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Oficina Analítica

Determinação de Escherichia coli e Coliformes termotolerantes

Legislação

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ANEXO 20 DA PORTARIA DE CONSOLIDAÇÃO N°5

Dispõe sobre os procedimentos de controle e de vigilância da qualidade da água para consumo humano e seu padrão de potabilidade.

� Parâmetros:� Coliformes Totais e E-coli

� Heterotroficas

� Cryptosporidium e Giardia


RESOLUÇÃO No 357, DE 17 DE MARÇO DE 2005 complemento CONAMA 274

Dispõe sobre a classificação dos corpos de água e diretrizes ambientais para o seu enquadramento, bem como estabelece as condições e padrões de lançamento de efluentes, e dá outras providências.

� Parâmetros:� Coliformes Termotolerantes ou

� E-coli ou

� Enterococcus


Resolução RDC nº 275, de 22 de setembro de 2005

Regulamento técnico de características microbiológicas para água mineral natural e água natural

Parâmetros:� Coliformes Totais E-coli

� Enterococcus

� Pseudomonas auruginosa

� Clostridium perfringens


MAPA - Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento

O Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (Mapa) é responsável pela gestão das políticas públicas de estímulo à agropecuária, pelo fomento do agronegócio e pela regulação e normatização de serviços vinculados ao setor.

Parâmetros:� Coliformes Totais e E-coli

� Enterococcus

� Pseudomonas auruginosa

� Clostridium perfringens

Aprovações


Aprovações

United States Environmental Protection AgencyWorld Health OrganizationInternational Standard Organization (Method 9308-2)International Bottled Water Association European Bottled Water AssociationThe United States Pharmacopeia

Organizations

Association of Official analytical Chemists InternationalU.S. Food and Drug AdministrationStandard Methods for the Examination of Water and Wastewater American Society for Testing and MaterialsUS Department of Defense


Acreditação ISO

ISO / IEC-17025 acreditação baseia-se uma avaliação completa dos sistemas de gestão de qualidade

ISO 11133: 2014 refere-se ao teste de preparação, produção, armazenamento e desempenho dos meios de cultura para alimentos, ração animal e água.


Standard Methods IDEXX Water são os únicos testes comerciais no Standard

Coliform/E. coli Method� Colilert®, Colilert 18® and Colisure®

Enterococcus Method� Enterolert®

Quantification Method� Quanti-Tray® and Quanti-Tray ®/2000

Heterotrophic Plate Count Method� SimPlate®

*Pseudalert ®em processo de revisão para publicação


METODOS ATUAIS PARA O CONTROLE DE COLIFORMES EM AGUA


BIOINDICADORES virus, bacterias, parásitos, cianobacterias

QUALIDADES DE UM BIOINDICADOR � Se encontram em abundancia

� Resistente as condições ambientais

� Fácil determinação


Curva Padrão de Crescimento Bacteriano


Grupo Coliformes


Coliformes fecais(Termotolerantes) : Representantes

É um sub-set de coliformes totaisDefinidos como bacterias que crescem a uma

temperatura de 44.5°C (+/- 0.2 °C)

Consistem das seguintes bacterias coliformes:

� E. coli

� K. pnuemoniae

� Enterobacter spp.


Por que E. coli?


METODOS ATUAIS

�FILTRAÇÃO POR MEMBRANA

�TUBOS MULTIPLOS

�ENZIMATICOS

Todos os procedimentos atuais para a detecção de coliformes e E. coli em agua se definem de acordo com o método utilizado

� Detecção de enzimas (β-D- galactosidase e β-D- glucuronidase

� Fermentação da lactose, a produção de gás, a reação de indol,

� Tolerância térmica (fecal)


Fermentação por Tubos Múltiplos (MTF)

Método tradicional de fermentação da LactosePreparação de meios:

Incubar LTB (caldo de lauril triptosa ) até 48 horas a 35°C• Teste presuntiva para ColiformesConfirmação em BGLB (caldo Bilis Verde Brillante) 48 horas a 35°C• Coliformes totaisConfirmação com meio de cultura EC (+mug) 24 horas a 44.5°CE.Coli

Leitura dos resultados:• Limite de quantificação : 1600• Turbidez• Produção de gás

Extensivo Controle de Qualidade


Filtração por Membrana (FM)

• M-Endo

• Resultado presuntivo en 24±2 h• Resultados confirmados en 3-4 días• Faixa máxima Quantificação : 80 coliformes totais• Leitura de Resultados:

• interpretação subjetiva• crescimento confluente • colónias sobrepondo

• Extensivo Controle de Qualidade


TECNOLOGIA DO SUBSTRATO DEFINIDO


SUSTRATO DEFINIDO Colilert®Colilert utiliza a Tecnologia do Substrato Definido (DST®) para detectar simultaneamente coliformes totais e E. coli. Para os coliformes crescerem no Colilert, eles usam β-galactosidase para metabolizar ONPG e alterá-lo de incolor para amarelo.

E. coli utiliza β-glucuronidase para metabolizar o MUG e criar fluorescência. Como a maioria dos não-coliformes não possuem estas enzimas, eles são incapazes de crescer e interferir.


Materiais necessários

• Reagente Colilert• Frasco com ou sem tiossulfato de sódio• Estufa regulada a 35 °C• Lâmpada UV de 365 nm e 6 W de potência• Comparador colorimétrico (opcional)


Determinação Qualitativa (P/A) de Coliformes totais e E.coli

Incubação: 24 horas

35°C.


LEITURA

.

Amostra incolorNEGATIVO

POSITIVO paraColiformes totais a amostra

fica amarelo

POSITIVO para E. Coli a amotra

emite fluorescencia

Quantificação


Determinação Quantitaiva dos Coliformes totaise E.coli com Quanti-tray

1

Incubação: 24 horas

35°C.


Leitura: Fluorescencia (Lampada UV 365nm 6W)


Quanti-Tray 51 MPN Table

No wells

giving

positive

reaction

MPN per

100ml

sample

95%

Lower

Confidenc

e Limit

95%

Upper

Confidenc

e Limit

0 <1 0 3.7

15 17.8 10.8 29.4

35 59.1 42 84.4

51 >200.5 146.1 infinity


Quanti-Tray 2000 MPN Table

No of large

wells giving

positive

reaction

No of small

wells giving

positive

reaction

MPN per

100ml

sample

95% Lower

Confidence

Limit

95% Upper

Confidence

Limit

10 2 13.2 7.1 22.0

30 12 64 46.8 85.1

47 40 509.9 393.4 652.5


Colilert-18

� Protocolo especifico para analise de termotolerante, método com incubação em 44.5ºC

� Ensaio para realização de balneabilidade (água salobra)

� Ensaio realizado em apenas 18h


Colisure

� Kit para analise de coliformes e e-coli

� Visualização em CPRG-MUG, Mudança do positivo para magenta.

� Resultado em 24 a 48h


Validade e Armazenamento dos KITS

� Colilert – 12 meses de fabricação ( Brasil chega com 9 meses)

� Coliter-18 – 15 meses de fabricação ( Brasil chega com 13 meses)

� Colisure - 12 meses de fabricação ( Brasil chega com 9 meses)

Temperatura de Armazenamento - 2 a 25° C


QC – Kit para controle de Qualidade

Realize as etapas seguintes à temperatura ambiente:

Etapa1: Retire os frascos da caixa. Deixe a temperatura ambiente por 15 minutos.

Etapa 2: Abra um frasco e transfira de forma asséptica o disco colorido, localizado sobre o tampão de algodão, para um frasco contendo 200mL de água estéril, não tamponada e sem oxidantes. Identifique a amostra (A, B, C). Eventualmente é possível que o disco grude no frasco. Se isto ocorrer, utilize pinças estéreis para remover o disco com cuidado.

Etapa 3: Agite a amostra e deixe repousar por 15 minutos. O disco deve dissolver-se completamente. Após ser dissolvido, misture invertendo o frasco por 10 vezes.

Etapa 4: Realize a análise (determinação quantitativa) em duplicata no período de 30 minutos após hidratação conforme seus procedimentos de rotina.

Repita as etapas para os demais frascos.


Perguntas frequentes

o Quais são as condições de armazenamento recomendadas para os testes de microbiologia IDEXX-QC?

o Os testes de microbiologia IDEXX-QC devem ser armazenados fechados –10ºC ou menos.

o Qual é a vida útil dos testes de microbiologia IDEXX-QC?o Consulte o certificado de análise para saber qual a vida útil do

produto.

o Os controles de CQ são rastreáveis ou são fornecidos por um fabricante aprovado para cumprir a norma NELAC?

o Estas duas opções aplicam-se aos controles de CQ.


www.idexx.com.br/agua

� Certificados de analise

� Vídeos de treinamento

� Documentos técnicos

� Aprovações


Obrigada!

Contato: Patrícia Gonçalves Vinksnaitis

E-mail: [email protected]

Tel: (11)94761-2843

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