., Joo H. & Kim E., 2002, “Ketamine abolishes ischemic preconditioning through inhibition of Katp channels in rabbit hearts”. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 283: Hl3-H21. Irnaten M., Wang J., Chang K.S.K., Andressen M.C. & Mendelowitz D., 2002, “Ketamine inhibits sodium currents in identified cardiac parasympathetic neurons in nucleus ambiguous”. Anesthesiology 96:659-666. Tikkanen P., 1999, “Characterization and application of analysis methods for ECG and time interval variability data”. Oulu University Library. EXPERIMENTAL PROTOCOL FOR CARDIOPHYSIOLOGYCAL STUDIES

IN MICE Sarah Soares de Castro Faculdade de Engenharia Elétrica – Universidade Federal de Uberlândia. FEELT/UFU – Av. João Naves de Ávila, 2121 – Santa Mônica – Uberlândia (MG) – Brasil – CEP 38400-902 sarah_ufu@hotmail.com Márcia Artiaga Colantoni marcinhamelv@yahoo.com.br

Abstract: This article aims at discussing cardiophysiological experiments in mice, so that to relate results with human physiology by means of comparative anatomy. The study consists in monitoring the animal cardiological state by means of electrocardiography (ECG) performed during drugs admission. Final results are obtained through spectral analysis that enables the analysis of cardiac activity changements after drugs injected. These results characterize the neurocardiovascular responses of the mice following drug application.

Keywords: compared physiology, electrocardiography, spectral analysis, animal cardiophysiology,

mouse.