digestão in vitro e fermentação colônica de compostos ... · ao meu avô, dono do sorriso mais...
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Universidade Federal do Rio de Janeiro
Centro de Ciências da Saúde
Instituto de Nutrição Josué de Castro
Digestão in vitro e fermentação colônica de
compostos fenólicos presentes no pão de goiaba
Isabel Pinto Vieira
Rio de Janeiro
Abril, 2016
DIGESTÃO IN VITRO E FERMENTAÇÃO COLÔNICA DE
COMPOSTOS FENÓLICOS PRESENTES NO PÃO DE GOIABA
Isabel Pinto Vieira
Dissertação de Mestrado apresentada ao
Programa de Pós-graduação em Nutrição do
Instituto de Nutrição Josué de Castro, da
Universidade Federal do Rio de Janeiro, como
parte dos requisitos necessários à obtenção do
título de Mestre em Nutrição.
Orientadora: Profa. Dr
a. Mariana Costa Monteiro
Rio de Janeiro
Abril de 2016
DIGESTÃO IN VITRO E FERMENTAÇÃO COLÔNICA DE
COMPOSTOS FENÓLICOS PRESENTES NO PÃO DE GOIABA
Isabel Pinto Vieira
Orientadora: Profa. Dr
a. Mariana Costa Monteiro
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-graduação em Nutrição do Instituto
de Nutrição Josué de Castro, da Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte dos
requisitos necessários à obtenção do título de Mestre em Nutrição.
Aprovada por:
___________________________________________________
Profª Drª Mariana Costa Monteiro, DSc
Instituto de Nutrição Josué de Castro
Universidade Federal do Rio de Janeiro
___________________________________________________
Prof Dra. Eliane Fialho de Oliveira, DSc
Instituto de Nutrição Josué de Castro
Universidade Federal do Rio de Janeiro
___________________________________________________
Prof Dr. Leandro Araújo Lobo, DSc
Instituto de Microbiologia Paulo de Góes
Universidade Federal do Rio de Janeiro
___________________________________________________
Prof Dra. Maria Lucia Mendes Lopes, DSc
Instituto de Nutrição Josué de Castro
Universidade Federal do Rio de Janeiro
Rio de Janeiro
Abril de 2016
“Mas agora, assim diz o SENHOR que te criou, ó Jacó, e que te formou, ó Israel: Não temas,
porque eu te remi; chamei-te pelo teu nome, tu és meu. Quando passares pelas águas estarei
contigo, e quando pelos rios, eles não te submergirão; quando passares pelo fogo, não te
queimarás, nem a chama arderá em ti. Porque eu sou o Senhor teu Deus, o Santo de Israel, o
teu Salvador; dei o Egito por teu resgate, a Etiópia e a Seba em teu lugar. Visto que foste
precioso aos meus olhos, também foste honrado, e eu te amei, assim dei os homens por ti, e os
povos pela tua vida. Não temas, pois, porque estou contigo; trarei a tua descendência desde o
oriente, e te ajuntarei desde o ocidente. (Isaías 43:1-18)
A Deus.
AGRADECIMENTOS
A Deus que simplesmente é.
Minha enorme gratidão à minha família que nesses últimos dois anos não foi apenas braço
direito, mas corpo inteiro. Minha base, meu suporte, meu socorro e meu auxílio. Aguentaram
(não sem muitos gritos) todo o meu desespero, minhas crises e tantas outras coisas que se não
fossem por eles, não teria chegado aqui hoje. Obrigada ainda é pouco.
Minha mãe, que em paralelo concluiu um doutorado e me deixou tão orgulhosa e ao mesmo
tempo, tão envergonhada. Meu primeiro exemplo na vida acadêmica, quem dera um dia ser
uma aluna tão boa quanto você. Enquanto isso entrego todos os meus esforços nesse trabalho
e dedico à ti que me deu forças e o exemplo de sempre se superar frente aos nossos desafios.
Mas, obrigada acima de tudo, por ter lutado por mim, diante do maior desafio da sua vida.
À minha avó, uma mulher para se admirar. Como não se inspirar em alguém que entrou na
vida acadêmica depois dos 50, desbancando mestrado e doutorado? Obrigada pelas palavras
sábias e todo o incentivo nos momentos mais difíceis. Crescer como “filha de vó” tem muitas
vantagens.
Ao meu avô, dono do sorriso mais doce e os abraços mais gostosos. Sem saber, o maior
estímulo nas manhãs para que os dias fossem mais tranquilos e o trabalho mais leve. Viver
nessa casa sem você não teria graça.
À Dalvinha, minha segunda mãe, que me ama e me mima como se eu tivesse saído do seu
próprio ventre. Muito obrigada pelo carinho, pelos muitos lanches e abraços nos momentos
em que eu mais precisei.
Aos meus amados tios, que mesmo de longe estiveram sempre na torcida. Aqueles que têm as
palavras certas para as horas ainda mais certas. Quem dera pudesse ser assim todos os dias.
Ao meu amor, Leo, que me acalma todos os dias e me ensina a viver de forma tão serena.
Obrigada pelo carinho e paciência, por me ouvir e tranquilizar apenas com um olhar.
Minhas amigas e irmãs de coração, Gabi e Clarinha, que às vezes de longe e outras de perto,
foram alento e paz pro meu coração. Dividimos uma vida juntas, e hoje divido também a
minha conquista com vocês.
Às minhas irmãs inacianas, Belinha e Deia, de quem tanto me ausentei nesses dois anos, mas
não deixei de contar um só minuto. Obrigada por todos os nossos momentos de descontração,
pela amizade firme e conselhos valiosos. Essa vitória é nossa.
Às minhas irmãs de fé, que Deus colocou na minha história para caminharmos e crescermos
juntas, Didi, Rapha e Thais. Àquelas que me deram mais que um ombro amigo e abriram mão
de si para tantas vezes me edificar e lutar pela minha felicidade. Onde está o meu tesouro,
definitivamente também está o meu coração.
Aos grandes presentes de Deus na minha vida, que nos últimos anos foram rocha forte e
sólida para que eu pudesse me sustentar. Filipe, Bruninho, Laurinha, Bela e Nina. Obrigada
por todas as orações, partilhas, encontros e missas. Tudo posso com aqueles que me
fortalecem.
Às minhas grandes amigas, que tantas vezes me ouviram reclamar e tantas outras foram
válvula de escape dos meus estresses... Lu Santos, Lu Mesquita, Luaninha, Tati Pecly, Bia e
Bellinha. Vocês são essenciais e também fazem parte dessa história.
Às minhas amigas e colegas de profissão, SGs amadas. Muito obrigada pelo apoio, torcida e
companheirismo ao longo dos últimos anos. Aqui com certeza tem um pouquinho de cada
uma de vocês. E meu obrigada ainda mais atencioso à Ju Nigri, com quem divido não apenas
a pós e a sala, mas principalmente os meus sentimentos. Obrigada ainda, por dividir comigo o
seu sucesso profissional, me encorajando e impulsionando a seguir em frente.
Aos meus tios Ada e Fernanda que se dispuseram rapidamente a me ajudar no translado dessa
dissertação. Muito, muito, muito obrigada!
Ao meu sócio Vicente, que foi gentil e paciente especialmente nesses últimos meses. Sorte a
minha poder dividir um sonho com uma pessoa tão boa.
À minha primeira orientadora Lucia Andrade, pessoa e profissional que admiro muito e de
quem muito aprendi durante a graduação. E também à Vera Valente, que foi não apenas a mãe
da minha amiga, mas minha professora querida e grande incentivadora.
À minha companheira e “tutora” de mestrado, Tamirys. Muito obrigada, de coração, por toda
ajuda e competência. À Mabel, que me ajudou a dar os primeiros passos para que tudo
acontecesse. E também à Helena, muito querida e sempre prestativa. Tenho certeza que aqui
tem um grande mérito de vocês também.
Aos meus companheiros de trabalho no laboratório no LBNA e seus docentes pela paciência e
presteza, me ajudando nas minhas análises e também distrações. Meu agradecimento e
admiração mais sinceros especialmente à Kim, André e Nívea que foram extremamente
atenciosos e carinhosos quando mais precisei.
Às meninas do LABAF, muito obrigada pela ajuda e incentivo. Agradeço especialmente
àquelas que tantas vezes me emprestaram os ouvidos e foram responsáveis por bons
momentos de descontração.
Aos professores e alunos do Laboratório de Biologia de Anaeróbios pela recepção e ambiente
de trabalho tão agradável. Com certeza um lugar para ser feliz.
Aos alunos do DAFFE, pelas muitas tardes partilhadas. Meu obrigada especial à Paola, que
foi não apenas uma grande estimuladora do meu trabalho, mas uma amiga que reconheci
nesse tempo.
À minha revisora, Maria Lucia Lopes, que mesmo doente e com o tempo corrido, nos deixou
grandes contribuições. E também a todos os membros da banca da defesa, que se dispuseram
a ler, corrigir e acrescentar ainda mais ao meu trabalho. Muito obrigada.
Aos meus doadores e potenciais o meu muito obrigada e reconhecimento desta difícil tarefa.
Nivea, André, Tamirys, Gabriel, Fê, Vicente, Flora, Hélio, Vanessa, Laís, Bela, Bia... Sem
vocês certamente esse trabalho não estaria pronto.
Por fim, à minha orientadora, a quem ainda me faltam palavras suficientes para agradecer. De
início, agradeço pela sua dedicação e sensibilidade, percebendo minhas limitações e
incentivando minhas competências. Obrigada ainda maior pela sua paciência sem limites e
por não ter desistido de mim. Obrigada pelo seu exemplo, tranquilidade e pela calma que
trouxe nos momentos de desespero. É um orgulho e um alívio muito grande saber que escolhi
não apenas uma professora, mas uma profissional que ama e se entrega ao que faz. Admiração
define.
“Não há no mundo exagero mais belo que a gratidão.” (Jean de la Bruyere)
RESUMO
VIEIRA, ISABEL PINTO. Digestão in vitro e fermentação colônica de compostos fenólicos
presentes no pão de goiaba. Rio de Janeiro, 2016. Dissertação (Mestrado em Nutrição) –
Instituto de Nutrição Josué de Castro, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro,
2016.
DIGESTÃO IN VITRO E FERMENTAÇÃO COLÔNICA DE COMPOSTOS FENÓLICOS
PRESENTES NO PÃO DE GOIABA
Os compostos fenólicos são metabólitos secundários de plantas caracterizados pela
presença de um anel aromático, com um ou mais substituintes hidroxílicos. Evidências
recentes demonstram que o seu consumo pode exercer efeitos na redução da incidência de
câncer e doenças crônicas. É fundamental investigar o metabolismo dos compostos fenólicos
visto que a interação com constituintes da matriz alimentar pode afetar a sua bioacessibilidade
e consequentemente sua biodisponibilidade. Estima-se que cerca de 90% do total de
compostos fenólicos ingeridos seguem para o cólon, onde são extensamente metabolizados
pela microbiota intestinal. Os metabólitos gerados são então absorvidos, contribuindo para o
aumento da biodisponibilidade. Paralelamente, os pães têm sido utilizados como ferramenta
para incorporação de constituintes bioativos, principalmente por ser alimento básico,
amplamente consumido e de baixo valor nutricional. A incorporação de farinha de frutas tem
estimulado a comercialização de frutas desidratadas como ingredientes funcionais. Em virtude
do perfil de compostos voláteis e fenólicos, a goiaba pode ser aplicada na elaboração de
produtos alimentares com potencial funcional. A farinha de goiaba foi incorporada
parcialmente em substituição à farinha de trigo, em pães tipo forma, resultando no aumento de
aproximadamente três vezes nos teores de compostos fenólicos quando comparado ao pão
sem adição de farinha de goiaba. Nesse contexto, o presente trabalho objetiva investigar a
bioacessibilidade dos compostos fenólicos de um pão controle (PC) e um pão com a
substituição parcial de 30% da farinha de trigo pela de goiaba (PG) por meio de modelos de
digestão simulada in vitro e fermentação colônica ex vivo. Os pães foram caracterizados
quanto à composição centesimal e teores de compostos fenólicos solúveis e insolúveis por
cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). A digestão simulada in vitro dos pães
mimetizou as fases oral, gástrica e intestinal em condições controladas de pH, temperatura e
agitação. O metabolismo colônico dos compostos fenólicos foi investigado por meio da
incubação com fezes de voluntários sadios por até 72 horas. Os metabólitos gerados após as
etapas de digestão e fermentação foram analisados por CLAE. Os teores de compostos
fenólicos do PG foram superiores aos do PC. Os resultados da digestão in vitro indicam que
os compostos fenólicos apresentam alta bioacessibilidade, sendo a do PC (574%) maior que a
do PG (393%). Dentre os compostos identificados, os ácidos gálico, 4-hidroxifenilacético e
benzoico apresentaram maior bioacessibilidade (acima de 150%), sugerindo que os mesmos
podem ser formados a partir de compostos mais complexos como as formas glicosiladas dos
flavonóis. Após a fermentação colônica, os compostos fenólicos do PC também apresentaram
maior bioacessibilidade (452%) quando comparado ao PG (257%). O contínuo aumento dos
metabólitos nesta etapa foi relacionado à metabolização dos compostos encontrados
inicialmente e da liberação da matriz alimentar, na qual muitos estavam sob a forma
insolúvel. Os resultados sugerem que ambos os pães têm compostos altamente bioacessíveis e
que as diferenças encontradas entre os pães podem estar relacionadas à forma insolúvel em
que os compostos foram encontrados no PG, além da interação entre os constituintes da
matriz alimentar.
Palavras-chave: bioacessibilidade, metabolismo, ácido gálico, ácido benzoico, ácido 4-
hidroxifenilacético.
ABSTRACT
IN VITRO DIGESTION AND COLONIC FERMENTATION OF PHENOLIC
COMPOUNDS PRESENT IN GUAVA BREAD
Phenolic compounds are secondary metabolites of plants characterized by the presence
of an aromatic ring with one or more hydroxyl substituents. Recent evidence shows that its
consumption may have effects in reducing the incidence of cancer and chronic diseases. Since
interaction with constituents of the food matrix can affect their bioaccessibility and therefore
its bioavailability, it is essential to investigate the metabolism of phenolic compounds. It is
estimated that about 90% of ingested phenolic compounds follows into the colon where they
are extensively metabolized by intestinal microflora. Metabolites generated are then absorbed,
contributing to increased bioavailability. In parallel, breads have been used as a tool for
incorporation of bioactive components, especially because it is a basic food, widely consumed
and has low nutritional value. The incorporation of fruit flour has increased
commercialization of dehydrated fruits as functional ingredients. On account of the profile of
volatile and phenolic compounds, guava has high application in the preparation of food with
functional potential. The guava flour was incorporated partially replacing the wheat flour, bun
shape, resulting in an increase of approximately three times the phenolics content when
compared to bread without addition of guava flour. In this context, the present study aims to
investigate the bioaccessibility of phenolic compounds of control bread (CB) and bread
prepared with replacement of 30% wheat flour by guava flour (GB) through in vitro simulated
digestion and colonic fermentation ex vivo models. The breads were characterized for
chemical composition and the content of soluble and insoluble phenolic compounds by high-
performance liquid chromatography (HPLC). The in vitro simulated digestion mimicked oral,
gastric and intestinal phases under conditions of controlled pH, temperature and agitation. The
colonic metabolism of phenolic compounds was investigated by incubation with feces of
healthy volunteers for 72 hours. The metabolites originated after digestion and fermentation
steps were analyzed by HPLC. The contents of phenolic compounds were higher in GB than
CB. The in vitro digestion results indicate that the phenolic compounds have high
bioaccessibility, and the CB (574%) greater than that of GB (393%). Among the identified
compounds, gallic acid, benzoic acid and 4-hydroxyphenylacetic were those with the highest
bioaccessibility (over 150%), suggesting that they may be formed from more complex
compounds such as glycosylated forms of flavonols. After colonic fermentation, phenolic
compounds of CB were also more bioaccessible (452%) when compared to GB (257%). The
ongoing increase of metabolites at this stage was related to the metabolism of compounds
found initially and the release of the food matrix, in which many of them were in the insoluble
form. The results suggest that the phenolic compounds of both breads were highly
bioaccessible and the differences between them can be related to the insoluble form in which
the compounds were found in GB, besides the interaction between the constituents of the food
matrix.
Keywords: bioaccessibility, metabolism, gallic acid, benzoic acid, 4-hydroxyphenylacetic
acid.
TRABALHOS DECORRENTES DA PRESENTE DISSERTAÇÃO
Resumo submetido em congresso
REVORÊDO, T.; VIEIRA, I.; PERRONE, D.; MONTEIRO, M. Bioaccessibility of phenolic
compounds in jabuticaba residue and guava bread. In: 7th
International Conference on
Polyphenols and Health, 2015, Paris.
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ..................................................................................................... 20
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ............................................................................. 23
2.1. Compostos fenólicos............. ........................................................................... 24
2.2. Bioacessibilidade e biodisponibilidade dos compostos fenólicos.................. 25
2.3. Modelo de digestão simulada in vitro.............................................................. 27
2.4. Fermentação colônica....................................................................................... 29
2.5. Goiaba ............................................................................................................. 31
2.6 Produtos de panificação enriquecida................................................................. 33
3. OBJETIVOS .......................................................................................................... 35
3.1. Objetivo geral ................................................................................................. 36
3.2. Objetivos específicos ...................................................................................... 36
4. MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................. 37
4.1. Obtenção da farinha de goiaba........................................................................ 38
4.2 Elaboração dos pães ........................................................................................ 39
4.3. Determinação da composição centesimal .................................................... 40
4.4. Determinação do teor de compostos fenólicos ............................................. 41
4.4.1. Extração das amostras............................................................................. 41
4.4.2. Condições cromatográficas..................................................................... 42
4.5. Digestão simulada in vitro e fermentação colônica ex vivo........................ 43
4.5.1. Simulação da fase oral............................................................................. 43
4.5.2. Simulação da fase gástrica....................................................................... 43
4.5.3. Simulação da fase intestinal..................................................................... 44
4.5.4. Fermentação colônica ex vivo.................................................................. 44
4.5.5. Análise de compostos fenólicos e seus metabólitos............................... 47
4.6. Análise estatística............................................................................................. 47
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO .......................................................................... 48
5.1. Composição centesimal ................................................................................... 49
5.2. Perfil de compostos fenólicos........................................................................... 50
5.3. Digestão simulada in vitro ............................................................................... 54
5.3.1 Etapa oral................................................................................................. 54
5.3.1 Etapa gástrica........................................................................................... 54
5.3.1 Etapa intestinal......................................................................................... 60
5.4. Fermentação colônica ex vivo 65
6. CONCLUSÕES....................................................................................................... 72
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..................................................................... 77
ANEXOS..................................................................................................................... 86
ANEXO A – INSTRUÇÃO PARA DOAÇÃO ESPONTÂNEA DE FEZES...... 87
ANEXO B – TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO....... 88
ANEXO C – FICHA TÉCNICA DE PREPARAÇÃO DO PÃO CONTROLE.... 90
ANEXO D – FICHA TÉCNICA DE PREPARAÇÃO DO PÃO DE GOIABA.... 91
ANEXO E – CROMATOGRAMAS DOS COMPOSTOS FENÓLICOS DA
FRAÇÃO SOLÚVEL.............................................................................................
92
ANEXO F – CROMATOGRAMAS DOS COMPOSTOS FENÓLICOS DA
FRAÇÃO INSOLÚVEL ALCALINA...................................................................
93
ANEXO G – CROMATOGRAMAS DOS COMPOSTOS FENÓLICOS DA
FRAÇÃO INSOLÚVEL ÁCIDA...........................................................................
94
ANEXO H – CROMATOGRAMAS DOS COMPOSTOS FENÓLICOS DA
ETAPA GÁSTRICA DA DIGESTÃO IN VITRO..................................................
95
ANEXO I – CROMATOGRAMAS DOS COMPOSTOS FENÓLICOS DA ETAPA
GÁSTRICA DA DIGESTÃO IN VITRO.................................................
96
ANEXO J – CROMATOGRAMAS DOS COMPOSTOS FENÓLICOS DA ETAPA
INTESTINAL DA DIGESTÃO IN VITRO..............................................
97
ANEXO K – CROMATOGRAMAS DOS COMPOSTOS FENÓLICOS DA
ETAPA INTESTINAL DA DIGESTÃO IN VITRO...............................................
98
ANEXO L – CROMATOGRAMAS DOS COMPOSTOS FENÓLICOS DA
FERMENTAÇÃO COLÔNICA EX VIVO.............................................................
99
ANEXO M – CROMATOGRAMAS DOS COMPOSTOS FENÓLICOS DA
FERMENTAÇÃO COLÔNICA EX VIVO.............................................................
100
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
ANOVA Análise de Variância
AOAC Association of Official Analytical Chemists
bs Base seca
CAPES Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
CADEG Central de abastecimento do estado da Guanabara
CLAE Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
CNPq Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico
DAD Detector de arranjo de diodo
DCNT
DP
Doenças crônicas não-transmissíveis
Desvio padrão
FAPERJ Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro
HPLC High Performance Liquid Chromatography
INJC Instituto de Nutrição Josué de Castro
IQ Instituto de Química
IMPPG Instituto de Microbiologia Professor Paulo Góes
LBNA Laboratório de Bioquímica Nutricional e de Alimentos
UFRJ
PC
PG
POF
RDC
UV
Universidade Federal do Rio de Janeiro
Pão controle
Pão de goiaba
Pesquisa de orçamento familiar
Resolução da Diretoria Colegiada
Raios ultravioleta
TCLE Termo de consentimento livre e esclarecido
LISTA DE TABELAS E FIGURAS
Revisão Bibliográfica
Figura 1. Estrutura química básica dos compostos fenólicos..................................... 24
Figura 2. Rota dos compostos fenólicos da dieta e seus metabólitos em seres
humanos .....................................................................................................
27
Material e métodos
Figura 1. Distribuição das goiabas fracionadas na bandeja....................................... 38
Figura 2. Farinha de goiaba................................................................................. 38
Tabela 1. Formulação para elaboração do pão controle e do pão de goiaba......... 39
Figura 3. Máquina automática de preparo dos pães.............................................. 40
Figura 4. Pão controle (PC) e pão de goiaba (PG)................................................ 40
Tabela 2. Programação do gradiente de concentração da fase móvel utilizada na
análise de compostos fenólicos nos pães................................................. 42
Tabela 3. Composição do fluido gástrico artificial.................................................. 43
Figura 5. Balões com nitrogênio realizando troca de atmosfera.......................... 44
Tabela 4. Composição do fluido intestinal artificial.................................................... 44
Tabela 5. Composição do meio rico em nutrientes utilizado para a diluição das fezes........ 45
Figura 6. Amostras sendo pipetadas na câmara de anaerobiose.......................... 46
Figura 7. Amostras posicionadas no agitador em temperatura ambiente............. 46
Resultados e discussão
Tabela 1. Teores de umidade, resíduo mineral fixo, proteínas, lipídeos e
carboidratos dos pães elaborados………………………………................
49
Tabela 2. Teores de compostos fenólicos solúveis e insolúveis (hidrólises alcalina
e ácida) nos pães..............................................................………………...
51
Figura 1. Distribuição do total de flavonoides e não flavonoides no pão controle e
no pão de goiaba.........................................................................................
52
Figura 2. Distribuição dos compostos fenólicos flavonoides e não flavonoides nas
frações solúvel e insolúvel..........................................................................
53
Figura 3. Teores totais de compostos fenólicos após a etapa gástrica da digestão
simulada in vitro do pão controle e pão de goiaba.....................................
55
Figura 4. Teores de compostos fenólicos após a etapa gástrica da digestão
simulada in vitro do pão controle e do pão de goiaba................................
57
Figura 5. Teores totais de compostos fenólicos após a etapa intestinal da digestão
simulada in vitro do pão controle e do pão de goiaba................................
60
Figura 6. Teores de compostos fenólicos após a etapa intestinal da digestão
simulada in vitro do pão controle e do pão de goiaba................................
61
Figura 7. Variação absoluta dos teores de compostos fenólicos entre as etapas
intestinal e gástrica da digestão simulada in vitro do pão controle e pão
de goiaba.....................................................................................................
63
Figura 8. Teores totais dos compostos fenólicos após 4 h, 24 h, 48 h e 72 h de
fermentação colônica do pão controle ............................….......................
66
Figura 9. Teores dos compostos fenólicos após 4 h, 24 h, 48 h e 72 h de
fermentação colônica do pão controle e do pão de goiaba.........................
68
Figura 10. Teores dos compostos fenólicos após 4 h, 24 h, 48 h e 72 h de
fermentação colônica do pão controle e do pão de goiaba...............……..
70
Figura 11. Representação esquemática de via metabólica da quercetina-3-O-
rutinosídeo e quercetina do pão de goiaba...........................................……..
74
Figura 12. Representação esquemática de via metabólica da miricetina-3-O-
ramnosídeo e miricetina do pão de goiaba..........................................……..
75
Figura 13. Representação esquemática de via metabólica do ácido gálico do pão
controle e do pão de goiaba...............….................................................…..
76
INTRODUÇÃO
20
Os compostos fenólicos são metabólitos secundários de plantas e exercem diferentes
funções nos vegetais, tais como proteção contra herbívoros e infecção microbiana, atrativos
para polinizadores e demais espécies dispersoras de sementes e proteção aos raios
ultravioletas (UV). Eles são caracterizados pela presença de um anel aromático, com um ou
mais substituintes hidroxílicos, incluindo seus grupos funcionais (MANACH et al., 2004).
Evidências recentes têm demonstrado que o consumo de compostos fenólicos pode exercer
efeitos favoráveis na redução da incidência de câncer e doenças crônicas, como as
cardiovasculares, diabetes do tipo 2, função cognitiva prejudicada, os quais têm ocorrido com
frequência elevada (DEL RIO et al., 2013).
No entanto, para que tais efeitos benéficos sejam extrapolados para o organismo
humano é fundamental investigar o metabolismo dos compostos fenólicos. Diversos fatores,
tal como a interação de constituintes da matriz alimentar, podem afetar a bioacessibilidade e
consequentemente a biodisponibilidade dos compostos fenólicos (MANACH et al., 2004). É
estimado que cerca de 90 a 95% do total de compostos fenólicos ingerido segue diretamente
para o cólon, onde é extensamente metabolizado pela microbiota intestinal. Os metabólitos
gerados, geralmente de baixo peso molecular, são então absorvidos, o que contribui para o
aumento da biodisponibilidade dos compostos fenólicos (PIMPÃO et al., 2013; CARDONA
et al., 2013).
Nos últimos anos a bioacessibilidade e o metabolismo colônico dos compostos
fenólicos presentes em frutas, principal fonte dietética dos compostos fenólicos, têm sido
investigados (PÉREZ-VICENTE; GIL-IZQUIERDO; GARCÍA-VIGUERA, 2002; NEILSON
et al., 2009; FERNÁNDEZ; LABRA, 2013; HENNING et al., 2014; LIMA et al., 2014;
CORREA-BETANZO et al., 2014; SENGUL; SUREK; NILUFER-ERDIL, 2014;
SÁNCHEZ-PATÁN et al., 2015; KOSIŃSKA-CAGNAZZO et al., 2015; GUERGOLETTO
et al., 2016). No entanto, ainda são escassos os estudos acerca desses compostos presentes em
matrizes alimentares complexas, tais como os pães (GAWLIK-DZIKI et al., 2009; HILLER et
al., 2011; SZAWARA-NOWAK; BĄCZEK; ZIELIŃSKI, 2016).
Os produtos de panificação, em especial os pães, têm sido utilizados como ferramenta
para incorporação de constituintes bioativos, principalmente por ser considerado um alimento
básico e amplamente consumido por grande parte da população mundial e por possuir baixo
valor nutricional (RUPASINGHE et al., 2008; PENG et al., 2010; SUN-WATERHOUSE et
al., 2011; HOYE & ROSS, 2011; SIVAM et al., 2012; HOBBS et al., 2014; RODRIGUEZ-
MATEOS et al., 2014). A incorporação de farinha de frutas desidratadas tem sido o foco de
21
grande parte dos estudos e tem estimulado a exploração comercial em larga escala de frutas
desidratadas como ingredientes funcionais (CHANG et al., 2016).
No que se refere à goiaba, recentemente em nosso grupo de pesquisa, foi elaborada
farinha de goiaba, que apresentou elevado potencial de aplicação na elaboração de produtos
alimentares com propriedade funcional em virtude do perfil de compostos voláteis e de
compostos fenólicos (NUNES et al., 2016). A farinha de goiaba foi incorporada, em
substituição à farinha de trigo, em pães tipo forma que tiveram boa aceitação, por potenciais
consumidores, bem como aumento, de cerca de três vezes, nos teores de compostos fenólicos
quando comparado ao pão sem adição de farinha de goiaba.
Apesar de os estudos apontarem para a viabilidade da elaboração de produtos de
panificação com farinha de frutas (HOYE; ROSS, 2011; HO; AZIZ; AZAHARI, 2013;
ALTUNKAYA et al., 2013; ALVES; PERRONE, 2015; NUNES et al., 2016), a
bioacessibilidade e o metabolismo colônico dos compostos fenólicos presentes no pão de
goiaba e no pão de controle elaborados no presente estudo ainda não foram investigados.
Portanto, torna-se relevante investigar as modificações ocorridas durante o processo de
digestão simulada in vitro bem como o metabolismo colônico dos compostos fenólicos
presentes nestes pães, como forma de avaliar o possível potencial funcional in vivo desse
alimento.
22
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
23
2.1. Compostos fenólicos
Os compostos bioativos são constituintes não nutricionais que ocorrem em baixos
teores nos alimentos. Eles apresentam diversas formas tanto no que se refere à sua estrutura
química, quanto ao seu aspecto funcional, de acordo com o grupo em que se encontram
(KRIS-ETHERTON et al., 2002). Dentre estes, os compostos fenólicos, também chamados
polifenóis, representam uma das suas principais classes, não apenas do ponto de vista de
variedade, mas também dos avanços científicos relacionados à bioatividade (MURKOVIC,
2003; CADORNA et al., 2013). Já foram identificados mais de 8 mil compostos fenólicos,
variando entre moléculas simples até compostos altamente polimerizados (DEL RIO et al.,
2013).
Os compostos fenólicos são metabólitos secundários de plantas e podem exercer
diferentes funções nos vegetais, tais como proteção contra herbívoros e infecção microbiana,
atrativos para polinizadores e demais espécies dispersoras de sementes e proteção aos raios
ultravioletas (UV). Eles são caracterizados pela presença de um anel aromático, com um ou
mais substituintes hidroxílicos, incluindo seus grupos funcionais, e podem ser divididos em
duas subclasses: flavonoides e não-flavonoides. Os não-flavonoides são representados pelos
ácidos fenólicos (derivados dos ácidos hidroxibenzoicos e ácidos hidroxicinâmicos) e outras
subclasses, enquanto os flavonoides são representados pelas flavonas, flavononas, flavonóis,
isoflavonas, flavanóis e antocianidinas (MANACH et al., 2004) (Figura 1). Os flavonoides
são os polifenóis mais comumente presentes nos alimentos de origem vegetal e compreendem
mais de 5 mil compostos (KRIS-ETHERTON et al., 2002).
Figura 1. Estrutura química básica dos ácidos hidroxibenzoicos (A), dos ácidos
hidroxicinâmicos (B) e dos flavonoides (C) (Adaptado de MANACH et al., 2004).
Nos alimentos, os compostos fenólicos podem estar presentes nas formas solúveis e/ou
insolúveis (ACOSTA-ESTRADA; GUTIERREZ-URIBE; SERNA-SALDIVAR, 2014). De
maneira geral, os compostos fenólicos encontrados nas frutas e vegetais apresentam em sua
R3
R2
R1
OH
O
A
R2
R1
OH
O
B
O
C
24
maior parte, na forma solúvel, enquanto os insolúveis representam aproximadamente 24% do
total de compostos fenólicos nessas matrizes alimentares (ADOM; LIU, 2002). Em
contrapartida, a maioria dos compostos fenólicos presentes nos grãos de cereais integrais são
encontrados na forma insolúvel, conjugados à componentes estruturais da parede celular,
como celulose, hemicelulose, lignina, pectina e proteínas (WONG, 2006).
Apesar de os compostos fenólicos estarem presentes em praticamente todos os
alimentos de origem vegetal, a sua ingestão dietética varia de acordo com o tipo de dieta e a
quantidade ingerida desses alimentos. A variabilidade das quantidades encontradas nos
vegetais é influenciada diretamente por fatores genéticos e condições de cultivo. Por exemplo,
os principais compostos fenólicos de cereais e legumes são os flavonoides, ácidos fenólicos e
taninos, enquanto os do vinho incluem os ácidos fenólicos, antocianinas, taninos e
flavonoides. Os mais abundantes em frutas são os flavonóis, ao passo que as oleaginosas são
também ricas em taninos (DEL RIO et al., 2013). Na dieta humana, as principais fontes
alimentares desses compostos são os alimentos de origem vegetal com destaque para as frutas,
devido à grande variedade e aos teores que apresentam (LIU, 2013).
Atualmente, tem-se investigado o papel protetor, frente a doenças crônicas não
transmissíveis, dos compostos fenólicos. Diferente das vitaminas, esses compostos fenólicos
não são essenciais para o bem-estar a curto prazo. No entanto, evidências recentes apontam
que o consumo moderado a longo prazo pode ser favorável para a redução da incidência de
algumas doenças como câncer, diabetes mellitus tipo 2, doenças cardiovasculares, mal de
Alzheimer e catarata (DEL RIO et al., 2013; LIU, 2013; SILVA et al., 2014).
Estima-se que um terço das mortes causadas por câncer nos Estados Unidos poderiam
ser prevenidas por mudanças na alimentação. Isso sugere que as adequações na dieta e no
estilo de vida como, por exemplo, o aumento do consumo de frutas e vegetais e a ingestão
balanceada de carnes e folhas, são estratégias práticas e eficazes para reduzir a incidência de
doenças crônicas (LIU, 2013).
2.2. Bioacessibilidade e biodisponibilidade dos compostos fenólicos
O termo bioacessibilidade é definido como a quantidade de determinado composto que
é liberada da matriz alimentar e estará disponível para a absorção intestinal, sendo este o
primeiro fator limitante para a investigação da biodisponibilidade. Já o termo
biodisponibilidade refere-se à quantidade que determinado composto é digerido, absorvido, e
25
estará circulante no organismo (PALAFOX-CARLOS; AYALA-ZAVALA; GONZALEZ-
AGUILAR, 2011).
Apesar de há muito se associar os compostos fenólicos de alimentos com benefícios à
saúde humana, somente nos últimos anos tem se discutido com maior ênfase a relação do seu
potencial bioativo e sua biodisponibilidade (AUGES et al., 2008; CROZIER; DEL RIO;
CLIFFORD, 2010; ALMINGER et al., 2014; BLANCAS-BENITEZ et al., 2014; WANG; HE;
CHEN, 2014). Sabe-se que nem todos os polifenóis são absorvidos com a mesma eficiência.
Eles são extensamente metabolizados pelas enzimas intestinais e hepáticas, além da
microbiota intestinal e os conhecimentos acerca de sua biodisponibilidade e metabolismo
devem ser avaliados de acordo com a atividade dos tecidos em que ocorrem (MANACH et
al., 2004). Após a ingestão, os compostos fenólicos são reconhecidos pelo nosso organismo
como xenobióticos e sua biodisponibilidade é relativamente menor quando comparada à dos
macro e micronutrientes (CADORNA et al., 2013).
Não obstante, de acordo com a complexidade e polimerização da estrutura desses
compostos, eles podem ser diretamente absorvidos no intestino delgado, ou alcançar o cólon
praticamente sem alterações. O metabolismo de compostos fenólicos se inicia no lúmen do
intestino delgado, onde estima-se que apenas de 5 a 10% do total ingerido seja absorvido.
Para que ocorra a absorção dos compostos fenólicos ligados a açúcares é necessário que
ocorra a desglicosilação dos mesmos (PALAFOX-CARLOS; AYALA-ZAVALA;
GONZÁLEZ-AGUILAR, 2011; CADORNA et al., 2013). Antes da passagem para a corrente
sanguínea, a forma aglicona pode ser metabolizada, formando metabólitos sulfatados,
glucuronidados e/ou metilados através da ação de enzimas. Ainda, alguns dos compostos
podem sofrer efluxo e voltar ao lúmen do intestino delgado. Uma vez na corrente sanguínea,
os metabólitos alcançam rapidamente o fígado, aonde sofrerão a metabolização de fase II,
podendo ser encaminhados aos seus sítios de ação ou voltar ao intestino delgado através da
bile (CROZIER; DEL RIO; CLIFFORD, 2010).
Os compostos fenólicos que não forem absorvidos no intestino delgado alcançam o
intestino grosso, onde a microbiota colônica clivará os compostos insolúveis e as agliconas
resultantes sofrerão fissão do seu anel aromático, levando à produção de moléculas menores,
como os ácidos fenólicos. Logo, estes poderão ser absorvidos ou excretados pelas fezes.
Quando absorvidos, podem alcançar o fígado pela veia portal, sítio em que possivelmente
passarão pela metabolização de fase II e, finalmente, entrarão na circulação sistêmica, sendo
distribuídos aos órgãos e/ou excretados na urina (Figura 2) (CROZIER; DEL RIO;
CLIFFORD, 2010; DEL RIO et al., 2010; CADORNA et al, 2013).
26
Figura 2. Rota dos compostos fenólicos da dieta e seus metabólitos em seres humanos
(Adaptado de SCALBERT et al., 2002).
A microbiota colônica é, então, responsável pela extensiva metabolização dos
compostos fenólicos em uma grande variedade de metabólitos de baixo peso molecular,
tornando-os absorvíveis e, provavelmente, os responsáveis pelos efeitos benéficos à saúde.
Sabe-se também que as bactérias colônicas atuam de forma diferente de acordo com a
variação da composição da microbiota interindividual. Consequentemente, as suas variações
podem levar a diferenças na metabolização dos compostos. Além disso, o cenário pode ser
ainda mais complexo quando avaliamos a relação de vias entre microbiota e compostos
fenólicos, na qual ambos podem exercer influência mutuamente (CADORNA et al., 2013).
2.3. Modelo de digestão simulada in vitro
Embora os estudos in vivo, como por exemplo, estudos de intervenção com seres
humanos, sejam mais específicos para fornecer informações acerca da biodisponibilidade de
compostos fenólicos, os modelos de digestão simulada in vitro são considerados metodologias
importantes e úteis para estimar os eventos pré absortivos, tais como estabilidade e
bioacessibilidade de compostos bioativos dos alimentos (RODRÍGUEZ-ROQUE et al., 2013).
Adicionalmente, esses modelos têm sido usados como uma etapa prévia aos estudos com
27
seres humanos por serem menos invasivos e dispendiosos (KAMILOGLU et al., 2014; LIMA
et al., 2014; PODESEDEK et al., 2014; RUBIÓ et al., 2014; VAN LOO-BOUWMAN et al.,
2014).
Os estudos de digestão simulada in vitro foram desenvolvidos para simular as
condições fisiológicas e a sequência de eventos que ocorre durante a digestão no trato
gastrointestinal humano. Nesses estudos são mimetizadas as condições físico-químicas que
ocorrem durante a digestão, considerando as três áreas do sistema digestório: boca, estômago
e intestino delgado. Suas principais características são a temperatura, a movimentação e a
composição química ou enzimática da saliva, do suco gástrico, do suco duodenal e da bile,
similares às do no organismo humano (FERNÁNDEZ-GARCÍA; CARVAJAL-LÉRIDA;
PÉREZ-GÁLVEZ, 2009; CORREA-BETANZO et al., 2014).
Muitas vezes os estudos de digestão simulada in vitro são preferíveis a estudos in vivo,
uma vez que estes podem ser facilmente afetados por diferenças em modelos humanos ou
animais e são muito mais complexos. Além disso, apresentam preço elevado e complicações
frente às questões éticas. Desta forma, destacam-se, entre as vantagens dos métodos in vitro,
a simplicidade, facilidade de aplicação e o baixo custo (SENGUL; SUREK; NILUFER-
ERDIL, 2014).
Uma importante questão a ser observada acerca dos ensaios in vitro é que diversos
modelos foram criados desde o primeiro, que foi descrito em 1981. A diversidade dificultou a
comparação dos resultados descritos na literatura e aumentou as chances de resultados
contraditórios. Os modelos empregados se diferenciam principalmente na inclusão de
diferentes estágios, nos tempos utilizados para a incubação, no pH (controlado ou não), na
natureza das enzimas digestivas e nas concentrações de eletrólitos e ácidos biliares. E, por
fim, enquanto a maioria dos estudos opera de forma estática, ou seja, com concentrações e
volumes fixos de materiais, enzimas e sais, alguns outros apresentam modelos dinâmicos que
mimetizam as mudanças contínuas das condições físico-químicas a fim de simular melhor a
passagem do bolo alimentar pelo trato digestório (ALMINGER et al., 2014).
Muitos fatores guiam a escolha do modelo in vitro a ser utilizado, sendo o mais
importante o objetivo final do estudo. Em alguns ensaios, o principal escopo é entender o
efeito da digestão simulada no trato gastrointestinal sobre certas classes de fitoquímicos. Em
estudos com pequeno número de amostras, a simulação em modelos dinâmicos e mais
profundos pode ser mais apropriada, visto que permite a mimetização de muitos efeitos do
trato digestório. Já em estudos de larga escala, com múltiplas amostras, um modelo estático e
mais simples pode ser mais apropriado. Em alguns casos, a função da digestão in vitro é
28
providenciar amostras que sejam fisiologicamente relevantes para futuros estudos da
bioatividade de constituintes presentes em alimentos, como com a preparação de amostras que
possam ser inoculadas no cólon (ALMINGER et al., 2014).
De fato, diversos estudos avaliaram a estabilidade e a absorção de dietas ricas em
compostos fenólicos na parte inferior do trato gastrointestinal. Porém, o modo de digestão de
complexos macromoleculares presentes em matrizes alimentares são limitados e foram pouco
investigados, visto que a maioria dos estudos foca apenas nos compostos fenólicos isolados e
seus metabólitos, não considerando os possíveis efeitos da matriz alimentar no processo
digestivo (CORREA-BETANZO et al., 2014). Ou seja, dados acerca da interação entre os
compostos fenólicos e a matriz alimentar são escassos (SENGUL; SUREK; NILUFER-
ERDIL, 2014; ṤTANISAVLJEVIC et al., 2015). No entanto, sabe-se que a biodisponibilidade
dos compostos fenólicos é diretamente afetada por constituintes da matriz alimentar, como a
interação entre proteínas, carboidratos, fibras e lipídeos (ORTEGA et al, 2011; SENGUL;
SUREK; NILUFER-ERDIL, 2014; ṤTANISAVLJEVIC et al., 2015).
O total de compostos fenólicos ingeridos nem sempre reflete a quantidade disponível
para o organismo. Muitas vezes, apesar da grande quantidade presente no alimento ingerido,
pequena quantidade por porção de alimento ingerido (entre 0,5 e 1,0%) é de fato absorvida.
Porém, biotransformações envolvendo quebras catabólicas, metilação, deglicosilação, entre
outras, geram metabólitos, o que contribui para aumentar a biodisponibilidade dos compostos
fenólicos (DALL’ASTA et al., 2012; CADORNA et al., 2013). A bioacessibilidade destes
compostos parece ainda mais complexa devido às diferentes estruturas químicas e mudanças
durante a digestão e metabolização, que estão diretamente relacionadas à sua polaridade, peso
molecular, glicosilação e esterificação (KAULMANN et al., 2016).
Outro fator importante a ser levado em consideração sobre a biodisponibilidade de
polifenóis é o pH do ambiente. Foi observado previamente que o pH durante o processo
digestivo varia entre 1,7 na parte gástrica até 5,4 nas partes superiores e média do duodeno.
Ao final da digestão, o pH do duodeno retorna aos valores de jejum de 6,7 em
aproximadamente 4 horas (ṤTANISAVLJEVIC et al., 2015).
2.4. Fermentação colônica
O cólon é o maior segmento do intestino grosso, sendo este termo também muito
utilizado para se referir a todo o intestino grosso. Ele se estende do ceco, localizado ao final
do intestino delgado, passando pelo lado direito do abdomen (cólon ascendente), para o lado
29
esquerdo (cólon transverso), descendo pelo lado esquerdo (cólon descendente) e depois se
flexionando (no cólon sigmóide) para se juntar ao reto. A função deste órgão é lubrificar os
produtos que serão excretados, absorver fluídos e sais remanescentes e armazenar as fezes até
o momento de sua excreção, além de ser um local extremamente ativo de fermentação,
produzindo diversos compostos que vão influenciar na fisiologia intestinal (Encyclopædia
Britannica, 2016; GUERGOLETTO et al., 2016). Este importante órgão habita um grande
número de microrganismos, os quais formam a microbiota colônica (MUÑOZ-TAMAYO et
al., 2010). A composição da microbiota interage em simbiose com o hospedeiro e é altamente
complexa, sendo governada pela idade, dieta, ambiente e filogenia (DALL’ASTA et al.,
2012). Ela representa um ecossistema, o qual contém três tipos de vida: bactéria, archaea e
eukarya. A maior comunidade reside no cólon, o qual aporta um ecossistema microbiano
altamente complexo, com aproximadamente 200 g de células vivas na concentração de 1012
microrganismos por grama de conteúdo intestinal. Além disso, apenas oito tipos de bactérias
foram identificadas no trato gastrointestinal, sendo elas classificadas em Firmicutes e
Bacterioidetes, que juntas formam mais de 90% da microbiota intestinal. O restante é
constituído de Actino bactérias, Proteobacteria, Verrucomicrobacteria e Cyanobacteria
(POSSEMIERS et al., 2011).
Essa comunidade microbiana é responsável pela quebra dos polissacarídeos dos
alimentos que não foram previamente digeridos, mediando muitos dos efeitos da alimentação
na saúde do intestino. A fermentação colônica gera vitaminas e co-fatores essenciais,
contribuindo com até 10% da energia de requerimento metabólico do organismo. Os
principais produtos da fermentação são os ácidos graxos de cadeia curta, hidrogênio e gás
carbônico (MUÑOZ-TAMAYO et al., 2010).
Como a microbiota colônica recebe uma larga diversidade de componentes
alimentares, parcialmente ou não digeridos, e abriga a excreção de produtos como nutrientes e
fontes de energia, o conjunto de genes de bactérias que codificam as enzimas metabólicas é
altamente diverso, a fim de garantir a sobrevivência em diferentes condições nutricionais.
Carboidratos, resistentes à digestão, conduzem a fermentação colônica e os produtos
resultantes, como ácidos graxos de cadeia curta, são considerados benéficos para o
hospedeiro. Em contrapartida, quando as proteínas são fermentadas, os produtos finais
incluem compostos tóxicos, como aminas e fenóis. Além dos carboidratos e proteínas, muitos
outros componentes, como os fitoquímicos ou contaminantes do ambiente também são
expostos a microbiota intestinal (POSSEMIERS et al., 2011).
30
Em relação à sua ação sobre os compostos fenólicos, apesar de serem modificados e
absorvidos através do intestino delgado antes de entrar na circulação sistêmica, a maioria não
é eficientemente absorvido, e logo chega ao intestino grosso. Nele, a microbiota induz
transformações drásticas muito diferentes daquelas exercidas pelas enzimas intestinais e
hepáticas. A microbiota intestinal realiza reações químicas para modificar estruturas fenólicas
e permitir a absorção de uma gama de metabólitos de menor peso molecular. Isso porque as
enzimas microbianas podem hidrolisar glicosídeos, glucuronídeos, sulfatos, amidas, ésteres,
lactonas e operar na clivagem de anéis, redução, descarboxilação, desmetilação e
desidroxilação dos compostos fenólicos (DALL’ASTA et al., 2012).
2.5. Goiaba (Psidium guajava L.)
A goiaba (Psidium guajava L.) é uma fruta tropical nativa da América, pertencente à
família Myrtaceae largamente cultivada nas regiões tropicais e subtropicais (THUAYTONG;
ANPRUNG, 2011). Ela vem se tornando cada vez mais popular e pode ser consumida fresca
ou nas formas processadas, como em sucos, purês, geleias e gelatinas (PINO; BENT, 2013).
No entanto, a goiaba foi classificada pelo Global Research on Underutilised Crops como
fruta subutilizada, sendo necessárias pesquisas com o objetivo de desenvolver novas formas
de utilização (WILLIAMS; HAQ, 2000).
Como características físicas, a fruta apresenta o formato redondo ou oval e a casca
macia, com exceção de alguns cultivares que podem apresentar a casca mais áspera
(THUAYTONG; ANPRUNG, 2011). A coloração da casca é predominantemente verde
escura quando a fruta não está madura, tornando-se verde clara ao longo da maturação,
alcançando a cor verde amarelada quando já madura (ARAÚJO et al., 2015). A polpa pode
variar de acordo com o cultivar e o seu estado de maturação, entre branca e rosa e vermelha
(FLORES et al., 2015; ARAÚJO et al., 2015).
Do ponto de vista nutricional, a goiaba contém nutrientes, tais como vitaminas A e C,
presentes em quantidades de 3 a 6 vezes maiores do que em laranjas. Além disso, também
possui vitaminas B1, B2, B6, ferro, cálcio e fibra alimentar. A goiaba vermelha contém, ainda,
maior quantidade de licopeno quando comparada ao tomate e ao mamão papaia, importantes
fontes dietéticas desse constituinte (THUAYTONG; ANPRUNG, 2011). Diferentes
compostos fenólicos já foram relatados na goiaba vermelha, tanto sob a forma solúvel quando
insolúvel (NUNES et al., 2016; FLORES et al., 2015).
31
Os teores de ácido ascórbico, carotenoides e compostos fenólicos na goiaba variam em
função do estágio de maturação, condições de cultivo, origem geográfica e condições de
colheita (ARAÚJO et al., 2015; VIEIRA et al., 2011). Adicionalmente, a metodologia de
extração e o tipo de solvente empregados também influenciam na quantificação dos
constituintes (VIEIRA et al., 2011). Amostras provenientes de frutas frescas podem
apresentar maiores teores de compostos fenólicos do que frutas que foram congeladas, em
virtude da danificação na estrutura celular provocada pelo congelamento, podendo levar a
degradação dos seus compostos (SHOFIAN et al., 2011).
O Brasil é um dos maiores produtores mundiais de goiabas vermelhas, sendo as
variedades mais cultivadas a Paluma e a Pedro Sato. No ano de 2014, de acordo com dados do
IBGE, a produção foi de 359.349 toneladas, com destaque ao crescimento intensivo das áreas
de cultivo de goiabeiras. São produzidas diferentes variedades voltadas para a indústria, como
por exemplo, “Paluma” e “Rica”, ou para consumo in natura, como as variedades “Sassaoka”
e “Pedro Sato”. Em geral, a produção da goiaba vermelha é maior do que a branca devido à
coloração mais demandada pela indústria de processamento e para consumo in natura
(HAIDA et al., 2015).
A goiaba é um fruto climatérico e apresenta alta taxa respiratória, possuindo curto
período de conservação e necessitando de rápida comercialização após a colheita (PEREIRA
et al., 2006). A sua vida útil é de aproximadamente 3 a 5 dias, o que depende da temperatura
ambiente e limita o período de transporte e estocagem. Logo, devido a alta perecibilidade as
perdas por deterioração podem chegar a 30% (HAIDA et al., 2015). Portanto, processamentos
tecnológicos podem ser essenciais para aumentar o tempo de vida útil e aumentar a
comercialização dessas frutas, possibilitando, também, o aproveitamento integral das mesmas
(LAGO, 2014).
Nesse contexto, se insere a aplicação de técnicas de conservação de alimentos que se
baseiam na remoção da água visando ampliar a vida de prateleira do produto e expandir suas
formas de utilização. Trabalhos publicados recentemente têm estimulado a exploração
comercial em larga escala de frutas desidratadas como ingredientes funcionais
(RUPASINGHE et al., 2008; ALTUNKAYA et al., 2013; HO; AZIZ; AZAHARI, 2013;
ALVES; PERRONE, 2015; CHANG; ALASALVAR; SHAHIDI, 2016). Os processos de
desidratação ocupam um lugar importante na indústria de alimentos há muitos anos e
diferentes tecnologias são utilizadas para a fabricação de produtos desidratados, com destaque
para a secagem em estufa e a liofilização. A secagem em estufa é um dos métodos mais
utilizados devido ao seu baixo custo. Além desse aspecto econômico, dados recentes do nosso
32
grupo de pesquisa demonstraram que o processo de desidratação em estufa, quando
comparado ao processo de liofilização, promove aumento dos teores de compostos fenólicos
solúveis (NUNES et al., 2016), que são mais biodisponíveis no organismo humano
(ACOSTA-ESTRADA; GUTIERREZ-URIBE; SERNA-SALDIVAR, 2014).
2.6. Produtos de panificação enriquecidos
O pão é um alimento consumido no mundo inteiro e apresenta elevado valor
energético, além de uma composição nutricional expressiva para a alimentação e nutrição de
um indivíduo. Em muitos países, é considerado o alimento principal da refeição, podendo ser
consumido com algumas ou até mesmo em todas as preparações (HATHORN et al., 2008;
GAWLIK-DZIKI et al., 2009; ṤWIECA et al., 2014). No Brasil, essa matriz alimentar
também não é apenas um complemento às refeições, representando para muitas famílias de
baixa renda o elemento principal a fornecer energia (VASCONCELOS et al., 2006). De
acordo com os dados da Pesquisa de Orçamento Familiar (POF), o consumo de pão de sal per
capita é de aproximadamente 53,0 g/dia, enquanto o pão integral apresenta consumo médio de
0,9 g/dia per capita.
Os ingredientes básicos que constituem o pão são farinha de trigo, sal e fermento, mas
atualmente muitos outros constituintes vêm sendo acrescentados a fim de aumentar a
diversidade e melhorar seus aspectos nutricionais e atrativos comerciais (LIN et al., 2009).
Segundo Gawlik-Dziki et al. (2009) as tentativas de enriquecimento de pães com ingredientes
ricos em compostos bioativos tem sido bastante visadas atualmente, dando destaque aos
compostos fenólicos. Além disso, o desenvolvimento de produtos de panificação é importante
não apenas para atingir benefícios fisiológicos, mas também a aceitação do consumidor em
termos de aparência, sabor e textura (ALTUNKAYA et al., 2013).
Muitos estudos têm sido desenvolvidos para a elaboração de produtos inovadores com
diferentes formulações visando a incorporação de constituintes alimentares de origem vegetal
como, por exemplo, pães com farinha de batata doce (HATHORN et al., 2008), casca de
cebola desidratada (GAWLIK-DZIKI et al., 2013), gengibre em pó (BALESTRA et al.,
2011), brotos de brócolis (GAWLIK-DZIKI et al., 2014), entre outros.
Em relação às frutas, pesquisadores têm buscado soluções para minimizar as perdas
pós-colheita ou melhorar o aproveitamento integral do alimento, incorporando parcialmente à
novas matrizes alimentares (O'SHEA; ARENDT; GALLAGHER, 2012). Nesse contexto,
diferentes farinhas de frutas, como a do pseudocaule de banana (HO; AZIZ; AZAHARI,
33
2013), da casca de maçã (RUPASINGHE et al., 2008), de romã (ALTUNKAYA et al., 2013),
da semente de uva (HOYE; ROSS, 2011; PENG et al., 2010) e de manga (RAMÍREZ-
MAGANDA et al., 2015) já foram incorporadas em produtos de panificação.
As frutas desidratadas têm grande parte de suas características nutricionais e sensoriais
preservadas e, portanto, tornam-se passíveis de adição em diversos produtos alimentícios,
agregando valor nutricional e funcional e contribuindo para a comercialização de produtos
inovadores. Logo, o Brasil por ser o terceiro maior produtor mundial de frutas, possui grande
potencial no desenvolvimento e comercialização desses alimentos com altos teores de
compostos fenólicos.
De acordo com Lago (2014) a substituição parcial de farinha de trigo por farinha de
goiaba desidratada nas proporções de 10% e 20% na elaboração de pães promoveu aumento
do teor de compostos fenólicos proporcional ao percentual de farinha de fruta utilizada. Além
disso, considerou que houve uma perda de aproximadamente 16% na quantidade de
compostos fenólicos presentes em ambas as farinhas durante o processo de panificação. Em
outro estudo foi realizada a análise sensorial de pães com substituição parcial da farinha de
trigo por farinha de goiaba nas mesmas proporções e também 30%, apontando como resultado
boa aceitação de todos os pães, especialmente os dois com maior percentual de substituição
(MINUZZO, 2015).
Durante o processo de panificação diversas reações químicas acontecem, entre elas a
produção enzimática de açúcares, gelatinização, caramelização, coagulação e desnaturação
proteica, inativação do fermento, reação de Maillard entre outras. Todas são essenciais para
determinação dos atributos de qualidade (características sensoriais e valores nutricionais). Em
paralelo, enquanto alguns compostos são destruídos durante o processamento, diversos outros
podem ser originados (DZIKI et al., 2014).
O enriquecimento de produtos alimentícios e uma alternativa prática e econômica para
a melhora da qualidade dos alimentos. Entretanto, alguns fatores ainda não foram bem
estabelecidos, como a proporção dos valores a serem substituídos parcialmente e a
bioacessibilidade e biodisponibilidade dos compostos adicionados (DZIKI et al., 2014).
34
OBJETIVOS
35
3.1. Objetivo geral
Avaliar a bioacessibilidade e o metabolismo colônico dos compostos fenólicos
presentes em pão controle e pão elaborado com a substituição parcial de farinha de trigo por
farinha de goiaba.
3.2. Objetivos específicos
• Elaborar pão tipo forma controle e com substituição parcial de farinha de trigo por
30% de farinha de goiaba;
• Determinar a composição centesimal dos pães elaborados;
• Determinar os teores e o perfil de compostos fenólicos solúveis e insolúveis nos pães
elaborados;
• Investigar a bioacessibilidade dos compostos fenólicos dos pães elaborados em
condições de digestão simulada in vitro;
• Investigar o metabolismo colônico dos compostos fenólicos dos pães elaborados por
meio da incubação da fração final obtida no processo de digestão in vitro com pool
fezes de voluntários sadios.
36
MATERIAL E MÉTODOS
37
4.1. Obtenção da farinha de goiaba
As goiabas (Psidium guajava L.) maduras do cultivar Pedro Sato foram adquiridas no
mês de abril no Centro de Abastecimento do Estado da Guanabara (CADEG, RJ). As frutas
foram transportadas até o laboratório, onde foram selecionadas, lavadas e sanitizadas em
solução de hipoclorito de sódio a 100 ppm durante 15 minutos. Após a higienização, as
goiabas inteiras foram fracionadas manualmente em cubos de aproximadamente 1 cm cubico,
distribuídas uniformemente em bandejas (Figura 1) e desidratadas em estufa com circulação
forçada de ar (330 drier, FANEM®) a 55 ºC durante 22 horas (Nunes et al., 2016).
Figura 1. Distribuição das goiabas fracionadas na bandeja.
Após a desidratação, as frutas foram moídas em moinho laboratorial (MF 10 Basic,
IKA®
) e peneiradas, para a obtenção das farinhas com granulometria de 20 mesh (Figura 2).
A farinha foi, então, acondicionada em sacos plásticos estéreis a vácuo e armazenadas a -20
°C até a o momento da elaboração dos pães. O rendimento médio das farinhas foi de 15% em
relação ao peso inicial das goiabas.
Figura 2. Farinha de goiaba desidratada.
38
4.2. Elaboração dos pães
Os pães tipo forma foram elaborados no Laboratório de Bioquímica Nutricional e de
Alimentos de acordo com metodologia adaptada de Lago (2014). Para elaboração do pão
controle (PC) foi utilizada farinha de trigo e para elaboração do pão de goiaba (PG) a farinha
de trigo foi parcialmente substituída por 30% de farinha de goiaba. Os ingredientes utilizados
bem como as quantidades estão apresentados na Tabela 1. A ficha técnica de preparação
encontra-se no Anexos C e D.
Tabela 1. Formulação para elaboração do pão controle e do pão de goiaba.
Ingredientes Pão controle Pão de goiaba
Farinha de trigo (g) 300,0 210,0
Farinha de goiaba desidratada (g) - 90,0
Manteiga sem sal (g) 12,0 12,0
Açúcar cristal (g) 12,0 12,0
Sal (g) 6,0 6,0
Carboximetilcelulose (g) 3,7 3,7
Melhorador de Pães (g) 3,0 3,0
Fermento biológico (g) 3,0 3,0
Água (mL) 171,0 171,0
Os pães foram elaborados em máquina automática de preparo de pães (BK2000B,
Breadman®) (Figura 3) em duplicata de acordo com as condições estabelecidas no
equipamento: 3 horas e 13 minutos e coloração “medium”. Os ingredientes líquidos foram
adicionados primeiro e em seguida os ingredientes secos. Durante o processo de produção há
grande variação da temperatura, a qual se inicia entre 21 °C e 23 °C para a mistura e
homogeneização dos ingredientes, passando para 35 °C no descanso e fermentação da massa e
alcançando o valor de 140 °C na etapa de assamento dos pães. O tempo médio de cada uma
dessas etapas é de 30 minutos, 116 minutos e 47 minutos, respectivamente.
Após o preparo, os pães foram resfriados a temperatura ambiente (Figura 4),
fracionados, moídos em moinho laboratorial (A11 Basic, IKA®), acondicionados em sacos
plásticos estéreis a vácuo e armazenados a -20 ºC até o momento das análises.
39
Figura 3. Máquina automática de preparo dos pães.
Figura 4. Pão controle (esquerda) e pão de goiaba (direita).
4.3. Determinação da composição centesimal
Os teores de umidade, resíduo mineral fixo, proteína, lipídeo e fibra dietética nos pães
controle e de goiaba foram determinados em triplicata de acordo com os métodos oficiais,
sendo considerado o fator de conversão de 6,25 para determinação dos teores de proteínas
(AOAC, 2000). Os teores de carboidratos foram calculados pela diferença entre 100% e a
soma das porcentagens de umidade, cinzas, proteína e lipídeos totais. O valor energético foi
40
calculado a partir do conteúdo de lipídeos (9 kcal/g), proteínas (4 kcal/g) e carboidratos (4
kcal/g).
4.4. Determinação do perfil e dos teores de compostos fenólicos por cromatografia
líquida de alta eficiência (CLAE)
4.4.1. Extração das amostras
A extração dos compostos fenólicos solúveis e insolúveis no pão controle e no pão de
goiaba foi realizada em triplicata de acordo com metodologia adaptada de Dinelli et al.
(2011).
Para a extração dos compostos fenólicos solúveis as amostras (aproximadamente 1 g)
foram adicionadas de 20 mL de solução gelada etanol:água (80:20, v/v) por 10 minutos sob
agitação em vórtex. Posteriormente foram centrifugadas (2500 × g, 5 minutos, 10 ºC) (Sorvall
ST 16R, Thermo ScientificTM
). O sobrenadante foi coletado e o resíduo submetido ao mesmo
procedimento novamente. Os sobrenadantes foram coletados, reunidos, evaporados em
rotaevaporador (R-215, Büchi®) e o resíduo seco foi reconstituído com 10 mL de água Milli-
Q.
A extração dos compostos fenólicos insolúveis foi realizada a partir do resíduo da
extração dos compostos solúveis em duas etapas de hidrólise, sendo uma alcalina e a outra
ácida. Para a hidrólise alcalina, o resíduo obtido da extração anterior foi incubado com 12 mL
de água destilada e 5 mL de NaOH 10M sob agitação a temperatura ambiente e no escuro por
16 horas (IKA KS 4000i control). Em seguida o pH foi ajustado para 2, com a adição de HCl
concentrado, e a mistura extraída por 30 segundos com 15 mL de acetato de etila. Após
centrifugação (2500 × g, 5 minutos, 10 ºC) o sobrenadante foi coletado e o resíduo re-extraído
mais duas vezes. Os sobrenadantes foram reunidos, evaporados e o resíduo seco foi
reconstituído em 10 mL de solução metanol:água (80:20, v/v).
Para hidrólise ácida, o resíduo obtido após a hidrólise alcalina foi incubado com 2,5
mL de HCl concentrado a 85 ºC por 30 minutos. Após o resfriamento o mesmo processo de
extração com acetato de etila descrito para a hidrólise alcalina foi realizado.
Todos os extratos obtidos foram filtrados em membrana de éster de celulose de 0,45
µm (Millipore, Brasil) e armazenado a -20 ºC até o momento das análises por CLAE.
41
4.4.2. Condições cromatográficas
A identificação e a quantificação dos compostos fenólicos foram realizadas por CLAE
em sistema Shimadzu® (Japão) que incluiu uma bomba quaternária LC-20AT, injetor
automático SIL-20AHT, detector de arranjo de diodos (DAD) SPD-M20A, sistema CBM-
20A como controlador e degaseificador DGU-20A5.
A separação cromatográfica dos analitos foi obtida utilizando-se uma coluna de CLAE
de fase reversa C18 (5 μm, 250 mm × 4,6 mm, Kromasil®). A fase móvel consistiu em uma
mistura de duas soluções: solução aquosa de ácido fórmico 0,3% (eluente A) e metanol
(eluente B). O eluente foi monitorado na faixa de 190 a 600 nm e o gradiente de concentração
da fase móvel foi programado de acordo com metodologia adaptada de Lago (2014),
utilizando-se fluxo de 0,8 mL/minuto (Tabela 2).
Tabela 2. Programação do gradiente de concentração da fase
móvel utilizada na análise de compostos fenólicos nos pães.
Tempo (min) Eluente A (%) Eluente B (%)
0,01 84,0 16,0
8,00 76,0 24,0
12,00 74,6 25,4
20,00 74,0 26,0
30,00 60,0 40,0
40,00 45,0 55,0
50,00 20,0 80,0
52,00 10,0 90,0
52,01 84,0 16,0
62,01 84,0 16,0
Os padrões externos, naringenina, rutina, miricetina, miricitrina, quercetina,
kaempferol e os ácidos gálico, siríngico, ferúlico, m-cumárico, p-cumárico, rosmarínico,
benzoico, salicílico, 3,4-dihidróxibenzoico e 4-hidroxifenilacético foram adquiridos da
Sigma-Aldrich (St Louis, MO) e injetados na forma de pool para a identificação dos mesmos
e para elaboração da curva de calibração. Os dados de integração foram adquiridos pelo
software LC Solution (Shimadzu Corporation®, version 1.25, 2009) e os resultados foram
expressos em mg do composto por 100 g em base seca (bs).
42
4.5. Digestão simulada in vitro e fermentação colônica ex vivo
O procedimento de digestão in vitro teve como finalidade simular as etapas oral,
gástrica e intestinal da digestão baseadas na fisiologia humana. Foram testadas e otimizadas,
para os pães, as metodologias descritas por Oomen et al. (2003) e Fernández & Labra (2013).
A fermentação colônica foi realizada de acordo com adaptação de metodologia descrita por
Hu et al. (2004) e Mosele et al. (2015). Todas as etapas foram realizadas em triplicata.
4.5.1. Simulação da fase oral
Em frascos de vidro foram pesados aproximadamente 0,50 g dos pães e adicionados 2
mL de água e 3 mL de saliva humana, obtida por doação espontânea de uma voluntaria sadia.
Em seguida, os frascos foram incubados a 37 °C por 1 minuto sob agitação orbital a 260 rpm
(Sorvall ST 16R, Thermo ScientificTM
).
4.5.2. Simulação da fase gástrica
Nos frascos provenientes da fase oral foram adicionadas 2,5 mL de fluido gástrico
artificial com pepsina gástrica suína (Tabela 3) e o pH foi ajustado para 2,0 com HCl 6 M.
Em seguida, os frascos foram fechados com septo de borracha, a atmosfera foi modificada
pela introdução de nitrogênio com auxílio de um balão de gás conectado a uma seringa
(Figura 5). Os frascos foram incubados a 37 ºC por 2 horas sob agitação orbital a 260 rpm.
Tabela 3. Composição do fluido gástrico artificial (por 1000 mL de
solução).
Reagente Quantidade
NaCl (g) 5,50
NaH2PO4 (g) 0,54
KCl (g) 1,64
CaCl2 (g) 0,84
NH4Cl (g) 0,62
Glicose (g) 1,30
Uréia (g) 0,17
Mucina (g) 6,0
Albumina bovina (g) 2,0
HCl concentrado (mL) 16,6
Pepsina gástrica suína (g) 5,28
43
Figura 5. Balões com nitrogênio realizando troca de atmosfera
4.5.3. Simulação da fase intestinal
Nos tubos provenientes da fase gástrica foi adicionado NaHCO3 1 M para o ajuste do
pH das amostras para 6,5. Em seguida, foram adicionados 2 mL de fluido duodenal artificial
contendo pancreatina suína, bile suína e albumina bovina (Tabela 4) com auxílio de uma
seringa para manter a anaerobiose do sistema reacional. Os frascos foram incubados a 37 ºC
por 2 horas sob agitação orbital a 260 rpm.
Tabela 4. Composição do fluido intestinal artificial (por 1000 mL de
solução).
Reagente Quantidade
NaCl (g) 13,50
CaCl2 (g) 0,41
NaHCO3 (g) 7,98
KH2PO4 (g) 0,12
KCl (g) 1,024
MgCl2 (g) 0,075
Uréia (g) 0,275
Pancreatina suína (g ou mg) 8,0
Bile suína (g) 50,0
Albumina bovina (g) 2,4
HCl concentrado (mL) 0,37
4.5.4. Fermentação colônica ex vivo
Voluntários
Seis voluntários saudáveis de ambos os sexos (02 homens e 04 mulheres) foram
recrutados para doação espontânea de fezes. As amostras de fezes foram reunidas em pool e
44
utilizadas até duas horas após a sua obtenção. Os critérios para a inclusão dos voluntários
foram: idade entre 18 e 45 anos, índice de massa corpórea dentro da normalidade (18,5 a 24,9
kg/m2), funcionamento intestinal regular (de 1 evacuação a cada dois dias a 2 evacuações ao
dia), não apresentar doenças gastrointestinais e sem uso de suplementos nutricionais,
reguladores da flora intestinal, enzimas digestivas, probióticos, prebióticos, simbióticos,
antibióticos e antiácidos nos três meses anteriores a coleta das fezes. Além disso, os
voluntários foram orientados (ANEXO A) a realizar uma dieta isenta de frutas, bebidas
alcóolicas, pães e demais alimentos elaborados com farinha de trigo nos dois dias anteriores à
coleta das fezes.
O protocolo do estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética e Pesquisa do Hospital
Universitário Clementino Fraga Filho da UFRJ (N° 512.847). Todos os voluntários assinaram
Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE) (ANEXO B).
Condições experimentais
As fezes coletadas dos voluntários foram homogeneizadas em placas de Petri estéreis
e o pool foi constituído de 2,1 g de fezes de cada voluntário, totalizando 12,6 g, que foi
diluído em 250 mL de meio rico em nutrientes (meio complexo) (MCDONALD et al., 2013)
(Tabela 5).
Tabela 5. Composição do meio rico em nutrientes utilizado para a diluição
das fezes (por 1L de meio).
Reagente Quantidade (g)
Peptona 2,0
Extrato de levedura 2,0
NaHCO3 2,0
CaCl2 0,01
NaCl 0,1
Pectina 2,0
Xilana 2,0
Goma arábica 2,0
Amido de batata 5,0
Caseína 3,0
Inulina 1,0
O preparo da amostra foi realizado em câmara anaeróbica (Figura 6) e todos os
materiais utilizados passaram por um compartimento prévio onde ocorre a retirada do ar,
deixando-os no vácuo e passíveis de entrada na câmara. O pool de fezes (12,6 g) foi
45
transferido da placa de Petri com auxílio de palito de madeira para tubo de ensaio e
adicionado ao meio (250 mL). A solução foi agitada manualmente por aproximadamente 3
minutos até que a coloração estivesse amarronzada. Em seguida as amostras provenientes da
etapa final da digestão in vitro foram dispensadas em tubos de ensaio e, então, foram
pipetados 10 mL da solução elaborada para cada um destes.
Figura 6. Amostras sendo pipetadas na câmara de anaerobiose.
Após a incubação em condições de anaerobiose e temperatura ambiente, os tubos
foram retirados da câmara de anaerobiose, vedados com filme parafilm, posicionados em
béquer e alocados no agitador orbital a 40 rpm a 37°C (Figura 7). Foram determinados 4
pontos de retirada: 4, 24, 48 e 72 horas.
Figura 7. Amostras posicionadas no agitador em temperatura ambiente.
46
4.5.5. Análise de compostos fenólicos e seus metabólitos
Para investigação das etapas gástrica e intestinal da digestão simulada in vitro e da
fermentação colônica ex vivo, todas as análises foram realizadas em triplicatas. Além disso, os
experimentos foram paralelos e independentes, de maneira que somente alíquotas relativas à
etapa a ser investigada foram retiradas do sistema reacional. Assim, após as etapas de digestão
gástrica e intestinal, 4 h, 24 h, 48 h e 72 h após a incubação com o pool de fezes, o conteúdo
dos frascos foi transferido para tubos tipo Falcon, que foram centrifugados por 5 minutos a
2500 × g e os sobrenadantes foram coletados. Aos sobrenadantes obtidos em todas as etapas
da digestão e fermentação foi adicionado ácido tricloroacético 100% (5:1, v/v), a mistura foi
homogeneizada em vórtex e, em seguida, centrifugada por 10 minutos a 12100 × g. A alíquota
final foi filtrada em membrana de éster de celulose de 0,22 µm e armazenada a -20 °C até o
momento da injeção no sistema de CLAE, conforme descrito no item 4.4.2.
4.6. Análises estatísticas
Análises de estatística descritiva foram utilizadas para o cálculo de média e desvio
padrão. O efeito da substituição parcial de farinha de trigo por farinha de goiaba sobre a
composição centesimal e os teores de compostos fenólicos dos pães foi avaliado por teste t
não pareado. O efeito da matriz alimentar sobre a bioacessibilidade e o metabolismo colônico
dos compostos fenólicos foi investigado por análise de variância (Oneway ANOVA) com
pós-teste de Tukey. As análises estatísticas foram realizadas com auxílio do software
GraphPad Prism®
para Windows, versão 5.04 (GraphPad Software, San Diego, CA). As
diferenças foram consideradas significativas quando p<0,05.
47
RESULTADOS E DISCUSSÃO
48
5.1. Composição centesimal
Os teores de umidade, resíduo mineral fixo, proteínas, lipídios e carboidratos do pão
controle (PC) e do pão elaborado com substituição parcial de farinha de trigo por farinha de
goiaba (PG) estão apresentados na Tabela 1.
Tabela 1. Teores de umidade, resíduo mineral fixo, proteínas, lipídeos e carboidratos
dos pães elaborados1.
Pão controle Pão de goiaba
Umidade (%) 30,4±0,04a 36,0±0,15
b
Resíduo mineral fixo (g/100 g)
2,7±0,04a 3,1±0,04
b
Proteínas (g/100 g)
13,4±0,6a
8,7±0,6b
Lipídeos (g/100 g)
3,7±0,1a
4,8±0,1b
Carboidratos (g/100 g) 52,5 50,5
Valor calórico (Kcal/100 g) 297 280 1Resultados expressos em base seca como média±DP de triplicatas. Letras diferentes
na mesma linha indicam diferença significativa entre os pães (Teste t não-pareado,
p<0,05).
Os teores de umidade dos pães elaborados estão de acordo com o preconizado pela
RDC n° 90 (BRASIL, 2000), que estabelece que o valor máximo de umidade em pães deve
ser de 38%. Lin et al. (2009) relataram teores de umidade semelhantes em pão de forma
branco (33%) e pão de forma enriquecido com trigo sarraceno (34%). Destaca-se que o
conteúdo de umidade é comumente utilizado como indicador da qualidade do alimento, sendo
extremamente importante que estes teores estejam dentro do adequado, visto que a
inadequação pode gerar impacto nas propriedades sensoriais, físicas e microbiológicas do
alimento (HATHORN et al., 2008).
A incorporação da farinha de goiaba ao pão promoveu o aumento dos teores de
resíduo mineral fixo (Tabela 1). De acordo com os padrões de identidade e qualidade
estabelecidos para farinha de trigo, o teor de resíduo mineral fixo na farinha não pode exceder
1,35% (BRASIL, 1996). Na farinha de goiaba utilizada no presente trabalho, valores
superiores a esse limite (4,1%) (LAGO, 2014) foram encontrados e, consequentemente
impactaram no aumento dos teores de resíduo mineral fixo no PG. Contrariamente, os teores
de proteína foram menores no PG quando comparados ao PC, fato atribuído aos maiores
teores de proteínas na farinha de trigo em relação à farinha de goiaba (Tabela 1).
O teor de lipídeos aumentou com a incorporação de farinha de goiaba utilizada na
formulação do pão (Tabela 1), o que pode estar relacionado à maior presença deste
49
constituinte na farinha de goiaba em relação à farinha de trigo. Os valores calóricos foram
similares em ambos os pães e são similares à pães de forma comerciais.
Os teores de fibra dietética não foram investigados nos pães elaborados em virtude de
problemas analíticos encontrados ao longo das análises. No entanto, em estudo prévio do
nosso grupo de pesquisa, os teores de fibra no pão controle e em pães elaborados com
substituição parcial da farinha de trigo pela farinha de goiaba nas concentrações de 10% e
20%, foram avaliados, tendo sido observado o aumento dos teores de fibras de acordo com a
maior incorporação da farinha de goiaba (LAGO, 2014). Portanto, como os pães avaliados no
presente estudo foram elaborados com a mesma formulação e mesmos ingredientes utilizados
por Lago (2014), presume-se que o PG possua maior teor de fibra dietética quando comparado
ao PC.
5.2. Perfil e teor de compostos fenólicos
O perfil e os teores de compostos fenólicos do PC e do PG estão apresentados na
Tabela 2 de acordo com a fração em que foram encontrados. Além disso, os cromatogramas
dos compostos estão disponibilizados nos ANEXOS E a M.
Quatro compostos fenólicos foram identificados no PC (ácidos ferúlico, rosmarínico,
4-hidroxifenilacético e m-cumárico). No pão de goiaba, doze compostos fenólicos foram
identificados (ácidos ferúlico, rosmarínico, 4-hidroxifenilacético, gálico, siríngico, benzoico e
3,4-dihidroxibenzoico, e quercetina, quercetina-3-O-rutinosídeo, miricetina, miricetina-3-O-
ramnosídeo e kaempferol) (Tabela 2). O ácido 4-hidroxifenilacético foi o composto fenólico
majoritário no pão controle (69%), seguido pelo ácido ferúlico (28%). Em contrapartida, no
PG o ácido 4-hidroxifenilacético e a miricetina-3-O-ramnosídeo foram os majoritários e
corresponderam, respectivamente, a 31% e 23% do total de compostos fenólicos (Tabela 2).
Os teores totais de compostos fenólicos no PG (70,4 mg/100 g) foram cerca de 1,5
vezes maiores quando comparados aos do PC (45,9 mg/100 g) (Tabela 2). Similarmente,
outros autores também reportaram aumento dos teores de compostos fenólicos em produtos de
panificação incorporados de farinha de frutas (RUPASINGHE et al., 2008; HOYE; ROSS,
2011; SIVAM et al., 2011; SIVAM et al., 2012; HO; AZIZ; AZAHARI., 2013; RAMÍREZ-
MAGANDA et al., 2015).
50
Tabela 2. Teores (mg/100 g) de compostos fenólicos solúveis e insolúveis (hidrólise
alcalina e ácida) no pão controle (PC) e no pão de goiaba (PG) 1.
Compostos Fração solúvel Fração insolúvel Solúvel + insolúvel
PC PG PC PG PC PG
Não flavonoides
Ácido gálico nd2 1,9±0,1
a nd 4,0±0,2
a nd 5,9±0,2
a
Ácido 4-hidroxifenilacético 31,5±0,2a 19,3±1,1
b 0,1±0,0
a 2,8±0,0
b 31,6±0,0
a 22,1±1,1
b
Ácido 3,4-dihidroxibenzoico nd nd nd 1,4±0,1a nd 1,4±0,1
a
Ácido ferúlico 0,4±0,0a 0,05±0,0
b 12,3±0,8
a 4,6±0,0
b 12,7±0,8
a 4,6±0,0
b
Ácido siríngico nd nd nd 1,0±0,1a nd 1,0±0,1
a
Ácido benzoico nd nd nd 10,2±0,3a nd 10,2±0,3
a
Ácido rosmarínico nd 0,2±0,0a 0,2±0,0
a 1,1±0,0
b 0,2±0,0
a 1,2±0,0
b
Ácido m-cumárico nd nd 1,4±0,1a nd 1,4±0,1
a nd
Total não flavonoides 31,9±0,2a 21,4±1,2
b 14,0±0,9
a 25,0±0,4
b 45,9±0,7
a 46,4±0,8
a
Flavonoides
Quercetina nd 0,3±0,0a nd 0,1±0,0
a nd 0,5±0,0
a
Quercetina-3-O-rutinosídeo nd 2,4±0,1a nd 4,4±0,0
a nd 6,8±0,1
a
Miricetina nd 0,4±0,0a nd nd nd 0,4±0,0
b
Miricetina-3-O-ramnosídeo nd 0,1±0,0a nd 15,9±0,1
a nd 15,9±0,1
a
Kaempferol nd 0,3±0,1a nd 0,1±0,0
a nd 0,4±0,0
a
Total flavonoides nd 3,5±0,1a nd 20,5±0,1
a nd 24,0±0,2
a
Total de compostos fenólicos 31,9±0,2a 24,9±1,3
b 14,0±0,9
a 45,5±0,3
b 45,9±0,7
a 70,4±1,1
b
1Resultados expressos em base seca como média±DP. Letras sobrescritas na mesma linha
dentro da mesma fração indicam diferença significativa entre os pães (teste t pareado,
p<0,05). 2nd = não detectado.
Nos dois pães elaborados os compostos fenólicos da classe dos não flavonoides foram
majoritários e representaram 100% do teor total de compostos fenólicos no PC e 66% no PG
(Figura 1), não havendo diferença significativa nesses teores entre os dois pães (Tabela 2).
Segundo Nunes et al. (2016), 76% do total de compostos fenólicos da farinha de goiaba
correspondem aos flavonoides, enquanto na farinha de trigo estes representam apenas 11%
(LAGO, 2014). Portanto, o elevado teor de flavonoides no pão de goiaba pode ser explicado a
partir do perfil de compostos fenólicos da farinha de goiaba adicionada.
51
Pão controle Pão de goiaba0
20
40
60
80
100
120
Dis
trib
uiç
ão
de
co
mp
ost
os
fen
óli
co
s (%
)
Figura 1. Distribuição do total de flavonoides (■) e não flavonoides (■) no pão controle e no
pão de goiaba.
Nos alimentos, os compostos fenólicos estão presentes na forma solúvel e insolúvel, os
quais estão covalentemente ligados a componentes da parede celular por ligações ésteres
(liberados após hidrólise alcalina) ou por ligações glicosídicas (liberados após hidrólise
ácida). No presente trabalho quantificamos os teores de compostos fenólicos solúveis e
empregamos as hidrólises alcalina e ácida para quantificar os teores de compostos fenólicos
insolúveis.
Foram observados perfis distintos de distribuição dos compostos fenólicos nas frações
solúvel e insolúvel entre os pães elaborados. No PC os compostos fenólicos estão
majoritariamente presentes na fração solúvel, representando 69% do total de compostos
fenólicos, ao passo que, no PG, essa fração representou apenas 35% do total de compostos
fenólicos (Figura 2A).
52
Figura 2. Distribuição dos compostos fenólicos (A), não flavonoides (B) e flavonoides (C)
nas frações solúvel (■) e insolúvel (■) no pão controle e no pão de goiaba.
Um estudo realizado anteriormente em nosso grupo de pesquisa, que avaliou os teores
de compostos fenólicos solúveis e insolúveis na farinha de trigo e na farinha de goiaba,
relatou que, em média, 79% do total de compostos fenólicos estão presentes sob a forma
insolúvel (LAGO, 2014; NUNES et al., 2016). Similarmente, outros autores também relatam
a maior presença dos compostos fenólicos sob a forma insolúvel na farinha de trigo refinada
(ADOM et al., 2003; DINELLI et al., 2011; OKARTER; LIU, 2010; RAGAEE et al., 2011).
Entretanto, os resultados observados no presente trabalho demonstram que, no pão
controle, os compostos fenólicos estão em sua maioria presentes sob a forma solúvel, o que
sugere a ocorrência de possíveis alterações ocasionadas durante a panificação (ṤWIECA et
al., 2014). Adicionalmente, apenas os compostos da classe dos não flavonoides (Figura 2B)
foram identificados no pão controle, que são mais encontrados no alimento sob a forma
solúvel (MANACH et al., 2004; JARDINI et al., 2010).
Pão controle Pão de goiaba0
20
40
60
80
100
AD
istr
ibu
ição
de
co
mp
ost
os
fen
óli
co
s (%
)
Pão controle Pão de goiaba0
20
40
60
80
100
B
Dis
trib
uiç
ão
de
não
-fla
vo
no
ides
(%)
Pão controle Pão de goiaba0
20
40
60
80
100
C
Dis
trib
uiç
ão
de
flavo
no
ides
(%)
53
Os flavonoides foram encontrados apenas no pão de goiaba, principalmente na fração
insolúvel (Figura 2C). Esses resultados então de acordo com o perfil de distribuição dos
flavonoides em alimentos, os quais normalmente se encontram no pericarpo, ocorrendo
usualmente sob a forma conjugada (ABDEL-AAL; RABALSKI, 2013; MOTILVA et al.,
2013). Além disso, os dados encontrados corroboram os dados recentes do nosso grupo, que
demonstram o maior percentual de flavonoides na farinha de goiaba sob a forma insolúvel
(NUNES et al., 2016).
5.3. Digestão simulada in vitro
5.3.1 Etapa oral
A etapa oral da digestão simulada in vitro foi previamente analisada como parte teste
de estudos do nosso grupo e não apresentou diferença significativa no perfil de compostos
fenólicos encontrados em relação à etapa gástrica. Entretanto, de acordo com Alminger et al.
(2014) a etapa oral da digestão é importante ao avaliar alimentos ricos em carboidratos e,
portanto, optou-se por mantê-la em nossos ensaios, diferente de outros estudos nos quais esta
etapa não foi incluída (FOGLIANO et al., 2011; CHANDRASEKARA; SHAHIDI, 2012;
CORREA-BETANZO et al., 2014).
5.3.1 Etapa gástrica
Após a etapa gástrica da digestão, o teor total de compostos fenólicos observado no
PC (115,3 mg/100 g, bs) foi superior ao observado no PG (93,7 mg/100g, bs) (Figura 3).
Vale ressaltar que os teores de compostos fenólicos no PG foram superiores quando
comparados ao PC (Tabela 2). Os teores de compostos fenólicos observados após a etapa
gástrica equivalem, respectivamente, a 251% e 133% do teor inicial de compostos fenólicos
no PC e no PG. Após essa etapa da digestão, tais resultados sugerem que os compostos
fenólicos do PG apresentaram menor bioacessibilidade, quando comparados aos do PC, ou
que os mesmos foram metabolizados mais rapidamente.
54
0
50
100
150
b
Total de compostos fenólicos
a
251%
133%
mg
/10
0 g
(b
s)
Figura 3. Teores totais (mg/100 g, bs) de compostos fenólicos após a etapa gástrica da
digestão simulada in vitro do pão controle (■) e do pão de goiaba (■). Letras diferentes
indicam diferença significativa entre os pães (Teste t não-pareado, p<0,05). Os valores
expressos sobre cada coluna equivalem ao teor percentual relativo ao encontrado nos
respectivos pães.
A menor bioacessibilidade dos compostos fenólicos do PG pode ser atribuída, dentre
outros fatores, aos maiores teores de fibra dietética. A interação dos compostos fenólicos com
constituintes da matriz alimentar pode influenciar diretamente na sua bioacessibilidade,
deixando os compostos fenólicos pouco solúveis nos fluidos gastrointestinais (ALMINGER et
al., 2014). Adicionalmente esses resultados podem estar relacionados com a forma (solúvel e
insolúvel) na qual os compostos fenólicos estão presentes nos dois pães estudados. Enquanto
no PC 69% do total de compostos fenólicos estavam presentes na forma solúvel, considerada
mais bioacessível, no PG apenas 35% dos compostos fenólicos estavam presentes nessa forma
(Tabela 2).
Estudos acerca da bioacessibilidade de compostos fenólicos em produtos de
panificação são escassos na literatura e os poucos que existem não fazem distinção entre as
etapas gástrica e intestinal da digestão in vitro (ṤWIECA et al., 2013; ṤWIECA et al., 2014).
No entanto, Liyana-Pathiana & Shahidi (2005) ao avaliar a bioacessibilidade dos compostos
fenólicos do trigo, um dos principais ingredientes dos pães elaborados, observaram aumento
da bioacessibilidade dos compostos fenólicos após a etapa gástrica da digestão in vitro. Tal
fato está associado à hidrólise, provocada pelo baixo pH, levando a ruptura das estruturas
químicas dos compostos fenólicos insolúveis (BAUBLIS; DECKER; CLYDESDALE, 2000).
No pão controle foram encontrados quatro compostos fenólicos (ácidos 4-
hidroxifenilacético, ferúlico, rosmarínico e m-cumárico). Destes, à exceção do ácido
rosmarínico, que estava presente em baixo teor no pão (0,4% do total de compostos fenólicos)
55
(Tabela 2), todos os demais foram identificados após a etapa gástrica da digestão in vitro.
Além desses, outros dois compostos fenólicos foram identificados: os ácidos siríngico e
benzoico (Figura 4). No pão de goiaba, dos doze compostos fenólicos identificados (Tabela
2), somente os ácidos ferúlico e 3,4-dihidróxibenzoico e quercetina-3-O-rutinosídeo e
quercetina não foram observados após a etapa gástrica da digestão (Figura 4).
Os teores dos ácidos gálico, benzoico, m-cumárico e ferúlico após a etapa gástrica da
digestão in vitro foram superiores no PC quando comparado com o PG (Figura 4). Destes,
somente os teores dos ácidos ferúlico e m-cumárico foram superiores no PC (Tabela 2). Já os
teores dos ácidos siríngico e rosmarínico e da miricetina e miricetina-3-O-ramnosídeo foram
superiores no PG (Figura 4), todos esses estavam presentes em maior quantidade no PG em
comparação ao PC (Tabela 2).
Em ambos os pães os ácidos 4-hidroxifenilacético, benzoico e siríngico apresentaram
teores superiores no digerido em relação ao teor inicial nos pães (Figura 4). A
bioacessibilidade superior a 100% desses compostos sugere que os mesmos foram liberados
da matriz alimentar e/ou então metabolizados a partir de compostos fenólicos com estruturas
mais complexas (NØRSKOV et al., 2013). Da mesma forma, Liyana-Pathiana & Shadidi
(2005) relataram aumento significativo no conteúdo de compostos fenólicos após a etapa
gástrica da digestão de grão de trigo, sugerindo que os compostos fenólicos insolúveis podem
ser hidrolisados sob as condições empregadas na digestão gástrica.
56
Figura 4. Teores (mg/100 g, bs) de compostos fenólicos após a etapa gástrica da digestão
simulada in vitro do pão controle (■) e do pão de goiaba (■). Letras diferentes letras para um
mesmo composto indicam diferença significativa entre os pães (Teste t não-pareado, p<0,05).
Os valores expressos sobre a coluna referente a cada composto equivalem ao teor percentual
relativo ao encontrado nos respectivos pães.
A elevada bioacessibilidade do ácido benzoico após a etapa gástrica da digestão
simulada de ambos os pães (Figura 4) podem ser justificados pelo fato de esse composto ser
formado a partir de diferentes compostos aromáticos, tais como a fenilalanina e a tirosina,
provenientes das proteínas, as quais também estão presentes nos pães (MATEO ANSON et
al., 2011). Adicionalmente, já foi reportado na literatura que o ácido benzoico é metabólito
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5179%
25%
a a
b
Áci
dom
-cum
áric
o
Áci
do sir
íngic
o
mg
/10
0 g
(b
s)
Áci
do fe
rúlic
o
Áci
do ro
smar
ínic
o0.00
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
2,5%
0,3%
a
a
mg
/10
0 g
(b
s)
Mir
icet
ina
Kae
mpfe
rol
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
16%0,6%
aa
Mir
icet
ina-
3-O-r
amnos
ídeo
135%a
mg
/10
0 g
(b
s)
Áci
do gá
lico
Áci
do 4-
hidro
xife
nilacé
tico
Áci
do ben
zoic
o0
20
40
60 155% 227%a
368%
a
59%
a a
b
b
mg
/10
0 g
(b
s)
57
dos ácidos fenilpropiônico e ferúlico (MATEO ANSON et al., 2011). Além disso, o ácido
benzoico é estrutura básica de diferentes ácidos fenólicos como os ácidos gálico, vanílico,
siríngico, protocatecuico e p-hidróxibenzoico (MANACH, 2004; NØRSKOV et al., 2013).
Portanto, acredita-se que esse ácido possa ser obtido a partir da clivagem dos mesmos e
consequentemente ter os seus teores aumentados após essa etapa da digestão. Vale ressaltar
que alguns compostos fenólicos não foram avaliados na presente matriz alimentar devido à
indisponibilidade de padrões analíticos no laboratório e, portanto, não é possível afirmar a
ausência dos mesmos. Logo, compostos que poderiam resultar na elevação de teores do ácido
benzoico, por exemplo, podem não estar discriminados no presente trabalho.
O ácido gálico, que não estava presente no PC, foi observado após a etapa gástrica da
digestão simulada (Figura 4). Similar ao relatado para o ácido benzoico, o acido gálico pode
ter sido clivado de outros compostos fenólicos com estrutura mais complexa. Após a digestão
do PG, a bioacessibilidade do ácido gálico foi de 59% (Figura 4). Vale ressaltar que esse
composto foi identificado no PG estando presente em maior parte (69%) na fração insolúvel,
o que pode justificar sua menor bioacessibilidade.
Os ácidos ferúlico, m-cumárico e rosmarínico apresentaram baixa bioacessibilidade
em ambos os pães (até 25%) (Figura 4). Os resultados referentes ao ácido ferúlico
corroboram estudo prévio descrito na literatura, no qual foi avaliada a bioacessibilidade deste
composto em diferentes matrizes alimentares (aleurona, farelo de trigo, farinha de trigo
refinada, pão enriquecido com aleurona, pão enriquecido com padrão comercial de ácido
ferúlico e pão elaborado com farinha de trigo refinada). A bioacessibilidade do ácido ferúlico
de todas as amostras foi, em média, de 0,5%, à exceção do pão enriquecido com o padrão
comercial de ácido ferúlico, no qual foi observada maior bioacessibilidade (60%) (MATEO
ANSON et al., 2009). Adicionalmente, tal resultado demonstra o efeito da matriz alimentar na
bioacessibilidade do acido ferúlico.
Nos alimentos, o ácido ferúlico está principalmente conjugado a arabinoxilanas e à
parede celular de outros polissacarídeos, que são resistentes à digestão gástrica, o que pode
justificar a sua baixa bioacessibilidade (MATEO ANSON et al., 2009). De fato, em ambos os
pães, o ácido ferúlico está presente principalmente sob a forma insolúvel (98%, em média) e,
além disso, uma possível via metabólica deste ácido aponta a quebra de sua molécula original
e perda de hidroxilas, levando à formação de diferentes metabólitos, inclusive o ácido
benzoico (MATEO ANSON et al., 2011).
Dentre os flavonoides do PG, apenas a miricetina apresentou bioacessibilidade acima
de 100% (135%) (Figura 4). A quercetina e a quercetina-3-O-rutinosídeo não foram
58
bioacessíveis após a etapa gástrica da digestão e a miricetina-3-O-ramnosídeo e o kaempferol
apresentaram baixa bioacessibilidade (até 16%). Esses resultados são diferentes dos relatados
por Vallejo et al. (2004), que estudaram a bioacessibilidade dos flavonoides presentes no
brócolis e apontaram não haver perdas, em relação aos teores no alimento, após a digestão
gástrica da digestão simulada. Entretanto, as divergências dos resultados podem estar
associadas às diferentes matrizes alimentares analisadas.
A não bioacessibilidade da quercetina e da quercetina-3-O-rutinosídeo pode ser
atribuída à forma na qual esses compostos estão presentes na matriz alimentar e/ou ao seu
metabolismo, que pode gerar diferentes metabólitos, inclusive os ácidos fenólicos. Ressalta-se
que a quercetina estava presente em baixos teores no PG (0,7% do teor total de compostos
fenólicos), o que pode justificar a sua ausência após a etapa gástrica. No que se refere a
quercetina-3-O-rutinosídeo, a mesma também estava presente em baixos teores no PG (9,7%
do teor total de compostos fenólicos), estando presente principalmente sob a forma conjugada
(65%). Adicionalmente, durante sua metabolização a quercetina-3-O-rutinosídeo poderia
sofrer desglicosilação gerando a quercetina. Esta, por sua vez, poderia sofrer fissão de seu
anel aromático, gerando o ácido 3,4-dihidroxifenilacético, o qual pode perder uma hidroxila e
formar os ácidos 3-hidroxifenilacético e 4-hidroxifenilacético (CROZIER; DEL RIO;
CLIFFORD, 2010; SERRA et al., 2012). A elevada bioacessibilidade do ácido 4-
hidroxifenilacético após a etapa gástrica da digestão do PG (227%) (Figura 4) poderia
também estar relacionada a essa possível rota de metabolização dos flavonoides.
Adicionalmente, outros flavonoides podem ser metabolizados e originar o ácido 4-
hidroxifenilacético (SERRA et al., 2012). Diferentes flavonoides, dos quais não havia
disponibilidade de padrões analíticos, já foram identificados na goiaba (NUNES et al., 2016;
FLORES et al., 2015).
5.3.1 Etapa intestinal
Diferente da etapa gástrica, não houve diferença significativa entre o teor total de
compostos fenólicos no PC (263,4 mg/100 g, bs) e no PG (276,7 mg/100 g, bs) nesta etapa da
digestão (Figura 5). Esses teores equivalem a 574% e 393%, respectivamente, do teor inicial
de compostos fenólicos do PC e do PG. Ainda assim, estes resultados corroboram os
observados após a etapa gástrica da digestão simulada, em que o PG apresenta novamente
menor bioacessibilidade ou mais rápida metabolização dos compostos fenólicos. É possível
também atribuir aos maiores teores de fibra dietética desta matriz alimentar ou então à forma
59
na qual os compostos fenólicos estão presentes no PG (preferencialmente sob a forma
insolúvel), o que pode deixá-los pouco solúveis nos fluidos gastrointestinais (ALMINGER et
al., 2014).
Figura 5. Teores totais (mg/100 g, bs) de compostos fenólicos após a etapa intestinal da
digestão simulada in vitro do pão controle (■) e do pão de goiaba (■). Letras diferentes
indicam diferença significativa entre os pães (Teste t não-pareado, p<0,05). Os valores
expressos sobre cada coluna equivalem ao teor percentual relativo ao encontrado nos
respectivos pães.
Os resultados obtidos no presente estudo foram diferentes da expectativa, apontando
maior bioacessibilidade dos compostos fenólicos do PC em relação ao PG. O fato de a matriz
alimentar com o maior teor de compostos fenólicos apresentar menor bioacessibilidade pode
estar associado às diferentes interações entre os compostos provenientes da goiaba e a matriz
alimentar em questão (OZDAL; CAPANOGLU; ALTAY, 2013). Além disso, interações
entre compostos fenólicos e enzimas digestivas são conhecidas por modificar as propriedades
físico-químicas e estruturais desses compostos, o que, consequentemente, pode resultar em
redução da atividade enzimática e da bioacessibilidade (ṤWIECA et al., 2014).
Os compostos fenólicos identificados após a etapa gástrica da digestão in vitro estão
apresentados na Figura 6 e também foram observados após a etapa intestinal, à exceção do
ácido ferúlico no PC e do kaempferol e da miricetina-3-O-ramnosídeo no PG, que não foram
observados após essa etapa da digestão simulada. Além destes, a quercetina-3-O-rutinosídeo,
que não havia sido identificada após a etapa gástrica, foi encontrada no PG após a etapa
intestinal (Figura 6).
0
100
200
300
400
393%
a574%
a
Total de compostos fenólicos
mg
/10
0 g
(b
s)
60
Figura 6. Teores (mg/100 g, bs) de compostos fenólicos após a etapa intestinal da digestão
simulada in vitro do pão controle (■) e do pão de goiaba (■). Letras diferentes letras para um
mesmo composto indicam diferença significativa entre os pães (Teste t não-pareado, p<0,05). Os valores expressos sobre cada coluna equivalem ao teor percentual relativo ao encontrado
nos respectivos pães.
Após a etapa intestinal da digestão apenas os teores do ácido 4-hidroxifenilacético
foram semelhantes entre os pães, ao passo que os teores dos ácidos benzoico, siríngico e m-
cumárico foram superiores no PC. No PG foram encontrados maiores teores de ácido gálico e
rosmarínico, além da presença dos flavonoides, encontrados apenas nesta matriz alimentar
(Figura 6).
Áci
do sirí
ngico
Áci
do ro
smar
ínic
o
0.0
0.5
1.0
1.5
19%
69%
a
b
a
a
4%
Áci
dom
-cum
áric
o
mg
/10
0 g
(b
s)
Mir
icet
ina
0.0
0.5
1.0
1.5
152%
0,2%
Mir
icet
ina-
3-O-r
amnos
ídeo
Quer
ceti
na-3-O
-ruti
nosídeo
15%
a
a
a
mg
/10
0 g
(b
s)
Áci
do gá
lico
Áci
do 4-
hidro
xife
nilacé
tico
Áci
do ben
zoic
o
0
40
80
120
160
200
240 610%973%
313%
a
470%
aa
a
bb
mg
/10
0 g
(b
s)
61
O processo de digestão simulada in vitro foi realizado em duas etapas independentes.
Porém, os resultados apresentados após a etapa intestinal também representam parcialmente
aqueles obtidos na etapa gástrica da digestão simulada in vitro. Portanto, a fim de encontrar o
resultado mais fidedigno da etapa intestinal na bioacessibilidade dos compostos fenólicos dos
pães, faz-se necessário subtrair os teores de compostos fenólicos observados nesta segunda
etapa dos valores encontrados após a primeira. Esses cálculos foram realizados e estão
apresentados na Figura 7, que mostra a variação absoluta dos percentuais de
bioacessibilidade entre as etapas gástrica e intestinal.
Os ácidos ferúlico, m-cumárico e rosmarínico apresentaram variação relativamente
pequena após a etapa intestinal da digestão (Figura 7A). Vale ressaltar que esses foram os
compostos menos bioacessíveis em ambas as etapas da digestão simulada e que os mesmos
estavam presentes em baixos teores nos pães e a maior parte sob a forma insolúvel (Tabela
2). O ácido siríngico não apresentou o mesmo padrão de comportamento entre os pães.
Observou-se um aumento da sua bioacessibilidade após a etapa intestinal da digestão
simulada no PC, matriz na qual esse composto não tinha sido identificado, ao passo que sua
bioacessibilidade foi reduzida no PG (Figura 7A). Estes resultados podem ser justificados
pelo fato de este composto ter sido observado apenas na fração insolúvel do PG, ou seja,
ligado a componentes da parede celular por ligações mais difíceis de romper.
62
Figura 7. Variação absoluta (mg/100 g, bs) dos teores de compostos fenólicos entre as etapas
gástrica e intestinal da digestão simulada in vitro do pão controle (■) e do pão de goiaba (■).
Os valores expressos em percentual sobre cada coluna equivalem a variação relativa à etapa
gástrica da digestão simulada in vitro.
A bioacessibilidade dos ácidos gálico e 4-hidroxifenilacético aumentou após a etapa
intestinal da digestão simulada (Figura 7B). Assim como na etapa gástrica, a
bioacessibilidade superior a 100% desses compostos sugere que os mesmos foram liberados
da matriz alimentar ou então metabolizados a partir de compostos fenólicos com estruturas
mais complexas (NØRSKOV et al., 2013). Sabe-se também que o ácido 4-hidroxifenilacético
Áci
do fe
rúlic
o
Áci
do ro
smar
ínic
o
Áci
do sirí
ngico
-1.5
-1.0
-0.5
0.0
0.5
1.0
1.5
-6%
1,6%
-110%
Áci
dom
-cum
áric
o
-0,3%
A
Varia
ção
ab
solu
ta
(mg
/10
0 g
, b
s)
Mir
icet
ina
Kae
mpfe
rol
-0.5
0.0
0.5
1.0
1.5
18%
15%
Mir
icet
ina-
3-O-r
amnos
ídeo
Quer
ceti
na-3-O
-ruti
nosídeo
-15%-0,4%
C
Varia
ção
ab
solu
ta
(mg
/10
0 g
, b
s)
0
50
100
150
200
323%
260%
Total de compostos fenólicos
D
Varia
ção
ab
solu
ta
(mg
/10
0 g
, b
s)
Áci
do gá
lico
Áci
do 4-
hidro
xife
nilacé
tico
Áci
do ben
zoic
o
-50
0
50
100
150
200
455%
411%
746%
-55%
B
Varia
ção
ab
solu
ta
(mg
/10
0 g
, b
s)
63
pode ser um metabólito comum de diferentes compostos fenólicos encontrados nesta matriz
alimentar como, por exemplo, os flavonoides (CROZIER; DEL RIO; CLIFFORD, 2010;
SERRA et al., 2012).
O ácido gálico é o ácido fenólico mais comum dessa classe de compostos e ocorre
comumente na forma de complexos ésteres de açúcar, como os galotaninos (DEL RIO et al.,
2013). Portanto, a maior bioacessibilidade do ácido gálico no PG em relação ao PC (Figura
7B) pode estar associado à presença das galocatequinas na goiaba, composto não identificado
neste trabalho devido à ausência do padrão comercial no laboratório de análise, porém já
relatado em outro estudo (FLORES et al., 2015). Já foi observado na literatura que as
galocatequinas podem ser parcialmente hidrolisadas e formar ácido gálico (TAKAGAKI;
NANJO, 2015). Além disso, o aumento deste composto em ambos os pães também pode estar
associado à sua estrutura química, comum a diversos compostos como, por exemplo, a
miricetina e a miricetina-3-O-ramnosídeo.
A bioacessibilidade do ácido benzoico após a etapa intestinal da digestão do PC não
apresentou diferença significativa em relação à etapa gástrica (Figura 7B). Porém, ao
analisarmos no PG, observa-se redução da sua bioacessibilidade após a etapa intestinal da
digestão (Figura 7B), o que pode estar associado a elevação de outros compostos que podem
ser seus metabólitos, tais como o ácido gálico e o ácido 4-hidroxifenilacético.
Em relação aos flavonoides, presentes apenas no PG, houve um aumento significativo
dos teores da miricetina e da quercetina-3-O-rutinosídeo após a etapa intestinal em relação à
etapa gástrica, apontando que esses compostos foram mais bioacessíveis (Figura 7C).
Entretanto, houve redução da bioacessibilidade do kaempferol e da miricetina-3-O-
ramnosídeo após a etapa intestinal da digestão in vitro (Figura 7C).
O aumento da bioacessibilidade da miricetina após a etapa intestinal da digestão do
PG pode ser atribuída a desglicosilação da miricetina-3-O-ramnosídeo. A redução dos teores
desta forma glicosilada corrobora a hipótese sugerida. De acordo com a via metabólica destes
compostos, é possível ainda, que a miricetina e suas formas glicosiladas formem diferentes
metabólitos, como os ácidos 3-hidroxifenilacético e 4-hidroxifenilacético, justificando o
aumento deste último composto (SERRA et al., 2012).
A maior bioacessibilidade da quercetina-3-O-rutinosídeo pode ser justificada pela
liberação das formas glicosiladas de quercetina, as quais ocorrem no intestino com maior
eficiência do que as formas agliconas (MANACH et al., 2005). Alguns mecanismos pelos
quais a glicosilação facilita a absorção da quercetina foram propostos (HOLLMAN et al.,
1995; DAY et al., 2000). Entretanto, não foram aplicáveis à absorção da quercetina-3-O-
64
rutinosídeo. A liberação deste flavonoide da matriz alimentar após a etapa intestinal pode
também estar associada à forma insolúvel em que foi mais encontrado no PG. Uma vez que a
etapa intestinal é a continuação da gástrica, pode haver maior liberação de compostos e
quebra de componentes da matriz alimentar.
Em relação ao teor total de compostos fenólicos em ambos os pães, os resultados
encontrados corroboram com demais estudos em que o teor total destes aumentou após a
etapa intestinal da digestão simulada (Figura 7D). Isso porque, sabe-se que o pH e o processo
de digestão resultam na hidrólise do amido, proteólise e liberação de compostos fenólicos de
sua forma conjugada e da parede celular de matriz alimentar. Este processo é muito
importante, uma vez que os nutrientes e não nutrientes estão na sua forma simples
(aminoácidos, ácidos graxos e açúcares simples) antes da absorção pela parede intestinal
(SZAWARA-NOWAK; BĄCZEK; ZIELIŃSKI, 2016).
5.4. Fermentação colônica ex vivo
As amostras do pool de fezes obtidas foram analisadas previamente à adição das
frações digeridas e cinco compostos fenólicos foram identificados (kaempferol e ácidos 4-
hidroxifenilacético, siríngico, benzoico e rosmarínico). Essas amostras foram consideradas
como controle. Os teores obtidos de compostos fenólicos foram descontados dos resultados
obtidos em cada tempo da fermentação colônica.
O perfil dos compostos fenólicos ao longo das 72 horas de fermentação foi
apresentado na Figura 8 e foi semelhante nos pães controle e de goiaba e, de maneira geral,
os teores totais de compostos fenólicos aumentaram ao longo das 72 horas de fermentação
colônica. Similar ao observado após as etapas gástrica e intestinal da digestão simulada in
vitro, a bioacessibilidade dos compostos fenólicos presentes no PC foi maior quando
comparada ao PG.
65
Figura 8. Teores totais (mg/100 g, bs) dos compostos fenólicos após 4 h, 24 h, 48 h e 72 h de
fermentação colônica do pão controle (■) e do pão de goiaba (■). Os valores expressos sobre
cada ponto equivalem ao teor percentual relativo ao encontrado na etapa intestinal da digestão
simulada in vitro.
O aumento da bioacessibilidade dos compostos fenólicos após a fermentação pode
estar associado à presença de fibra dietética em ambos os pães. Segundo Nordlund, Aura e
Matilla (2012) esse componente alimentar carreia os compostos fenólicos até o cólon, onde
são liberados da matriz alimentar e, então, convertidos em metabólitos dos ácidos
fenilpropiônico, fenilacético e benzoico. A maior bioacessibilidade nesta etapa dos compostos
fenólicos presentes no PG pode ter ocorrido em virtude do maior teor de fibras alimentares
bem como pelo perfil de sua distribuição (preferencialmente sob a forma insolúvel), o que
dificulta a liberação desses compostos da matriz alimentar (ALMINGER et al., 2014).
Adicionalmente, Hiller et al. (2011) constataram que pães com maiores teores de fibra
alimentar promoveram diminuição da atividade de enzimas bacterianas fecais e,
consequentemente, redução da taxa de metabolização dos compostos fenólicos.
Além dessas hipóteses, outros estudos apontam para a possível interação (covalente e
não covalente) entre os compostos fenólicos de alimentos e a proteína do trigo (OZDAL;
CAPANOGLU; ALTAY, 2013; ṤWIECA et al., 2014), o que pode justificar a menor
bioacessibilidade dos compostos fenólicos do PG quando comparado ao do PC.
De outro pronto de vista, de acordo com Manach et al. (2004), os compostos fenólicos,
de maneira geral, não são absorvidos no intestino delgado e alcançam o cólon, permitindo que
a microbiota hidrolise as formas glicosídicas, gerando agliconas e, por fim, metabolizando-as
extensivamente em diversos compostos aromáticos de baixo peso molecular, tais como ácidos
hidroxifenilacéticos, hidroxifenilpropiônicos e fenilenteorolactonas. Em seguida, esses
compostos podem ainda ser metabolizados em diferentes derivados do ácido benzoico.
0 12 24 36 48 60 720
500
1000
1500
Tempo de fermentação (h)
272%
394%
467% 452%
124%
293%317%
257%
To
tal
de
com
po
sto
s fe
nó
lico
s
(mg
/10
0 g
, b
s)
66
No PC foram identificados cinco compostos fenólicos durante a fermentação colônica,
sendo eles: ácidos gálico, 4-hidroxifenilacético, siríngico, benzoico e rosmarínico. Já no PG,
foram identificados sete compostos fenólicos nesta etapa, sendo os mesmos seis encontrados
no PC e os flavonoides kaempferol e miricetina. No PC todos os compostos fenólicos
identificados nesta etapa, com exceção do ácido rosmarínico, foram também observados após
a etapa intestinal da digestão in vitro. No PG todos os compostos identificados nesta etapa
também foram identificados na etapa anterior, exceto o kaempferol. De maneira geral, os
compostos fenólicos apresentaram-se mais bioacessíveis, exceto os ácidos siríngico e a
miricetina.
Os resultados encontrados no presente trabalho corroboram a literatura, que aponta a
extensa metabolização dos compostos fenólicos encontrados em diferentes matrizes
alimentares, gerando especialmente os ácidos benzoico, gálico e 4-hidroxifenilacético
(MANACH et al., 2004; SANCHEZ-PÁTAN et al., 2015) (Figura 9).
No PC, o ácido gálico apresentou perfil diferente dos demais compostos identificados,
visto que teve uma redução significativa no tempo de 24 horas seguido de aumento dos teores
nos tempos seguintes (Figura 9A). Sánchez-Patán et al. (2015) ao estudar a fermentação
colônica de extrato de semente de uva notaram degradação do ácido gálico após 24 horas,
comportamento semelhante ao encontrado no presente trabalho, podendo indicar a degradação
e metabolização dos compostos provenientes da fase intestinal. Entretanto, os picos elevados
nos horários seguintes podem apontar para a metabolização de outros compostos que não
haviam sido liberados da matriz alimentar até então.
Pimpão et al. (2014) ao avaliar os metabólitos de compostos fenólicos na urina de
voluntários após a ingestão de um purê de frutas relataram que a absorção e a eliminação do
ácido gálico é rápida, sendo o pico dos metabólitos de fase II observados entre 2 e 4 horas. No
entanto, as formas conjugadas do ácido gálico ainda foram observadas na urina entre 8 e 24
horas após a ingestão do purê, sugerindo a degradação de compostos como ésteres de ácido
gálico, além da quebra de outros compostos fenólicos, como as antocianinas pela microbiota
colônica.
67
Figura 9. Teores (mg/100 g, bs) dos compostos fenólicos após 4 h, 24 h, 48 h e 72 h de
fermentação colônica do pão controle (■) e do pão de goiaba (■). Os valores expressos sobre
cada ponto equivalem ao teor percentual relativo ao encontrado na etapa intestinal da digestão
simulada in vitro. Ácido gálico (A), ácido 4-hidroxifenilacético (B) e ácido benzoico (C).
No presente estudo, apesar da diferença na matriz alimentar, os resultados podem ter
justificativa semelhante, em que o ácido gálico continua a ser produzido e tem os seus teores
elevados devido à extensa metabolização dos compostos fenólicos presentes inicialmente nos
pães. No PG, os elevados teores de ácido gálico encontrados durante a fermentação colônica
(Figura 9A) podem ser justificados pela metabolização contínua das galocatequinas, já
relatadas na goiaba (FLORES et al., 2015) porém não identificadas neste estudo devido à
ausência de padrão comercial no laboratório de análise.
De forma semelhante, foi relatado por Mosele et al. (2015) que a degradação dos
galotaninos do Arbutus unedo continuou na presença da microbiota humana, gerando acúmulo
de ácido gálico nos primeiros estágios de fermentação. Os metabólitos microbianos dos
galotaninos do estudo em questão foram os ácidos gálico, protocatecuico e p-hidroxibenzoico.
0 12 24 36 48 60 720
200
400
600
800A
236%
360%
390%
345%
Tempo de fermentação (h)
146%
266%
211%
247%
Áci
do
4-h
idro
xif
enil
acé
tico
(m
g/1
00 g
, b
s)
0 12 24 36 48 60 720
100
200
300
400
Tempo de fermentação (h)
B
131%
561% 578%604%
90%230% 254%
64%
Áci
do
ben
zóic
o
(m
g/1
00 g
, b
s)
0 12 24 36 48 60 720
100
200
300
400
Tempo de fermentação (h)
C
1031%
322%
978%
1162%
590%
1220%
570%Áci
do
gáli
co
(m
g/1
00 g
, b
s)
68
É possível também que estes outros metabólitos sejam gerados pelas galocatequinas, porém
não foram avaliados devido à ausência do padrão comercial no laboratório de análise.
A bioacessibilidade do ácido 4-hidroxifenilacético, aumentou durante a fermentação
colônica em ambos os pães, sendo esta maior no PC do que no PG (Figura 9B). A sua
bioacessibilidade atingiu maior percentual em 48 h e 24 h, respectivamente, após a incubação
com o PC e o PG. Após esses períodos foi observada uma redução na bioacessibilidade, que
se manteve superior a 200% em relação ao encontrado na etapa intestinal.
Os ácidos fenilacéticos são os principais metabólitos colônicos dos flavonóis, o que
pode justificar a sua elevada bioacessibilidade após a fermentação colônica. Entretanto, não
são apenas estes compostos que podem gerar os ácidos fenilacéticos como metabólitos, mas
também os derivados de ácido ferúlico e cafeico, por exemplo, o que poderia também
justificar o aumento da bioacessibilidade do 4-hidroxifenilacético no PC (Figura 9B)
(NORDLUND et al., 2012).
Os resultados encontrados para o ácido benzoico apontaram elevada bioacessibilidade
deste composto após a fermentação colônica (Figura 9C). Estes dados corroboram o descrito
na literatura, em que os derivados de ácido benzoico foram encontrados como o segundo
principal metabólito colônico do farelo de trigo, centeio e aveia (NORDLUND et al., 2012).
Além disso, os ácidos ferúlico e cafeico podem ser desesterificados a ácido 3-(3-hidroxifenil)-
propiônico e em seguida ser β-oxidado à ácido benzoico (NØRSKOV et al., 2013). Os
maiores teores deste composto no PC em relação ao PG podem também ser atribuídos a este
fato, visto que a primeira matriz alimentar possui maiores teores de farinha de trigo, bem
como de ácido ferúlico (Tabela 2).
O ácido rosmarínico apresentou elevada bioacessibilidade em ambos os pães, visto que
ultrapassou os 400% no PG e, no PC, esse composto não havia sido encontrado após a etapa
intestinal (Figura 10A). Este fato pode estar relacionado à forma em que esse ácido está
presente em ambas as matrizes alimentares, nas quais foi encontrado principalmente na fração
insolúvel.
69
Figura 10. Teores (mg/100 g, bs) dos compostos fenólicos após 4 h, 24 h, 48 h e 72 h de
fermentação colônica do pão controle (■) e do pão de goiaba (■). Os valores expressos sobre
cada ponto equivalem ao teor percentual relativo ao encontrado na etapa intestinal da digestão
simulada in vitro. Ácido rosmarínico (A), ácido siríngico (B), kaempferol (C) miricetina (D).
No PG foram encontrados dois flavonoides após a fermentação colônica, sendo eles o
kaempferol e a miricetina (Figura 10 C e D), dos quais apenas a última havia sido
identificada após a etapa intestinal da digestão simulada in vitro. Os demais flavonoides
encontrados na última etapa da digestão (quercetina-3-O-rutinosídeo e miricetina-3-O-
ramnosídeo) não foram observados após a fermentação colônica. Ainda assim, a
bioacessibilidade dos flavonóides encontrados foi baixa (26% a 48%) (Figura 10D).
A identificação do kaempferol, que não estava presente após a digestão simulada in
vitro, pode estar relacionada a possível quebra de compostos fenólicos com estruturas
moleculares complexas como a isoharmetina-3-O-glicosídeo, composto não identificado no
presente estudo por falta de padrões analíticos no laboratório, porém já relatado na goiaba
(JOSLINE; SALIB; MICHAEL, 2004; FLORES et al., 2015). Du, Zhao e Xu (2014) ao
analisarem os metabólitos da isoharmetina-3-O-glicosídeo produzidos pela flora intestinal
0 12 24 36 48 60 720.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
Tempo de fermentação (h)
A
414%563% 540% 537%
Áci
do
ro
smarí
nic
o
(m
g/1
00 g
, b
s)
0 12 24 36 48 60 720
1
2
3
4
Tempo de fermentação (h)
B
69%
224%
256%258%
15%48%
Áci
do
sir
íngic
o
(m
g/1
00 g
, b
s)
0 12 24 36 48 60 720.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
Tempo de fermentação (h)
C
Kaem
pfe
rol
(m
g/1
00 g
, b
s)
0 12 24 36 48 60 720.0
0.2
0.4
0.6
0.8
Tempo de fermentação (h)
D
48%40%
26%
46%
Mir
icet
ina
(m
g/1
00 g
, b
s)
70
encontraram cinco metabólitos e, entre eles, o kaempferol. As possíveis vias metabólicas para
este processo são desglicosilação, gerando isoharmetina, seguida de demetilação, formando o
kaempferol ou o processo inverso, ocorrendo uma demetilação, seguida de desglicosilação.
O fato de os flavonoides quercetina-3-O-rutinosídeo e miricetina-3-O-ramnosídeo
serem identificados após a etapa intestinal da digestão in vitro, e não após a fermentação
colônica pode ser justificado pela possível metabolização destes compostos a metabólitos de
baixo peso molecular, como os ácidos 3-dihidroxifenilacético e 4-hidróxifenilacético
(CROZIER; DEL RIO; CLIFFORD, 2010; SERRA et al., 2012), o que estaria de acordo com
o aumento da bioacessibilidade deste último após a fermentação colônica dos dois pães. De
acordo com Del Rio et al. (2011) uma possível via de transformação catalisada pelas bactérias
colônicas seria a desglicosilação da quercetina-3-O-rutinosídeo, levando a formação da
quercetina e consequente fissão do seu anel e a geração do metabólito 3,4-
dihidroxifenilacético. Por fim, este metabólito está passível de perder uma hidroxila e formar
o ácido 4-hidroxifenilacético. Do mesmo modo, é possível que a miricetina-3-O-ramnosídeo
encontrada no PG tenha também sofrido desglicosilação e por isso apenas a sua forma
aglicona tenha sido encontrada.
71
CONCLUSÕES
72
A caracterização do perfil de compostos fenólicos de ambos os pães foi relevante para
a compreensão dos resultados encontrados após as etapas de digestão in vitro e da
fermentação colônica. A forma (solúvel e/ou insolúvel) na qual os compostos fenólicos estão
presentes nos alimentos estudados parece ter influenciado sua bioacessibilidade e sua
fermentação colônica, sendo, em geral, os compostos fenólicos insolúveis menos
bioacessíveis. Apesar disso, os compostos fenólicos dos pães apresentaram elevada
bioacessibilidade.
Em sua maioria, os compostos fenólicos foram extensamente metabolizados nas etapas
de digestão simulada in vitro e também na fermentação colônica por ação da microbiota. Os
ácidos gálico, 4-hidroxifenilacético e benzoico apresentaram elevada bioacessibilidade após
as etapas de digestão in vitro e de fermentação, sugerindo que os mesmos são formados a
partir de reações de desglicosilação e desidroxilação, por exemplo, de compostos mais
complexos, tais como as formas glicosiladas dos flavonóis. Dentre os flavonoides, a
miricetina, identificada apenas no pão de goiaba, apresentou maior bioacessibilidade após a
etapa intestinal da digestão simulada (152%), sendo reduzida (em torno de 40%) após a
fermentação colônica. As vias metabólicas de alguns dos compostos fenólicos presentes nos
pães são apresentadas de maneira esquemática nas Figuras 11 a 13.
Os compostos fenólicos observados após a fermentação colônica podem exercer
efeitos benéficos locais bem como sistêmica, uma vez que podem ser reabsorvidos. Embora
os resultados in vitro e ex vivo observados no presente trabalho não possam ser diretamente
relacionados com as condições in vivo, esses dados fornecem evidências de que o pão pode
ser uma ferramenta útil para ser empregada para aumentar a ingestão dietética de compostos
fenólicos pela população.
73
Figura 11. Representação esquemática da via metabólica da quercetina-3-O-
rutinosídeo e da quercetina presentes no pão de goiaba. As setas vermelhas e verdes
representam, respectivamente, diminuição e aumento dos compostos em comparação
com o pão de goiaba. As setas tracejadas representam possíveis vias metabólicas, já
descritas para outros alimentos, mas não observadas no presente trabalho. O símbolo
representa metabólitos já descritos na literatura, mas não identificados no
presente estudo.
% de variação: (-100/-75%) (-75/-50%) (-50/-25%) (-25/-0%)
Pã
o d
e g
oia
ba
Est
ôm
ag
oIn
test
ino
Có
lon
Ácido 3,4-dihidroxifenilacético
Desglicosilação
Quercetina-3-O-rutinosídeo
OH
OH
O
O
O
OH
OH
Rutinose
OH
OH
O
OH
O
OH
OH
OH
OH
O
O
O
OH
OH
Rutinose
Quercetina-3-O-rutinosídeo Quercetina
OH
OH
O
OH
O
OH
OH
Quercetina
OH
OH
O
O
O
OH
OH
Rutinose
Quercetina-3-O-rutinosídeo
OH
OH
O
OH
O
OH
OH
Quercetina
OH
OH
O
O
O
OH
OH
Rutinose
Quercetina-3-O-rutinosídeo
OH
OH
O
OH
O
OH
OH
Quercetina
OH
OH
OH
O
Ácido 4-hidroxifenilacético
Fissão do anel C
Desidroxilação
OH
OH
O
74
Figura 12. Representação esquemática da via metabólica da miricetina-3-O-
raminosídeo e da miricetina presentes no pão de goiaba. As setas vermelhas
representam diminuição dos compostos em comparação com o pão de goiaba. As setas
tracejadas representam possíveis vias metabólicas, já descritas para outros alimentos,
mas não observadas no presente trabalho.% de variação: (-100/-75%) (-75/-50%) (-50/-25%) (-25/-0%)
Pão d
e goia
ba
Miricetina
Est
ôm
ago
Inte
stin
oC
ólo
nOH
OH
OHO
O
O
OH
OHRaminose
OH
OH
O
OH
O
OH
OH
OH
Miricetina-3-O-raminosídeo
Miricetina
OH
OH
OHO
O
O
OH
OHRaminose
OH
OH
O
OH
O
OH
OH
OH
Miricetina-3-O-raminosídeo
Miricetina
OH
OH
OHO
O
O
OH
OHRaminose
OH
OH
O
OH
O
OH
OH
OH
Miricetina-3-O-raminosídeo
Desglicosilação
OH
OH
OHO
O
O
OH
OHRaminose
Miricetina-3-O-raminosídeo Miricetina
OH
OH
O
OH
O
OH
OH
OH
OH OH
O
OH
OH
Fissão do anel C
Ácido 3,4,5-trihidroxifenilacético
Desidroxilação
Ácido 4-hidroxifenilacético
OH
OH
O
Desglicosilação
Ácido gálico
OH
O
OH
OH
OH
75
Figura 13. Representação esquemática da via metabólica do ácido gálico
presente no pão controle e no pão de goiaba. As setas vermelhas e verdes
representam, respectivamente, diminuição e aumento dos compostos em
comparação com os pães. As setas tracejadas representam possíveis vias
metabólicas, já descritas para outros alimentos, mas não observadas no
presente trabalho. % de variação:
(-100/-75%) (-75/-50%) (-50/-25%) (-25/-0%)
(100/125%) (125/150%) (150/200%) (>200%)
Pã
o d
e g
oia
ba
Est
ôm
ag
oIn
test
ino
Cólo
n
Ácido gálico
OH
O
OH
OH
OH
Ácido gálico
OH
O
OH
OH
OH
Ácido gálico
OH
O
OH
OH
OH
Ácido gálico
OH
O
OH
OH
OH
Galocatequinas
Desidroxilação
Ácido gálico
OH
O
OH
OH
OH
Pão co
ntro
le
OH
O
Ácido benzóico
Ácido gálico
OH
O
OH
OH
OH
Ácido gálico
OH
O
OH
OH
OH
Desidroxilação
OH
O
Ácido benzóico
Outros compostos fenólicos
com estrutura mais complexa
76
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85
ANEXOS
86
ANEXO A – INSTRUÇÃO PARA DOAÇÃO ESPONTÂNEA DE FEZES
Instruções para doação espontânea de fezes
O doador não deve consumir os seguintes alimentos nas 48 horas precedentes à coleta:
- Pães;
- Alimentos à base de farinha de trigo (macarrão, pizza, massas em geral)
- Frutas em geral e seus derivados, (principalmente goiaba);
- Bebidas alcoólicas.
A coleta das fezes deve ser realizada necessariamente pela manhã e entregue o mais rápido
possível (até 2 horas depois).
Qualquer dúvida entrar em contato.
Muito obrigada pela sua colaboração.
Isabel Vieira
(21) 98667-7021 (telefone ou Whatsapp)
87
ANEXO B – TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Universidade Federal do Rio de Janeiro
Instituto de Nutrição Josué de Castro
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO (TCLE)
Trabalho de pesquisa: “Digestão in vitro e fermentação colônica de compostos fenólicos
presentes no pão de goiaba”
Você está sendo convidado (a) a participar como voluntário (a) de uma pesquisa cujo objetivo
é investigar as mudanças que componentes naturalmente presentes no pão e em pão
enriquecido com farinha de goiaba sofrem quando em contato com fezes. Este estudo está
sendo realizado pela nutricionista e mestranda do Programa de Pós-Graduação em Nutrição
(UFRJ), Isabel Pinto Vieira, sob orientação da Prof. Dra Mariana Monteiro do Instituto de
Nutrição da UFRJ.
Participando deste estudo, dois dias antes de uma coleta de fezes você será orientado a:
Não consumir frutas em geral e seus derivados (principalmente goiaba), pães em
geral, alimentos à base de farinha (pizza, macarrão, massas) e bebidas alcoólicas.
As fezes dos voluntários adultos serão coletadas e armazenadas em potes plásticos.
Todos os materiais para coleta e armazenamento das amostras lhe serão fornecidos
gratuitamente. Também serão solicitadas informações socioeconômicas (local onde mora,
renda familiar mensal) e relativas à sua saúde (hábitos alimentares e de estilo de vida,
histórico pessoal e familiar de doenças pré-existentes, uso de medicamentos, etc).
Esclarecemos que o procedimento de coleta de fezes não acarretará desconforto ou
riscos para você. Lembramos que é muito importante a lavagem das mãos com água e sabão
após a coleta das fezes para não adquirir ou transmitir nenhuma doença. Esclarecemos, ainda,
que não há benefício direto para o participante, e que você não terá despesas relacionadas à
pesquisa, nem retorno financeiro (por exemplo, para pagamento de transporte e alimentação).
A sua participação na pesquisa não é obrigatória e sua recusa não acarretará nenhum prejuízo.
Além disso, você poderá se retirar da pesquisa a qualquer momento, sem constrangimentos,
sem que isso lhe traga qualquer prejuízo ou penalização, sem necessidade de justificativa.
Em qualquer etapa do estudo, você terá acesso direto com os responsáveis pela
pesquisa das seguintes formas:
Isabel Pinto Vieira - email: [email protected] – Telefone de contato: (21)
98667-7021
Prof. Mariana Costa Monteiro - email: [email protected] - Endereço: Av.
Carlos Chagas Filho, 373, Centro de Ciências da Saúde, bloco J, segundo andar, sala
16. Cidade Universitária. Rio de Janeiro. Telefone de contato: 3938-6449
Se você tiver alguma consideração ou dúvida sobre a ética da pesquisa, entre em
contato com o Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) do Hospital Universitário Clementino
Fraga Filho/HUCFF/UFRJ – Rua Professor Rodolpho Paulo Rocco, nº 255, sala 01D-46/1º
andar. Cidade Universitária/Ilha do Fundão. Rio de Janeiro. Telefone (21) 2562-2480, de
segunda a sexta-feira, das 8 às 15 horas ou através do email: [email protected].
Todos os dados fornecidos são considerados confidenciais, sendo totalmente garantido
o sigilo das informações e sua privacidade. Os dados não serão divulgados de forma a
possibilitar a sua identificação e os resultados obtidos neste trabalho serão divulgados em
revistas científicas da área.
Acredito ter sido suficientemente informado (a) a respeito das informações sobre o
estudo acima citado que li ou que foram lidas para mim.
88
Eu discuti com a nutricionista Isabel Pinto Vieira sobre a minha decisão em participar
nesse estudo. Ficaram claros para mim quais são os propósitos do estudo, os procedimentos a
serem realizados, seus desconfortos e riscos, as garantias de confidencialidade e de
esclarecimentos permanentes. Ficou claro também que minha participação é isenta de
despesas e que tenho garantia de acesso a tratamento hospitalar quando necessário. Concordo
voluntariamente em participar deste estudo e poderei retirar o meu consentimento a qualquer
momento, sem penalidades ou prejuízos e sem a perda de atendimento nesta Instituição ou de
qualquer benefício que eu possa ter adquirido. Eu receberei uma cópia desse Termo de
Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE) e a outra ficará com o pesquisador responsável
por essa pesquisa. Além disso, estou ciente de que eu (ou meu representante legal) e o
pesquisador responsável deveremos rubricar todas as folhas desse TCLE e assinar na última
folha.
____________________ __________________ Rio de Janeiro, ____/____/____
Declaro obtive de forma apropriada e
voluntária o Consentimento Livre e Esclarecido do voluntário para participação no estudo.
___________________ ___________________ Rio de Janeiro, ____/____/____
Nome do pesquisador
responsável
Assinatura do pesquisador
responsável
Nome do sujeito da
pesquisa
Assinatura do sujeito da
pesquisa
89
ANEXO C – FICHA TÉCNICA DE PREPARAÇÃO DO PÃO CONTROLE
FICHA TÉCNICA DE PREPARAÇÃO NO : 1
PREPARAÇÃO: Pão de forma controle NO de PORÇÃO: 10
INGREDIENTES
UND PC PB
Quantidade
Total
(QT)
Custo
unitário
Custo
Total
Água L 0,0171 0,0171 0,171 - -
Manteiga sem sal Kg 0,0012 0,0012 0,012 R$0,03 R$0,36
Farinha de trigo Kg 0,03 0,03 0,3 R$2,95 R$0,89
Açúcar Kg 0,0012 0,0012 0,012 R$0,0029 R$0,03
Sal g 0,6 0,6 6,0 R$0,0019 R$0,01
CMC g 0,37 0,37 3,7 R$0,127 R$0,47
Melhorador g 0,3 0,3 3,0 R$0,203 R$0,61
Fermento biológico g 0,3 0,3 3,0 R$0,145 R$0,44
TÉCNICA DE PREPARO
1. Colocar todos os gêneros líquidos em temperatura ambiente no recipiente da máquina de pão;
2. Colocar em seguida os gêneros sólidos também em temperatura ambiente;
3. Fechar a máquina de pão e configurar o aquecimento médio durante 3 horas e 13 minutos.
Rendimento
Total
0,450 kg
Porção
(kg/ L)
0,045
COMPOSIÇÃO NUTRICIONAL
(Per capita)
Custo total: R$ 2,81 Custo porção: R$0,28 Glicídios (g) 23,63
COMENTÁRIO SENSORIAL DA PORÇÃO Proteínas (g) 6,03
Lipídeos (g) 1,66
COR Marrom claro VET (kcal) | porção
AROMA De pão
SABOR Característico 133,58
TEXTURA Macia
OBSERVAÇÕES
90
ANEXO D – FICHA TÉCNICA DE PREPARAÇÃO DO PÃO DE GOIABA
FICHA TÉCNICA DE PREPARAÇÃO NO : 2
PREPARAÇÃO: Pão de goiaba NO de PORÇÃO: 10
INGREDIENTES
UND PC PB
Quantidade
Total
(QT)
Custo
unitário
Custo
Total
Água L 0,0171 0,0171 0,171 - -
Manteiga sem sal g 1,2 1,2 12,0 R$0,03 R$0,36
Farinha de goiaba g 0,9 0,9 90,0 R$0,028 R$2,52
Farinha de trigo Kg 0,021 0,021 0,21 R$2,95 R$0,62
Açúcar g 1,2 1,2 12,0 R$0,0029 R$0,03
Sal g 0,6 0,6 6,0 R$0,0019 R$0,01
CMC g 0,37 0,37 3,7 R$0,127 R$0,47
Melhorador g 0,3 0,3 3,0 R$0,203 R$0,61
Fermento biológico g 0,3 0,3 3,0 R$0,145 R$0,44
TÉCNICA DE PREPARO
1. Colocar todos os gêneros líquidos em temperatura ambiente no recipiente da máquina de pão;
2. Colocar em seguida os gêneros sólidos também em temperatura ambiente;
3. Fechar a máquina de pão e configurar o aquecimento médio durante 3 horas e 13 minutos.
Rendimento
Total
0,457 kg
Porção
(kg/ L)
0,046
COMPOSIÇÃO NUTRICIONAL
(Per capita)
Custo total: R$ 5,06 Custo porção: R$0,51 Glicídios (g) 22,73
COMENTÁRIO SENSORIAL DA PORÇÃO Proteínas (g) 3,92
Lipídeos (g) 2,16
COR Marrom avermelhado escuro VET (kcal) | porção
AROMA De goiaba
SABOR Levemente de goiaba 126,04
TEXTURA Pouco macia
OBSERVAÇÕES
91
ANEXO E – CROMATOGRAMAS DOS COMPOSTOS FENÓLICOS DA FRAÇÃO
SOLÚVEL
Cromatograma do perfil de compostos fenólicos da fração solúvel do pão controle. Composto
identificado: ácido 4-hidroxifenilacético (1).
Cromatograma do perfil de compostos fenólicos da fração solúvel do pão de goiaba.
Composto identificado: ácido 4-hidroxifenilacético (1).
10.0 12.5 15.0 17.5 min
0
25
50
mAU
0.0
25.0
50.0
75.0
kgf/cm2
1
λ = 274 nm
7.5 10.0 12.5 15.0 min
0
25
50
mAU
0.0
25.0
50.0
75.0
kgf/cm2
1
λ = 274 nm
92
ANEXO F – CROMATOGRAMAS DOS COMPOSTOS FENÓLICOS DA FRAÇÃO
INSOLÚVEL ALCALINA
Cromatograma do perfil de compostos fenólicos da fração insolúvel alcalina do pão controle.
Composto identificado: ácido ferúlico (1).
Cromatograma do perfil de compostos fenólicos da fração insolúvel alcalina do pão de
goiaba. Composto identificado: miricetina-3-O-ramnosídeo (1).
20.0 25.0 30.0 35.0 min
0
25
50
75
100
125mAU
0.0
25.0
50.0
75.0
kgf/cm2
1
λ = 325 nm
λ = 355 nm
30 40 50 min
0
10
20
30
40mAU
0.0
25.0
50.0
75.0
kgf/cm2
1
93
ANEXO G – CROMATOGRAMAS DOS COMPOSTOS FENÓLICOS DA FRAÇÃO
INSOLÚVEL ÁCIDA
Cromatogramas do perfil de compostos fenólicos da fração insolúvel ácida do pão de goiaba.
Compostos identificados: ácido benzoico (1) e miricetina-3-O-ramnosídeo (2).
47.5 50.0 52.5 55.0 57.5 60.0 min
-500
-400
-300
-200
-100mAU
0.0
25.0
50.0
75.0
kgf/cm2
λ = 230nm
1
20 30 40 50 min
0
10
20
30
mAU
0.0
25.0
50.0
75.0
kgf/cm2
2
λ = 355 nm
94
ANEXO H – CROMATOGRAMAS DOS COMPOSTOS FENÓLICOS DA ETAPA
GÁSTRICA DA DIGESTÃO IN VITRO
Cromatogramas do perfil de compostos fenólicos da etapa gástrica da digestão in vitro do pão
controle. Compostos identificados: ácido gálico (1) e ácido 4-hidroxifenilacético (2).
5.0 7.5 min
0
100
200
300mAU
0.0
25.0
50.0
75.0
kgf/cm2
1λ = 270 nm
7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 min
0
25
50
75
mAU
0.0
25.0
50.0
75.0
kgf/cm2
2
λ = 274 nm
95
ANEXO I – CROMATOGRAMAS DOS COMPOSTOS FENÓLICOS DA ETAPA
GÁSTRICA DA DIGESTÃO IN VITRO
Cromatogramas do perfil de compostos fenólicos da etapa gástrica da digestão in vitro do pão
de goiaba. Compostos identificados: ácido 4-hidroxifenilacético (1) e ácido benzoico (2).
10.0 12.5 15.0 17.5 min
0
25
50
75
100
mAU
0.0
25.0
50.0
75.0
kgf/cm2
1
λ = 274 nm
47.5 50.0 52.5 55.0 57.5 60.0 min
-500
-250
0
250
500
750
mAU
0.0
25.0
50.0
75.0
kgf/cm2
2
λ = 230 nm
96
ANEXO J – CROMATOGRAMAS DOS COMPOSTOS FENÓLICOS DA ETAPA
INTESTINAL DA DIGESTÃO IN VITRO
Cromatogramas do perfil de compostos fenólicos da etapa intestinal da digestão in vitro do
pão controle. Compostos identificados: ácido gálico (1) e ácido 4-hidroxifenilacético (2).
3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 min
0
100
200
300
400
500mAU
0.0
25.0
50.0
75.0
kgf/cm2
1
λ = 270 nm
7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 min
0
25
50
75
mAU
0.0
25.0
50.0
75.0
kgf/cm2
2
λ = 274 nm
97
ANEXO K – CROMATOGRAMAS DOS COMPOSTOS FENÓLICOS DA ETAPA
INTESTINAL DA DIGESTÃO IN VITRO
Cromatogramas do perfil de compostos fenólicos da etapa intestinal da digestão in vitro do
pão de goiaba. Compostos identificados: ácido gálico (1) e ácido 4-hidroxifenilacético (2).
5.0 7.5 10.0 min
0
50
100
150
mAU
0.0
25.0
50.0
75.0
kgf/cm2
1
λ = 270 nm
10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 min
0
25
50
75
100
mAU
0.0
25.0
50.0
75.0
kgf/cm2
2
λ = 274 nm
98
ANEXO L – CROMATOGRAMAS DOS COMPOSTOS FENÓLICOS DA
FERMENTAÇÃO COLÔNICA EX VIVO
Cromatogramas do perfil de compostos fenólicos após 72 horas da fermentação colônica ex
vivo do pão controle. Compostos identificados: ácido 4-hidroxifenilacético (1), ácido siríngico
(2) e rosmarínico (3).
1
λ = 280nm
10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 min
0
50
100
150
mAU
0.0
25.0
50.0
75.0
kgf/cm2
2
3
λ = 330 nm
35.0 40.0 45.0 50.0 min
0.0
2.5
5.0
7.5
10.0
mAU
0.0
25.0
50.0
75.0
kgf/cm2
99
ANEXO M – CROMATOGRAMAS DOS COMPOSTOS FENÓLICOS DA
FERMENTAÇÃO COLÔNICA EX VIVO
Cromatogramas do perfil de compostos fenólicos após 72 horas da fermentação colônica ex
vivo do pão de goiaba. Compostos identificados: miricetina (1), kaempferol (2) e rosmarínico
(3).
1
λ = 370 nm
45.0 50.0 55.0 min
0
1
2
3
4
5mAU
0.0
25.0
50.0
75.0
kgf/cm2
2
3
λ = 372 nm
42.5 45.0 47.5 min
0.0
2.5
5.0
7.5
10.0
mAU
0.0
25.0
50.0
75.0
kgf/cm2