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Desenvolvimento de
Medicamentos Oncológicos
Aspectos Gerais dos Estudos Não-Clínicos in
vitro e in vivo de Eficiência e Segurança
Programação
• Introdução
• Modelos in vitro
• Modelos in vivo
Introdução
Desenvolvimento de Medicamentos Oncológicos - Aspectos
Gerais dos Estudos Não-Clínicos in vitro e in vivo de Eficiência
e Segurança
O que é o Câncer?
www.inca.gov.br
+ de 100 tipos diferentes de doenças com características comuns de crescimento desordenado de
células, invasão de tecidos e órgãos adjacentes, podendo ou não atingir outras regiões do corpo.
Tumor
(Hiperplasia)
Tumor Invasivo
(Câncer)
Homeostase
Célula
Normal
Diferenciação
Melino, Nature 412: 23, 2001.
Célula
Normal
Célula com acúmulo de erros
Mitoses sucessivas
Ativação de
Processos de
Morte Celular
Programada
Anoikes;
Apoptose
intrínseca ou
extrínseca;
Autofagia;
Catástrofe mitótica;
Necroptose;
Entre outras.
Homeostase
Melino, Nature 412: 23, 2001; Kroemer et al., Cell Death and Differentiation 16: 3-11, 2009; Galluzzi et al., Cell Death and Differentiation 19: 107-120, 2012.
Mehta et al. Pharm Res 27: 950–961, 2010; Barcellos-Hoff et al. Nature Reviews Cancer 13: 511–518, 2013; Kotecha et al., Oncotarget 7 (32): 52517–52529, 2016.
Carcinogênese
Tecido
normal
Iniciação
Construção
Promoção
Expansão
Progressão
Maturação
Câncer e o
microambiente
tumoral Carcinógenos;
Predisposição
genética
Hanahan & Weinberg. Cell 144, 646, 2011.
Principais
Características
(“Hallmarks”)
do Câncer
Proliferação
autossustentada
Evasão dos supressores
de crescimento
Evitar destruição pelo
sistema imune
Imortalidade replicativa
Microambiente
inflamatório
Mecanismos de invasão
e metástase Indução de angiogênese
Instabilidade genômica
e mutações
Resistência à morte
celular
Desregulação do
metabolismo celular
Hartung, T.; Daston, G. Toxicological Sciences 111(2): 233–237, 2009.
Como avaliar o potencial antitumoral de uma
substância?
Fase Pré-clínica
Modelos in vitro
Reações químicas,
Cultura de células e microrganimos;
Modelos in vivo
Fase Clínica
Fases I, II, III e IV
Fases
Métodos in vitro
Desenvolvimento de Medicamentos Oncológicos - Aspectos
Gerais dos Estudos Não-Clínicos in vitro e in vivo de Eficiência
e Segurança
Amostra
+
Reagente Condições de
Reação
(tempo,
Temperatura,
agitação)
Análise do Resultado:
* UV/Vis;
* fluorescência;
* luminescência.
Avaliação de (principalmente):
atividade antioxidante (Apak et al., J. Agric. Food Chem. 2016, 64: 997−1027, 1028−1045 e
1046−1070.)
ação sobre enzimas (Bisswanger, Perspectives in Science 2014, 1: 41–55.)
Métodos in vitro - Reações Químicas
DPPH NN
NO2
NO2O2N
a) Amostra
b) Amostra + Reagente
1. Desenvolvimento
da CCD
2. Nebulização com
Revelador
Métodos associados a Cromatografia:
Exemplo – Teste de DPPH
Métodos in vitro - Reações Químicas
Vantagens:
* Simplicidade e robustez ;
* Baixo custo relativo;
* Reprodutibilidade;
* Permite automação do processo.
Limitações:
* Limite de detecção;
* Substâncias interferentes;
* O reagente é biologicamente relevante?;
* Sistema homogêneo;
* Lipofilicidade/Hidrofilicidade.
Prior et al, Journal of Agricultural and Food Chemistry 53: 4290-4302, 2005.
Reações Químicas
Células primárias e finitas;
Células imortalizadas;
Alteração espontânea
Alteração induzida: Agentes químicos ou biológicos (vírus).
Células tumorais.
UACC 62 (melanoma)
VERO
(célula epitelial - rim)
Freshney, R. I. Culture of animal cells : a manual of basic technique and specialized applications. 6th ed., Hoboken, New Jersey: John Wiley & Sons (2010).
Métodos in vitro - Cultura de Células
Congelamento
Descongelamento
Experimento
Cultivo
Métodos in vitro - Cultura de Células
Freshney, R. I. Culture of animal cells : a manual of basic technique and specialized applications. 6th ed., Hoboken, New Jersey: John Wiley & Sons (2010).
Etapas:
1. Escolha da Linhagem Celular
2. Tempo de Exposição
Realização da Curva de Crescimento Celular
Determinar qual a densidade de inoculação necessária para que
durante o experimento as células estejam em fase de
crescimento adequada.
Métodos in vitro - Cultura de Células
Freshney, R. I. Culture of animal cells : a manual of basic technique and specialized applications. 6th ed., Hoboken, New Jersey: John Wiley & Sons (2010).
Curva de Crescimento
HT29 (cólon)
Densidades:
1 x 103 cel/compartimento
2 x 103 cel/compartimento
3 x 103 cel/compartimento
4 x 103 cel/compartimento
5 x 103 cel/compartimento
Métodos in vitro - Cultura de Células
Etapas:
1. Escolha da Linhagem Celular
2. Tempo de Exposição
3. Preparo prévio das células e do material
Expandir a linhagem para preparação do inóculo;
Cultura de células: preparo das placas com as células 24h antes da aplicação das
amostras.
Métodos in vitro - Cultura de Células
1. Escolha da Linhagem Celular
2. Tempo de Exposição
3. Preparo prévio das células e do material
4. Diluição da amostra
Uso de agente dispersor:
DMSO, Etanol, misturas de solventes.
Métodos in vitro - Cultura de Células
Etapas:
Les
Lab
ora
toir
es S
ervie
r
1. Escolha da Linhagem Celular
2. Tempo de Exposição
3. Preparo prévio das células e do material
4. Diluição e Inter valo de concentração da amostra
Uso de agente dispersor :
DMSO, Etanol , misturas de solventes.
Cuidado com a escolha da faixa de concentração.
Produção de artefatos (p. ex.: H2O2);
Pressão Osmótica.
Métodos in vitro - Cultura de Células
Etapas:
Cuidado com escolha das concentrações!
Á c i d o Ro s ma r í n i co
C o n c . = 1 mM ≈ 3 6 0 µ g / m L
3 7°C , 5 % C O 2
Long et al. Archives of Biochemistry and Biophysics 501: 162-169, 2010.
Métodos in vitro - Cultura de Células
1. Escolha da Linhagem Celular
2. Tempo de Exposição
3. Preparo prévio das células e do material
4. Diluição e Inter valo de concentração da amostra
5. Desenho Experimental :
Les
Lab
ora
toir
es S
ervie
r
Métodos in vitro - Cultura de Células
Etapas:
Material de
Estudo
Células
Intactas
Meio de
cultura
Técnica Microscopia
Citometria de Fluxo
Outras Técnicas
(Espectrofotometria, LC, CG, EM, Eletroforese, PCR)
Galluzzi et al., Cell Death and Differentiation 16: 1093-1107, 2009.
Células
Lisadas
Métodos in vitro - Cultura de Células
Células
Intactas
Viabilidade Celular
Les
Lab
ora
toir
es S
ervie
r
Controle de células sem tratamento, ao
final do tempo de exposição (T1)
Células com diferentes tratamentos (A)
Métodos in vitro - Cultura de Células
100% ─ T1
X% ─ A
X (%) = viabilidade celular
Resultado
Células
Intactas
10-1
100
101
0
25
50
75
100
IC50
Via
bili
da
de
Ce
lula
r (%
)
Concentração (g/mL)
MCF-7
HaCat
Doxorrubicina
MCF-7: IC50 = 0,17 µg/mL HaCaT: IC50 = 0,077 µg/mL
Métodos in vitro - Cultura de Células
Proliferação celular (protocolo NCI60)
Les
Lab
ora
toir
es S
ervie
r
Controle de células sem tratamento ao
final do tempo de exposição (T1)
Células com diferentes tratamentos (A)
Les
Lab
ora
toir
es S
ervie
r
Placa T1 Placa T0
Controle de células sem
tratamento no início do tempo de
exposição (T0)
Células
Intactas Métodos in vitro - Cultura de Células
Se T0 ≤ A
X (%) = proliferação celular
100% ─ (T1-T0)
X% ─ (A-T0)
Se T0 > A
X (%) = proliferação celular
100% ─ (T0)
X% ─ (A-T0)
Resultado
10-1
100
101
-100
-75
-50
-25
0
25
50
75
100
TGI
LC50
Concentração (g/mL)
Pro
life
raçã
o C
elu
lar
(%)
MCF-7
HaCat
GI50
Doxorrubicina
MCF-7:
GI50 = 0,055 µg/mL
TGI = 2,38 µg/mL
LC50 = > 25 µg/mL
HaCaT:
GI50 = 0,035 µg/mL
TGI = 0,88 µg/mL
LC50 = 25 µg/mL
Células
Intactas Métodos in vitro - Cultura de Células
Métodos de Detecção
Método Não-Clonogênico:
Avaliação de parâmetros celulares para inferir indiretamente a viabilidade ou a
proliferação celular.
Corantes de exclusão (integridade da membrana celular);
Corantes que avaliam a atividade enzimática celular;
Quantificação de proteínas totais;
Quantificação de ATP;
Corantes de DNA.
Células
Intactas Métodos in vitro - Cultura de Células
Método Não-Clonogênico:
Vantagens:
Facilidade operacional (“adicionar, misturar, medir”);
Aplicação em formato multicompartimentos (placas de 96 ou 384 compartimentos);
Possibilidade de automatização do processo (protocolos para triagem de alto
rendimento, high-throughtput screening – HTS).
Limitações:
Limite de detecção;
Presença de interferentes e reações secundárias (variam de acordo com o método
escolhido).
Métodos de Detecção
Células
Intactas Métodos in vitro - Cultura de Células
Métodos in vitro - Cultura de Células
Stokes, et al. Current Protocols in Toxicology 36: 20.4.1-20.4.20, 2008; OECD. Series on Testing and Assessment no. 129. Guidance document on using cytotoxicity tests to estimate
starting doses for acute oral systemic toxicity tests, 2010.
Les
Lab
ora
toir
es S
ervie
r
Concentração
(g/mL ou menor)
Dose
(mg/Kg ou menor)
Métodos in vitro - Cultura de Células
Stokes, et al. Current Protocols in Toxicology 36: 20.4.1-20.4.20, 2008; OECD. Series on Testing and Assessment no. 129. Guidance document on using cytotoxicity tests to estimate
starting doses for acute oral systemic toxicity tests, 2010.
Como transpor o resultado, em concentração (m/v), do teste in vitro para as doses (m/m) do teste in vivo?
Les
Lab
ora
toir
es S
ervie
r
Concentração
(g/mL ou menor)
Dose
(mg/Kg ou menor)
Estimativa de potencial dose letal (DL50) por via oral através do valor de IC50 (teste de viabilidade
celular) para a amostra na linhagem 3T3 (fibroblasto embrionário de camundongo):
log LD50 (mmol/kg) = 0.439 log IC50 (mM) + 0.621 para IC50 em mM;
OU
log LD50 (mg/kg) = 0.372 log IC50 (μg/ml) + 2.024 para IC50 em μg/ml;
Vantagens
Protocolos básicos são amplamente conhecidos, permitem o entendimento do mecanismo de
diferentes efeitos e existem modelos celulares para quase todos os tecidos;
Necessitam de pequena quantidade de amostra;
Alto número de replicatas e possibilidade de automatização;
Novas tecnologia: captura de imagens e “omicas”;
Poucos problemas éticos:
Células primarias (humanas ou não): é necessário autorização de Comitê de Ética;
Células tronco embrionárias.
Métodos in vitro - Cultura de Células
Venkataramanan et al., Life Sciences 78: 2105, 2006; Hartung & Daston. Toxicological Sciences 111: 233, 2009; Agarwal et al., Current Opinion in Biotechnology 25: 39–44, 2014.
Limitações
Condições artificiais de cultivo:
Crescimento em monocamadas ou em suspensão;
Condições de cultura não homeostáticas;
Monocultura (uma única linhagem celular);
Ausência de capacidade de biotransformação;
Maioria das linhagens celulares tem origem em tecidos tumorais;
Autenticidade das linhagens celulares.
Métodos in vitro - Cultura de Células
Venkataramanan et al., Life Sciences 78: 2105, 2006; Hartung & Daston. Toxicological Sciences 111: 233, 2009; Agarwal et al., Current Opinion in Biotechnology 25: 39–44, 2014.
Métodos in vivo
Desenvolvimento de Medicamentos Oncológicos - Aspectos
Gerais dos Estudos Não-Clínicos in vitro e in vivo de Eficiência
e Segurança