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Dinâmica Molecular da Cu,Zn-SOD Quando Complexada a Espécies Ricas em Oxigênio

Tânia M. Manieri, Marina de Tella-Joly, Giselle Cerchiaro e Maurício D. Coutinho-Neto

Centro de Ciências Naturais e Humanas – Laboratório de Transformações II e LSSMA, Universidade Federal do ABC

Av. dos Estados, 5001, Santo André, SP

Parâmetros para o Hamiltoniano empírico AMBER [1] relevantes na descrição da enzima Cu,Zn-SOD associada a espécies ricas em oxigênio, em particular o OOH-, OOH•, O2•, H2O, CO4•-, HCO4• e HCO4- foram determinados utilizando cálculos de primeiros princípios. Dentre esses parâmetros destacam-se constantes de força e ângulo além de cargas atômicas. Cálculos de dinâmica molecular para o ligante OOH demonstraram uma alta acuidade para a parametrização obtida. Foi possível observar que meio enzimático modelado como um solvente influencia fortemente o potencial eletrostático do sistema.

Palavras-chave. Cu,Zn-SOD, AMBER, metaloenzima, dinâmica molecular.

I. INTRODUÇÃO

A formação endógena de radicais livres passou a ser considerada importante somente a partir da caracterização da metaloenzima citosólica superóxido dismutase (Cu,Zn-SOD

ou SOD1) por McCord & Fridovich ao final dos anos 601. Um dos casos mais estudados e intrigantes é relativo a mutantes da Cu,Zn-SOD, ilustrada na Figura 1.

Nosso estudo in silico do oxidante envolvido na atividade peroxidásica da SOD1 tem como objetivo entender a flexibilidade e variabilidade da estrutura proteica quando associada a ligantes não padrões através de cálculos de dinâmica molecular da estrutura enzimática. Dentre as várias possibilidades de ligantes reativos à enzima complexados ao Cu(I) a serem exploradas temos: OOH-, OOH•, O2

•-, H2O, CO4•-, HCO4

•e HCO4-. Toma-se,

neste estudo, o superóxido protonado com o ligante padrão da Cu,Zn-SOD. Nos cálculos de dinâmica molecular foram utilizados fundamentos da mecânica clássica/Newtoniana como também

o Hamiltoniano empírico AMBER,2 definido na equação 1. A

formulação padrão do AMBER não contém todos os parâmetros necessários para a condução deste estudo, como para o Cu(I) associado aos ligantes e às histidinas. Estes parâmetros foram calculados utilizando o funcional B3LYP da Teoria do Funcional da Densidade como implementado no

programa GAUSSIAN033. O efeito do meio enzimático nas cargas efetivas RESP, nas energias de ligação com os ligantes de interesse foi

investigado utilizando-se o método PCM4 (do inglês Polarizable Continuum Model), que considera o meio solvente/enzimático como um dielétrico polarizável.

Figura 1: Estrutura de um dos homodímeros da Cu,Zn-SOD referência PDB 2C9V, representada em cartoon com o sítio ativo contendo Cu(II) e Zn(II) em evidência.

II. METOLOGIA Primeiramente foi necessário construir, com o auxílio do programa GAUSSVIEW5, a partir da estrutura cristalográfica da enzima Cu,Zn-SOD e Zn,Zn-SOD (código de acesso PDB 2C9V e 2C9S), um cluster (ou agregado molecular) envolvendo grupos situados a cerca de cinco Ångstrons de distância do átomo metálico (Figura 2). Este procedimento tem como objetivo produzir uma representação tão simplificada do sítio ativo enzimático a ser utilizada nos cálculos de energia livre e para a obtenção dos parâmetros necessários à dinâmica molecular. Com o cluster definido, foram calculados, a partir das estruturas otimizadas, os parâmetros de ligação e ângulo (constantes de força e posições de equilíbrio).

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Figura 2: Representação em “Ball and Stick”. A: H2O associado a uma representação simplificada do sítio ativo da Zn,Zn-SOD. B: íon OOH- associado a uma representação simplificada do sítio ativo. Átomos de hidrogênio estão suprimidos desta representação.

Os ligantes escolhidos para esta etapa foram o OOH- para a estrutura com Cu, e H2O para a estrutura com Zn. Tal escolha é satisfatória para os ligantes OOH-, O2

•-, H2O, CO4•-, HCO4

- e HCO3

- onde a geometria do composto é típica de complexos de Cu(I). Em alguns casos, foi necessário mudar a configuração de equilíbrio do cluster, definindo através de

restrições3 no ângulo diedro dos anéis imidazol uma geometria

de mínimo local. Para a obtenção das cargas RESP foram feitos cálculos de energia no programa GAUSSIAN utilizando as palavras chave: gen iop(6/33=2) pop=(chelpg,dipole,readradii), e funções de base assinaladas na Tabela 1. Cargas RESP, utilizando o método PCM (Polarizable Continuum Model), foram calculados com os solventes acetona (dielétrico em torno de 20) e dicloroetano (dielétrico em torno de 10). Estas cargas são necessárias para a definição do Hamiltoniano empírico. o cálculo da dinâmica molecular, realizada no AMBER94,5. O padrão de campo de força

utilizado nas simulações foi o ff995.

totalE = K rbonds

∑ (r − req)2+ Kθ (

angles

∑ θ −θeq)2 + Vn

2dihedrals

∑ [1+ cos(nφ − γ)] +Aij

Rij12

−Bij

Rij6

+qiq j

εRij

i< j

∑

Eq 1: Hamiltoniano empírico AMBER. Kr, Kθ, Vn, são as constants de força de ligação, ângulo e ângulo diédro a serem determinadas. As cargas RESP (qi e qj) fazem parte do quinto termo da equação e correspondem a contribuição eletrostática à energia total

Tabela 1: Funções de base utilizadas no cálculo das cargas RESP. As

bases seguem o modelo proposto pelo AMBER.

Ligante Átomo Base

Água H C N O 6-31G**

Cu 6-311+G(3df,3pd)

OOH- H C N O 6-31G**

Cu 6-311+G(3df,3pd)

III. RESULTADOS

A comparação dos resultados obtidos para o Cu(I) (Tabela 2) com alguns encontrados na literatura para o Cu(II) e a análise dos gráficos utilizados na determinação desses parâmetros, mostraram que, em algumas estruturas, existiam interações secundárias como pontes de hidrogênio ou interações de van der Waals. Interações secundárias levam a erros na determinação dos parâmetros empíricos AMBER. A determinação dos parâmetros a partir de uma nova estrutura de mínimo local, obtida impondo-se restrições geométricas,

corrigiu o problema deixando os parâmetros comparáveis aos existentes na literatura. Tabela 2: Parâmetros de ligação e ângulo calculados com o método DTF

Ângulo Tipo do átomo

kθ θeq (deg) (kcal mol-1 rad-2)

His N-Cu(I)-His N NB-Cu-NB 14,77 125

Cu(I)-O-OH Cu-OM-OH 28,09 104,3

HOO- Cu-His N O-Cu-NB 10,53 100,2

HOO- Cu-His N O-Cu-NB 12,37 100,8

His N-Zn(II)-His N NB-Zn-NB 14,59 117

H2O-Zn(II)-His N OW-Zn-NB 17,29 105

Zn(II)-HisN-C Zn-NB-C 311,6 123

Cu(I)-HisN-C Cu-NB-C 24,02 124

HO-O-CO2 173,4 109,7

Ligação Tipo de kr r eq

(Å) interação (kcal mol-1 Å-2) Cu(I)-His N Cu-NB 69,91 2,05

HOO-Cu(I) O-Cu 56,96 2,2

Zn(II)-His N Zn-NB 126,2 2,02

H2O-Zn(II) OW-Zn 50,96 2,27

O-OH- O-OH 253,6 1,56

OO-H- O-H 513,6 1

Cu(I)O-OH OM-OH 259,4 1,56

HOO(CO)-O 713,9 1,29

HOO-CO2 200,9 1,52

As cargas RESP foram calculadas com os ligantes OOH- e H2O em vácuo, acetona e dicloroetano, mostram que o meio enzimático modelado como um solvente influencia no potencial eletrostático do sistema. Quando o ligante é carregado, devido a uma maior polarização e transferência de carga entre o metal e o ligante, este efeito é mais pronunciado. Resultados utilizando acetona e dicloroetano foram próximos, indicando certa insensibilidade do procedimento em relação ao solvente utilizado para a descrição do meio enzimático. A partir da análise da dinâmica molecular foi possível verificar a rigidez da estrutura, medida pelo desvio médio quadrático (RMSD), como mostrado a figura 2. Pode-se observar que o RMSD se estabiliza em torno de 1,011, que é um baixo desvio, evidenciando a acuidade da parametrização. As figuras 3 e 4 ilustram a variação de ângulos entre os ligantes do cobre, que também comprovam a rigidez estrutural da molécula e a acuidade da parametrização. Um aspecto interessante que pode ser observado na dinâmica molecular é a estabilização do ligante OOH- feita por uma interação com a Histidina-Ponte, resíduo 63. A figura 5 mostra que o comprimento de ligação entre o oxigênio do ligante e o

B A

3

nitrogênio anel imidazol é tipicamente o mesmo de uma ligação de hidrogênio, aproximadamente 2,8 Å, evidenciando uma possível importância catalítica do resíduo 63 via interação direta com o substrato da enzima.

0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 8500,75

0,80

0,85

0,90

0,95

1,00

1,05

1,10

1,15

1,20

1,25

RM

SD

Frame

RMSDDesvio Médio Quadratico

Figura 2: Desvio médio quadrático da estrutura cristalográfica da

enzima Cu,Zn-SOD ao longo da dinâmica molecular.

0 10 20 30 40 500

25

50

75

100

125

Num

ero

de O

bser

vaço

es

Diedro (graus)

Numero de ObservaçoesDiedro His46-Cu-His120

Figura 3: Variação do ângulo diedro entre o resíduo 46, Cu(II) e

resíduo 120 da estrutura cristalográfica da enzima Cu,Zn-SOD ao longo da dinâmica molecular.

115 120 125 130 135 140 1450

20

40

60

80

100

120

140

Num

ero

de O

bser

vaço

es

Angulo (graus)

Numero de Observaçoes

His48-Cu-His120

Figura 4: Variação do ângulo entre o resíduo 46, Cu(II) e resíduo 120

da estrutura cristalográfica da enzima Cu,Zn-SOD ao longo da dinâmica molecular.

2,6 2,7 2,8 2,9 3,0 3,1 3,20

50

100

150

200

250

Num

ero

de O

bser

vaço

es

Distancia de Ligaçao (Å)

Numero de ObservaçoesDistancia de Ligaçao

Figura 5: Variação do comprimento de ligação entre o nitrogênio do resíduo 63 da estrutura cristalográfica da enzima Cu,Zn-SOD e o

oxigênio do ligante longo da dinâmica molecular.

IV. CONCLUSÕES

Parâmetros e cargas RESP relevantes para a definição do Hamiltoniano empírico AMBER de foram calculados para a Zn,Cu(I)-SOD associada espécies ricas em oxigênio. A determinação destes parâmetros possibilitou o cálculo da dinâmica da enzima associada ao ligante OOH-. A dinâmica molecular mostrou dados importantes acerca da rigidez e estabiliadade da estrutura, bem como validou os parâmetros e cargas RESP calculados, mostrando a importância de um trabalho minucioso nestes cálculos. Para a conclusão deste estudo serão realizadas cálculos de dinâmica molecular com os ligantes: OOH-, OOH•, O2

•-, H2O, CO4•-,

HCO4•e HCO4

-, entre outra possíveis opções.

V. REFERÊNCIAS 1 J.M. McCord, I. Fridovich, J. Biol. Chem. 1969, 244: 6049.

2 W. D. Cornell, P. Cieplak, C .I. Bayly, I. R. Gould, K. M. Merz, Jr., D. M. Fergus on, D. C. Spellmeyer, T. Fox, J. W. Caldwell, P. A. Kollman, J. Am. Chem. Soc. 1995, 117: 5179-97.

3 Gaussian 03, Revision E.01, M. J. Frisch et. al., Gaussian, Inc., Wallingford CT, 2004.

4 Cancès, B. Mennucci, J. Math. Chem. 1998, 23, 309

5 J.W. Ponder and D.A. Case. Adv. Prot. Chem. 2003, 66: 27-85