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Instituto Oswaldo Cruz

Curso de Pós-graduação em Biologia Celular e Molecular

DESENVOLVIMENTO EMBRIONÁRIO DO OVO DE Schistosoma mansoni SAMBON, 1907

ARNON DIAS JURBERG

Dissertação apresentada ao Instituto Oswaldo Cruz como

requisito parcial à obtenção do título de Mestre em

Ciências na área de Biologia Celular e Molecular

Orientadores: Dr. Henrique Leonel Lenzi

Dr. Paulo Marcos Zech Coelho

Julho de 2008

Livros Grátis

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Milhares de livros grátis para download.

Instituto Oswaldo Cruz

Curso de Pós-graduação em Biologia Celular e Molecular

ARNON DIAS JURBERG


Orientadores: Dr. Henrique Leonel Lenzi

Dr. Paulo Marcos Zech Coelho

Banca examinadora:

1 Naftale Katz (presidente)

2 José Roberto Machado-Silva (membro)

3 Gerson Cotta-Pereira (membro)

4 Lycia de Brito Gitirana (revisora/suplente)

5 Arnaldo Maldonado Jr. (suplente)

18/07/2008

ii

A minha mãe,

Vania Maria Mello Dias,

por todo amor, dedicação e incentivo

na minha formação pessoal e profissional.

Sem ela, esse trabalho não

teria sido possível.

e

À Raquel Miscow Ferraz de Mendonça,

com muito amor e carinho.

iii

“The egg cell is... a universe.”

Ernest Just, 1939.

“Muito louco isso.”

Henrique Lenzi, 2007.

“Afinal, mestrado é pra gente se divertir.”

Luís Fernando Ferreira, 2007.

iv

AGRADECIMENTOS

A realização desse trabalho somente foi possível com o envolvimento e a

participação, direta ou indireta, de pessoas muito especiais. A elas, meu

profundo reconhecimento:

Aos meus queridos orientadores, Dr. Henrique Leonel Lenzi e Dr. Paulo

Marcos Zech Coelho, pelos seus exemplos como seres humanos e

profissionai; pelo convívio e estimulantes discussões científicas e culturais;

pelos inúmeros incentivos e pela confiança. Por toda a dedicação e paciência,

mas, sobretudo, pela afetuosa amizade. Aos senhores, o meu mais sincero

agradecimento.

À Tiana Gonçalves e Tatiane Andrade Costa, pela imensurável contribuição

na realização desse trabalho. Ao Bernardo Miguel de Oliveira Pascarelli,

pelas inumeráveis horas de análise ao microscópio confocal de varredura a

laser. A vocês, pelos inesquecíveis momentos de convivência e aprendizado.

Por todo o apoio e incentivo, mas principalmente pela amizade, que espero

carregar para o resto da vida. Sem vocês, esse trabalho não teria sido

possível.

A todos os amigos do Laboratório de Patologia-IOC, que sempre contribuíram

de alguma forma muito especial, além dos agradáveis momentos de

convivência e descontração. Em especial, ao Dr. Marcelo Pelajo-Machado,

por toda a dedicação em proporcionar as melhores condições possíveis de

trabalho no laboratório; pelo incentivo e paciência. À equipe do setor de

histotecnologia – Luzia Fátima G. Caputo, Luciana Silva Souza, Luzia Helena

Pereira Barros, Marcelo Barbosa dos Santos e Alexandra Menezes dos

Santos – pelas excelentes preparações histológicas, fundamentais para a

realização desse trabalho. À Iolanda Deolinda Pedro, Filomena de Fátima

Cruz, Andréa Natividade e Juciara Felisbino de Souza, pela manutenção do

ciclo biológico do Schistosoma mansoni e do biotério do laboratório. Ao Pedro

Paulo de Abreu Manso e à Priscila Tavares Guedes, pela ajuda na realização

de reações de imuno-histoquímica; ao Pedro Paulo, também por auxiliar na

aquisição de imagens ao microscópio confocal. À Rosinei Miranda Ferreira e

à Alexandra Corrêa Pereira, pelo auxílio e apoio burocrático.

v

A todos os amigos do laboratório de Esquistossomose-IRR, que me

acolheram tão bem durante as minhas estadias. Em especial, à Ana Carolina

de Mattos, Ana Karine Sarvel, Neuza de Araújo e ao Áureo Almeida de

Oliveira, pela inestimável contribuição e grande paciência na realização de

alguns experimentos. À Vera de Paula Ribeiro e ao Dr. John R. Kusel (da

Glasgow University), pelas valiosas revisões de inglês dos artigos

submetidos/publicados.

Ao Marcelo Ribeiro Alves, da Plataforma de Desenvolvimento em Tecnologia e

Insumos em Saúde (PDTIS), Nanotecnologia e Microarranjos – Centro de

Desenvolvimento Tecnológico em Saúde (CDTS)/Fiocruz, pela inestimável

modelagem estatística dos dados de crescimento dos ovos. Ao Bruno

Eschenazi, do setor Produção e Tratamento de Imagens/IOC, pela belíssima

representação esquemática do desenvolvimento embrionário dos ovos (artigo

2).

À Dra. Jane Arnt Lenzi e à Dra. Lycia de Brito Gitirana, pela minuciosa

revisão dessa dissertação.

Ao Laboratório de Biologia Celular/IOC, na pessoa da Dra. Andréa Henrique

Pons, por permitir a utilização do criostato na obtenção de secções

histológicas para a realização de imunomarcações indiretas.

À Flávia Rachel Moreira Lamarão, Kelly Grace Magalhães, Mariana

Acquarone, bem como ao Thiago Parente e Gustavo Lázaro Rezende, pelo

incentivo, sugestões e ajudas, além dos empréstimos de reagentes e,

sobretudo, pelo agradável convívio.

À Coordenação do Programa de Pós-graduação em Biologia Celular e

Molecular do Instituto Oswaldo Cruz, nas figuras de seu Coordenador, Dr.

Milton Ozório Moraes, e de Daniele Lobato, secretária executiva, pelo apoio

burocrático e suporte financeiro em eventos científicos.

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e

à Fundação Oswaldo Cruz (Fiocruz), pelo suporte financeiro durante a

vi

realização desse trabalho. À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal

Superior (CAPES), pela criação e manutenção do portal de acesso de

periódicos internacionais (http://www.periodicos.capes.gov.br), muito útil

na redação dessa dissertação.

Por fim, mas não menos importante, à minha família, por todo o apoio e

incentivo. Em especial, à minha querida mãe, Dra. Vania Maria Mello Dias,

por toda a sua dedicação e suporte na minha formação pessoal e

profissional. Ao meu irmão Igor, pelo grande exemplo de garra e

determinação, mesmo continuando a um oceano de distância. Ao meu pai,

Dr. Pedro Jurberg, pelas proveitosas conversas e ensinamentos. À Raquel

Miscow Ferraz de Mendonça, minha amada namorada (calma, agora só falta

o doutorado para o casório), por todos os inúmeros e especiais momentos e o

aconchegante carinho.

vii

http://www.periodicos.capes.gov.br/

Este trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Patologia do Instituto

Oswaldo Cruz (IOC), Rio de Janeiro, RJ, e no Laboratório de

Esquistossomose do Instituto René Rachou, Belo Horizonte, MG, ambos da

Fundação Oswaldo Cruz (Fiocruz). Este trabalho recebeu suporte financeiro

da Fiocruz e do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e

Tecnológico (CNPq).

viii

Sumário

Lista de figuras .................................................................................................. xi

Lista de abreviaturas ......................................................................................... xii

Resumo ............................................................................................................. xiii

Abstract ............................................................................................................. xiv

I – Considerações iniciais ............................................................................... 15

1. Introdução ............................................................................................. 16

2. Fundamentação teórica .......................................................................... 18

2.1. Classificação taxonômica ................................................................. 18

2.2. Características gerais dos esquistossomos ....................................... 18

2.3. Esquistossomose mansoni ............................................................... 19

2.4. O ciclo biológico do Schistosoma mansoni ........................................ 21

2.5. O desenvolvimento embrionário dos platielmintos ........................... 22

2.5.1. Conceitos básicos em biologia do desenvolvimento ................... 23

2.5.2. Filogenia dos platielmintos, com ênfase em Schistosomatidae e

Schistosoma ...................................................................................... 38

2.5.3. Visão geral do desenvolvimento embrionário dos platielmintos . 53

2.6. O desenvolvimento embrionário do ovo do Schistosoma mansoni ...... 66

2.6.1. Fecundação ............................................................................. 66

2.6.2. Formação da casca do ovo ....................................................... 67

2.6.3. Desenvolvimento embrionário dos ovos .................................... 69

2.7. Reação granulomatosa (granuloma periovular) ................................. 71

2.7.1. Antígenos solúveis do ovo ........................................................ 72

2.8. Morfologia do miracídio de Schistosoma mansoni ............................. 79

II – Objetivos .................................................................................................. 82

1. Objetivo geral ..................................................................................... 83

2. Metas …………………………………………………………………………….... 83

III – Justificativa …………………………………………………………………………… 84

IV – Artigos …………………………………………………………………………………. 86

ix

Artigo 1. Trematode embryology: a new method for whole-egg analysis

by confocal microscopy …………………………………………………………... 87

Artigo 2. The embryonic development of the trematode Schistosoma

mansoni …………………………………………………………………..……….…. 93

V – Considerações finais e Conclusões ………………………………………………. 148

1. Discussão ........................................................................................ 149

1.1. Sistemas de classificação ......................................................... 150

1.2. Desenvolvimento embrionário in vivo e in vitro .......................... 151

1.3. Desenvolvimento embrionário e filogenia .................................. 153

1.4. Desenvolvimento embrionário e granulomatogênese ................. 156

2. Conclusões ...................................................................................... 160

VI – Referências bibliográficas …………………………………………………………. 165

x

Lista de figuras

Figura 1.1. Casal de vermes adultos de Schistosoma mansoni ...................................... 19 Figura 1.2. Ciclo biológico de Schistosoma mansoni ...................................................... 22 Figura 1.3. Ciclo celular de blastômeros e células somáticas ........................................ 24 Figura 1.4. Planos da clivagem holoblástica total ......................................................... 26 Figura 1.5. Resumo dos principais padrões de clivagem ............................................... 27 Figura 1.6. Clivagem em espiral do molusco Trochus .................................................... 28 Figura 1.7. Clivagem em espiral ................................................................................... 32 Figura 1.8. Tipos de movimentos celulares durante a gastrulação ................................ 34 Figura 1.9. Modos de formação do mesoderma na gástrula tardia ................................ 35 Figura 1.10. Formação do celoma por esquizocelia ....................................................... 37 Figura 1.11. Formação do celoma por enterocelia ......................................................... 37 Figura 1.12. Dendogramas exemplificando três tipos de táxons .................................... 39 Figura 1.13. Geração de genes ortólogos e parálogos .................................................... 40 Figura 1.14. Resumo das relações filogenéticas dos platielmintos ................................. 47 Figura 1.15. Filograma dos trematódeos de tetrápodes ................................................. 50 Figura 1.16. Estratégias de desenvolvimento em diferentes táxons de platielmintos ..... 54 Figura 1.17. Clivagem em espiral de um policlado ........................................................ 59 Figura 1.18. Larva de Muller ........................................................................................ 59 Figura 1.19. Desenvolvimento inicial de embriões F1 de Gyrodactylus gasterostei ........ 64 Figura 1.20. Miracídio de Schistosoma mansoni por microscopia confocal de varredura

a laser (CLSM) ............................................................................................................. 81

xi

Lista de abreviaturas

AB alcian blue (azul de Alciano)

CLSM microscopia confocal de varredura a laser

COPT do inglês, circumoval precipitin reactions

DDC dietilditiocarbamato

DNA ácido desoxirribonucléico

E exsudativo

EP exsudativo-produtivo

ESP proteínas totais secretadas pelo ovo

evo-devo biologia evolutiva do desenvolvimento

FaRPs peptídeos FMRFamida-relacionados

HSPs proteínas de choque térmico

i.e. isto é

IL interleucina

INF-gama interferon-gama

kDa kiloDalton

LSU grandes subunidades de RNAr

MHC complexo principal de histocompatibilidade

RNAmi micro-ácido ribonucléico

RNAm ácido ribonucléico mensageiro

mtDNA ácido desoxirribonucléico mitocondrial

NPFs neuropeptídeos Fs

P produtivo

p.ex. por exemplo

p.i. após a infecção

PAS reação do ácido periódico de Schiff

pH pontencial hidrogeniônico

pI ponto isoelétrico

RI reação inicial

RNAr ácido ribonucléico ribossomal

SEA antígeno solúvel do ovo

SSU pequenas subunidades de RNAr

xii

INSTITUTO OSWALDO CRUZ


RESUMO

DISSERTAÇÃO DE MESTRADO

Arnon Dias Jurberg

Na patogênese da esquistossomose e na continuidade do ciclo de vida do parasito,

os ovos possuem um papel central. Tradicionalmente, o amadurecimento dos ovos é

classificado a partir da simples relação entre os tamanhos do embrião e do ovo

propriamente dito (classificação de Vogel e de Prata, “VP”). A proporção de cada

estádio (oograma) tem sido considerada como um critério confiável para a avaliação

de drogas esquistossomicidas. Contudo, pouco se sabe sobre a sua biologia do

desenvolvimento propriamente dita. A presente dissertação objetivou descrever os

eventos morfológicos durante a embriogênese dos ovos de Schistosoma mansoni

através de histologia convencional e análise de preparados inteiros. Os eventos

foram divididos em dez estádios, adaptando uma classificação prévia inicialmente

introduzida para um rabdocelo de vida livre. O amadurecimento dos ovos no

hospedeiro e em cultura (meio RPMI-1640) foi também avaliado por modelagem

estatística da área média de cada estádio (considerando a classificação VP) e então,

morfologicamente, pela análise de ovos inteiros sob microscopia confocal a laser

(nosso sistema de estagiamento aqui proposto). Devido ao difícil reconhecimento

dos eventos morfológicos observados em ovos vivos não-corados, uma correlação

com a classificação VP é apresentada. De fato, o desenvolvimento embrionário dos

ovos de esquistossomos é mais complexo do que considerado previamente (como na

classificação de Vogel). A diferenciação das estruturas embrionárias e seus

prováveis papéis na granulomatogênese são discutidos. O sistema de estadiamento,

aqui proposto, pode contribuir para uma melhor compreensão da biologia do ovo e

embasar futuros estudos sobre a produção e difusão dos antígenos do ovo na

reação granulomatosa.

xiii

INSTITUTO OSWALDO CRUZ

THE EMBRYONIC DEVELOPMENT OF Schistosoma mansoni SAMBON, 1907 EGGS

ABSTRACT

MASTER DISSERTATION

Arnon Dias Jurberg

In pathogenesis of schistosomiasis and in its life cycle, the eggs have a central role.

Traditionally, the primary screening of antischistosomal drugs uses as main criteria

the Vogel and Prata’s classification (VP’s), which is based on the relation of

embryo/eggshell sizes and the qualitative oogram. However, little is known on egg

developmental biology itself so far. The present work aimed to describe the

morphological events during the Schistosoma mansoni egg embryogenesis by using

conventional histology and whole-mount preparations. These events were divided in

ten stages, adapting a previous classification initially introduced for a free-living

rhabdocoel. Egg maturation in the host and in culture (RPMI-1640 medium) were

also evaluated by statistical modeling of the mean area for each stage (considering

VP’s classification) and then morphologicaly by whole-mount eggs under the

confocal laser microscopy (our proposed staging system herein). Due to difficult

recognition of the morphological events in live, unstained eggs, a further correlation

to the VP’s classification is presented. Indeed, schistosome egg embryonic

development is more complex than previous considered (as in VP´s classification).

The differentiation of embryonic structures and their probable role in

granulomatogenesis is discussed. The stage system here proposed may contribute

to a better comprehension of the egg biology and underlies further studies on egg

antigen production and its diffusion in the the granuloma reaction.

xiv

Considerações Iniciais Dissertação de Mestrado

15

I – Considerações Iniciais


16

I – Considerações Iniciais

I. 1 – Introdução

Como um organismo se forma? Como se produz um outro ser? A busca pelo

entendimento dessas questões e de inúmeras outras mais específicas fez da

Biologia do Desenvolvimento um dos campos mais fascinantes em biologia.

Organismos tão diferentes quanto borboletas, ouriços-do-mar, peixes, primatas e

vermes originam-se a partir de uma única célula, o zigoto. Para esses seres (e

outros vários), a construção de uma estrutura adulta perpassa por estádios

transitórios. O tempo é fundamental.

Nos esquistossomos, causadores da esquistossomose humana, o zigoto é

circundado por células vitelínicas individualizadas, ainda no sistema reprodutivo da

fêmea adulta. Ao redor dessa massa celular é polimerizada uma casca de formato

peculiar (diferente para cada espécie de esquistossomo). Os ovos possuem um papel

ainda mais intrigante: eles são os agentes primários na patologia da

esquistossomose. Após serem liberados pelas fêmeas adultas na corrente sanguínea

do hospedeiro vertebrado, eles são passivamente carregados até ficarem retidos em

vasos de calibre mais reduzido. Nesse momento, tais ovos são capazes de atuar

como agentes granulomatogênicos, podendo causar fibrose periportal e hipertensão,

além de varizes esofagianas, que, ao se reomperem, podem muitas vezes levar ao

óbito. Apesar do seu papel central na biologia dos esquistossomos e na patogenia

da esquistossomose, o desenvolvimento embrionário dos ovos tem sido alvo de

estudos esporádicos, quase sempre superficiais. Por exemplo, sua classificação é

atualmente baseada simplesmente na relação entre o tamanho do embrião em

relação ao ovo (Vogel 1942; Prata 1957). Pouco se conhece sobre as moléculas do

ovo relacionadas com a patogenia e menos ainda sobre os mecanismos moleculares

que regem o seu desenvolvimento. Frequentemente, ovos isolados para avaliações

moleculares (genômica, transcriptômica, glicômica, lipidômica e outros) são

considerados como uma entidade única, sem os diferentes estádios de maturação.

Assim, essa dissertação tem por finalidade a descrição da embriogênese dos

ovos de Schistosoma mansoni Sambon, 1907 em seu hospedeiro experimental

murino. Para fins de comparação, o desenvolvimento de ovos em cultura também

foi avaliado. O cultivo de ovos é amplamente utilizado em estudos moleculares e

imunológicos, bem como em avaliações quimioterapêuticas. É necessário, portanto,

determinar se as condições de cultura empregadas nesse trabalho são, de fato,

válidas para o estudo do amadurecimento dos ovos em circunstâncias livres de

variações intrínsecas desconhecidas, como em hospedeiros animais. Em outras


17

palavras, é preciso definir se as condições de cultura utilizadas, por si só, não

afetam o desenvolvimento dos ovos e seus processos biológicos. Outra intenção

dessa dissertação é propor um sistema de estadiamento para o desenvolvimento

ovular de S. mansoni a partir de critérios morfológicos e morfogenéticos, como

previamente introduzido por Hartenstein e Ehlers (2000) para outros platielmintos.

A identificação morfológica desses estádios permite comparar eventos do

desenvolvimento, tais como movimentos morfogenéticos, expressão gênica e

diferenciação celular. Isso é especialmente útil no caso dos esquistossomos, já que

seus ovos são encontrados em diferentes momentos de amadurecimento nos tecidos

do hospedeiro. Por fim, a presença de certos antígenos do ovo foi avaliada durante a

sua embriogênese.


18

I. 2 – Fundamentação Teórica

I. 2. 1 – Classificação Taxonômica

Reino: Metazoa

Filo: Platyhelminthes

Classe: Trematoda

Subclasse: Digenea

Ordem: Strigeidida

Família: Schistosomatidae

Gênero: Schistosoma

Espécie: Schistosoma mansoni

I. 2. 2 – Características gerais dos esquistossomos

Os esquistossomos são trematódeos (do grego trematodes, furado)

digenéticos (do grego dis, duplo; genos, raça), inteiramente adaptados ao

parasitismo e com ciclo biológico complexo. O termo trematódeo refere-se a

estruturas notáveis da superfície do corpo – as ventosas. Uma delas, situada

ventralmente, é particularmente bem desenvolvida e delimitada do parênquima por

uma cápsula distinta, sendo denominada acetábulo. Uma segunda ventosa dispõe-

se em torno da boca nas espécies parasitas – é a ventosa oral. Os trematódeos

possuem ainda um sistema reprodutivo com canal de Laurer e um cirro como órgão

masculino copulatório (também encontrado em outros grupos, mas provavelmente

não-homólogo). Poro(s) excretor(es) localiza(m)-se posteriormente. Eles têm também

uma larva (miracídio) com células epidérmicas ciliadas, com núcleos intra-epiteliais

(neoderme). O hospedeiro invertebrado é preponderantemente um molusco

(raramente, um anelídeo), enquanto o hospedeiro vertebrado pode ser facultativo ou

obrigatório.

Por sua vez, o termo digenético refere-se aos dois tipos de geração no ciclo

de vida: (1) os esporocistos, que parasitam o hospedeiro intermediário e

reproduzem-se assexualmente; e (2) o adulto, que é primariamente endoparasito de

vertebrados (exceto Cyclostomata) e reproduz-se sexualmente. Outras

características desse grupo referem-se à organização em fileiras transversais

regulares das células epidérmicas ciliadas dos miracídios, bem como a presença de

outra forma larvar, chamada cercária. Usualmente, os vermes adultos nesse grupo

são hermafroditas; porém, os esquistossomos (Fig. 1.1) e poucos outros


19

trematódeos são dióicos (do grego di, dois; oykos, casa), ou seja, possuem sexos

separados.

Figura 1.1. Casal de vermes adultos de Schistosoma mansoni. A fêmea, destacada

artificialmente na cor verde, fica alojada no canal ginecóforo do macho. Na região anterior

do macho é possível visualizar as duas ventosas (setas). Fonte: Scientific American Brasil.

2004 (28) Set.

I. 2. 3 – Esquistossomose mansoni

As histórias sobre o descobrimento e os primeiros estudos da

esquistossomose como moléstia humana são um pouco obscuras e fontes ainda de

grandes debates entre as escolas médicas (ver Katz 2008). O primeiro relato escrito

sobre esquistossomose humana data do antigo Egito (Olds e Dasarathy 2001,

citando Girges 1934). Neste relato, a presença de um verme foi associada com

sangramento urinário. Todavia, a primeira descrição formal desse verme foi

somente realizada no século XIX, pelo patologista alemão Theodor Bilharz (1825-

1862). Bilharz (1853a) relatou a presença de vermes adultos na veia porta hepático-

intestinal de um homem jovem autopsiado (apud Olds e Dasarathy 2001). Em sua

homenagem, portanto, a denominação bilharziose, que é utilizada ainda hoje em

alguns países. Bilharz (1853b, 1856) também relatou alterações patológicas

características, bem como sintomas clínicos da esquistossomose.

Na época, os vermes apresentados por Bilharz foram denominados de

Distomium haematobium (Bilharz 1853b). Poucos anos depois, Wienland e Cobbold

sugeriram o nome Schistosoma, pois constataram que apenas uma das duas

ventosas do então Distomum levava a uma cavidade oral (Cobbold 1859; Warren


20

1973). A etimologia do termo Schistosoma refere-se à fenda (“schisto”) no corpo

(“soma”) do macho, atualmente denominada canal ginecóforo. Assim, desde 1864, a

nomenclatura científica oficial utilizada para essa doença tem sido

“esquistossomose”.

Alguns anos mais tarde, ao examinar as fezes de um paciente, o médico

escocês Patrick Manson (1844-1922) sugeriu a existência de uma nova espécie, com

ovos com espinho lateral (Manson 1902). Pouco tempo depois, a partir da análise de

um único verme adulto macho, o médico italiano Louis Westenra Sambon (1865-

1931) descreveu uma nova espécie (Sambon 1907a, b), a qual denominou

Schistosoma mansoni em homenagem ao seu admirado amigo e mestre (Wilkinson

2002; Katz 2008).

Embora Bilharz (1853b) tenha observado ovos com um espinho terminal na

urina de seus pacientes, ele também encontrou ovos nas fezes e vermes adultos na

veia porta hepático-intestinal. Tais achados não deixavam explícito qual das

espécies de Schistosoma (S. haematobium ou S. mansoni) havia sido descrita. Em

1908, o médico brasileiro Manuel Augusto Pirajá da Silva (1873-1961) publicou o

primeiro trabalho sobre esquistossomose no Brasil (Pirajá da Silva 1908a),

relatando que havia observado quatro anos antes, mas que não sabia explicar, ovos

com espinho lateral nas fezes de pacientes. Somente após a leitura dos trabalhos de

Manson e Sambon que Pirajá da Silva pôde compreender o seu achado (Pirajá da

Silva 1908a; Katz 2008). Ele avaliou os 20 primeiros casos humanos da doença na

Bahia, forneceu seu diagnóstico e descreveu suas manifestações clínicas. Em três

oportunidades, o médico brasileiro realizou a necrópsia dos pacientes e encontrou

apenas um verme nos dois primeiros casos e 24 vermes (19 machos, uma fêmea e

dois casais) no terceiro. Pirajá da Silva ainda fotografou um ovo com espinho lateral

no útero de uma fêmea, além de outras características particulares do referido

parasito. A eclosão do miracídio também foi observada por Pirajá da Silva. A

descrição precisa do tamanho e características dos vermes fizeram Pirajá da Silva

concluir que tais exemplares constituíam uma espécie diferente de S. haematobium

(Pirajá da Silva 1908a, b, 1909; Katz 2008). Todos esses indícios destacados pelo

médico brasileiro contribuíram fortemente para a consolidação da espécie S.

mansoni na comunidade científica internacional da época (Andrade 2002; Katz

2008).

A distribuição geográfica do S. mansoni abrange o continente africano, a

América do Sul e as Antilhas (Rey 2001). Os vermes normalmente determinam uma

infecção assintomática ou oligossintomática, a depender principalmente da carga

parasitária e de características do hospedeiro; o quadro inicial é geralmente


21

discreto, com exantema (erupções cutâneas), prurido (coceira) e outras

manifestações alérgicas locais, devido à penetração das cercárias. Com o tempo

(cerca de oito dias após a infecção), os vermes começam a atingir o sistema porta

intra-hepático e amadurecem. Febre (aumento da temperatura corporal), eosinofilia

(aumento da taxa de eosinófilos no sangue), linfadenopatia (inflamação dos

linfonodos), esplenomegalia (aumento patológico do volume do baço) e urticária

(lesão cutânea, causada por edema localizado) podem manifestar-se. O fígado pode

aumentar também de tamanho (hepatite difusa). Ulcerações necróticas

hemorrágicas da mucosa disseminam-se por todo o intestino. Com a produção

continuada de ovos, lesões nodulares (granulomas) levam a extensa fibrose do

fígado e outros órgãos, como o baço. Casos graves exibem fibrose periportal,

hipertensão porta e hepatoesplenomegalia, com acentuado comprometimento do

funcionamento dos órgãos. Lesões cardiopulmonares, renais e neurológicas também

podem ocorrer, devido à embolização de ovos para tais regiões. O rompimento de

varizes esofagianas pode causar o óbito do paciente (Rey 2001; Lenzi et al. 2008).

I. 2. 4 – O Ciclo Biológico do Schistosoma mansoni

Eventos complexos são decisivos para a patogênese, o sucesso reprodutivo e

a continuação do ciclo biológico dos esquistossomos (Fig. 1.2). De forma

simplificada, um vertebrado infectado libera ovos de S. mansoni em suas fezes.

Caso esses ovos atinjam a massa de água, em condições adequadas de

temperatura, luminosidade, salinidade e pH, há a eclosão de uma forma larvar,

chamada miracídio. Os miracídios nadam livremente e têm a capacidade de infectar

caramujos do gênero Biomphalaria. Nesses hospedeiros intermediários, uma série

de divisões celulares e modificações morfológicas levam à formação de cercárias. A

cercária é o agente penetrante na pele ou na mucosa de mamíferos suscetíveis

(humanos e outros primatas, carnívoros, marsupiais, edentatas, arctiodáctilos e

insetívoros). Tais mamíferos recebem a denominação de hospedeiros definitivos, por

abrigarem a forma do parasito que realiza reprodução sexuada.

Aspectos da localização e do reconhecimento, bem como a subsequente

penetração através da pele, as fases de desenvolvimento e a migração até o sistema

porta-hepático intestinal desses mamíferos suscetíveis foram revistos recentemente

em um capítulo de livro ainda a ser publicado (Lenzi et al. 2008a) no livro

“Esquistossomose mansoni: uma visão multidisciplinar” (Carvalho et al. 2008). Esse


22

capítulo, intutilado “Migração e desenvolvimento do Schistosoma mansoni no

hospedeiro definitivo” (Lenzi et al. 2008a).

Figura 1.2. Ciclo biológico de Schistosoma mansoni. O casal em cópula aloja-se

preferencialmente nas veias porta e mesentéricas do hospedeiro mamífero. A fêmea libera os

ovos na corrente sanguínea, que são carregados passivamente até ficarem retidos em

delgados capilares do sistema porta-hepático intestinal. Os ovos devem ser eliminados junto

com as fezes para dar continuidade ao ciclo. Na água, os miracídios eclodem e penetram em

caramujos do gênero Biomphalaria, se desenvolvendo em esporocistos primários e

secundários, até originarem as cercárias, forma infectante para o vertebrado suscetível.

Após a penetração em hospedeiro definitivo, as cercárias se transformam em

esquistossômulos, que amadurecem no sistema porta-hepático intestinal. Fonte: Panasco

MS. Estudo morfo-funcional do tecido linfo-mielóide celomático em camundongos normais e

infectados por Schistosoma mansoni, sua caracterização em humanos e resposta a vários

outros agentes infecciosos e parasitários [tese]. Rio de Janeiro: Instituto Oswaldo

Cruz/Fiocruz; 2006.


23

I. 2. 5 – Desenvolvimento Embrionário dos Platielmintos

Diversos livros-texto sobre embriologia animal ou humana, zoologia geral ou

de biologia do desenvolvimento propriamente ditos têm como capítulos

introdutórios extensas revisões sobre conceitos fundamentais para a compreensão

dos fenômenos biológicos relacionados ao desenvolvimento dos animais e suas

relações filogenéticas. Com o objetivo de facilitar o entendimento dos termos

utilizados nesse trabalho e embasar as discussões subsequentes, alguns desses

conceitos serão sumariados a seguir. Exceto quando indicado, as informações dessa

seção foram extraídas de Gilbert (2003) e Brusca e Brusca (2003).

I.2.5.1 – Conceitos básicos em biologia do desenvolvimento

Tradicionalmente, o estudo do desenvolvimento animal era conhecido como

embriologia e compreendia a fase de um organismo entre a fertilização e o seu

nascimento. No entanto, o desenvolvimento não termina ao nascimento. A maioria

dos animais se mantém em constante renovação de células, mesmo durante o

envelhecimento. Por sua vez, alguns organismos sofrem metamorfose ou podem

apresentar uma notável capacidade de regeneração, como as planárias. Por essa

razão, a disciplina que estuda os processos embrionários e do desenvolvimento

passou a ser conhecida como biologia do desenvolvimento. Basicamente, o

desenvolvimento busca gerar diversidade celular e ordem, além de garantir a

continuidade da vida, de uma geração para a seguinte.

De forma geral, as células dos animais se organizam em unidades

funcionais, primeiramente como tecidos e então como órgãos, podendo formar

sistemas de órgãos. Nesse tipo de divisão didática, cada uma dessas estruturas tem

papéis específicos, inter-relacionados e interdependentes, que sustentam a vida de

todo o organismo. Suas atividades complexas são coordenadas em padrões

adaptativos previsíveis, também interdependentes. Segundo Maturana e Varela

(1994), a organização caracteriza-se como o conjunto de relações entre os seus

componentes, que define a identidade do sistema. Organização difere de estrutura,

que configura fisicamente os componentes estruturais e suas relações concretas. A

estrutura do sistema pode alterar-se sem que haja perda de organização percebida

pelo observador. Isso acontece durante o desenvolvimento de um ser vivo: fenótipos

adultos resultam a partir de sequências hierárquicas específicas dos estádios do

desenvolvimento e padrões evolutivos revelam-se, em grande parte, através das

ontogenias.


24

A ontogenia de um organismo do reino animal tem início com a fecundação,

que é resultante do encontro de duas células sexuais especializadas, os gametas. O

gameta masculino ou espermatozóide, localiza, reconhece e penetra ativamente no

gameta feminino, ou oócito. Nesse momento, ocorre a fusão dos pró-núcleos

haplóides em um núcleo diplóide, que contém as metades do genoma dos

genitores. O zigoto sofre uma série de divisões mitóticas, conhecidas coletivamente

por clivagem, que dividem o grande volume de citoplasma em numerosas células

nucleadas menores, os blastômeros. As divisões celulares são frequentemente

referidas como iguais ou desiguais, indicando tamanhos comparativos entre os

blastômeros. Três tipos de blastômeros podem ser produzidos a partir de diferentes

modos de clivagem: em divisões iguais, as células resultantes possuem o mesmo

volume e recebem o nome de mesômeros; em divisões desiguais, originam-se

células grandes, ou macrômeros, e células menores, os micrômeros. Quando as

células resultantes são apenas levemente diferentes em tamanho, diz-se que a

divisão celular foi sub-igual. O volume citoplasmático das células-filha não

aumenta durante a clivagem, devido à supressão do período de crescimento entre

as divisões celulares (Fig. 1.3).

Certos aspectos dos padrões de clivagem são determinados pela quantidade e

distribuição de nutrientes, coletivamente designados como vitelo, que auxiliam no

desenvolvimento inicial do embrião. Em geral, o vitelo retarda ou mesmo impede as

divisões celulares. Alguns fatores citoplasmáticos maternos, como reguladores

protéicos e RNAm, também são determinantes na clivagem, influenciando o ângulo

de formação do fuso mitótico e o tempo de sua polimerização.

Figura 1.3. Ciclo celular de blastômeros e células somáticas. (A) O simples ciclo celular

bifásico de precoces blastômeros de anfíbio tem apenas dois estados, S (de síntese de DNA,

do inglês DNA synthesis) e M (de mitose, do inglês mitosis). A síntese de ciclina B (do inglês,


25

cyclin B) permite a progressão para M, enquanto a degradação de ciclina B permite que as

células passem para a fase S. (B) Ciclo celular de uma típica célula somática. A mitose é

seguida de uma fase de “intérfase” (do inglês, interphase). Esse período é subdividido nas

fases G1, S e G2. As células que estão diferenciando-se estão usualmente “fora” do ciclo

celular, em uma fase G1 estendida, denominada G0. As ciclinas responsáveis pela

progressão através do ciclo celular e suas respectivas quinases (do inglês, kinase) são

mostradas nos seus pontos de regulação do ciclo celular. Fonte: Gilbert SF. Developmental

Biology. 7ª ed. Sunderland: Sinauer Associates. 2003.

A produção de vitelo (vitelogênese) é, geralmente, a fase mais longa da

produção de ovos. Todavia, sua duração varia enormemente entre as espécies e

suas taxas de produção são dependentes das estratégias empregadas. Por exemplo,

espécies oportunistas (ou r-selecionadas) produzem uma grande quantidade de ovos

e, por isso, necessitam fazer uma rápida conversão de nutrientes para a produção

de vitelo; espécies especialistas (ou k-selecionadas), por outro lado, utilizam padrões

mais vagarosos e, consequentemente, têm uma menor produção de ovos.

Zigotos isolécitos contêm uma quantidade relativamente escassa de vitelo,

uniformemente distribuída por todo seu citoplasma. Nesse caso, a clivagem é total

ou holoblástica, isto é, o sulco de clivagem estende-se por toda a célula. Esse tipo

de clivagem é encontrado em equinodermos, anfioxos, anelídeos, moluscos,

platielmintos, tunicados, mamíferos e nematóides. Em anfíbios, a disposição

moderada de vitelo em seus zigotos (mesolécito) causa um ligeiro deslocamento

dos sulcos de clivagem. Em certos casos, pode ocorrer concentração de vitelo em

alguma região da célula-ovo, usualmente definindo sua polarização (eixo animal-

vegetal): o pólo rico em vitelo é denominado pólo vegetal, enquanto que o outro,

com pouco ou nenhum vitelo, é chamado pólo animal. Essa polaridade pode ser

aparente ou tornar-se reconhecível somente com o prosseguimento do

desenvolvimento. Zigotos com esse padrão são conhecidos como telolécitos e

sofrem clivagem meroblástica, onde somente uma parte do citoplasma é clivada.

Frequentemente, o núcleo desses zigotos fica deslocado para o pólo animal. Ovos

telolécitos ocorrem em cefalópodes, peixes, répteis e pássaros. Na maioria dos

insetos, o vitelo concentra-se no centro do zigoto. Tal localização define os ovos

como centrolécitos. As divisões mitóticas ocorrem superficialmente (clivagem

superficial), somente em uma estreita região do citoplasma na periferia da célula-

ovo.

Os padrões de clivagem recebem ainda outros nomes específicos, segundo as

orientações de seus sulcos de divisão (Fig. 1.4). A Figura 1.5 sumaria esses


26

padrões. Em razão do objeto de estudo dessa dissertação, apenas a clivagem em

espiral, presente em platielmintos, anelídeos e moluscos, será detalhada a seguir.

Detalhes sobre os outros tipos de clivagem podem ser encontrados em Gilbert

(2003).

Figura 1.4. Planos da clivagem

holoblástica total. (A) Clivagem igual. (B) Clivagem desigual produz micrômeros e

macrômeros. (C-E) Planos de clivagem em

relação ao eixo animal-vegetal do zigoto. (C)

Clivagem longitudinal (=meridional),

paralela ao eixo animal-vegetal. (D)

Clivagem equatorial, perpendicular ao eixo

animal-vegetal e dividindo o zigoto em duas

metades animal e vegetal iguais. (E)

Clivagem latitudinal, perpendicular ao eixo

animal-vegetal, mas sem passar pelo plano

equatorial. Fonte: Brusca RC, Brusca GJ.

Invertebrates. 2ª ed. Sunderland (MA):

Sinauer Associates. 2003.


27

Figura 1.5. Resumo dos principais padrões de clivagem. Para mais informações, ver

Gilbert SF. Developmental Biology. 7ª ed. Sunderland: Sinauer Associates. 2003.


28

Na clivagem holoblástica espiral, os planos de clivagem são formados em

ângulos oblíquos. Com isso, as células-filha se deslocam para sobre os sulcos de

clivagem entre duas outras células (Fig. 1.6). Quando a divisão envolve o

deslocamento das células no sentido horário (visto do pólo animal), ela é chamada

dextrotrópica; quando ocorre no sentido anti-horário, recebe o nome levotrópica.

Esses tipos de giro ocorrem em alternância, aproximadamente até o estádio de 64-

células. Todavia, as divisões celulares não são necessariamente sincrônicas.

Portanto, nesse padrão de clivagem, as células assumem a orientação mais

termodinamicamente estável de agregação.

Figura 1.6. Clivagem em espiral do molusco Trochus. (A) Visão do pólo animal. (B) Visão

do lateral. As células derivadas do blastômero A estão coloridas. Os fusos mitóticos,

representados apenas nos estádios iniciais, dividem as células desigualmente e em um

ângulo oblíquo aos eixos vertical e horizontal. Fonte: Gilbert SF. Developmental Biology. 7ª

ed. Sunderland: Sinauer Associates. 2003.

Geralmente, os embriões que realizam esse tipo de clivagem sofrem menos

divisões celulares antes de se reorganizarem para a estruturação de seus tecidos

(processo conhecido como gastrulação, relatado adiante), o que facilita a

identificação das linhagens celulares formadas. Representações gráficas dessa

diferenciação celular em um embrião são comumente chamadas de mapas de

destino. Atualmente, corantes vitais ou marcadores genéticos podem ser usados

com essa finalidade. As células individuais são acompanhadas para verificar que


29

estruturas da larva ou do adulto elas originarão. Isso é possível porque o destino

celular é estreitamente regulado por interações célula-célula ou pela distribuição

assimétrica particular de moléculas de padronização (morfógenos).

Em alguns casos, os destinos celulares são determinados muito inicialmente

no desenvolvimento, ainda na primeira ou segunda clivagem. Quando isso ocorre, a

clivagem é dita determinada, pois o blastômero faltante impede o correto

desenvolvimento posterior. Em outros casos, alguns animais mantêm seu adequado

padrão de desenvolvimento, mesmo quando seus blastômeros são separados

durante os estádios iniciais de duas ou quatro-células, ou mesmo em estádios mais

tardios. Nesse caso, os blastômeros que se perdem durante o desenvolvimento são

substituídos por outros e a clivagem é dita indeterminada. Com isso, os destinos

celulares são determinados apenas mais tardiamente no desenvolvimento.

Em 1892, ao estudar o desenvolvimento embrionário do poliqueto Neanthes

succinea, o zoólogo e geneticista americano Edmund B. Wilson propôs um sistema

de codificação na determinação dos destinos celulares para padrões de clivagem em

espiral (Wilson 1892). Tal sistema tem aplicação geral, servindo como referência

para a descrição dos padrões de clivagem de outros grupos animais.

No início da clivagem em espiral, após a primeira divisão, as duas células-

filha recebem os códigos AB e CD. Em seguida, no estádio de 4-células, as células

resultantes são codificadas como A, B, C e D, segundo o sentido horário, quando

analisadas a partir do pólo animal. Essas quatro células são referidas como um

quarteto de macrômeros, podendo ser coletivamente codificadas por Q. A clivagem

subsequente é desigual e as quatro células menores são deslocadas em modo

dextrotrópico, posicionando-se no pólo animal da mórula. Tais células formam o

primeiro quarteto de micrômeros (coletivamente chamadas de células 1q) e recebem

os códigos individuais 1a, 1b, 1c e 1d. Mesmo que macrômeros e micrômeros

possam ter tamanhos similares em alguns casos, tais termos são sempre utilizados

na descrição da clivagem em espiral.

Nesse sistema, o algarismo que precede as letras indica o número de vezes

que os macrômeros originais (Q = A, B, C, D) se dividiram para corresponder ao

número do quarteto de micrômeros produzidos, isto é, o algarismo “1” no embrião

no estádio de oito-células indica que as células Q dividiram-se uma vez. As letras

minúsculas referem-se aos respectivos macrômeros de origem, enquanto as letras

maiúsculas continuam designando os macrômeros (agora também precedidos pelo

algarismo “1”, indicando a formação do primeiro conjunto de micrômeros). Assim, a

mórula no estádio de oito-células possui quatro pares de células-filha (1Q = 1A, 1B,

1C, 1D; 1q = 1a, 1b, 1c, 1d):


30

1a 1b 1c 1d

A B C D

1A 1B 1C 1D

A clivagem seguinte, do estádio de oito para 16-células, ocorre de modo

levotrópico. Os macrômeros 1Q se dividem para produzir um segundo quarteto de

micrômeros (2q = 2a, 2b, 2c, 2d). O primeiro quarteto de micrômeros (1q) também

se divide, formando oito células-filha. Tais células continuam sendo identificadas

pela letra correspondente ao macrômero-pai, mas passam a ostentar também

numerais expoentes. Assim, o micrômero 1a (do embrião de 8-células) produz duas

células-filhas, codificadas por 1a1 e 1a2. O expoente “1” se refere à célula

fisicamente mais próxima do pólo animal, enquanto que a outra célula recebe

expoente “2”. Apenas os prefixos dos macrômeros são modificados com as divisões

subsequentes (indicando o número de divisões individuais que tais células

sofreram). O estádio de 16-células, portanto, inclui as seguintes células:

Derivadas de 1q 1a1, 1b1, 1c1, 1d1

1a2, 1b2, 1c2, 1d2

Derivadas de 1Q 2q = 2a , 2b, 2c, 2d

2Q = 2A , 2B, 2C, 2D

Na transição do estádio de 16 para 32-células, a próxima clivagem ocorre

com o deslocamento das células de modo dextrotrópico. Os macrômeros 2Q dividem

desigualmente, originando o terceiro quarteto de micrômeros (3q = 3a, 3b, 3c, 3d) e

outro quarteto de macrômeros-filho (3Q = 3A, 3B, 3C, 3D). Todos os doze

micrômeros previamente existentes também se dividem. Desse modo, expoentes são

adicionados às células derivadas dos primeiro e segundo quarteto de micrômeros,

segundo a regra de posicionamento anteriormente mencionada. Portanto, a célula

1b1 divide-se para produzir as células 1b11 e 1b12; a célula 1a2 produz as células

1a21 e 1a22; a célula 2c origina as células 2c1 e 2c2 e assim por diante. Os expoentes

não devem ser considerados como números de dois dígitos (isto é, “vinte e um” ou

“vinte e dois”), mas interpretados como sequências de dois dígitos (isto é, “um-um”,

“um-dois”, “dois-um” ou “dois-dois”), refletindo a linhagem precisa de cada célula. O

estádio de 32-células é composto das células:


31

Derivadas de 1q

1a11, 1b11, 1c11, 1d11

1a12, 1b12, 1c12, 1d12

1a21, 1b21, 1c21, 1d21

1a22, 1b22, 1c22, 1d22


2a2, 2b2, 2c2, 2d2


3Q = 3A , 3B, 3C, 3D

A divisão subsequente, para o estádio de 64-células, segue o mesmo padrão,

com as alterações apropriadas na codificação. O deslocamento das células ocorre de

modo levotrópico, resultando nas seguintes células:

Derivadas de 1q

1a111, 1b111, 1c111, 1d111

1a112, 1b112, 1c112, 1d112

1a121, 1b121, 1c121, 1d121

1a122, 1b122, 1c122, 1d122

1a211, 1b211, 1c211, 1d211

1a212, 1b212, 1c212, 1d212

1a221, 1b221, 1c221, 1d221

1a222, 1b222, 1c222, 1d222

Derivadas de 2q

2a11, 2b11, 2c11, 2d11

2a12, 2b12, 2c12, 2d12

2a21, 2b21, 2c21, 2d21

2a22, 2b22, 2c22, 2d22


3a2, 3b2, 3c2, 3d2


4Q = 4A , 4B, 4C, 4D


32

O sistema de codificação de Wilson é simples e bastante elegante, pois cada

codificação conta a história e a posição de cada célula no embrião. Por exemplo, no

embrião de 32-células, o código 1d11 indica que: (1) a célula deriva do primeiro

quarteto de micrômeros; (2) que seu macrômero de origem é a célula D; (3) que o

micrômero original 1d se dividiu duas vezes desde a sua formação, e; (4) que essa

célula particular está na região mais apical do embrião, em relação às suas células-

irmãs. Nenhuma das células divide o mesmo código, possibilitando a identificação

individual precisa dos blastômeros e de suas linhagens (ver Fig. 1.6).

Em certos animais, padrões característicos de distribuição celular, formados

pela orientação de alguns micrômeros apicais do primeiro quarteto, aparecem

tardiamente. Mais próximas do topo, as células 1q111 assumem um aspecto

semelhante a uma roseta. Em anelídeos e equiúros, os micrômeros 1q112 parecem

formar uma cruz grosseira nos ângulos retos da roseta. Essa cruz recebe o nome de

cruz anelídeo. Em moluscos e sipunculados, tal cruz persiste e, adicionalmente,

forma-se outra cruz a partir das células 1q12 e suas derivadas. A cruz molusco

posiciona-se entre as células da cruz anelídeo (Fig. 1.7). Essas cruzes são

características embriológicas únicas, importantes na determinação das relações

filogenéticas naturais entre certos grupos de metazoários.

Figura 1.7. Clivagem em espiral. (A-D) Divisões sincrônicas, até o estádio de 32-

células. As células estão marcadas segundo

o sistema de codificação de E.B. Wilson

(visão do pólo animal). (E) Representação

esquemática de um embrião composto

aproximadamente no estádio de 64-células,

mostrando as posições de roseta, cruz

anelídeo e cruz molusco. Fonte: Brusca RC,

Brusca GJ. Invertebrates. 2ª ed. Sunderland

(MA): Sinauer Associates. 2003.


33

Ao final da clivagem, os blastômeros do embrião compõem uma estrutura

denominada blástula, que antecede a formação das camadas germinativas. Pelo

menos quatro tipos são identificados nos invertebrados: (1) a celoblástula, (2) a

estereoblástula, (3) a discoblástula e (4) a periblástula. A celoblástula é uma esfera

oca, formada por uma parede celular. O espaço no interior dessa esfera de células é

chamado de blastocele, ou de cavidade corporal primária. Por sua vez, a

estereoblástula é uma esfera sólida de células, obviamente sem blastocele. Esse é o

tipo de blástula dos platielmintos. Na discoblástula, um disco de células se localiza

no pólo animal do embrião, sobre a massa de vitelo não clivada. Finalmente, a

periblástula é similar à celoblástula, mas a cavidade interior é preenchida por

vitelo acelular. Nos mamíferos, a blástula é chamada de blastocisto.

Após o término da clivagem, as células primordiais da blástula se

reorganizam em camadas germinativas através de um processo chamado

gastrulação. Usualmente, tal processo envolve todo o embrião em uma combinação

de alguns tipos básicos de movimentos celulares: (1) invaginação, (2) involução, (3)

ingressão, (4) delaminação e (5) epibolia. Na invaginação, ocorre uma dobra de

uma camada de células (frequentemente, no pólo vegetal) para o interior do

embrião, como um saco. A camada celular interna é chamada de endoderma e o

saco, por ela definido, delimita o intestino primitivo, ou arquêntero. A camada

celular que se mantém externamente é denominada ectoderma. Na involução, as

células nas extremidades do embrião (geralmente uma discoblástula) proliferam

sob o disco, estendendo-se adjacentes à superfície basal das células que

permanecem no exterior. Na ingressão, algumas células se separam da superfície

do embrião e migram independentemente para a blastocele, eventualmente

preenchendo-a como uma sólida massa de endoderma. Na ingressão unipolar, esse

processo ocorre somente no pólo vegetal, enquanto na ingressão multipolar, ocorre

por praticamente toda a blástula. Na delaminação, uma camada celular da

blástula se divide em duas camadas mais ou menos paralelas. Embora semelhante

à ingressão, esse tipo de movimento celular resulta na formação de uma camada de

células inteiramente nova ou, eventualmente, uma massa sólida de endoderma. Na

epibolia, há a expansão do ectoderma presuntivo em volta das camadas mais

profundas do embrião. As células do pólo animal proliferam rapidamente em

direção ao pólo vegetal, empurrando as células para baixo para circundar o

endoderma. Pode ocorrer também pela modificação de suas formas ou por diversas

camadas intercalando-se em menos camadas. Frequentemente, os três mecanismos

ocorrem concomitantemente. Tipicamente, o arquêntero é formado


34

secundariamente, como um espaço dentro do endoderma desenvolvido. A Figura

1.8 representa esquematicamente tais movimentos celulares.

As camadas germinativas do embrião regem a formação de sistemas de

órgãos específicos. Uma característica marcante da unidade dos metazoários é a

consistência dos destinos dessas camadas. O ectoderma gera a camada mais

externa do embrião (epiderme) e o sistema nervoso; o endoderma transforma-se na

camada mais interna do embrião, originando o epitélio do tudo digestório e órgãos

associados; uma terceira camada, quando presente, posiciona-se entre o ectoderma

e o endoderma, constituindo o envoltório celômico, o sistema circulatório e a

maioria das estruturas internas de suporte e musculatura. Quando a terceira

camada deriva do endoderma, ela é denominada endomesoderma, ou mesoderma

verdadeiro. Geralmente, é simplesmente referida como mesoderma.

Figura 1.8. Tipos de movimentos celulares durante a gastrulação. A gastrulação de

qualquer organismo em particular é um conjunto de diversos desses movimentos. Fonte:


Dois processos básicos podem originar o mesoderma. Na maioria dos filos

que realizam clivagem espiral (p.ex. platielmintos, anelídeos e moluscos), um único

micrômero – a célula 4d ou mesentoblasto – produz o mesoderma por proliferação,

se posicionando entre o arquêntero (endoderma) e a parede corporal (ectoderma). As

outras células do quarteto 4q e as células 4Q usualmente contribuem para o

endoderma; em outros táxons (p.ex. equinodermos e cordados), o mesoderma surge

a partir da parede propriamente dita do arquêntero (i.e., do endoderma pré-

formado), como folheto sólido ou como bolsa oca (Fig. 1.9).

Os organismos que apresentam essas três camadas são agrupados como

triploblásticos. Entretanto, alguns organismos como os poríferos, cnidários e

ctenóforos, carecem de um mesoderma verdadeiro. A camada intermediária é


35

derivada do ectoderma, sendo em grande parte acelular. Por tal razão, é referida por

ectomesoderma. Esses animais são considerados diploblásticos.

Figura 1.9. Modos de formação do mesoderma na gástrula tardia. Secção frontal. (A)

Mesoderma forma-se a partir de derivados dos mesentoblastos. (B) Mesoderma formado por

embolsamento arquentérico. Fonte: Brusca RC, Brusca GJ. Invertebrates. 2ª ed. Sunderland

(MA): Sinauer Associates. 2003.

A partir da aquisição evolutiva de um mesoderma verdadeiro, os filos

triploblásticos alcançaram novas sofistificações corporais, que possibilitaram o

aumento de sua complexidade estrutural. Uma das mais importantes tendências na

evolução foi o surgimento de uma cavidade corporal preenchida por um fluído,

entre parede corporal externa e o tubo digestório. Essa nova organização, de “um-

tubo-dentro-de-outro-tubo”, permitiu que os órgãos internos (tubo digestório e seus

anexos) não fossem mais espacialmente limitados pelos seus pontos de contato com

a parede corporal, exceto nas suas extremidades. Além de servir para amortecer

mecanicamente o contato entre esses dois grandes tubos independentes, a cavidade

corporal preenchida por fluído possibilitou o desenvolvimento e a expansão de

novas estruturas dentro do corpo. Outrossim, a câmara corporal serviu também

como uma câmara de armazenamento de produtos corporais, bem como exerceu os

papéis de meio para circulação e de esqueleto hidrostático incipiente.

Em certos triploblásticos, no entanto, o mesoderma verdadeiro não origina

dessa cavidade corporal. Ao invés disso, produz um mesênquima, no qual as

células ficam esparsamente espalhadas em uma matriz gelatinosa (ou mesóglea). O

grupo acelomado (do grego a, “sem”; coel, “oco”, “cavidade”) é composto por

Platyhelminthes, Entoprocta, Gnathostomulida e Gastrotricha. Por sua vez,

virtualmente todos os outros animais triploblásticos desenvolvem uma cavidade


36

preenchida por fluído entre a parede corporal e o intestino. Animais

blastocelomados (p.ex. rotíferos, nematóides e outros) possuem uma cavidade

revestida apenas parcialmente pelo mesoderma; como na maioria dos casos esse

espaço representa resquícios da blastocele, essa estrutura é atualmente referida

como blastoceloma. Já os metazoários eucelomados (p.ex. moluscos, anelídeos,

artrópodes e cordados) têm a cavidade corporal originada a partir do mesoderma

propriamente dito e revestida completamente por uma delgada membrana de

origem também mesodérmica, chamada peritôneo. Essa cavidade é referida como

celoma verdadeiro (ou euceloma).

A formação do celoma está intimamente relacionada com a formação do

mesoderma. Quando o mesoderma é produzido pela proliferação do mesentoblasto,

a cavidade corporal origina-se por esquizocelia. As massas sólidas de mesoderma,

localizadas lateralmente no embrião, expandem-se e tornam-se ocas;

eventualmente, transformam-se em espaços celômicos, de parede celular delgada

(Fig. 1.10). A quantidade de tais espaços pareados pode variar enormemente,

estando frequentemente associada com a segmentação (p.ex. em anelídeos). Na

enterocelia, o surgimento do celoma ocorre concomitantemente com a formação do

mesoderma. Nesse caso, ambos os eventos compreendem o mesmo processo, que é

chamado de embolsamento arquentérico. Nele, expansões em forma de bolsa se

desprendem do arquêntero como compartimentos celômicos completos e suas

paredes celulares são definidas como mesoderma. Em alguns casos, primeiro surge

o mesoderma como um folheto sólido; posteriormente, essa massa celular torna-se

uma bolsa oca. Frequentemente, a conclusão da formação do celoma por

enterocelia define um arranjo tripartido, no qual as cavidades corporais são

designadas protocele, mesocele e metacele (Fig. 1.11).

Mesmo com as camadas germinativas estabelecidas, os órgãos não se

formam independentemente: interações celulares e novos rearranjos teciduais

precisam ocorrer para produzi-los. Esse processo é chamado de organogênese.

Nele, diversos órgãos do jovem organismo podem ser formados por células de mais

de uma camada germinativa. A comunicação celular é essencial, seja entre células

adjacentes ou entre células distantes. Sinais moleculares, como hormônios, fatores

de crescimento e morfógenos, modificam o comportamento celular de determinados

tecidos, em momentos adequados. Esse fenômeno é coletivamente conhecido por

indução, enquanto tal aptidão de resposta a um determinado indutor específico é

denominada competência. A competência de resposta é ativamente adquirida

durante o desenvolvimento. Alguns tipos celulares realizam longas migrações até se

estabelecerem em sua localização final. Nesse momento, o reconhecimento seletivo


37

e as adesões célula-célula ou célula-matriz extracelular necessitam ser altamente

precisos. A própria morte celular, programada e estreitamente regulada, auxilia na

modelagem de algumas estruturas. Ao final da organogênese, o jovem organismo

emerge para o ambiente externo, seja através da eclosão do ovo ou pelo nascimento.

Entretanto, o seu desenvolvimento continua até a sua morte.

Figura 1.10. Formação do celoma por esquizocelia. Secção frontal (A) Condição pré-

celomática, com pacotes pareados de mesoderma. (B) Esvaziamento dos pacotes

mesodérmicos para produzir um par de espaços celômicos ocos. (C) Proliferação progressiva

de pares de espaços celômicos arranjados seriadamente. Esse processo ocorre em anelídeos

metaméricos. Fonte: Brusca RC, Brusca GJ. Invertebrates. 2ª ed. Sunderland (MA): Sinauer

Associates. 2003.

Figura 1.11. Formação do celoma por enterocelia. Secção frontal (A) Embolsamento

arquentérico. (B) Proliferação e subsequente esvaziamento de uma placa de mesoderma a

partir do arquêntero. (C) Arranjo tripartido típico dos celomas em um embrião

deuterostomado. Fonte: Brusca RC, Brusca GJ. Invertebrates. 2ª ed. Sunderland (MA):



38

I.2.5.2 – Filogenia dos platielmintos, com ênfase em Schistosomatidae e Schistosoma

Basicamente, o termo filogenia refere-se ao relacionamento evolutivo entre

organismos, desde o aparecimento das primeiras espécies até o presente. Todavia,

até pouco tempo atrás, a tarefa de remontar tal história evolutiva esbarrava na

ausência de testemunhos fósseis adequadamente preservados. Provavelmente, os

ancestrais metazoários careciam de estruturas rígidas que pudessem favorecer o

processo de preservação (fossilização) por centenas de milhares de anos, desde o

período Pré-cambriano e o início do Cambriano. Portanto, a solução seria fazer uma

“paleontologia sem fósseis” – termo cunhado pelo biólogo molecular Sean Carrol

(segundo DiSilvestro 1997) – ou melhor, procurar no genoma das espécies atuais

pistas sobre seus ascendentes mais próximos. Tais pistas são encontradas em

genes homólogos. Isso somente foi possível com o advento e o aperfeiçoamento de

técnicas moleculares, como o sequenciamento e alinhamento de ácidos

ribonucléicos (p.ex. DNA, DNAmt, RNAr, RNAmi) e de proteínas.

Homologia é um conceito-chave na biologia comparativa, pois se refere a

similaridades compartilhadas entre grupos taxonômicos, a partir de uma mesma

característica presente em um ancestral em comum (Creighton 1999). Em

filogenética sistemática (ou cladística), uma característica ancestral é dita

plesiomórfica, enquanto o seu estado derivado (novo) é referido como apomórfico.

Quando esse estado derivado é restrito a um único táxon, é chamado de

autapomorfia; mas se compartilhado por dois ou mais táxons, é nomeado de

sinapomorfia. Já que sinapomorfias são características homólogas herdadas de um

ancestral comum imediato, todos os homólogos podem ser considerados

sinapomorfias em (apenas) um único nível do relacionamento filogenético; em todos

os níveis inferiores, eles constituem simplesiomorfias. Assim, em certo nível

filogenético, todas as características homólogas definem grupos monofiléticos.

Nesse grupo, todos os seus membros são relacionados entre si por uma história

única de descendência (com modificações) a partir de um ancestral comum.

Quando alguns de seus descendentes não estão contidos nesse grupo, ele é dito

parafilético. Assim, o termo que nomeia o clado (i.e., o nome do táxon, tal como

“Turbellaria”) deve ser escrito utilizando-se aspas, para indicar o seu status

parafilético. Por sua vez, um grupo é polifilético quando compreende integrantes

que surgiram de dois ou mais ancestrais imediatos diferentes (Fig. 1.12).


39

Figura 1.12. Dendogramas exemplificando três tipos de táxons. O táxon W, que

compreende três espécies, é monofilético, pois contém todos os descendentes (espécies C e

D) do ancestral comum imediato (espécie B), mais esse ancestral. O táxon X é parafilético,

pois inclui um ancestral (espécie A), mas somente alguns de seus descendentes (espécie E a

I, deixando de fora as espécies B, C e D). O táxon Y é polifilético porque contém táxons que

não são derivados de um mesmo ancestral comum imediato; as espécies M e P podem

parecer similares como resultado de convergência evolutiva ou paralelismo e, portanto,

foram agrupadas juntas em um único táxon. O táxon Z é parafilético. Nesse caso, trabalhos

adicionais nas espécies de J a P devem, eventualmente, revelar a correta relação entre os

táxons. A espécie M deve ser classificada com as espécies K e L; já a espécie P, com as

espécies N e O. Fonte: Brusca RC, Brusca GJ. Invertebrates. 2ª ed. Sunderland (MA):


Embora originalmente o termo homologia fosse mais utilizado para

características morfológicas, o emprego da biologia molecular tornou a utilização

desse conceito bastante trivial na análise filogenética de genes e proteínas. Genes

homólogos podem ser: parálogos, quando surgem por duplicação de um mesmo

gene em uma espécie ancestral em comum, ou ortólogos, quando são passados

como cópias simples durante os eventos de especiação. A comparação entre táxons

intimamente relacionados, ou mesmo entre táxons distantes, se baseia na condição

de que, em duas espécies diferentes, genes ortólogos são expressos em uma posição

similar; essas áreas ou regiões são consideradas homólogas, mesmo quando entre

filos. Tais genes, portanto, devem ter estados presentes em seu último ancestral

comum, mantendo-se presentes nas duas novas espécies dado o seguimento da

especiação (Fig. 1.13). Em geral, os genes ortólogos têm a mesma função em cada

uma das espécies resultantes e somente eles podem ser utilizados para a

reconstrução de árvores filogenéticas (ou seja, da genealogia). Por sua vez, os

genes parálogos estão no genoma como membros de uma família gênica, tendo

usualmente adquirido diferentes funções no transcurso da evolução da espécie em

questão.


40

Figura 1.13. Geração de genes ortólogos e parálogos. Para detalhes, ver o texto. Fonte:

Creighton TE. Encyclopedia of Molecular Biology. Vol. 1-4. Nova York (NY): John Wiley e

Sons. 1999.

A comparação entre genes de várias espécies abriu uma perspectiva

inteiramente nova para a análise da evolução. Embora a genética de populações

tenha estabelecido o princípio de que a evolução se deve às alterações nos genes,

nenhum exemplo havia sido identificado até o momento. Assim, permanecia a

pergunta de como as mudanças evolutivas podiam ocorrer. A revelação somente

surgiu com a descoberta dos genes que controlavam a embriogênese em moscas.

Esses genes têm homólogos exatos na maioria dos animais, desempenhando as

mesmas funções, ou seja, animais tão diversos quanto vermes, moscas e

camundongos possuem os mesmos conjuntos de genes envolvidos com a formação

e diferenciação de suas características morfológicas e fisiológicas. “A construção das

formas depende da ativação e desativação de determinados genes em diferentes

momentos e posições ao longo da embriogênese”, registrou Carrol (2005). A partir

daí, estabeleceu-se uma nova síntese evolutiva, cujo princípio fundamental propõe

que “a evolução é causada por modificações herdáveis no desenvolvimento dos

organismos” (ver Valentine 1997 e Gilbert 2003). A importância da embriogênese

para a evolução, todavia, já havia sido sugerida há mais de um século, por Darwin

(1859; 1871), Huxley (1863) e Roux (1894). Surgiu, enfim, um novo campo

interdisciplinar na biologia – a biologia evolutiva do desenvolvimento, ou

simplesmente “evo-devo”.

Apesar dos recentes avanços moleculares, a origem e a filogenia do filo

Platyhelminthes (do grego platy, achatado; helminth, verme) ainda permanecem

bastante controversas. Predominantemente, os representantes desse grupo são

parasitas pertencentes às classes Trematoda (como no caso do objeto desse


41

trabalho, o S. mansoni), Monogenea ou Cestoda. Completa o filo outro grupo,

conhecido por Turbellaria, preponderantemente de vida-livre. Como será visto

adiante, essa antiga classe é considerada inválida, por não ser monofilética (Tyler et

al. 2006). O termo “turbelário”, no entanto, pode ainda ser aplicado aos vermes

anteriormente contidos nesse táxon.

Tradicionalmente, a origem dos platielmintos era postulada estar relacionada

ao surgimento da simetria bilateral ou mesmo com a origem dos metazoários,

como revisto por Brusca e Brusca (2003). A hipótese ciliado-para-acelomado

remete à teoria sincicial para a origem da condição metazoária. Nessa teoria, o

ancestral metazoário seria um protista ciliado, multinucleado e bilaterado. Com

hábito bêntico, tal ancestral rastejaria sobre o substrato com sua abertura oral

voltada baixo; seus núcleos então teriam se separado entre si, pela formação de

membranas celulares e a epiderme celular resultante circundaria uma massa

sincicial interna, definindo uma criatura semelhante a um platielminto. Tal

hipótese, entretanto, não é mais sustentável em sua forma original. Em diversos

acelomados, a natureza sincicial do endoderma é, provavelmente, secundariamente

derivada de um ancestral com um intestino celular.

Outra proposta foi nomeada de hipótese ctenóforo-policlado, sugerindo que

um ctenóforo achatado teria originado um turbelário policlado. Nesse cenário, tal

ancestral assumiria um estilo de vida bêntico, também rastejante, com a boca

direcionada para o substrato. A condição bilaterada teria sido obtida com a redução

dos tentáculos e seu posterior posicionamento junto ao órgão sensorial apical. Pelo

menos em teoria, a organização policlada teria sido alcançada com o aumento da

ramificação intestinal e a formação de uma faringe pregueada. Todavia, essa

hipótese também não possui mais sustentação científica.

Atualmente, ainda persistem outros cenários alternativos. Em um deles, os

platielmintos teriam surgido a partir de uma série de reduções em um ancestral

vermiforme celomado (teoria arquicelomado). Isso implicaria que os surgimentos

do eixo dorso-ventral (simetria bilateral) e do mesoderma provavelmente teriam

ocorrido simultaneamente com os aparecimentos do celoma e da segmentação

corporal. Dessa forma, os animais acelomados (bem como os blastocelomados)

teriam sido originados a partir de um clado celomado, segmentado e derivado de

cnidários acelomados, radialmente simétricos e não-segmentados (ver revisão por

Baguñà et al. 2008). Essa idéia sugere que as bolsas gástricas dos cnidários seriam

homólogas com as bolsas gástricas (enteroceles) que formam as cavidades

celômicas dos deuterostomados (ver Willmer 1990; Rieger e Ladurner 2001). Seria

possível, portanto, que tais linhagens acelomadas tivessem surgido por neotenia


42

dos estádios embrionários desse ancestral celomado, isto é, que o desenvolvimento

somático desses animais tenha sido retardado em algum estádio larvar de corpo

sólido (ou mesmo com blastoceloma), antes da formação da cavidade celômica

propriamente dita.

Outro cenário mais gradual vem despertando progressivo interesse científico

atualmente. Nele, os turbelários platelmintos teriam surgido por progênese

(obtenção de maturidade sexual em formas larvais) a partir de uma protoplânula

(ou arquiplânula) pelágica ancestral, radialmente simétrica e diploblástica (teoria

planulóide-acelomado; von Graff 1882). A plânula é o tipo larvar básico dos

cnidários atuais. De fato, um crescente conjunto de evidências morfológicas e

moleculares tem sugerido que os cnidários são, de fato, bilaterados verdadeiros

secundariamente derivados para simetria radial (externa), devido ao seu estilo de

vida predominantemente séssil (Finnerty et al. 2004; Martindale 2005; Baguñà et

al. 2008).

Os indícios que suportam esse panorama referem-se às homologias entre o

eixo oral-aboral (O-AB) dos cnidários e o eixo antero-posterior (A-P) dos bilaterados,

bem como entre o “eixo diretivo” dos cnidários e o eixo dorso-ventral (D-V) dos

bilaterados. Inicialmente baseada na expressão assimétrica transitória de genes

ortólogos cnidários BMP2/4/dpp, tal relação vem sendo corroborada pela

caracterização da expressão assimétrica de outros genes, envolvidos na

diferenciação do endoderma, mesoderma e neural (Martindale 2005; Matus et al.

2006). Assim, a análise filogenética com marcadores quantitativos, como genes

ribossomais (18S+28S) e nucleares, bem como com marcadores qualitativos, como

agregados de genes HOX e conjuntos de RNAmi, têm reforçado o posicionamento

dos cnidários como grupo-irmão de um clado bilaterado menos abrangente,

chamado Triploblastica. Esse clado, portanto, compreende os bilaterados atuais

com mesoderma verdadeiro (Baguñà et al. 2008). É possível que o último ancestral

comum dos bilaterados tenha sido pequeno, bêntico, com desenvolvimento direto e

sem segmentos, cavidades celômicas, nefrídeos e um cérebro verdadeiro (Jondelius

et al. 2002).

Dentro de Triploblastica, teria então ocorrido a ramificação precoce do clado

parafilético “Acoelomorpha”, inicialmente com os vermes Acoela e, posteriormente,

com os Nemertodermatida (Carranza et al. 1997; Ruiz-Trillo et al. 1999, 2002,

2004; Sempere et al. 2007; Wallberg et al. 2007; Philippe et al. 2007; Baguñà et al.

2008). Os representantes atuais dos “Acoelomorpha” possuem organização corporal

muito simples, carecendo de nefrídeos, glândulas digestivas, cordões nervosos

longitudinais e uma massa nervosa verdadeira, com neurópilo (Ehlers 1984, 1985;


43

Raikova et al. 1998; Reuter et al. 1998). Eles ainda compartilham um sistema ciliar

radiculado, cílios curvados e, provavelmente, padrão de clivagem espiral dueto-

símile (Smith et al. 1986; Haszprunar 1996). Tradicionalmente, os acelomorfos

eram agrupados como ordens da classe Turbellaria, do filo Platyhelminthes (revisto

por Brusca e Brusca 2003). Atualmente, esse novo clado é considerado grupo-irmão

dos Eubilateria ou, como também referido por alguns autores, dos Nephrozoa,

devido ao aparecimento de um sistema excretor (Jondelius et al. 2002; Ruiz-Trillo et

al. 2002; Sempere et al. 2007; Baguñà et al. 2008).

Nesse cenário, as apomorfias de todos os bilaterados seriam o

estabelecimento e consolidação de um novo eixo D-V e a subsequente simetria

bilateral, além do aparecimento de um agregado básico de genes HOX (dois genes

HOX/dois genes ParaHOX) e um conjunto mínimo (dois de três genes) de RNAmi.

Baguñà et al. (2008) ainda destacaram que outra apomorfia importante dos

Triploblastica é a reunião de células nervosas na extremidade anterior, de onde

feixes longitudinais de fibras nervosas se originam. Provavelmente, esses caracteres

surgiram concomitantemente à primeira expansão dos agregados HOX/ParaHOX

(grupo três e genes HOX centrais) e a novos RNAmi (Baguñà et al. 2008). As

plesiomorfias desse grupo, compartilhadas com os ctenóforos, seriam um eixo A-P

(O-AB nos cnidários e ctenóforos), diploblastia (ectoderma e endoderma) e a

presença de um mesoderma verdadeiro (Burton 2008).

Após a divergência dos “acelomorfos” e de outros grupos

acelomados/pseudocelomados atuais (Xenoturbellida) ou extintos, a radiação dos

Nephrozoa (ou eubilaterados) resultou em protonefrídeos, um intestino ininterrupto

e o desenvolvimento progressivo de um sistema nervoso mais concentrado (camadas

de células nervosas circundando um neurópilo e definidas como cordas nervosas

ventrais). O aparecimento de estruturas mais elaboradas também foi acompanhado

por conjuntos completos de agregados de genes HOX/ParaHOX e novos grupos de

RNAmi (Baguñà et al. 2008). Dentro dos nefrozoários encontram-se dois grandes

clados: os protostomados e os deuterostomados.

Os protostomados (do grego proto, “primeiro”; stome, “boca”) foram assim

denominados porque sua boca é formada primeiro, perto ou na abertura do tubo

digestório. Quando presente, o ânus se forma posteriormente, em outra localização.

Nesse grupo, outra grande divisão pode ser feita: a linhagem Lophotrochozoa é

caracterizada por apresentar clivagem espiral, uma forma característica de

alimentação através de um conjunto de tentáculos que circundam a boca (lofóforo)

ou uma forma comum de larva ciliada, nadadora (trocófora) (Halanych et al. 1995).

Todavia, é possível que esse agrupamento necessite ser revisado, pois nem todos os


44

seus membros possuem um lofóforo ou mesmo uma larva trocófora (Giribet 2002;

Brusca e Brusca 2003; Sánchez Alvarado 2003). Platielmintos, briozoários,

anelídeos e moluscos são alguns de seus representantes; por sua vez, nos

Ecdysozoa, estão agrupados os animais que realizam muda de seus esqueletos

externos (exoesqueleto), como no filo Nematoda (vermes cilíndricos) e no filo

Arthropoda (insetos, aracnídeos, ácaros, crustáceos e miriápodes). Cada uma

dessas duas linhagens é considerada monofilética.

Nos deuterostomados (do grego deutero, “segundo”; stome, “boca”), a

abertura oral surge somente após a formação da abertura anal. Ao contrário dos

protostomados, nesse grupo, o blastóporo define o local do ânus. Cordados e

equinodermos são seus representantes, embora os adultos dos equinodermos

exibam simetria radial; suas larvas são originariamente bilaterais.

Assim, os platielmintos têm uma posição central em todos os cenários sobre

a história primordial dos bilaterados. Todavia, a ausência de sinapomorfias

convincentes tem dificultado o agrupamento natural de seus membros, i.e., a

formação de táxons monofiléticos (Carranza et al. 1997; revisto em Baguñà e

Riutort 2004a, b). Na realidade, as características usualmente consideradas como

autapomorfias dos platielmintos são questionáveis. A posse de neoblastos (células-

tronco capazes de substituírem outras células já diferenciadas), como apontado por

Ehlers (1986), ainda não foi devidamente avaliada em diversos outros filos. A

presença de um intestino em fundo-de-saco (i.e., ausência da abertura anal) é,

provavelmente, uma retenção de uma condição primitiva (simplesiomorfia) dos

eumetazoários, que também precisa ser reapreciada em outros bilaterados (p.ex.

Gnathostomulida, Gastrotricha) (revisto em Baguña e Riutort 2004a; Philippe et al.

2007). Ehlers (1985, 1986, 1995) ainda propôs como características autapomórficas

dos platielmintos a presença de protonefrídeos (na realidade, uma sinapomorfia dos

Nephrozoa) e de células epidérmicas multiciliadas sem centríolos, além da ausência

de mitose em células somáticas em todos os estádios pós-embrionários (ver também

Ax 1987). Entretanto, diversos autores têm contestado tais características (Smith et

al. 1986; Rohde 1990). De fato, como visto anteriormente, o filo Platyhelminthes é

polifilético em pelo menos duas de suas ordens (Acoela e Nemertodermatida)

(Carranza et al. 1997; Littlewood et al. 1999a; Ruiz-Trillo et al. 1999, 2002, 2004;

Jondelius et al. 2002; Pasquinelli et al. 2003; Telford et al. 2003; ver Baguñà e

Riutort 2004a; Sempere et al. 2007; Wallberg et al. 2007; Philippe et al. 2007;

Baguñà et al. 2008).

Dessa forma, os Platyhelminthes stricto sensu podem ser subdivididos em

ainda duas distintas linhagens (ver Ruiz-Trillo et al. 1999; Baguñà e Riutort 2004a;


45

Telford et al. 2005). Os Catenulida ocupam uma posição mais basal. Eles possuem

uma massa nervosa verdadeira, com neurópilo e cordões nervosos; um único

protonefrídeo, localizado dorso-medianamente; um sistema reprodutor completo,

com testículos e poro genital masculino localizados dorsalmente na metade anterior

do corpo, além de espermatozóides imóveis, aciliares (ver Baguñà e Riutort 2004a).

Os Rhabditophora compreendem um táxon monofilético, assim denominado devido

à presença, pelo menos primitivamente, de rabditos lamelados (secreções sólidas

com uma camada cortical composta de lamelas arranjadas concentricamente e uma

medula, de consistência homogênea para granular) (Ax 1996). Outras

sinapomorfias do grupo referem-se a um par de órgãos glandulares adesivos e a

presença de protonefrídeos pareados com bulbo flamejante multiciliado e canal

celular interdigitante para formar uma barragem (Ehlers 1985; Littlewood et al.

1999a). Os rabditóforos reúnem a maioria das espécies, primariamente abrangendo

os Macrostomorpha e os Trepaxonemata. Os Macrostomorpha dividem-se ainda

em Haplopharyngida e Macrostomida; nos Trepaxonemata, encontram-se os

Polycladida basais e os Neoophora. O termo Neoophora se refere ao modo de

desenvolvimento dos ovos, no qual pequenos oócitos são circundados por células

vitelínicas individualizadas, formadas por um órgão especializado (vitelário); nos

táxons mais ancestrais, como macrostomídeos e policlados, os oócitos propriamente

ditos são ricos em vitelo e realizam um tipo modificado de clivagem em espiral

(Younossi-Hartenstein e Hartenstein 2000; Morris et al. 2004). Eles formam um

grupo parafilético, conhecido por “Archoophora”.

Os neoóforos se dividem ainda em “Lecithoepitheliata” e Eulecithophora. Os

eulecitoforados então abrangem os clados Prolecithophora, Rhabdocoela e “Seriata”.

Os Rhabdocoela são ainda divididos em mais seis sub-clados: “Dalyellioida”,

Endoaxonemata, Kalyptorhynchia, “Typhloplanoida”, Temnocephalida e

Revertospermata. Por sua vez, os Revertospermata estão reunidos os Fecampiida e

os Mediofusata. Os Mediofusata ainda abrangem as famílias Urastomidae,

Genostomatidae e o grupo parasita Neodermata, que inclui as tradicionais classes

Trematoda, Cestoda e Monogenea. Os “Seriata” são parafiléticos (Carranza et al.

1997). Eles reúnem os Proseriata, Bothrioplanida e Tricladida, que ainda é

subdividido em Maricola, Cavernicola, Paludicola e Terricola (Tyler et al. 2006; ver

também Norén e Jondelius 1999, 2002; Lockyer et al. 2003a).

Os Neodermata são um grupo monofilético, como primeiramente proposto

por Ehlers (1984, 1985) (Littlewood et al. 1999b). As sinapomorfias desse grupo

são: substituição da epiderme larvar por uma neoderme com pericários abaixo da

superfície (tegumento sincicial), ausência de radículas ciliares verticais dos cílios


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epidérmicos, presença de colares elétron-densos de receptores sensoriais

“neodermato-símile” característicos, axonemas dos espermatozóides incorporados

no corpo celular por fusão próximo-distal e incorporação de hospedeiro vertebrado

no ciclo de vida. Dentro dos Neodermata, a análise gênica de pequenas (SSU) e

grandes (LSU) subunidades de RNAr agrupa os Trematoda e os Cestoda, embora

nenhuma sinapomorfia morfológica seja conhecida para esse clado (Lockyer et al.

2003). Nesse trabalho, o suposto clado Cercomeromorphae (Monogenea + Cestoda)

foi rejeitado, ainda que não significativamente. Os trematódeos ainda dividem-se em

Aspidogastrea e Digenea (Littlewood et al. 1999a; Rohde 2001). Entre os cestódeos,

agrupam-se os Gyrocotylidea, Amphilinidea e Eucestoda. Por fim,

Monopisthocotylea e Polyopisthocotylea definem o monofilético táxon Monogenea,

grupo-irmão de Trematoda + Cestoda (Littlewood et al. 1999b; Lockyer et al. 2003).

Um sumário dessas supostas relações filogenéticas apresentadas está representado

na Fig. 1.14. Tais relações ainda estão sendo avaliadas em novas investigações. É

provável que, em breve, outros indícios morfológicos e moleculares possam resultar

em modificações adicionais nesse cenário.

A neoderme foi, provavelmente, uma importante aquisição evolutiva ao

parasitismo nos platielmintos stricto sensu. A localização dos pericários em

camadas mais profundas do tegumento possivelmente foi útil na proteção contra

reações abrasivas ou imunológicas. Nesse contexto, a ausência de radículas

verticais nas placas epidérmicas ciliadas das formas larvais pode ter facilitado a sua

liberação durante a infecção de um hospedeiro. Além disso, a neoderme possui um

importante papel na aquisição de nutrientes, através de uma área superficial

bastante aumentada por microvilosidades, microcristas e concavidades, além de um

vigoroso glicocálice envolvido na incorporação ativa de nutrientes e seu transporte

subsequente (Halton 1997; Tyler e Tyler 1997). Na realidade, uma variedade de

adaptações comportamentais foi necessária para o estabelecimento do parasitismo

entre os platielmintos. Entre elas, a localização e o reconhecimento do hospedeiro

suscetível, a adesão de ovos e sua eclosão em resposta a sinais do hospedeiro,

ritmos endógenos de eclosão e comportamentos especiais das larvas. De fato, não

houve apenas uma única inovação crítica ao sucesso dos platielmintos parasitas.

Como outras associações ecológicas, o parasitismo surgiu diversas vezes entre os

“turbelários” (ver Littlewood et al. 1999b).


47

Figura 1.14. Resumo das relações filogenéticas dos platielmintos. Para mais detalhes e

referências, ver o texto.

O último suposto ancestral comum dos Neodermata ainda é incerto.

Littlewood e colaboradores (1999b) postularam que o ciclo de vida desse ancestral

era direto, por um único hospedeiro vertebrado. A favor dessa hipótese, os autores

argumentaram que os hospedeiros vertebrados são comuns nos ciclos de vida de

todos os Neodermata atuais e que a aceitação do endoparasitismo como modo

primordial de interação seria mais parcimoniosa, já que apenas os Monogenea

apresentam hábito ectoparasita, ao passo que mantêm a neoderme (Littlewood et al.

1999b). Controversamente, Zamparo e colaboradores (2001) defendem que esse

ancestral tinha um ciclo de vida com dois hospedeiros, relacionado com a adição de

um hospedeiro vertebrado ao plesiomórfico ciclo de vida direto em um hospedeiro

artrópode, como primeiramente sugerido por Brooks e colaboradores (Brooks et al.

1985; Brooks 1989a, b; Brooks e McLennan 1993). Nesse cenário, o

endoparasitismo de vertebrados pode ter surgido a partir da predação de artrópodes

(Zamparo et al. 2001).

Dentre os trematódeos, a separação dos Aspidogastrea e Digenea

provavelmente ocorreu concomitantemente com a divergência dos condrictes (p.ex.,

tubarões e raias) e osteíctes (peixes ósseos) (Brooks et al. 1989a). Os trematódeos


48

digenéticos são bastante comuns em membros de todas as classes de vertebrados,

exceto nos Chondrichthyes. Nesses animais, apenas poucos vermes digenéticos

conseguem lidar com a uréia presente em seus tecidos (ver Schmidt e Roberts

2000). Por outro lado, os Cestoda são tolerantes à uréia e podem, inclusive,

degradá-la; com isso, uma diversa gama de cestódeos pode ser encontrada em raias

e tubarões (Read et al. 1959; ver Caira e Jensen 2001).

Os Digenea talvez representem o maior grupo de metazoários endoparasitas,

com cerca de 18.000 espécies nominais (Cribb et al. 2001). Recentemente, Olson e

colaboradores (2003) estimaram a filogenia dos Digenea via parsimônia máxima e

inferência Bayesiana, ao analisar duas sequências gênicas ribossomais (SSU e LSU)

de 163 táxons de vermes digenéticos (compreendendo 77 famílias nominais) e sete

táxons de Aspidogastrea como grupo-externo (representado três famílias). Os

autores concluíram que os trematódeos digenéticos se ramificam em dois clados

principais: os Plagiorchiida e um segundo grupo, que foi nomeado Diplostomida. Os

Plagiorchiida compreendem um vasto grupo de 13 linhagens independentes (para

mais detalhes, ver Olson et al. 2003). Os Diplostomida se dividem ainda em outras

três linhagens: os Brachylaimoidea, no qual os Leucochloridiidae foram agrupados

dentro de “Brachylaimidae”; os Diplostomoidea, com Diplostomidae e “Strigeidae”

misturados, e; os Schistosomatoidea, que reúnem as famílias de ambiente

sanguíneo Sanguinicolidae (parasitas de peixes), “Spirorchiidae” (parasitas de

tartarugas) e Schistosomatidae, além de Clinostomidae (Brooks et al. 1985, 1989a,

b; Olson et al. 2003).

Embora os clinostomídeos não residam no sangue de seus vertebrados, eles

possuem uma íntima relação com as famílias supracitadas, como primeiramente

sugerido por La Rue (1957). Uma prega natatória corporal dorsal na cercária pode

ser a sinapomorfia dos Schistosomatoidea, embora reduzida nos Spirorchiidae e

aparentemente secundariamente ausente nos Schistosomatidae (Pearson 1992);

sua presença ocorre nos Clinostomidae, sugerindo seu agrupamento dentro desse

clado. Ademais, Olson e colaboradores (2003) apontaram que o táxon

Schistosomatoidea somente é monofilético com a inclusão da família Clinostomidae.

Por outro lado, a análise individual ou combinada dos genes ribossomais SSU e

LSU indica que a família Spirorchiidae é, de fato, parafilética; seus membros,

entretanto, são agrupados basalmente dentro de Schistosomatoidea, enquanto os

monofiléticos esquistossomatídeos ocupam uma posição mais derivada (Snyder

2004).

Das mais de 100 famílias nominais de vermes digenéticos, com mais de

10.000 espécies reunidas, apenas duas não são hermafroditas (LoVerde e Chen


49

1991; Platt e Brooks 1997). Entre essas duas, a família Schistosomatidae reúne

membros que parasitam pássaros, mamíferos e crocodilos, além de usarem um

gastrópode como hospedeiro intermediário. Usualmente, seus representantes estão

associados a ambientes de água doce, em regiões temperadas e tropicais. Os

esquistossomatídeos ainda podem ser subdivididos em quatro clados: ocupando

uma posição basal, o clado AO, composto pelos gêneros Autrobilharzia e

Ornithobilharzia, forma o grupo-irmão de Schistosoma; já Schistosoma e

Orientobilharzia definem o clado SO; Heterobilharzia e Schistosomatium

compreendem o clado HS, e; com uma posição mais derivada, o clado BTDG

abrange Bilharziella, Trichobilharzia, Dendritobilharzia e Gigantobilharzia (Lockyer et

al. 2003; Olson et al. 2003; Snyder 2004) (Fig. 1.15).

A localização basal do clado AO reforça o posicionamento de três gêneros de

espirorquídeos que parasitam tartarugas marinhas como grupo-irmão monofilético

de Schistosomatidae, ainda que a família Spirorchiidae seja parafilética e

taxonomicamente inválida (Snyder 2004; ver também Brant e Loker 2005). Como

todos os espirorquídeos, as cercárias das espécies de Autrobilharzia e

Ornithobilharzia possuem ocelos (Lockyer et al. 2003). Outros cinco gêneros

exclusivamente parasitam tartarugas (como hospedeiro definitivo) e caramujos

(como hospedeiro intermediário) de água doce. Eles ocupam uma posição basal na

filogenia dos trematódeos sanguíneos de tetrápodes (Snyder 2004). De fato, as

tartarugas marinhas são consideradas derivadas de um ancestral criptodiro de

água doce, que divergiu há cerca de 90-120 milhões de anos (Shaffer et al. 1997).

Isso sugere que os espirorquídeos marinhos originaram-se a partir de um ancestral

dulcícola, que passou a infectar gastrópodes e tartarugas de ambientes marinhos.

Além disso, esse cenário assume um destacado papel na origem dos

esquistossomatídeos e seu respectivo estado dióico, já que seus membros atuais

mais basais (gêneros Autrobilharzia e Ornithobilharzia) também utilizam

gastrópodes marinhos como hospedeiros intermediários e possuem pronunciado

dimorfismo sexual. Nesse caso, é possível que um ancestral espirorquídeo tenha

conseguido colonizar uma ave marinha como hospedeiro vertebrado (Snyder 2004;

Brant e Loker 2005; ver também a revisão de Platt e Brooks 1997). Outros autores

sugerem que os esquistossomatídeos originaram como parasitos de crocodilos e

evoluíram secundariamente dentro das aves e então mamíferos (Carmichael 1984;

Basch 1991; Morand e Müller-Graf 2000).


50

Figura 1.15. Filograma dos trematódeos de tetrápodes. Baseado em inferência Bayesiana

de dados combinados das subunidades ribossomais pequena e grande de DNA. A topologia

da árvore é idêntica à produzida por análise de parcimônia máxima dos dados combinados.

As famílias as quais pertencem os gêneros dos trematódeos de peixes ou de tetrápodes estão

indicadas à direita da figura; Clinostomum pertence à Clinostomidae. Os hospedeiros

definitivos estão indicados por ícones a direita dos nomes dos gêneros. Para maiores

informações, ver Snyder SD. Phylogeny and paraphyly among tetrapod blood flukes

(Digenea: Schistosomatidae and Spirorchiidae). Int J Parasitol. 2004 Nov;34(12):1385-92.

Indícios adicionais são necessários para determinar a origem da diocia

nesses vermes. Coincidentemente, outras características singulares entre os

Digenea surgiram nos esquistossomatídeos (discutidas por diversos autores, como

Grossman et al. 1981; Short 1983; Carmichael 1984; Basch 1990; Combes 1991;

Basch 1991; Després e Maurice 1995; Platt e Brooks 1997; Morand e Müller-Graf

2000; Snyder 2004; Brant e Loker 2005). A aquisição de corpos mais finos

provavelmente favoreceu o pareamento entre vermes de diferentes sexos (exceto em

Schistosomatium), bem como a cooperação e divisão de funções entre machos e

fêmeas. Geralmente, a fêmea possui um corpo pouco musculoso, com menos


51

parênquima e faringe reduzida; isso dificulta a sua migração intravascular e a sua

digestão. O macho é o oposto, i.e., ele abriga a fêmea no seu canal ginecóforo,

diminuindo o contato dela com sistema imunológico do hospedeiro, além de

transportá-la pela vasculatura hepático-intestinal; os machos aproveitam para

inseminar constantemente as fêmeas. Além disso, a musculatura desenvolvida do

macho auxilia no processo digestório da fêmea, através de inúmeras contrações.

Com uma menor quantidade de tecidos, as reservas energéticas das fêmeas ficam

direcionadas para a produção de ovos e o tamanho mais delgado permite que elas

atinjam vasos de menor calibre, para ovipor. A oviposição em vasos pequenos

aumenta as chances de que os ovos abandonem o território vascular e atinjam a luz

intestinal (Basch 1990; Read e Nee 1990; Platt e Brooks 1997; Morand e Müller-

Graf 2000).

Outras características apontadas como possíveis causas para a diocia dos

esquistossomatídeos se referem à endotermia (Grossman et al. 1981; Short 1983) e

à mudança do ambiente arterial para o venoso, acompanhada pelo desenvolvimento

de um sistema porta homeotérmico e a subsequente colonização de hospedeiros

terrestres, como proposto por Basch (1991). Embora Morand e Müller-Graf (2000)

tenham refutado essa hipótese ao destacar a localização arterial de Griphobilharzia

em crocodilos (ver Platt et al. 1991), Brant e Loker (2005) defendem que

Griphobilharzia amoena esteja, de fato, mais intimamente relacionada aos

espirorquídeos de tartarugas de água doce. Duas implicações então emergem: a

variedade de hospedeiros dos espirorquídeos passa a incluir outros répteis e os

esquistossomatídeos parasitam apenas hospedeiros endodérmicos (Brant e Loker

2005). A colonização do sistema venoso pode ainda ter conduzido a evolução dos

esquistossomatídeos ao causar constantes flutuações ambientais, como aquelas

geradas pelos elaborados sistemas imunológicos dos hospedeiros (Combes 1991). A

habilidade em responder a essas alterações seria favorecida pela presença de um

mecanismo de geração de variabilidade genética, como a reprodução cruzada ou a

existência da diocia. Nesse contexto, a sofistificação dos sistemas imunológicos dos

vertebrados teria um papel central na co-evolução dos esquistossomatídeos.

No entanto, outras duas espécies de esquistossomatídeos residem no sistema

arterial de seus hospedeiros (ver revisão de Loker e Brant 2006): Dendritobilharzia

pulverulenta parasita patos, liberando seus ovos em artérias relativamente grandes,

que são depois carregados pelo fluxo sanguíneo para os leitos capilares do intestino,

e; Schistosoma hippopotami, que se localiza preferencialmente em artérias

pulmonares e nas câmaras direitas do coração, assim como nas principais veias e

no sistema porta hepático do hipopótamo. Os sítios de oviposição não são


52

conhecidos e poucas informações estão disponíveis sobre essa espécie de

esquistossomo (Kruger et al. 1988). É possível que tais espécies sejam exceções à

regra (Loker e Brant 2006). Assim, estudos adicionais são ainda necessários.

Por fim, há 14 gêneros reconhecidos na família Schistosomatidae, com cerca

de 100 espécies de esquistossomos (Khalil 2002). Dessas, cerca de 20 espécies

estão incluídas no gênero Schistosoma. Tais espécies foram inicialmente divididas

em quatro grupos, tendo como base a morfologia de seus ovos, do gênero do

hospedeiro intermediário encontrado naturalmente infectado e nas suas respectivas

distribuições geográficas (ver Rollinson e Southgate 1987). Cada grupo foi nomeado

a partir de seu exemplar considerado mais importante. Todavia, a partir da análise

filogenética de três genes (SSU, LSU e citocromo oxidase 1 mitocondrial), Lockyer e

colaboradores (2003b) sugeriram que o gênero Orientobilharzia seja sinônimo de

Schistosoma. Contudo, o tradicional agrupamento foi pouco comprometido, sendo

agora melhor representado por seis linhagens.

O grupo “japonicum” posiciona-se fortemente na base, como grupo-irmão de

todos os outros esquistossomos (Snyder e Loker 2000; Lockyer et al. 2003b;

Webster et al. 2006). Por esta razão, é provável que o último ancestral comum do

gênero Schistosoma tenha surgido na Ásia (Hirai et al. 2000; Morgan et al. 2003;

Agatsuma 2003). O grupo inclui S. japonicum, S. sinensium, S. mekongi e S.

malayensis. A espécie S. hippopotami ramifica-se individualmente, como um clado

africano (Morgan et al. 2003; Webster et al. 2006). Orientobilharzia e S. incognitum

definem um terceiro clado, ainda pouco resolvido (Lockyer et al. 2003b; Webster et

al. 2003). O grupo “mansoni” é definido pela espécie S. mansoni, objeto dessa

dissertação, e por S. rodhaini, que parasita roedores. O grupo “indicum” é formado

pelas espécies S. indicum, S. nasale e S. spindale, enquanto o grupo “haematobium”

compreende as espécies S. haematobium, S. mattheei, S. intercalatum e S.

guineensis, que infectam o homem e as espécies S. margrebowiei, S. leiperi, S. bovis

e S. curassoni parasitam principalmente ovelhas e o gado (Webster et al. 2006). Pelo

menos 165 milhões de bovinos são afetados pela esquistossomose (de Bont e

Vercruysse 1997).

Na África, a divergência entre os grupos “mansoni” e “haematobium”

provavelmente ocorreu há mais de cem milhões de anos, que corresponde ao tempo

de divergência dos respectivos hospedeiros caramujos, Biomphalaria e Bulinus

(Davis et al. 1980, 1993). Por outro lado, a colonização da América do Sul pelo S.

mansoni parece ser bem mais recente, causada pelo advento do tráfego negreiro

oriundo da África Ocidental (Snyder e Loker 2000; Morgan et al. 2005). Todos os


53

isolados brasileiros de S. mansoni têm haplotipos de DNAmt praticamente idênticos,

sugerindo a ocorrência de efeito fundador no seu estabelecimento e dispersão

(Morgan et al. 2005).

I.2.5.3 – Visão geral do desenvolvimento embrionário dos platielmintos

Como descrito anteriormente, a filogenia dos platielmintos ainda é bastante

controversa e o estudo da embriogênese desse grupo pode auxiliar na determinação

das suas relações de parentesco. De fato, o desenvolvimento e a reprodução podem

estar estreitamente interligados nesse grupo, principalmente entre os “turbelários”

terrestres e dulcícolas. Eles possuem uma impressionante capacidade regenerativa

(revisto por Egger et al. 2007). A reprodução assexuada pode ocorrer por fissão

transversal simples, fissão transversal múltipla e fragmentação. Por sua vez, os

trematódeos (como no caso de S. mansoni) multiplicam assexuadamente suas

formas larvais em determinado ponto de seus ciclos, o que determinou uma

importante aquisição adaptativa na sobrevivência dessas espécies. Já a reprodução

sexuada assegura a variabilidade da prole pelo intercâmbio de material genético,

mesmo nos platielmintos hermafroditas. De fato, uma grande variedade de formas

do sistema reprodutor é encontrada nos platielmintos: no sistema masculino, os

testículos podem ser únicos, pareados ou múltiplos; enquanto que no sistema

feminino, a organização depende do tipo de ovo produzido. Nessa seção, o

desenvolvimento embrionário dos táxons de platielmintos será brevemente

exemplificado a partir de algumas espécies selecionadas. Uma comparação das

estratégias de desenvolvimento nos diferentes táxons de platielmintos está

representada na Fig. 1.16.


54

Figura 1.16. Estratégias de desenvolvimento em diferentes táxons de platielmintos. Representação esquemática de secções sagitais de embriões em diferentes estádios (A zigoto

fertilizado; B clivagem; C gastrulação/camadas germinativas; D organogênese; E embrião

maduro). Os diferentes tipos de tecidos estão destacados em cores diferentes (ver legenda).

Para maiores informações, ver Hartenstein V, Ehlers U. The embryonic development of the

rhabdocoel flatworm Mesostoma lingua (Abildgaard, 1789). Dev Genes Evol. 2000 Sep;210(8-

9):399-415.


55

I.2.5.3.1 – “Arcoóforos”

Os membros desse grupo são reunidos por conveniência, pois todos têm ovos

endolécitos, i.e., os oócitos propriamente ditos são ricos em vitelo. Tipicamente, eles

também possuem um órgão produtor tanto de ovos quanto de vitelo. Tal órgão é o

germovitelário, que pode ser único ou pareado. Contudo, esse grupo não é

taxonomicamente válido.

Acoela e Nemertodermatida

Embora diversas evidências moleculares recentes e alguns indícios

morfológicos considerem os Acoela e os Nemertodermatida como grupos externos

aos platielmintos stricto sensu (Carranza et al. 1997; Littlewood et al. 1999a; Ruiz-

Trillo et al. 1999, 2002, 2004; Reuter et al. 2001; Jondelius et al. 2002; Pasquinelli

et al. 2003; Telford et al. 2003; Baguñà e Riutort 2004a, b; Egger e Ishida 2005;

Sempere et al. 2007; Wallberg et al. 2007; Philippe et al. 2007; Baguñà et al. 2008),

a embriogênese desses grupos será sumariada para comparação.

Os acoelos possuem organização corporal muito elementar: quando presente,

a faringe é simples; a cavidade digestória não é permanente; a boca ou faringe

levam a uma massa sincicial sólida ou a uma massa celular endodérmica. Esses

animais são pequenos (1-5 mm) e marinhos. Alguns poucos são planctônicos ou

simbiontes (Brusca e Brusca 2003). A espécie Neochildia fusca tem um padrão de

clivagem espiral em dueto, no qual a segunda clivagem ocorre em um plano oblíquo

levotrópico em relação ao eixo animal-vegetal. No estádio de quatro-células, o plano

da primeira clivagem corresponde ao plano de simetria bilateral. As clivagens

restantes são simétricas ao plano sagital. Os primeiros três duetos de micrômeros

originam somente derivados ectodérmicos; o ectomesoderma não se forma. O

terceiro dueto de macrômeros forma o endomesoderma, com a complexa

estruturação de fibras musculares circulares, longitudinais e oblíquas, além do

parênquima periférico e central. Os acoelas exibem um padrão único de

desenvolvimento, pouco parecido com outros espiralianos (p.ex. policlados) (Henry

et al. 2000).

Os Nemertodermatida também possuem uma simples faringe, quando

presente. A cavidade digestória possui processos interdigitantes a partir de seu

revestimento intestinal. Os espermatozóides são uniflagelados, enquanto os outros

platielmintos possuem espermatozóides com dois ou nenhum flagelo. Habitam em

zonas marinhas subtidais de lodo e areia. Um gênero (Meara) é parasita de pepinos-

do-mar (Brusca e Brusca 2003). Não foram encontradas informações sobre o

desenvolvimento embrionário desse grupo.


56

Catenulida

Os vermes catenulídeos são alongados, marinhos ou dulcícolas; possuem

uma faringe simples e um sistema digestório em fundo de saco elementar. Em

alguns casos, o mesênquima é reduzido em uma matriz fluída (Brusca e Brusca

2003). Os catenulídeos reproduzem-se assexuadamente por fissão transversal,

formando cadeias de zoóides (Hyman 1951; ver também Egger et al. 2007). No

entanto, não foram encontradas informações sobre o desenvolvimento embrionário

desse grupo.

Macrostomorpha

Esse táxon compreende os Haplopharyngida e os Macrostomida. Como

observado em acoelos e catenulídeos, o modo de reprodução dos macrostomorfos

está intimamente associado com a capacidade regenerativa (revisto por Egger et al.

2007). Os Haplopharyngida são organismos diminutos, com até 6 mm de

comprimento, e possuem uma probóscide e uma faringe simples. A probóscide

separa-se da faringe, sob a extremidade anterior do corpo. O poro anal é

ligeiramente desenvolvido, mas permanente. O cérebro é encapsulado por uma

membrana única (Brusca e Brusca 2003). Não foram encontradas informações

sobre o desenvolvimento embrionário desse grupo.

Os macrostomídeos são pequenos e predominantemente intertidais,

marinhos ou dulcícolas. Possuem uma faringe elementar e um intestino em fundo-

de-saco também simples (Brusca e Brusca 2003). A espécie Macrostomum sp. sofre

um padrão de clivagem espiral modificado, em quartetos; os micrômeros não são

tão menores em comparação com os macrômeros. A estereoblástula resultante é

circundada por uma camada vitelínica externa, que se origina a partir de grandes

células vegetais periféricas. Tais células vegetais se destacam do embrião e

achatam-se (membrana externa, do inglês hull membrane). Essas células,

primeiramente descritas por Seilern-Aspang (1957) para M. appendiculatum e Tyler

(1981) para M. hystricinum, formam o envoltório vitelínico externo, que

gradualmente desaparece durante o desenvolvimento (Morris et al. 2004). Células

periféricas anteriores e laterais geram o primórdio somático, que formará a parede

corporal e o sistema nervoso. No centro do embrião, algumas células originam o

grande primórdio digestório, rico em vitelo. Os primórdios da faringe e da massa

nervosa aparecem como densidades simétricas antero-ventrais, dentro do primórdio

somático. O neurópilo central da massa nervosa é formado a partir da extensão dos

axônios neuronais. A camada celular mais externa do primórdio somático

diferencia-se em epitélio epidérmico ciliado. Outros cílios surgem no lúmen do


57

primórdio faringiano, no sistema protonefridial e, mais tardiamente, no lúmen

intestinal. Em seguida, o primórdio somático estende-se ao redor da superfície

ventral e dorsal, formando completamente a parede corporal. Os precursores

musculares se diferenciam em miofilamentos de uma rede ortogonal de fibras

circulares, diagonais e longitudinais altamente organizadas. Por fim, neurônios do

primórdio nervoso originam uma comissura no neurópilo, da qual se estende

posteriormente um par único de troncos nervosos ventro-laterais (cordões

longitudinais principais). O lúmen do primórdio faringiano fusiona-se

proximalmente com a epiderme ventral e distalmente com o intestino, formando um

tubo digestório contínuo. O corpo da larva assume um formato em “U”, enquanto o

sistema nervoso enfim se condensa. Nesse momento, a larva está pronta para

eclodir (Morris et al. 2004).

Polycladida

A maioria dos vermes policlados possui faringe pregueada e intestino multi-

ramificado, com divertículos. Esses animais compreendem um grupo diverso, com

formas relativamente grandes; geralmente, habitam zonas litorâneas, especialmente

nos trópicos. São, predominantemente, bentônicos e de vida-livre. Poucos são

pelágicos ou simbiontes (Brusca e Brusca 2003). Diversos policlados tiveram sua

embriogênese documentada (Lang 1884; Surface 1907; Kato 1940; Boyer et al.

1996, 1998; Younossi-Hartenstein e Hartenstein 2000; Younossi-Hartenstein et al.

2000).

Em geral, os dois primeiros planos de clivagem são oblíquos ao plano de

simetria bilateral e os blastômeros do estádio de quatro-células têm,

aproximadamente, o mesmo destino daqueles de outros Spiralia mais derivados

(Henry et al. 1995). O estádio de quatro-células de Hoploplana inquilina consiste de

dois blastômeros vegetais grandes, que se encontram sobre o sulco de clivagem, e

dois blastômeros menores, no pólo animal. A segunda clivagem dá origem ao

primeiro quarteto de micrômeros, que produzirá a maioria do ectoderma anterior e

lateral da larva resultante. O segundo quarteto de micrômeros forma o ectoderma

dorsal e ventral, além dos músculos circulares. Já o terceiro quarteto de

micrômeros origina apenas pequenos clones de ectoderma. Como observado por

Surface (1907) e Kato (1940), somente a célula 4d do quarto quarteto contribui para

a estrutura interna da larva, produzindo o endoderma, o mesênquima e os

músculos longitudinais (Boyer et al. 1998). Contudo, segundo van den Biggelaar e

colaboradores (1997), a célula 4d se divide assimetricamente em células-filha

animal (4d1) e vegetal (4d2). Apenas a célula 4d1 se divide então simetricamente em


58

células-tronco esquerda e direita dos cordões mesodérmicos. O mesentoblasto em

policlados forma-se então uma geração após do que em moluscos e anelídeos (van

den Biggelaar et al. 1997). Além disso, o quarto quarteto de células 4a, 4b e 4c não

forma apenas endoderma, mas contribui também para a formação do ectoderma

(Boyer et al. 1996). A figura 1.17 exibe os estádios iniciais do desenvolvimento dos

policlados. Ao final da embriogênese dos policlados, dois tipos larvais podem

emergir: a larva de Müller, com oito lobos ventrais ciliados, e; a larva de Götte, com

apenas quatro (Fig. 1.18) (Nielsen 1995; Brusca e Brusca 2003).

Na espécie Imogine mcgrathi, os quartetos de micrômeros 1-3 formam uma

camada dupla irregular de células mesenquimais, que se expande durante a

gastrulação (por epibolia) sobre o quarto quarteto de micrômeros. O micrômero 4d

se divide em diversos precursores mesendodérmicos grandes, que definem o lado

ventral do embrião. Essas células formam com os micrômeros sub-superficiais do

pólo animal uma profunda camada, que originará todas as estruturas internas do

embrião (sistema nervoso, musculatura, protonefrídeos e intestino). Os micrômeros

4a-c são células vitelínicas grandes que são incorporadas no lúmen intestinal; elas

não contribuem para o epitélio desse órgão. Logo após a gastrulação, ocorre a

diferenciação celular, em um padrão bastante similar ao dos rabdocelos

(Hartenstein e Ehlers 2000; Younossi-Hartenstein e Hartenstein 2000): as células

da superfície assumem características epiteliais e formam cílios; já outras células

um pouco mais profundas, posicionadas lateralmente, formam os protonefrídeos.

Na região anterior do embrião, um agregado de cerca de 50 células forma a massa

nervosa. A pigmentação dos ocelos ocorre assincronicamente. A faringe forma-se a

partir de uma invaginação ectodérmica, que se fusiona posteriormente com o

intestino densamente ciliado. Após cerca de sete dias, uma larva tipo de Götte está

pronta para eclodir (Younossi-Hartenstein e Hartenstein 2000).


59

Figura 1.17. Clivagem em espiral de um policlado. Visão do pólo animal, excetuando o

estádio de quarto quarteto (fourth quartet), visto do pólo vegetal. O grande quarto quarteto

de micrômeros (4a-4d) e os diminutos macrômeros (4A-4D) são característicos desse grupo.

No estádio de 4-células, os blastômeros B e D encontram-se no sulco de clivagem vegetal.

Tipicamente, os micrômeros derivados dos quadrantes B e D encontram-se no sulco de

clivagem animal. Para maiores informação, ver Boyer BC, Henry JJ, Martindale MQ. The cell

lineage of a polyclad turbellarian embryo reveals close similarity to coelomate spiralians.

Dev Biol. 1998 Dec 1;204(1):111-23.

Figura 1.18. Larva de Müller. Visão da “face” da larva do policlado Planocera. Fonte: Brusca RC, Brusca GJ. Invertebrates. 2ª ed. Sunderland (MA): Sinauer Associates. 2003.


60

I.2.5.3.2 – Neoóforos

Como mencionado, esse é um táxon monofilético. A sinapomorfia de todos os

seus integrantes é a produção de ovos ectolécitos, ou seja, de oócitos pequenos,

circundados por células acessórias individualizadas. Essas células são as células

vitelínicas, produzidas por um órgão especializado, chamado vitelário, ou

glândulas vitelínicas.

“Lecithoepitheliata”

Esse grupo parafilético apresenta variadas organizações de faringe, mas

intestino simples. Cerca de 30 espécies estão reunidas nesse clado por dividirem

uma condição intermediária entre ovos endolécitos e ectolécitos (Brusca e Brusca

2003). Poucas informações sobre a embriogênese desse grupo foram encontradas.

Segundo Hartenstein e Ehlers (2000), citando Reisinger et al. 1974a, b), o quarteto

de micrômeros expande-se (por epibolia) sobre os macrômeros, incluindo parte do

vitelo dentro da cavidade corporal embrionária primária. As células ectodérmicas

“extra-embrionárias” dão origem a uma membrana externa (hull membrane)

transitória, enquanto que alguns dos micrômeros reconstituem o ectoderma

embrionário propriamente dito: a monocamada plana formada define a superfície

ventral do primórdio embrionário. Esse ectoderma embrionário gradualmente

cresce, circundando o embrião e o vitelo localizado abaixo da membrana externa. A

epiderme então se diferencia e as camadas internas do primórdio embrionário

originam a massa nervosa, a musculatura, a faringe e os nefrídeos.

Prolecithophora

Os prolecitóforos têm uma faringe pregueada ou bulbosa e intestino simples.

São animais pequenos, de vida-livre, marinhos ou dulcícolas (Brusca e Brusca

2003). Não foram encontradas informações sobre o desenvolvimento embrionário

desse grupo.

“Seriata”

Esse grupo parafilético reúne os Proseriata, os Bothrioplanida e os Tricladida.

Os Seriata possuem uma grande capacidade regenerativa, que é utilizada como

estratégia de reprodução assexuada. De fato, essa habilidade em Bothrioplanida

ainda não foi extensivamente avaliada (revisto por Egger et al. 2007). Por causa

dessa impressionante característica, o táxon Tricladida tem recebido especial

atenção. Seus membros possuem uma faringe cilíndrica pregueada e o intestino tri-


61

ramificado, com numerosos divertículos (Brusca e Brusca 2003). As planárias (p.ex.

Dugesia e Schmidtea) estão entre os representantes mais conhecidos e melhor

estudados desse grupo.

Na espécie de planária Schmidtea polychroa, os ovos possuem de dois a seis

oócitos envoltos por células vitelínicas, que se fusionam em um sincício.

Particularmente, os triclados têm um tipo único de clivagem entre os platielmintos,

denominado anarquia dos blastômeros. Ao invés de formar uma mórula ordenada

de micrômeros e macrômeros, os blastômeros perdem o contato e migram

ativamente para diversas posições, dentro do sincício vitelínico. Mais tarde, a

maioria dos blastômeros se reassocia para formar o embrião. No entanto, alguns

blastômeros permanecem no vitelo e sofrem divisões como uma população de

células espalhadas. Outro grupo de blastômeros se diferencia em uma epiderme

embrionária transitória (membrana externa, do inglês hull membrane), que circunda

parcialmente o sincício vitelínico e a faringe embrionária. A membrana externa

mantém uma abertura pela qual o vitelo exterior pode movimentar-se para dentro

da cavidade gástrica limitada por ela, no centro do sincício vitelínico. Essa abertura

tem um anel muscular que atua como faringe e define o pólo posterior do embrião.

O sincício e os blastômeros contidos na cavidade gástrica são então comprimidos

em uma delgada camada periférica. Perto da faringe, precursores de cordões

nervosos ventrais bilateralmente simétricos estendem-se para a região anterior.

Uma massiva proliferação celular dá então início à diferenciação dos primeiros

tecidos embrionários definitivos, enquanto grandes células ricas em vitelo, que

revestiam o sincício, formam a gastroderme. O sincício vitelínico externo é

reabsorvido e as células embrionárias contidas nele diferenciam-se em um

arcabouço irregular de células musculares e nervosas. A epiderme embrionária

transitória é enfim substituída por células epidérmicas verdadeiras. Populações

frouxamente espalhadas de células em diferenciação consolidam estruturalmente

os órgãos do embrião, que assume uma característica vermiforme. Os eventos

morfogenéticos da embriogênese de S. polychroa assemelham-se ao cenário

regenerativo. Para informações adicionais e outras referências, ver Cardona et al.

(2005).

Rhabdocoela

Os rabdocelos formam um grupo diverso e amplo, dividido em “Dalyellioida”,

Endoaxonemata, Kalyptorhynchia, “Typhloplanoida”, Temnocephalida e

Revertospermata. Todos os rabdocelos possuem uma faringe bulbosa e intestino em


62

fundo-de-saco simples, sem divertículos. Os ovários são completamente separados

do vitelário (Brusca e Brusca 2003).

Aparentemente, o tifloplanóide Mesostoma lingua não segue o padrão típico

para a clivagem em espiral: os quartetos regulares de macrômeros e micrômeros

não foram identificáveis por Hartenstein e Ehlers (2000). No centro do ovo, o zigoto

sofre quatro ou cinco clivagens, dando origem a um disco sólido, grosseiramente

circular (estereoblástula). Esse disco migra para a periferia do ovo, onde adquire

simetria bilateral: o contato com a superfície do ovo define a futura superfície

ventral do embrião. Ao contrário dos neoóforos basais (p.ex. “Lecithoepitheliata”), a

membrana externa (hull membrane) é formada pelas células vitelínicas, ao invés dos

blastômeros. Essa membrana circunda todo o vitelo, desde o início da

embriogênese. Os primeiros primórdios de órgãos (massa nervosa e faringe) surgem

a partir de massas mesenquimais de células. Não há gastrulação em Mesostoma e a

organogênese tem início com a formação do epitélio epidérmico na superfície ventral

do embrião. Células mais internas se diferenciam em neurônios, células

musculares (somáticas e da faringe) e em células epiteliais faringianas e excretoras

(protonefrídeos). A diferenciação dos ocelos destaca-se pela produção de

pigmentação. A massa nervosa compacta-se, enquanto as células musculares

(miócitos) assumem aspecto filiforme. Contrações da larva tornam-se aparentes em

ovos vivos, quando a larva está pronta para eclodir (ver Hartenstein e Ehlers 2000).

A embriogênese de outra espécie de rabdocelo, o dalielídeo Gieysztoria

superba, apresenta diversas similaridades com Mesostoma, como a clivagem

irregular, o primórdio embrionário mesenquimal e a ausência de gastrulação.

Entretanto, em comparação com outros rabdocelos, Gieysztoria exibe uma precoce

diferenciação do epitélio intestinal e no aparelho genital masculino. Na metade da

embriogênese, a camada epidérmica invagina (“invaginação embrionária”),

deslocando o embrião para o centro do vitelo. Em seguida, a organogênese tem

início. Nos estádios finais do desenvolvimento, o embrião everte-se de volta à

superfície, onde o primórdio epidérmico expande-se ao redor do vitelo para fechar-

se dorsalmente. No Mesostoma, essas estruturas são formadas após a eclosão (ver

Younossi-Hartenstein e Hartenstein 2000). A embriogênese dos rabdocelos

temnocefalídeos Craspedella pedum e Diceratocephala boschmai também foi

estudada por Younossi-Hartenstein e Hartenstein (2001).

Monogenea

A maioria de seus membros é ectoparasita, usualmente de peixes. Poucos

são endoparasitas de vertebrados ectotérmicos (Brusca e Brusca 2003). Possuem


63

um corpo recoberto por tegumento, a ventosa oral é reduzida ou ausente e não

possuem acetábulo. Esses animais têm um pró-haptor anterior e um órgão

posterior de fixação, o opistohaptor. O ciclo de vida passa apenas por um único

hospedeiro (Brusca e Brusca 2003).

A embriogênese desse grupo é bastante peculiar. Em Gyrodactylus sp., cada

geração de embriões é sequencialmente encapsulada e nutrida pela sua geração

anterior, por pelo menos 20 gerações (Braun 1966; Harris 1998). Isto é, os embriões

se desenvolvem dentro de outros mais antigos, que surgiram a partir do mesmo

zigoto. Todos os embriões dentro desse grupo têm o mesmo genótipo (Harris 1993,

1998). A reprodução dessa espécie segue um padrão específico: o desenvolvimento

da primeira progênie ocorre assexuadamente, enquanto seu progenitor ainda é um

embrião. As progênies subsequentes se desenvolvem a partir de oócitos, que

adentram o útero após o nascimento da geração precedente. Somente após o início

do desenvolvimento da segunda progênie, o sistema reprodutor masculino torna-se

funcional (Harris 1985) e as progênies subsequentes desenvolvem-se tanto

partenogeneticamente quanto sexualmente (Harris 1993).

Após a entrada de um oócito no útero, a primeira clivagem divide o zigoto

longitudinalmente em dois blastômeros iguais, os quais podem ser encontrados

dissociados no útero, devido à atividade muscular do progenitor. A dissociação e

redistribuição das células dentro do útero continuam enquanto as clivagens iniciais

prosseguem. As células podem mover-se livremente e se associarem ou se

dissociarem umas das outras (anarquia dos blastômeros, como nos triclados).

Subsequentemente, pares de micrômeros posicionam-se predominantemente na

região anterior, sobre o sulco entre dois macrômeros. O destino de células

individuais é de difícil determinação por técnicas convencionais de microscopia.

Diversos rearranjos ocorrem no estádio de oito-células. A clivagem não é em

mosaico, mas deve ser altamente regulada. A presença de um ou dois macrômeros

quiescentes dentro da massa de micrômeros também é fonte de variação: eles

podem se dividir entre os estádios de 30 a 150-células (Fig. 1.19). Os mecanismos

de diferenciação e separação do tegumento de um dos embriões (progênie) e da

parede uterina do outro (progenitor) ainda não são conhecidos. Estruturas como o

intestino, o sistema excretor e o aparelho de adesão se diferenciam mais tarde, pós-

embrionariamente (Cable e Harris 2002). Para informações adicionais, ver os

trabalhos de Cable et al. (1998), Cable et al. (2002) e Cable e Harris (2002).


64

Figura 1.19. Desenvolvimento inicial de embriões F1 de Gyrodactylus gasterostei. Representação esquemática a partir de preparações inteiras, visualizadas por microscopia

de contraste de fase. A Segunda e terceira clivagem, gerando micrômeros e macrômeros. B

Conformações diferentes dos estádios de oito-células. C Ambos os macrômeros em divisão,

nos estádios de 50- e 150-células. Para maiores informações, ver Cable J, Harris PD.

Gyrodactylid developmental biology: historical review, current status and future trends. Int

J Parasitol. 2002 Mar;32(3):255-80.

Trematoda

Como mencionado anteriormente, os trematódeos têm um tegumento

especializado e duas ventosas. A maioria de seus membros é endoparasita de dois

ou três hospedeiros durante o seu ciclo de vida (Brusca e Brusca 2003). Em geral,

pouco se sabe sobre a embriogênese dos ovos de trematódeos: apenas as espécies

de importância médica ou veterinária foram alvos de alguns estudos (p.ex., para

Schistosoma, ver Vogel 1942; Prata 1957; para Fasciola, Horstmann 1962; Schmidt

1998; para Echinostoma, Idris e Fried 1996; Schmidt 1998; Fujino et al. 2000). Uma

revisão das informações disponíveis sobre o desenvolvimento embrionário dos ovos

de S. mansoni será apresentada na seção 2.6.


65

Cestoda

Exclusivamente endoparasitas, as tênias possuem um corpo recoberto por

tegumento, dividido em um escólex anterior, um curto pescoço e um estróbilo. O

estróbilo é formado por uma série de segmentos, ou proglótides. O tubo digestório é

ausente (Brusca e Brusca 2003). A morfologia do primeiro estádio larval pode variar

bastante entre os diferentes subtáxons de Cestoda. Os girocotilideanos e

anfilinidianos, que parasitam peixes marinhos, produzem uma larva licófora, que

exibe diversas características das larvas ou formas juvenis de platielmintos de vida-

livre (Rohde e Georgi 1983; Xylander 1986, 1987). As larvas licóforas possuem um

corpo alongado, uma massa nervosa anterior, um sistema de protonefrídeos

pareados e uma epiderme ciliada. Na região distal, os girocotilidianos e

anfilinidianos têm um conjunto de dez ganchos para fixação ao hospedeiro

crustáceo, que necessitam ativamente localizar e penetrar.

Os cestódeos mais derivados (Cestoidea), que são parasitas de vertebrados

aquáticos e terrestres, possuem dois tipos de larvas: coracídio, para aqueles de

ambiente aquático, e oncosfera, para os terrestres. Nos dois casos, as larvas têm

estrutura simplificada e precisam ser ingeridas pelo hospedeiro para continuarem

seus ciclos de vida. Ambas as larvas são diminutas esferas (menos de 20 µm de

diâmetro), com até 100 células (revisto em Rybicka 1966; Ubelaker 1980). Em

Hymenolepis diminuta, a oncosfera madura tem menos de 50 células. No início da

embriogênese, o oócito sofre clivagem total e desigual (a clivagem em espiral não é

aparente), gerando cinco grandes macrômeros e diversos micrômeros. Os primeiros

dois macrômeros fusionam-se em para formar o envoltório externo. Os três

macrômeros restantes formam outro sincício, que se expande e envolve a massa de

micrômeros em divisão. O envoltório interno, ou embrióforo, é desprovido de cílios

e resistente, sendo considerado homólogo à epiderme ciliada primária de outras

larvas de cestódeos. Os micrômeros sofrem diversas outras divisões, formando uma

massa mesenquimal bilateralmente simétrica. Aparentemente, não há folhetos

embrionários na massa celular e a gastrulação também parece não ocorrer (ver

Hartenstein e Jones 2003).

A diferenciação celular tem início com a formação de três pares de ganchos

(descrito por Swiderski 1973, para Catenotaenia pusilla), cujos primórdios

aparecem adjacentes aos grandes núcleos ovóides dos oncoblastos. Os ganchos

crescem e rompem a membrana dessas células, alcançando seu tamanho e forma

(lâmina, colar ou haste) finais. Entre os oncoblastos, dois pares de células

precursoras das glândulas epidérmicas se localizam no pólo posterior do embrião.

Essas células precursoras se achatam e emitem projeções em direção à região


66

anterior do embrião, onde encontram processos semelhantes, de outras células

glandulares. Ao lado do par de precursores das glândulas epidérmicas antero-

mediais, localizam-se precursores neurais, que emitem pequenos processos

direcionados posteriormente. Nesse momento, os mioblastos se diferenciam em

fibras musculares ao redor dos ganchos e da parede corporal. A parede corporal

compreende uma fina camada sincicial e o epitélio embrionário. Esse epitélio

envolve o sistema de células glandulares, formando-se pelo posicionamento do

corpo celular de uma célula binucleada em camadas profundas, no centro da

oncosfera; ele corresponde à neoderme sincicial, não-ciliada, que forma o

tegumento dos cestódeos. A glândula de penetração origina-se a partir de um

sincício de células repletas com grânulos, arranjadas em “U”. Ao término da

embriogênese, a oncosfera, ao ser ingerida, perde seus envoltórios protetores e

penetra na parede intestinal do hospedeiro primário. Na cavidade corporal, a

oncosfera sofre metamorfose em um segundo tipo larva, chamado cisticercóide (ver

Hartenstein e Jones 2003).

I. 2. 6 – Desenvolvimento Embrionário do Ovo de Schistosoma mansoni

Historicamente, a biologia dos ovos dos esquistossomos vem sendo tratada

apenas marginalmente, com a atenção voltada principalmente para a formação de

granulomas e o efeito de tratamentos quimioterapêuticos na oviposição das fêmeas.

Apesar dos recentes avanços em estudos moleculares (genômica, transcriptômica,

glicômica, lipidômica e outros), os ovos continuam sendo considerados como uma

entidade única, invariável durante o tempo. Obviamente, isso não é verdade e os

ovos provavelmente apresentarão perfis de expressão gênica e ativação de proteínas

distintos durante a sua embriogênese. Todavia, apenas estudos esporádicos

abordam o desenvolvimento embrionário do ovo, alguns ainda superficialmente (ver

Neill et al. 1988; Swiderski 1984, 1994; Ashton et al. 2001; Freitas et al. 2007). A

escassez de informações sobre essa fase do ciclo dos esquistossomos pode ser

reflexo das dificuldades técnicas para estudá-los (ver Neill et al. 1988; Ashton et al.

2001; Jurberg et al. 2008a). A seguir, as informações disponíveis sobre a biologia do

desenvolvimento dos ovos de S. mansoni serão sumariadas.

I.2.6.1 – Fecundação

Na fêmea acasalada, logo após deixar o ovário, o oócito maduro é

provavelmente fecundado na porção posterior do oviducto. Nessa região, Erasmus


67

(1973) identificou a presença de espermatozóides em fêmeas maduras, mas não em

fêmeas imaturas ou de infecções unissexuais. Também conhecido como

receptáculo seminal, essa câmara no oviducto possui paredes lamelares que

ajudam a reter os espermatozóides (Spence e Silk 1971). Em S. japonicum, Yang e

colaboradores (2003) observaram que a fecundação ocorre em uma região especial,

carente de lamelas, logo antes do receptáculo seminal. Como sugerido, isso

possibilitaria que os espermatozóides tenham livre movimentação para encontrar e

fecundar um oócito.

Grânulos corticais nos oócitos maduros evitam a polispermia (fecundação

múltipla) (Erasmus 1973; Orido 1988). Tais grânulos não são observados após a

fecundação (Orido 1988) ou em oócitos de fêmeas de infecções unissexuais

(Erasmus 1973). Em mamíferos, grânulos desse tipo rapidamente se fusionam com

a membrana plasmática do oócito após a penetração do espermatozóide. Diversas

enzimas são liberadas, atuando na modificação ou destruição de sítios de ligação de

receptores para os espermatozóides. Além disso, uma espessa camada é formada,

impossibilitando a entrada de outros espermatozóides. Os mecanismos bioquímicos

que regem esse fenômeno ainda são desconhecidos nos esquistossomos.

Com a fecundação, a primeira divisão meiótica é completada e os

cromossomos reaparecem. O zigoto é formado a partir da fusão dos pró-núcleos

masculino e feminino, após a segunda divisão meiótica e a extrusão do corpúsculo

polar, como observado em S. japonicum (Yang et al. 2003). A célula-ovo passa

através do receptáculo seminal cheio de espermatozóides, migra pelo oviducto e

então pelo vitelo-oviducto. Nesse momento, células vitelínicas maduras circundam

o zigoto (modo de desenvolvimento ectolécito, característico em vermes neoóforos).

O preciso número de células vitelínicas ao redor do zigoto de S. mansoni ainda é

incerto – variando de 20 a cerca de 40 células (Erasmus 1987; Smyth e Clegg 1959;

Smyth e Halton 1983; Wells e Cordingley 1991). Então, as contrações musculares

dos vermes em cópula auxiliam a rápida passagem desse aglomerado celular para o

oótipo, onde ocorre a formação da casca (Moczon et al. 1992).

I.2.6.2 – Formação da casca do ovo

A formação do ovo propriamente dito tem início com a polimerização de sua

casca em uma câmara especializada do sistema reprodutor da fêmea. Nessa

câmara, ou oótipo, a massa de células vitelínicas que circunda o zigoto encontra

um ambiente viscoso, ligeiramente alcalino (pH 7,0-7,5), devido às secreções das

glândulas de Mehlis (Wells e Cordingley 1991). O meio alcalino provoca a secreção

de vesículas ácidas, que contêm as proteínas precursoras da casca e enzimas fenol


68

oxidases. De fato, todos os componentes necessários para a formação da casca

estão presentes nessas vesículas (Wells e Cordingley 1991), tendo sido previamente

sintetizados pelas células vitelínicas, ainda nas glândulas vitelínicas (vitelário)

(Threadgold 1982; Koster et al. 1988; Erasmus 1987). Assim, é possível que o sinal

desencadeante para a formação da casca seja uma pequena molécula (ainda

desconhecida) que interaja com um receptor nas células vitelínicas, disparando

uma série de eventos intracelulares (Berridge e Irvine 1989). Esses eventos

culminam no aumento do cálcio intracelular, que causa a exocitose dessas

vesículas (Wells e Cordingley 1991).

A exocitose das vesículas ácidas diminui ligeiramente o pH do fluído em

torno da massa celular, suficiente para prevenir a fusão imediata dos grânulos

precursores da casca. Nesse momento, o oótipo se contrai vigorosamente e relaxa

por algumas vezes, provavelmente modelando a nova casca em seu formato

característico (Wells e Cordingley 1991). A casca do ovo se forma então pela ligação

cruzada de monômeros de pelo menos três famílias distintas de proteínas – P14,

P34 e P48 (Ebersberger et al. 2005), presumivelmente em um processo baseado no

enrijecimento de quinonas mediado por fenol oxidases (Wells e Cordingley 1991;

Fitzpatrick et al. 2007). A inibição de duas dessas enzimas (tirosinases 1 e 2, ou

SmTYR1 e SmTYR2), mediada pela incubação de ácido de Kojic em cultura de

vermes adultos, diminui significantemente a produção de ovos fenotipicamente

normais, sem defeitos em suas cascas (Fitzpatrick et al. 2007). Outro inibidor da

atividade dessa família de enzimas, o dietilditiocarbamato (DDC), também previne a

formação da casca de ovos em esquistossomos (Bennet e Gianutsos 1978).

A polimerização da casca do ovo, como suposto por Wells e Cordingley

(1991), seria resultado da perda das cargas positivas na superfície dos grânulos

precursores da casca, na interface de contato com as secreções alcalinas das

glândulas de Mehlis. Com isso, os grânulos precursores se fusionariam e

enrijeceriam. A ocorrência de microespinhos apenas na superfície externa da casca

seria resultante desse contato com o ambiente alcalino das secreções do oótipo. Ao

final de sua formação, a casca emite fluorescência natural (autofluorescência)

quando observada em microscopia de fluorescência (Wells e Cordingley 1991).

Observações na formação da casca dos ovos de Fasciola hepatica sugerem que esse

mecanismo possa ser comum para outras espécies de trematódeos (Colhoun et al.

1998).


69

I.2.6.3 – Desenvolvimento embrionário dos ovos

Após a formação da casca no oótipo, o ovo é liberado no útero da fêmea, onde

fica brevemente. A curta permanência no útero suscita questionamentos sobre a

importância desse órgão no desenvolvimento dos ovos. Como diversos outros

helmintos parasitas, o S. mansoni apresenta padrão oportunista (r-selecionado) de

produção de ovos e precisa direcionar rapidamente os nutrientes absorvidos pelas

fêmeas para a geração dos ovos e, em especial, das células vitelínicas. As fêmeas

produzem cerca de 300 ovos por dia (Moore e Sandground 1956; Pellegrino e Coelho

1978), cerca de um ovo a cada cinco minutos. Todavia, outros autores reportaram

valores diferentes para o número de ovos produzidos por dia pelas fêmeas (Faust et

al. 1934; Valadares et al. 1981; Cheever 1994a, b; Lenzi JA 1998). Essa variação

pode ter sido causada pelo ser emprego de métodos, animais e/ou isolados de S.

mansoni diferentes. De fato, a maioria dos trabalhos aponta para números entre

150 a 300 ovos por fêmea/dia. Nesse caso, as fêmeas chegam a gerar até 12.000

células vitelínicas por dia.

Os ovos são então ovipostos na corrente sanguínea do hospedeiro vertebrado,

ainda imaturos. Nesse momento, eles possuem cerca de 112 µm de comprimento

por 44 μm de largura (Ashton et al. 2001) e exibem um conspícuo espinho lateral,

característico da espécie S. mansoni. Nos tecidos do hospedeiro ou em cultura, o

desenvolvimento embrionário completo tem duração de seis a sete dias (Prata 1957;

Pellegrino et al. 1962; Michaels e Prata 1968). Swiderski (1984) descreveu

sucintamente as fases iniciais da embriogênese dos ovos: a clivagem é total e

desigual, gerando blastômeros de três tipos. Os micrômeros e mesômeros darão

origem ao miracídio; enquanto os macrômeros e alguns mesômeros formarão os

envoltórios do ovo ao redor do embrião em desenvolvimento. Nenhuma menção à

organogênese foi feita.

Três camadas da casca são morfologicamente distintas à microscopia

eletrônica de transmissão: o envoltório externo ou camada de Reynolds é ausente

nos ovos mais prematuros e engrossa progressivamente conforme o ovo amadurece,

principalmente nos pólos. Esse envoltório se forma a partir de dois macrômeros que

se soltam em pólos opostos da superfície do embrião e se fusionam com o sincício

vitelínico, previamente formado a partir de resquícios das células vitelínicas. Ele

transforma-se em uma matriz acelular e fibrilar que se posiciona entre a margem

interna da casca do ovo propriamente dita e o outro envoltório do ovo. O envoltório

interno, mais conhecido por envoltório de von Lichtenberg, é formado por três a

quatro mesômeros que também se destacam da superfície do embrião em

desenvolvimento após a formação do envoltório externo. O citoplasma dessas


70

células também se fusiona em uma camada que envolve o embrião, logo abaixo do

envoltório externo. Em estádios avançados da embriogênese do ovo, esse envoltório

é caracterizado pela presença de núcleos grandes e achatados pertos dos pólos do

ovo, apresentando nucléolos esféricos evidentes e densas ilhas de heterocromatina.

Conforme o miracídio amadurece, os núcleos se deterioram; o citoplasma contém

retículo endoplasmático rugoso bem desenvolvido, numerosas gotículas lipídicas e

extensos agregados de rosetas α de glicogênio e de partículas β de glicogênio; por

fim, a lacuna de Lehman é o espaço entre a membrana plasmática apical do

envoltório interno e o próprio embrião. Durante os momentos mais iniciais do

desenvolvimento, essa cavidade é preenchida por um fluído elétron-luminescente,

com corpúsculos lipóides espalhados, espirais mielinóides e resquícios de células

vitelínicas e/ou células vitelínicas ainda íntegras. Nos estádios mais tardios, essa

lacuna contém discretas massas grandes de material grânulo-focular, os

corpúsculos de Cheever (Neill et al. 1988; Swiderski 1994).

Classicamente, entretanto, o amadurecimento dos ovos dos esquistossomos é

classificado apenas considerando as dimensões do embrião em relação ao tamanho

do ovo propriamente dito (Vogel 1942; Prata 1957). Essa classificação foi

denominada de oograma (Pellegrino et al. 1962; Cunha et al. 1962). No estádio I, o

embrião mede cerca de um terço do diâmetro transversal do ovo. No estádio II, ele

ocupa um pouco mais da metade do diâmetro transversal do ovo. Já no estádio III,

o embrião alonga-se e passa a ocupar cerca de 2/3 do diâmetro longitudinal do ovo.

O estádio IV engloba os embriões que ocupam todo o interior do ovo, que ainda

apresenta alguns vestígios de vitelo em seus pólos. O último estádio (estádio V)

refere-se ao miracídio completamente desenvolvido, que apresenta movimentação,

batimento ciliar, contração muscular e atividade das células-flama. Obviamente, o

estádio V é mais facilmente determinado em observados frescos de esmagados de

intestino ou em ovos isolados viáveis. As mudanças na abundância desses

diferentes estádios do desenvolvimento, i.e, no oograma, têm sido utilizadas como

um critério simples, sensível e confiável na avaliação primária de drogas para a

esquistossomose (Pellegrino e Faria 1965).

Ao final da embriogênese, os ovos necessitam sair do território vascular e

atravessar a parede do intestino, especialmente a camada mucosa (que engloba o

epitélio e a lâmina própria), para serem liberados junto com as fezes, dando

continuidade ao complexo ciclo biológico do parasito (ver Fig. 1.2). Nessa fase, os

ovos maduros podem permanecer vivos nos tecidos do hospedeiro por um período

máximo de 12 dias (Prata 1957; Cançado et al. 1965). Ao atravessarem a mucosa


71

intestinal, os ovos são eliminados com as fezes e eclodem caso alcancem condições

adequadas em tempo útil (ver revisão de Coelho et al. 2008).

I. 2. 7 – Reação Granulomatosa (Granuloma Periovular)

Os ovos liberados pelas fêmeas de S. mansoni começam a se desenvolver já

na corrente sanguínea do hospedeiro, sendo carregados passivamente para diversos

órgãos, como fígado, intestino delgado e grosso, pâncreas, baço e pulmões. Ao

atingirem vasos de menor calibre, os ovos ficam retidos e podem atuar como

agentes granulomatogênicos, isto é, causar um tipo de reação inflamatória peculiar,

denominada granuloma. Entretanto, é interessante notar que, de alguma maneira,

a formação dos granulomas seja dependente do amadurecimento dos ovos, como

destacado por Prata (1957). Ele relatou jamais ter encontrado granulomas cercando

ovos imaturos isolados.

No intestino, a reação inflamatória intravascular inicial ao redor dos ovos

possibilita que estes saiam dos vasos e atinjam os tecidos adjacentes (Lenzi et al.

1987). É possível que os ovos também possam ser passivamente transferidos para o

espaço perivenular pela ação não-específica de células endoteliais (File 1995). Às

vezes, agregados de ovos comprometem o fluxo sanguíneo, gerando necrose da

parede vascular (Bloch 1980). A passagem dos ovos pela mucosa intestinal é

dependente de células inflamatórias periovulares, especialmente macrófagos e

eosinófilos, que degradam a membrana basal epitelial e, com isso, criam um

ambiente de fácil penetração para os ovos. Assim, o peristaltismo intestinal expulsa

os ovos para a sua luz (Lenzi et al. 1987, 1991) e, ao atingirem as fezes, os ovos

podem dar continuidade ao ciclo desse parasito, caso encontrem condições

adequadas para a eclosão dos miracídios.

No fígado, a retenção dos ovos embolizados nos finos vasos portais causa a

dilatação dos ramos periportais. Caso a produção de ovos continue, a subsequente

oclusão desses ramos pode provocar reação granulomatosa, angiogênese e fibrose.

O granuloma esquistossomótico é um sistema adaptativo complexo de células

migrantes e componentes heterogêneos de matriz extracelular que se organizam em

uma estrutura dinâmica, ao redor do ovo. Como sistema complexo, o granuloma é

caracterizado pelas seguintes propriedades: (1) dinamismo, (2) irreversibilidade, (3)

homeostasia, (4) agregação, (5) não-linearidade, (6) fluência, (7) diversidade, (8)

rotulagem, (9) modelos internos, (10) blocos de construção ou de montagem (Lenzi e

Romanha 2003; Lenzi et al. 2006; Romanha 2007). Basicamente, o granuloma é


72

uma reação inflamatória crônica local, compacta e organizada, caracterizada pela

presença de células da linhagem macrofágica, onde outros tipos celulares (p.ex.

células epitelióides) também podem estar presentes (ver Lenzi et al. 1998).

A literatura sobre o granuloma esquistossomótico por S. mansoni é bastante

extensa e inumeráveis revisões já foram realizadas (p.ex. Lenzi et al. 1998;

Cummings e Nyame 1999; Weinstock et al. 1999; Rumbley e Phillips 1999;

Stadecker 1999a, b; Boros 1999; Wynn 1999; Infante-Duarte e Kamradt 1999;

Stadecker et al. 2001; Cheever et al. 2002; Asahi e Stadecker 2003; Stavitsky 2004;

Wynn et al. 2004; Abath et al. 2006; Wilson et al. 2007; Lenzi et al. 2008b). Por

isso, apenas alguns aspectos-chave da granulomatogênese, relacionados com o

desenvolvimento dos ovos, serão destacados a seguir.

I.2.7.1 – Antígenos solúveis do ovo

Durante a presença dos ovos nos tecidos do hospedeiro, alguns de seus

componentes são ativamente secretados ou mesmo disponibilizados para o meio

circundante após a morte e desintegração do ovo. Acredita-se que a reação

granulomatosa periovular atue na contenção da difusão desse material exógeno ao

hospedeiro (Adams 1983; Reis e Andrade 1987), coletivamente conhecido como

“antígeno solúvel do ovo”, ou SEA, do inglês soluble egg antigen. O granuloma,

portanto, impediria que tais antígenos alcançassem o sistema vascular e fossem

então levados para outros órgãos, distantes de seu local original de produção (p.ex.,

fígado). No entanto, a produção acentuada de ovos e o consequente elevado número

de granulomas podem ocasionar fibrose hepática, hepatoesplenomegalia e

hipertensão portal.

Tradicionalmente, considerava-se que o SEA era composto por pelo menos

trinta glicoproteínas imunogênicas, com peso molecular aparente variando de 10 a

mais de 200 kDa (Asahi et al. 1999; Stadecker et al. 2001). Entretanto, um estudo

recente utilizando Tecnologia de Identificação Multidimensional de Proteínas (do

inglês, Multidimensional Protein Identification Technology) apontou, de fato, 188

proteínas secretadas pelo ovo (“secretoma do ovo”). Essas proteínas estão

envolvidas em balanço redox, chaperonamento e montagem protéica, no

desenvolvimento e na sinalização celular, na remoção de detritos e em cascatas

metabólicas e modulação da resposta imunológica. Além disso, 32 novas proteínas,

ainda não caracterizadas, foram também identificadas (Cass et al. 2007).

No caso da granulomatogênese, a atividade das proteínas imunogênicas está

restrita à presença de unidades terminais LacNAc (Galβ1-4GlcNAc, como na

asialofetuina) ou LacdiNAc (GalNAcβ1-4GlcNAc) (van de Vijver et al. 2006),


73

previamente identificadas nos ovos de esquistossomos por Khoo e colaboradores

(1997). O SEA também medeia a migração tecidual dos ovos e sua adesão ao

endotélio vascular, bem como a passagem para a luz intestinal, agregação

plaquetária e processos relacionados à angiogênese (Lenzi et al. 1987; Ngaiza e

Doenhoff 1990; File 1995; Lejoly-Boisseau et al. 1999; Loeffler et al. 2002; Stanley

et al. 2003; Doenhoff et al. 2003). Ao atingir o meio periovular, os antígenos do ovo

são internalizados e processados por células dentríticas derivadas de monócitos e

apresentados às células T via MHC de classe II (van Liempt et al. 2007). Suas

imunogenicidade e patogenicidade irão variar de acordo com fatores geneticamente

determinados do hospedeiro, como os haplotipos de MHC e o repertório de células T

(revisto por Abath et al. 2006). Apesar dos recentes avanços na imunopatologia da

inflamação granulomatosa na esquistossomose, a origem da maioria desses

antígenos e seus epítopos de células T permanecem amplamente desconhecidos

(Asahi e Stadecker 2003).

A imunolocalização das proteínas totais secretadas pelo ovo (ESP) identificou

o envoltório interno do ovo, também conhecido como envoltório de von Lichtenberg,

ao invés do miracídio propriamente dito, como fonte dessas proteínas (Ashton et al.

2001). Quando madura, tal estrutura possui um retículo endoplasmático rugoso

desenvolvido, que indica elevados níveis de síntese protéica, e grandes agregados de

material granular, que pode significar o armazenamento dessas proteínas recém-

sintetizadas antes da sua exocitose (Ashton et al. 2001). Esse envoltório surge

precocemente no desenvolvimento do ovo (Swiderski 1994; Ashton et al. 2001) (ver

seção 2.6). Anticorpos monoclonais anti-LacdiNAc também revelaram a localização

desse carboidrato na superfície externa da casca do ovo (van Remoortere et al.

2000; van den Berg et al. 2004). Outro estudo também localizou uma importante

proteína do ovo (IPSE/alfa-1), capaz de estimular basófilos a degranularem e

liberarem IL-4, na mesma região adjacente a casca (Schramm et al. 2006).

Entretanto, como os próprios autores reconheceram, os momentos nos quais a

síntese dessas moléculas tem início e que seus estímulos indutores ainda

permanecem desconhecidos. Assim, é preciso não apenas identificar quais

antígenos ocorrem, mas determinar suas estruturas e suas localizações espaciais

durante o desenvolvimento do ovo; se os antígenos são secretados ou não e ainda se

eles são compartilhados com outras fases do ciclo de vida do esquistossomo.

A seguir, uma breve descrição dos antígenos ovulares secretados mais

abundantes será apresentada (ver também Stadecker et al. 2001; Asahi e Stadecker

2003; Cass et al. 2007). Os outros antígenos secretados, com abundância relativa

intermediária ou mínima, foram sumariados em Cass e colaboradores (2007).


74

IPSE/alfa-1 (ou ainda Sm-p25)

É o antígeno de maior abundância relativa no secretoma do ovo (Cass et al.

2007). Inicialmente chamado de alfa-1 (Dunne et al. 1991), esse antígeno é idêntico

ao princípio indutor de IL-4 dos ovos de S. mansoni (IPSE, do inglês IL-4-inducing

principle of S. mansoni eggs) (Schramm et al. 2006) e ao antígeno Sm-p25

(Schramm et al. 2003). Esse antígeno é uma glicoproteína estádio-específica de 20

kDa, que forma um homodímero de 40 kDa com capacidade de estimular a

desgranulação de basófilos e a liberação de IL-4 (Schramm et al. 2003, 2006). Essa

interleucina atua na proliferação de células T e na mudança de fenótipo da resposta

imunológica para Th-2, bem como na proliferação de mastócitos, megariócitos e

precursores eritróides; além de estimular a secreção de anticorpos por linfócitos B

(troca de isotipo para IgE) (Abbas e Lichtman 2005). A localização de IPSE/alfa-1 se

restringe à área subjacente a casca, presumivelmente nos envoltórios interno

(envoltório de von Lichtenberg) e externo (camada de Reynolds) do embrião maduro,

e no entorno dos ovos, bem como em algumas células da camada central do

granuloma (Schramm et al. 2006).

Ômega-1

Segundo antígeno em abundância relativa no secretoma do ovo (Cass et al.

2007), o antígeno ômega-1 foi primeiramente caracterizado por Dunne e

colaboradores (1991) como uma glicoproteína monomérica estádio-específica, de 31

kDa e pI maior que 9,0. Esse antígeno é uma ribonuclease funcional, com atividade

hepatotóxica (Dunne et al. 1991; Fitzsimmons et al. 2005). Não há ainda dados

disponíveis sobre a sua localização e produção durante o desenvolvimento do ovo e

a granulomatogênese.

Sm-p40 e proteínas de choque térmico (HSPs)

Outro antígeno de grande abundância relativa no secretoma do ovo (Cass et

al. 2007), a proteína de 40 kDa do S. mansoni (Sm-p40) foi primeiramente

identificada por Nene e colaboradores (1986) em ovos e miracídios. A sua sequência

de 354 resíduos de aminoácidos compartilha homologia com a família de α-

cristalinas e de proteínas de choque térmico (HSPs) (Nene et al. 1986; Cass et al.

2007). As α-cristalinas podem atuar como chaperonas para outros antígenos do ovo

durante a migração tecidual, prevenindo a agregação de proteínas e facilitando a

sua montagem (Nene et al. 1986; Horwitz et al. 1992). É possível também que esse

antígeno possa de alguma forma proteger o ovo dentro do ambiente oxidativo do


75

granuloma (Cass et al. 2007). Nas cepas murinas H-2k, C3H e CBA (formadoras de

granulomas grandes), o antígeno Sm-p40 causa uma forte resposta celular Th

CD4+; em contraste, evoca respostas muito mais fracas na cepa BL/6, que forma

granulomas consideravelmente menores (Fanning et al. 1981; Cheever et al. 1987;

Hernandez et al. 1997a, b; Stadecker e Hernandez 1998; Stadecker et al. 2001). Em

humanos, o Sm-p40 também é imunogênico (Stadecker 1999a). Isso implica que a

origem genética do hospedeiro possivelmente modula a intensidade da inflamação

granulomatosa e sugere que o reconhecimento diferencial dos antígenos pode ser

um dos fatores determinantes (Stadecker e Hernandez 1998; Stadecker et al. 2001).

Ao contrário do SEA total não-fracionado, que polariza uma resposta imunológica

para o fenótipo Th-2 (Pearce et al. 1991), o antígeno Sm-p40 possui um epítopo

imunodominante de célula T que evoca uma resposta fortemente inclinada ao

fenótipo Th-1 e pelo menos outros dois epítopos subdominantes (Cai et al. 1996;

Hernandez et al. 1998; Chen e Boros 1998; Hernandez e Stadecker 1999). Embora

um anticorpo monoclonal anti-Sm-p40 já tenha sido desenvolvido (Hernandez et al.

1998; Abouel-Nour et al. 2006), não há ainda dados disponíveis sobre a localização

e produção desse antígeno durante o desenvolvimento do ovo e a formação de

granulomas.

Proteínas de choque térmico, como HSP86/90, -70, -60, -40 e -10, também

foram identificadas no secretoma do ovo (Cass et al. 2007). Em geral, essa classe de

proteínas está envolvida em respostas a condições de estresse, como no aumento de

temperatura. As HSP estão entre as proteínas celulares mais prolíficas, presentes

de bactérias até humanos. De fato, a proteína HSP86/90 foi primeiramente

identificada por Johnson e colaboradores (1989) em vermes adultos, sendo

homóloga à HSP90 de Saccharomyces cerevisae e à HSP83 de Drosophila

melanogaster (Johnson et al. 1989). Por sua vez, anticorpos específicos anti-HSP70

de S. mansoni foram utilizados para detectar infecções crônicas em humanos.

Entretanto, foram observadas reações cruzadas contra indivíduos com filaríase ou

malária. Soros de pacientes infectados com S. haematobium também reconheceram

a HSP70 de S. mansoni; o mesmo não aconteceu com soro de pacientes infectados

com S. japonicum (Moser et al. 1990). Já a proteína HSP60 foi previamente

identificada em cercárias, vermes adultos e esporocistos. Um anticorpo monoclonal

anti-HSP60 de S. mansoni também foi produzido (Tielens et al. 1993). Embora

anticorpos contra esses antígenos tenham sido desenvolvidos ou estejam

disponíveis comercialmente, ainda não há informações sobre a localização e síntese

dessas proteínas durante o desenvolvimento do ovo e a granulomatogênese. Dados

adicionais sobre as HSP40 e -10 de S. mansoni são ainda necessários.


76

Niemann-Pick tipo C2 (NPC2)

Pela primeira vez identificada em secreções parasitárias e em Schistosoma

(Cass et al. 2007), essa pequena e ubíqua proteína intra-lisossomal é essencial ao

tráfego de colesterol, via compartimentos endossomais/lisossomais (Vanier e Millat

2004; Cheruku et al. 2006). As NPC2 de S. mansoni e humana compartilham 37%

de identidade e 55% de similaridade (Cass et al. 2007), bem como os resíduos de

aminoácidos Phe-66, Val-96 e Tyr-100 essenciais para a ligação com o colesterol

(Ko et al. 2003; Cass et al. 2007). Essencial para o funcionamento da NPC2

humana, um sítio de N-glicosilação foi predito na NPC2 de S. mansoni (Cass et al.

2007). O papel da NPC2 nos ovos precisa ser avaliado, mas é possível que ela esteja

envolvida na absorção de colesterol, bem como de outros glicolipídeos. A NPC2 de S.

mansoni pode ainda participar na permuta de moléculas imunomodulatórias com o

hospedeiro (Cass et al. 2007). Por exemplo, Sprong e colaboradores (2006)

observaram que glicoproteínas circulantes de S. mansoni em partículas

lipoprotéicas de baixa-densidade do hospedeiro rompem com homeostasia de

lipídeos nas células imunológicas, induzindo apoptose.

Frutose-1,6-bisfosfato aldolase

Identificada no secretoma do ovo (Cass et al. 2007), essa enzima da cascata

glicolítica foi primeiramente clonada e caracterizada por El-Dabaa e colaboradores

(1998). Composta por 363 resíduos de aminoácidos, essa proteína apresenta 66% e

65% de identidade com as isoenzimas humanas C e A, respectivamente. Entretanto,

ensaios de ativação e ligação ao substrato sugerem que esse antígeno assemelha-se

a aldolase tipo A. Usando anticorpos contra a enzima recombinante purificada, uma

banda de 40 kDa foi reconhecida em extratos de cercárias, de esquistossômulos

(cinco e 25 dias), de vermes adultos e de ovos. Em vermes adultos, sua localização é

tegumentar (El-Dabaa et al. 1998). Não foram realizadas imunolocalizações nas

outras fases do ciclo.

Peptidilglicina alfa hidroxilante mono-oxigenase (SmPHM)

A SmPHM foi primeiramente clonada e caracterizada por Mair e

colaboradores (2004). Essa enzima é fundamental para a conversão de um peptídeo

intermediário glicina-estendido em um produto aminado na extremidade C-

terminal. A SmPHM foi localizada por todo o sistema nervoso dos vermes adultos,

na massa nervosa anterior, nos cordões nervosos longitudinais dorsais e nas

comissuras transversais interconectantes. Nos machos, a SmPHM foi identificada

nos plexos nervosos subtegumentares e dentro dos tubérculos. Já nas fêmeas, a


77

SmPHM também estava presente nas células nervosas e fibras do oótipo.

Ultraestruturalmente, a SmPHM se localiza na rede-trans do complexo de Golgi e

em vesículas secretoras dos nervos centrais e periféricos de ambos os vermes. A

ampla presença dessa enzima confirma o importante papel dos neuropeptídeos

aminados nos esquistossomos, como os peptídeos FMRFamida-relacionados

(FaRPs) e os neuropeptídeos Fs (NPFs) que terminam com uma fenilalanina-amida

(Day e Maule 1999; Mair et al. 2004). Nos ovos, a SmPHM foi identificada no

secretoma e localizada na superfície externa da casca, via reação de precipitação ao

redor do ovo (COPT; do inglês, circumoval precipitin reactions) (Cass et al. 2007).

Glutationa S-transferase de 26 kDa (SmGST-26)

Também identificada no secretoma do ovo com uma abundância

relativamente alta (Cass et al. 2007), essa proteína antioxidante foi clonada em

vermes adultos por Trottein e colaboradores (1990) e Henkle e colaboradores (1990).

Sua sequência predita de resíduos de aminoácidos mostrou forte homologia com

GST-26 de S. japonicum (SjGST-26) e um menor nível de homologia com as

isoenzimas GST de classe µ dos mamíferos. Além disso, não foi constatada

homologia significante com a SmGST-28. Ultraestruturalmente, a SmGST-26 foi

identificada no tegumento e em células parênquimais subepidérmicas, da mesma

forma que SmGST-28. Por sua vez, apenas SmGST-26 é encontrada nas digitações

citoplasmáticas da câmara apical delineada pelo corpo celular dos protonefrídeos,

sugerindo que esse antígeno seja ativamente excretado pelos vermes adultos

(Trottein et al. 1990). Cass e colaboradores (2007) localizaram essa proteína ao

redor do ovo, via COPT. Dados adicionais sobre a localização e síntese dessa e

outras GSTs durante o desenvolvimento do ovo e a granulomatogênese são

necessários.

Fosfoenolpiruvato carboxiquinase-GTP (SmPEPCK)

Essa enzima da cascata gliconeogênica e outras três (glicose-6-fosfatase,

frutose-1,6-bisfosfatase e piruvato carboxilase) foram detectadas em homogenatos

de vermes adultos por Tielens e colaboradores (1991). Em condições anaeróbicas,

esporocistos de S. mansoni produzem lactato e uma ampla quantidade de sucinato,

via atividade da SmPEPCK. Na presença de oxigênio, esse estádio larval deriva a

maior parte de sua energia a partir da degradação aeróbica de glicose a dióxido de

carbono (Tielens et al. 1992). Ainda em esporocistos, essa enzima participa na

gliceroneogênese (produção de glicerol a partir de precursores, como a glutamina)

(Khayath et al. 2006). Também identificada no secretoma do ovo (Cass et al. 2007),


78

essa enzima de 62 kDa possui uma forte ação estimulatória na proliferação de

células T CD4+ de camundongos C57BL/6 infectados (Asahi et al. 1999). Por sua

vez, embora uma SmPEPCK recombinante de 626 resíduos de aminoácidos também

evoque uma forte resposta proliferativa de células Th CD4+ em camundongos

C57BL/6, CBA e BALB/c, a resposta imunológica é polarizada para o fenótipo Th-1,

com significante produção de INF-gama e, em dimensão, de IL-2 e IL-5. Um epítopo

de célula T, de doze aminoácidos (DKSKDPKAHPNS), foi demonstrado na região dos

resíduos 398 a 409 (Asahi et al. 2000). Não há ainda informações sobre a

localização desse antígeno durante o desenvolvimento do ovo e a

granulomatogênese.

Tioredoxina peroxidase 1/Peroxiredoxina 1 (SmTPx-1/SmPrx-1)

Membro de uma ampla e ubíqua família de proteínas antioxidantes,

conhecidas como peroxiredoxinas, essa enzima de 26 kDa foi primeiramente

identificada por Kwatia e colaboradores (2000) em vermes machos e fêmeas. Já

Williams e colaboradores (2001) apontaram sua presença no envoltório interno

(envoltório de von Lichtenberg) de ovos maduros, bem como sua secreção para o

meio periovular (confirmado por Cass et al. 2007). Essa enzima consiste de 185

resíduos de aminoácidos, com dois resíduos de cisteína (48 e 169) funcionais

(Kwatia et al. 2000). A SmTPx-1/SmPrx-1 estimula a proliferação significativa de

células T CD4(+) em camundongos C57BL/6 e CBA com oito semanas e meia de

infecção, além de uma produção mista de citocinas dos tipos Th-1 e Th-2. A

produção de anticorpos mais significante ocorre após o início da oviposição

(Williams et al. 2001). No miracídio, a SmTPx-1/SmPrx-1 e outra peroxiredoxina

(SmTPx-2/SmPrx-2) são encontradas na papila apical (ou terebratório); nos

esporocistos, elas são localizadas no tegumento sincicial e liberadas com as

proteínas secretadas/excretadas durante a transformação da larva em cultura,

sugerindo sua participação antioxidante também na fase intra-molusco (Vermeire e

Yoshino 2007).

Tioredoxina glutationa reductase (SmTGR)

Essa enzima antioxidante multifuncional possui uma abundância relativa

intermediária no secretoma ovo (Cass et al. 2007), mas será abordada devido a sua

destacada posição como novo alvo quimioterapêutico (Sayed et al. 2008).

Primeiramente identificada por Alger e Williams (2002) em vermes adultos, a

SmTGR é a principal responsável pelas atividades tioredoxina redutase, glutationa

redutase e glutaredoxina do sistema antioxidante dessa fase do ciclo. A inibição


79

dessa enzima por tecnologia de RNA de interferência provocou uma diminuição

substancial da taxa de sobrevivência de esquistossômulos incubados em condições

aeróbicas ou anaeróbicas, após quatro dias de tratamento (Kuntz et al. 2007). Uma

avaliação quantitativa automatizada de alta produção (do inglês, automated

quantitative high-throughput; qHTS) analisou a atividade de 71.028 compostos como

potenciais inibidores da SmTGR e identificou diversas séries promissoras de amidas

fosfínicas e 2-óxido oxidiazóis (Simeonov et al. 2008). O tratamento de

camundongos (por cinco dias consecutivos, com injeção intraperitoneal de 10

mg/kg) em diferentes tempos de infecção (com início após 1, 23 e 37 dias de

infecção) com o composto 4-fenil-1,2,5-oxadiazol-3-carbonitrila-2-óxido causou

acentuada redução na carga parasitária, indicando que tal droga é eficaz contra a

fase dérmica, pulmonar e adulta do parasito. Macroscopicamente, o número de

granulomas hepáticos foi consideravelmente menor do que nas infecções controles

(Sayed et al. 2008). Não há ainda informações sobre a localização desse promissor

antígeno durante o desenvolvimento do ovo e a granulomatogênese.

I. 2. 8 – Morfologia do miracídio de Schistosoma mansoni

Ao atingirem uma massa de água em condições adequadas de luminosidade,

salinidade, temperatura e pH, os ovos maduros eclodem rapidamente e liberam

uma forma larvar ciliada, chamada miracídio (revisto por Coelho et al. 2008). O

miracídio é o primeiro estádio infectivo (de caramujos) do complexo ciclo de vida do

S. mansoni. A eclosão é possivelmente iniciada pela ativação de uma leucina

aminopeptidase específica (Xu e Dresden 1986), em baixos níveis de salinidade

(Donnelly et al. 1984). Na água, os miracídios passam a realizar rápidos

movimentos no interior do ovo, até provocarem a ruptura de sua casca, que

geralmente ocorre em sentido transversal (Kusel 1970). Recém liberado, os

miracídios nadam em direção à luz através da agitação coordenada de seus cílios,

devendo encontrar rapidamente o seu hospedeiro invertebrado suscetível para dar

continuidade ao seu ciclo biológico. Os mecanismos de localização, reconhecimento

e penetração nesses hospedeiros foram recentemente revistos por Coelho e

colaboradores (2008) e não serão abordados nessa seção.

A morfologia do miracídio de S. mansoni foi alvo de dois extensos trabalhos.

Ottolina (1957) realizou a primeira descrição da anatomia, citologia e fisiologia

desse estádio larval por microscopia de campo claro. Mais tarde, Pan (1980)

revelou, por microscopia eletrônica de transmissão, delicados detalhes desses


80

componentes celulares (Fig. 1.20). O conhecimento minucioso das estruturas e

sistemas de órgãos dessa larva é imprescindível para fundamentar a descrição da

embriogênese dos ovos, já que o miracídio é a forma final da primeira etapa de

desenvolvimento do ciclo de vida desse parasito. Suas estruturas e respectivas

localizações servem como referência para a descrição dos eventos morfogenéticos

que ocorrem no embrião em desenvolvimento. A seguir, portanto, uma breve

descrição do miracídio será apresentada.

O miracídio tem forma ligeiramente cilíndrico-cônica e cerca de 180 µm de

comprimento por 60 µm de diâmetro (Ottolina 1957). Células epidérmicas ciliadas,

arranjadas em placas dérmicas, permitem o movimento natatório, através de seus

batimentos ciliares sincronizados. As células da epiderme formam um delgado

sincício, com núcleos redondos proeminentes e intensamente basófilos, e uma

conspícua membrana basal separa as células da epiderme da dupla camada

muscular subjacente.

Na extremidade anterior, encontra-se o terebratório ou papila apical, por

onde perpassam e terminam os ductos das duas glândulas laterais – também

conhecidas como glândulas de adesão – e o ducto da glândula apical ou glândula de

penetração. Antigamente, a glândula de penetração era confundida com um tubo

digestório primitivo ou saco digestório (Ottolina 1957). De fato, o tubo digestório

primitivo está ausente nesse estádio larval (Pan 1980). No terebratório, há um

conjunto de cílios maiores e espículos anteriores, provavelmente relacionados com o

processo de penetração nos moluscos, bem como terminações nervosas, com

funções tácteis e sensoriais (Pan 1980). O sistema excretor é formado por quatro

células-flama e seus ductos coletores, que são drenados para uma ampola excretora

que se abre em um poro excretor. O sistema nervoso consiste de uma massa

esferóide central, com núcleos neuronais perifericamente localizados e envolvendo

numerosos axônios e dendritos (neurópilo). Os núcleos são irregulares, ligeiramente

ovais e achatados, contendo um pequeno nucléolo evidente. Por meio de cordões

nervosos, formados por células bipolares, há a comunicação com células nervosas

periféricas, que regem a contratilidade e mobilidade do miracídio, ao comandar a

camada muscular subepitelial (Pan 1980). Cerca de 20 células intersticiais

preenchem os espaços intercelulares e aparentemente atuam no armazenamento de

energia. Células germinativas, também em número aproximado de 20, darão

continuidade ao ciclo no hospedeiro invertebrado. Tais células contêm um grande

núcleo pobre em heterocromatina e um proeminente nucléolo, citoplasma granular

escasso repleto com numerosos ribossomos, diversas pequenas mitocôndrias e


81

poucos retículos endoplasmático rugoso e partículas β de glicogênio (Pan 1980,

1996).

Uma vez que o miracídio penetra no caramujo, ele sofre uma profunda

reorganização morfológica e fisiológica para desenvolver-se e multiplicar-se

assexuadamente (Pan 1996). Ao final da segunda etapa de desenvolvimento do ciclo

(revisto por Coelho et al. 2008), um outro estádio infectivo, chamado cercária, é

liberado no meio aquático. As cercarias devem localizar, aderir e penetrar na pele

ou na mucosa de mamíferos suscetíveis para dar continuidade ao ciclo de vida

desse parasito (revisto por Lenzi et al. 2008a).

Figura 1.20. Miracídio de Schistosoma mansoni por microscopia confocal de varredura a laser (CLSM). Plano intermediário. GA, glândula apical; mn, massa nervosa; cg,

células germinativas; Ep, epiderme; c, cílios. As glândulas laterais e o terebratório não foram

visualizados nesse plano focal. Coloração por carmim clorídrico. Fonte: Jurberg AD,

Gonçalves T, Costa TA, Mattos ACA, Pascarelli BM, Manso PPA, Ribeiro-Alves M, Pelajo-

Machado M, Coelho PMZ, Lenzi HL, manuscrito em preparação (artigo 2 dessa dissertação).

Objetivos Dissertação de Mestrado

82

II – Objetivos

Objetivos Dissertação de Mestrado

83

II – Objetivos

II. 1 – Objetivo Geral

Detalhar morfologicamente e classificar o desenvolvimento embrionário do

ovo de S. mansoni, segundo critérios morfológicos e morfogenéticos.

II. 2 – Metas

1. Descrever a embriogênese do ovo no interior da fêmea, através de análise

histológica convencional ao microscópio de campo claro e de análise de fêmeas

inteiras coradas com carmim clorídrico ao microscópio confocal de varredura a

laser;

2. Documentar e classificar a embriogênese miracidiana de S. mansoni no

hospedeiro experimental murino e em condições in vitro, a partir de critérios

morfológicos e morfogenéticos, através de cortes histológicos e da análise de ovos

inteiros;

3. Detalhar a diferenciação e formação dos sistemas nervoso, muscular,

tegumentar e osmorregulatório do miracídio em desenvolvimento, por histologia

convencional (com colorações específicas e seletivas), por microscopia confocal de

ovos inteiros corados com carmim clorídrico.

Justificativa Dissertação de Mestrado

84

III – Justificativa

Justificativa Dissertação de Mestrado

85

III – Justificativa

Com base na fundamentação teórica, o estudo detalhado da biologia do

desenvolvimento dos ovos de S. mansoni poderá contribuir para: 1) uma melhor

intelecção da granulomatogênese e da patogenia resultante; 2) a compreensão dos

mecanismos de expulsão dos ovos do sistema vascular para os tecidos, bem como a

passagem pela parede intestinal para o lúmen do órgão; 3) o entendimento dos

processos básicos do desenvolvimento, como a determinação dos eixos corporais e a

organogênese, visto que muitos dos mecanismos moleculares e suas cascatas de

regulação são compartilhados por todos os organismos conhecidos atualmente

(revisto por Rudel e Sommer 2003); 4) uma melhor compreensão das relações

filogenéticas dos platielmintos; 5) o refinamento de estudos moleculares (genômica,

transcriptômica, glicômica, lipidômica e outros) ao considerar os diferentes estádios

da embriogênese do ovo; 6) a criação de linhagens transgênicas ou nocaute para

genes específicos, e; 7) o desenvolvimento de novas estratégias quimioterapêuticas,

a partir do descobrimento de novos alvos para tratamento.

Artigos Dissertação de Mestrado

86

IV – Artigos

Artigo 1 Jurberg et al. – Development, Genes and Evolution

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Trematode embryology: a new method for

whole-egg analysis by confocal microscopy

Arnon D Jurberg, Bernardo M Pascarelli, Marcelo Pelajo-Machado,

Arnaldo Maldonado Jr., Ester M Mota, Henrique L Lenzi

Publicado no periódico Development, Genes and Evolution 2008;218:267-271.

Estado do conhecimento

A embriogênese de trematódeos tem sido ainda pouco explorada,

principalmente devido às dificuldades técnicas para analisar seus ovos (ver, p.ex.,

Neill et al. 1988). A grande presença de células vitelínicas ao redor do

zigoto/embrião torna árdua a visualização dos estádios iniciais do desenvolvimento

em ovos vivos ou em preparações inteiras. A casca do ovo por si só também impede

a impregnação adequada de resinas para a realização de estudos histológicos,

imuno-histoquímicos e ultra-estruturais. A proposta dessa nota técnica é divulgar

uma nova ferramenta para a análise de ovos inteiros de trematódeos (no caso,

Schistosoma mansoni e Echinostoma paraensei), a partir da modificação de uma

coloração amplamente utilizada no estudo morfológico de “helmintos” adultos

inteiros.

Questão

- É possível visualizar o desenvolvimento embrionário de ovos inteiros de S.

mansoni e E. paraensei, a partir de uma coloração (carmim clorídrico) que fluoresce

ao microscópio confocal de varredura a laser (CLSM)?

- É possível reduzir a autofluorescência da casca dos ovos com a realização

de uma etapa de clareamento em hidróxido de potássio (KOH)?

Resultados principais

Essa técnica de coloração ao CLSM mostrou-se promissora no estudo da

embriogênese dos ovos de trematódeos, destacando eventos morfológicos não

distinguíveis à microscopia de campo claro. A incubação em KOH não causou os

efeitos esperados de redução da autofluorescência da casca. Ao contrário, causou

uma redução da fluorescência da coloração quando observada ao CLSM.


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The embryonic development of the parasite

trematode Schistosoma mansoni

Arnon D Jurberg, Tiana Gonçalves, Tatiane A Costa, Ana Carolina A de

Mattos, Bernardo M Pascarelli, Marcelo Ribeiro-Alves, Pedro Paulo de A

Manso, Marcelo Pelajo-Machado, Paulo Marcos Z Coelho, Henrique L Lenzi

Em preparação para o periódico Development, Genes and Evolution

Estado do conhecimento

Apesar da sua destacada importância na infecção esquistossomótica, a

biologia dos ovos tem sido considerada apenas superficialmente. Classicamente, o

amadurecimento dos ovos é classificado a partir da simples relação entre os

tamanhos do embrião e o da casca (Vogel 1942; Prata 1957). Pouco se sabe sobre os

eventos morfológicos, moleculares e bioquímicos durante a sua embriogênese.

Questão

- Como ocorre o desenvolvimento embrionário dos ovos de S. mansoni?

Resultados principais

Nesse trabalho, descrevemos os eventos morfológicos durante a

embriogênese dos ovos de S. mansoni. A partir dessas características, um novo

sistema de estadiamento é proposto, dividido em dez estádios. Entretanto, como

tais evidências morfológicas são de difícil visualização em ovos inteiros não-corados,

correlacionamos a classificação proposta com aquela de Vogel (1942) e de Prata

(1957). Comparações por modelagem estatística e análise morfológica do

desenvolvimento de ovos mantidos em cultura (RPMI-1640) e isolados do

hospedeiro experimental murino sugerem que a embriogênese entre esses dois

grupos é similar (no fenótipo), mas ocorre em ritmos diferentes. O papel da

diferenciação das estruturas embrionárias na formação de granulomas é discutido.


94

Title page:

Authors: Arnon D Jurberg, Tiana Gonçalves, Tatiane A Costa, Ana Carolina A de Mattos1,

Bernardo M Pascarelli, Pedro Paulo de A Manso, Marcelo Ribeiro-Alves2, Marcelo Pelajo-

Machado, Paulo Marcos Z Coelho1, Henrique L Lenzi

Title: The embryonic development of the parasite trematode Schistosoma mansoni

Institutional Affiliation: Laboratório de Patologia – Instituto Oswaldo Cruz (IOC)/Fundação

Oswaldo Cruz (Fiocruz). Pavilhão Gomes de Faria. Av. Brasil, 4365 – Manguinhos. CEP:

21040-900. Rio de Janeiro, RJ. Brazil. 1Laboratório de Esquistossomose – Instituto René

Rachou (CPqRR)/Fiocruz. 2Centro de Desenvolvimento Tecnológico em Saúde

(CDTS)/Fiocruz.

Communicating author: Henrique L Lenzi

E-mail address: [email protected]

Telephone: 55 21 2598-4350

Fax number: 55 21 2573-8673

Number of words: 14,067

Expected printed length: ±25 pages


95

Abstract

Schistosomiasis is a water-borne parasitic illness caused by neoophoran trematodes of the

genus Schistosoma. Besides its importance in schistosome’s life cycle, eggs have a central

role in the pathogenesis of the disease by inducing granuloma formation. Using classical

histological techniques and whole-mount preparations, the present work describes the

embryonic development of Schistosoma mansoni eggs in the murine host and compares it

with egg maintained under in vitro conditions (RPMI-1640 medium). Two pre-embryonic

stages occur inside the female worm: the pre-zygotic stage is characterized by the release of

mature oocyte from the female ovary until its fecundation. The zygotic stage encompass the

migration of the zygote to the ootype, where the eggshell is formed, and then to the uterus.

Fully formed eggs are laid still undeveloped, without suffering any cleavage. In the outside

environment, eight embryonic stages can be defined: stage 1 refers to early cleavages and the

beginning of yolk fusion. Stage 2 represents late cleavage, with the formation of a

stereoblastula and the onset of outer envelope differentiation. Stage 3 is defined by the

elongation of the embryonic primordium and the onset of inner envelope formation. In stage

4, the first organ primordia arise. During stages 5-7, tissue and organ differentiation occur

(neural mass, epidermis, terebratorium, musculature, and miracidial glands). Stage 7 is

characterized by nuclear condensation of brain neurons. Stage 8 refers to the fully formed

larva, presenting muscular contraction, cilia and flame-cell beating. This staging system was

compared to a previous classification, which considers only the simple relation of

embryo/eggshell sizes. The differentiation of embryonic structures and their probable roles in

granulomatogenesis receive particular attention. The staging system proposed here could

underlie further studies on egg antigen production and its diffusion in the host tissue.


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Introduction

Schistosomiasis is a general denomination to human infections caused by trematode worms of

the genus Schistosoma. One of the main etiological agents of this disease is the species S.

mansoni, which remains endemic in sub-Saharan Africa, Brazil, Egypt, and others countries

(Chitsulo et al. 2000; WHO 2006). To humans, infection may be a debilitating illness

affecting liver function and the kidney. Periportal fibrosis, portal hypertension, and

esophageal varices may cause death. Unlike other platyhelminths, schistosomes have separate

sexes and reside as couples for years in the portal hepatic system of the susceptible vertebrate

host (including other mammals than humans).

Among other parasitic worms, schistosomes arise as an exciting field of study for a

multidisciplinary approach to parasitologists and developmental biologists. Eggs mature in the

host tissues prior to be expelled into the gut lumen with the feces, but are also the major cause

of illness. In brief, inside the host vasculature, each inseminated female adult worms release

approximately 300 eggs/day (Moore & Sandground 1956; Pellegrino & Coelho 1978). When

feces with eggs reach freshwater, a ciliated larva hatches. This so-called miracidium has to

localize and penetrate a snail intermediate host of the genus Biomphalaria. Within the

molluscan host, some cycles of asexual reproduction drive to the emergence of cercaria, the

infecting form to humans. Cercariae actively swim towards the susceptible hosts and penetrate

the skin, where a second set of morphological changes (with no reproduction) will originate

the adult worms. However, about half of the laid eggs lodge in smaller blood vessels as liver

sinusoids, and intestinal capillaries, where they act as granulomatogenic triggers (Warren

1978). Schistosome granulomatous response is an organized complex focal inflammatory

reaction around the egg. This reaction is characterized of a set of cells of the mononuclear

phagocyte lineage to protect the host tissues from egg secretions, collectively known as

soluble egg antigens (SEA) (Reis & Andrade 1987; Turk 1992; Lenzi et al. 1998).


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Granuloma formation is strictly dependent of viable mature eggs (Sorour 1929; Espin 1941),

not occurring around single immature eggs (Prata 1957). Recently, Ashton et al. (2001)

suggested that the secretion of egg proteins (ESP) to periovular tissues may be related to the

formation of eggshell underlying structures during schistosome egg maturation. These

structures are known as the Reynold’s layer and the von Lichtenberg’s envelope (Neill et al.

1988). However, as stated by Swiderski (1994), the use of such distinct terminology is not

justified since these envelopes share ontogenetic, structural, and functional similarities to

other platyhelminth eggs (for example, cestodes). Further references to the schistosome

eggshell structures in this paper will consider their positions within the egg. The Reynolds’

layer will be referred as the “outer envelope” and the von Lichtenberg’s envelope as the

“inner envelope”.

Despite its importance in pathogenesis and life cycle continuity, egg embryogenesis has been

superficially considered, probably because of technical limitations. Although the eggshell is

transparent, structural details of the embryonic development are not easily followed in the

live, isolated eggs due to the great amount of yolk material at early stages (Jurberg et al.

2008b). The eggshell is also relatively impermeable to some embedding resins, which leads to

ultrastructural observations restricted only to the surrounding envelopes and to brief notes of

embryo internal structures in abstracts (von Lichtenberg 1967; Stenger et al. 1967; Michaels

& Prata 1968; Race et al. 1969; Race et al. 1971; Eklu-Natey et al. 1982; Swiderski et al.

1982; Swiderski 1984, 1985, 1986a, b; Neill et al. 1988; Ashton et al. 2001; Swiderski 1994).

No information on miracidial organogenesis is available so far.

Classically, maturation of schistosome eggs was first classified into five stages based on a

simple relation between the embryo size itself and the eggshell size (Vogel 1942; Prata 1957).

Here, Vogel and Prata’s staging system will be referred in roman numerals: stage I, embryo


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occupies one-third of the diameter of the egg; stage II egg, embryo occupies one-half of the

diameter of the egg; stage III, embryo has two-thirds of the length of the egg; stage IV,

embryo almost occupies the entire interior of the egg; stage V corresponds to the mature

embryo, presenting cell-flame and cilia beating, and muscle contraction. Pellegrino´s group

adapted this staging system to the “oogram” technique by calculating each stage frequency in

compressed fragments of intestine as a reliable criterion for the primary screening of

schistosomicidal drugs (Pellegrino et al. 1962; Cunha et al. 1962; Pellegrino & Faria 1965).

Recently, Hartenstein & Ehlers (2000) introduced a different staging system for the free-

living rhabdocoel Mesostoma lingua. This system considers morphological events during its

embryogenesis and has shown to be applicable for other free-living flatworms (Hartenstein &

Ehlers 2000; Younossi-Hartenstein et al. 2000; Younossi-Hartenstein & Hartenstein 2000b,

2001; Ramachandra et al. 2002; Hartenstein & Jones 2003; Morris et al. 2004; Cardona et al.

2005, 2006). Briefly, stage 1 refers to early cleavages, during which the zygote divides

basically in a spiral pattern. Stage 2 represents late cleavage, in which a proliferating mass

(the embryonic primordium) is formed. Stage 3 is defined by the expansion and

diversification of the embryonic primordium. In the stage 4 some embryonic primordia can be

distinguished. Stage 5 is characterized by the onset of tissue and organ differentiation. In the

stage 6 occurs the complete formation of the epidermis. During stage 7 occurs the elongation

of the embryo. The neural mass primordium condenses. Finally, stage 8 refers to the fully

formed mature larva.

In the present paper, we describe the morphological events during S. mansoni egg

embryogenesis by using histological and whole-mount techniques. Since S. mansoni mature

larvae (miracidia) have no eyespots and digestive system (Pan 1980), morphological

hallmarks have been determined by analyzing whole-mount miracidia prior to study egg


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development. Then, a new staging system (in arabic numerals) is proposed and then further

correlated to the previous existing one by Vogel (1942) and Prata (1957) (stages in roman

numerals). Egg development under in vitro conditions was also evaluated considering this

new staging system.

Materials and Methods

Parasites

Five-day old Swiss Webster mice were exposed to 70 or 150 cercariae of S. mansoni (LE

strain) and euthanatized in a CO2 chamber at 45-60 days after infection, in accordance to the

Ethical Committee for Animal Use-Fiocruz (CEUA L-0013/07). Adult worms were recovered

by direct incisions of the portal hepatic intestinal system or by perfusion (Smithers & Terry

1965), using RPMI-1640 plus heparin as the perfusing fluid (Kusel et al. 2006). Miracidia

were obtained from blended livers by using a modified hatching method as described

previously (Jurberg et al. 2008a). Eggs were isolated by sieving homogenized intestines

(Dresden & Payne 1981) followed by purification through a Percoll gradient (Dalton et al.

1997).

Histology

Intestines and livers from infected mice were fixed in Carson’s modified Millonig’s

phosphate-buffered formalin (Carson et al. 1973), pH 7.4, and embedded in paraffin.

Recovered female worms fixed in a 70% alcohol-formalin-acetic acid solution (AFA) and

embedded in paraffin were also processed as follows. Serial sections of 5 μm were stained by

the following methods for bright field microscopy (BM): hematoxylin and eosin (H&E) and

Lennert’s Giemsa (Lennert 1978) for cellular characterization, periodic acid-Schiff counter-


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stained with hematoxylin (PASH) for neutral polysaccharides and glycoproteins (Lillie &

Fullmer 1976), PAS-Alcian Blue pH 1.0 (PAS-AB) to differentiate between neutral and acidic

mucosubstances, and Masson trichrome for collagen and smooth muscle (Bancroft & Stevens

1996).

In vitro attainment of eggs

To compare the maturation of eggs laid in vitro and eggs isolated from the murine host (as

described above), adult worms were recovered by perfusion, and washed in RPMI-1640 with

no serum supplements. They were then maintained in RPMI-1640 containing penicillin (100

U/ml) and streptomycin (100 μg/ml), and 5% bovine fetal serum at 37° C in 5% CO2 (Kusel

et al. 2006). The medium was changed every two days. At these conditions, worm couples lay

eggs continuously for several days. Development was followed every day under an inverted

microscope, until the complete formation of the miracidium. Miracidium maturity was

inferred by movements inside the eggshell, muscle contractions and flame-cell beating (Vogel

and Prata’s stage V). Other cultivated eggs in different times of maturation were fixed in

Carson’s Millonig-formalin for whole-egg analysis.

Measurement of egg growth

At each day of incubation, eggs were collected and mounted on regular flat slides using solid

vaseline as spacers. For comparison of egg growth, isolated eggs from the murine host were

also obtained and analyzed. Eggs were classified in accordance to the Vogel and Prata’s

staging system due to the lack of morphological resolution when analyzed as unstained

whole-mounts by BM. As this staging system is based on the ratio of egg size and the embryo

itself, the area of the egg was defined as a simple character to compare the embryonic

development between each stage under these two different conditions (isolated from the host

and cultivated). At random, thirty eggs in each stage of maturation obtained at these two


101

conditions were measured (length and width) at 100X magnification using the KS300

software 3.0 (Zeiss), totalizing 300 eggs (Table 1).

Statistical analysis

The area A of each egg was estimated by considering its longest length (major axis) and its

longest width (minor axis), in accordance to the area formula of an ellipse: A = (Π * major

axis * minor axis) / 4. An analysis of variance, two-way ANOVA, followed by Tukey's Post

Hoc Test were carried out in the R software (version 2.6.2, available at

http://cran.stat.auckland.ac.nz/) with the following model for the elliptical estimated area of

the egg

Aij = μ + Ci + Sj + (CS) ij + εij (1)

where, μ denotes the area global mean, C and S are eggs source and maturation stage main

effects, respectively. Indices i and j stands for the levels of the main effects C (cultivated and

isolated) and S (stages I to V). The term CS captures the interaction effect between egg source

and maturation stage. Two interaction plots were built, one for each main effect. The

nonparallel nature of lines connecting the mean area at levels of one main source hierarchized

by the levels of the other main source suggests interaction (see Supplementary Materials). The

residual ε term accounts for sources of area variation not incorporated in the model. It is

expected to have mean 0 and variance sigma square, ε ~ Ν (0, δ²), for well fitted models.

Modeling assumptions were confirmed after the residual diagnostics. Residuals were

evaluated graphically using the Q-Q norm plot of sample quantiles versus the theoretical

quantiles of the normal distribution (see Supplementary Materials), and statistically by the

Shapiro-Wilk Normality test. Statistical significance was set as P ≤ 0.05.


102

Whole-mount analyses: carmine staining and basic fuchsine staining

Adult female worms, miracidia, and eggs obtained by sieving homogenized intestines or by

culturing worm couples were all stained in hydrochloric carmine for confocal microscopy.

Female worms were fixed in AFA and processed as described by Machado-Silva et al. (1998).

Miracidia and eggs were fixed in Carson’s Millonig-formalin and stained using conical

centrifuge tubes. Staining procedures were modified based on a previous work (Jurberg et al.

2008b). In brief, fixed eggs were stained overnight in carmine under agitation, dehydrated in

graded alcohol series and mounted as whole-preparations in ethylene glycol between

depression slides and coverslips. Tomographic images were obtained by confocal laser

scanning microscopy (CLSM; LSM 510-META, Zeiss), using a HeNe 543nm laser and a LP

560 filter.

Other isolated or cultivated eggs were stained in accordance to a basic fuchsine technique

previous introduced by Zalokar & Erk (1977) and widely used by the Hartenstein group for

studying platyhelminth embryogenesis (Hartenstein & Ehlers 2000; Younossi-Hartenstein et

al. 2000; Younossi-Hartenstein & Hartenstein 2000b, 2001; Hartenstein & Jones 2003; Morris

et al. 2004). Briefly, following fixation in Carson’s Millonig-formalin, eggs were washed

three times in 70% ethanol (5 min each) and in distilled water (5 min). They were incubated

in 2 N HCl (10 min) at 60° C for DNA desnaturation, and washed again in distilled water (5

min). After two washes in 5% acetic acid, eggs were stained for 15 min in a 2% solution of

filtered basic fuchsine in 5% acetic acid. All steps were carried out using conical centrifuge

tubes. Following staining, eggs were placed within a small wire mesh basket for removing

cytoplasmic fuchsine in a 5% acetic acid wash. They were dehydrated in graded ethanol series

(70%, 80%, 90%, 95%, and 100%; 5 min each) and mounted in ethylene glycol on depression

slides. Abnormal and dead (semitransparent, without embryonic disc or granular) eggs were

not examined.


103

The intestinal scraping technique

This simple technique is based on scraping the mucosal layer by a scalpel. Fragments of 1.0

cm of small intestine from infected mice were collected, opened in full-length and washed in

0.9% saline for removing fecal debris. These fragments were dried on an absorbent paper and

placed between slides and coverslips. Scraping the mucosal layer makes a thinner sample that

can be microscopically examined.

The oogram technique by CLSM

Freshly obtained small intestines were opened lengthwise and brief washed in 0.9% saline for

removing fecal debris. Then, fragments of 0.5 cm were cutted off, slightly dried in absorbent

paper, and maintained strongly pressed between glass slides with rubber bands during fixation

overnight in 70 % alcohol under agitation. Top slides were removed and flattened samples

were stained overnight in carmine under agitation, at room temperature. Intestinal fragments

were dehydrated in graded alcohol series (equal to isolated eggs) and mounted in ethylene

glycol. Examination of the slides was carried out under confocal microscopy with the same

settings cited above for whole-mount eggs.

Results

Miracidium morphology by CLSM

Whole-mounted, carmine stained miracidia were analyzed under CLSM to detail internal

organs as reference to classify the embryonic development of the eggs. Histological sections

of mature eggs in the small intestine were also considered. The following structures were

easily visualized for both methods: (1) neural mass (spherical, with a peripheral layer of one-

two small irregular nuclei circumventing an acellular mass, called neuropile), (2) lateral

glands (a pair, unicellular), (3) apical gland (single, with three nuclei), (4) terebratorium (in


104

the apical region), (5) ciliated tegument, (6) germ cells (generally grouped at the posterior

region). Although evident in the miracidium, germ cells were not considered as a reference

feature due to their similarity with early immature cells (blastomeres). They possess large

round nucleus, prominent nucleolus and scarce cytoplasm (Fig. 1).

Female reproductive system and intrafemale egg development

Just a brief period of the egg development occurs inside the female reproductive system. The

single ovary presented small, hexagonal cells, with a central nucleus, lining its walls at the

distal pole. Maturation occurred in the direction of the proximal pole, near a short segment of

the oviduct, just before the seminal receptacle (Fig. 2a). Mature oocytes were bigger than

immature ones, with a large central, basophilic nucleus. Nucleolus was evident, intensely

basophilic, and presented a very prominent, slightly eosinophilic nucleolar inclusion.

Cytoplasm was abundant and homogeneously blue on Giemsa-stained sections, indicating the

wide presence of ribosomes or poliribosomes (Fig. 2b). In the brief prezygotic stage, each

oocyte left the ovary at a single moment through the projection of its cytoplasm (pseudopod)

(Fig. 2c). In the oviduct, shortly before the seminal receptacle full of sperm, the oocyte was

fecundated, giving rise to the zygotic stage (also named as stage 0). The zygote passed

through the sperms towards the oviduct and then the vitelline-oviduct. In the vitelline-oviduct,

the zygote was surrounded by approximately 40-45 vitelline cells (vitellocytes), which leads

to a production of about 13,500 vitelline cells per female worm per day. Vitelline cells were

smaller than the zygote, with central, eosinophilic nucleus, and azurophilic cytoplasm full of

blue-stained yolk granules on Giemsa. On PASH and Masson trichrome-stained sections, the

vitelline cell cytoplasm was slightly eosinophilic with weakly red and green-blue tinge,

respectively. This cell mass entered the ootype, where the eggshell was formed (Fig. 2d). At

this moment, the zygotic cell did not suffer any division. The fully formed egg, with its

characteristic conspicuous lateral spine, was released in the uterus (Fig. 2e). Then, it was


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deposited through the gonopore just beneath the ventral sucker of the female, without

suffering any cleavage, as observed on newly laid eggs in vitro (Fig. 2f).

Egg growth under in vivo and in vitro conditions

Eggs laid under in vitro conditions developed completely and released viable infective

miracidia (data not shown). Regarding the estimated egg area as a simple character, the effect

of two different environments on egg growth while embryo develops (assessed by the Vogel

and Prata’s staging system under BM) was modeled according to the equation 1. Goodness of

fitting was checked by graphical (Supplementary Materials) and statistical residual analysis (P

≤ 0.001). Considering only the effect of each environment in the mean area of the eggs (with

no distinction in regard to egg age), a significant difference was detected between eggs

obtained from host tissues and eggs cultivated in vitro (P = 0.00017). When considering only

the maturation stages with no distinction in regard to egg origin, the mean egg area also

differed significantly between each stage and its following one (P < 0.0001), except between

the stages I and II (P = 0.976). Both main effects (egg origin and stage) interacted to explain

area variability (P = 0.0001) as suggested by line crosses in its interaction plots (see

Supplementary Materials). Considering matching stages of both environments between

themselves, differences in mean area were statistically significant for all stages (P < 0.0001),

but less impressive between eggs from stage I (P = 0.017) and not significant between mature

eggs (stage V) (P = 0.445).

A clear increase in egg size during miracidium embryogenesis in culture was statistically

significant between each stage and its following one, although no difference in the mean areas

occurred between eggs from stage I and stage II (P = 1.000). In fact, the mean area of eggs in

stage II was smaller than the mean area of eggs in stage I under such in vitro conditions,

despite minimum and maximum values of eggs in stage II have been bigger than in stage I. In


106

sequence, eggs in stage II were significant smaller than in its following stage III (P < 0.0001),

which were also smaller than eggs in stage IV (P < 0.005). Eggs in stage IV were also

significant smaller than mature eggs (P < 0.0001) (Fig. 3a).

A similar growing pattern was also noted in eggs obtained from the murine host. Eggs in

stages I and II did not differ statistically in size (P = 0.969) such as eggs in stages II and III (P

= 0.390). On the other hand, eggs in stage III were significantly smaller than eggs in stage IV

(P < 0.0001), and eggs in stage IV were also significantly smaller than mature eggs (stage V)

(P < 0.0001) (Fig. 3b).

Comparing the interaction of both main effects on egg mean area, eggs in stage I from both

environments did not show significant differences among themselves (P = 0.325). Isolated

eggs from stage II were significantly bigger than their matching cultivated stage (P < 0.005),

while isolated stage III and stage IV-eggs were significantly smaller than their respective

matching cultivated stages (P < 0.0001). No statistically significant difference between egg

mean areas of mature eggs (stage V) was detected (P = 0.999) (Fig. 3c, d; Table 2).

Stages in Schistosoma mansoni egg embryogenesis

Stage 1

Newly laid eggs were passively carried by the blood flow until they were trapped in small

vessels of the murine host. In the onset of this stage (also corresponding to Vogel and Prata’s

stage I), the embryo was too small to be visible in isolated, stained or unstained, whole eggs

by BM (Figs. 4a, 10). Carmine-stained eggs under CLSM and histological sections revealed

that the first cleavage was total and subequal, producing two blastomeres slightly different in

size (Fig. 4b). They showed a central large round nucleus, homogeneously stained but without


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heterochromatin delineation (“ground glass” aspect), with a very prominent and intense

basophilic nucleolus. Nucleolar inclusions were visualized under BM. The cytoplasm was

abundant and homogeneously blue when stained with PASH, and Giemsa (Fig. 4b, c). These

features indicate that the cells were actively engaged in protein synthesis. Embryonic cells

were difficult to be seen on PAS-AB-stained slides, due to the very weak staining of both

nucleus and cytoplasm (Fig. 11a). Vitelline cells exhibited an apparently vacuolated

cytoplasm, slightly stained in red on PASH (Fig. 4b) and in green-blue on Masson trichrome

(Fig. 4d), but heavily stained on PAS-AB-stained slides (Fig. 11a). This staining pattern

suggests the presence of neutral polysaccharides or neutral glycoproteins. As soon as the first

cleavages occur, the vitelline cells started to fuse into a single yolk syncytium. The remnant

vitelline nuclei were small, basophilic, irregularly shaped (Fig. 4d). Following cleavages

occurred asynchronously, resulting in the formation of the animal-vegetal axis. By the end of

stage 1, the embryo formed a roughly circular disc, 2-3 cells in diameter (Fig. 4e). The

embryonic primordium was now visible in the center of whole, unstained eggs as a clear disc,

occupying about the half of the transversal length of the egg (now corresponding to Vogel and

Prata’s stage II) (Figs. 4f, 10).

Stage 2

The embryonic primordium increased in size (Fig. 4g, 9e, 10). The number of embryonic

cells, visible in carmine-stained whole-mounts under CLSM or by histology, reached 4-6 cells

wide and 6-8 cells long (Figs. 4h-m, 9e). Morphological features of embryonic cells and the

yolk syncytium remained similar to the previous stage (Figs. 4h-m, 9e). Mitotic figures were

visualized throughout the embryo (Figs. 4l, m). Other cells presented pycnotic nuclei on

PASH, Giemsa, and Masson trichrome-stained sections (Fig. 4m), suggesting the occurrence

of apoptosis during early embryonic development. Vitelline cells fused completely. Some

macromeres seemed to detach from the embryo poles, adhering to the eggshell (Fig. 4l). They


108

will give rise to the outer envelope of the egg, also named the Reynolds’ layer. These

macromeres had a large, round nucleus, with “ground glass” aspect (slightly

heterochromatic). The nucleolus was round, intensely basophilic, and very prominent, with a

punctiform light nucleolar inclusion. Their cytoplasms were scarce, and apparently basophilic,

being stained in blue on H&E, PASH, and Giemsa (Fig. 4l). Some vitelline nuclei also

seemed to adhere to the eggshell. By the end of stage 2, a solid proliferating cell mass

(stereoblastula) occupied the whole transversal length of the egg (corresponding also to Vogel

and Prata’s stage II) (Figs. 4m, 10).

Stage 3

In whole eggs, the clear area corresponding to the embryo increased in size, assuming an

elongated form, that occupies two-thirds of the longitudinal length of the egg (like in Vogel

and Prata’s stage III) (Figs. 4n, 9f, 10). On histological sections, the yolk syncytium remained

heavily stained in red on PAS-AB, while the embryo itself remained difficult to be visualized.

Cellular differentiation began, giving rise to at least two types of cells (Figs. 4o-p, r). Type I

cells preserved the immature morphology, possessing a large, round nucleus, with “ground

glass” aspect, prominent nucleolus, and scarce cytoplasm, stained in blue on Giemsa. Type II

cells (neuroblasts?) seemed to be concentrated in the center of the embryo. They had small,

slightly irregular nucleus, with a close chromatin pattern, and scarce cytoplasm. The nucleus

was slightly stained green-blue on Masson trichrome, and a punctiform nucleolus was

evident. The embryo had about 7-10 cells wide, and 9-12 cells long (Figs. 4o-p, r). Several

mitotic figures were seen at this stage throughout the embryo (Fig. 4r). Signs of apoptosis as

pycnotic nuclei were present mainly in the periphery of the embryo (Fig. 4r). Other peripheral

embryonic cells seemed to be compromised in the differentiation of the inner envelope (also

known as the von Lichtenberg’s envelope). Their nuclei were slightly flattened (Fig. 4r). In

the outer envelope, the differentiation initially started at stage 2 with the adhesion of


109

macromeres to the eggshell and subsequent syncytium formation, seemed to continue with the

fusion to the yolk syncytium.

Stage 4

Considering the previous stage, it was not possible to distinguish morphological changes in

whole, unstained eggs (corresponding to the Vogel and Prata’s stage III) (Fig. 10). On

histology, the differentiation of the inner envelope became apparent with the formation of a

detaching syncytium surrounding the whole embryo (Fig. 5). On PAS-AB-stained sections,

the cytoplasm of these cells were lightly stained in red, while the yolk mass was heavily

stained, and the embryo itself was barely stained (Fig. 11b). On PASH, the inner envelope

syncytium was also stained in red, while on Giemsa its cytoplasm was stained in blue,

suggesting the wide presence of ribosomes (Figs. 5a-c). The flattened nuclei remained with

their “ground glass” aspect, with a pronounced lateral nucleolus. The outer envelope was

fused to the yolk syncytium and seemed to disappear progressively towards the development

(Fig. 5b). These events were also visualized in whole carmine-stained eggs under CLSM

(Figs. 5d-i). Vitelline nuclei were visible at the poles of the egg. In the center of the embryo,

the neural mass primordium arose from a roughly spherical group of cells with small,

heterochromatic nuclei, and punctiform nucleolus (type II cells). These neuroblasts were

arranged in a layer of 1-2 cells thick around an acellular region (neuropile). On Masson

trichrome, such nuclei stained slightly in blue-green (Fig. 5j). Immature cells (type I cells)

concentrated mainly in the periphery of the embryo (Figs. 5b, c, e-i).

Stage 5

The embryo occupied almost the whole egg interior, although some vitelline remnants were

present at the poles (corresponding to the Vogel and Prata’s stage IV) (Fig. 6a, d-i, 10). The

outer envelope assumed a thin, granular, and anucleate aspect, that difficult its visualization


110

on histological sections. The inner envelope was heavily stained in red with PASH and PAS-

AB, and it kept its syncytial aspect (Fig. 6b-i). The neural mass primordium increased in size,

expanding its central, acellular region (Fig. 6b, c, g-i). The epidermis started to differentiate

from the most peripheral cells of the embryo (Fig. 6b, c, e-i). These small, cuboidal

primordial cells fused to form another syncytium just beneath the inner envelope (Fig. 6).

Such epidermal primordium had round nucleus with no pattern of heterochromatin delineation

(“ground glass” aspect). Its basophilic cytoplasm were stained in blue on Giemsa sections

(Fig. 6b), indicating an active engagement in protein synthesis. In the anterior region of the

embryo, two large, immature cells are positioned at each side of the neural mass primordium.

Stage 6

Taking into consideration the Vogel and Prata’s classification, no differences were identified

between this stage and the previous analyzing whole, unstained eggs. On PASH-stained

sections, the lateral, anterior immature cells exhibited cytoplasmatic granules heavily-positive

to the PAS method (Fig. 7a, b). The nucleus remained large and round, without

heterochromatin delineation. Nucleolus was prominent. Such cells will give rise to the lateral

glands of the miracidium. An anterior group of immature, small cells presented a weaker

pattern of cytoplasmic positive staining to the PAS reaction (Fig. 7a, b). This group will form

the apical gland of the mature larvae. The epidermis of the anterior region of the embryo

seemed to project onwards, elongating in a cone-like structure, called terebratorium (Fig. 7a,

g-h). The neuropile of the neural mass primordium exhibited a weak positive stain to PAS,

similarly to the embryonic parenchyma staining (Fig. 7a). In the posterior region of the

embryo, groups of three to five cells with immature features (large, round nucleus with

“ground glass” aspect, and scarce, basophilic cytoplasm) were positioned (Fig. 7g-i). They

correspond to the germ cells of miracidia. The inner envelope showed the same features of the

previous stages, with large, round, “ground glass” nuclei, and prominent nucleoli (Fig. 7a, c-


111

i). The syncytial cytoplasm was homogenously stained in red on PASH sections (Fig. 7a). At

the end of this stage, the epidermal epithelium was clearly distinguishable from the

mesenchyme (Fig. 7b-i).

Stage 7

Elongated embryo occupied the whole eggshell interior, but no movement was observed in

freshly isolated and cultivated eggs or by the oogram (Fig. 9a) and intestinal scraping

techniques. A small amount of dark yolk material was positioned in the poles of the egg (Fig

10d). Eggs in this stage still correspond to Vogel and Prata’s stage IV (Fig. 10). In

histological sections, the unicellular lateral glands were strongly stained in red on PASH and

in green on Masson trichrome (Fig. 8a, b). They extended (gland ducts) towards the

terebratorium (Fig. 8m, n). Their nuclei were smaller, irregularly round, and heterochromatic.

The apical gland was formed by the fusion of three immature cells, positioned in the anterior

region of the embryo and flanked by the two lateral glands (Fig. 8a). The apical gland was

also stained in red on PASH and in green on Masson trichrome, but exhibited a granular,

heterogeneous pattern (Fig. 8a, b). Three small, irregularly shaped nuclei were localized in

center of the apical gland. They were bigger than the lateral gland nuclei. The localization and

staining pattern of both lateral glands and apical glands allowed the distinction between them

(Fig. 8a, b). In this stage, the neural mass exhibited nuclei condensation (Fig. 8c, d),

suggesting that brain differentiation was completed. This process of neuronal nuclei

condensation was followed by an increasing in neuropile volume. The neurons had small

nuclei, roughly round or elongated, and heterochromatic. Posteriorly, no pattern modification

occurred to the immature cells (germ cells) (Fig. 8a, b). The eggshell was thicker in the poles.

Under BM, the outer envelope was difficult to be recognized in this stage. The inner envelope

kept its previous characteristics (Fig. 8a, b). The subepidermical musculature was revealed

throughout the embryo by the Masson trichrome staining (Fig. 8b).


112

Stage 8

Embryos occupied the whole interior of the egg. In freshly isolated and cultivated eggs or in

the oogram (Fig. 9) and the intestinal scraping techniques, they move rapidly and make

circumvolutions inside the eggshell. Muscular contractions, cilia and flame-cell beating were

also indicative of maturity in live eggs. They were ready to hatch if reach appropriate

conditions. This stage corresponds to the final stage V of the Vogel and Prata’s classification

(Fig. 10). Even in unstained eggs, the neural mass was easily recognized in the mid-anterior

region of the miracidium (Fig. 10d). In sections, one to two layers of neurons were organized

peripherally around the roughly round neuropile (Fig. 8d, f-g). In the anterior region, the

terebratorium, the apical gland, and both lateral glands were fully formed (Fig. 8e-n).

Morphological signs of gland secretions to the interior of the egg were observed inside the

murine host (Fig. 8f). Epidermal cells were distributed in ciliated epidermal plates, forming a

thin syncytium with round, basophilic nuclei (Fig. 8h). A conspicuous basal membrane

separated the epidermal cells from the muscular adjacent layer. It was revealed in negative by

the PAS-AB method (Fig. 11c). No mitotic figures were seen throughout the embryo. Germ

cells were arranged posteriorly in groups of three to five cells (Fig. 8, 9d). Taking into

consideration the eggshell structures, the outer envelope kept its previous features, while the

inner envelope seemed less thick (Fig. 8h-n). Whole stained eggs analyzed under CLSM

exhibited a granular material (Cheever corpuscules?) within the space between the apical

membrane of the inner envelope and the miracidium itself (Fig. 8l-n). This space was named

Lehman lacuna by Neill (1988).

Discussion

Based on a recently introduced morphological staging system and adapted to other flatworm

species (Hartenstein & Ehlers 2000; Younossi-Hartenstein et al. 2000; Younossi-Hartenstein

& Hartenstein 2000a, b, 2001; Ramachandra et al. 2002; Morris et al. 2004; Cardona et al.


113

2005, 2006), the present investigation has demonstrated that the schistosome egg development

is complex, and described for the first time the sequence of its morphological events up to the

complete formation of the ciliated larva (miracidium) (see Fig. 10). Egg maturation under in

vivo and in vitro conditions has been also evaluated statistically by using the ratio embryo/egg

size as a simple character, and morphologically by using carmine staining of whole-eggs.

Schistosomes have the neoophoran mode of development, in which a specialized organ

(vitellarium or vitelline gland) provides individualized vitelline cells that surround the zygote

in the vitelline-oviduct, before entering the eggshell forming apparatus (the ootype). The

number of vitelline cells within the newly formed egg capsule of S. mansoni is not precise in

the literature, varying from 20 to 40 cells (Gonnert 1955; Wells & Cordingley 1991;

Swiderski 1994; Michel et al. 2003; Knobloch et al. 2006). Our preliminary findings on

eggshell formation in whole-mount mature females analyzed by CLSM pointed

approximately 40-45 individualized vitelline cells in each newly enclosed egg, but additional

analyses must be carried out for a statistically significant result. In schistosomes, these cells

probably have a key role in eggshell formation and a reduced importance in embryo

nourishment (Erasmus 1975; Erasmus et al. 1982; Bobek et al. 1986; Johnson et al. 1987;

Koster et al. 1988; Reis et al. 1989; Chen et al. 1992; Schussler et al. 1995; Fitzpatrick et al.

2004; Fitzpatrick et al. 2007). The eggshell has cribriform-like pores, which allow the uptake

of exogenous nutrients during egg migration through host tissues (Lewert et al. 1970;

Stjernholm & Warren 1974; Neill et al. 1988; Swiderski 1994).

The present findings on the reproductive system of S. mansoni female worms are in

accordance to Neves et al. (2005), although the morphology of the Mehlis’ gland has not been

examined. These authors suggested that the Mehlis’ gland of S. mansoni mature females is

formed by thick cuboidal epithelial cells with flabby chromatin, which line the ootype. Their


114

description is controversial, since ultrastructural investigations by Spence & Silk (1971a, b),

Irie et al. (1983), and Moczon et al. (1992) have pointed a set of unicellular glands with

narrow cytoplasmic projections in the lateroposterior region of the ootype as seen in other

trematodes (for S. margrebowiei, see Awad & Probert 1990; for echinostomes, see Rao 1963;

Lie 1965; for Fasciola spp., see Rao 1959; Threadgold & Irwin 1970; Anuracpreeda et al.

2006). In the ootype, the quite viscous secretions of the Mehlis’ gland create an alkaline

interface around peripheral acidic eggshell precursor granules exocytosed from the vitelline

cells. This promotes the coalescence of these eggshell precursor granules to form the eggshell

(Wells & Cordingley 1991) that hardens in the female uterus by a process dependent of two

tyrosinases (Swiderski 1994; Fitzpatrick et al. 2007). As noted by several authors,

schistosome eggs are not retained in the female parental uterus and are laid still undeveloped.

Before studying egg embryogenesis, we examined the morphology of the miracidium by

histology and whole-mount preparations in order to define “hallmark” structures for each

stage of embryo formation. Previously, the morphology of the fully formed, newly hatched

larva of S. mansoni was extensively studied by two authors, using BM (Ottolina 1957) and

transmission electron microscopy (TEM) (Pan 1980). Our findings on the miracidium

morphology are in agreement with Pan (1980). But unlike Hartenstein & Ehlers (2000) for the

rhabdocoel Mesostoma lingua, such references were difficult to recognize in live eggs, even

under differential interference contrast microscopy (data not shown). In mature eggs, muscle

contraction, cilia and flame-cell beating are easily observed and indicative of miracidium

viability (Prata 1957). These movements were seen in all the techniques performed prior to

fixation. However, flame-cell differentiation was not determined yet. It probable occurs late

during organogenesis, perhaps starting in stage 7. Further investigations to clarify the

formation of embryo excretory system are now in progress.


115

An alternative attempt to improve embryo survey was to remove the eggshell from live eggs,

but we were not successful in the present time (data not shown). To circumvent this

drawback, we had previously adapted a staining protocol for single whole-eggs by confocal

microscopy (Jurberg et al. 2008b) and we now present the use of the same staining (carmine)

in conjunction to the oogram technique and confocal microscopy (Fig. 9). The classical

technique by Pellegrino & Faria (1965) is commonly used to infer interruption of egg-laying

on chemotherapeutical evaluations, which causes changes of egg frequencies in host tissues

(in this case, intestine). However, whether it occurs, this technique does not access the effect

of drug treatment on the egg embryonic development. The oogram technique in conjunction

to carmine staining under CLSM has revealed in great details the morphological events during

egg embryogenesis in situ (Fig. 9d-f). It is important to emphasize the need to compress very

well the intestinal samples during preparation. The analyses of whole eggs from in vivo and in

vitro conditions could bring additional information to egg biology, especially seeking

phenotypic changes in drug evaluations and in RNA interference–mediated knockdown

studies, as performed by Freitas et al. (2007). It is possible that removing the eggshell will

further improve embryo visualization, probably facilitating embryonic cell lineage tracing and

future studies.

Although difficult to visualize the described morphogenetic events in live eggs, it is possible

to correlate them with Vogel and Prata’s staging system (Vogel 1942; Prata 1957) (Fig. 10).

These authors do not classify the egg formation inside the female, which we divided in two

stages: the prezygotic stage refers to the release of mature oocyte from the multi-lobated

ovary until its fecundation in the short segment of the oviduct, just before the seminal

receptacle, while zygotic stage (also stage 0) is characterized by the following migration of

the early-fertilized zygote. Early cleavages correspond both to our stage 1 and Vogel and

Prata’s stage I, in which the embryonic primordium is too small to be visible under BM. At


116

the end of this stage, the embryo becomes visible as a clear central disc, occupying one-third

of the diameter of the egg. Our stage 2 represents late cleavages, in which the embryonic mass

becomes bigger (stereoblastula) and occupies one-half of the diameter of the egg. This is

correspondent to Vogel and Prata’s stage II. The Vogel and Prata’s stage III, when embryo

elongates to occupy two-thirds of the length of the egg, was divided by us into two novel

stages: in stage 3, when cellular differentiation starts producing at least two cell types, while

in stage 4, the first embryonic primordium (neural mass) arises from a mesenquimal mass of

cells. In the Vogel and Prata’s stage IV, embryo increases in size occupying almost the entire

egg. This stage comprehends the main steps of organogenesis and can be also divided in: our

stage 5, that refers to the beginning of epidermis formation; in stage 6, when occur

terebratorium and miracidial glands differentiations; while in stage 7, the neural mass suffers

nuclear condensation. In both staging system, the last stage (Vogel and Prata’s stage V and

our stage 8) refers to the fully formed larva before hatching (Fig. 10).

Comparison between the development of eggs laid in vitro and of eggs isolated from the

murine host were assessed by statistical (using only the Vogel and Prata’s staging system) and

morphological (using both staging systems) analyses of whole-mount eggs in different stages

of maturation. Despite the lack of information on its embryonic development, schistosome

eggs have been commonly maintained under culture conditions for a wide variety of purposes,

as drug screening, antibody production, and RNA-interference knockdown (Asahi &

Stadecker 2003; Schramm et al. 2006; Freitas et al. 2007; de Araujo et al. 2007; Cass et al.

2007). However, as reviewed by Gobert et al. (2007) for mechanically transformed

schistosomula, culturing parasites in vitro should be considered with caution, especially at

molecular or biochemical levels. Michaels & Prata (1968) have followed egg maturation in

two distinct culture media and defined the M199 containing 10% calf serum as adequate to

support egg embryogenesis and miracidial life span as well as the host environment. On the


117

other hand, some authors use the RPMI-1640 culture medium (Ashton et al. 2001; Kusel et al.

2006; Schramm et al. 2006). Here, we evaluated the embryonic development of S. mansoni

eggs in this medium and compare it with data obtained from isolated eggs.

At the conditions used here, undeveloped eggs laid in vitro are capable of mature completely

and hatch when placed in water. The fully formed larva also infects Biomphalaria glabrata

snails, with cercaria release (data not shown). To both environments (culture and host), eggs

significantly increased in size during development, which was previously reported by Prata

(1957) to eggs in the host and by Michaels & Prata (1968) to cultivated eggs. Ashton et al.

(2001) confirmed this growth by calculating a factor of biomass gain in 3.33. Considering egg

growth between each following Vogel and Prata’s stage, no significant difference was

observed during early stages (stages I and II). In fact, unlike observed in isolated eggs in these

early stages, the mean estimated area of cultivated eggs in stage II was smaller than in stage I,

despite minimum and maximum values of eggs in stage II have been bigger than in stage I.

This indicates a great dispersion of area values in cultivated eggs from stage II, which may be

explained by a natural phenotypic plasticity of egg size under in vitro conditions. It is also

possible that eggs do not increase in size during early stages of development because they

probably should adapt to the new, external environment (culture or host). To both

environments, eggs increased significantly in size in the following stages, reaching maximum

values when mature. The statistical significant differences in the mean estimated areas of

cultivated and isolated eggs between distinct stages of maturation may suggest unequal rates

of maturation, since the gross morphology of each matching stage seems to be similar.

Moreover, mature eggs from both environments exhibited no significant differences in area

when compared among themselves. In this case, culturing eggs for studying morphological

events during embryogenesis may be useful, although it should raise questions on interpreting

biochemical and molecular data as stressed by Gobert et al. (2007) for schistosomula. A chief


118

difference among eggs cultivated in vitro refers to the lack of evident signs of death when

compared with eggs from the host (Michaels & Prata 1968). Sarvel et al. (2006) used the

fluorescent probe Hoechst 33258 to differentiate dead eggs from live ones by labeling nuclei

of damaged cells. We tried to perform this method in conjunction to carmine staining, but we

were not successful, even modifying the staining steps sequence (data not shown).

As seen in culture conditions, eggs within the female reproductive system did not undergo any

cleavage and the first mitotic division occurs only in the female external environment (host

bloodstream or culture). The triggering signal(s) is(are) still unknown. Before the first total,

unequal cleavage, vitelline cells start to fuse progressively into a single syncytium, as also

reported by Swiderski (1994). Cell fusion is a key process for plant and animal development

and is quite common during miracidium embryogenesis (in the formation of inner and outer

envelopes, apical gland and epidermis). Other several examples are available in the literature

(Podbilewicz 2006; Oren-Suissa & Podbilewicz 2007; Larsson et al. 2008). Generally, it

involves bringing two lipid bilayers into close proximity, followed by the formation of a

fusion pore and cytoplasmic mixing, to form a syncytium (Oren-Suissa & Podbilewicz 2007).

However, nothing is known on vitelline fusion during the embryonic development of

schistosome eggs. It is possible that yolk syncytium formation facilitates nutrient availability

to the embryo, including the uptake of host metabolites via eggshell pores (Lewert et al. 1970;

Stjernholm & Warren 1974). Remnants of the vitelline cells also fuse to two macromeres that

have detached from the poles of the developing stereoblastula and adhered to the internal

surface of eggshell to form the outer envelope (Reynolds’ layer), as also reported by

Swiderski (1994). This starts to occur in the period that we have classified as stage 2 (late

cleavage) and disappear progressively around stage 4 (organ primordia formation).

Ultrastructurally, the outer envelope thickens as maturation proceeds, especially at the poles

of the eggshell. In later stages, is characterized as an acellular matte of arborizing and


119

anastomosing electron-dense fibrils in a finely granular matrix with many free ribosomes in

mature eggs (Neill et al. 1988; Swiderski 1994). On the other hand, the egg inner envelope

(von Lichtenberg’s envelope) arises exclusively from peripheral embryonic cells that start to

differentiate in a stage which we had classified as stage 3. Nevertheless, it becomes apparent

in the following stage 4, while fusion proceeds to encircle the embryo as a detaching syncytial

layer slightly positive to PAS. During these later stages, the inner envelope expands while

embryo grows and adheres to the remnants of the outer envelope. Nuclei are flattened and

large, with scant heterochromatin and prominent nucleoli, while the cytoplasm is thin, with

developed granular reticulum, abundant polysomes, elongate mitochondria, and several lipid

droplets. In mature eggs, this envelope deteriorates (Neill et al. 1988; Swiderski 1994; Ashton

et al. 2001), which may facilitate the release of egg antigens to the surrounding environment.

A marked change in positive reaction in PAS and PAS-AB methods occurs during the

embryonic development of schistosome eggs (Fig. 11). These stainings reveal the production

of neutral glycoproteins, first by the inner envelope (beginning in stage 4) and then by

miracidial glands (in stage 6). Mature embryos are strongly positive to PAS reactions. This

may suggest that late production of glycoproteins is related to previous observations by Prata

(1957), in which granuloma formation does not occur around single immature eggs, but only

around mature eggs.

Indeed, Andrade & Barka (1962) first suggested that host-immunogenic antigens are

polysaccharides or glycoproteins. It is now known that schistosome eggs secrete at least 188

proteins of a wide variety of functions (Cass et al. 2007), and that granulomatogenic activity

is triggered specifically by glycoconjugates with terminal Galβ1-4GlcNAc (LacNAc) or

LacdiNAC elements (Van de Vijver et al. 2006). The localization of these egg secreted total

proteins (ESP) was attributed to egg envelopes instead of the miracidium itself (Ashton et al.

2001). However, as first pointed by Lewert & Lee (1954), miracidial glands are also positive


120

to the PAS reaction. Our results showed that both types of miracidial glands (lateral and

apical) differentiate late in development (stages 6 and 7), producing PAS-positive granules,

and secrete them to the interior of the egg in the fully formed miracidium. In this case, like in

egg envelopes (Ashton et al. 2001; Schramm et al. 2006; Van de Vijver et al. 2006), it is

possible that gland material also contributes to granuloma formation. Besides the production

of immunogenic components, egg envelopes may play another important role, acting as a

slow antigen-releasing barrier to the surrounding environment and preventing premature egg

expulsion to gut lumen (Ashton et al. 2001). The differentiation of miracidial glands also

strengthens this scenario, since their glycoprotein production start late during egg

development. Further histochemical (lectins) and immunohistochemical studies should be

performed to evaluate the role of specific egg antigens during embryo formation and to clarify

the role of miracidial glands during granulomatogenesis. So far, just a few egg antigens had

been located, exclusively in mature eggs (Williams et al. 2001; Schramm et al. 2006; Van de

Vijver et al. 2006).

Apoptosis in platyhelminths was first reported in the free-living Macrostomum sp. (Nimeth et

al. 2002) and then observed in planarians during regeneration (Hwang et al. 2004). Nuclear

morphology assessed by Giemsa staining is considered a reliable criterion for apoptosis

determination (e.g. see Baskic et al. 2006). In schistosome egg embryogenesis, signs of

programmed cell death as pycnotic nuclei were found during late cleavage, the blastula stage,

and early organogenesis. Presumably, cell death is involved in tissue formation and

arrangement. However, its role on tissue homeostasis during embryonic development of

schistosome eggs remains to be better evaluated in further studies.

Following envelopes formation, organogenesis starts to occur (beginning in stage 5).

Phylogeneticaly, schistosome egg development was quite similar to the rhabdocoel pattern


121

showed by Mesostoma lingua, in which gastrulation does not seem to occur (see Hartenstein

& Ehlers 2000). The cleavage-resulting solid blastula gives rise to organ primordia, such as

neural mass, epidermis, and other organs from mesenchymal cells, but unlike rhabdocoels,

schistosome embryo do not form pharynx and gut during egg development. The lack of such

structures is probable associated with the parasitic lifestyle. They will appear only during

miracidium-sporocyst-cercariae transformation within the snail intermediate host (Pan 1996;

Dorsey et al. 2002). Another similar event is the formation of egg embryonic envelopes,

which might be derivatives of the huell membrane of turbellarian flatworms. For instance, in

Mesostoma, this transient membrane arises from vitelline cells that surround the embryo

ventrally and disappear progressively around stage 6 (Hartenstein & Ehlers 2000). However,

as other parasitic platyhelminths (e.g. cestodes) schistosomes have two envelopes, which may

be also an adaptation to parasitism. They protect the developing and fully formed miracidium,

act as nutrient producing and storage compartments, secrete immunogenic materials which

can contribute to egg expulsion to gut lumen, and provide motility for miracidial movements

prior to hatching (Neill et al. 1988; Swiderski 1994; Ashton et al. 2001; see also Conn &

Swiderski 2008). Both envelopes are cellular in origin, syncytial in nature, and enclose the

embryo (Swiderski 1994). Nevertheless, the outer envelope has mixed origin (from

macromeres and vitelline cells) and disappears gradually such as the huell membrane, while

the inner envelope arises from mesomeres and persists until egg hatching.

Epidermis formation begins during stage 5 by fusion of an embryonic peripheral monolayer,

just underneath the inner envelope. As differentiation proceeds, single epidermal cells form

hundreds of cilia that became identifiable around stage 7 by BM and CLSM. However, it is

possible that their formation start a little earlier. The body wall of S. mansoni miracidia is

arranged in four tiers of 6, 8, 4, and 3 plates, from the anterior to the posterior end (Pan 1980;

Eklu-Natey et al. 1985). These plates are separated from each other by epidermal ridges,


122

interconnected by their cell bodies and narrow cytoplasmic bridges, except in the first tier

where no ridges separate them (Pan 1980; Eklu-Natey et al. 1985). As noted by Pan (1980,

1996), the terebratorium appears to be a modified epidermal ridge, which contains at least 12

peripheral sensory organelles and the openings of miracidial gland ducts. In S. mansoni, it has

a ‘honeycomb’ pattern (Eklu-Natey et al. 1985). The underlying muscle layer was visible in

mature embryos, but its differentiation should be detailed by immunohistochemical and

ultrastructural studies. Epidermis formation, cilia growth, and terebratorium differentiation

should be also detailed by TEM in further studies. Parasitic platyhelminths belong to the

monophyletic group Neodermata (Ehlers 1985; Littlewood et al. 1999), in which the larval

ciliated epidermis is replaced by a syncytial nonciliated epidermis with “insunk” nuclei

(tegument) in the adult, called neodermis (Tyler & Tyler 1997).

In late stages of miracidium embryogenesis, when the larva is almost fully formed, germ cells

were evident in whole-mounts or histological sections, but were not considered as a reference

feature due to their similarity with early immature cells (blastomeres). They possess large

round nucleus, prominent nucleolus and scarce cytoplasm. Based on ultrastructural

observations of the miracidium-sporocyst transformation in the snail host (Pan 1996), we

postulate that the miracidial germ cells may be homologous to neoblasts of other

platyhelminth worms, although no accounts of regeneration potential has been given for any

of schistosomal evolutive stages. Both cell types have remarkable proliferative capacity and

are morphologically defined by a prominent nucleus and a small rim of basophilic cytoplasm,

by free ribosomes and a relatively small amount or lack of endoplasmic reticulum. Miracidial

germ cells have many mitochondria unlike well-established neoblasts (Pan 1980;

Gschwentner et al. 2001).


123

The staging system introduced by the Hartenstein group for free-living flatworms (Hartenstein

& Ehlers 2000) was very useful to detail and classify schistosome egg embryogenesis. The

assumption considered by Younossi-Hartenstein & Hartenstein (2001) that the temporal

sequence in which homologous morphogenetic events occur, and the spatial framework in

which these events unfold, is sufficiently similar between some flatworms proved to be valid

also for the trematode parasite S. mansoni. However, miracidia of schistosomes do not have

primitive gut and eyespots (for S. mansoni, see Pan 1980).

In conclusion, this work proposes a new staging system for S. mansoni egg maturation, in

which two pre-embryonic stages occur inside the female worm and then eight embryonic

stages occur after egg-laying. Stage 1 refers to early cleavages and the beginning of yolk

fusion. Stage 2 represents late cleavage, with the formation of a stereoblastula and the onset of

outer envelope differentiation. Stage 3 is defined by the elongation of the embryonic

primordium and the onset of inner envelope formation. In stage 4, the first organ primordia

arise. During stages 5-7, tissue and organ differentiation occur (neural mass, epidermis,

terebratorium, musculature, and miracidial glands). Stage 7 is characterized by nuclear

condensation of brain neurons. Stage 8 refers to the fully formed larva, presenting muscular

contraction, cilia and flame-cell beating. However, since these morphological events are

difficult to visualize in live eggs, our classification should be considered simultaneously to the

Vogel and Prata’s staging system whenever convenient. In the future, the staging system

proposed here could contribute to a better comprehension of S. mansoni egg biology, by the

generation of cell-lineage fate map and the localization of molecular components (as

granuloma-triggering antigens) during embryogenesis (“egg localizome”).


124

Acknowledgments

The authors acknowledge the staffs of the Laboratório de Patologia /IOC and of the

Laboratório de Esquistossomose/CPqRR for technical assistance, Mr. Bruno Eschenazi from

the Setor de Produção e Tratamento de Imagens/IOC for the schematic drawing of S. mansoni

embryonic development, and Dr. John R Kusel from the Glasgow University for critical

review of the manuscript. ADJ and TG received fellowhips from the Conselho Nacional de

Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) – Brazil. TAC and ACA de M received

fellowhips from the Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

– Brazil. The work was supported by Fundação Oswaldo Cruz (Fiocruz).


125

References

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Figure 1. Miracidial morphology by confocal laser scanning microscopy (CLSM). Virtual

sections in ventral view of the same whole mount miracidium stained with hydrochloric

carmine. a Panoramic view of an intermediate plane. b Detail of the anterior region, showing

the terebratorium (t) and the apical gland (ag). c Detail of the neural mass (nm) flanked by the

lateral glands (lg). d Detail of posterior region, showing three germ cells (gc). np neuropile; c

cilia. Scale bars 20 µm.

Figure 2. Intrafemale egg development. a-b Bright field micrographs of female worms. c-f

Confocal laser scanning microscope images of wholemount females (a-e) and in vitro laid egg

(f) stained with hydrochloric carmine. a Female ovary. The arrow represents the direction of

oocyte maturation. H&E-staining. b-c Detail of the ovary, showing mature oocytes (o). Note

in b the vitelline duct full of vitelline cells (vc). Giemsa-staining. In c, a mature oocyte leaves

the ovary by projecting a pseudopod (arrow). d Eggshell formation in the ootype (ot). This

zygote was surrounded by 40 vitelline cells. e Egg in the uterus. This egg has 45 vitelline

cells. f Early laid egg in culture. Notice no cleavage during intrafemale egg development.

Plasma membranes seem to disappear progressively. z zygote; ds digestive system; sr seminal

receptacle. Scale bars 50 µm.

Figure 3. Statistical analysis of egg growth. a-b Only the biological relevant relationships

were plotted, i.e., M-I:M-II, M-II:M-III, M-III:M-IV, and M-IV:M-V, where M is the

maturation stage in roman numerals (according to the Vogel and Prata’s classification). a

Simultaneous 95% confidence intervals for comparing estimated mean areas of cultivated

eggs during growth under in vitro conditions (RPMI-1640 medium). b Simultaneous 95%

confidence intervals for comparing estimated mean areas of isolated eggs during growth in the


137

murine host. The overlapping of confidence intervals with the vertical dotted line at abscissa 0

indicates no pairwise difference between maturation stages at a level of confidence set as

0.05. Positive significant mean differences are bigger than 0 for the lower intervals, while

negative significant mean differences are lower than 0 for higher intervals. See details in the

text. c Box plot of egg area in different stages of maturation (M) in regard to egg source (S).

S1 refers to eggs obtained from the host and S2 refers to eggs maintained in culture. d

Simultaneous 95% confidence intervals for comparing estimated mean areas of each matching

stages for both sources (isolated and cultivated), i.e. M-I:M-I, M-II: M-II, M-III:M-III, M-

IV:M-IV, and M-V:M-V.

Figure 4. Early stages of S. mansoni embryonic development. a, f, g, n Bright field

micrographs of whole eggs obtained from the host. a, g, n Basic fuchsine-staining. f

Unstained egg. b-e, l, m, q, r Bright field micrographs of eggs in the intestine of the host. b, l,

m, r PASH-staining. c Giemsa-staining. e Masson trichrome-staining. q PAS-AB pH 1.0. h-j,

o, p Confocal laser scanning microscope images of wholemount eggs stained with

hydrochloric carmine. Both eggs were obtained from the host. a-f Stage 1, early cleavage. a

The embryonic disc is not visible. The egg is full of yolk (yk). Note yolk nuclei. b, c, e

Embryonic cells (em) in early cleavage. The surrounding vitelline cells fuse. d Detail of the

vitelline cells stained in green. Cytoplasmic vacuoles seem to occur. e Transversal section of

the vegetal pole, showing six macromeres. f Late stage 1. The light embryonic disc (em) in the

center of the egg. Yolk is dark. g-m Stage 2, late cleavage. g The embryonic disc (em)

increases in size, occupying one-half of the diameter of the egg. h, j Virtual sections of the

same egg, showing the stereoblastula. i Detail of h (inset). A highly vacuolated vitelline cell

in degradation process. l, m The stereoblastula exhibits several mitotic figures (mi) and

pycnotic nuclei (py). A macromere detaches from the embryo and adheres to the eggshell,

giving rise to the outer envelope (oe). n-r Stage 3. n The embryonic disc (em) elongates. o, p


138

Virtual sections of the same egg reveal at least two types of cells (considering the nuclear

morphology) and the outer envelope (oe). q A marked difference on the staining pattern

between the embryonic cells and the yolk syncytium is evident. Yolk (yk) is stained with the

PAS reaction, indicating a rich neutral glycoconjugate content. r The embryo still exhibits

several mitotic figures (mi) and some pycnotic nuclei (py). At one pole some cells seems to be

compromised with the inner envelope (ie) differentiation. Scale bars 20 µm.

Figure 5. Stage 4 of S. mansoni embryonic development. a-c, j Bright field micrographs of

eggs in the intestine of the host. a-c Giemsa-staining. j Masson trichrome-staining. d-i

Confocal laser scanning microscope images of the same whole-mounted egg isolated from the

host stained with hydrochloric carmine. a, b Parasagittal sections of the embryo reveal the

differentiation of the inner envelope (ie) and at least two types of cells (tI and tII). Type II cells

are probably differentiating neuroblasts and concentrate in the interior of the embryo. In b, the

outer envelope (oe) seems to fuse with the yolk (yk). Pycnotic nuclei (py) are also visible. c

Transversal section of the embryo, showing the syncytial aspect of the inner envelope and the

localization of type-I (tI) and type-II (tII) cells. d-i Virtual sections of the same egg in ventral

view, showing the outer envelope (oe), the inner envelope (ie), cell types I and II (tI and tII),

and the onset of the neural mass formation. j Parasagittal sections of the embryo reveal the

differentiation of the neural mass primordium (nmp) with an acellular central region, called

neuropile (np). Notice the neuroblast nuclei stained in green on Masson trichrome. Scale bars

20 µm.

Figure 6. Stage 5 of S. mansoni embryonic development. a Bright field micrograph of a

whole egg obtained from the host, stained with basic fuchsine. The embryo occupies almost

the entire egg. Some yolk is located at the poles. Notice a more stained round mass in the

mid-region of the embryo. It is the neural mass primordium (nmp). b, c Bright field


139

micrographs of eggs in the intestine of the host. b Giemsa-staining. c PASH-staining. d-i

Confocal laser scanning microscope images of the same whole-mounted egg stained with

hydrochloric carmine. This egg was obtained from in vitro cultivation. b Parasagittal section

of the embryo shows the neural mass primordium (nmp) and its acellular neuropile (np), the

inner envelope (ie) and the onset of epidermis (epi) formation, by the fusion of some

peripheral cells. Type-I cells (tI) are spread mainly at the poles of the embryo. They will give

rise to the miracidial glands and to the germ cells. c Transversal section of the embryo,

detaching the neural mass primordium (nmp), its neuropile (np), and the syncytial epidermis

primordium (epi). The neuropile (np) has a slight staining in red on PASH sections. d-i

Virtual sections of the same egg in ventral view, showing the inner envelope (ie), the

epidermis (epi) primordium, yolk (yk), type-I cells (tI)), the neural mass primordium (nmp),

and its acellular neuropile (np). Scale bars 20 µm.

Figure 7. Stage 6 of S. mansoni embryonic development. a-c Bright field micrographs of eggs

in the intestine of the host. a, b PASH- staining. c Masson trichrome-staining. d-i Confocal

laser scanning microscope images of the same whole-mounted egg isolated from the host

stained with hydrochloric carmine. . a, c Parasagittal sections of the embryo reveal the

differentiation of miracidial glands and of the terebratorium (t). a Just above the neural mass

primordium (nmp) two laterally located type-I cells start to produce PAS-positive cytoplasmic

granules and will give rise to the lateral glands (lg). More anteriorly, other three type-I cells

also produce PAS-positive granules and will fuse to form the apical gland (ag). The inner

envelope (ie) is also positive to the PAS reaction. b Transversal section of three different

eggs. Notice the positive PAS-staining only in some type-I-like cells. c The epidermis (epi) is

almost fully formed, but no underlying musculature and cilia were revealed by the Masson

trichrome-staining (compare to Figs. 8b, g). d-i Virtual sections of the same egg in ventral

view, showing the inner envelope (ie), the epidermis (epi) primordium, yolk (yk), the


140

terebratorium (t), the formation of the two lateral glands (lg) and the three apical gland (ag)

nuclei, the neural mass primordium (nmp) and its acellular neuropile (np), and some germinal

cells (gc). Scale bars 20 µm.

Figure 8. Stages 7 and 8 of S. mansoni embryonic development. a-d, f, g Bright field

micrographs of eggs in the intestine of the host. a, c, d, f PASH- staining. b, g Masson

trichrome-staining. e Bright field micrographs of whole eggs obtained from the host, stained

with basic fuchsine. h-n Confocal laser scanning microscope images of the same whole-

mounted egg isolated from the host, stained with hydrochloric carmine. a, b, c Stage 7. a, b

Parasagittal sections of the embryos showing that the embryonic development is almost

complete. Notice the morphology of neuronal nuclei. They are bigger than in stage 8 and

present a lighter staining pattern. In a, the apical gland (ag) is completely fused and the lateral

glands (lg) are also formed. The basement membrane (bm) is distinguishable on PAS-stained

sections. In b, the epidermis (epi) is fully formed, presenting cilia (c). Masson trichrome-

staining reveals its underlying musculature (mu). The apical gland (ag) presents a granular

pattern of staining when compared with the lateral glands (lg). c Detail of the neural mass

primordium (nmp) from Fig. 8a. d Detail of the mature neural mass (nm) from Fig. 8f.

Compare c and d to notice the nuclear condensation of neuronal nuclei and the increase of

neuropile (np) size. The mature neural mass has smaller neuronal nuclei, with a stronger

pattern of staining. d-n Stage 8, mature egg. e In whole-stained mature egg, the neural mass

(nm), the terebratorium (t), and some germinal cells (gc) are visible under BM. f, g

Parasagittal sections of the mature larvae. In f, the PAS-positive gland contents seem to be

secreted to the interior of the egg in the murine host. In g, compare the staining pattern

between the apical gland (ag) and the lateral gland (lg) on the Masson trichrome sections.

Neuronal nuclei seem to be tightly compacted and darker than in stage 7 (compare to Fig. 8b).

h-n Virtual sections of the same egg in ventral view, showing the mature miracidium ready to


141

hatch. It is possible to distinguish the epidermal plates and their cilia (c), the inner envelope

(ie), a space between this envelope and the fully formed epidermis (epi), called Lehman

lacuna (l), the terebratorium (t), the pair of lateral glands (lg), the apical gland (ag), the

mature neural mass (nm) and its acellular neuropile (np), and the germinal cells (gc). Scale

bars 20 µm.

Figure 9. The oogram technique by brightfield and confocal microscopies. a-c Bright field

micrographs of compressed fragments of S. mansoni-infected mouse intestines (oogram

technique). a Classical oogram. Three mature eggs are shown. b, c Compressed intestinal

fragments stained with hydrochloric carmine under BM. It is difficult to identify the stages of

maturation in each egg. d, e, f Confocal laser scanning microscope images of carmine-stained

fragments of compressed intestines. d Two mature eggs (stage 8) shown in a sagittal section

and a third egg in an oblique view (nm, neural mass; np, neuropile; lg, lateral glands; gc,

germinal cells). e Stage 2 egg, with the developing embryo (em). The stereoblastula and the

yolk are visible. f Stage 3 egg, with an elongate embryo (em) and some yolk (yk). Scale bars

100 µm.

Figure 10. Comparison between the staging systems of S. mansoni egg maturation. a-e Bright

field micrographs of whole, unstained eggs isolated from the murine host, in accordance to

the Vogel and Prata’s staging system. a Stage I. b Stage II. See Fig. 4f to an egg in early stage

II. c Stage III. d Stage IV. e Stage V (mature egg). Notice the increase in embryo size in

relation to egg size itself. Scale bar 20 µm. More details in the text. f Schematic drawings of

the major events of egg embryogenesis in ventral view. Anterior is at the top and posterior at

the bottom. The number at the bottom left of each drawing indicates the embryonic stage

regarding the morphological events, as defined in the text. Tissues are shaded in different

colors as shown at the bottom right of the panel. Dotted lines indicate cell fusion. Cilia were


142

not represented. They arise in late stage 7. Drawings are not in scale. For more informations

on the morphological events during embryogenesis, see the text. The zygotic stage (also stage

0) occurs inside the female worm, from the formation of the eggshell in the ootype. Stage 1

corresponds to Vogel and Prata’s stage I. Stage 2 to Vogel and Prata’s stage II, and Stages 3

and 4 to Vogel and Prata’s stage III. Stages 5, 6, and 7 occur during Vogel and Prata’s stage

IV. Finally, the mature embryo in stage 8 corresponds to Vogel and Prata’s stage V.

Figure 11. Patterns of PAS-positive reaction during S. mansoni egg embryogenesis. a-c Light

microscope micrographs of eggs in the intestine of the host, stained by the PAS-AB method. a

Eggs in stage 1 show positive reaction only in the yolk. No positive reaction stains the embryo

(em) itself. b During the stage 4, a light positive reaction stains the inner envelope (ie). The

embryonic primordium (em) remains negative to the PAS reaction. c Mature eggs (stage 8)

are completely positive to the PAS reaction, except by the neural mass (nm) and the basement

membrane (bm), that are slightly stained. It is possible to distinguish the neuronal nuclei and

the neuropile (np) due to this negative staining.


143

Table 1. Experimental design

Stagesa total

I II III IV V So

urce

isolated 30 30 30 30 30 150

cultivated 30 30 30 30 30 150

total 60 60 60 60 60 300

aaccording to Vogel and Prata’s staging system

Table 2. Estimated mean areas (µm2) during S. mansoni egg growth in mice (isolated) and

under in vitro conditions (cultivated).

Source

Stagesa Isolated SD Cultivated SD P value

I 3812.74 243.66 3492.87 450.73 0.325

II 3974.96 406.26 3442.46 394.08 0.005b

III 4280.97 464.45 5422.56 560.71 0.0001b

IV 5003.54 870.83 5948.06 428.83 0.0001b

V 6832.23 576.61 0.999 6730.61 510.27 aaccording to Vogel and Prata’s staging system

bstatistical significance (P < 0.05)


144

Figure 1


145

Figure 2


146

Figure 3


147

Figure 4


148

Figure 5


149

Figure 6


150

Figure 7


151

Figure 8


152

Figure 9


153

Figure 10


154

Figure 11


155

Electronic Supplementary Material 1


156



157


Considerações Finais Dissertação de Mestrado

158

V- Considerações Finais


159

V – Considerações Finais

V. 1 – Discussão

Os últimos avanços na biologia dos esquistossomos foram principalmente

impulsionados pelos recentes adventos técnicos em Biologia Molecular e Bioquímica

(proteômica), o que gerou uma enorme quantidade de dados (como em Verjovski-

Almeida et al. 2003, 2004, 2007; Cass et al. 2007). Usando técnicas tradicionais

(p.ex. histologia e cultura de vermes) e microscopia óptica avançada (CLSM), essa

dissertação buscou responder uma das lacunas da biologia dos esquistossomos,

isto é, como acontece o desenvolvimento embrionário dos ovos de S. mansoni.

De fato, a biologia dos ovos vem sendo considerada apenas marginalmente,

como destacado na Fundamentação Teórica. Em geral, os ovos são tratados como

uma entidade invariável durante o tempo (desenvolvimento embrionário).

Provavelmente, tal prática é resultante da ampla presença de ovos maduros após

procedimentos de isolamento a partir de intestinos e fígados de animais infectados

(Dresden e Payne 1981) ou da dificuldade em separar grandes quantidades de ovos

em estádios distintos de amadurecimento. No entanto, em estudos moleculares,

essa generalização pode gerar resultados equivocados sobre a expressão de algum

gene ou a presença de alguma proteína, por exemplo. Nesse caso, portanto, é

necessário um esforço maior e mais refinado na obtenção e separação dos ovos, ou

ainda, o emprego de kits de extração e técnicas de ampliação de material mais

sensível e eficaz para a avaliação dos mecanismos moleculares durante a

embriogênese dos ovos de esquistossomos. É possível, ainda, que o

desenvolvimento embrionário dos ovos tenha sido superficialmente considerado até

o momento por causa de limitações técnicas impostas pela casca do ovo, ou mesmo

pela grande presença de células vitelínicas nos estádios iniciais do

desenvolvimento.

Como resultado direto do esforço para descrever o desenvolvimento

embrionário de S. mansoni, dois artigos foram elaborados e estão incluídos nos

resultados dessa dissertação (Jurberg et al. 2008a; Jurberg et al. em preparação).

Um terceiro artigo, sobre a localização de antígenos do ovo durante o seu

desenvolvimento embrionário, está em preparação. Como consequência indireta

desse trabalho (para a obtenção de miracídios), um simples aparelho de eclosão foi

manufaturado e patenteado (2007). A sua avaliação experimental como método

diagnóstico para a esquistossomose originou um artigo (Jurberg et al. 2008b).

Outro método diagnóstico também foi desenvolvido. Por ser baseado em um

princípio diferente, ele também é capaz de diagnosticar outras helmintíases além da


160

esquistossomose. Sua patente está ainda pendente. Por essa razão, a avaliação

experimental desse outro método ainda não foi publicada. Recentemente, ambos os

métodos foram também avaliados em campo. A publicação desse inquérito aguarda

o término da análise das amostras e a redação do(s) manuscrito(s).

V.1.1 – Sistemas de classificação

Tradicionalmente, os ovos de esquistossomos são classificados a partir da

relação de tamanhos entre o embrião e o ovo propriamente dito (Vogel 1942; Prata

1957). Embora útil, esse sistema de estagiamento não considera a complexidade

dos eventos morfogenéticos que ocorrem durante o amadurecimento dos ovos.

Assim, conforme descrito no segundo artigo científico dessa dissertação, critérios

morfológicos de fácil reconhecimento em cortes histológicos e em ovos inteiros

analisados sob microscopia confocal foram definidos e identificados. A partir desses

critérios, foi então proposto um novo sistema de classificação para o

desenvolvimento embrionário dos ovos de esquistossomos. Esse sistema,

entretanto, não é de todo original, tendo sido adaptado a partir de um sistema de

estagiamento inicialmente introduzido para platielmintos de vida-livre (Hartenstein

e Ehlers 2000; Younossi-Hartenstein et al. 2000; Younossi-Hartenstein e

Hartenstein 2000a, b, 2001; Ramachandra et al. 2002; Morris et al. 2004; Cardona

et al. 2005, 2006). A similaridade temporal em que eventos morfológicos homólogos

ocorrem entre os táxons de platielmintos possibilita que eles sejam comparados

filogeneticamente (ver adiante).

Todavia, os critérios morfológicos utilizados como referência não são

identificáveis em ovos vivos (como em cultura ou no caso da técnica do oograma),

ou em ovos inteiros sob microscopia de campo claro convencional. Por essa razão,

correlacionamos o sistema de estadiamento proposto com a classificação de Vogel

(1942) e de Prata (1957), conforme também exposto no segundo artigo (Jurberg et

al. em preparação). Nesse mesmo artigo, apresentamos uma adaptação do protocolo

de visualização de ovos inteiros individuais em CLSM (Jurberg et al. 2008a) para a

análise de ovos inteiros em fragmentos de intestino comprimidos, como na técnica

do oograma de Pellegrino e Faria (1965). Por exemplo, em situações de avaliações

quimioterapêuticas in vivo, a utilização em conjunto de ambas as técnicas pode

possibilitar a rápida inferência de alterações nas frequências de cada estádio de

amadurecimento (via técnica clássica de oograma) e da visualização de alterações

morfológicas nos embriões (via técnica do oograma para microscopia confocal), caso

elas de fato ocorram. Nesse caso, esse novo método necessita ser ainda melhor

avaliado. É importante ressaltar ainda que para a visualização adequada dos ovos,


161

as amostras de intestino devem ser fortemente achatadas ao serem fixadas, antes

de serem coradas. Por sua vez, em ovos individualizados, a remoção da casca (mal-

sucedida até o momento) pode facilitar o acesso ao embrião, tornando possível a

construção de mapas de linhagem celular, imunomarcações em embriões inteiros e

análises ultra-estruturais do embrião propriamente dito, por exemplo.

Como apresentado no segundo artigo, o sistema de estadiamento proposto e

a classificação introduzida por Vogel (1942) e por Prata (1957) são, de fato,

complementares. Elas devem ser utilizadas de acordo com a conveniência e o

objetivo de cada investigação. No entanto, em alguns casos (p.ex. ver Freitas et al.

2007), é importante considerar os eventos morfológicos da embriogênese do ovo,

mesmo quando em uma primeira etapa do experimento, somente o sistema de Vogel

(1942) e de Prata (1957) possa ser empregado. Por exemplo, o estádio IV de Vogel e

Prata pode ser subdividido em três momentos morfológicos distintos

(cronologicamente: formação da epiderme; diferenciação do terebratório e das

glândulas miracidianas, e; o condensamento nuclear da massa nervosa), segundo a

nossa classificação. Assim, por revelar a complexidade morfológica durante o

amadurecimento dos ovos, é possível que o sistema de estadiamento apresentado

aqui possa contribuir para uma melhor compreensão da biologia dos ovos. Em

especial, ele pode ser empregado na busca por alterações fenotípicas e na

imunolocalização (em criosecções) de antígenos do ovo durante o desenvolvimento.

V.1.2 – Desenvolvimento embrionário in vivo e in vitro

Diversos protocolos de cultura de vermes adultos e ovos estão disponíveis na

literatura (p.ex., ver Michaels e Prata 1968; Lewis 2001; Kusel et al. 2006; Freitas et

al. 2007). Esses protocolos são empregados nas mais variadas investigações, desde

a preparação de SEA e produção de anticorpos monoclonais, avaliações

quimioterapêuticas e em ensaios bioquímicos e moleculares, como por exemplo,

transfecção e inibição da expressão gênica por técnicas de RNA de interferência.

Alguns estudos avaliaram a oviposição e/ou o amadurecimento dos ovos em

diferentes condições de cultura (p.ex. Michaels e Prata 1968; Schiller et al. 1975;

Newport e Weller 1982a, b; Barth et al. 1996; El-Ridi et al. 1997). No entanto, pela

primeira vez, detalhes dos eventos morfológicos durante a embriogênese foram

revelados em ovos cultivados in vitro. Além disso, o desenvolvimento embrionário

desses ovos foi comparado com o desenvolvimento de ovos isolados a partir do

hospedeiro murino.

A dificuldade de acompanhamento dos eventos morfológicos em ovos vivos

fez necessária a utilização dos dois sistemas de estagiamento, reforçando a


162

complementaridade entre ambas as classificações. Em um primeiro momento, ovos

isolados e ovipostos em cultura foram classificados de acordo com o sistema de

Vogel (1942) e de Prata (1957) para a mensuração de seus eixos (maior

comprimento e largura) e subsequente cálculo de suas áreas. A área média de cada

estádio foi utilizada como parâmetro para comparação de crescimento, a partir de

modelagem estatística de variância por ANOVA two-way e teste Post Hoc de Tukey,

em ambiente R. Em um segundo momento, os ovos isolados e cultivados em cada

estádio do desenvolvimento foram fixados e corados para análise ao microscópio

confocal (segundo o novo sistema de classificação do desenvolvimento).

Aparentemente, a morfologia dos ovos foi bastante similar, comparando os estádios

correspondentes entre si. A avaliação conjunta desses resultados sugere que o

amadurecimento (acompanhado pelo crescimento em tamanho) dos ovos in vivo e in

vitro ocorreu a taxas desiguais, pois os padrões de desenvolvimento atingiram o

mesmo ponto: os ovos maduros em ambas as condições não exibiram diferenças

significativas entre as médias de suas áreas, os embriões maduros apresentaram as

mesmas características ao microscópio confocal e os ovos, quando colocados em

água, eclodiram e liberaram miracídios capazes de infectarem B. glabrata, com

eliminação de cercárias.

Segundo Michaels e Prata (1968), uma importante diferença morfológica nos

ovos cultivados é a ausência de sinais de morte quando comparados com ovos

obtidos a partir do hospedeiro. Recentemente, Sarvel e colaboradores (2006)

utilizaram a sonda fluorescente Hoechst 33258 para marcação dos núcleos de

células danificadas, assim diferenciando ovos mortos de ovos viáveis. Esse método,

no entanto, não foi aplicado com sucesso em conjunção com a coloração por

carmim clorídrico, mesmo alterando a ordem das etapas de coloração (dados não

mostrados). A utilização de outros corantes fluorescentes em conjunção com essa

sonda para viabilidade dos ovos precisa ainda ser avaliada. Para contornar essa

limitação, uma grande quantidade de ovos foi analisada, além dos ovos com sinais

evidentes de morte não terem sido avaliados. Assim, a cultura de ovos sob as

condições empregadas pode ser valiosa para estudos morfológicos da embriogênese,

como a determinação de mapas de destino. Todavia, em estudos moleculares e

bioquímicos, cuidados especiais devem ser considerados na interpretação dos

dados, como destacado por Gobert e colaboradores (2007) para esquistossômulos.


163

V.1.3 – Desenvolvimento embrionário e filogenia

“A evolução da forma ocorre por meio de alterações no desenvolvimento

embrionário” sintetizou Carrol (2006). Como visto na fundamentação teórica dessa

dissertação, as relações filogenéticas dos diversos táxons de platielmintos têm

certas incompatibilidades, com a persistência de alguns grupos parafiléticos. Uma

suposta relação filogenética entre os diferentes táxons de platielmintos,

considerando os vermes Acoela e Nemertodermatida como grupo externo aos

Platyhelminthes stricto sensu, foi sumariada na Fig. 1.14. No grupo parafilético

basal “Archoophora” são reunidos, por conveniência, aqueles que possuem ovos

endolécitos, ricos em vitelo. Anteriormente incluídos entre os platielmintos

arcoóforos, os Acoela apresentam um padrão único de desenvolvimento com

clivagem espiral em dueto, pouco parecido com outros espiralianos (p.ex. policlados)

(Henry et al. 2000). Nenhuma informação foi encontrada sobre a embriogênese dos

Nemertodermatida. É possível que ambos os grupos possuam características

embrionárias consideradas basais entre os platielmintos verdadeiros.

Por sua vez, o grupo dos platielmintos verdadeiros pode ser subdividido em

dois grandes ramos. Em um deles, representado pelos Catenulida, não foram

encontradas informações sobre a sua embriogênese. Contudo, sabe-se que eles se

reproduzem assexuadamente por fissão transversal, formando cadeias de zoóides

(Hyman 1951; ver também Egger et al. 2007). Já o táxon monofilético

Rhabditophora reúne os Macrostomorpha e os Trepaxonemata. Dentro dos

Macrostomorpha, encontram-se os Haplopharyngida e Macrostomida; porém, não

foram encontradas informações sobre o desenvolvimento embrionário dos

Haplopharyngida. Os macrostomídeos apresentam uma modificação do padrão de

clivagem observado nos vermes acoelos, i.e., ao invés de duetos de células, são

formados quartetos. Neles, os micrômeros não são tão menores do que os

macrômeros. A estereoblástula resultante é cercada por uma camada vitelínica

externa transitória (membrana externa, do inglês hull membrane), a partir da

diferenciação de grandes células vegetais periféricas (Seilern-Aspang 1957; Tyler

1981; Morris et al. 2004). A gastrulação nesse grupo também difere

significantemente do modo espiraliano típico, que é preservado em outros

arcoóforos. Como a formação do manto vitelínico externo, a gastrulação se

assemelha aos estádios iniciais do desenvolvimento de neoóforos (Bresslau 1904;

Hartenstein e Ehlers 2000; Morris et al. 2004). Assim, após a formação do manto

vitelínico, as células no interior do embrião estabelecem um primórdio digestório

rico em vitelo, formado por células grandes localizadas mais centralmente, e um

primórdio somático, que consiste de células menores localizadas anteriormente.


164

Gradualmente, essas células expandem-se posteriormente para formar massas

celulares mesenquimais achatadas, em cada lado do primórdio intestinal. Somente

durante os estádios tardios da embriogênese, bem após o início da diferenciação

celular, que o primórdio somático expande dorsalmente e ventralmente para

encerrar o primórdio intestinal (Morris et al. 2004).

Os Trepaxonemata ramificam-se ainda em duas linhagens, os Polycladida

basais e os Neoophora. Uma diferença é marcante no modo de formação da parede

corporal entre macrostomídeos e policlados (e outros espiralianos): nos policlados,

as células da membrana externa (do inglês, hull cells) não estão presentes. O

primórdio definitivo da epiderme é formado por micrômeros animais em um estádio

inicial durante a gastrulação, que por movimentos epibólicos alongam-se sobre as

grandes células ricas em vitelo no pólo vegetal (Surface 1907; Boyer et al. 1996,

1998; Younossi-Hartenstein e Hartenstein 2000b; Morris et al. 2004).

Os platielmintos neoóforos são agrupados juntos por possuírem ovos

ectolécitos, com células acessórias individualizadas (células vitelínicas), e se

ramificam também em duas linhagens: uma parafilética, chamada

“Lecithoepitheliata”, e outra monofilética, chamada Eulecithophora. Os

“Lecithoepitheliata” reúnem cerca de 30 espécies, por dividirem uma condição

intermediária entre ovos endolécitos e ectolécitos (Brusca e Brusca 2003). Poucas

informações sobre a embriogênese desse grupo estão disponíveis. Por epibolia, um

quarteto de micrômeros alonga-se sobre os macrômeros, formando uma membrana

externa transitória (hull membrane) que circunda parte do vitelo em uma cavidade

corporal embrionária primária. Outros micrômeros reconstituem o ectoderma

embrionário propriamente dito, definindo a superfície ventral do embrião. Esse

ectoderma se expande gradualmente, envolvendo todo o embrião e o vitelo

posicionado logo abaixo da membrana externa (Reisinger et al. apud Hartenstein e

Ehlers 2000).

Os eulecitoforados agrupam os clados Prolecithophora, Rhabdocoela e

“Seriata”. Não foram encontradas informações sobre a embriogênese dos

prolecitóforos. O grupo parafilético “Seriata” possui uma grande capacidade

regenerativa, utilizada como estratégia de reprodução assexuada. Ele reúne os

Proseriata, os Bothrioplanida e os Tricladida. Dentre os “Seriata”, os tricladidos têm

recebido especial atenção. Eles compartilham diversas características com outros

neoóforos, mas são únicos em alguns aspectos. Os embriões não apresentam o

padrão regular de clivagem em espiral e formam uma massa irregular de

blastômeros praticamente iguais, que fica localizada no centro do vitelo. No

primórdio embrionário, os órgãos se diferenciam sem a ocorrência de gastrulação e


165

a formação evidente de camadas germinativas. Os blastômeros são altamente

móveis e deslocam-se ao redor do vitelo (fenômeno conhecido por “anarquia dos

blastômeros”). A faringe embrionária diferencia-se bombeando vitelo para o

embrião, dando origem à cavidade digestória. Durante esse processo, o primórdio

embrionário é deslocado para a periferia do ovo. Por essa razão, uma delgada

camada celular (banda germinativa) ao redor da cavidade digestória é formada. Ao

contrário da organogênese de outros platielmintos, a dispersão do primórdio

embrionário em estádios iniciais do desenvolvimento causa a formação irregular de

camadas de células. Os diversos tipos de precursores ficam misturados e somente

consolidam os primórdios de órgãos e dão forma ao embrião relativamente tarde

durante o desenvolvimento.

Os rabdocelos representam seis sub-clados, alguns parafiléticos

(“Dalyellioida”, Endoaxonemata, Kalyptorhynchia, “Typhloplanoida”,

Temnocephalida e Revertospermata). A espécie tifloplanóide Mesostoma lingua, por

exemplo, parece também não seguir o padrão típico de clivagem em espiral, mas

investigações adicionais são ainda necessárias (Hartenstein e Ehlers 2000). Nessa

espécie, a membrana externa transitória (hull membrane) é formada exclusivamente

por células vitelínicas, ao invés de blastômeros. Desde o início, a membrana externa

circunda o vitelo inteiramente, de modo que a formação de uma faringe embrionária

não é necessária. Não parece ocorrer gastrulação (considerando como o

estabelecimento de camadas germinativas antes do aparecimento dos primórdios de

órgãos). Os órgãos surgem a partir de agrupamentos homogêneos maciços de

células mesenquimais. Investigações sobre genes homólogos desse grupo, que

sabidamente são responsáveis pela especificação das camadas germinativas em

outros animais, ainda precisam ser realizadas (para mais detalhes, ver Hartenstein

e Ehlers 2000).

Entre os Revertospermata estão reunidos os Fecampiida e os Mediofusata.

Os Mediofusata abrangem as famílias Urastomidae, Genostomatidae e o grupo

parasita Neodermata, que inclui as tradicionais classes Trematoda, Cestoda e

Monogenea. Dentro dos trematódeos, como visto na Fundamentação Teórica,

encontra-se a espécie estudada nessa dissertação. Nossos resultados sugerem que

o desenvolvimento do ovo de S. mansoni ocorre, aparentemente, de modo similar ao

padrão rabdocelo descrito na espécie M. lingua, no qual a gastrulação parece não

ocorrer (ver Hartenstein e Ehlers 2000). Grupamentos de células mesenquimais

também parecem originar os primórdios de órgãos. Entretanto, ao contrário dos

rabdocelos, o embrião de esquistossomo não forma faringe e intestino durante o seu

desenvolvimento no ovo. Provavelmente, a ausência dessas estruturas está


166

associada com hábito parasita. Esses órgãos somente surgem durante a

transformação miracídio-esporocisto-cercária no interior do hospedeiro

intermediário (Pan 1996).

Outro evento similar entre esquistossomos e rabdocelos é a formação dos

envoltórios embrionários, que podem ser derivados da membrana externa (huell

membrane) dos turbelários. Por exemplo, no Mesostoma, essa membrana transitória

surge a partir de células vitelínicas que circundam o embrião ventralmente e

desaparecem progressivamente em torno do estádio 6 (Hartenstein e Ehlers 2000).

Contudo, como em outros platielmintos parasitas (p.ex. cestódeos), os

esquistossomos têm dois envoltórios, que podem ser uma adaptação ao

parasitismo. Tais envoltórios protegem o embrião em desenvolvimento e o miracídio

completamente formado, atuam como compartimentos de produção e

armazenamento de nutrientes, secretam materiais imunogênicos que podem atuar

na expulsão dos ovos para o lúmen intestinal e propiciam espaço para os

movimentos miracidianos antes da eclosão (Neill et al. 1988; Swiderski 1994;

Ashton et al. 2001; ver também Conn e Swiderski 2008). No S. mansoni, ambos os

envoltórios são celulares em origem, sincicial em natureza e circundam o embrião

(Swiderski 1994). Todavia, o envoltório externo tem origem mista (a partir de

macrômeros e células vitelínicas) e desaparece gradualmente tal qual a membrana

externa (huell membrane), enquanto o envoltório interno origina-se a partir de

mesômeros e persiste até a eclosão do ovo (Swiderski 1994).

Como exposto por Hartenstein e Ehlers (2000) para a espécie M. lingua,

investigações adicionais sobre os destinos celulares durante o desenvolvimento

(mapa de destino) e a presença de genes homólogos e suas localizações nos tecidos

do embrião em desenvolvimento precisam ser realizados para esclarecer alguns dos

eventos morfológicos observados nesse trabalho e acrescentar novas informações à

filogenia dos platielmintos em geral e à biologia dos ovos de esquistossomo. Se, de

fato, “a evolução da forma ocorre por meio de alterações no desenvolvimento

embrionário” (Carrol 2006), resta determinar quais alterações no desenvolvimento

embrionário dos platielmintos de vida-livre deu origem ao hábito parasita e definiu

a evolução dos esquistossomos.

V.1.4 – Desenvolvimento embrionário e granulomatogênese

Por si só, os ovos de S. mansoni têm destacada importância na infecção

esquistossomótica. Aqueles que não conseguem atingir o lúmen intestinal podem

causar reações inflamatórias focais (granulomas), que comprometem o

funcionamento regular de diversos órgãos, em especial, o fígado. Em casos mais


167

graves, a infecção pode evoluir até o óbito. Como mencionado na Fundamentação

Teórica, entretanto, a formação de granulomas não ocorre ao redor de ovos

imaturos isolados (Prata 1957), mas é estreitamente dependente de ovos maduros

viáveis (Sorour 1929; Espin 1941).

Ao contrário do que era tradicionalmente considerado (Asahi et al. 1999;

Stadecker et al. 2001), os antígenos secretados pelos ovos maduros totalizam 188

proteínas (Cass et al. 2007). Utilizando soro de coelho previamente imunizado

contra as proteínas totais secretadas pelo ovo (ESP), Ashton e colaboradores (2001)

relataram que essas proteínas encontravam-se presentes predominantemente no

envoltório interno do ovo maduro (envoltório de von Lichtenberg); em ovos maduros,

tal estrutura possui retículo endoplasmático rugoso desenvolvido e grandes

agregados de material granular (Ashton et al. 2001). Com isso, eles sugeriram que

esse envoltório seria a fonte principal de secreções do ovo. Anticorpos monoclonais

anti-LacdiNAc (GalNAcβ1-4GlcNAc) e anti-IPSE/alfa-1 também localizaram seus

respectivos epítopos nessa mesma região (van Remoortere et al. 2000; van den Berg

et al. 2004; Schramm et al. 2006). Mais tarde, van de Vijver e colaboradores (2006)

atribuíram atividade granulomatogênica às glicoproteínas com unidades terminais

LacNAc (Galβ1-4GlcNAc, como na asialofetuina) ou LacdiNAc (GalNAcβ1-4GlcNAc).

Convencionalmente, as glicoproteínas podem ser demonstradas por técnicas

de coloração seletivas. Glicoconjugados neutros são revelados pela reação do ácido

periódico de Schiff (PAS), enquanto a diferenciação entre glicoconjugados ácidos

sulfatados e carboxilados pode ser realizada por modificações do método do azul de

Alciano (AB), apenas variando o pH das soluções (Kierman 1990). A utilização

dessas técnicas possibilitou avaliar a presença e localização de glicoproteínas

durante a embriogênese dos ovos. No entanto, ensaios histoquímicos com lectinas e

imuno-histoquímicos com anticorpos monoclonais contra os recentes descobertos

antígenos secretados do ovo (Cass et al. 2007) necessitam ainda serem realizados

para avaliar especificamente suas respectivas produções, localizações e dispersões

para o ambiente periovular durante a embriogênese dos ovos (localizoma).

Nossos resultados apontaram que a diferenciação do envoltório interno do

ovo, durante os estádios 3 e 4, é acompanhada por um aumento gradual de

positividade à reação ao PAS. O mesmo é observado em secções coradas pelas

técnicas de PAS-AB. Todavia, a produção de glicoconjugados neutros não é

exclusiva desse envoltório. No estádio 6, as células precursoras das glândulas

miracidianas passam a apresentar grânulos citoplasmáticos fortemente positivos ao

PAS. Mais tarde, com o embrião maduro, os conteúdos glandulares parecem ser

secretados para o interior dos ovos. Em secções coradas ao PAS-AB, as


168

glicoproteínas neutras ocupavam praticamente a totalidade dos embriões em

estádios mais tardios. Glicoconjugados ácidos não foram detectados pela coloração

ao AB durante toda a embriogênese. É possível que o material glandular também

contribua para a formação de granulomas. Nesse caso, o conteúdo glandular

liberado para o interior do ovo maduro (estádio 8) pode difundir através dos

envoltórios do ovo e alcançar o meio circundante. Nesse cenário, além do envoltório

interno produzir componentes imunogênicos, ele poderia atuar também como uma

barreira de liberação lenta dos antígenos para o ambiente periovular, como

postulado anteriormente por Ashton e colaboradores (2001). A diferenciação tardia

das glândulas miracidianas também suporta esse cenário. No entanto, o papel das

glândulas miracidianas na granulomatogênese ainda precisa ser melhor avaliado. O

ensaio de Ashton e colaboradores (2001) com imunomarcação anti-ESP em

microscopia de fluorescência convencional não deixa claro se outras estruturas do

ovo maduro estavam positivas.

Utilizando o mesmo modelo animal empregado nesse trabalho (camundongos

Swiss Webster), Romanha (2007) demonstrou que a oviposição tem início aos 30

dias após a infecção (p.i.) (ver também Brener 1956; Lenzi JA 1998; Lenzi et al.

2008a). Como inferido nessa dissertação, os ovos são liberados na vasculatura do

hospedeiro ainda sem terem sofrido qualquer clivagem. Nesse ambiente, os ovos

causam uma resposta celular inicial (RI, reação inicial), que persiste

preponderantemente no fígado pelos próximos cinco a sete dias de infecção (35-37

dias p.i.) (Romanha 2007). O mecanismo de sensibilização do hospedeiro para essa

reação ainda é desconhecido. Todavia, a RI parece estar relacionada com o

amadurecimento dos ovos, que também tem aproximadamente a mesma duração

(Prata 1957; Pellegrino et al. 1962; Michaels e Prata 1968; Romanha 2007). Em

seguida, com os ovos maduros, a RI é substituída pelo estádio exsudativo (E), ainda

pré-granulomatoso. O estádio granulomatoso tem início a partir do 38° dia de

infecção, quando os granulomas hepáticos podem apresentar-se no estádio

exsudativo-produtivo (EP) inicial, com a presença de células fibroblastóides

dispersas (ver também Lenzi JA 1998; Lenzi et al. 1998; Romanha 2007). Um pouco

mais tarde, com 45 dias p.i., os granulomas mais velhos estão no estádio EP

maduro, com a definição de três zonas (central, paracentral e periférica) bem

delimitadas. Até esse momento, 15 dias se passaram desde a chegada dos primeiros

ovos ao fígado. Granulomas em outros estádios mais recentes de desenvolvimento

podem ser encontrados, devido à liberação contínua de ovos pelas fêmeas adultas.

Em seguida, os granulomas mais velhos evoluem para o estádio produtivo (P),

exibindo arranjo concêntrico compacto das fibras colagênicas na zona paracentral.


169

No hospedeiro, os ovos permanecem viáveis por cerca de 18-28 dias a partir da sua

oviposição (Prata 1957; Lenzi JA 1998). Com a morte do miracídio no interior do

ovo, o estímulo antigênico é interrompido, dando início a processos involutivos

(Lenzi et al. 1998; Lenzi et al. 2006; Romanha 2007).

O papel do amadurecimento dos ovos na formação dos granulomas parece

estar bem definido. Todavia, como mencionado anteriormente, a participação das

glândulas miracidianas ainda precisa ser melhor avaliada. De fato, os mecanismos

de interação ovo-granuloma ainda precisam ser melhor compreendidos através da

realização de novos estudos histoquímicos e imuno-histoquímicos. Para isso, é

preciso determinar o momento preciso e a localização para cada uma das 188

proteínas secretadas pelo ovo, bem como a sua difusão ao redor dos ovos e a

resposta imunológica, que é gerada em diferentes linhagens organismos

hospedeiros. No momento, uma meta-análise da literatura disponível revela que

apenas pouquíssimos antígenos do ovo foram localizados por anticorpos

monoclonais, em trabalhos que investigaram apenas ovos maduros (Jurberg et al.

em preparação). Estudos por microscopia eletrônica de transmissão podem ainda

revelar detalhes adicionais sobre a organogênese do miracídio e essa relação.

Todavia, a casca do ovo como barreira à impregnação de resinas é uma limitação

que precisa ser superada.


170

V. 2 – Conclusões e Perspectivas

1. O desenvolvimento embrionário dos ovos de esquistossomosos é mais complexo

do que considerado previamente por outros autores. Essa dissertação descreveu,

pela primeira vez, a sequência de eventos morfológicos até a completa formação do

miracídio.

2. As fêmeas de esquistossomosos possuem modo de desenvolvimento neoóforo,

com a participação de um órgão especializado (glândulas vitelínicas) na produção de

células vitelínicas. Essas células circundam o zigoto como uma camada celular

separada. Na literatura, o número de células vitelínicas no ovo recém-formado não é

preciso. Nossos resultados preliminares apontam para cerca de 40-45 células

vitelínicas por ovo.

3. Uma extensa análise de um amplo número de ovos tornou possível a construção

de uma sequência plausível dos eventos da embriogênese de S. mansoni;

4. O tratamento com hidróxido de potássio para a remoção da autofluorescência da

casca mostrou resultados insatisfatórios para o estudo morfológico do

desenvolvimento embrionário de S. mansoni e E. paraensei por CLSM. No entanto, a

microscopia confocal em conjução com a técnica do carmim clorídrico possibilitou a

visualização tridimensional em grandes detalhes da anatomia interna dos ovos

durante o seu desenvolvimento;

5. A partir de critérios morfológicos, o desenvolvimento dos ovos pode ser dividido

em dez estádios. De fato, os dois primeiros estádios são pré-embrionários e ocorrem

no interior da fêmea, enquanto os outros oito estádios ocorrem no hospedeiro (ou

em cultura). Resumidamente, o estádio pré-zigótico refere-se à liberação do oócito

maduro pelo ovário da fêmea; o estádio zigótico (também estádio 0) compreende a

fecundação a até a primeira clivagem. Os estádios subsequentes acontecem no

exterior. No estádio 1, ocorrem as clivagens iniciais. O estádio 2 refere-se às

clivagens tardias, com a formação de uma estereoblástula. No estádio 3, há o

alongamento e a diversificação do primórdio embrionário. No estádio 4, ocorre a

diferenciação de alguns primórdios (p.ex. massa nervosa). O estádio 5 é

caracterizado pelo início da formação de órgãos e tecidos (p.ex. epiderme). No

estádio 6, as glândulas miracidianas começam se diferenciar. No estádio 7, ocorre o

condensamento nuclear dos neurônios da massa nervosa e a diferenciação do


171

terebratório. O estádio 8 refere-se à larva completamente formada, logo antes de

eclodir;

6. A dificuldade de visualização desses critérios morfológicos em ovos inteiros não-

corados tornou necessária a correlação dos eventos observados com o sistema de

Vogel (1942) e de Prata (1957) (em algarismos romanos). Tais autores não

classificaram o desenvolvimento no interior das fêmeas, que dividimos em dois

momentos: antes da fecundação (estádio pré-zigótico) e formação do zigoto até a

primeira divisão celular (estádio zigótico ou estádio 0). As clivagens iniciais

correspondem ao primero estádio de ambos os sistemas de classificação (o embrião

é muito pequeno para ser visível sob microscopia de campo claro). O mesmo é

verdadeiro para o estádio subsequente. No nosso estádio 2, as clivagens tardias dão

origem a uma estereoblástula, que se posiciona no centro do ovo, como no estádio II

de Vogel e de Prata. O estádio III de Vogel e de Prata (embrião ocupa dois terços do

comprimento do ovo) pode ser dividido em dois momentos: nosso estádio 3 refere-se

ao início da citodiferenciação, enquanto o nosso estádio 4 refere-se ao surgimento

dos primeiros primórdios de órgãos. O estádio IV de Vogel e de Prata (aumento do

embrião, que ocupa quase todo interior do ovo) compreende os principais estádios

da organogênese: o nosso estádio 5 refere-se ao início da formação da epiderme; no

estádio 6 ocorre a diferenciação do terebratório e das glândulas miracidianas, e; no

estádio 7, a massa nervosa sofre condensamento nuclear. O último estádio para

ambos os sistemas de estadiamento (estádio V de Vogel e de Prata e estádio 8)

refere-se ao mirácidio completamente formado, antes de eclodir. Ambos os sistemas

de estadiamento são, portanto, complementares. Sempre que pertinente, eles

podem ser utizados em conjunto, a depender da conveniência e objetivos do estudo;

7. Apesar dos esforços empregados durante a realização desse trabalho

(tratamentos químicos, físicos e enzimáticos), a casca do ovo permanece como uma

limitação técnica à impregnação por resinas, à realização de imunomarcações e a

uma melhor visualização do embrião em preparados inteiros. Novas tentativas para

a sua remoção devem ser realizadas;

8. As técnicas de visualização de ovos inteiros (em ovos isolados e no oograma)

apresentadas nessa dissertação parecem promissoras na busca de alterações

fenotípicas durante a embriogênese em avaliações in situ e in vitro de drogas

esquistossomicidas, bem como em estudos moleculares pela técnica de RNA de

interferência. É possível que a remoção da casca melhore a visualização do embrião,


172

o que provavelmente facilitaria a construção de mapas de destino celular e outros

estudos;

9. A comparação estatística da área média dos ovos durante seu desenvolvimento in

vitro e in vivo indica que a idade dos ovos e o ambiente no qual eles se desenvolvem

interagem para determinar seus tamanhos durante o amadurecimento. As

diferenças significativas observadas na área média estimada para essas duas

condições sugerem que o amadurecimento dos ovos ocorre a taxas desiguais, já que

a morfologia entre os estádios correspondentes pareceu similar. Ovos mantidos em

cultura (RPMI-1640) atigiram a maturidade e liberaram larvas viáveis, que

infectaram caramujos B. glabrata;

10. Quando comparado com os ovos no hospedeiro, a ausência de sinais de morte

(recente) em ovos mantidos em cultura dificulta a precisa avaliação do

desenvolvimento embrionário nessas condições. O emprego da sonda fluorescente

Hoechst 33258 para diferenciar ovos mortos não foi satisfatório quando em

conjunto com a técnica do carmim clorídrico;

11. A fusão celular é um evento-chave durante a embriogênese dos ovos de S.

mansoni. Eventos de fusão celular ocorrem na formação dos envoltórios da casca,

na diferenciação da epiderme e da glândula apical. O(s) mecanismo(s) de fusão, no

entanto, permane(m) desconhecido(s) para S. mansoni;

12. Sinais de apoptose (núcleo picnótico) foram identificados durante a clivagem

tardia, o estádio de blástula e a organogênese inicial. Estudos adicionais devem ser

realizados para avaliar seu papel na homeostasia tecidual durante a formação e

rearranjo de tecidos;

13. Tradicionalmente, a formação de granulomas está associada à presença de ovos

maduros viáveis. Os ovos liberam para o meio circundante glicoproteínas

imunogênicas ao hospedeiro. Previamente, tais proteínas foram localizadas no

envoltório interno do ovo (envoltório de von Lichtenberg). Nossos resultados

apontaram para uma marcada mudança no perfil de reação ao PAS (que evidencia

glicoproteínas neutras) durante o desenvolvimento dos ovos. A partir do estádio 4,

o envoltório interno em diferenciação passou a apresentar gradual reação positiva

ao PAS. Isso corrobora a literatura disponível, que atribuí a essa estrutura um


173

importante papel na produção e liberação de antígenos do ovo para o meio

periovular.

14. Em seguida, a diferenciação das glândulas miracidianas (a partir do estádio 6)

também foi acompanhada por uma grande produção citoplasmática de

glicoproteínas neutras grânulares (positivas à reação de PAS). Em ovos maduros,

tais conteúdos glandulares foram secretados para o interior do ovo. É possível,

portanto, que o material glandular também contribua para a formação de

granulomas. Como proposto anteriormente, além de seu papel na produção

antigênica, o envoltório interno pode também atuar com uma barreira de lenta e

gradual liberação antigênica. Nesse caso, a diferenciação das glândulas

miracidianas reforçaria o cenário de granulomatogênese apenas ao redor de ovos

maduros, visto que a produção de glicoproteínas somente tem início tardiamente

durante o desenvolvimento. Os ovos maduros apresentaram-se fortemente positivos

à reação de PAS. Estudos imunoistoquímicos e histoquímicos (lectinas) devem ser

realizados para avaliar o papel da diferenciação glandular durante a

granulomatogênese;

15. Filogeneticamente, o desenvolvimento dos ovos de S. mansoni apresentou-se

bem similar ao padrão rabdocelo. Isso reforça a posição filogenética atual desses

dois grupos. Por sua vez, as diferenças morfológicas observadas na embriogênese de

S. mansoni podem estar associadas à aquisição do hábito de vida parasitário;

16. Os miracídios de S. mansoni parecem possuir uma “variação” das células

totipotentes (neoblastos) de outros platielmintos (p.ex. planárias). Essas células

(células germinativas) darão origem aos esporocistos durante a infecção do

hospedeiro invertebrado. As células germinativas apresentam características

histológicas e ultraestruturais de células imaturas (blastômeros) e são de difícil

identificação durante os estádios iniciais da embriogênese (por se assemelharem

aos blastômeros). É possível, portanto, que as células germinativas sejam células

embrionárias que não sofreram diferenciação durante o desenvolvimento, mantendo

suas características totipotentes. No entanto, o papel das células germinativas na

regeneração de partes do miracídio é desconhecido;

17. O postulado de que a sequência temporal em que eventos morfogenéticos

homólogos ocorrem e a estrutura espacial em que eles se desdobram é


174

suficientemente similar entre alguns táxons de platielmintos mostrou-se válida

também para S. mansoni, mas com algumas adaptações;

18. O sistema de estadiamento introduzido por Hartenstein e Ehlers (2000) revelou-

se de grande valor para detalhar e classificar o desenvolvimento da embriogênese do

ovo de esquistossomos. Entretanto, investigações ultraestruturais necessitam ainda

serem realizadas;

19. Acreditamos que o sistema de estagiamento descrito nessa dissertação

contribuirá significativamente para uma melhor compreensão da biologia dos ovos

de esquistossomos, especialmente na determinação (por imuno-histoquímica)

espaço-temporal da produção e liberação de antígenos do ovo;

20. Estudos adicionais com imunomarcadores (de preferência, anticorpos

monoclonais) são necessários para uma completa discriminação e definição da

morfogênese de cada órgão da larva (miracídio).

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