descoloraÇÃo e detoxificaÇÃo do azo corante … · que compreendeu minha paixão pela...

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO

CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

DOUTORADO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

DESCOLORAÇÃO E DETOXIFICAÇÃO DO AZO CORANTE ALARANJADO II POR Geobacillus

stearothermophilus, Pseudomonas aeruginosa e P.

fluorescens ISOLADOS E EM CULTURA MISTA

NORMA SUELY EVANGELISTA BARRETO

Recife

Maio, 2006

NORMA SUELY EVANGELISTA BARRETO

DESCOLORAÇÃO E DETOXIFICAÇÃO DO AZO CORANTE ALARANJADO II POR Geobacillus stearothermophilus,

Pseudomonas aeruginosa e P. fluorescens ISOLADOS E EM CULTURA MISTA

Tese apresentada ao Programa de Pós-

graduação em Ciências Biológicas da

Universidade Federal de Pernambuco, como

parte dos requisitos, para obtenção do título

de Doutor em Ciências Biológicas, na área de

Microbiologia.

Orientadores: Profa. Dra. GALBA MARIA DE CAMPOS-TAKAKI Profa. Dra. REGINE HELENA S. DOS FERNANDES VIEIRA

Recife

Maio/2006

“A sabedoria é a meta da alma humana;

Mas a pessoa, à medida que em seus conhecimentos avança,

Vê o horizonte do desconhecido cada vez mais longe”.

(Heráclito)

"Isto foi para mim,

entre todas as maravilhas

que descobri na natureza,

a mais maravilhosa de todas;

Preciso dizer que,

para mim, visão mais agradável

jamais veio ante meus olhos

que aquelas milhares

de criaturas viventes,

vistas numa gotinha de água..."

Anton van Leeuwenhoek

Agradeço e dedico este trabalho

Ao meu amado Leo,

que compreendeu minha paixão pela Microbiologia,

e me incentivou a ir mais além,

suportando bravamente a saudade e a distância,

Aos meus pais e irmãos,

(Marcos e Neusa, Marcos Aurélio, João Paulo e Evandro)

que mesmo tão distantes e as vezes sem entenderem o que faço,

sempre torcem por mim.

Agradecimentos

- A Deus, luz que me conduz incessantemente nesta estrada e me ampara nos

momentos de fraqueza;

- A toda minha família, compreensivos com a minha ausência constante e em

particular a minha tia Mariana, pelo apoio e carinho em todos os momentos. Aos

meus sogros, amigos queridos e incentivadores. Aos pequenos Marcos Vinicius e

Gabriel, sobrinhos amados;

- Ao Reitor da Universidade Católica de Pernambuco, Prof. Dr. Pe Rubens

Ferreira Oliveira, S.J. pelo acesso e utilização das instalações no Núcleo de

Pesquisa em Ciências Ambientais (NPCIAMB);

- Á Profa. Regine Vieira, pela amizade e por ter sido a responsável de despertar

em mim o amor pela microbiologia e a pesquisa;

- Ao Prof. Dr. Nelson Duran e Livia Cordi (UNICAMP), pelas análises de

toxicidade;

- À Profa. Clarissa Albuquerque (UNICAP), pelas análises estatísticas e

sugestões na elaboração dos planejamentos;

- A Profa. Dra. Aline do Nascimento (UNICAP) e ao colega Marcos Lima pelo

auxílio com as fotomicrografias;

- Ao Prof. Sergio C. Paiva (UNICAP), pelo apoio e auxílio nas análises de DQO;

- Aos professores do Doutorado em Ciências Biológicas pela amizade e

conhecimentos transmitidos durante o curso contribuindo na minha formação, em

especial à Coordenadora do curso Profa. Dra. Suely Lins Galdino pela atenção e

excelente trabalho desenvolvido;

- A grande amiga Mabel Calina, sempre tão prestativa nos momentos de

“socorro”, me compreendendo e confortando nos momentos de intensa saudade

de casa;

- As minhas amigas do LABOMAR-UFC-CE, amigas de todas as horas e sempre

na torcida (Gleire, Cris, Osca, Bel, Anahy, Janisi, Claudia, Edirsana, Carol e

Rosa);

- Aos meus amigos do CCB, pelo companheirismo em sala de aula e aos amigos

do NPCIAMB - Luciana Franco e Thayza Stamford (amigas queridas), Marcos

Morais, Daniela, Marta, Raquel e Carol (que com paciência me ajudaram na

confecção de alguns gráficos), Petrusk, Luiza, Patrícia, Adriana, Fabíola, Thayze,

Juliana, Charles e Aline pela oportunidade de convivência e a amizade;

- A Sônia Maria de Souza, secretária do núcleo e os técnicos do NPCIAMB

Severino Humberto e Salatiel Joaquim, por tornarem o ambiente do laboratório

mais acolhedor;

- A Secretária do CCB, Adenilda Eugenia sempre tão prestativa e eficiente, além

da amizade e;

- Aos professores do NCIAMB, Dra. Leonie Sarubbo, Dra. Alexandra Salgueiro,

Dr. Carlos Alberto, Dra. Kaoru Okada, Dr. Ricardo Kenji e Dra. Arminda Saconi,

pelo convívio diário;

- Ao Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento (CNPq), pela concessão

da bolsa, CNPq/CTPETRO/PRONEX, pelo financiamento dos experimentos

realizados;

- À banca examinadora pelas valiosas sugestões;

- A todos que, direta ou indiretamente, contribuíram para a realização deste

trabalho; que um dia foi um sonho.

Agradecimento Especial

À minha orientadora e segunda mãe científica Profa. Dra. Galba Maria de

Campos Takaki a quem admiro muito. Agradeço pela confiança e por ter me

aceito em seu grupo de pesquisa. Que apesar de seu jeito rígido, procura nos

direcionar no desenvolvimento da tese, na profissão e acima de tudo para a vida.

Âncora do NPCIAMB, eu serei eternamente grata por sua paciência,

ensinamentos e por um dia ter sido uma “galbete”.

SUMÁRIO

LISTA DE FIGURAS i

LISTA DE TABELAS iii

LISTA DE ABREVIATURAS v

RESUMO vi

ABSTRACT vii

1. INTRODUÇÃO 1

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 5

2.1. Corantes 5

2.1.1. Considerações Gerais 5

2.1.2. Estrutura e Classificação 8

2.2. Indústria Têxtil 13

2.2.1. Beneficiamento Têxtil 13

2.2.2. Perfil Ambiental 16

2.2.3. Problemas Toxicológicos Associados aos Corantes 20

2.3. Tratamento dos Efluentes 22

2.3.1. Métodos Químicos 24

2.3.2. Métodos Físicos 26

2.3.3. Métodos Biológicos 27

2.3.3.1. Biodegradação dos Corantes por Bactérias 29

2.3.3.2. Biosorção pela Biomassa Microbiana 36

2.4. Geobacillus stearothermophilus 39

2.5. Pseudomonas aeruginosa 41

3. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 44

PRIMEIRO ARTIGO

Descoloração do azo corante Alaranjado II por Geobacillus

stearothermophilus (UCP 986) sob condições de co-metabolismo 62

Resumo 63

Introdução 64

Material e Métodos 66

Resultados e Discussão 69

Conclusões 76

Agradecimentos 76

Referências 76

Tabelas 81

Figuras 82

SEGUNDO ARTIGO

Biorremediação do azo corante têxtil Alaranjado II por Pseudomonas

aeruginosa UCP 992 sob condições aeróbicas 86

Resumo 87

Introdução 88



Conclusões 101

Agradecimentos 102

Referências 102

Tabelas 107

Figuras 108

TERCEIRO ARTIGO

Potencial aplicação do consórcio de Geobacillus stearothermophilus UCP 986 e Pseudomonas aeruginosa UCP 992 no processo de

113

descoloração do Alaranjado II Resumo 114

Introdução 115



Agradecimentos 126

Referências 126

Tabelas 131

Figuras 133

QUARTO ARTIGO

Processo de descoloração e detoxificação de um efluente têxtil por Geobacillus stearothermophilus, Pseudomonas aeruginosa e P.

fluorescens, isolados e em cultura mista

135

Resumo 136

Introdução 137


Resultados e discussão 143

Conclusões 149

Agradecimentos 150

Referências 150

Tabelas 155

Figuras 160

CONCLUSÕES GERAIS 161

ANEXOS 163

LISTA DE FIGURAS

REVISÃO BIBLIOGRÁFICA Figura 1. Produção de corantes no Brasil (Abiquim, 2005a). 7

Figura 2. Estrutura molecular característica de um corante têxtil (A) onde

o grupo cromóforo é da família azo (B). 9

Figura 3. Modelo de interação dos corantes reativos com a fibra têxtil (Hao

et al., 2000). 15

Figura 4. Mecanismo proposto para a redução dos azo corantes pelas

células bacterianas (Pearce et al., 2003). 33

PRIMEIRO ARTIGO

Figura 1. Estrutura química do azo corante Alaranjado II. 82

Figura 2. Efeitos padronizados com diferentes fatores testados no

experimento de descoloração do azo corante Alaranjado II por

Geobacillus stearothermophilus UCP 986, após 24 h de cultivo A 50ºC. (1)

Tamanho do inóculo, (2) meios de cultura, (3) concentração do corante e

(4) tipo de agitação.

82

Figura 3. Percentual de descoloração, crescimento celular, consumo de

glicose e pH durante o processo de remoção do azo corante Alaranjado II

usando Geobacillus stearothermophilus, por 48 h a 50ºC. (A) Ensaio 9, (B)

Ensaio 10, (C) Ensaio 13 e (D) Ensaio 14.

83

Figura 4. Avaliação da toxicidade dos metabólitos formados durante o

processo de descoloração do azo corante Alaranjado II por Geobacillus

stearothermophilus, após 48 h de cultivo a 50ºC, usando Artemia salina.

84

SEGUNDO ARTIGO

Figura 1. Diagrama de Pareto mostrando os efeitos principais e

interações das variáveis independentes no processo de descoloração do

Alaranjado II por Pseudomonas aeruginosa UCP 992, após 24 h de cultivo

a 40ºC. (1) Tamanho do inóculo, (2) Concentração do corante, (3) Faixa

de agitação.

108

Figura 2. Percentual de descoloração, crescimento celular, consumo de

glicose e pH durante o processo de remoção do azo corante Alaranjado II

por Pseudomonas aeruginosa.

109

Figura 3. Eletromicrografia de Pseudomonas aeruginosa (UCP 992) após

o processo de descoloração do azo corante Alaranjado II, por microscopia

eletrônica de varredura.

110


processo de descoloração do Alaranjado II, por Pseudomonas aeruginosa

(UCP 992), após 48 h de cultivo a 40ºC, usando Artemia salina.

111

TERCEIRO ARTIGO

Figura 1. Estrutura química do azo corante Alaranjado II. 133

Figura 2. Biomassa, pH, consumo de glicose e descoloração do azo

corante Alaranjado II usando um consórcio bacteriano, por 48 h a 40ºC. 133

QUARTO ARTIGO

Figura 1. Descoloração do efluente têxtil por Geobacillus

stearothermophilus, Pseudomonas aeruginosa e P. fluorescens,

durante 72 h de cultivo. a = efluente com nutrientes, b= efluente sem nutrientes. BI = Geobacillus stearothermophilus, BII = Pseudomonas aeruginosa e P. fluorescens e BIII = consórcio com os três microrganismos.

160

LISTA DE TABELAS

REVISÃO BIBLIOGRÁFICA Tabela 1. Classificação dos corantes e pigmentos segundo a utilização do

substrato

10

Tabela 2. Estimativa do grau de fixação de diferentes corantes nas fibras

e as perdas para o efluente, permitidos pela Sociedade de Corantes e

Colorações

14

PRIMEIRO ARTIGO

Tabela 1. Matriz codificada do planejamento fatorial 24 em relação à

resposta de descoloração do azo corante Alaranjado II por Geobacillus

stearothermophilus UCP 986, após 24 h de cultivo a 50ºC

81

SEGUNDO ARTIGO Tabela 1. Matriz codificada do planejamento fatorial 23 em relação à

resposta de descoloração do Alaranjado II e pH por Pseudomonas

aeruginosa UCP 992, após 24 h de cultivo a 40ºC

107

TERCEIRO ARTIGO

Tabela 1. Concentração de proteína total e atividade enzimática, do

líquido metabólico livre de células no cultivo de Geobacillus

stearothermophilus e Pseudomonas aeruginosa, durante o processo de

descoloração do Alaranjado II, por 48 h a 40ºC

131

Tabela 2. Inibição no crescimento da alga Selenastrum capricornutum

pelo líquido metabólico provenientes do processo de descoloração do azo

corante Alaranjado II usando um consórcio microbiano, por 48 h a 40ºC

132

QUARTO ARTIGO

Tabela 1. Características físico-químicas do efluente têxtil proveniente de

uma indústria de tingimento de poliéster 155

Tabela 2. Remoção do carbono orgânico total (COT), demanda química

de oxigênio (DQO) e pH durante a descoloração do efluente têxtil 156

Tabela 3. Análise de variância da descoloração do efluente têxtil sob as

condições: tipo de bioensaio (sem consórcio, consórcio 1 e consórcio 2) e

tipo de efluente (com e sem nutrientes)

157

Tabela 4. Inibição e CL50 no crescimento da alga Selenastrum

capricornutum em contato com as amostras provenientes do processo de

descoloração do efluente têxtil, usando diferentes tratamentos

158

Tabela 5. Avaliação da toxicidade por Artemia salina em contato com as

amostras provenientes do processo de descoloração do efluente têxtil 159

LISTA DE ABREVIATURAS

mg dm3 - Miligrama por Decímetro Cúbico

ETAD - Ecological and Toxicological Association of the Dyestuff

Manufacturing Industry

EEA - European Environmental Agency

UNEP - United Nations Environment Programme

DL50 - Dose Letal para 50% dos Hospedeiros

CL50 - Concentração Letal para 50% dos Hospedeiros

POAs - Processos Oxidativos Avançados

ATP - Trifosfato Adenosina

LB - Luria Bertani

YP - Levedura-Peptona

DQO - Demanda Química de Oxigênio

APHA - American Public Health Association

UFC - Unidade Formadora de Colônia

NADH - Nicotinamida Adenina Dinucleotídeo Reduzido

TCA - Ciclo do Ácido Tricarboxílico

HPLC - Cromatografia Líquida de Alta Eficiência

USBR - Reator Anaeróbico de Manta de Lodo

SBR - Reator de Fluxo Contínuo

RESUMO

As indústrias têxteis são responsáveis pelo descarte inadequado de diversos

corantes nos efluentes industriais, causando sérios danos ao ambiente. A

aplicação de tratamentos biológicos tem demonstrado que as bactérias são

consideradas como microrganismos capazes de descolorir efluentes altamente

coloridos. Neste sentido, estudos foram realizados para a remoção do azo corante

Alaranjado II usando Geobacillus stearothermophilus, Pseudomonas aeruginosa e

P. fluorescens, isolados e em cultura mista, crescidos em diferentes substratos

(meios de cultura e efluente têxtil). A adição de glicose como co-substrato, sob

agitação contínua, promoveu de forma eficiente a descoloração do Alaranjado II,

usando G. stearothermophilus, enquanto P. aeruginosa foi fortemente inibida pela

agitação elevada. A presença de ácido sulfanílico, um metabólito formado durante

o processo de biodegradação do Alaranjado II não foi encontrado no cultivo

contendo G. stearothermophilus, ao contrário do cultivo contendo P. aeruginosa.

O consórcio usando G. stearothermophilus e P. aeruginosa numa seqüência

agitação-repouso-agitação, removeu totalmente o azo corante, não apresentando

metabólitos mais tóxicos. A descoloração de um efluente têxtil contendo o

Alaranjado II e usando os três microrganismos, isolados e em associação,

demonstrou que a descoloração do efluente está relacionada à adição de

nutrientes no cultivo, sugerindo que a ausência de nutrientes como fonte de

energia inicial, afeta o processo de descoloração. Ainda nestas condições, se

observou que a utilização de consórcios promove total remoção da cor do

corante, além da redução total ou parcial na toxicidade dos metabólitos formados.

Baseado nisso, os microrganismos G. stearothermophilus, P. aeruginosa e P.

fluorescens são capazes de descolorir efetivamente o azo corante Alaranjado II,

não formando compostos mais tóxicos, apresentando dessa maneira, grande

potencial na descoloração de corantes têxteis.

Palavras chave: Biodegradação; Descoloração; Alaranjado II; Efluente têxtil.

ABSTRACT

The textile industries are responsible for the inadequate discarding of diverse dyes

in the industrials effluents, causing serious damages to the environment. The

application of biological treatments has been demonstrated that the bacteria are

considered as microorganisms capable to discolor effluents highly colorful. In this

direction, studies had been carried out with removal of azo dye Orange II using

Geobacillus stearothermophilus, Pseudomonas aeruginosa and P. fluorescens,

isolated and in mixed culture, grown in different substrates (culture medium and

textile effluent). The addition of the glucose as co-substratum, under continuous

agitation, promoted in an efficient way the discoloration of the Orange II, using G.

stearothermophilus, while P. aeruginosa was inhibited strongly by the high

agitation. The presence of sulphanilic acid, a metabolite formed during the process

of biodegradação of the Orange II was not found in the cultivation containing G.

stearothermophilus, unlike the cultivation containing P. aeruginosa. The

consortium using G. stearothermophilus and P. aeruginosa in a sequence

agitation-repose-agitation, it totally removed the coloring occasion, not presenting

more poisonous metabolites. The discoloration of a textile effluent containing the

Orange II and using the three microorganisms, isolated and in association, it

demonstrated that the discoloration of the effluent is related to the addition of

nutrients in the cultivation, suggesting that the absence of nutrients as initial

source of energy, affects the discoloration process. Still in these conditions, it was

observed that use of consortia promotes total removal of the color, besides the

reduction total or partial in the toxicity of the formed metabolites. Based on that,

the microorganisms G. stearothermophilus, P. aeruginosa and P. fluorescens are

capable to discolor the Orange coloring occasion indeed II, not forming more

toxics compounds, presenting than great potential in the discoloration of dyes

textile.

Key words: Biodegradation; Discoloration; Orange II; Effluent textile.

Evangelista-Barreto, N.S. – Descoloração e detoxificação do azo corante Alaranjado II...

1

1. INTRODUÇÃO

Com o aumento da população urbana nas últimas décadas e o amplo

desenvolvimento do setor industrial, novos compostos foram sintetizados e

continuamente lançados no meio ambiente, contribuindo, dessa maneira, para o

aumento da poluição ambiental. Os resíduos poluentes descartados pelas

indústrias podem permanecer no meio ambiente por grandes períodos, sendo a

água e o solo, um dos recursos mais afetados na natureza (GOMES et al., 1998).

Dentre os vários setores industriais responsáveis pela poluição, o setor de

acabamento têxtil merece destaque, devido ao grande consumo de água e

produtos químicos usados durante o processo de tingimento de seus tecidos,

produzindo desta maneira, efluentes altamente coloridos. Por outro lado, os

compostos formados a partir desses processos apresentam elevada carga

orgânica, aliada ao elevado teor de sais inorgânicos (DUENSER, 1992; BANAT et

al., 1996).

No Brasil, devido as características climáticas, o setor têxtil baseia-se

predominantemente no algodão, com cerca de 75% de suas indústrias,

localizadas na região sul (Santa Catarina), sudeste (São Paulo e Minas Gerais) e

nordeste (Bahia, Pernambuco e Ceará) (GUARATINI & ZANONI, 2000).

Os corantes e pigmentos são compostos extensamente usados nas

indústrias têxteis, de alimento, papel, farmacêutica e de cosméticos, dentre outras

(McMULLAN et al., 2001; DONMEZ, 2002; BEYDILLI & PAVLOSTATHIS, 2005).

Com isso, a remoção desses poluentes nos efluentes têxteis tem recebido

considerável atenção nas pesquisas do meio ambiente. Durante a síntese e uso


2

dos azo corantes, acredita-se que pelo menos 4% da sua produção seja perdida

para o meio ambiente a cada ano; enquanto outros pesquisadores calculam

perdas tão altas quanto 10 a 15% (COUGHLIN et al., 2003; FORGACS et al.,

2004).

Segundo Robinson et al. (2002) a liberação dos corantes no ambiente é tida

como poluição da água, uma vez que, os corantes são visíveis em quantidades

mínimas, devido ao seu alto brilho. Recentemente, as indústrias têxteis da União

Européia foram pressionadas a reduzir o teor químico de seus efluentes em

atendimento a legislação vigente (AZMI et al., 1998; O'NEILL et al., 1999). Nos

Estados Unidos, as agências estaduais e federais têm requisitado baixos índices

colorimétricos (< 200 unidades) em seus efluentes industriais (McCURDY et al.,

1992).

Os corantes são difíceis de serem tratados por causa de sua origem sintética

e, principalmente, devido suas estruturas moleculares aromáticas complexas,

visto que tais estruturas são constituídas para resistir à exposição ao sabão,

água, luz, agentes oxidantes e suor, sendo por isso mais estáveis e menos

biodegradáveis (BANAT et al., 1996; AKSU & DONMEZ, 2003; SENAN et al.,

2003; ADEDAYO et al. 2004). Por outro lado, a presença de rejeitos coloridos

contribui na menor penetração da luz solar, afetando a atividade fotossintética;

bem como alterando a solubilidade dos gases, causando danos às guelras e

brânquias dos organismos aquáticos. Segundo Zanoni & Carneiro (2001) acredita-

se que esses compostos podem permanecer por cerca de 50 anos nos ambientes

aquáticos, pondo em risco a estabilidade dos ecossistemas e a vida ao seu redor.

A liberação destes poluentes, normalmente tóxicos, representa um dos

maiores problemas ambientais, uma vez que estas substâncias apresentam alta


3

recalcitrância (WANG & YU, 1998), além de uma cinética de degradação muito

lenta para os processos biológicos convencionais (BROMBERG & DURAN, 2000).

Assim, diferentes tratamentos físico-químicos têm sido aplicados no tratamento

dos efluentes, como por exemplo, adsorção com carvão ativado, ultrafiltração,

osmose reversa, coagulação-floculação, troca iônica, etc. (GALINDO et al., 2001;

KONSTANTINOU & ALBANIS, 2004) e embora, muitos deles apresentem

eficiente remoção, principalmente com relação aos corantes reativos, o alto custo

inicial e operacional constitui a principal desvantagem para as indústrias de

tingimento e acabamento (AKSU & DONMEZ, 2003, VERMA & MADAMWAR,

2005). Desta maneira, a descoloração de corantes sintéticos usando diferentes

microrganismos tem sido vista como uma tecnologia bastante promissora,

podendo representar um tratamento relativamente barato na remoção destes

poluentes (MOREIRA et al., 2000; VAN DER ZEE & VILAVERDE, 2005).

Os microrganismos são particularmente úteis na degradação dos corantes,

porque apresentam elevada capacidade de clivagem redutiva nas ligações azo,

fato este, geralmente associado às enzimas azoredutases (KUNZ et al., 2002). No

ambiente, a molécula do azo corante pode ser transformada ou degradada por

diversos microrganismos, incluindo as bactérias, fungos, leveduras, actinomicetos

e algas (CHEN et al., 2003; VERMA & MADAMWAR, 2005). Com exceção dos

actinomicetos, o isolamento de bactérias capazes de descoloração aeróbica,

especialmente dos azo corantes sulfurados, tem sido difícil (McMULLAN et al.,

2001).

Considerando que uma das rotas a ser explorada é o uso de microrganismos

termotolerantes e termofílicos em sistemas de descoloração, uma vez que o

processo de tingimento ocorre em elevadas temperaturas (50o - 60oC); bem como


4

a utilização de consórcios microbianos, este trabalho foi realizado utilizando um

isolado selvagem de Geobacillus stearothermophilus (UCP 986), Pseudomonas

aeruginosa (UCP 992) e P. fluorescens (CCT 4056) visando atender às seguintes

etapas:

1. Avaliar o potencial de descoloração do azo corante reativo Alaranjado II,

utilizando Geobacillus stearothermophilus (UCP 986) sob condições de co-

metabolismo;

2. Avaliar o potencial de crescimento e biodegradação de Pseudomonas

aeruginosa, em meio contendo o azo corante reativo Alaranjado II;

3. Investigar a biodegradação do azo corante reativo Alaranjado II, utilizando

um consórcio microbiano;

4. Investigar a toxicidade dos produtos intermediários formados durante o

processo de biodegradação do azo corante reativo Alaranjado II;

5. Avaliar o potencial biotecnológico dos microrganismos na descoloração de

um efluente têxtil.


5

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1. Corantes

2.1.1. Considerações Gerais

O homem utiliza as cores há mais de 20 mil anos, sendo o Negro-de-Fumo

(Carbon Black) o primeiro corante a ser conhecido pela humanidade. Por volta de

3.000 a.C., foram produzidos alguns corantes inorgânicos sintéticos, como por

exemplo, o Azul Egípcio (ABIQUIM, 2005).

Durante séculos, e até a metade do século 19, só existiam pigmentos

naturais, provenientes de vegetais, insetos, moluscos e minerais. Entretanto,

muitos corantes naturais utilizados na Antigüidade ainda são empregados em

larga escala, como é o caso do índigo, um pigmento azul, extraído da Indigofera

tinctoria L.; alizarina, extraído da raiz de Rubia tinctorium L. e henna, extraído de

Lawsonia inermis, utilizada na indústria de cosméticos (ZANONI & CARNEIRO,

2001; QMCWEB, 2004).

O primeiro corante sintético foi descoberto na Inglaterra, em 1856, pelo

químico Willian H. Perkin (1838-1929), que o obteve como produto da oxidação

da anilina (C6 H7N) com o dicromato de potássio (K2Cr2O7), como um precipitado

de coloração avermelhada, denominado de Malva. No fim do século 19, os

fabricantes dos corantes sintéticos, estabeleceram-se na Alemanha, Inglaterra,

França e Suíça, suprindo as necessidades das indústrias que, na época,

fabricavam tecidos, couro e papel (ZANONI & CARNEIRO, 2001; ABIQUIM,


6

2005). Até a Segunda Guerra Mundial, a Alemanha manteve o monopólio sobre a

produção de corantes sintéticos, sendo hoje a indústria dos Estados Unidos, a

maior fonte exportadora destes produtos, colocando no mercado

aproximadamente dois mil diferentes tipos de corantes sintéticos (GUARATINI &

ZANONI, 2000).

Com o fim da Segunda Guerra Mundial a manufatura e comercialização dos

corantes se tornou intensa e, atualmente o Colour Index, um catálogo usado para

classificação internacional dos corantes, criado pela Sociedade de Corantes e

Colorações, fundada em 1924, registra mais de oito mil corantes orgânicos

sintéticos associados à indústria têxtil (O’NEILL et al., 1999; ZANONI &

CARNEIRO, 2001). Por causa do seu baixo custo de síntese, estabilidade e

variedade de cores quando comparado aos corantes naturais, os corantes

sintéticos têm sido extensamente usados na indústria têxtil, de papel, borracha,

plásticos, cosméticos, farmacêutica e de alimentos (CHAGAS & DURRANT, 2001;

GONG et al., 2005).

Visando atender à grande demanda comercial, o setor industrial tem

investido no desenvolvimento de corantes econômicos, com propriedades

específicas, a fim de obter boa fixação da coloração nos tecidos e elevada

resistência aos agentes de desbotamento (CORREIA et al., 1994). Dessa

maneira, nos últimos 100 anos, mais de 100 mil corantes comerciais têm sido

sintetizados, com uma produção anual em torno de um milhão de toneladas

(SELVAM et al., 2003; ADEDAYO et al., 2004), sendo 54.000 toneladas somente

no Brasil (ABIQUIM, 2005a) (Figura 1).

No Brasil, até 1985 o algodão e as fibras naturais detinham 70% do

consumo interno. Atualmente, as fibras químicas avançam com rapidez,


7

representando um percentual de 40% do consumo (TEIXEIRA, 2003). De acordo

com a Associação Brasileira de Produtores de Fibras Artificiais e Sintéticas

(Abrafas), a fabricação nacional de fibras químicas em 2002 era de 366 mil

toneladas, versus um consumo no mesmo período de 464 mil toneladas, números

não muito diferentes dos estimados para 2003 (SANT’ANNA, 2004).

Figura 1. Produção de corantes no Brasil (Abiquim, 2005a).

A utilização de corantes têxteis no país se concentra, principalmente, nos

corantes reativos para fibras celulósicas, que hoje respondem por 57% do

mercado, seguido pelos corantes dispersos, com 35%; poliamida, com 3% e

acrílico, com 2% (ABIQUIM, 2005).

O consumo de fibra têxtil per capita no Brasil até 1990 era estimado em 7,7

kg/habitante, passando para 11,2 kg em 2000. Hoje, o consumo mundial oscila


8

entre 14 Kg/habitante/ano, um índice que quase chega a 8,5 kg/habitante/ano no

Brasil (TEIXEIRA, 2003).

Atualmente, o setor têxtil/confeccionista brasileiro é importante no mercado

global, porque movimenta cerca de US$ 22 bilhões ao ano, produzindo 7,2

bilhões de peças anualmente em mais de 30 mil empresas, além de empregar 1,4

milhões de trabalhadores (INFORMATIVO ABIT, 2005). Dessa maneira, o Brasil é

o terceiro produtor mundial de tecidos de malha, o quinto em peças

confeccionadas e o sétimo em fios e filamentos, ou seja, encontra-se em sétimo

lugar na produção têxtil mundial (COSTA, 2005).

Devido a uma tendência mundial, a indústria de corantes no Brasil, tem se

esforçado para atender às regras de proteção ambiental, embora a aplicação

destes corantes no processo de tinturaria constitua efetivamente um sério

problema, uma vez que um grande número destas indústrias é de pequenas

empresas, tornando difícil a atividade de fiscalização (GUARATINI & ZANONI,

2000).

1.1.2. Estrutura e Classificação

Estruturalmente, a molécula do corante utilizada para o tingimento da fibra

têxtil se divide em duas partes distintas, um grupo cromóforo, também conhecido

como azo, antraquinona, nitro, etc., que é responsável pela cor, e grupos

auxiliares, ou seja, grupos aromáticos que propiciam sua afinidade pela fibra têxtil

natural ou sintética (CORREIA et al., 1994; KUNZ et al., 2002; ZANONI &

CARNEIRO, 2003), além da propriedade de absorver luz na região visível

(BANAT et al., 1996) (Figura 2).


9

Diversos corantes são de difícil descoloração devido à sua estrutura

complexa e origem sintética (SESHADRI et al., 1994; ROBINSON et al., 2001).

Segundo Nigam et al. (1996) compostos azo com um grupo hidroxila ou um grupo

amina são mais fáceis de serem degradados do que compostos com grupos metil,

sulfo ou nitro.

Figura 2. Estrutura molecular característica de um corante têxtil (A) onde o

grupo cromóforo é da família azo (B).

De acordo com o Colour Index (CI) os corantes e pigmentos podem ser

classificados em 26 tipos, segundo os critérios da classe química e em 20 tipos,

além de algumas subdivisões, do ponto de vista de aplicações (Tabela 1)

(ABIQUIM, 2005). Essa diversidade ocorre principalmente porque cada tipo de

fibra a ser colorida requer corantes com características próprias e bem definidas

(GUARATINI & ZANONI, 2000).

A B

Ácido Alaranjado 7


10

Com relação à estrutura química, o corante é conhecido através de um

número CI que lhe é atribuído; onde a primeira palavra corresponde à

classificação do corante e a segunda palavra, corresponde à sua coloração ou

tonalidade, como por exemplo, o corante ácido Amarelo 36 (CI 13065) (HAO et

al., 2000).

Tabela 1. Classificação dos corantes e pigmentos segundo a utilização por

substrato

Classe Principais campos de aplicação

Branqueadores

ópticos

Detergentes, fibras naturais, fibras artificiais, fibras

sintéticas, óleos, plásticos, sabões, tintas e papel

Corantes

À Cuba Sulfurados Fibras naturais e fibras artificiais

À Tina Fibras naturais

Ácidos Alimentos, couro, fibras naturais, fibras sintéticas, lã e

papel

Ao Enxofre Fibras naturais

Azóicos Fibras naturais e fibras sintéticas

Básicos Couro, fibras sintéticas, lã, madeira e papel

Diretos Couro, fibras naturais, fibras artificiais e papel

Dispersos Fibras artificiais e fibras sintéticas

Mordentes Alumínio, lã, fibras naturais e fibras sintéticas

Reativos Couro, fibras naturais, fibras artificiais e papel

Solventes Ceras, cosméticos, gasolina, madeira, plásticos, solventes

orgânicos, tintas de escrever e vernizes

Pigmentos Orgânicos Tintas gráficas, tintas e vernizes, estamparia têxtil e

plásticos

Pigmentos

Inorgânicos

Tintas gráficas, tintas e vernizes, estamparia têxtil e

plásticos Fonte: ABIQUIM (2005)


11

Os corantes ácidos são corantes aniônicos solúveis em água com diferentes

grupos cromóforos e grupos funcionais como nitro-, carboxil- e ácido sulfanílico;

quando adicionado um grupo sulfanílico, a molécula insolúvel em água se torna

solúvel. Os corantes básicos são do tipo catiônico com o grupo cromóforo

tipicamente apresentando grupos aminas. Os corantes diretos são sais altamente

solúveis em água, enquanto os corantes de dispersão são moléculas não-

aniônicas, altamente insolúveis em água quando aplicadas às fibras hidrofóbicas

(HAO et al., 2000).

Com relação à fixação dos corantes, o grupo mais representativo e

amplamente empregado pertence à família azo, que representa cerca de 60-80%

(TUNUSSI & SOBRINHO, 2002; RISMAYANI et al., 2004; SILVA et al., 2004) dos

mais de dez mil corantes aplicados nas indústrias de processamento têxtil

(SPONZA e ISIK, 2004), seguido pelo grupo antraquinona (KONSTANTINOU &

ALBANIS, 2004). Por outro lado, o grupo azo pode ser dividido em monoazo,

diazo e triazo, de acordo com a presença de uma ou mais ligações nitrogênio-

nitrogênio (–N=N–) ligados a sistemas aromáticos (MANU & CHAUDHARI, 2003),

podendo também apresentar grupos do ácido sulfanílico (CHAGAS & DURRANT,

2001).

Os corantes reativos diferem de todas as outras classes de corantes porque

se ligam às fibras têxteis, como o algodão, por ligações covalentes (AKSU &

DONMEZ, 2003; BEYDILLI & PAVLOSTATHIS, 2005). Eles também formam

ligações com grupos amino, hidróxila e tióis nas fibras protéicas e também com

grupos amino dos poliamidas. Nos diferentes corantes reativos existentes, os

principais contêm a função azo e antraquinona como grupos cromóforos e os


12

grupos clorotriazinila e sulfatoctilsulfonila como grupos reativos (GUARATINI &

ZANONI, 2000).

Semelhantes aos corantes diretos, estes corantes também são corantes

aniônicos altamente solúveis em água (HAO et al., 2000), no entanto, apresentam

características favoráveis como cor luminosa, fácil aplicação, com baixo custo e

consumo de energia (KUNZ, et al., 2002; AKSU & DONMEZ, 2003) e alta

estabilidade quando molhados (PEARCE et al., 2003; BEYDILLI &

PAVLOSTATHIS, 2005).

Os corantes básicos apresentam alto brilho e intensidade de cor, tornando-

os mais difíceis de descolorir. Os corantes complexados com base em metal e

cromo são compostos carcinogênicos, enquanto os demais corantes dispersivos

demonstram tendência de bioacumulação. Íons de metais pesados presentes nos

efluentes têxteis, têm sido reportados em altas concentrações na água e plantas

(BANAT et al., 1996).

Dessa maneira, a recalcitrância dos azo corantes foi atribuída à presença de

grupos sulfurados e ligações azo, duas características consideradas geralmente

xenobióticas. A ligação azo na molécula do corante, entretanto, é vulnerável a

clivagem redutiva (KUDLICH et al., 1996; PINHEIRO et al., 2004). Por outro lado,

os corantes baseados em antraquinonas são altamente resistentes à degradação,

devido suas estruturas aromáticas fundidas (DONG et al., 2003).


13

2.2. Indústria Têxtil

2.2.1. Beneficiamento Têxtil

Os corantes apresentam estruturas moleculares complexas que podem

envolver, durante seu processo de síntese, até 500 reações intermediárias

(ZANONI & CARNEIRO, 2001). A forma de fixação da molécula do corante nas

fibras têxteis geralmente ocorre em solução aquosa, podendo envolver

basicamente quatro tipos de interações: ligações iônicas, ligações de hidrogênio,

ligações de Van der Waals e ligações covalentes (GUARATINI & ZANONI, 2000).

O volume de água usado durante o processamento é muito grande, variando

de 120 a 380 litros por metro de tecido processado (BALAN, 2005). Durante o

banho de tingimento, os corantes são hidrolisados, geralmente em altas

temperaturas (50 a 135oC), com concentrações que variam de 10 mg L-1 a 1000

mg L-1, dependendo do poder de reação do corante e do processo de tingimento

utilizado, como por exemplo, intensidade da cor (TUNUSSI & ALEM SOBRINHO,

2002).

Devido à competição entre a celulose (CellO-) e íons OH- nos banhos

contendo corantes reativos em condições típicas de tingimento, ou seja, pH ≥ 10 e

concentração de sais variando de 60 a 100 g L-1, calcula-se perdas dos corantes

de 20 a 50%, devido à não fixação na forma hidrolisada (Tabela 2). Esta falta de

afinidade pela fibra têxtil resulta, conseqüentemente, no efluente colorido

(TUNUSSI & ALEM SOBRINHO, 2002; BEYDILLI & PAVLOSTATHIS, 2005). Os

corantes hidrolisados ocorrem quando a molécula do corante reage com a água


14

no lugar da hidróxila de celulose, devido sua alta solubilidade na água e as

características de brilho dos corantes (PEARCE et al., 2003) (Figura 3).

Tabela 2. Estimativa do grau de fixação dos diferentes corantes nas fibras têxteis

e perdas para o efluente, permitidos pela Sociedade de Corantes e Colorações

Grau de fixação Perda para o efluente Classe de aplicação dos corantes Fibras (%) (%)

Ácidos Poliamida 89-95 5-20

Básicos Acrílico 95-100 0-5

Diretos Celulose 70-95 5-30

Dispersos Poliéster 90-100 0-10

Complexados com metal Lã 90-98 2-10

Reativos Celulose 50-90 10-50

Sulfurados Celulose 60-90 10-40

Vat Celulose 80-95 5-20

Fonte: O’NEILL et al. (1999)


15

Figura 3. Modelo de interação dos corantes reativos com a fibra têxtil

(Hao et al., 2000).


16

2.2.2. Perfil Ambiental

Em decorrência das tendências da moda e demanda do consumidor, o setor

industrial tem cada vez mais desenvolvido novos reagentes, novos processos,

maquinaria e técnicas para a confecção de seus produtos, colocando o ambiente

em contato com diversos tipos de poluentes; interrompendo assim o equilíbrio

natural, devido à recalcitrância de grande parte destes compostos (BALAN, 2005).

Embora, o destino dos poluentes no ambiente natural, seja largamente afetado

por processos abióticos, como foto-oxidação e atividade metabólica dos

microrganismos, estes processos são bastante lentos, podendo causar sérios

transtornos ecológicos (KNACKMUSS, 1996).

Os efluentes industriais são freqüentemente misturados com esgotos

sanitários antes de sua chegada à planta de tratamento do esgoto municipal, com

muitos municípios confiando predominantemente no processo de lodo ativado,

para a desintoxicação e mineralização do efluente, antes do mesmo ser lançado

no ambiente (COUGHLIN et al., 2003). O aporte de esgotos e rejeitos industriais

promove alterações significativas nas características físico-químicas dos

ambientes aquáticos (ANDRADE et al., 1998). Dessa maneira, inúmeros trabalhos

empregados na degradação dos corantes diz respeito à descoloração dos azo

corantes, que na sua grande maioria, são mais resistentes ao processo de

degradação (WALKER & WEARTHERLEY, 2000).

Do ponto de vista ambiental, as indústrias têxteis consomem grandes

volumes de água e substâncias químicas no processo de tingimento de seus

tecidos (ROBINSON et al., 2001). O impacto ambiental proveniente destas

indústrias ocorre principalmente, devido a sua descarga altamente colorida em


17

águas receptoras, que afeta principalmente a atividade de fotossíntese, devido à

baixa penetração da luz (DONMEZ, 2002, GEORGIOU et al., 2004).

Os efluentes das indústrias têxteis também apresentam altas concentrações

de compostos orgânicos, como amido, dextrinas, gomas, graxas, pectinas,

álcoois, ácido acético, sabões e detergentes; compostos inorgânicos como,

hidróxido de sódio, carbonato, sulfato e cloreto, além de corantes que contêm

metais pesados (CORREIA et al., 1994; ANDRADE et al., 1998, BALAN, 2005).

Em grandes concentrações, os metais pesados apresentam ação tóxica sobre os

microrganismos responsáveis pela decomposição da matéria orgânica, reduzindo

assim, a capacidade auto-depurativa dos corpos aquáticos (CID et al., 1995). Por

outro lado, a presença de alcalóides ou ácidos no processo de branqueamento,

engomagem e demais etapas na lavagem, resulta em um elevado pH e elevado

teor de sais (BUITRON et al., 2004).

Embora, o volume de corante produzido por uma indústria têxtil, a princípio,

possa parecer pequeno, o alto potencial de coloração destes compostos não pode

ser esquecido. A percepção pública da qualidade da água é fortemente

influenciada pela cor. Assim, a presença de cor não natural é esteticamente

desagradável e tende a ser associada com contaminação (NIGAM et al., 1996;

PEARCE et al., 2003; GONG et al., 2005). Alguns pesquisadores têm relatado

quantidades de 1,56 mg dm-3 do corante como sendo detectada nos cursos

d’água, embora concentrações tão baixas quanto 0,005 mg dm-3 sejam visíveis

em águas claras de rios (BANAT et al., 1996; O'NEILL et al., 1999)

particularmente nas regiões do espectro entre o vermelho e o púrpura (PIERCE,

1994).


18

Alguns requisitos importantes a serem observados pela indústria na escolha

do corante a ser utilizado diz respeito à estabilidade estrutural e a diversidade das

cores (CORREIA et al., 1994). Todavia, a quantidade do corante perdido é

dependente do tipo de corante, rota de aplicação e intensidade da tonalidade

requerida (PEARCE et al., 2003). Tal necessidade gera produtos que são de difícil

degradação biológica por causa da presença dos substituintes, como grupos

halógenos, sulfo, azo ou nitro (PAGGA & BROWN, 1986; NIGAM et al., 1996).

Segundo Kudlich et al. (1996) em algumas plantas convencionais de esgoto os

compostos aromáticos que apresentam grupos SO3H como substituintes,

freqüentemente resistem à biodegradação ou são degradados somente

parcialmente.

Por conseqüência, a remoção econômica destes poluentes é um problema

de grande importância, particularmente para os novos regulamentos da

comunidade européia, onde o tratamento dos efluentes industriais é obrigatório

(NIGAM et al., 1996; TRUNG et al., 2003). De acordo com sua nova legislação foi

restringido o uso de colorantes que não podem ser convertidos sob nenhuma

condição. Recentemente, o governo alemão proibiu a importação de produtos

têxteis, como por exemplo, couro e outros artigos coloridos, contendo azo

corantes, baseados em aminas carcinogênicas (PADMAVATHY et al., 2003;

VIJAYA & SANDHYA, 2003).

Segundo Castro (2003) a diretriz 2002/G1/CE do Parlamento Europeu, listou

2.500 substâncias azóicas em suspensão, embora apenas 100 delas tenham

apresentado uma das 22 aminas com propriedade carcinogênicas já conhecidas.

Com relação aos padrões de cor em diferentes estados, os mesmos podem

variar de localidade para localidade, baseado inicialmente na qualidade da água


19

de recepção (HAO et al., 2000). No Reino Unido, desde setembro de 1997,

concentração “zero” foi imposta para os compostos sintéticos liberados no

ambiente marinho. A execução desta lei assegurará que as indústrias têxteis

tratem seus efluentes coloridos a fim de mantê-los dentro do padrão exigido

(ROBINSON et al., 2001). Atualmente, o órgão regulador que aplica os padrões

governamentais, monitorando a poluição nos rios e administrando os recursos

d’água é a Agência Ambiental (PEARCE et al., 2003).

No Brasil, embora a legislação vigente não apresente restrição de cor para

padrões de lançamentos dos efluentes, existe um limite de cor nos corpos d’água

receptores de despejos, sendo que para a maioria deles, esse limite é de 75 mg-

Pt L-1 (TUNUSSI & ALEM SOBRINHO, 2002). E, embora as indústrias têxteis

tenham procurado tratar seus rejeitos no fim do processo de tinturaria, para

atender aos padrões estabelecidos; o contínuo processo de degradação do

ambiente é prova de que essa abordagem contém graves erros, sobretudo ao

supor que o ambiente pode tolerar determinado grau de poluição. Infelizmente,

esse tipo de atitude não reconhece que muitas vezes a poluição não pode ser

controlada e que a ênfase deve ser dada à prevenção (ZANONI & CARNEIRO,

2001).

No Brasil, a classe de corantes reativos tem sido motivo de grande

preocupação, devido sua intensa utilização na tinturaria do algodão,

principalmente, porque os resíduos deste corante podem ser altamente nocivos

quando presentes em qualquer organismo vivo. Estudos têm demonstrado que

estes compostos na forma não hidrolisada apresentam alta estabilidade em meio

neutro, permitindo um tempo de vida de até 50 anos em ambientes aquáticos

(GUARATINI & ZANONI, 2000).


20

2.2.3. Problemas Toxicológicos Associados aos Corantes

Apesar do grande percentual de resíduos gerados pelas indústrias ao redor

do mundo, informações disponíveis sobre a toxicidade causada pelo impacto

desses rejeitos nos ecossistemas aquáticos ainda são pouco difundidas. A

poluição dos corpos aquáticos a partir destes compostos, provoca alterações nos

ciclos biológicos, podendo causar toxicidade aguda e crônica às comunidades ali

presentes (BANAT et al., 1996).

Desta maneira, o Ecological and Toxicological Association of the Dyestuff

Manufacturing Industry (ETAD), um órgão internacional criado em 1974, tem

tentado minimizar os possíveis danos causados ao homem e ao meio ambiente,

através da fiscalização, durante a fabricação e aplicação dos corantes sintéticos

(ZANONI & CARNEIRO, 2001).

É importante ressaltar que os riscos crônicos dos corantes estão

relacionados principalmente às etapas de biotransformação, ou seja, a rota de

metabolismo dos organismos, que catalisados por enzimas específicas, podem

gerar compostos com propriedades carcinogênicas e mutagênicas, como por

exemplo, aminas aromáticas, toluidinas, benzidinas e radicais ativos, dentre

outros (KUDLICH et al., 1999; ZANONI & CARNEIRO, 2001).

No que diz respeito à saúde humana, os principais riscos toxicológicos dos

corantes sintéticos relacionados à saúde, estão intrinsecamente relacionados à

aplicação e tempo de exposição, ou seja, ingestão oral, sensibilidade da pele e

das vias respiratórias, etc. (GUARATINI & ZANONI, 2000). De acordo com alguns

órgãos existentes, como o EEA (European Environmental Agency) e UNEP

(United Nations Environment Programme), tem sido ressaltado que a maioria dos


21

mais de mil produtos químicos manufaturados e usados, não disponibilizam dados

de toxicidade e eco-toxicidade que avaliem seus riscos (PINHEIRO et al., 2004).

Dentre as diversas classes dos corantes, os compostos azo, em particular,

segue um metabolismo voltado para os processo de redução, envolvendo entre

outros, reações de hidroxilação e formação de aminas aromáticas incolores, como

principal produto da clivagem da ligação azo (BANAT et al., 1996; CHAGAS &

DURRANT, 2001; ONG et al., 2005). Entretanto, a redução da ligação azo

formando aminas aromáticas foi demonstrada em várias condições ecológicas,

inclusive no trato digestivo de mamíferos (CHUNG & CERNIGLIAB, 1992;

PINHEIRO et al., 2004).

Segundo Platzek et al. (1999) a formação de aminas carcinogênicas

formadas pela quebra do corante direto Azul 14 por bactérias isoladas da pele foi

observada. Por outro lado, a presença de 1-amino-2-naftol, produzido pela

clivagem redutiva do ácido Alaranjado 7, foi relatado como induzindo tumores de

bexiga (MENDEZ-PAZ et al., 2005a).

Os primeiros estudos com interesse nas aminas aromáticas carcinogênicas

expostas ao homem foram levantados ainda no século 19 na indústria de

manufaturamento de corantes (GUARATINI & ZANONI, 2000). Entretanto, ainda

hoje pouco se conhece sobre algumas aminas hidrofílicas, resultantes da

clivagem redutiva dos corantes (PINHEIRO et al., 2004).

Segundo a Agência Internacional em pesquisa de câncer tem sido incluído

alguns corantes baseados em benzidina, encontrados na categoria do grupo A e

oito corantes encontrados na categoria do grupo 2B, sendo alguns corantes azo

(PINHEIRO et al., 2004). A análise do grau de toxicidade oral dos corantes é

medida através da dose letal (DL50), ou seja, dose responsável por inibir 50% do


22

organismo teste. Desta maneira, estudos biocinéticos têm apresentado evidências

de que os azo corantes solúveis em água, se oralmente ingeridos são

metabolizados na microflora intestinal e excretados mais rapidamente do que os

compostos menos solúveis (GUARATINI & ZANONI, 2000).

Atualmente, a inibição da respiração bacteriana tem sido um dos métodos

aplicados para medir a toxicidade dos corantes (JARDIM et al., 1997). Outros

testes, no entanto, também podem ser aplicados, usando algas, células animais,

mamíferos e zooplâncton (KONSTANTINOU & ALBANIS, 2004). Segundo Chen

(2002) a toxicidade dos azo corantes e produtos intermediários parece estar

relacionada com a natureza degradadora do organismo. Para Donlon et al. (1997)

o azo corante mordente Alaranjado 1 foi redutivamente clivado em aminas

aromáticas menos tóxicas, durante um processo de metanogênese.

A biodegradação de compostos tóxicos inclui várias rotas de metabolismo,

tais como mineralização, hidrólise e co-metabolismo. Acredita-se que somente

10% dos microrganismos dentre o grupo de microrganismos que promovem a

degradação, conseguem completa mineralização dos produtos químicos (DONG

et al., 2003).

2.3. Tratamento dos Efluentes

Nas tinturarias têxteis, com tingimento e estamparia, os efluentes líquidos

apresentam altas cargas poluídoras, especialmente nos processos de

desengomagem e tingimento, apresentando altas cargas orgânicas, corantes e

demais produtos inorgânicos auxiliares (TUNUSSI & ALEM SOBRINHO, 2002).

Os efluentes do tingimento têxtil têm como características, pH elevado ou baixo,


23

elevada temperatura, alta concentração de material colorido (DANESHVAR et al.,

2003), elevada DQO (demanda química de oxigênio) (LIN & CHEN, 1997) e

elevada salinidade (LIN & LIN, 1993; SENAN et al., 2003). Os sólidos totais

variam de 1000 - 1600 mg L-1, enquanto o teor de sólidos em suspensão varia de

30 a 50 mg L-1 (BALAN, 2005).

O tratamento dos efluentes contendo corantes pode ser fundamentado em

dois processos básicos: remoção por técnicas que permitam eliminar os

compostos por transferência, a partir de suportes adequados, sem, no entanto

degradar os compostos coloridos, ou a degradação parcial ou completa, até

mineralização do corante (SLOKAR & Le MARECHAL, 1998).

Os processos de tratamentos adotados pelas indústrias têxteis que operam

por meio de sistemas físico-químico, seguido do tratamento biológico via lodo

ativado, embora apresente eficiência relativamente alta na remoção da cor (cerca

de 80%), apresenta como principal desvantagem à geração de lodo, considerado

crítico do ponto de vista ambiental, visto o percentual de corantes adsorvidos

(KUNZ et al., 2002; MAAS & CHAUDHARI, 2005), criando um problema de

disposição (GALINDO et al., 2001; ROBINSON et al., 2001).

Dentre os tratamentos físico-químicos, normalmente aplicados podemos

citar a coagulação e floculação (GOLOB et al., 2005), eletro-coagulação

(DANESHVAR et al., 2003), filtração por membrana (CIARDELLI et al., 2000),

destruição eletroquímica (LIN & CHEN, 1997), oxidação ou ozonização

(MUTHUKUMAR et al., 2005; MUTHUKUMAR et al., 2005a) radiação e adsorção

(AZMI et al., 1998), dentre outros. No entanto, esses métodos apresentam

algumas desvantagens, como por exemplo, a presença em excesso de produtos

químicos e o alto custo operacional (LIN & PENG, 1994; BANAT et al., 1996;


24

DANESHVAR et al., 2003). Por outro lado, os corantes reativos e ácidos solúveis

em água são os mais problemáticos, porque tendem a passar através dos

sistemas de tratamentos convencionais (AKSU, 2005).

Dessa maneira, um monitoramento cuidadoso é requerido antes que o

efluente tratado seja lançado nas vias fluviais (ROBINSON et al., 2001) e a

presença de possíveis aminas formadas se submetam a diluições cada vez

maiores, fazendo com que sua detecção e quantificação se torne cada vez mais

difícil (ALONSO & BARCELÓ, 2000; PINHEIRO et al., 2004).

2.3.1. Métodos Químicos

Os tratamentos químicos para os efluentes coloridos geralmente são

simples, sendo a oxidação o método mais comum. Em geral, o agente oxidante é

o peróxido de hidrogênio (H2O2), e o método, varia basicamente de acordo com a

forma com que este é ativado (SLOKAR & Le MARECHAL, 1998; ARSLAN-

ALATON & FERRY, 2002; MUTHUKUMAR et al., 2005).

A degradação oxidativa pelo cloro e ozônio são os processos químicos mais

comuns na remoção da cor, no entanto, a cloração tem a desvantagem de

produzir sub-produtos organoclorados (SARASA et al., 1998). Os processos de

oxidação avançados (POAs) podem atacar os compostos orgânicos de 106 - 109

vezes mais rapidamente do que os agentes de oxidação como o ozônio e o

peróxido de hidrogênio. No entanto, a ozonização catalítica é um POA com baixo

consumo de ozônio que descolore e mineraliza rapidamente corantes reativos de

efluentes têxteis coloridos (ARSLAN-ALATON et al., 2002; MENDEZ-PAZ et al.,

2005).


25

A ozonização não é um tratamento eficaz para os corantes de dispersão,

sendo eficaz somente em pH elevado. Por outro lado, o reagente Fenton’s que é

um processo bastante eficaz dentro de uma estreita faixa de pH (< 3,5), é

bastante útil na descoloração dos corantes de dispersão (HAO et al., 2000).

O método fotoquímico tem se mostrado importante como etapa primária na

degradação de alguns corantes, uma vez que os corantes sintéticos apresentam

alta estabilidade quando submetidos à luz visível ou ultravioleta (GUARATINI &

ZANONI, 2000). Neste processo, a degradação é causada pela produção de altas

concentrações de radicais hidróxilas. A vantagem desse tipo de tratamento em

efluentes coloridos, é que não há produção de lodo e odores fétidos são

geralmente reduzidos (ROBINSON et al., 2001). A aplicação do fotocatalisador

TiO2 tem sido utilizada na destruição de compostos orgânicos desde a década

passada (JARDIM et al., 1997), tendo sido largamente usado, devido sua

disponibilidade, baixo custo e não toxicidade (KONSTANTINOU & ALBANIS,

2004). No entanto, os processos fotocatalíticos são limitados às unidades de

tratamentos, devido à baixa penetração de irradiação UV nos efluentes altamente

coloridos (VANDEVIVERE et al., 1998).

Outra medida alternativa também utilizada no processo de descoloração é o

processo de eletrólise do corante. Neste sistema, a degradação da molécula é

dissociada eletroquimicamente através de potencial ou corrente controlada, ou

através de reagentes secundários gerados eletroquimicamente. Todavia, o alto

custo com a energia utilizada, além da produção de reações paralelas, tais como

cloro, radicais hidróxila e outras reações indesejáveis, têm reduzido a sua

aplicação (GUARATINI & ZANONI, 2000).


26

2.3.2. Métodos Físicos

A adsorção encontra-se entre os processos físicos mais utilizados (HUANG

& SHU, 1995; OZDEMIR et al., 2004). Esta técnica se baseia na remoção do

corante através da passagem da amostra em carvão ativado, sílica gel, bauxita,

resinas de trocas-iônica, etc. (GUARATINI & ZANONI, 2000). No entanto, o custo

com a recuperação destes adsorbentes são caros; e por isso, muitos

pesquisadores têm buscado a aplicação de materiais alternativos mais

econômicos e eficientes tais como, talo de girrassol (SUN & XU, 1997), casca de

eucalipto (SALIBA et al., 2002), bagaço de cana-de-açúcar (CHANDRAN et al.,

2002), quitosana (UZUN, 2006) e quitina (LONGHINOTTI et al., 1998), dentre

outros.

O carvão ativado é o sorbente mais popular e extensamente usado no

tratamento de efluentes têxteis, devido a sua estrutura porosa (AKSU, 2005).

Embora seja uma técnica extremamente efetiva na remoção da cor,

principalmente em volumes de pequena escala, é um método lento, com custo

relativamente alto (AZMI et al., 1998; GUARATINI & ZANONI, 2000; GONG et al.,

2005). A aplicação de membranas especiais, tais como nanofiltração e osmose

reversa, também tem sido proposta. Esta técnica permite o tratamento de grandes

volumes, de modo rápido e satisfatório, porém o elevado custo e a limpeza das

membranas tem se mostrado como a principal desvantagem (GUARATINI &

ZANONI, 2000).

Com relação à coagulação e floculação, sua aplicação tem permitido uma

remoção satisfatória da cor em grandes volumes de efluentes (AZMI et al., 1998;

GOLOB, et al., 2005). Esta técnica, quando associada a polieletrólitos e/ou


27

floculantes inorgânicos, como sais de ferro e alumínio, apresenta resultados

satisfatórios, como tratamento terciário no efluente têxtil. Entretanto, para se obter

uma alta eficiência, normalmente se utiliza polieletrólitos (Al2(SO4)3) e amônia em

excesso, que por sua vez acarreta a presença de resíduos tóxicos ao efluente

(COPPER, 1993).

2.3.3. Métodos Biológicos

Dentre as opções mais econômicas e viáveis para o tratamento dos

efluentes coloridos, os sistemas biológicos se apresentam como os mais práticos

e de baixo custo (MENDEZ-PAZ et al., 2005). Entretanto, os mecanismos

biológicos podem ser bastante complexos (FORGACS et al., 2004).

Inicialmente foi bem relatado que a descoloração dos corantes normalmente

ocorre pela redução ou clivagem da ligação azo anaerobicamente, resultando em

compostos incolores ou aminas aromáticas (KODAM et al., 2005). As aminas

aromáticas por sua vez, são bastante estáveis em ambientes anaeróbicos e sua

completa mineralização ocorre apenas sob condições aeróbicas (MENDEZ-PAZ

et al., 2005a).

Assim, para superar a problemática da recalcitrância dos azo corantes sob

condições anôxicas, alguns pesquisadores tem utilizado duas fases durante o

processo de descoloração (O’NEILL et al., 2000). Neste processo, a remoção do

grupo azo ocorre sob condições anaeróbicas, enquanto os compostos aminados

resultantes são bons substratos para a degradação aeróbica (PEARCE et al.,

2003). Segundo Kudlich et al. (1997) a completa mineralização do azo corante


28

sulfurado mordente Amarelo 3 foi alcançada usando Sphingomonas sp. BN6, co-

imobilizadas em contas de alginato.

O uso de processos exclusivamente aeróbicos na descoloração dos azo

corantes não é comum, sendo assim, pouco se conhece dos microrganismos

quanto a sua habilidade de clivagem redutiva nas ligações azo, sendo as reações

extremamente de substrato específico (BLUMEL et al., 1998; COUGHLIN et al.,

2003). Segundo He et al. (2004) culturas mistas têm se mostrado eficientes na

descoloração de alguns corantes azo. Para Nigam et al. (1996) a utilização de

uma cultura bacteriana mista foi responsável por aproximadamente 80% da

remoção da cor em amostras de efluentes contendo misturas de corantes reativos

azo e diazo.

Segundo Forgacs et al. (2004) a utilização de consórcios microbianos

oferece consideráveis vantagens quando comparadas ao uso de culturas puras,

visto que as espécies individuais podem atacar a molécula do corante em

diferentes posições ou podem ainda, usar os produtos de degradação produzidos

por uma dada espécie, numa degradação adicional.

Por outro lado, uma rota a ser explorada diz respeito aos microrganismos

termotolerantes e/ou termofílicos em sistemas de descoloração, uma vez que

diversos efluentes têxteis são produzidos em altas temperaturas (50 - 60oC),

mesmo após refrigeração. Assim, a aplicação de microrganismos termotolerantes

pode reduzir custos significativos, como a remoção de resfriadores,

proporcionando tratamento imediato (BANAT et al., 1996).


29

2.3.3.1. Biodegradação dos Corantes por Bactérias

O metabolismo de compostos aromáticos por bactérias tem sido bem

documentado. Entre os gêneros mais comumente observados, pode-se citar

Achromobacter, Acinetobacter, Aeromonas, Alcaligenes, Bacillus, Beijerinckia,

Corynebacterium, Flavobacterium, Moraxella, Mycobacterium, Nocardia,

Pseudomonas, Vibrio e Xantobacter (BARBIERI, 1997).

Devido à recalcitrância dos compostos aromáticos no ambiente, seu

desaparecimento pode ocorrer por diversos processos abióticos. A biodegradação

representa a principal rota pela qual esses compostos são removidos do ambiente

e sua eficiência encontra-se, sobretudo, no número de anéis aromáticos da

molécula (BARBIERI, 1997) e grupos heterocíclicos (OZDEMIR et al., 2004).

Ainda que, diversos grupos de pesquisadores tenham demonstrado a

habilidade de alguns fungos, principalmente os fungos da podridão branca, na

descoloração e degradação dos corantes têxteis, o longo ciclo de crescimento e

moderadas taxas de descoloração limitam o desempenho desses microrganismos

(BANAT et al., 1996; McMULLAN et al., 2001). Por outro lado, a descoloração

bacteriana geralmente ocorre mais rápida, com elevadas taxas de descoloração

(HAUG et al., 1991).

Os processos de biodegradação podem ser anaeróbicos, aeróbicos ou

envolver uma combinação dos dois (PEARCE et al., 2003). Entretanto, o completo

mecanismo que envolve a descoloração dos azo corantes pelos microrganismos

ainda é pouco conhecido (MAAS & CHAUDHARI, 2005). Acredita-se que pelo

menos dois mecanismos estejam envolvidos. O primeiro seria a transferência

direta de elétrons para os azo corantes como aceptor final de elétrons via rota


30

enzimática, durante o catabolismo bacteriano, ligado a geração de ATP

(conservação de energia) e o segundo seria uma redução gratuíta na molécula do

azo corante por produtos terminais do catabolismo bacteriano, não ligado à

geração de ATP (PEARCE et al., 2003). Outro possível mecanismo de remoção

envolveria a redução das ligações azo, pela redução de compostos inorgânicos,

como Fe2+ ou H2S, formados como produtos finais de certas reações anaeróbicas

nos metabólitos bacterianos (KUDLICH et al., 1997).

Para Stolz (2001) estas reações espontâneas permitem que vários

processos não específicos de redução, orientados principalmente por potenciais

redox ou mediadores redox e compostos azo ocorram durante a degradação da

molécula do corante. Isto ocorre, principalmente, porque é improvável que altas

cargas do corante contendo enxofre e alto peso molecular, possam atravessar a

membrana celular (KECK et al., 1997; RUSS et al., 2000). Assim, a atividade

redutora pode não ser dependente da captação intracelular do corante (PEARCE

et al., 2003).

Segundo Kudlich et al. (1997) a adição de quinonas em um sistema

contendo azo corantes e Sphingomonas xenophaga BN6 agiram como

mediadores redox, sendo então reduzidas enzimaticamente por S. xenophaga

BN6, enquanto as hidroquinonas formadas, reduziram os azo corantes no

sobrenadante da cultura numa reação redox puramente química.

Com relação à descoloração anaeróbica, a redução bacteriana é

relativamente não específica com relação aos compostos azo envolvidos, sendo

assim de maior aplicação na remoção da cor dos azo corantes presentes nos

efluentes coloridos. Por outro lado, em processos aeróbicos, após um período de

adaptação, as bactérias sintetizam azoredutases específicas, que sob condições


31

controladas reduzem e quebram os grupos azo na presença do oxigênio (STOLZ,

2001). Isto foi observado por Wong & Yuen (1996) quando relataram à

descoloração e biodegradação do azo corante Vermelho de Metila sob condições

aeróbicas usando Klebsiella pneumoniae. Sarnaik & Kanekar (1999) também

descreveram a mineralização aeróbica dos corantes Trifenilmetano e Metil Violeta

por Pseudomonas mendocina MCM-402.

A descoloração anaeróbica envolve uma reação de oxido-redução com

hidrogênio no lugar do oxigênio molecular livre nos sistemas aeróbicos

(ROBINSON et al., 2001). Tipicamente, a quebra da molécula forma metano e

sulfeto de hidrogênio. Os azo corantes atuam como agentes oxidantes na redução

de flavina nucleotídeo na cadeia transportadora de elétrons microbiana, sendo

então reduzidos e descoloridos simultaneamente. Para que esta redução ocorra,

carbono adicional é requerido e então convertido a metano e gás carbônico,

liberando assim os elétrons. Estes elétrons ao entrarem na cadeia respiratória,

requerem um aceptor final de elétrons, que neste caso, é o azo corante reativo.

Quando os elétrons reagem com o corante, reduz a ligação azo, causando a

descoloração (CARLIELL et al., 1996).

Para que este mecanismo de redução ocorra, as bactérias têm que

estabelecer uma ligação entre o seu sistema de transporte de elétrons intracelular

e a molécula do corante de alto peso molecular. Para que esta ligação seja

estabelecida, os componentes transportadores de elétrons devem estar

localizados na membrana exterior das células bacterianas; no caso de bactérias

Gram-negativas, elas podem estabelecer contato direto com o substrato contendo

o azo corante ou um mediador redox através de sua superfície celular (MYERS &

MYERS, 1992). Por outro lado, o baixo peso molecular do mediador redox pode


32

agir como transportador de elétron entre o azo corante e as azoredutases

dependentes de NADH, situadas na membrana exterior (PEARCE et al., 2003).

Keck et al. (1997) demonstraram que certos compostos baseados em

quinonas formados durante o metabolismo de substratos específicos, se

comportaram como mediadores redox entre a molécula do corante e a membrana

bacteriana. A adição de mediadores redox sintéticos, como por exemplo,

antraquinonas sulfuradas, mesmo em baixas concentrações, facilita a redução

não enzimática dos azo corantes dentro do ambiente extracelular (YOO et al.,

2001). Entretanto, se este ambiente for aeróbico, este mecanismo de redução

pode ser inibido pelo oxigênio, devido à oxidação preferencial de redução do

mediador redox pelo oxigênio no lugar do azo corante (PEARCE et al., 2003).

Para Kudlich et al. (1997) a atividade azoredutase ligada à membrana e

mediada pelo composto redox, é diferente das azoredutases solúveis no

citoplasma, responsáveis pela redução do corante não sulfurado, que penetra na

membrana da célula. Assim, as azoredutases ligadas à membrana e as

azoredutases citoplasmáticas são dois sistemas enzimáticos diferentes.

A Figura 3 mostra um mecanismo proposto para a redução dos azo corantes

através de mediadores redox dependentes, em células bacterianas quando

incubadas sob condições anaeróbicas. Embora, a redução final do azo corante

nas células do sobrenadante seja uma reação química redox dominante, os

mediadores redox dependem de enzimas redutoras citoplasmáticas para prover

elétrons. Também, é possível que esta reação química redox trabalhe em

conjunto com reações enzimáticas envolvendo as azoredutases, que podem ser

enzimas desidrogenases, sintetizadas ao longo do citoplasma e segregadas sem

acúmulo dentro da célula (PEARCE et al., 2003).


33

Com relação à descoloração aeróbica, durante os últimos anos, diversas

espécies bacterianas têm sido citadas como responsáveis por mecanismos de

redução, contribuindo assim para a descoloração de alguns corantes. A

habilidade das bactérias em crescer na presença de simples compostos azo

carboxilados como única fonte de carbono e energia, foi primeiramente

demonstrada por Overney em 1979, ao isolar Flavobacterium sp. que crescia

aerobicamente na presença de 4,4’dicarboxiazobenzeno (STOZ, 2001).

Solução colorida contendo aminas

Figura 4. Mecanismo proposto para a redução dos azo corantes pelas

células bacterianas (Pearce et al., 2003).

Solução incolor

Contendo aminas Solução colorida

Contendo o corante


34

O metabolismo aeróbico redutor dos azo corantes requer enzimas

específicas, chamadas de azoredutases aeróbicas, que catalisam estas reações

na presença do oxigênio molecular. Segundo Zimmermann et al. (1982) as

azoredutases aeróbicas que clivaram o composto carboxil Alaranjado II,

produzidas pelas espécies K22 e KF46, foram caracterizadas e comparadas a

outras enzimas.

Durante o processo de descoloração, a disponibilidade de uma fonte

adicional de energia é sugerida como uma ferramenta que pode facilitar a

degradação dos corantes (KAPDAN et al., 2000). Tais transformações,

denominadas co-metabólicas, envolvem a clivagem da molécula xenobiótica,

seguida de reações espontâneas que levam a mineralização do composto

(KNACKMUSS et al., 1996; STOLZ, 2001). Isto foi observado em uma espécie

bacteriana não identificada e o corante ácido Alaranjado 7 (COUGHLIN et al.,

1997). Pseudomonas sp., também foi capaz de utilizar o mesmo composto, como

única fonte de carbono e energia para seu crescimento (ZIMMERMANN et al.,

1982; HAO et al., 2000).

Segundo Sumathi & Manju (2000) dentre as fontes de carbono mais

utilizadas, a glicose é um monossacarídeo capaz de promover expressiva

descoloração. Carliell et al. (1996) observaram que a descoloração sob condições

anaeróbicas de alguns azo corantes reativos solúveis em água era alcançada

usando a glicose como fonte de carbono. Wong & Yuen (1996) também relataram

a degradação do azo corante Vermelho Metil, utilizando K. pneumoniae RS-13, na

presença de 0,5-5,0 g L-1 de glicose.

Como forma alternativa e possível minimização dos custos de produção,

outras fontes de energia têm sido testadas no processo de descoloração dos


35

corantes. Dentre elas, podemos citar o amido de tapioca, que realçou a remoção

de três diferentes corantes sintéticos (CHINEWITVANICH et al., 2000) e um meio

contendo melaço e Candida tropicalis que descoloriu os corantes têxteis Azul

remazol, Preto e Vermelho reativo (Donmez, 2002).

A reação de sinergismo de um consórcio bacteriano contendo Pseudomonas

sp. e um fungo da podridão branca, usando o azo corante direto Fast Scarlet 4BS

como única fonte de carbono, alcançou descoloração de quase 100% logo nas

primeiras 24 horas de incubação (HE et al., 2004). A atividade catabólica dos

microrganismos em consórcios mistos serve de complemento para a outra cultura

e assim, interações sintróficas presentes nas comunidades mistas, podem

conduzir à completa mineralização dos azo corantes (KNACKMUSS, 1996;

PEARCE et al., 2003).

Um outro fato a ser considerado na degradação dos azo corantes diz

respeito a configuração da molécula. Zimmermann et al. (1982) relataram uma

taxa decrescente de redução da cor, quando um sistema de enzimas correu com

um substrato, estabilizado na forma hidrazona via ligação de hidrogênio,

sugerindo que a configuração da molécula do substrato é importante para a

reação enzimática. De acordo com Kudlich et al. (1999) derivados naftalenos

mono e disulfurados com um grupo hidroxi na posição “ortho” do grupo amino,

são os produtos de redução de uma ampla escala de azo corantes.

Segundo Hao et al. (2000) a posição “para” do corante ácido Alaranjado 20 é

facilmente descolorido por Pseudomonas sp., quando comparado com a posição

“ortho” do corante ácido Alaranjado 7. Por outro lado, inúmeras aminas formadas

durante a redução anaeróbica dos azo corantes (normalmente encontradas na

posição ortho-aminohidroxinaftaleno) são menos estáveis sob condições


36

aeróbicas, se submetendo facilmente a reação de auto-oxidação e assim, não

sendo completamente mineralizadas (STOLZ, 2001).

2.3.3.2. Biosorção pela Biomassa Microbiana

A sorção é considerada o primeiro mecanismo de remoção de muitos

corantes nos sistemas de tratamentos biológicos aeróbicos (BASIBUYUK &

FORSTER, 2003). O termo “biosorção” é usado para indicar um número de

processos independentes do metabolismo (adsorção física e química, interações

eletrostáticas, troca de íons, complexação, quelação e microprecipitação) que

ocorre essencialmente na parede celular (ROBINSON et al., 2001; AKSU, 2005).

A biosorção tende a ocorrer em um intervalo razoavelmente rápido, ou seja,

alguns minutos para as algas e algumas horas para as bactérias (HU, 1996).

A parede celular das bactérias consiste essencialmente de vários compostos

orgânicos, incluindo quitina, polissacarídeos acidificados, lipídeos, aminoácidos e

outros componentes celulares que mantêm a capacidade de adsorção dos

poluentes orgânicos (AKSU & YENER, 1998).

Nos últimos anos, a biomassa das bactérias, leveduras e fungos tanto

inativada como viva, tem sido usada com a finalidade de descolorir os efluentes

coloridos. O fato dos corantes têxteis apresentarem diversas variações em sua

estrutura química, bem como diferentes interações com os microrganismos,

depende basicamente da química, em particular do corante, química específica da

biomassa microbiana e condições ambientais (POLMAN & BRECKENRIDGE,

1996; AKSU, 2005). Por outro lado, certos corantes específicos apresentam

particular afinidade em suas ligações com as espécies microbianas (ROBINSON


37

et al., 2001). Isso foi observado com a superfície bacteriana carregada

negativamente, que pode adsorver cátions de metal em solução (WIGTMAN &

FEIN, 2004).

Segundo Chu & Chen (2002), a adsorção de corantes básicos através da

biomassa de lodo ativado, demonstrou que a biomassa não apresentava

nenhuma afinidade com os corantes aniônicos e não-aniônicos selecionados

(direto Alaranjado 39 e direto Vermelho 83, disperso Violeta 8 e disperso Amarelo

54). Entretanto, a biomassa pôde interagir com os corantes catiônicos sob as

mesmas condições.

A capacidade de adsorção máxima indica uma correlação entre a estrutura

química e o comportamento do adsorbente, ou seja, a basicidade e o peso

molecular. Basibuyuk & Forster (2003) citaram que a principal razão para a baixa

capacidade de adsorção dos corantes ácidos aniônicos é a carga elétrica negativa

do lodo ativado em pH normal, condicionando a repulsão entre os íons

carregados negativamente do sorbante (corante) e a superfície carregada

negativamente do sorbente (biomassa), bem como o número de grupos sulfos

presentes no corante ácido que também reduz a adsorção do corante.

Com relação à capacidade de remoção da biomassa, o uso de células

microbianas inativadas no processo de biosorção é mais vantajoso no tratamento

da água, porque a biomassa microbiana não é afetada pela toxicidade do corante,

não requer fonte contínua de nutrientes e pode ser regenerada e reutilizada por

vários ciclos (ROBINSON et al., 2001). Estas células apresentam ainda melhor

remoção, quando comparadas às células vivas, devido ao aumento da área de

superfície.


38

As bactérias Gram-negativas apresentam maior capacidade de adsorção

quando comparadas as bactérias Gram-positivas, visto o elevado índice de

lipídeos em sua parede celular (AKSU, 2005). Um outro componente também

importante nas células Gram-positivas é a presença dos ácidos teicoicos e ácidos

associados à parede celular, cujos grupos fosfato são componentes chave na

remoção dos metais (COSTA & DUTA, 2001).

Hu (1996) estudando a biosorção de alguns corantes com biomassa de

Aeromonas sp., observou adsorção máxima de 114-146 mg g-1 quando a

concentração inicial do corante era 200 mg g-1. Polman & Breckenridge (1996),

testando 30 espécies de fungos, leveduras e bactérias na remoção de alguns

corantes reativos e sulfurados, com biomassa viva e morta, observaram que 71%

dos microrganismos foram mais eficientes em se ligar na forma inativada do que

na forma viva. Resultados semelhantes foram observados por Evangelista-Barreto

et al. (2005), ao estudarem a descoloração do azo corante Alaranjado II com

biomassa de Phanerochaete chrysosporium (UCP 593). É provável que isto tenha

ocorrido devido ao aumento da área de superfície, causada pela ruptura da célula

no momento da inativação.

Vale salientar ainda que, no caso da biomassa viva, a biosorção pode ser

um pré-requesito para a biotransformação, pois a passagem do corante para o

interior da célula pode ser uma condição necessária para o processo de

metabolização intracelular. Desta maneira, pode ocorrer interferência na taxa de

descoloração devido à barreira causada pela superfície celular (MAAS &

CHAUDHARI, 2005).

Aksu & Tezer (2000), estudando a biomassa seca de Rhizopus arrhizus na

remoção do corante reativo aniônico Preto B em solução aquosa, propuseram que


39

a biosorção resulta da interação entre os grupos ativos na superfície das células

do fungo e o corante.

Desta maneira, a biomassa bacteriana poderia ser usada como um

adsorbente de origem biológica na remoção de baixas concentrações de

compostos orgânicos perigosos nos efluentes, uma vez que os poluentes

hidrofóbicos apresentam maior tendência de acúmulo nas células microbianas ou

lodo ativado (SUMATHI & MANJU, 2000; AKSU, 2005).

2.4. Geobacillus stearothermophilus

Microrganismos adaptados para crescer em elevadas temperaturas (60 -

108°C) têm sido isolados de habitat’s terrestres e marinhos (BERTOLDO &

ANTRANIKIAN, 2002). A família Bacillaceae é constituída por diversos

microrganismos formadores de esporos, destacando-se entre eles o gênero

Bacillus. Este gênero compreende bastonetes Gram-positivos ou variáveis,

formadores de endosporos que podem estar localizados na posição central,

terminal e sub-terminal. A parede celular destes microrganismos é constituída por

peptideoglicano com características antifagocitárias, no qual muitos estudos

consideram uma das principais chaves de sua virulência (MYRVIK & WEISER,

1988).

A família Bacillaceae é constituída por gêneros como Alicyclobacillus,

Paenibacillus, Brevibacillus, Salibacillus, Aneurinibacillus, Gracilibacillus,

Ureibacillus, e mais recentemente, Geobacillus. O gênero Geobacillus apresenta

características de microrganismos extremófilos com temperatura ótima de

crescimento em torno de 60ºC e 80ºC (BERTOLDO & ANTRANIKIAN, 2002),


40

aeróbios ou anaeróbios facultativos, podendo ser encontrado em ambientes bem

diversificados, apresentando ainda grande potencial no tratamento de ambientes

contaminados por resíduos recalcitrantes (MARCHANT et al., 2003).

De acordo com a temperatura de crescimento e alterações ambientais, os

bacilos podem se apresentar como microrganismos mesófilos e termofilicos

(MYRVIK & WEISER, 1988). Bacillus subtilis e Bacillus sthearothermophilus

(atualmente classificado como Geobacillus) são bastante conhecidos por servirem

de controle de qualidade em testes de esterilização com óxido de etileno e vapor.

Neste gênero, os microrganismos são capazes de sobreviver em condições

bastante adversas, como dessecação, temperatura, pH, etc., devido a sua

capacidade de produzir esporos resistentes e crescerem em temperaturas

elevadas (40 - 70ºC) (NG & SCHAFFNER, 1997). Estes microrganismos se

apresentam ainda como sendo fenotipicamente heterogêneo, com seus membros

exibindo uma escala extremamente ampla com relação ao requerimento

nutricional, condições de crescimento e diversidade metabólica (SOUZA &

MARTINS, 2001).

Com relação à atividade enzimática dos microrganismos termofílicos e

hipertermofílicos, eles além de representar fontes ideais de muitas enzimas

(MORANA et al., 2002), apresentam grande importância quanto às enzimas

mesofílicas, devido à correlação entre a termoestabilidade e o aumento da

resistência à desnaturação (EWIS et al., 2004). Bertoldo & Antranikian (2002)

relataram que enzimas que hidrolisam o amido são abundantes nos

microrganismos extremófilos, sugerindo que as mesmas exercem um importante

papel em seu metabolismo. As enzimas termoestáveis que hidrolisam o amido


41

tais como amilase, pululanases e glicoamilases são de grande importância na

indústria de alimentos, química e farmacêutica.

De acordo com a literatura, G. stearothermophilus tem sido citado como

responsável pela produção de diversas enzimas termoestáveis. Ben Ali et al.

(1999) realizando um estudo com α-amilase isolada de G. stearothermophilus na

hidrólise do amido, encontraram como os principais produtos formados,

maltohexose e maltopentose. Ewis et al. (2004), também trabalhando com este

microrganismo, isolaram e caracterizaram duas esterases termoestáveis,

designadas de Est55 e Est30.

Uma outra característica de G. stearothermophilus que evidência seu

potencial biotecnológico, é que este microrganismo contém pelo menos três

oxidases terminais em sua cadeia respiratória, ou seja, citocromo oxidase c tipo

caa3, oxidase quinol tipo-bd e citocromo oxidase c-551 tipo-b(o/a3 (SONE et al.,

1999).

2.5. Pseudomonas aeruginosa

O gênero Pseudomonas compreende um grande número de espécies (em

torno de 100) de bacilos Gram-negativos, normalmente diferenciados por meio de

provas bioquímicas, testes de sensibilidade a antibióticos, formação de pigmento,

número e localização dos flagelos (TOLEDO & TRABULSI, 1999). Os membros

deste gênero são os microrganismos freqüentemente mais isolados em corpos

aquáticos. Entretanto, sua presença não necessariamente indica possível risco à

saúde pública. No entanto, P. aeruginosa tem sido utilizada na análise de águas


42

recreacionais, devido sua resistência à desinfecção química (TORANZOS &

McFETERS, 1996).

Pseudomonas aeruginosa é um dos microrganismos mais ubiquitários, ou

seja, é encontrada no solo, na água, em vegetais, animais, alimentos e nos mais

diversos ambientes hospitalares. Considerada como patógeno oportunista, é um

dos mais importantes agentes de infecção hospitalar (LINCOPAN & TRABULSI,

2004).

Taxonomicamente, P. aeruginosa pertence à família Pseudomonadaceae,

classificada no grupo de homologia rRNA I, especificamente no grupo

fluorescente. Microscopicamente a bactéria é definida como um bacilo Gram-

negativo reto, de 0,5-0,7 µm de espessura por 1,5-3,0 µm de comprimento, não

esporulado, móvel por um único flagelo polar (LINCOPAN & TRABULSI, 2004).

De acordo com sua fisiologia, é classificada como uma bactéria aeróbica,

podendo crescer anaerobicamente na presença de nitrato, sendo então usado

como aceptor final de elétron. Embora a espécie seja quimiorganotrófica, a

obtenção de energia a partir de carboidratos implica num metabolismo oxidativo

(dependente de O2), não fermentador. Como alternativa, pode usar outras fontes

de carbono como, por exemplo, o acetato. Esta versatilidade no requerimento

nutricional e energético lhe permite crescer rapidamente em diferentes meios de

cultura e numa ampla faixa de temperatura (4 - 42oC) (LINCOPAN & TRABULSI,

2004), sendo potencialmente capaz de degradar mais de 100 compostos

orgânicos diferentes (BARBOSA & TORRES, 1998).

Uma das características mais destacadas dessa espécie é a sua capacidade

em produzir pigmentos hidrossolúveis, um de cor azul, denominado piocianina

(TOLEDO & TRABULSI, 1999) e outro esverdeado, denominado pioverdina


43

(LINCOPAN & TRABULSI, 2004). Outros pigmentos também podem ser

observados com menor freqüência, como piomelanina (castanho) e piorrubina

(vermelho). Esta observação, assim como a produção de odor característico de

frutas, produto da aminoacetofenona liberada pelo microrganismo, é uma

característica de grande importância na sua identificação. Outra característica

destacável é a formação, em meios de cultura líquido e sólido, de uma camada de

aspecto mucóide denominada “slime”, importante na formação de biofilmes

(LINCOPAN & TRABULSI, 2004).


44

3. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

ABIQUIM. Associação Brasileira da Indústria Química. Corantes e pigmentos.

2005. Disponivel em: <http://www.abiquim.org.br/canais.asp?id=15> Acesso em: 11 jan 2005.

ABIQUIM. Associação Brasileira da Indústria Química. Corantes e pigmentos.

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61

PRIMEIRO ARTIGO

Descoloração do Azo Corante Alaranjado II por Geobacillus

stearothermophilus (UCP 986) sob Condições de Co-metabolismo

Manuscrito a ser submetido para publicação no periódico

International Biodeterioration and Biodegradation


62

Descoloração do Azo Corante Alaranjado II por Geobacillus

stearothermophilus (UCP 986) sob Condições de Co-metabolismo

Norma S. Evangelista-Barretoa, Clarissa D. Albuquerqueb, Regine Helena

S.F. Vieirac, G.M. Campos-Takakid*

aPrograma de Pós-graduação em Ciências Biológicas, Universidade Federal de

Pernambuco, Av. Professor Moraes Rego s/n, Cidade Universitária, 50.670-901

Recife, PE, Brasil e Núcleo de Pesquisa em Ciências Ambientais, Universidade

Católica de Pernambuco, Rua Nunes Machado, 42, Boa Vista. 50.050-590,

Recife, PE, Brasil. E-mail: [email protected]

bDepartamento de Estatística e Informática e Núcleo de Pesquisa em Ciências

Ambientais, Universidade Católica de Pernambuco, Rua Nunes Machado, 42, Boa

Vista. 50.050-590, Recife, PE, Brasil. E-mail: [email protected]

cDepartamento de Engenharia de Pesca e Instituto de Ciências do Mar-

LABOMAR, Universidade Federal do Ceará, Av. Abolição, 3207, Meireles, 60.165-

081, Fortaleza, CE, Brasil. E-mail: [email protected] *dDepartamento de Química e Núcleo de Pesquisa em Ciências Ambientais,

Universidade Católica de Pernambuco, Rua Nunes Machado, 42, Boa Vista.

50.050-590, Recife, PE, Brasil. Tel.: +55-81-2119.4017 Fax: +55-81-2119.4043.

E-mail: [email protected]

Parte dos resultados foram publicados no livro de resumos do 2nd International

Symposium in Biochemistry of Macromolecules and Biotechnology-SBBq. UFPE-

Recife-PE (17-19/11/2004)


63

RESUMO

A descoloração do azo corante Alaranjado II usando Geobacillus

stearothermophilus (UCP 986), foi realizada sob diferentes condições de cultivo,

de acordo com um planejamento fatorial 24, que teve como variáveis

independentes, a agitação, concentração do corante, tamanho do inóculo e meio

de cultura, e como variável resposta, a descoloração do corante. O experimento

foi realizado por 24 h a 50ºC. Nestas condições, observou-se que o meio Luria

Bertani (LB) e a agitação aumentaram a eficiência de descoloração, com remoção

da cor de 96-98%, quando comparado ao meio extrato de levedura-peptona (YP)

(43-61%). A eficiência do meio LB na redução da cor se deve ao processo de co-

metabolismo, pela presença da glicose, que foi consumida com 15 h de cultivo. O

pH do meio variou de 5,0 a 6,5. Ácido sulfanílico, uma amina formada durante a

clivagem do azo corante, não foi encontrada. Bioensaios usando Artemia salina

mostraram que metabólitos mais tóxicos que o composto pai, não foram

formados, com exceção do ensaio 13 (meio LB, corante 0,050 mM, inóculo 1 mL e

agitação 150 rpm), que apresentou uma CL50 de 49,28% v.v-1. Os resultados

obtidos demonstram que as variáveis meio e agitação são significativas no

processo de descoloração do Alaranjado II e que G. stearothermophilus (UCP

986) apresenta grande potencial biotecnológico na descoloração de corantes

têxteis, em condições de co-metabolismo.

Palavras-chave: Geobacillus stearothermophilus, biodegradação, corante têxtil,

toxicidade, co-metabolismo.


64

Introdução

Os azo corantes são extensamente usados na indústria de acabamento têxtil,

constituindo aproximadamente 50% dos corantes produzidos e assim, tendo

grande interesse no tratamento de efluentes aquáticos (Manu & Chaudhari, 2003;

Sponza & Isik, 2004). A elevada solubilidade destes compostos resulta em baixa

fixação da cor durante o processo de tingimento, lançando alta descarga colorida

diretamente no ambiente (Oxpring et al., 1996; Panswad & Luangdilok, 2000).

Devido à natureza sintética dos corantes e sua estrutura química complexa, as

moléculas dos corantes permanecem por longos períodos na natureza. Os azo

corantes constituem a maior classe de corantes sintéticos, sendo caracterizados

por sua típica ligação -N=N- (Manu & Chaudhari, 2003). Estes compostos

recalcitrantes podem causar sérios problemas ambientais, devido à formação de

compostos carcinogênicos ou mutagênicos.

No ambiente natural, os azo corantes podem ser transformados ou degradados

por uma variedade de microrganismos, incluindo bactérias e fungos aeróbios e

anaeróbios (Banat et al., 1996; Chang & Kuo, 2000), sob condições mesófilas

(Chen, 2002) ou termofílicas (Banat et al., 1997). Os microrganismos são

particularmente úteis na degradação dos corantes, porque apresentam

capacidade de clivagem redutiva nas ligações azo, fato este geralmente

associado às enzimas azoredutases (Kunz et al., 2002). As bactérias têm sido

citadas como uma aplicação promissora no tratamento de efluentes têxteis,

devido aos custos de investimento que são de cinco a vinte vezes menores que

em alguns processos de tratamentos químicos, como por exemplo, o ozônio ou

peróxido de hidrogênio (Marco & Esplugas, 1997).


65

O tratamento anaeróbico geralmente apresenta bons resultados na remoção da

cor (Santos et al., 2003), no entanto, estes microrganismos não conseguem

completa mineralização dos compostos (Field et al., 1995). Sob condições

aeróbicas, baixa remoção da cor é alcançada porque o oxigênio é um aceptor de

elétrons mais eficiente, conseqüentemente, tem maior afinidade por parte dos

elétrons do que os corantes (Stolz, 2001). No entanto, a descoloração aeróbica

tem sido relatada por diversos pesquisadores (Jian & Bishop, 1994; Padmavathy

et al., 2003; Kodam et al., 2005).

Por outro lado, nos últimos anos, diversos trabalhos publicados relataram

alguns fatores que podem afetar a remoção dos corantes sintéticos durante o

processo de descoloração microbiana. Dentre eles, os fatores nutricionais (fontes

de carbono e nitrogênio) e fatores físicos (temperatura, agitação e pH, dentre

outros) podem influenciar na degradação dos azo corantes (Chang & Kuo, 2000,

Mielgo et al., 2001).

Considerando que a descoloração dos azo corantes pode ser influenciada por

diversos fatores com variados graus de importância, neste trabalho utilizou-se um

planejamento fatorial para realizar uma triagem dos vários fatores potencialmente

importantes usando o termofílico Geobacillus stearothermophilus (UCP 986). O

corante escolhido foi o ácido Alaranjado 7 (AO7) também conhecido como

Alaranjado II, que é intensamente usado no tingimento têxtil, alimentos e

cosméticos, estando presente nos efluentes de manufaturamento (Mendez-Paz et

al., 2005).


66

Material e Métodos

Microrganismo: Geobacillus stearothermophilus (UCP 986) isolado de efluente

de lodo têxtil na indústria Suape Têxtil, Pernambuco, faz parte do Banco de

Culturas do Núcleo de Pesquisas em Ciências Ambientais da UNICAP (Recife-

PE, Brasil). A manutenção era realizada em meio Agar nutriente, com repiques

mensais e mantida sob refrigeração a 5ºC.

Corante: corante do tipo azo reativo, Alaranjado II (C.I. 15510) (Figura 1) foi

adquirido da Sigma (Sigma-Aldrich Corporation, St. Louis, Missouri, USA). Uma

solução estoque do corante (3 mM) foi preparada dissolvendo o corante em água

deionizada esterilizada. Esta solução foi previamente filtrada em filtro de vidro

com membrana Millipore (0,22 µm).

Meios de cultivo: o microrganismo foi crescido em meio Luria Bertani (LB)

(Chang et al., 2001a), com a seguinte composição (g L-1): triptona 10, extrato de

levedura 5, NaCl 10. Para o cultivo das amostras, foi utilizado LB suplementado

com glicose (5 g L-1) (Konishi et al., 1997) e caldo YP com a seguinte composição

(g L-1): extrato de levedura 10, peptona 10, NaCl 2 (Ikeuchi et al., 2003). Ambos

com pH 7,0 ± 0,2.

Métodos microbiológicos

Condições de cultivo: Geobacillus stearothermophilus (UCP 986) foi cultivado

em 100 mL de caldo LB em frasco Erlenmeyer de 250 mL de capacidade,


67

incubado por 12 h sob agitação orbital a 150 rpm, resultando em uma cultura 106

UFC mL-1, que serviu como pré-inóculo. Em seguida, 1 e 4 mL foram transferidos

para frascos Erlenmeyers com capacidade de 500 mL, contendo 150 mL do meio

de cultura e o corante, de acordo com as combinações descrita no planejamento

fatorial (Tabela 1). O experimento foi realizado por 24 h a temperatura de 50ºC.

Viabilidade celular: foi realizada através da técnica “pour plate”, usando como

meio inoculante Agar nutriente. A contagem era realizada com o auxílio de um

contador de colônias após incubação a cada 24 h.

Procedimentos analíticos

Determinação do consumo de glicose e pH: a determinação do pH e o

consumo de glicose foram determinados no líquido metabólico livre de células. O

consumo de glicose foi determinado através do método enzimático colorimétrico

glicose-oxidase kit Labtest®, utilizando uma solução de glicose (100 mg dL-1)

como padrão e medido espectrofotometricamente a 505 nm.

Descoloração do azo corante: para determinação da descoloração, as amostras

foram submetidas à centrifugação de 10.000 g por 8 minutos, para separação das

células do líquido metabólico. A concentração do meio contendo o corante foi

avaliada pela diminuição da absorbância, empregando espectrofotômetro UV-VIS

(Espectronic Gênesis modelo 2). O comprimento de onda era fixado pela

absorção máxima do corante na região do visível, a 485 nm. A concentração do

corante foi calculada pela seguinte fórmula:


68

Remoção da cor (%) = (A) – (B) x 100

(A)

onde, (A) indica a absorbância do caldo não inoculado e (B) indica a absorbância

residual do caldo.

Análise dos produtos de degradação: após o período de descoloração, o

sobrenadante foi separado da biomassa por centrifugação (4500 rpm 15 min/4ºC)

e submetido à extração com acetato de etila (3 vezes de 130 mL). O extrato

obtido foi seco com Na2SO4 anidro e concentrado em rotaevaporador (Cha et al.,

2001). Os produtos concentrados foram analisados por cromatografia líquida de

alta performance (HPLC) (Varian, USA) utilizando uma coluna de fase reversa

(4,6 mm x 150 mm, Microsorb-MVTM C18, Creek, CA USA). A eluição foi realizada

em sistema de solvente isocrático composto por metanol e água (30:70), com

fluxo de 0,5 mL min-1 (Mendez-Paz et al., 2005). Os produtos foram monitorados a

254 nm com detector UV-VIS. A presença do ácido sulfanílico foi detectada a

partir do padrão (F-Maia, Brasil). Os reagentes analíticos usados apresentavam

grau cromatográfico (Sigma-Aldrich Chemical, USA).

Efeito da toxicidade pelos metabólitos do corante

Os testes de toxicidade foram realizados nos ensaios 9, 10, 13 e 14 após a

descoloração do Alaranjado II, usando o bioindicador Artemia salina. O bioensaio

foi baseado apenas na porcentagem de morte dos organismos em relação ao seu

número total (10 larvas), na presença de diferentes concentrações das amostras

(17, 33, 67 e 83%), diluídas em 5 mL de uma solução aquosa de sal marinho

sintético (30 g L-1) por 24 h. Neste método o volume máximo da amostra teste


69

deve ser de 1,5 mL (McLaughlin et al. (1985). Em seguida, foi realizada a

contagem dos organismos sobreviventes, determinando-se a dose limite do

poluente (CL50). Os testes foram realizadas em triplicata.

Planejamento fatorial: realizou-se um planejamento fatorial completo 24 sem

ponto central (Tabela 1), para analisar os efeitos e interações das variáveis

independentes: tamanho do inóculo, tipo de meio (co-substrato), concentração do

corante e agitação, sobre a descoloração do Alaranjado II. A estimativa do erro foi

calculada pelas quatro repetições. Todos os resultados foram analisados

utilizando o programa STATISTICA versão 5.0 da Statsoft, USA.

Resultados e Discussão

Condições de cultivo

A descoloração usando G. stearothermophilus (UCP 986) foi realizada durante

24 h em diferentes condições de cultivo, de acordo com as combinações

determinadas pelo planejamento fatorial 24. O planejamento foi utilizado para

avaliar os efeitos principais e interações das quatro variáveis escolhidas (tipo de

meio, concentração do corante, tamanho do inóculo e faixa de agitação), sobre a

variável resposta, porcentagem de descoloração do Alaranjado II. Os níveis

inferior e superior do planejamento foram escolhidos de acordo com estudos que

investigaram condições que favorecem o processo de descoloração dos corantes

sintéticos usando diferentes microrganismos (Padmavathy et al., 2003, Ambrósio

& Campos-Takaki, 2004, Fang et al., 2004).


70

Dos vinte ensaios realizados, a maior porcentagem de descoloração foi

observada nos ensaios 9, 10, 13 e 14, que se encontravam no nível -1 para o tipo

de meio e nível +1 para a faixa de agitação. Nestas condições, a taxa de

descoloração alcançada foi de 96-98% (Tabela 1), sugerindo a clivagem redutiva

do corante.

De acordo com o Diagrama de Pareto (Figura 2), cálculo dos efeitos principais

e de interações entre os fatores investigados, se observa que dentre as variáveis

independentes utilizadas, o tipo de meio e a agitação são estatisticamente

significativos no processo de descoloração do azo corante, para um nível de 95%

de confiança. O efeito negativo do meio indica que esta variável deve ser utilizada

em seu nível inferior (-1), enquanto, a passagem da agitação do nível -1 para o

nível +1, exerceu um efeito positivo no processo de descoloração do corante.

As demais variáveis (concentração do corante e tamanho do inóculo), embora

tenham exercido um efeito positivo no processo de descoloração, devendo ser

usadas em seu nível superior (+1), não foram estatisticamente significativas,

sugerindo que G. stearothermophilus pode ser testado numa faixa de

concentração do corante maior. Com relação às interações das variáveis,

observa-se que somente as interações meio-agitação e inóculo-agitação

apresentaram significado estatístico, embora com efeito negativo (Figura 2).

Segundo Padmavathy et al. (2003) é importante conhecer se os

microrganismos que descolorem os azo corantes podem suportar elevadas

concentrações desses compostos, visto que, a concentração de corantes em um

típico efluente industrial varia em torno de 10-50 mg L-1.

Neste trabalho verificou-se que a utilização do LB foi o principal responsável

pelo aumento na taxa de descoloração do Alaranjado II. Observou-se ainda, que


71

nessas condições, o processo de descoloração foi influenciado principalmente,

pela agitação, mostrando que a remoção da cor pelo microrganismo depende do

ambiente rico em oxigênio e do co-substrato utilizado. Estes resultados são

semelhantes aos observados por Fang et al. (2004) ao estudarem a descoloração

do azo corante Direto Fast Scarlet (4BS) usando uma cultura de um fungo da

podridão branca (fungos 8-4) e observaram que a presença do oxigênio através

da agitação, aumentou a taxa de remoção do corante.

A utilização de co-substratos atua inicialmente como doador de elétrons, sendo

importante não somente para melhorar a taxa de remoção da cor, mas também

fornecer a manutenção dos microrganismos termofílicos (Santos et al., 2004).

Para Padmavathy et al. (2003) a descoloração dos azo corantes reativos

Vermelho RB e Vermelho Remazol usando glicose como co-substrato, contribuiu

para uma descoloração de 91-94%.

A cultura de G. stearothermophilus quando regulada no nível inferior (-1), para

meio e agitação, (ensaios 1, 2, 5 e 6) a descoloração visivelmente diminuiu (55-

61%). Nos ensaios contendo o meio YP como co-substrato em ambos os níveis, a

taxa de descoloração do corante foi menor (33-61%) (Tabela 1).

A ausência de glicose no meio YP contribuiu para que a taxa de descoloração

do corante visivelmente diminuísse. Segundo Santos et al. (2004), a atividade

metabólica de um inóculo termofílico induziu a redução do azo corante reativo

Vermelho 2, indicando domínio do processo biótico. Por outro lado, devido a

temperatura elevada do efluente (40 a 60oC), a utilização de microrganismos

termofílicos torna-se um método apropriado ao sistema de biotransformação.


72

Cinética de crescimento de G. stearothermophilus

A partir dos melhores resultados obtidos no planejamento fatorial (ensaios 9,

10, 13 e 14), realizou-se outro experimento a fim de observar a cinética de

crescimento de G. stearothermophilus. Nestes ensaios, remoção da cor, pH,

consumo de glicose e crescimento celular, foram observados nos intervalos de 4,

8, 15, 20, 24, 28, 32 e 48 h.

A melhor taxa de descoloração (99%) foi observada no ensaio 13 com 15 h de

cultivo. Nestas condições, o inóculo era menor (1 mL) e a concentração do

corante maior (0,050 mM). Nos ensaios 10 e 13 re-coloração do meio foi

observada (Figura 3).

A re-coloração do meio pode ser justificada pelo processo de dessorção ou

ego-polimerização da molécula do corante. Ambrósio & Campos-Takaki (2005)

estudando a descoloração de uma mistura de corantes por Cunninghamella

elegans (UCP 542), também observaram um processo de re-coloração do meio

após 96 h de cultivo. Segundo os autores, este fato ocorreu devido à degradação

dos corantes adsorvidos, desde que se observou deslocamento espectral

significativo nas regiões de 500 para 400 nm.

O crescimento de G. stearothermophilus, apresentou uma fase lag nas

primeiras 8 h de cultivo, seguido de uma fase estacionária (8-48 h) e uma fase de

declínio após 48 h (ensaios 10 e 13) (Figura 3). As maiores taxas de descoloração

foram observadas durante a fase estacionária. Nesses ensaios, a velocidade

média específica de crescimento foi de (µmax) 0,62 h-1 e o tempo de geração (TG)

1,13 h. Segundo Chen (2002), a descoloração não é associada ao crescimento

celular, mas ainda assim é dependente da atividade metabólica.


73

O catabolismo da glicose aumentou a eficiência de remoção do azo corante.

Isto foi observado no ensaio 14, que com 8 h de cultivo, já havia metabolizado

mais de 70% da glicose, com remoção da cor de 73% (Figuras 3). Resultados

semelhantes foram obtidos por Buitron et al. (2004), ao citarem que a ocorrência

do catabolismo microbiano em condições aeróbicas promoveu a biodegradação

do Ácido Vermelho 151, pela clivagem bioquímica nas ligações azo, através de

seus metabólitos secundários produzidos.

Embora, os metabólitos formados durante o processo de remoção da cor não

descolore diretamente os azo corantes, os mesmos podem agir como mediador

redox, aumentando a eficiência de descoloração dos compostos azo (Keck et al.,

1997). A presença de mediadores redox (metabolicamente formados) na redução

eficaz dos azo corantes foi demonstrada por Haug et al. (1991) quando

observaram que uma linhagem de Sphingomonas sp. BN6 era capaz de

metabolizar pequenas quantidades de glicose sob condições anaeróbicas,

formando metabólitos com habilidade redox.

Assim, é provável que o Alaranjado II foi descolorido por reação redutiva,

através de co-metabolismo, resultando na clivagem da ligação azo. Biosorção

inicial também foi observada, uma vez que a biomassa do microrganismo se

apresentou colorida. Tais interações ocorrem devido às diferenças de cargas na

parede celular do microrganismo e corante.

A biosorção pode ser atribuída ao pH ácido (5,2) (Figura 4). A diminuição do pH

inicial se deve a formação de ácidos orgânicos, provenientes do metabolismo da

glicose. Segundo Ong et al. (2005) à adsorção pela biomassa microbiana

aumentou a remoção do Alaranjado II usando um reator anaeróbico de manta de

lodo (USBR) e reator de fluxo contínuo (SBR).


74

Chang et al. (2001b) relataram que embora o efeito de adsorção exerça um

importante papel na dinâmica de descoloração durante a fase inicial,

transformação enzimática dos microrganismos pode dominar e conduzir a

completa remoção da cor. Para Walker & Weatherley (2000) a remoção da cor

pelo processo de biosorção usando biomassa de Bacillus sp. foi responsável por

19% da descoloração do corante Ácido Antraquinona.

Durante todo o cultivo, o pH variou entre 5,0 - 6,5. Os ensaios 9, 10 e 13

apresentaram um pH ao redor de 5,0, enquanto o ensaio 14, apresentou pH 6,5

(Figura 3).

Produtos da degradação

A análise por HPLC quanto à formação de metabólitos intermediários durante

a descoloração do Alaranjado II foi investigado nas amostras 9, 10, 13 e 14, após

extração com acetato de etila. O pico correspondente ao ácido sulfanílico (tempo

de retenção de 3,5 min, no padrão), não foi detectado, indicando a completa

remoção desta amina. A presença de 1-amino-2-naftol, outra amina gerada, não

pôde ser observada. Resultados semelhantes também foram encontrados por Hu

(1994) ao relatar a ausência de ácido sulfanílico, na descoloração dos azo

corantes Vermelho G, RP2B e V2RP, usando Pseudomonas luteola, sob

condições de agitação e repouso.

Efeito da toxicidade dos metabólitos do corante

O ensaio de letalidade permite a avaliação da toxicidade geral e, portanto, é

considerado essencial como bioensaio preliminar no estudo de compostos com

potencial atividade biológica (Cavalcante et al., 2000).


75

Após o período de descoloração, teste de toxicidade foi realizado nos ensaios

9, 10, 13 e 14, utilizando o bioindicador A. salina. A Figura 4 mostra a

porcentagem de mortalidade para A. salina, após exposição com as amostras

descoloridas por 24 h e comparadas ao controle (contendo apenas água do mar).

O ensaio 13 (meio LB, corante 0,050 mM, inóculo 1 mL e agitação 150 rpm),

responsável pela maior descoloração com 15 h, apresentou maior toxicidade, com

mortalidade de 67 a 100%. Os demais ensaios apresentaram baixas taxas de

mortalidade (< 10%). Somente o ensaio 10 apresentou uma mortalidade de 37%,

na concentração da amostra de 67%.

O valor da CL50 (concentração que causa 50% de mortalidade) foi calculada

pelo método de Trimmed Spearman-Karber (Youn-Joo, 2006). No entanto,

apenas a amostra 13 pôde ter a CL50 calculada segundo este método, uma vez

que as demais amostras apresentaram baixo percentual de mortalidade. A CL50

da amostra 13 foi de 49,28% (v.v-1), com uma faixa de variação de 43,13 e

56,30%, para um intervalo de confiança 95%. O teste controle, indicou que as

larvas não foram afetadas. Amostras não tratadas também foram testadas,

apresentando uma mortalidade inferior a 10%.

Segundo Ambrósio & Campos-Takaki (2004) inibição em mais de 60% foi

observada na respiração de Escherichia coli durante a descoloração do azo

corante Alaranjado II usando C. elegans. Kundu et al. (1989) estudando a

toxicidade de corantes diluídos de efluentes industriais usando o lagostim

Paraopenaopsis sculptilis, observaram que a natureza físico-química do efluente

causava uma mortalidade de 100%, na concentração de 1%.


76

Conclusões

A aplicação do planejamento fatorial demonstra que das quatro variáveis

utilizadas, somente duas (meio mais glicose e agitação), parecem afetar

significantemente o processo de descoloração do Alaranjado II usando G.

stearothermophilus. A presença da glicose como co-substrato aumenta a

eficiência de descoloração do corante em mais de 35%. A ausência de ácido

sulfanílico, uma amina gerada durante a clivagem da molécula não foi encontrada,

sugerindo a degradação do Alaranjado II. A descoloração do azo corante por G.

stearothermophilus não forma metabólitos tóxicos.

Agradecimentos

Os autores agradecem ao Prof. Dr. Nelson Duran e Lívia Cordi (Laboratório de

Química Biológica, UNICAMP, SP) pelos testes de toxicidade. Ao Dr. Ricardo

Kenji Shiosaki (NPCIAMB, UNICAP, PE) pelas análises de HPLC. Agradecemos

também a agência financiadora CNPq e FINEP/CTPETRO e FACEPE pelo

suporte financeiro e a UNICAP pelas instalações cedidas.

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81

Tabela 1. Matriz codificada do planejamento fatorial 24 em relação à resposta de

descoloração do azo corante Alaranjado II por Geobacillus stearothermophilus

UCP 986, após 24 horas de cultivo a 50ºC

Níveis dos fatoresa Ensaio

Inóculo Meio Corante Agitação

Descoloração (%)b

1 -1 -1 -1 -1 55 2 +1 -1 -1 -1 61 3 -1 +1 -1 -1 33 4 +1 +1 -1 -1 45 5 -1 -1 +1 -1 59 6 +1 -1 +1 -1 60 7 -1 +1 +1 -1 40 8 +1 +1 +1 -1 55 9 -1 -1 -1 +1 96 10 +1 -1 -1 +1 97 11 -1 +1 -1 +1 59 12 +1 +1 -1 +1 42 13 -1 -1 +1 +1 98 14 +1 -1 +1 +1 98 15 -1 +1 +1 +1 61 16 +1 +1 +1 +1 49 17c -1 -1 -1 -1 54 18c +1 +1 +1 +1 50 19c -1 -1 -1 -1 54 20c +1 +1 +1 +1 53

aNíveis dos fatores, codificados como valores de -1 e +1 na tabela, como segue: Inóculo (105): 1 mL para o nível -1; (106) 4 mL nível +1; Concentração do corante: 0,025 mM para o nível -1; 0,050 mM nível +1; Tipo de meio: LB para nível -1; YP para nível +1; Agitação: 0 rpm para nível -1; 150 rpm nível +1. bResposta obtida com cada ensaio referente a descoloração do Alaranjado II por G. stearothermophilus UCP 986. cEnsaios repetidos.


82

Figura 1. Estrutura química do azo corante Alaranjado II.

Pareto Chart of Standardized Effects; Variable: COR

4 factors at two levels; MS Residual=,0020455

DV: COR

Effect Estimate (Absolute Value)

,1686509

,3397808

-,411087

-,527034

1,212178

1,876181

-3,54167

-6,67225

11,33095

-14,1969

p=,05

1by3

(1)INÓCULO

3by4

1by2

2by3

(3)CORANTE

1by4

2by4

(4)AGITAÇÃO

(2)MEIO

-2 0 2 4 6 8 10 12 14 16

Figura 2. Efeitos padronizados com diferentes fatores testados no experimento de

descoloração do azo corante Alaranjado II por Geobacillus stearothermophilus UCP

986, após 24 h de cultivo a 50ºC. (1) Tamanho do inóculo, (2) meios de cultura, (3)

concentração do corante e (4) tipo de agitação.

N = N

OH

NaO3S


83

Figura 3. Percentual de descoloração, Crescimento celular, consumo de glicose e pH durante o processo de

remoção do azo corante Alaranjado II usando Geobacillus stearothermophilus, por 48 h a 50ºC. (A) Ensaio 9,

(B) Ensaio 10, (C) Ensaio 13 e (D) Ensaio 14.

B

C D

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 4 8 15 20 24 28 32 48

Tempo (h)

% D

esco

lora

ção

Ln (U

FC m

L-1)

0

1

2

3

4

5

6

7

8

pH

Glic

ose

(g L

-1)

co rante cresc. celular pH Glicose

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 4 8 15 20 24 28 32 48

Tempo (h)

% D

esco

lora

ção

Ln

(UFC

L-1)

0

1

2

3

4

5

6

7

8

pH

Glic

ose

(g L

-1)


0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 4 8 15 20 24 28 32 48

Tempo (h)

% D

esco

lora

ção

Ln (U

FC m

L-1)

0

1

2

3

4

5

6

7

8

pH

Glic

ose

(g L

-1)


0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 4 8 15 20 24 28 32 48

Tempo (h)

% D

esco

lora

ção

Ln (U

FC m

L-1)

0

1

2

3

4

5

6

7

8

pH

Glic

ose

(g L

-1)

corante cresc. celular pH glicose

A


84

0102030405060708090

100110

17 33 67 83

Concentração (%)

% M

orta

lidad

e

Ensaio 9 Ensaio 10 Ensaio 13 Ensaio 14


processo de descoloração do azo corante Alaranjado II por

Geobacillus stearothermophilus, após 48 h de cultivo a 50ºC, usando

Artemia salina.


85

SEGUNDO ARTIGO

Biorremediação do Azo Corante Têxtil Alaranjado II por

Pseudomonas aeruginosa UCP 992 sob Condições Aeróbicas


Dyes and Pigments


86

Biorremediação do Azo Corante Têxtil Alaranjado II por

Pseudomonas aeruginosa UCP 992 sob Condições Aeróbicas

Norma Suely Evangelista-Barreto1,2, Clarissa D. Albuquerque2, Marcos A. B. Lima1,2, Aline E. do Nascimento2, Regine Helena S. F. Vieira3 e Galba Maria

de Campos-Takaki1,24*

1Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas, UFPE, Recife, PE, Brasil;

2Núcleo de Pesquisa em Ciências Ambientais, NPCIAMB, UNICAP, Recife, PE, Brasil;

3Instituto de Ciências do Mar-LABOMAR, UFC, Fortaleza, Ceará, Brasil; 5Departamento

de Química, UNICAP, Recife, Pernambuco, Brasil.

Parte dos resultados foram publicados no livro de resumos do XXIII Congresso

Brasileiro de Microbiologia. Santos-SP. 22-25/12/2005.

*Correspondência do autor: Galba Maria de Campos-Takaki, Departamento de Química, Núcleo

de Pesquisas em Ciências Ambientais, Universidade Católica de Pernambuco, Rua Nunes

Machado, 42, Boa Vista. 50050-590, Recife - Pe, Brasil. Tel. +00-55-81-2119.4017; Fax: +00-55-

81-2119.4043. E-mail: [email protected].


87

Resumo

A biodegradação do azo corante Alaranjado II usado em indústrias têxteis foi

investigada usando Pseudomonas aeruginosa (UCP 992), sob diferentes

condições de cultivo, usando um planejamento fatorial 23, que teve como

variáveis independentes, a agitação, concentração do corante e tamanho do

inóculo, e como variável resposta, a descoloração do corante. De acordo com os

resultados P. aeruginosa promoveu uma descoloração de 85-94% do corante, sob

condições de repouso, 60% sob agitação de 75 rpm e apenas 19% sob agitação

de 150 rpm. Nos frascos mantidos em repouso, o pH do meio variou de 6,8 a 8,5

e a glicose, usada como co-substrato, não influenciou no processo de

descoloração. A presença de ácido sulfanílico, um metabólito da redução do

Alaranjado II, analisada por HPLC, sugere que a descoloração do azo corante

ocorreu pela clivagem da ligação azo. O bioensaio usando Artemia salina

apresentou mortalidade de 80-97%, quando comparada ao controle, indicando a

recalcitrância do composto. Os resultados obtidos demonstram que das três

variáveis usadas, apenas a agitação é significativa no processo de remoção do

Alaranjado II e que a descoloração por P. aeruginosa é fortemente afetada pela

aeração, demonstrando que o oxigênio inibe a atividade azoredutase, necessária

ao processo de descoloração deste composto.

Palavras-chave: Pseudomonas aeruginosa, descoloração, azo corante

Alaranjado II, toxicidade.


88

1. Introdução

Cerca de um milhão de toneladas de corantes são produzidos anualmente no

mundo [1]. Os azo corantes, caracterizados pela ligação azo (R1-N=N-R2),

representam aproximadamente 70% da produção [2], sendo amplamente usados

como corantes têxteis, de alimentos e cosméticos [3]. Os azo corantes reativos,

ou seja, corantes com grupos reativos que formam ligações covalentes com OH-,

NH- ou grupos SH-, são extensivamente usados na indústria têxtil, embora,

apresentem baixo grau de fixação às fibras (10-50%) [4].

A elevada solubilidade na água, faz com que os azo corantes não sejam

degradados por plantas convencionais de tratamentos de esgotos [5, 6]. Deste

modo, efluentes coloridos contendo azo corantes reativos têm causado sérios

problemas ambientais, principalmente, porque estes compostos, quando

presentes na água são altamente visíveis, afetando a transparência e estética do

corpo aquático [7].

Dessa maneira, é importante que se investigue linhagens microbianas que

apresentem elevado potencial de descoloração, através da clivagem redutiva do

grupo azo na molécula dos corantes têxteis. Nos últimos anos, diversos

pesquisadores têm demonstrado a habilidade de vários microrganismos em

transformar compostos azo em produtos não coloridos, bem como, realizar

completa mineralização, sob determinadas condições ambientais [8]. Os azo

corantes podem ser degradados sob condições aeróbicas [9] ou anaeróbicas [10].

A degradação bacteriana é geralmente iniciada pela redução anaeróbica na

ligação azo, que, no entanto, apresenta como principal desvantagem a produção

de aminas aromáticas potencialmente tóxicas e carcinogênicas [11]. Os produtos


89

dessa redução (aminas) podem ser tratados posteriormente numa etapa aeróbica

[12]. Compostos azo também podem ser reduzidos a aminas por co-metabolismo

[13].

A biotransformação aeróbica dos azo corantes por fungos e bactérias tem sido

bastante relatada. Segundo Abraham et al. [14] o tratamento aeróbico é mais

atrativo, como método de biodegradação destes compostos. Neste processo, o

metabolismo redutivo aeróbico requer enzimas específicas (azoredutases

aeróbicas) que catalisam a redução do composto azo através de NAD-

dependentes [8]. As azoredutases aeróbicas (flavinas monoméricas) isoladas de

Pseudomonas K22 e KF46 utilizam NADPH e NADH como cofatores na redução

de diversos corantes sulfurados [15].

Por outro lado, os modelos fatoriais têm sido usados como uma importante

ferramenta tanto para a realização de pesquisas, como para trabalhos aplicados

[16, 17]. Neste sentido, devem ser considerados parâmetros significativos para

um determinado processo, assim como, a interação entre eles, permitindo que

processos de otimização nos processos de descoloração sejam alcançados.

Este trabalho teve como objetivo avaliar o potencial de descoloração por

Pseudomonas aeruginosa (UCP 992) usando o azo corante Alaranjado II, sob

diferentes condições de cultivo, usando um planejamento fatorial completo 23.


90

2. Material e Métodos

2.1. Microrganismo

Pseudomonas aeruginosa UCP 992 utilizada nos experimentos de

biodegradação foi gentilmente cedida do Banco de Culturas do Núcleo de

Pesquisa em Ciências Ambientais NPCIAMB, UNICAP, Recife, Brasil, sendo

mantida no meio Ágar nutriente e armazenado a 4ºC. Repiques bimestrais eram

realizados em Ágar nutriente e mantidos sob refrigeração a 5ºC.

2.2 Corante

O corante utilizado foi o azo reativo Alaranjado II (C.I. 15510) obtido da Sigma

(Sigma-Aldrich Corporation, St. Louis, Missouri, USA).

2.1. Ensaios Microbiológicos

2.1.1.Condições de cultivo

Pseudomonas aeruginosa foi previamente cultivada em 100 mL de caldo Luria

Bertani (LB) [18] (g L-1: triptona 10, extrato de levedura 5, NaCl 10, adicionado de

glicose 5) distribuído em frasco Erlenmeyer de 250 mL e incubada por 12 h sob

agitação de 150 rpm a 40ºC, resultando em uma cultura de 108 UFC/mL. Em

seguida, inóculos de 1, 2,5 e 4 mL foram transferidos para frascos Erlenmeyers

de 500 mL de capacidade, contendo 150 mL do meio LB adicionado de glicose,


91

pH 7,0 ± 0,2. Os ensaios foram realizados de acordo com o planejamento fatorial

23, por 48 h à 40ºC.

2.1.2.Contagem de células

A contagem das células foi realizada através da técnica “pour plate”, usando

como meio inoculante Agar nutriente. A contagem foi realizada com o auxilio de

um contador de colônias após 24 h de incubação.

2.2. Métodos Analíticos

2.2.1. Determinação do consumo de glicose e pH

A determinação do consumo de glicose foi analisada no líquido metabólico

livre de células através do método enzimático colorimétrico glicose-oxidase, kit

Labtest®, medido espectrofotometricamente a 505 nm. O pH do meio livre de

células foi medido utilizado um pHmetro Orion, modelo 310.

2.2.2. Remoção do corante

A concentração do corante no meio foi avaliada pela diminuição da absorção,

após remoção das células por centrifugação (10.000 x g, 8 min.), empregando

espectrofotômetro UV-VIS (Espectronic Gênesis modelo 2). O comprimento de

onda foi fixado pela absorção máxima do corante na região do visível, a 485 nm.

2.2.3. Análise dos produtos da degradação


92

Os componentes da degradação do corante no sobrenadante foram extraídos

com acetato de etila (3 vezes de 100 mL), seco com Na2SO4 anidro e concentrado

em rota evaporador (Quimis, Mod. Q-219) [19]. As amostras foram analisadas por

cromatografia líquida de alta performance (HPLC) (Varian, USA) utilizando uma

coluna de fase reversa (4,6 mm x 150 mm, Microsorb-MVTM C18, Creek, CA

USA). A eluição foi realizada em sistema de solvente isocrático composto por

metanol e água (30:70), com fluxo de 0,5 mL min-1 [20]. Os produtos foram

monitorados a 254 nm com detector UV-VIS. A presença do ácido sulfanílico foi

observada a partir do tempo de retenção do padrão (F-Maia, Brasil) e comparada

com as amostras. Os reagentes analíticos usados apresentavam grau

cromatográfico (Sigma-Aldrich Chemical, USA).

2.3. Características morfológicas

As amostras coletadas após a descoloração foram lavadas em PBS, pH 7,2

por duas vezes, durante 10 min. Em seguida, fixadas com glutaraldeido 2,5% em

tampão fosfato 0,1 M, pH 7,4, durante 1h, a temperatura ambiente. Após a etapa

de fixação, todas as amostras foram novamente lavadas com tampão fosfato,

duas vezes, durante 10 min. Seguindo-se a pós-fixação com tetróxido de ósmio

1%, em tampão fosfato, durante 1 h a temperatura ambiente, em condições de

escuridão. Em seguida, as amostras foram mais uma vez lavadas com tampão

fosfato 0,1M, sendo posteriormente submetidas ao processo de desidratação.

Para a desidratação das amostras foi utilizado álcool etílico, em proporções de 50,

70 e 90% (5 min. para cada troca) até a proporção de 100% (três vezes, 10 min.

cada troca). Após esta etapa, as amostras foram submetidas ao ponto critico para


93

eliminação total da fase líquida, seguindo-se a montagem em suportes de

alumínio e posterior metalização. Preparadas as amostras, as mesmas foram

analisadas e fotografadas ao microscópio eletrônico de varredura (JEOL LSM

5.600 LV), operando a 20 kv.

2.4. Ensaios de toxicidade

O ensaio biológico foi realizado utilizando a metodologia de McLauglin et al.

[21] nos ensaios 1, 2, 3 e 4 (maior descoloração). Cerca de 10 larvas de Artemia

salina foram transferidas para frascos contendo a amostra teste (material

descolorido) com diferentes concentrações (17, 33, 67 e 83%), diluídas em 5 mL

de água artificial do mar. Teste controle foi realizado contendo somente água do

mar. Os testes foram realizados em triplicata. A contagem dos animais mortos e

vivos foi realizada após 24 h de exposição. Para obtenção das CL50 e respectivos

intervalos de confiança, utilizou-se o método de análise Trimmed Spearman-

Karber [22].

2.5. Construção do planejamento fatorial

Para construir a matriz de planejamento, os níveis inferior e superior foram

substituídos por -1 e +1, respectivamente, o que torna os valores dos níveis no

ponto central todos iguais a zero. Decidiu-se realizar 16 ensaios (mais o ponto

central), e para isso escolheu-se o planejamento fatorial completo 23 (Tabela 1),

para analisar os efeitos e interações das variáveis independentes: volume do

inóculo, concentração do corante e agitação, sobre a variável resposta, percentual


94

de descoloração após 48 h. Todos os resultados foram analisados utilizando o

programa STATISTICA versão 5.0 da Statsoft, USA.

3. Resultados e Discussão

3.1. Descoloração do azo corante

A descoloração dos azo corantes tem como reação inicial a clivagem redutiva

do grupo azo. Contudo, sob condições anaeróbicas estas reações podem ser

catalisadas por diversos sistemas biológicos, conduzindo ao acúmulo de aminas

aromáticas [23]. Nos últimos anos, diversos trabalhos têm relatado alguns fatores

que podem afetar a remoção dos corantes sintéticos durante o processo de

descoloração microbiana. Dentre eles, os fatores nutricionais (fontes de carbono e

nitrogênio) e fatores físicos (temperatura, agitação e pH, dentre outros) podem

influenciar na degradação dos compostos azo (7, 24, 25).

Neste sentido, experimentos foram realizados com P. aeruginosa (UCP 992)

durante 48 h, usando diferentes combinações das três variáveis escolhidas

(agitação, concentração do corante e tamanho do inóculo) de acordo com o

planejamento fatorial 23. Dessa forma, observou-se que a melhor taxa de

descoloração do corante foi obtida quando todas as variáveis independentes

encontravam-se reguladas em seu nível inferior (ensaio 1), promovendo uma

descoloração de 94% e sugerindo a clivagem do grupo azo do corante (Tabela 1).

Quando as variáveis independentes se encontravam em seu nível superior

(ensaio 8), a taxa de descoloração visivelmente diminuiu, sendo de apenas 11%.

No entanto, quando os frascos foram submetidos à agitação moderada (75 rpm),


95

a taxa de descoloração foi maior (60%) (Tabela 1). Nos ensaios com maior

descoloração, se observou um aumento no pH do meio, sugerindo a presença de

aminas, provenientes da clivagem do corante e reconhecidas pela alcalinidade

(Tabela 1).

A cor dos corantes Vermelho Congo e DB 38 foi removida em até 98 e 72%,

respectivamente, por Escherichia coli sob condições anaeróbicas e nenhuma

descoloração ocorreu durante a incubação aeróbica [26]. Segundo Chang et al.

[27] a presença do oxigênio não inibe diretamente a atividade azoredutase, sendo

esta inibição, provavelmente, um evento dependente do metabolismo microbiano.

Assim, microrganismos viáveis são definitivamente requeridos para uma maior

descoloração nos processos biológicos, significando que a descoloração biológica

é possível [28]. Devido à recalcitrância das aminas aromáticas normalmente

observadas na fase anaeróbica, a agitação suave deve ser vantajosa no processo

de descoloração. Adicionalmente, Bromley-Challenor et al. [29] relataram que

agitação suave ocasional promove uniformidade do corante, diminuindo as

limitações de difusão.

Por outro lado, a agitação das células contribui para que parte da energia seja

oxidada via glicólise e ciclo TCA, gerando desta maneira nucleotídeos reduzidos.

Quando os nucleotídeos são reoxidados via sistema de transporte de elétrons

produzem alta energia, ou seja, ATP, proporcionando crescimento e manutenção

celular [30]. No entanto, o consumo do NADH na fosforilação oxidativa resulta em

um efeito negativo na etapa de descoloração [26]. Entretanto, Zimmermann et al.

[23], isolaram e purificaram uma azoredutase insensível ao oxigênio, a partir da

degradação aeróbica do azo corante Alaranjado II por Pseudomonas KF46.


96

De acordo com o diagrama de Pareto (Figura 1), observa-se que para um nível

de confiança de 95%, as variáveis independentes (concentração do corante e

agitação) exerceram um efeito negativo no processo de descoloração do corante,

contudo, somente a agitação apresentou efeito estatisticamente significativo,

sugerindo que esta variável é um parâmetro de grande importância no processo

de descoloração do Alaranjado II por P. aeruginosa. Quando analisando as

interações das variáveis estudadas, podemos observar ainda na Figura 1, que

embora nenhuma delas tenha apresentado efeito estatístico significante, apenas a

interação inóculo-agitação apresentou um efeito negativo no processo de

descoloração.

Chang & Kuo [25] ao estudar a descoloração do corante reativo Vermelho 22,

usando Escherichia coli, sob condições anóxicas e aeróbicas, também

observaram que o nível de oxigênio dissolvido inibiu significantemente a remoção

da cor. Segundo Isik & Sponza [26] a descoloração dos azo corantes Vermelho

Congo e Preto Reativo 38 em culturas de Pseudomonas sp. foi 100 e 83%,

respectivamente, após cinco dias de incubação anaeróbica. Contudo, sob

condições microaerofílicas, apenas descoloração de 76 e 74%, respectivamente,

foi observada. Nenhuma descoloração ocorreu sob condições aeróbicas.

Entretanto, descoloração aeróbica do corante Navitan Fast Blue S5R por P.

aeruginosa foi relatada Nachiyar & Rajakumar [19]

Baseado na literatura sabe-se que o oxigênio reprime a expressão

azoredutase intracelular e assim, a descoloração é temporariamente inibida em

culturas sob agitação. Porém, sob condições estáticas, apenas parte do oxigênio

é transferida da superfície do meio e as células que se encontram no fundo do

frasco exercem uma descoloração anaeróbica [30].


97

3.2. Perfil de crescimento de P. aeruginosa

A partir dos ensaios 1, 2, 3 e 4 (Tabela 1) que apresentaram melhor taxa de

descoloração, novos experimentos foram realizados, a fim de observar o perfil de

crescimento de P. aeruginosa.

Nestas condições, a descoloração do Alaranjado II apresentou uma remoção

de 96%, nos ensaios 1 e 2, que apresentavam menor concentração do corante.

Com 12 h de cultivo, todos os ensaios, com exceção do ensaio 1, apresentaram

uma remoção do Alaranjado II em torno de 30%, alcançando 95% com 24 h

(Figura 2). Nestes ensaios, biosorção também ocorreu, visto que a biomassa se

apresentava colorida.

O crescimento de P. aeruginosa, apresentou uma fase lag de 4 h, seguida da

fase estacionária até 48 h (Figura 2). Em todos os ensaios, observou-se um

período de diaexia, provavelmente, em decorrência dos metabólitos formados

durante a degradação do corante. Este fato foi menos evidenciado no ensaio 1,

que apresentou um maior número de células (108 UFC mL-1). Nestas condições, a

concentração do corante era mínima, o que se supõe que P. aeruginosa não

tolere maiores concentrações do corante. A velocidade específica (µ) de

crescimento de P. aeruginosa nos ensaios 1, 2, 3 e 4 foi de 0,48 h-1, 0,18 h-1, 0,57

h-1 e 0,27 h-1, respectivamente, e o tempo de geração (TG) 1,44 h, 3,85 h, 1,2 h e

2,57 h, respectivamente.

Baseado nestes resultados é coerente afirmar que a descoloração não parece

ser dependente da concentração da biomassa, mas ainda assim, é correlacionada

ao nível de oxigênio dissolvido no meio de cultura. Segundo Chang & Lin [31] a

ausência de crescimento celular foi observado no cultivo contendo P. luteola e o


98

corante reativo Vermelho 22, sem aeração. Hu [32] também relatou que o cultivo

estático não rendeu bom crescimento nas células de P. luteola, no entanto, foi

responsável por 23-76% da remoção da cor dos azo corantes direto Vermelho G e

V2RP, respectivamente.

O pH do meio ao longo do cultivo tendeu a faixa alcalina (8,5) (Figura 2). Este

fato pode ser explicado pela produção de metabólitos intermediários (aminas

aromáticas), a partir da biodegradação do composto. Segundo Chang & Kuo [25]

valores de pH neutro e básico parecem ser mais favoráveis na descoloração dos

azo corantes. O mesmo foi citado por Bin et al. [33], ao relatar que o efeito do pH

na atividade azoredutase, numa faixa de 5,0 a 9,0, apresentou melhor atividade

em pH 8,0.

A adição da glicose, eficiente na descoloração do Alaranjado II por G.

stearothermophilus [34], não afetou a descoloração do Alaranjado II por P.

aeruginosa, uma vez que, com 24 h de cultivo e descoloração máxima, o

consumo da glicose foi de apenas 15% nos ensaios 1 e 2, e de 35% nos ensaios

3 e 4 (Figura 2). Estes resultados são opostos aos encontrados por Carliell et al.

[2] que observaram metabolização da glicose como fonte de carbono,

aumentando a redução dos azo corantes. Segundo Haug et al. [13] a capacidade

de Sphingomonas sp. BN6 em metabolizar pequenas quantidades de glicose sob

condições anaeróbicas, formando equivalentes redutores, aumentou a eficiência

de descoloração.

Embora a glicose seja citada como uma importante fonte de carbono e

obtenção de energia, o metabolismo do extrato de levedura como fonte de

nitrogênio é considerado essencial na regeneração do NADH, que age como um

doador de elétron na redução das ligações azo [35]. Para Chang et al. [27] a


99

adição de glicose no caldo LB diminuiu em quase 70% a descoloração do corante

reativo Vermelho 22, enquanto a presença de triptona e extrato de levedura foram

requeridos como sendo necessários para ativar as vias metabólicas e produzir

coenzimas necessárias à atividade azoredutase, importantes no processo de

descoloração.

3.3. Caracterização morfológica

Ao final da descoloração, se observou principalmente nos frascos em repouso,

a formação de um biofilme na superfície e paredes dos frascos. O gênero

Pseudomonas é conhecido por produzir uma camada de aspecto mucóide

denominada slime, importante na formação de biofilmes [36]. O biofilme formado

provavelmente contribui para estabelecer um ambiente anaeróbico. Quando a

cultura foi observada por microscopia eletrônica de varredura, foi possível

visualizar as células formando agregados celulares (Figura 3). A produção de um

pigmento esverdeado, provavelmente pioverdina, também foi observada durante o

cultivo de P. aeruginosa (UCP 992).

3.4. Metabólitos formados durante a biodegradação do Alaranjado II

O passo inicial para a biodegradação de compostos azo é a clivagem redutiva

do grupo azo, que sob condições anaeróbicas é catalisada por vários sistemas

biológicos [32].

A identificação do ácido sulfanílico, um precursor do processo de síntese do

Alaranjado II, foi identificada no sobrenadante do meio usando HPLC. Em todos


100

os ensaios analisados (1, 2, 3 e 4) a presença do ácido sulfanílico foi observada,

apresentando um tempo de retenção de 3,5 min. Estes resultados indicam que a

presença desta amina no meio, caracteriza a natureza recalcitrante do corante.

Por outro lado, este fato indica que o processo de descoloração do Alaranjado II

ocorreu pela redução da ligação azo e que o ambiente semi-anaeróbico não

promove a mineralização das aminas aromáticas formadas.

A presença de ácido sulfanílico também foi relatada por Brás et al. [37] ao

investigarem a descoloração do Alaranjado II usando atividade metanogênica

num reator anaeróbico de manta de lodo (UASB).

3.5. Toxicidade

Ensaios de toxicidade usando A. salina nas amostras descoloridas (ensaios 1,

2, 3 e 4), foram realizados afim de determinar a toxicidade aguda do corante após

o tratamento com P. aeruginosa.

Os resultados obtidos nos testes de toxicidade são mostrados na Figura 3. A

porcentagem de mortalidade foi comparada com o controle, que não apresentava

nenhuma substância tóxica. Dentre as amostras testadas, o ensaio 4 apresentou

menor toxicidade (23%). Os demais ensaios apresentaram mortalidade elevada

(>80%) apenas na maior concentração (83%), com exceção do ensaio 2, que

apresentou mortalidade de 50% na concentração de 67% da amostra. Segundo

Kudlich et al. (12) a mortalidade observada pode ser sugerida pela presença de

grupos SO3H, que freqüentemente resistem a biodegradação ou são degradados

somente parcialmente.


101

A CL50 das amostras (concentração que causa 50% de mortalidade) com seus

respectivos coeficientes de confiança mínimo e máximo foram calculados pelo

método Trimmed Spearman-Karber [22]. A maior CL50 foi apresentada para o

ensaio 3 (67,98% v.v-1), seguido do ensaio 2 (60,18% v.v-1) e ensaio 1 (59,77%

v.v-1). O ensaio 4 não pôde ter a CL50 calculada pelo presente método.

Assim, pôde-se observar que a degradação do corante formou metabólitos,

que se apresentaram tóxicos para A. salina. A presença de ácido sulfanílico,

presente no meio pode ter contribuído para a toxicidade apresentada. Segundo

Isik & Sponza [38] testes de toxicidade usando D. magna mostraram que o

tratamento aeróbico de um efluente têxtil não removeu a DQO e que a parcela

não degradável do corante era responsável pela toxicidade.

4. Conclusões

Dentre as variáveis de partida, ficou constatado que somente uma (agitação)

parece afetar significantemente o processo de descoloração do Alaranjado II,

demonstrando que a agitação elevada inibe o processo de descoloração.

Conhecendo agora qual o fator mais significativo, torna-se possível introduzir

novas variáveis, ou alterar os níveis dos fatores já estudados, em busca de obter

melhores respostas. Como os resultados mostraram que a agitação é um fator

promissor, sugere-se a realização de mais ensaios na mesma região, estudando

melhor a influencia do tempo de cultivo, que é um fator de grande importância

para a viabilidade econômica no processo industrial.


102

Agradecimentos

Os autores agradecem ao Prof. Dr. Nelson Duran e Lívia Cordi (Laboratório de

Química Biológica, UNICAMP, SP) pelos testes de toxicidade. Ao Dr. Ricardo

Kenji (NPCIAMB, UNICAP, PE) pelas análises de HPLC. Agradecemos também a

agência financiadora CNPq e FINEP/CTPETRO e FACEPE pelo suporte

financeiro e a UNICAP pelas instalações cedidas.

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107

Tabela 1. Matriz codificada do planejamento fatorial 23 em relação à resposta de

descoloração do Alaranjado II e pH por Pseudomonas aeruginosa UCP 992, após 24

h de cultivo a 40ºC

Níveis dos Fatoresa Descoloração (%)b Amostra

Inóculo Corante Agitação 24h 48h

pH(final)c

1 -1 -1 -1 93% 94% 7,20

2 +1 -1 -1 93% 85% 7,42

3 -1 +1 -1 83% 91% 7,39

4 +1 +1 -1 94% 90% 7,35

5 -1 -1 +1 11% 16% 6,92

6 +1 -1 +1 14% 19% 6,86

7 -1 +1 +1 16% 08% 6,87

8 +1 +1 +1 14% 11% 6,79

9d 0 0 0 51% 59% 7,42

10d 0 0 0 49% 58% 7,30

11d 0 0 0 50% 60% 7,45

12d 0 0 0 51% 59% 7,45 aNíveis dos fatores, codificados como valores de -1 e +1 e 0 (ponto central) na tabela, como segue:

Inóculo (107): 1 mL para o nível -1; 2,5 mL nível 0; 4 mL nível +1; Concentração do corante: 0,025

mM para o nível -1; 0,037 mM nível 0; 0,050 mM nível +1; Agitação: 0 rpm para nível -1; 75 rpm nível

0; 150 rpm nível +1. bResposta obtida com cada ensaio referente a descoloração do Alaranjado II por

Pseudomonas aeruginosa. cpH final do meio ao termino do experimento em cada ensaio. dEnsaios

em replicatas.


108

Pareto Chart of Standardized Effects; Variable: COR

2**(3-0) design; MS Residual=,0014033

DV: COR

Effect Estimate (Absolute Value)

-,377515

,566273

-,943788

1,132546

1,321304

-29,0687

p=,05

(2)CORANTE

1by2

1by3

(1)INÓCULO

2by3

(3)AGITAÇÃO

-5 0 5 10 15 20 25 30 35

Figura 1. Diagrama de Pareto mostrando os efeitos principais e interações das

variáveis independentes no processo de descoloração do Alaranjado II por

Pseudomonas aeruginosa UCP 992, após 24 h de cultivo a 40ºC. (1) Tamanho

do Inóculo, (2) Concentração do corante e (3) Faixa de agitação.


109

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 4 8 12 24 28 36 48Tempo (hora)

% D

esco

lora

ção

Ln (U

FC m

L-1)

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

pH

Glic

ose

(g L

-1)

DO

UFC

pH

Glicose

0

10

20

30

40

50

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70

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100

0 4 8 12 24 28 36 48Tempo (hora)

% D

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lora

ção

Ln (U

FC m

L-1)

0

1

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5

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pH

Glic

ose

(g L

-1)

DO

UFC

pH

Glicose

0

10

20

30

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50

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0 4 8 12 24 28 36 48Tempo (hora)

% D

esco

lora

ção

Ln (U

FC m

L-1)

0

1

2

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5

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8

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pH

Glic

ose

(g L

-1)

DO

UFC

pH

Glicose

0

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20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 4 8 12 24 28 36 48Tempo (hora)

% D

esco

lora

ção

Ln (U

FC m

L-1)

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

pH

Glic

ose

(g L

-1)

DO

UFC

pH

Glicose

Figura 2. Percentual de descoloração, crescimento celular, consumo de glicose e pH durante o

processo de remoção do azo corante Alaranjado II por Pseudomonas aeruginosa.

Ensaio 2Ensaio 1

Ensaio 3 Ensaio 4


110

Figura 3. Eletromicrografia de Pseudomonas aeruginosa (UCP 992)

após o processo de descoloração do azo corante Alaranjado II, por

microscopia eletrônica de varredura.


111

0

1020

3040

50

6070

8090

100

17 33 67 83

Concentrações (%)

% M

orta

lidad

e

Ensaio 1

Ensaio 2

Ensaio 3

Ensaio 4


processo de descoloração do Alaranjado II, por Pseudomonas

aeruginosa (UCP 992), após 48 h de cultivo a 40ºC, usando Artemia

salina.


112

TERCEIRO ARTIGO

Potencial Aplicação do Consórcio de Geobacillus

stearothermophilus UCP 986 e Pseudomonas aeruginosa UCP

992 no Processo de Descoloração do Alaranjado II

Manuscrito submetido no periódico

Journal of Hazardous Materials


113

Potencial Aplicação do Consórcio de Geobacillus

stearothermophilus UCP 986 e Pseudomonas aeruginosa UCP

992 no Processo de Descoloração do Alaranjado II

N.S. Evangelista-Barreto, Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas,

Universidade Federal de Pernambuco, Av. Professor Moraes Rego s/n, Cidade

Universitária, 50.670-901 Recife, PE, Brasil;

L. Cordi, Laboratório de Química Biológica, Universidade Estadual de Campinas,

Cidade Universitária “Zeferino Vaz”, Caixa Postal 6154, Distrito de Barão Geraldo,

Campinas, SP, Brasil;

N. Durán, Laboratório de Química Biológica, Universidade Estadual de Campinas,

Cidade Universitária “Zeferino Vaz”, Caixa Postal 6154, Distrito de Barão Geraldo,

Campinas, SP, Brasil e Núcleo de Ciências Ambientais, Universidade de Mogi das

Cruzes, SP, Brasil.

R.H.S.F. Vieira, Departamento de Engenharia de Pesca e Instituto de Ciências do

Mar-LABOMAR, Universidade Federal do Ceará, Av. Abolição, 3207, Meireles,

60.165-081, Fortaleza, Ceará, Brasil *G.M. Campos-Takaki, Departamento de Química e Núcleo de Pesquisa em

Ciências Ambientais, Universidade Católica de Pernambuco, Rua Nunes

Machado, 42, Boa Vista. 50.050-590 Recife, PE, Brasil. Tel.: +55-81-2119.4017

Fax: +55-81-2119.4043. E-mail: [email protected]


114

RESUMO

A descoloração do azo corante Alaranjado II (0,050 mM) foi realizada

utilizando Geobacillus stearothermophilus (UCP 986) e Pseudomonas aeruginosa

(UCP 992), sob condições aeróbica e semi-aeróbica, por 48 h a 40ºC. A cor

remanescente, pH, biomassa, dosagem de proteínas totais, consumo de glicose e

toxicidade foram monitorados em intervalos de 12 h. Nos ensaios com 24 h

contendo G. stearothermophilus remoção do corante de 90% foi observada. Após

a adição de P. aeruginosa, remoção total do corante ocorreu com 36 h. O pH do

meio variou de 5,7 a 8,1 e a glicose foi consumida com 12 h. A glicose usada

como fonte de energia inicial, favorece o processo de descoloração. A biomassa

final foi de 2,54 g L-1 e a absorção dos nutrientes foi observada pela diminuição no

perfil protéico ao longo do cultivo. Bioensaios (CL50) usando Selenastrum

capricornutum nas amostras descoloridas apresentaram uma toxicidade ao redor

de 50%, no entanto, ao usar Artemia salina nenhuma toxicidade foi observada. A

descoloração do azo corante Alaranjado II pelo consórcio bacteriano demonstrou

ser um processo promissor no tratamento de amostras coloridas.

Palavras-chave: Descoloração, Geobacillus stearothermophilus, Pseudomonas

aeruginosa, corante têxtil, detoxificação.


115

1. Introdução

Os corantes sintéticos têm sido intensamente usados no setor têxtil e em

tinturarias devido a fácil aplicação, baixo custo, firmeza e variedade de cores

quando comparados aos corantes naturais [1].

Os azo corantes compreendem a maioria dos corantes têxteis produzidos,

sendo comumente usados nas indústrias de impressão de papel, têxtil e

cosméticos [2, 3]. Os compostos azo são caracterizados pela presença de uma ou

mais ligações -N=N-, em associação com um ou mais sistemas aromáticos [1].

Acredita-se que cerca de 1000 mg/L de corantes esteja presente nos banhos de

tingimento [4], e devido à solubilidade na água [5], cerca de 40% do composto

não é fixado durante o processo de tingimento, sendo então liberado para o

ambiente [6]. A maioria destes compostos é altamente resistente ao ataque

microbiano e conseqüentemente, de difícil remoção nos efluentes, quando

tratados por processos biológicos convencionais, a exemplo do lodo ativado [7].

Atualmente, a aplicação de consórcios bacterianos tem sido de grande

interesse por parte da comunidade científica, principalmente, na elaboração de

novas metodologias com aplicação de novos microrganismos. A atividade

catabólica dos microrganismos em consórcios se complementa e interações

sintróficas presentes nestas comunidades pode conduzir a completa

mineralização dos azo corantes [8, 9].

A degradação bacteriana de compostos azo é freqüentemente iniciada sob

condições anaeróbicas por uma via de transformação enzimática que envolve a

quebra da ligação azo, através de enzimas azoredutases que utilizam à coenzima

reduzida NADH como doadora de elétrons [10]. Contudo, o processo de


116

descoloração anaeróbico apresenta como principal desvantagem a produção de

aminas aromáticas [11], consideradas mutagênicas e carcinogênicas [12]. Os azo

corantes, no entanto, podem sofrer completa mineralização numa etapa aeróbica

posterior através de enzimas não especificas, com hidroxilação e fissão do anel

aromático [13].

Nigam et al. [14] relataram 100% de remoção da cor, utilizando cultura

bacteriana mista, em amostras de efluente, contendo corantes reativos azo e

diazo. Abraham et al. [11] também relataram elevada eficiência de degradação de

uma mistura de corantes azo, usando um consórcio bacteriano aeróbico. Baseado

nisso, um consórcio bacteriano utilizando Geobacillus stearothermophilus UCP

986 e Pseudomonas aeruginosa UCP 992 foi realizado para avaliar a

descoloração e biodegradação do azo corante Alaranjado II, sob condições

aeróbicas e microaerofílicas.


2.1. Microrganismos

Foram utilizados duas espécies bacterianas, Geobacillus stearothermophilus

UCP 986, isolado de efluente de lodo têxtil na indústria Suape Têxtil,

Pernambuco, Brasil e Pseudomonas aeruginosa UCP 992, pertencente ao Banco

de Culturas do Núcleo de Pesquisa em Ciências Ambientais, NPCIAMB, UNICAP,

PE. Os isolados foram mantidos em meio Agar nutriente a 4ºC.


117

2.1. Métodos Microbiológicos

2.1.1. Condições de cultivo

O pré-inóculo mantido por 12 h de cada microrganismo foi cultivado em 50 mL

de caldo Luria Bertani (LB) [15] em frascos Erlenmeyers de 125 mL de

capacidade e incubados sob agitação orbital de 150 rpm a 40ºC. Em seguida, um

inóculo de 1% do cultivo de G. stearothermophilus foi transferido para frascos

Erlenmeyers com capacidade de 250 mL, contendo 50 mL do meio LB com a

seguinte composição (g L-1): triptona 10, extrato de levedura 5 e NaCl 10,

adicionado de glicose 0,5 [16], pH 7,0 ± 0,2. Após o inóculo, foi acrescido o

corante Alaranjado II, na concentração final de 0,050 mM. Os frascos foram

mantidos sob agitação de 75 rpm por 24 h a 40ºC. Em seguida, um inóculo de 1%

de P. aeruginosa, foi adicionado ao meio, e os frascos deixados em repouso por

12 h e posteriormente submetidos à nova agitação (12 h). Alíquotas do

sobrenadante nos intervalos de 12, 24, 36 e 48 h foram retiradas para o

monitoramento da cor, pH, consumo de glicose e dosagem de proteínas. Ao final

de cada tempo, a biomassa era centrifugada a 4.000 rpm por 15 min. a 4ºC e

posteriormente submetida a liofilização para determinação do peso seco. Frascos

controle sem o microrganismo foram mantidos nas mesmas condições. Todos os

experimentos foram realizados em triplicata, sob condições controladas.

2.1.2. Ensaios com o corante

O corante Alaranjado II (C.I. 15510) do tipo azo reativo, foi adquirido da Sigma

(Sigma-Aldrich Corporation, St. Louis, Missouri, USA). O Alaranjado II apresenta

absorbância máxima a 485 nm e sua estrutura é ilustrado na Figura 1. A


118

descoloração do azo corante foi monitorada no comprimento de onda máxima do

sobrenadante após centrifugação (10.000 g por 8 min.), usando espectrofotômetro

UV-VIS (Espectronic Gênesis modelo 2). A eficiência na remoção da cor foi

expressa pela relação do percentual de descoloração da concentração inicial do

corante.

Remoção da cor (%) = (A) – (B) x 100

(A)

onde (A) indica a absorbância do caldo não inoculado e (B) indica a absorbância

residual do caldo.

2.1.3. Atividade fenoloxidase

O teste foi realizado a partir do cultivo de G. stearothermophilus e P.

aeruginosa em caldo LB a temperatura de 45 e 35°C, respectivamente, por 24 h.

Em seguida discos de cinco milímetros de diâmetro foram removidos,

assepticamente, e transferidos para o centro de placas de Petri contendo 20 mL

do meio Agar LB contendo ácido tânico e gálico (0.5%). A confirmação positiva no

teste foi observada através de uma zona de coloração marrom escuro ao redor

dos discos [17]. Placas sem o ácido tânico e gálico também foram utilizadas como

controle negativo.

Para testar a atividade de enzimas no líquido metabólico livre de células, após

a descoloração, discos de oxidase da SENSOBIODISC/CECON® foram

adicionados em tubos de ensaio contendo 2 mL da amostra. A positividade do

teste foi observada através da coloração rósea do meio.


119

2.2. Métodos Analíticos

2.2.1. Determinação do pH, consumo de glicose e proteínas totais

O pH do líquido metabólico livre de células foi medido utilizado um pHmetro

Orion, modelo 310. O consumo de glicose foi determinado no líquido metabólico

livre de células através de kit comercial (Labtest®). A dosagem de glicose consiste

no método enzimático colorimétrico glicose-oxidase usando uma solução padrão

de glicose (100 mg dL-1) e medido espectrofotometricamente a 505 nm. A

determinação do consumo de proteínas foi realizada usando o método

colorimétrico do Biureto (kit Labtest®), com leitura de absorbância a 545 nm.

2.3. Testes de Toxicidade

2.3.1. Selenastrum capricornutum

O teste de toxicidade foi realizado usando a alga verde de água doce

Selenastrum capricornutum (adquirida na coleção de culturas de algas da

EMBRAPA, Jaguariúna/São Paulo, Brasil) [18]. Os ensaios foram realizados em

Erlenmeyers de 125 mL contendo diferentes concentrações (2,5, 5,0, 10 e 26 mL)

da amostra teste, meio mineral e a alga (inóculo - 106 cels mL-1 / 72 h / Aa 0,160 a

680 nm). Ensaios controle e branco também foram realizados. Todos os frascos

foram incubados a 24ºC e expostos sob agitação constante (100 rpm) à luz

fluorescente branca, para assegurar o crescimento exponencial das algas. Após

72 h, a densidade da alga foi medida através da fluorescência da clorofila das

algas, usando fluorímetro modelo F-4500 (Hitachi), para determinação da CL50.

Os ensaios foram realizados em triplicata e o volume final do teste era de 30 mL.


120

2.3.2. Artemia salina

A toxicidade frente ao microcrustáceo A. salina foi determinada apenas pela

porcentagem de morte dos organismos em relação ao seu número total (10

larvas), na presença de diferentes concentrações da amostra teste, por 24 h [19].

O método consistiu em avaliar a morte das larvas de A. salina (cistos de camarão

disponíveis em lojas de alimentos para peixes), cultivando-os em diferentes

concentrações (17, 33, 67 e 83%) da amostra teste diluídas em 5 mL de água do

mar artificial (38 g L-1 de sal marinho). Após 24 h era feita a contagem dos

organismos sobreviventes, determinando-se a dose limite do poluente (CL50). Os

experimentos foram realizados em triplicata.


A descarga de efluentes coloridos no ambiente tem causado sérios problemas

ambientais. Os métodos geralmente utilizados no tratamento de efluentes

contendo corantes são os métodos físico-químicos. No entanto, a aplicação do

tratamento biológico tem sido mais atrativo, devido seu baixo custo e menor

impacto causado ao ambiente.

Devido a natureza recalcitrante dos azo corantes durante a degradação

aeróbica, o uso de consórcios microbianos tem demonstrado elevada eficiência

na degradação de alguns compostos azo. Segundo Watanabe and Baker [20] a

utilização de consórcios bacterianos contribui para que os microrganismos

possam agir em diversos poluentes.


121

3.1. Descoloração do corante

No presente estudo, um consórcio bacteriano combinado contendo G.

stearothermophilus (UCP 986) e P. aeruginosa (UCP 992), mantidos numa

seqüência agitação-repouso-agitação foi realizado a fim de descolorir o azo

corante Alaranjado II. A taxa de descoloração do corante é mostrada na Figura 2.

Com 12 h de cultivo, mais de 50% do corante já havia sido removido. Neste

intervalo, (cultivo apenas com G. stearothermophilus) o processo de descoloração

ocorreu em parte por biosorção, visto que a biomassa foi prontamente colorida.

Segundo Chen [21], o acúmulo do corante, pode indicar toxicidade crônica às

células, onde a bioacumulação (para degradação ou armazenamento) é uma

condição necessária a sobrevivência da célula. Ainda nestas condições, a

biomassa celular apresentou um rendimento de 2,54 g L-1 (Figura 3). Após o

período de 24 h, apenas 10% do corante remanescente permanecia no meio,

indicando que a agitação moderada não afetou o processo de descoloração,

contribuindo ainda para aumentar a biomassa celular. Neste intervalo de tempo, a

descoloração ocorreu apenas por degradação, visto que a biomassa se

apresentava incolor. Nos frascos controle, sem a adição do microrganismo, não

houve alteração na cor.

Embora, os azo corantes tenham sido considerados como não sendo

biodegradáveis por bactérias, sob condições aeróbicas [14], devido a inibição da

enzima azoredutase pelo oxigênio [21], alguns compostos azo, têm sido relatados

como sendo reduzidos sob condições aeróbicas ou microaerofílicas [22].

No intervalo de tempo em que os frascos foram mantidos sob repouso (24 - 36

h) e P. aeruginosa foi adicionada ao meio, descoloração total e rendimento celular

máximo de 5,35 g L-1 foi observando. A etapa final (sob agitação) teve como


122

objetivo eliminar a presença de possíveis compostos facilmente oxidáveis,

formados durante a etapa de repouso. Nestas condições, os microrganismos já

apresentavam uma fase de declínio (biomassa 4,77 g L-1), provavelmente devido

à escassez de nutrientes (Figura 2).

A aplicação de consórcios na descoloração de corantes têxteis tem sido

bastante promissora, porque os microrganismos podem agir sinergicamente em

uma variedade de corantes e misturas de corantes, sendo degradados

principalmente, por co-metabolismo [20].

Alguns parâmetros foram analisados para análise do crescimento: faixa de pH,

consumo de glicose e dosagem protéica.

O pH diminuiu com 12 h (5,7), tendendo a faixa alcalina ao final do cultivo

(8,1). A diminuição inicial do pH é justificada pelo acúmulo de ácidos orgânicos,

resultante da degradação da glicose, quase totalmente ausente neste intervalo de

tempo. O aumento do pH, provavelmente ocorreu devido à formação de

compostos básicos, como por exemplo, aminas [23], sugerindo a degradação do

corante (Figura 2).

Segundo Adedayo et al. [24] a descoloração total do corante Vermelho de

Metila (5 mg L-1) usando um consórcio bacteriano, foi observada após 6 h em pH

6 e 7 e de apenas 82 e 65% em pH 8 e 9, respectivamente.

Com relação à adição do co-substrato, a glicose durante o co-metabolismo é

citada como realçando a eficiência de redução da cor. Segundo Van der Zee and

Villaverde [25] a descoloração dos azo corantes é um processo relativamente não

específico com relação ao seu doador de elétrons, no entanto, a presença de um

doador de elétron externo é um pré-requisito importante na redução dos azo

corantes. Mendez-Paz et al. [26] relataram que a taxa de remoção do corante


123

Alaranjado II foi altamente favorável quando a glicose era adicionada como co-

substrato. Por outro lado, Albuquerque et al. [28] citaram que a remoção de cor do

Alaranjado II sob condições anaeróbicas era muito baixa usando amido,

aumentando significantemente, com a adição do lactato.

O efeito favorável da glicose na degradação dos azo corantes ocorre devido o

aumento na formação de equivalentes redutores (flavina nucleotídeos), que são

responsáveis pela redução do corante [3, 28]. Por outro lado, mediadores redox

são bastante eficazes na redução de compostos azo, provavelmente devido a

natureza de seu grupo cromóforo -N=N-, que é eletronicamente instável e tem

capacidade de receber elétrons na forma reduzida do mediador [29].

Com relação à dosagem de proteínas totais (Tabela 1) analisadas no líquido

metabólico livre de células, se observou uma diminuição em torno de 50% ao fim

do cultivo, indicando um comportamento bioquímico clássico de absorção dos

nutrientes [30].

A ação de enzimas azoredutases insensíveis ao oxigênio envolvidas na

descoloração de alguns azo corantes, foi descrita por Zimmermann et al. [10]. A

partir daí, outros estudos demonstraram que algumas espécies bacterianas são

capazes de degradar aerobicamente estes compostos. Nachiyar and Rajkumar

[22] demonstraram a atividade de uma azoredutase (11U), como sendo

responsável pela redução da ligação azo na descoloração do Navitan Fast Blue

S5R.

Segundo Durán and Esposito [31] um número de enzimas oxidativas, como

peroxidases e/ou fenoloxidases podem agir em poluentes recalcitrantes

específicos, pela precipitação ou transformação para outros produtos, permitindo

assim, melhor tratamento final do disperdício.


124

Considerando as informações da literatura, realizou-se testes de detecção da

atividade de fenoloxidase pelos microrganismos estudados. O teste foi realizado

usando ácido tânico e gálico como indicador e ambos os microrganismos

apresentaram atividade positiva. A adição de discos de oxidase bacteriana no

líquido metabólico livre de células também foi realizada, apresentando

positividade para este teste (Tabela 1).

Segundo Nachiyar and Rajkumar [22] Bacillus stearothermophilis (hoje

denominado G. stearothermophilus), tem sido considerado capaz de produzir

peroxidases. A lacase peroxidase independente produzida por uma espécie

bacteriana não identificada (BF2) foi citada como sendo a maior enzima oxidativa

envolvida na degradação de compostos azo [32]. Enquanto Flavibacterium é

capaz de produzir peroxidase na degradação aeróbica de compostos azo [33].

3.2. Avaliação da toxicidade

A porção não-biodegradável do corante formada durante o processo de

descoloração através de seus produtos intermediários ou compostos estáveis é

conhecida como sendo responsável pela toxicidade [34]. Segundo Carliell et al. [2]

as aminas aromáticas são mais tóxicas que seu composto original porque

penetram nas células dos microrganismos com maior facilidade.

Segundo Mendez-Paz et al. [28] a redução do corante Alaranjado II forma

como produtos intermediários, ácido sulfanílico e 1-amino-2-naftol, este último

quase nunca encontrado porque se auto-oxida rapidamente a 1,2-naftolquinona.

Devido a toxicidade apresentada por alguns corantes em seus intermediários

formados pela clivagem parcial da molécula, testes de toxicidade após a


125

descoloração do Alaranjado II foram realizados usando dois organismos

indicadores, à alga de água doce S. capricornutum e o microcrustáceo A. salina.

A toxicidade crônica foi avaliada usando S. capricornutum, sendo observada

inibição no crescimento dos organismos, quando expostos aos ensaios após 24 e

48 h de descoloração, em todas as concentrações testadas, quando comparadas

ao controle (Tabela 2).

Os valores da CL50 (concentração que causa 50% de inibição no crescimento

da alga) das amostras testes após 24 e 48 h de descoloração, calculados a partir

de curvas de regressão logarítmica (concentração da amostra versus inibição da

alga), foram de 17,8 e 8,7 mL (v.v-1), respectivamente. Segundo Reginatto [18], o

ensaio com algas, às vezes não permite diferenciar se o efeito causado pelas

amostras coloridas é um efeito tóxico real, ou, simplesmente, se a luz fornecida às

algas para seu crescimento, foi em parte, absorvida por estas amostras. Assim,

um outro bioensaio de toxicidade, empregando o microcrustáceo A. salina foi

realizado.

Os testes usando este bioindicador foram realizados em todos os intervalos de

descoloração estudados (12, 24, 36 e 48 h). Diferente dos resultados

apresentados para S. capricornutum, a toxicidade observada para A. salina

diminuiu com o decorrer da remoção do corante, ou seja, nas amostras com 12 e

24 h de descoloração, uma mortalidade de 37% e 17%, respectivamente, foi

observada apenas na maior concentração testada (83%), quando comparadas ao

controle. Nas amostras com 36 e 48 h de descoloração, a toxicidade foi

praticamente zero em todas as concentrações testadas. Assim, a diminuição na

toxicidade dos metabólitos formados no decorrer da descoloração, sugere a

degradação do composto. Segundo Isik and Sponza [34] uma seqüência de


126

processos biológicos anaeróbicos e aeróbicos são mais efetivos para reduzir a

toxicidade.

4. Conclusões

Baseado nisso, pode-se concluir que o consórcio microbiano contendo os

microrganismos G. stearothermophilus (UCP 986) e P. aeruginosa (UCP 992)

descolore efetivamente o azo corante Alaranjado II sob condições aeróbicas e

microaerofílicas, sugerindo a sua aplicação no tratamento de efluentes contendo

este composto e assim, podendo ser descarregado nos corpos d’água sem

causar danos a biota.

Agradecimentos Os autores agradecem à agência financiadora CNPq, FINEP/CTPETRO e

FACEPE pelo suporte financeiro e a UNICAP pelas instalações cedidas.

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131

Tabela 1. Concentração de proteína total e atividade enzimática, do líquido

metabólico livre de células no cultivo de Geobacillus stearothermophilus e

Pseudomonas aeruginosa, durante o processo de descoloração do Alaranjado II,

por 48 h a 40ºC

Ensaios Proteína total (g L-1) Atividade enzimática

(teste de oxidase)

0h 9,80 -

12h 6,60 +

24h 5,90 +

36h 5,20 ++

48h 4,80 ++


132

Tabela 2. Inibição no crescimento da alga Selenastrum capricornutum pelo líquido

metabólico proveniente do processo de descoloração do azo corante Alaranjado II

usando um consórcio microbiano, por 48 h a 40ºC

Inibição no crescimento da alga Selenastrum

capricornutum Concentração

(mL) 24 h (%) CL50

a (mL) 48h (%) CL50b (mL)

2,5 5 25

5 20 37

10 40 58

26 57

17,8

69

8,7

aCL50 24h: Eq: y = 22.654Lx(x) - 15.297 (R2 = 0.9912) bCL50 48h: Eq: y = 19.581Ln(x) + 7.6652 (R2 = 0.9674)


133

Figura 1. Estrutura química do azo corante Alaranjado II.

N = N

OH

NaO3S

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

110

0 12 24 36 48

Tempo (h)

% D

esco

lora

ção

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

pH

corante biomassa glicose pH

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

5

5,5

6

Biom

assa

(g L

-1)

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

Glic

ose

(g L

-1)

Figura 2. Biomassa, pH, consumo de glicose e descoloração do azo

corante Alaranjado II usando um consórcio bacteriano, por 48 h a 40ºC.


134

QUARTO ARTIGO

Processo de Descoloração e Detoxificação de um Efluente

Têxtil por Geobacillus stearothermophilus, Pseudomonas

aeruginosa e P. fluorescens, Isolados e em Cultura Mista


Water Research


135

Processo de Descoloração e Detoxificação de um Efluente

Têxtil por Geobacillus stearothermophilus, Pseudomonas

aeruginosa e P. fluorescens, Isolados e em Cultura Mista

Norma S. Evangelista-Barreto1,4, Nelson Duran2,3, Lívia Cordi2, Regine H. S.

dos F. Vieira4, Galba M. Campos-Takaki1,5,6*

1Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas, UFPE, PE, Brasil

2Instituto de Química, Universidade Estadual de Campinas-UNICAMP, SP, Brasil

3Núcleo de Ciências Ambientais, Universidade de Mogi das Cruzes, SP, Brasil

4Instituto de Ciências do Mar-LABOMAR, UFC, CE, Brasil

5Núcleo de Pesquisa em Ciências Ambientais, UNICAP, PE, Brasil

6Departamento de Química, UNICAP, PE, Brasil

*Correspondência do autor: Galba Maria de Campos-Takaki, Departamento de Química, Núcleo de Pesquisas em Ciências Ambientais, Universidade Católica de Pernambuco, Rua Nunes Machado, 42, Boa Vista. 50050-590 Recife – Pe, Brasil. Tel. +00-55-81-2119.4017; fax: +00-55-81-2119.4043. E-mail: [email protected]


136

RESUMO

A descoloração e detoxificação do efluente têxtil contendo o azo corante

Alaranjado II foram avaliadas usando três bioensaios contendo diferentes

combinações dos microrganismos Geobacillus stearothermophilus, Pseudomonas

aeruginosa e P. fluorescens, sob agitação e/ou repouso, com e sem adição de

nutrientes. Os resultados obtidos indicaram que a descoloração depende do tipo

de bioensaio e do tempo de cultivo. O Alaranjado II foi totalmente removido pelos

três bioensaios, na presença de nutrientes. A adição de glicose e extrato de

levedura aumentou efetivamente a eficiência do processo de descoloração

usando G. stearothermophilus. Em todos os bioensaios o pH do meio foi de 8,0 e

9,5. A remoção do carbono orgânico total (COT) nos bioensaios I (G.

stearothermophilus), II (P. aeruginosa e P. fluorescens) e III (consórcio dos três

microrganismos) foi de 70, 60 e 80%, respectivamente. A redução da demanda

química de oxigênio (DQO) variou em torno de 50-70%. Nos testes de toxicidade

usando Selenastrum capriconurtum e Artemia salina, redução parcial ou total da

toxicidade, formada a partir dos metabólitos produzidos durante a etapa de

clivagem da molécula do corante, foi observada apenas por Artemia salina,

quando comparada ao composto original.

Palavras-chave: efluente têxtil, descoloração, toxicidade, azo corante, consórcio.


137

1. Introdução

Considerando à baixa fixação dos corantes durante o processo de tingimento

têxtil, uma descarga altamente colorida é perdida diretamente para o ambiente,

causando sérios danos ao ecossistema (Robinson et al., 2002). A presença de

pequenas concentrações de corantes nos efluentes é altamente visível e não

desejável, não somente devido à estética, mas principalmente, devido à redução

da luz, afetando o processo de fotossíntese (McMullan et al., 2001).

Neste sentido, as leis de proteção ambiental procuram ser claras quanto aos

critérios para lançamento de resíduos líquidos industriais no meio ambiente,

permitindo a eliminação dos resíduos somente após serem tratados, desde que

essa operação não implique na poluição das águas receptoras. Entretanto, a

degradação do ambiente prova à ineficiência desses tratamentos, sobretudo ao

supor que o ambiente pode tolerar determinado grau de poluição (Zanoni &

Carneiro, 2001; Uygur, 2001).

Os processos de tratamentos adotados pelas indústrias têxteis operam

basicamente por meio de sistemas físico-químicos, incluindo fotólise, coagulação,

ozonização, filtração por membranas ou avançados processos de oxidação

(APOs), dentre outros (Lin & Peng, 1996; Ciardelli et al., 2000; Ledakowicz et al.,

2001. Contudo, tais tecnologias para o setor têxtil, são consideradas dispendiosas

e de difícil manuseio (Robinson et al., 2001). Por outro lado, tais métodos

concentram os poluentes numa fase sólida ou líquida, requerendo tratamento

adicional ou de disposição. Os tratamentos biológicos, por sua vez, podem

promover a completa mineralização dos compostos poluentes, além de se

apresentar como uma tecnologia de baixo custo (Shaw et al., 2002).


138

O tratamento com microrganismos vivos ou inativados tem possibilitado a

remoção de corantes e efluentes têxteis, promovendo a descoloração através de

mecanismos enzimáticos e interações físico-químicas entre a molécula do corante

e os componentes da superfície de parede celular (Kunz et al., 2002; Aksu, 2005).

Adicionalmente, a complexidade dos consórcios microbianos se apresentam

como tecnologias alternativas que permitem agir em uma grande variedade de

poluentes (Watanabe & Baker, 2000; Senan & Abraham, 2004).

Segundo Seshadri et al. (1994) a descoloração de alguns azo corantes foi

realizada usando lodo ativado, em uma etapa anaeróbica e aeróbica. Neste

sistema, as ligações azo foram reduzidas na fase anaeróbica, resultando em

aminas aromáticas que foram degradadas aerobicamente via hidroxilação e

clivagem do anel aromático.

Uma outra rota a ser explorada é o emprego de microrganismos

termotolerantes ou termofílicos em sistemas de descoloração, uma vez que os

efluentes são produzidos em temperaturas elevadas (50-60ºC). Alternativamente,

as enzimas sintetizadas por estes microrganismos são de grande interesse no

âmbito biotecnológico. Este trabalho foi realizado na tentativa de investigar o

potencial de descoloração de um efluente têxtil usando o termofílico Geobacillus

stearothermophilus UCP 986 associado a Pseudomonas aeruginosa UCP 992 e

P. fluorescens CCT 4056.


139


2.1. Microrganismos

Os experimentos foram realizados usando Geobacillus stearothermophilus

(UCP 986) e Pseudomonas aeruginosa (UCP 992) pertencentes ao Banco de

Culturas no Núcleo de Pesquisa em Ciências Ambientais, UNICAP, Recife, PE, e

Pseudomonas fluorescens (CCT 4056), gentilmente cedida pelo Laboratório de

Química Biológica no Instituto de Química da UNICAMP, São Paulo, SP. As

linhagens foram mantidas em meio Ágar nutriente a 4ºC.

2.2. Alga

A cultura da alga foi adquirida da coleção de culturas de algas da EMBRAPA,

Jaguariúna, SP.

2.3. Corante

O corante do tipo azo reativo, Alaranjado II (C.I. 15510) foi adquirido da Sigma

(Sigma-Aldrich Corporation, St. Louis, Missouri, USA).

2.4. Efluente Têxtil

A amostra do efluente foi adquirida de uma indústria de tingimento de poliéster

na cidade de Americana, São Paulo, Brasil. As características físico-químicas do

efluente são apresentadas na Tabela 1.


140

2.5. Condições Experimentais

2.5.1. Microrganismos e preparação do inóculo

G. stearothermophilus, Pseudomonas aeruginosa e P. fluorescens foram

cultivados em frascos de Erlenmeyers de 125 mL de capacidade, contendo 50 mL

do meio de crescimento caldo LB (g L-1: peptona 10, extrato de levedura 5, NaCl

10 e glicose 5, pH final 7,0 ± 0,2) (Konishi et al., 1997). Os frascos foram

incubados por 12 h sob agitação orbital de 150 rpm e temperatura de 35ºC para

Pseudomona aeruginosa e P. fluorescens e 50ºC para G. Stearothermophilus,

servindo como pré-inóculo.

2.5.2. Bioensaio I: Descoloração por G. stearothermophilus

O experimento foi realizado adicionando 1% do pré-inóculo (108 UFC mL-1) de

G. stearothermophilus em frascos Erlenmeyers de 250 mL, contendo 100 mL do

efluente diluído em água (50:50 v.v-1), a solução corante na concentração final de

0,050 mM (17,5 mg L-1) e uma solução de glicose e extrato de levedura a 0,25%

(v.v-1) (5 mL). O corante foi adicionado em virtude da falta de cor do efluente.

Paralelamente, frascos sem a glicose e extrato de levedura também foram

usados. O experimento foi mantido sob agitação de 150 rpm por 72 h, a 50ºC.

2.5.3. Bioensaio II: Descoloração por P. aeruginosa e P. fluorescens:

Nestas condições 1% de cada pré-inóculo (108 UFC mL-1) foi transferido para

frascos Erlenmeyers de 250 mL, contendo 100 mL do efluente diluído (50:50 v.v-

1), o corante na concentração final de 0,050 mM (17,5 mg L-1) e uma solução de

glicose e extrato de levedura a 0,25% (v.v-1) (5 mL). Frascos sem nutrientes


141

também foram comparados. O experimento foi mantido sob condições estáticas

por 48 h, a 35ºC.

2.5.4. Bioensaio III: descoloração utilizando um consórcio dos três

microrganismos

O experimento foi realizado nas mesmas condições do Bioensaio II, todavia

com agitação de 100 rpm por 48 h.

2.6. Procedimentos analíticos

2.6.1. Determinação do pH

O pH do meio livre de células foi medido a cada 24 h, usando um pHmetro

WTW 320/Set.

2.6.2. Determinação da demanda química de oxigênio (DQO)

Este método é utilizado para determinar o oxigênio necessário para oxidar

toda a matéria orgânica presente na amostra, que seja susceptível a um forte

agente oxidante, como o dicromato de potássio. O método utilizado foi o de

refluxo fechado colorimétrico APHA 5220 C5-12 (1995a), empregando dicromato

de potássio como agente fortemente oxidante (solução digestora), em meio ácido

(H2SO4), na presença de um catalisador (Ag2SO4), a elevada temperatura,

durante 2 horas. A análise consistiu em adicionar 2,5 mL da amostra teste, 1,5 mL

da solução digestora e 3,5 mL da solução H2SO4/ Ag2SO4 (solução catalisadora),

em tubo de digestão fechado, mantido a 150ºC, por 2 horas. A leitura de

absorbância foi realizada a 600 nm.


142

2.6.3. Determinação do carbono orgânico total (COT)

As medidas da concentração de carbono total foram realizadas seguindo a

metodologia padrão APHA 6310B, 1995b), que se baseia na oxidação da matéria

orgânica catalisada a alta temperatura, empregando-se um analisador de carbono

orgânico total, modelo TOC 5000A (Shimadzu). Neste método, uma pequena

quantidade da amostra homogeneizada foi oxidada a 660ºC e catalisada por

platina adsorvida sobre óxido de alumínio. A água foi vaporizada e o carbono

orgânico oxidado a CO2, sendo quantificado por meio de um analisador de

infravermelho não dispersivo. O carbono inorgânico foi medido pela passagem da

amostra em uma câmara de reação que contém ácido fosfórico, na qual foi

convertido a CO2 e quantificado de maneira semelhante à descrita anteriormente.

O carbono orgânico total foi então obtido pela diferença entre o carbono total e o

carbono inorgânico.

2.6.4. Determinação da concentração do corante

A cada intervalo de 24 h, alíquotas de 2 mL foram centrifugadas a 10.000 g

por 8 min., para separação das células do líquido metabólico. A concentração do

corante no meio foi avaliada pela diminuição da absorbância, empregando

espectrofotômetro Hitachi modelo U-2000. O comprimento de onda foi fixado pela

absorção máxima do corante na região do visível, a 485 nm. A concentração do

corante foi calculada pela absorbância do caldo não inoculado e absorbância

residual do caldo.


143

2.7. Testes de toxicidade

2.7.1. Toxicidade crônica

A toxicidade crônica foi realizada com a alga Selenastrum capricornutum,

segundo o método descrito por Reginatto (1998). Este teste consistiu no

crescimento da alga em diferentes diluições do efluente descolorido (2,5, 5, 10 e

26 mL), no meio mineral durante 72 h. O inóculo inicial foi de 106 cel mL-1 (Aa

0,160 a 680 nm). O crescimento da alga foi determinado por fluorescência

(fluorímetro modelo F-4500, Hitachi) a 680 nm, excitação a 435 nm. Os ensaios

foram realizados em triplicata para cada diluição da amostra teste.

2.7.2. Toxicidade aguda

Para este teste se utilizou a metodologia descrita por Meyer et al. (1982). O

método consiste em avaliar a morte das larvas de Artemia salina, cultivadas em

diferentes concentrações da amostra teste (17, 33, 67 e 83%) diluídas em 5 mL

de água artificial do mar, por 24 h. Em seguida, realizou-se a contagem dos

organismos sobreviventes, determinando-se a dose limite do poluente (CL50). Os

experimentos foram realizados em triplicata. O controle foi realizado contendo

somente água do mar.


A descoloração do efluente têxtil contendo o azo corante Alaranjado II foi

avaliada utilizando três diferentes condições experimentais. Os microrganismos

G. stearothermophilus, Pseudomonas aeruginosa e P. fluorescens isolados e em


144

consórcios foram usados no efluente contendo nutrientes (A) e efluente sem

nutrientes (B).

A ineficiência da descoloração aeróbica, inicialmente conhecida, tem sido

confirmada por vários pesquisadores (Wong & Yuen, 1996; Adedayo et al., 2004;

Senan & Abraham, 2004) e somente em alguns casos ensaios de toxicidade

foram realizados.

3.1 Descoloração do efluente

Quando comparando os três Bioensaios, observou-se que as melhores taxas

de remoção foram obtidas nos Bioensaios II e III e efluentes A e B. No Bioensaio

II e efluente B, a descoloração total ocorreu com 24 h, enquanto no Bioensaio II e

efluente A, a descoloração foi de 90%. Por outro lado, no Bioensaio III, observou-

se o contrário, ou seja, total remoção do corante no efluente A e remoção de 92%

no efluente B (Figura 1). Assim, a aplicação dos consórcios apresentou melhor

eficiência no processo de descoloração do efluente têxtil.

Segundo Chang et al. (2001), redução parcial e/ou completa clivagem na

ligação azo do corante Reativo Vermelho 22 foi observada por P. luteola, sendo

as enzimas azoredutases responsáveis pela clivagem do grupo azo.

A maior remoção do COT (80-90%) e DQO (50-70%) foi observada no

Bioensaio III e efluente A, enquanto no efluente B, foi de 80% e 76%,

respectivamente. No Bioensaio II efluentes A e B, a remoção do COT e DQO

ocorreu em torno de 60 e 50%, respectivamente (Tabela 2). Segundo Supaka et

al. (2004) nos processos aeróbicos, a presença de uma fonte de energia


145

disponível nos efluentes sintéticos, resulta na redução mais rápida da DQO,

devido ao crescimento celular e a manutenção da cultura.

A DQO restante presente no efluente, demonstra a recalcitrância do azo

corante, sugerindo que a sua remoção seja independente da atividade

degradadora (Mendez-Paz et al., 2005). Por outro lado, a baixa redução do COT é

sugerida pela biotransformação do azo corante em outros compostos

intermediários, como as aminas, porém sem nenhuma mineralização (Mendez-

Paz et al., 2005a). Segundo Supaka et al. (2004) a mineralização das aminas

aromáticas por meio do tratamento aeróbico, ocorre através de enzimas não

específicas que atuam na hidroxilação e fissão do anel dos compostos

aromáticos.

A re-coloração do meio (83%) foi observada no Bioensaio III efluente B (Figura

1). Resultados semelhantes foram encontrados por Libra et al. (2004) ao

estudarem a descoloração e parcial mineralização do corante diazo Reativo Preto

5 e observaram que a forma oxidada de um de seus metabólitos, que permanecia

no efluente aeróbico, apresentava cor, embora, nenhum traço do corante

estivesse presente. Hao et al. (2004) também relataram que o re-aparecimento da

cor pode ser causado pela modificação que a biomassa produz na molécula do

corante, que dependendo do arranjo formado, produz outros cromóforos coloridos

e também aminas, que ao serem parcialmente quebradas, podem ego-polimerizar

e formar compostos biológicos recalcitrantes e coloridos.

Com relação ao Bioensaio I, observou-se que a melhor remoção da cor (99%)

foi alcançada apenas com 72 h de cultivo, no efluente A (com nutrientes) (Figura

1). Este fato pode ser justificado pela baixa concentração do co-substrato,

evidenciado principalmente, no efluente sem nutrientes, que apresentou remoção


146

máxima da cor de 53%. A redução do COT e DQO foi de 60-70% e 45-50% para

o efluente A, respectivamente, e de 70% e 65%, respectivamente, para o efluente

B (Tabela 2). Nestas condições, re-coloração do meio também foi observada no

efluente B.

Embora, G. stearothermophilus tenha sido capaz de usar o corante como fonte

de carbono, a ausência de nutrientes, afetou o processo de descoloração,

apresentando uma remoção da cor inferior aquela observada em caldo Luria

Bertani (Evangelista-Barreto, 2004).

O aumento na eficiência da descoloração dos azo corantes requer doadores

de elétrons. Segundo Verma & Madamwar (2005) a glicose é a melhor fonte de

carbono usada na descoloração destes compostos. No entanto, em alguns casos,

outros substratos como acetato, etanol, amido, etc., podem ser mais indicados,

devido à própria natureza do substrato ou o microrganismo envolvido (Van der

Zee & Villaverde, 2005). Para Mendez-Paz et al. (2005a) a adição de glicose, fez

com que a remoção do Alaranjado II ocorresse mais rápida.

Por outro lado, os corantes quando reduzidos, também podem agir como

aceptor de elétrons na cadeia transportadora de elétrons (Adedayo et al., 2004).

Em alguns casos, na ausência de um doador de elétron como a glicose, os

substratos endógenos da biomassa fornecem equivalentes redutores necessários

à redução do corante (Van der Zee et al., 2001).

Segundo Van der Zee et al. (2000) a redução do Alaranjado II também pode

ocorrer na presença de 1-amino-2-naftol (1A2N) uma das aminas formadas, que

atua como mediador redox, acelerando a taxa de redução.

Com relação ao pH do meio, observou-se uma tendência alcalina (7,0 - 9,0)

em todos os Bioensaios, com exceção do Bioensaio I, efluente A (pH 6,6). A faixa


147

alcalina sugere a presença de possíveis compostos aminados, formados durante

a clivagem redutiva do corante (Tabela 2). A diminuição no pH se deve ao

metabolismo da glicose por G. stearothermophilus, formado compostos ácidos.

Os resultados da análise de variância realizada em função do Bioensaio e

efluente, são mostrados na Tabela 3. Devido o Fcalculado ter sido superior ao

Ftabelado, pode-se concluir, para um nível de significância de 5%, que o tipo de

bioensaio, tipo de efluente e a interação de ambos, afeta a descoloração do

efluente analisado.

O teste Tukey, calculado para comparar as médias dos Bioensaios, mostrou

para um nível de significância de 5%, que a diferença mínima significativa (dms)

de 4,994, foi menor que as médias calculadas para os Bioensaios II e III (~ 22),

logo, pode-se afirmar que as culturas contendo os consórcios (Bioensaios II e III)

são mais eficientes no processo de descoloração do efluente têxtil do que a

cultura no Bioensaio I. Quando comparando as médias do tipo de efluente (A e B)

encontrou-se uma dms de 6,264. Neste caso, apenas a condição A (efluente com

nutrientes) foi estatisticamente significativa (~12), podendo-se afirmar que o

efluente que recebeu os nutrientes, apresentou melhor eficiência de descoloração

do que o efluente sem nutrientes.

Dessa maneira, a degradação de compostos recalcitrantes com características

xenobióticas, usualmente requer atividade catabólica, que na maioria das vezes,

não pode ser exercida por um único microrganismo (Rajaguru et al., 2000). No

presente estudo, pôde-se observar que a aplicação de consórcios aumentou a

eficiência de descoloração do efluente têxtil e que a ausência de uma fonte de

carbono externa afetou fortemente a descoloração usando o termofílico G.

stearothermophilus.


148

3.2. Avaliação da toxicidade

Os ensaios de toxicidade realizados após a etapa de descoloração dos

compostos azo, podem ser interpretados como evidências indiretas da formação

de aminas aromáticas e o seu potencial tóxico.

A toxicidade do efluente colorido após o processo de descoloração, foi

avaliada usando a alga S. capricornutum (toxicidade crônica) e o microcrustáceo

A. salina (toxicidade aguda). Com relação à taxa de crescimento da alga, se

observa inibição em todas as diluições testadas, quando comparadas ao controle

(Tabela 4). Na concentração contendo 10 mL da amostra, houve inibição no

crescimento da alga em torno de 50%, com inibição de 100% na maior

concentração (26 mL). A amostra do efluente sem a adição do corante, não

apresentou inibição no crescimento das algas. Os valores da CL50 (concentração

que causa 50% de inibição no crescimento da alga), obtidos a partir de curvas de

regressão (Freire, 2002) são apresentados na Tabela 4. A maior CL50 foi obtida no

Bioensaio I, efluente B, que apresentou a menor descoloração do efluente.

Segundo Reginatto (1998) amostras coloridas podem não ser indicadas para

este tipo de teste, uma vez que a cor do corante, além da presença de moléculas

orgânicas, pode interferir na determinação da concentração da alga.

Em virtude da baixa eficiência apresentada pelo bioensaio contendo S.

capricornutum, toxicidade aguda das amostras foi avaliada usando A. salina.

Semelhantes às algas, estes organismos apresentam grande importância

ecológica por se encontrarem na base da cadeia alimentar de muitos

ecossistemas.


149

Dessa maneira, diferentes concentrações da amostra teste (17, 33, 67 e 83%)

foram usadas para avaliar o percentual de mortalidade dos organismos,

comparando-os ao controle que não apresentava nenhum corante ou substância

tóxica (Tabela 5). Assim, a maior mortalidade (40-45%) foi observada na maior

concentração da amostra (83%). A menor inibição foi observada na amostra BII-A

(consórcio 1, efluente A), demonstrando a não formação de compostos mais

tóxicos. A CL50 não foi calculada, devido à baixa taxa de mortalidade observada.

Segundo Isik & Sponza (2004) a toxicidade de um efluente após tratamento

anaeróbico e uma seqüência anaeróbica-aeróbica, usando Daphnia magna,

demonstrou que a toxicidade da descoloração no efluente anaeróbico era maior

quando comparada a seqüência anaeróbica-aeróbica. Libra et al. (2004) relataram

que a hidrólise do corante Reativo Preto 5 antes do tratamento biológico

anaeróbico-aeróbico impediu a toxicidade, embora completa mineralização do

composto não tivesse sido alcançada.

El-Naggar et al. (2004) estudando a biotoxicidade do Cristal Violeta usando P.

aeruginosa, observaram que a toxicidade das amostras descoloridas foi reduzida

aquela da amostra controle (corante sem tratamento), sugerindo que durante a

descoloração, produtos intermediários ou mais tóxicos não foram formados.

4. Conclusões

O efluente têxtil usado pode ser biologicamente degradado sob condições

aeróbicas e semi-aerofílicas. Entretanto, a taxa de remoção da cor usando G.

stearothermophilus, é mais elevada na presença de uma fonte adicional de

carbono e nitrogênio. Por outro lado, a combinação Pseudomonas aeruginosa e


150

P. fluorescens apresenta maior eficiência no processo de descoloração do

efluente têxtil.

Agradecimentos

Os autores agradecem ao Sr. Francisco Adão Camargo (Técnico do

Laboratório de Química Biológica, UNICAMP, SP) pelas análises de COT.

Agradecemos também à agência financiadora CNPq, FINEP/CTPETRO e

FACEPE pelo suporte financeiro e a UNICAP pelas instalações cedidas.

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155

Tabela 1. Características físico-químicas do efluente têxtil proveniente de uma

indústria de tingimento de poliéster

Efluente Têxtil

pH 6,41

TOC (ppm) 489,40

DQO (mg L-1) 1.750

Coloração incolor

Condutividade 19 mV


156

Tabela 2. Remoção do carbono orgânico total (COT), demanda química de

oxigênio (DQO) e pH durante a descoloração do efluente têxtil

% de remoção Tratamentos

COT (ppm) DQO (mg L-1) pH

Bioensaio I-Aa 60 - 70 45 - 50 7,1 - 8,8

Bioensaio I-Bb 71 - 61 63 - 65 7,0 - 9,3

Bioensaio II-A 51 - 60 33 - 47 6,9 - 8,3

Bioensaio II-B 51 - 62 33 - 47 6,9 - 8,2

Bioensaio III-A 81 - 90 58 - 70 7,0 - 8,4

Bioensaio III-B 82 - 83 73 - 76 6,9 - 8,5

aefluente com nutrientes e befluente sem nutrientes.

I: Geobacillus stearothermophilus, II: Pseudomonas aeruginosa e P. fluorescens e III:

consórcio com os três microrganismos.


157

Tabela 3. Análise de variância da descoloração do efluente têxtil sob as

condições: tipo de bioensaio (sem consórcio, consórcio 1 e consórcio 2) e tipo de

efluente (com e sem nutrientes)

Causa Variação GL SQ QM Fcal Ftab

Consórcio 2 1305,5000 652,7500 156,6600 5,14

Efluente têxtil 1 408,3333 408,3333 98,0000 5,99

Interação

microbiana

2 1447,1666 723,5833 173,6600 5,14

Corante 6 25,0000 4,1667

Total 11 3185,9999


158

Tabela 4. Inibição e CL50 no crescimento da alga Selenastrum capricornutum em contato com as amostras provenientes do

processo de descoloração do efluente têxtil, usando diferentes tratamentos

Inibição no crescimento da alga Selenastrum capricornutum (%) Concentração

(mL) BI-Aa CL50

(mL)

BI-Bb CL50

(mL)

BII-A CL50

(mL)

BII-B CL50

(mL)

BIII-A CL50

(mL)

BIII-B CL50

(mL)

Controle 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

2,5 25 4 45 27 35 40

10 58 5,0 35 7,0 39 5,0 50 5,9 49 4,0 42 5,5

20 66 74 57 52 91 51

26 100 100 100 100 100 100


BI: Geobacillus stearothermophilus, BII: Pseudomonas aeruginosa e P. fluorescens e BIII: consórcio com os três microrganismos.


159

Tabela 5. Avaliação da toxicidade por Artemia salina em contato com as amostras

provenientes do processo de descoloração do efluente têxtil

Percentual de mortalidade para Artemia salina Concentração

(%) BI-Aa

(%)

BI-Bb

(%)

BII-A

(%)

BII-B

(%)

BIII-A

(%)

BIII-B

(%)

Controle 0 0 0 0 0 0

17 20 0 0 0 20 10

33 40 10 0 10 30 10

67 40 20 0 20 40 20

83 45 40 40 40 40 40


BI: Geobacillus stearothermophilus, BII: Pseudomonas aeruginosa e P. fluorescens e BIII:

consórcio com os três microrganismos.


160

01020304050

60708090

100110

BI-A BI-B BII-A BII-B BIII-A BIII-B

Amostras

% D

esco

lora

ção

24h

48h

72h

Figura 1. Descoloração do efluente têxtil por Geobacillus

stearothermophilus, Pseudomonas aeruginosa e P. fluorescens,

durante 72 h de cultivo. A = efluente com nutrientes, B = efluente sem nutrientes BI = Geobacillus stearothermophilus, BII = Pseudomonas aeruginosa e P. fluorescens e BIII = consórcio com os três microrganismos.


161

CONCLUSÕES GERAIS

A partir dos resultados obtidos conclui-se:

PRIMEIRO ARTIGO

- Geobacillus stearothermophilus (UCP 986), remove efetivamente o azo corante

Alaranjado II em condições de co-metabolismo, não gerando metabólitos

intermediários tóxicos.

- A presença da glicose como co-substrato e a agitação, promovem o aumento do

processo de descoloração do Alaranjado II.

- Geobacillus stearothermophilus (UCP 986) é eficaz na degradação do

Alaranjado II apresentando baixa toxicidade.

SEGUNDO ARTIGO

- Pseudomonas aeruginosa (UCP 992) apresenta elevado potencial de

descoloração do azo corante Alaranjado II em condições microaerofílicas.

- A adição da glicose como co-substrato não apresenta efeito significativo no

processo de descoloração do azo corante.

- Pseudomonas aeruginosa (UCP 992) no processo de clivagem do corante

produz metabólitos no sobrenadante do meio com natureza recalcitrante.


162

TERCEIRO ARTIGO

- O consórcio microbiano contendo Geobacillus stearothermophilus (UCP 986) e

Pseudomonas aeruginosa (UCP 992) descolore efetivamente o azo corante

Alaranjado II, sob condições aeróbicas e microaerofílicas.

- O azo corante clivado pelo mecanismo de degradação do consórcio microbiano

apresenta a formação de metabólitos tóxicos, que são reduzidos ao longo do

cultivo, sugerindo a mineralização total do azo corante.

QUARTO ARTIGO

- O corante Alaranjado II presente no efluente têxtil pode ser biologicamente

degradado sob condições aeróbicas e semi-aerofílicas.

- A taxa de descoloração do azo corante usando Geobacillus stearothermophilus,

é aumentada pela presença de uma fonte adicional de carbono e nitrogênio.

- A utilização de consórcio é mais favorável no processo de descoloração do

efluente têxtil, devido ao sinergismo empregado pelos microrganismos.


163

ANEXOS


164

PRIMEIRO ARTIGO

TRIMMED SPEARMAN-KARBER METHOD. VERSION 1.5 ENTER DATE OF TEST: 28/02/2006 ENTER TEST NUMBER: Ensaio 13 WHAT IS TO BE ESTIMATED? (ENTER "L" FOR LC50 AND "E" FOR EC50): L ENTER TEST SPECIES NAME: Artemia salina ENTER TOXICANT NAME: Alaranjado II ENTER UNITS FOR EXPOSURE CONCENTRATION OF TOXICANT: % ENTER THE NUMBER OF INDIVIDUALS IN THE CONTROL: 30 ENTER THE NUMBER OF MORTALITIES IN THE CONTROL: 0 ENTER THE NUMBER OF CONCENTRATIONS (NOT INCLUDING THE CONTROL; MAX = 10): 4 ENTER THE 4 EXPOSURE CONCENTRATIONS (IN INCREASING ORDER): 17, 33, 67, 83 ARE THE NUMBER OF INDIVIDUALS AT EACH EXPOSURE CONCENTRATION EQUAL(Y/N)? y ENTER THE NUMBER OF INDIVIDUALS AT EACH EXPOSURE CONCENTRATION: 30 ENTER UNITS FOR DURATION OF EXPERIMENT (ENTER "H" FOR HOURS, "D" FOR DAYS, ETC.): h ENTER DURATION OF TEST: 24 ENTER THE NUMBER OF MORTALITIES AT EACH EXPOSURE CONCENTRATION: 1, 5, 20, 30 WOULD YOU LIKE THE AUTOMATIC TRIM CALCULATION(Y/N)? y DATE: 28/02/20 TEST NUMBER: Ensaio 13 DURATION: 24 h TOXICANT : Corante Alaranjado II SPECIES: Artemia salina

RAW DATA: (%)

Concentration Exposed

Number Mortalities

Controle 30 0 17.00 30 1 33.00 30 5 67.00 30 20 83.00 30 30

SPEARMAN-KARBER TRIM: 3.33% SPEARMAN-KARBER ESTIMATES: LC50: 49.28 95% LOWER CONFIDENCE: 43.13 95% UPPER CONFIDENCE: 56.30


165

SEGUNDO ARTIGO

TRIMMED SPEARMAN-KARBER METHOD. VERSION 1.5 ENTER DATE OF TEST: 21/02/2006 ENTER TEST NUMBER: Ensaio 1 WHAT IS TO BE ESTIMATED? (ENTER "L" FOR LC50 AND "E" FOR EC50): LC50 ENTER TEST SPECIES NAME: Artemia salina ENTER TOXICANT NAME: Alaranjado II ENTER UNITS FOR EXPOSURE CONCENTRATION OF TOXICANT : % ENTER THE NUMBER OF INDIVIDUALS IN THE CONTROL: 30 ENTER THE NUMBER OF MORTALITIES IN THE CONTROL: 0 ENTER THE NUMBER OF CONCENTRATIONS (NOT INCLUDING THE CONTROL; MAX = 10): 4 ENTER THE 4 EXPOSURE CONCENTRATIONS (IN INCREASING ORDER): 17, 33, 67, 83 ARE THE NUMBER OF INDIVIDUALS AT EACH EXPOSURE CONCENTRATION EQUAL(Y/N)? y ENTER THE NUMBER OF INDIVIDUALS AT EACH EXPOSURE CONCENTRATION: 30 ENTER UNITS FOR DURATION OF EXPERIMENT (ENTER "H" FOR HOURS, "D" FOR DAYS, ETC.): h ENTER DURATION OF TEST: 24 ENTER THE NUMBER OF MORTALITIES AT EACH EXPOSURE CONCENTRATION: 1, 6, 7, 29 WOULD YOU LIKE THE AUTOMATIC TRIM CALCULATION(Y/N)? y DATE: 28/02/20 TEST NUMBER: Ensaio 1 DURATION: 24 h TOXICANT : Corante Alaranjado II SPECIES: Artemia salina

RAW DATA: (%)


Number Mortalities

Controle 30 0 17.00 30 1 33.00 30 6 67.00 30 7 83.00 30 29

SPEARMAN-KARBER TRIM: 3.33% SPEARMAN-KARBER ESTIMATES: LC50: 59,77 95% LOWER CONFIDENCE: 52,28 95% UPPER CONFIDENCE: 68,24

ENTER DATE OF TEST: 21/02/2006 ENTER TEST NUMBER: Ensaio 2 WHAT IS TO BE ESTIMATED? (ENTER "L" FOR LC50 AND "E" FOR EC50): LC50 ENTER TEST SPECIES NAME: Artemia salina ENTER TOXICANT NAME: Alaranjado II ENTER UNITS FOR EXPOSURE CONCENTRATION OF TOXICANT : % ENTER THE NUMBER OF INDIVIDUALS IN THE CONTROL: 30 ENTER THE NUMBER OF MORTALITIES IN THE CONTROL: 0 ENTER THE NUMBER OF CONCENTRATIONS (NOT INCLUDING THE CONTROL; MAX = 10): 4 ENTER THE 4 EXPOSURE CONCENTRATIONS (IN INCREASING ORDER): 17, 33, 67, 83 ARE THE NUMBER OF INDIVIDUALS AT EACH EXPOSURE CONCENTRATION EQUAL(Y/N)? y ENTER THE NUMBER OF INDIVIDUALS AT EACH EXPOSURE CONCENTRATION: 30 ENTER UNITS FOR DURATION OF EXPERIMENT (ENTER "H" FOR HOURS, "D" FOR DAYS, ETC.): h ENTER DURATION OF TEST: 24 ENTER THE NUMBER OF MORTALITIES AT EACH EXPOSURE CONCENTRATION: 2, 4, 15, 25 WOULD YOU LIKE THE AUTOMATIC TRIM CALCULATION(Y/N)? y DATE: 28/02/20 TEST NUMBER: Ensaio 2 DURATION: 24 h TOXICANT : Corante Alaranjado II SPECIES: Artemia salina

RAW DATA: (%)


Number Mortalities

Controle 30 0 17.00 30 2 33.00 30 4 67.00 30 15 83.00 30 25

SPEARMAN-KARBER TRIM: 16.67%


166

SPEARMAN-KARBER ESTIMATES: LC50: 60,18 95% LOWER CONFIDENCE: 52,31 95% UPPER CONFIDENCE: 69,22 ENTER DATE OF TEST: 21/02/2006 ENTER TEST NUMBER: Ensaio 3 WHAT IS TO BE ESTIMATED? (ENTER "L" FOR LC50 AND "E" FOR EC50): LC50 ENTER TEST SPECIES NAME: Artemia salina ENTER TOXICANT NAME: Alaranjado II ENTER UNITS FOR EXPOSURE CONCENTRATION OF TOXICANT : % ENTER THE NUMBER OF INDIVIDUALS IN THE CONTROL: 30 ENTER THE NUMBER OF MORTALITIES IN THE CONTROL: 0 ENTER THE NUMBER OF CONCENTRATIONS (NOT INCLUDING THE CONTROL; MAX = 10): 4 ENTER THE 4 EXPOSURE CONCENTRATIONS (IN INCREASING ORDER): 17, 33, 67, 83 ARE THE NUMBER OF INDIVIDUALS AT EACH EXPOSURE CONCENTRATION EQUAL(Y/N)? y ENTER THE NUMBER OF INDIVIDUALS AT EACH EXPOSURE CONCENTRATION: 30 ENTER UNITS FOR DURATION OF EXPERIMENT (ENTER "H" FOR HOURS, "D" FOR DAYS, ETC.): h ENTER DURATION OF TEST: 24 ENTER THE NUMBER OF MORTALITIES AT EACH EXPOSURE CONCENTRATION: 3, 1, 7, 29 WOULD YOU LIKE THE AUTOMATIC TRIM CALCULATION(Y/N)? y DATE: 28/02/20 TEST NUMBER: Ensaio 3 DURATION: 24 h TOXICANT : Corante Alaranjado II SPECIES: Artemia salina

RAW DATA: (%)


Number Mortalities

Controle 30 0 17.00 30 3 33.00 30 1 67.00 30 7 83.00 30 29

SPEARMAN-KARBER TRIM: 6.67% SPEARMAN-KARBER ESTIMATES: LC50: 67,98 95% LOWER CONFIDENCE: 62,10 95% UPPER CONFIDENCE: 74,41 NOTE: MORTALITY PROPORTIONS WERE NOT MONOTONICALLY INCREASING.

ADJUSTMENTS WERE MADE PRIOR TO SPEARMAN-KARBER ESTIMATION.

ENTER DATE OF TEST: 21/02/2006 ENTER TEST NUMBER: Ensaio 4 WHAT IS TO BE ESTIMATED? (ENTER "L" FOR LC50 AND "E" FOR EC50): LC50 ENTER TEST SPECIES NAME: Artemia salina ENTER TOXICANT NAME: Corante Alaranjado II ENTER UNITS FOR EXPOSURE CONCENTRATION OF TOXICANT : % ENTER THE NUMBER OF INDIVIDUALS IN THE CONTROL: 30 ENTER THE NUMBER OF MORTALITIES IN THE CONTROL: 0 ENTER THE NUMBER OF CONCENTRATIONS (NOT INCLUDING THE CONTROL; MAX = 10): 4 ENTER THE 4 EXPOSURE CONCENTRATIONS (IN INCREASING ORDER): 17, 33, 67, 83 ARE THE NUMBER OF INDIVIDUALS AT EACH EXPOSURE CONCENTRATION EQUAL(Y/N)? y ENTER THE NUMBER OF INDIVIDUALS AT EACH EXPOSURE CONCENTRATION: 30 ENTER UNITS FOR DURATION OF EXPERIMENT (ENTER "H" FOR HOURS, "D" FOR DAYS, ETC.): h ENTER DURATION OF TEST: 24 ENTER THE NUMBER OF MORTALITIES AT EACH EXPOSURE CONCENTRATION: 0, 4, 7, 6 WOULD YOU LIKE THE AUTOMATIC TRIM CALCULATION(Y/N)? y MINIMUM REQUIRED TRIM IS TOO LARGE: 78.3, SO SK IS NOT CALCULABLE.


167

TERCEIRO ARTIGO

24 horas

y = 22,654Ln(x) - 15,297R2 = 0,9912

0

10

20

3040

50

60

70

0 5 10 15 20 25 30

Concentrações da amostra (mL)

Inib

ição

de

cres

cim

ento

(%)

48 horas

y = 19,581Ln(x) + 7,6652R2 = 0,9674

01020304050607080

0 5 10 15 20 25 30

Concentrações da amostra (mL)

Inib

ição

de

cres

cim

ento

(%)

The Official Journal of the International Biodeterioration and Biodegradation Society

Guide for Authors Submission of papers Submission of a manuscript implies that the author(s) have the authority to publish the work and that it is not being considered contemporaneously for publication elsewhere. Submission of a multi-authored manuscript implies the consent of all the participating authors. All papers will be independently refereed. All manuscripts for International Biodeterioration and Biodegradation should be submitted electronically through Elsevier Editorial System (EES), which can be accessed at http://ees.elsevier.com/ibb. You will be guided stepwise through the creation and uploading of the various files. The system automatically converts source files to a single Adobe Acrobat PDF version of the article, which is used in the peer-review process. Please note that even though manuscript source files are converted to PDF at submission for the review process, these source files are needed for further processing after acceptance. All correspondence, including notification of the Editor's decision and requests for revision, takes place by e-mail and via the Author's homepage, removing the need for a hard-copy paper trail. The above represents a very brief outline of this form of submission. It may be advantageous to print this "Guide for Authors" section from the "Author Gateway" site for reference in the subsequent stages of article preparation. Types of contribution Contributions may be original papers, review articles, case studies, short communications, reports of conferences or meetings, book reviews, or news of forthcoming meetings. The subject and content of review articles should be discussed with the Editors prior to submission to the journal. All papers should be written in English. Format of manuscripts Wherever possible, authors should consult a recent issue of the journal for style and layout. Manuscripts that do not conform to the style of the journal or in which the English is poor may be returned to authors before they are accepted for reviewing. It is in the interests of authors who are not familiar with the correct use of English to have someone proficient in the English language check their manuscript before it is submitted. The Editors reserve the right to adjust style to certain standards of uniformity. Information on author-paid and pre-acceptance language editing services available to authors can be found at http://authors.elsevier.com/LanguageEditing.html. The manuscript should be prepared on a word-processor, in single-spaced typing on pages of uniform size with a 2.5cm margin all round. Artificial (hyphenated) word breaks should not be used at the end of lines. Footnotes to the text should be avoided. All pages should be numbered consecutively. The first page of the manuscript should give:- title of the paper; name(s) of author(s); address(es); and name, full post address, e-mail address, and telephone and fax numbers of the corresponding author, to whom page proofs will be sent. On the first page the author also needs to state what the scientific relevance of the paper is. Please note that papers with a routine nature and lacking originality, novelty, and uniqueness will not be accepted for publication. In general, the manuscript should not exceed 10 000 words, or about 20 printed pages. It should comprise the following sections: Abstract. This summary, consisting of about 150-200 words, should report concisely on the purpose and results of the work described. It should be followed by up to five keywords. Introduction. This should give (a) a salient background to enable the reader to understand and assess the study presented and (b) a statement of the aims of the study.

Materials and Methods. Enough technical information should be given in this section for the experimental work to be repeated. New methods should be described fully, but for established methods reference to published papers or readily available manuals is adequate. Results. Results should be presented as concisely as possible. Use should be made here of well-constructed tables and figures. The text here should not be used to reiterate or discuss the results presented in tables and figures, but should direct the attention of the reader to the important findings in them. Data should not be presented in tables and figures where they can be more concisely set down in the text. Discussion. This section should interpret and discuss the results in the light of previous work; it should not repeat at length material presented in the Introduction or Results. In Short Communications, the Results and Discussion sections may be combined. Acknowledgements. Collate acknowledgements in a separate section at the end of the article and do not, therefore, include them on the title page, as a footnote to the title or otherwise. References. Following the Harvard system, there should be a list of references in alphabetical order at the end of the paper, following the Harvard system. All references in this list must be cited in the text, and vice versa. The references should be indicated at the appropriate place in the text using surnames and year of publication, as in Canale-Parola (1992), Eaton and Hale (1993), and for three or more authors Bjordal et al. (2000). Where in a series, references should be in ascending order of year, as in (Daniel and Nilsson 1986; Canale-Parola 1992; Eaton and Hale 1993; Björdal et al. 2000). Where two or more papers by the same author(s) are published in the same year they should be cited as Smith (1995a), Smith (1995b), etc. When together in parentheses they should appear as (Smith 1992a,b). Each reference in the list should give names and initials of ALL authors, and the year and the exact title of the paper or book. For journals there should follow the full title, volume number (but not part number), and initial and final page numbers of the article; for books there should follow the name of the publisher and place of publication. The styles for contributions to edited books and proceedings, reports and online articles are shown below. Björdal, C.G., Daniel, G., Nilsson, T., 2000. Depth of burial, an important factor in controlling bacterial decay of waterlogged archaeological poles. International Biodeterioration and Biodegradation 45, 15-26. Eaton, R.A., Hale, M.D.C., 1993. Wood - decay, pests and protection. Chapman and Hall, London. Dillon, H.K., Heinsohn, Miller, J.D., (Eds.), 1996. Field guide for the determination of biological contaminants in environmental samples. American Industrial Hygiene Association, Fairfax, VA. Adan, O.C.G., 1994. On the fungal defacement of interior finishes, PhD thesis, Eindhoven University of Technology, Eindhoven, The Netherlands. Canale-Parola, E., 1992. Free-living saccharolytic spirochetes: The genus Spirochaeta. In: Balows, A., Truper, M., Dworkin, M., Harder, W., Schleifer, K.H., (Eds.), The Prokaryotes (2nd ed.), Vol. 4, Springer-Verlag, New York, pp. 3524-3536. Huang, S.J., Bell, J.P., Knox, J.R., Atwood, H., Bansleben, D., Bitritto, W. Broghard, W., Chapin, T., Leong, K.W., Natarjan, K., Nepumuceno, J., Roby, M., Soboslai, J., Shoemaker, N., 1976. Design, synthesis and degradation of polymers susceptible to hydrolysis by proteolytic enzymes. In: Sharpley, J.M., Kaplan, A.M., (Eds.), Proceedings of the Third International Biodegradation Symposium, Applied Science, London, pp. 731-741. Daniel, G., Nilsson, T., 1986. Ultrastructural observations on wood-degrading erosion

bacteria. IRG/WP/1283. The International Research Group on Wood Preservation, Stockholm. Carey, J., Grant, C., 2002. The treatment of dry rot in historic buildings. Cathedral Communications Ltd, online at http://www.buildingconservation.com/articles/rot/rot.htm. Unpublished data or private communications should not appear in the reference list. References to unpublished data will only be accepted at the discretion of the Editors. Units The SI system should be used for all scientific and laboratory data; if, in certain instances, it is necessary to quote other units, these should be added in parentheses. Temperatures should be given in degrees Celsius. The unit 'billion' (109 in America, 1012 in Europe) is ambiguous and should not be used. Abbreviations for units should follow the suggestions of the British Standards publication BS 1991. The full stop should not be included in scientific abbreviations such as h (not h.), m (not m.), and ppm (not p.p.m.); '%' should be used in preference to 'per cent'; 'per', as in mg per liter, should be written in exponential notation as mg l-1 (not mg/l). Where abbreviations are likely to cause ambiguity or cannot be readily understood by an international readership, units should be given in full. Greek symbols and unusual symbols used for the first time should be defined by name in the left-hand margin. Abbreviations Abbreviations of chemical or other names should be defined when first mentioned, unless the abbreviation is commonly used and internationally known and accepted, e.g. ATP, DNA, EDTA, GC-MS, GLC, HPLC, IU (International Unit). For approximately, use approx. or c. (not ca.); for versus, use vs (not v.); for the statistical terms standard deviation, standard error and standard error of the mean, use SD, SE, and SEM without definition. Nomenclature Authors should check all chemical, biochemical, and microbiological names before submission of the manuscript. Chemical Abstracts should be consulted for names of chemical compounds; The Merck Index, 13th ed., 2001, is a useful alternative source. For biochemicals, the Compendium of Biochemical Nomenclature and Related Documents, published for The Biochemical Society, London, by Portland Press (1992), should be consulted. Enzymes should be given the (trivial) names in Enzyme Nomenclature (Academic Press, 1992) as recommended by the International Union of Biochemistry and the assigned EC number appended. Latin binomials should be used for all organisms other than man and farm stock. At first mention in both the Abstract and the main body of the text the full names should be given, as in Mangifera indica, and thereafter abbreviated by using only the initial letter of the generic name, as in M. indica. Where several genera have the same initial letter (and abbreviation of the generic names might cause confusion), the full generic name should be retained. For common generic names in bacteria, the abbreviations standardly used, e.g. Staph., Ser., and Strep. for Staphylococcus, Serratia, and Streptococcus, should be employed. For the correct spelling of bacterial names, authors should consult Bacterial Nomenclature Up to Date http://www.dsmz.de/bactnom/bactname.htm or List of Bacterial Names with Standing in Nomenclature http://www.bacterio.cict.fr. For fungal names, the Index Fungorum http://www.indexfungorum.org/Names/Names.asp or Ainsworth and Bisby's Dictionary of the Fungi, 8th edition (Commonwealth Agricultural Bureaux International, Egham, Surrey, 1995) should be consulted. Preparation of electronic illustrations General points • Make sure you use uniform lettering and sizing of your original artwork. • Save text in illustrations as "graphics" or enclose the font.

• Use only the following fonts in your illustrations: Arial, Courier, Helvetica, Times, Symbol.

• Number the illustrations according to their sequence in the text.

• Use a logical naming convention for your artwork files.

• Provide all illustrations as separate files and as hardcopy printouts on separate sheets.

• Provide captions to illustrations separately.

• Produce images near to the desired size of the printed version. A detailed guide on electronic artwork is available on our website: http://authors.elsevier.com/artwork You are urged to visit this site; some excerpts from the detailed information are given here. Formats Regardless of the application used, when your electronic artwork is finalised, please "save as" or convert the images to one of the following formats (note the resolution requirements for line drawings, halftones, and line/halftone combinations given below): EPS: Vector drawings: Embed the font or save the text as "graphics". TIFF: Colour or greyscale photographs (halftones): Always use a minimum of 300 dpi. TIFF: Bitmapped line drawings: Use a minimum of 1000 dpi. TIFF: Combinations bitmapped line/half-tone (colour or greyscale): A minimum of 500 dpi is required. DOC, XLS or PPT: If your electronic artwork is created in any of these Microsoft Office applications please supply "as is". Please do not:

• Supply embedded graphics in your word-processor (spreadsheet, presentation) document;

• Supply files that are optimised for screen use (like GIF, BMP, PICT, WPG); the resolution is too low;

• Supply files that are too low in resolution;

• Submit graphics that are disproportionately large for the content. Language editing Information on author-paid and pre-acceptance language editing services available to authors can be found at http://authors.elsevier.com/LanguageEditing.html. Proofs PDF proofs will be sent by e-mail to the corresponding author. To avoid delay in publication, only necessary changes should be made, and corrections should be returned promptly. Offprints The corresponding author, at no cost, will be provided with a PDF file of the article via e-mail or, alternatively, 25 free paper offprints. The PDF file is a watermarked version of the published article and includes a cover sheet with the journal cover image and a disclaimer outlining the terms and conditions of use. Online Publication Your article will appear on Elsevier's online journal database ScienceDirect as an "Article in Press" within approximately 4-6 weeks of acceptance. Articles in Press for this journal can be viewed at http://www.sciencedirect.com/science/journal/09648305. An Article in Press may

be cited prior to its publication by means of its unique digital object identifier (DOI) number, which does not change throughout the publication process. Services Authors can keep a track on the progress of their accepted article, and set up e-mail alerts informing them of changes to their manuscript's status, by using the 'Track a Paper' feature of Elsevier's http://authors.elsevier.com Author Gateway.

Submission checklist Before submission, authors should ensure that the following has been done: One Author designated as corresponding Author, and the article includes his or her: • E-mail address • Full postal address • Telephone and fax numbers All necessary files have been uploaded • Keywords • All figure captions • All tables (including title, description, footnotes) are complete Further considerations • Manuscript has been "spellchecked" • All text, including References and Legend for Tables and Figures, is single-spaced • References are in the correct format for this journal • All references mentioned in the Reference list are cited in the text, and vice versa • Permission has been obtained for use of copyrighted material from other sources (including the Web) • Colour figures are clearly marked as being intended for colour reproduction on the Web (free of charge) and in print or to be reproduced in colour on the Web (free of charge) and in black-and-white in print • If only colour on the Web is required, black and white versions of the figures are also supplied for printing purposes • Enclose papers that are important for the understanding or judgement of the submitted manuscript, but which have either been submitted or are in press and are not yet published • Enclose, if desired, the names of up to three potential referees For any further information please contact the Author Support Department at [email protected]