departamento de zoologia e antropologia julho de 2007 · passar pela implementação de medidas e...
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Avaliação do efeito do chumbo na
qualidade espermática de humanos e de
ratinhos
Tânia Abrantes Silva
Departamento de Zoologia e Antropologia
Julho de 2007
Avaliação do efeito do chumbo na qualidade
espermática de humanos e de ratinhos
Tese submetida à Faculdade de Ciências da Universidade do Porto para
a obtenção do grau de Mestre em Biologia para o Ensino
Tânia Abrantes Silva
Orientação: Profª. Doutora Maria de Lourdes Pereira (Universidade de Aveiro) e Co-orientação: Prof. Doutor Vasco Almeida (Universidade do Porto). Este trabalho foi desenvolvido no Departamento de
Biologia da Universidade de Aveiro e no Centro de Estudos de Infertilidade e Esterilidade no Porto e co-
financiado pelo Centro de Materiais Cerâmicos e Compósitos da Universidade de Aveiro (CICECO)
Departamento de Zoologia e Antropologia
Julho de 2007
Introdução
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AAAGGGRRRAAADDDEEECCCIIIMMMEEENNNTTTOOOSSS
Agradeço à Professora Doutora Maria de Lourdes Pereira, a quem devo a
orientação deste trabalho, o constante incentivo, empenho e disponibilidade
manifestados e as numerosas sugestões que contribuíram para a sua execução e
enriquecimento.
Ao professor Doutor Vasco Almeida, agradeço o apoio, a orientação e a
disponibilidade demonstrados.
À Helena Oliveira e Rita Cerejeira o meu profundo agradecimento por todo o
apoio, acompanhamento e dedicação, que permitiram a execução deste trabalho.
Agradeço também a sua amizade e companhia que jamais irei esquecer.
O meu muito obrigado à Isabel Damião, por todos os ensinamentos e apoio
demonstrado.
Agradeço a toda a equipa do Centro Clínico de Medicina do Trabalho de
Aveiro (CCMT), em especial à Dr. Graça Gonçalves e à D. Cláudia Ferreira que
tanto me ajudaram na angariação de empresas para o estudo do efeito do chumbo
na fertilidade humana. Agradeço também à empresa que aderiu ao estudo referido.
Ao Departamento de Biologia da Universidade de Aveiro, ao Centro de
Estudos de Infertilidade e Esterilidade e ao Centro de Investigação em Materiais
Cerâmicos e Compósitos (CICECO) agradeço o apoio e acolhimento concedidos
que tornaram possível a realização deste trabalho.
Ao Sr. Aldiro Pereira, Sr. Armando Costa e Sr. Rui Marques agradeço a
cooperação no decorrer das experiências efectuadas.
Aos meus pais e irmã agradeço o seu voto de confiança, o estímulo e ânimo
que sempre me proporcionaram.
Ao Luís Filipe, agradeço todo o apoio e paciência com que acompanhou a
execução deste trabalho.
Introdução
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RRREEESSSUUUMMMOOO
A saúde reprodutiva é um bem essencial à continuidade da vida. A avaliação da saúde reprodutiva masculina torna-se essencial, dado que nos dias de hoje os trabalhadores
de determinadas indústrias se encontram expostos a múltiplos agentes causadores de alterações da sua fertilidade, nomeadamente aos compostos de chumbo. Como tal, o
presente trabalho teve como objectivo avaliar o efeito do chumbo na qualidade espermática humana e de ratinhos, comprovando a necessidade da promoção da saúde reprodutiva no
local de trabalho.
Na primeira fase do trabalho efectuaram-se espermogramas de trabalhadores
expostos a ambientes plumbíferos, comparando-os com os de trabalhadores não expostos. Dos parâmetros analisados (motilidade, vitalidade, hipoosmolaridade, concentração e
morfologia espermática) apenas se verificou uma diminuição significativa ao nível da motilidade dos espermatozóides de trabalhadores expostos, nomeadamente nas categorias
de motilidade progressiva rápida e de progressiva lenta.
Foram efectuados ainda ensaios in vitro e in vivo em ratinhos para avaliação da
toxicidade do PbCl2. Nos ensaios in vitro foram testadas duas doses de chumbo: 2,4 mg/l e 488,9 mg/l. Efectuou-se a análise da motilidade, vitalidade e hipoosmolaridade dos grupos
expostos e respectivos controlo. Verificou-se uma diminuição significativa na motilidade e vitalidade dos espermatozóides expostos directamente a uma concentração de 2,4 mg/l e
488,9 mg/l de Pb2+. A percentagem de hipoosmolaridade dos espermatozóides apenas diminuiu na concentração mais elevada.
Para os ensaios in vivo, efectuou-se a injecção, por via subcutânea, a dois grupos de ratinhos (150mg PbCl2/kg de peso vivo) durante 4 e 6 dias, respectivamente, com o
sacrifício dos animais 24 horas após a última injecção. O terceiro grupo de ratinhos foi injectado subcutaneamente com a dose referida anteriormente durante 4 dias, com sacrifício
dos animais ao 35º dia após a primeira exposição. Consideraram-se ainda os respectivos grupos controlo. Após a análise de parâmetros como a motilidade, vitalidade,
hipoosmolaridade, concentração, integridade acrossómica e morfologia dos
espermatozóides, verificou-se que os dois primeiros diminuíram significativamente em todos os períodos testados comparativamente com os respectivos grupos controlo. A
hipoosmolaridade dos espermatozóides diminuiu significativamente no grupo exposto durante 6 dias e no grupo cujo sacrifício dos animais ocorreu ao 35º dia. Foi apenas neste
último grupo que se verificou uma diminuição significativa da concentração, da integridade acrossómica e alterações na morfologia dos espermatozóides.
Introdução
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Os resultados do presente trabalho permitiram concluir que o PbCl2 provoca alterações em parâmetros essenciais à fertilidade masculina, como a motilidade, a vitalidade,
a hipoosmolaridade, a concentração, a integridade acrossómica e a morfologia dos espermatozóides. Salienta-se, ainda, o efeito directo do chumbo nos espermatozóides,
comprovado pelos ensaios in vitro.
Citando alguns dos ramos de actividade profissional com risco de exposição a
chumbo, e comprovados os efeitos deste composto ao nível reprodutivo, ressalta a necessidade da promoção da saúde reprodutiva masculina ao nível ocupacional. Esta deve
passar pela implementação de medidas e recomendações referidas ao longo do presente trabalho.
Introdução
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AAABBBSSSTTTRRRAAACCCTTT
Reproductive health is an important issue for continuity of life. The evaluation of male
reproductive health is relevant due to a wide range of hazardous metals on the workplace, such as lead compounds, causing fertility disturbances. For this reason, the aim of the
present work was to evaluate the effects of lead on human and mouse sperm parameters,
demonstrating the relevancy of the reproductive health promotion at the occupational level.
In the first part of the present work, sperm parameters (motility, vitality, hypoosmolality, concentration and morphology) of some workers exposed to the lead
compounds were studied and compared with those unexposed. A significant decrease in spermatozoa motility of exposed workers was observed among the sperm parameters.
In vitro and in vivo studies were also conducted in mice for the evaluation of PbCl2 on sperm quality. Two doses of lead were tested for in vitro studies: 2,4 mg/l and 488,9 mg/l.
Sperm motility, vitality, and hypoosmolality analysis of the exposed groups and the respective controls were studied. A significant decrease in the motility and vitality of the
spermatozoa exposed to the lowest concentration of Pb2+ was observed. In the other group, all parameters had been significantly modified.
For the in vivo assay two groups of mice were subcutaneously injected with 150 mg PbCl2/kg/body weight during 4 and 6 days, respectively, and animals were sacrificed 24
hours after the last injection. A third group of mice was subcutaneously injected with the same dose during 4 days and sacrificed on the 35th day after the first exposure. Control
groups were also analysed. Epididymal sperm parameters were analysed (motility, vitality, hypoosmolality, concentration, acrosome integrity and morphology). The sperm motility and
vitality significantly decreased in all the periods tested, as compared with those controls. Hypoosmolality of the spermatozoa decreased significantly in the group exposed during 6
days and in the group whose animals were sacrificed after 35 days. This group revealed a
decrease in the concentration, acrosome integrity, and morphological changes of spermatozoa.
From these in vivo results it was concluded that lead chloride affected essential
sperm parameters such as the motility, vitality, hypoosmolality, concentration, acrosome integrity, and morphology of the spermatozoa. The in vitro assays have demonstrated that
lead have direct effects on spermatozoa.
Finally, this work underlines the promotion of the male reproductive health at the
occupational level as a relevant endeavour, and several recommendations are addressed.
Introdução
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ÍÍÍNNNDDDIIICCCEEE
1. INTRODUÇÃO ……………………………………………………………………………
1.1. Saúde reprodutiva masculina …………………..........................................
1.2. Chumbo: propriedades e características ……………………………………
1.3. Vias de penetração no organismo ………………..…………….……….….
1.3.1. Vias respiratórias ……………………………………………….……...
1.3.2. Via cutânea ……………………………………………………….….…
1.4. Ramos de actividade sujeitos à exposição de chumbo ……………….......
1.5. Considerações gerais sobre a espermatogénese …………………………
1.6. Aspectos morfo-funcionais do epidídimo ……………………………………
1.7. Características do espermatozóide ………………………………………….
1.8. Efeito do chumbo na espermatogénese e epidídimo ………..…………….
1.9. Legislação que salvaguarde a exposição dos trabalhadores a
chumbo …………………………………………………………………………
1.10. Actuação dos Serviços de Segurança, Higiene e Saúde no
trabalho(SSHST) ………...…………………………………………………….
1.11. Objectivos do presente trabalho …..…………………………………………
2. MATERIAL E MÉTODOS ……………………………………………………….…………
2.1. Efeito do chumbo na qualidade espermática humana ……………...…….
2.1.1. Design experimental …………………………………………………..
2.1.2. População estudada …………………………………………………..
2.1.3. Avaliação da motilidade espermática ………………………………..
2.1.4. Avaliação da vitalidade espermática ………………………………...
2.1.5. Teste da hipoosmolaridade …………………………………………...
2.1.6. Determinação da concentração de espermatozóides ……………..
2.1.7. Avaliação morfológica dos espermatozóides ……………………….
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Introdução
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2.1.8. Análise de outras propriedades físicas do sémen ………………….
2.2. Efeito in vitro e in vivo do chumbo na qualidade espermática de ratinhos
2.2.1. Animais de laboratório ………………………………………………...
2.2.2. Preparação de soluções ………………………………………………
2.2.3. Design experimental …………………………………………………..
2.2.4. Colheita de órgãos e preparação das amostras ……………………
2.2.5. Avaliação da motilidade espermática ………………………………..
2.2.6. Avaliação da vitalidade espermática ………………………………...
2.2.7. Teste da hipoosmolaridade …………………………………………...
2.2.8. Determinação da concentração de espermatozóides ……………..
2.2.9. Avaliação da integridade acrossómica ………………………………
2.2.10. Avaliação morfológica dos espermatozóides ……………………...
2.3. Análise estatística ………………………………………………...…………...
3. RESULTADOS ……………………….....………………………………..……………….
3.1. Efeito do chumbo na qualidade espermática humana …………………….
3.2. Efeito in vitro do chumbo na qualidade espermática de ratinhos ………..
3.2.1. Exposição a 2,4 mg/l e 488,9 mg/l de chumbo …………………..
3.3. Efeito in vivo do chumbo na qualidade espermática de ratinhos ……...…
3.3.1. Adminis tração de 150 mg de PbCl2/kg de peso vivo durante 4 e
6 dias …………………………………………………………………...
3.3.2. Qualidade espermática de ratinhos após 35 dias da exposição a
PbCl2 (150 mg/kg de peso vivo durante 4 dias) …………………...
4. DISCUSSÃO ………………………………………………………….....…………….….
4.1. Efeito do chumbo na qualidade espermática humana …………………….
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Introdução
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4.2. Efeito do chumbo na qualidade espermática de ratinhos………………….
4.2.1. Efeito in vitro do chumbo na qualidade espermática …………….
4.2.2. Efeito in vivo do chumbo na qualidade espermática …………….
5. CONCLUSÕES ………………………………………………………………………...…
6. PERSPECTIVAS FUTURAS PARA A PROMOÇÃO DA SAÚDE REPRODUTIVA
MASCULINA …………..…………………………………….……………….…………...
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS …….…………………………………………………...
8. ANEXOS ………………………………………………………………………………….
Anexo I - Decreto Regulamentar n.º 6/2001 de 5 de Maio ……………………….
Anexo II - Decreto Lei n.º 274/89 de 21 de Agosto ………………………………
Anexo III - Decreto Lei n.º 441/91 de 14 de Novembro …………………………..
Anexo IV - Decreto Lei n.º n.º 26/94 de 1 de Fevereiro ………………………….
Anexo V - Valores de referência para parâmetros de um espermograma ……..
Anexo VI - Questionário dirigido aos trabalhadores ………………………………
Anexo VII - Protocolo de colaboração entre o IDICT, o DEB, o DES e a DGFV
Anexo VIII- Protocolo experimental: Efeito do chumbo na qualidade
espermática de ratinhos ……………….……………………………….
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Introdução
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ÍÍÍNNNDDDIIICCCEEE DDDEEE FFFIIIGGGUUURRRAAASSS
Figura 1.1 Entrada e destino de agentes tóxicos no corpo humano …......... 16
Figura 1.2 Espermatogénese ………………………………………………….... 19
Figura 1.3 Representação do epidídimo de ratinho e humano ……………... 21
Figura 1.4 Representação esquemática do processo de formação e
controlo de gâmetas masculinos desde o testículo até ao
epidídimo ……………………………………………………………..
22
Figura 1.5 Representação esquemática de espermatozóide humano e de
espermatozóide de ratinho ………………………………………….
23
Figura 2.1 Representação esquemática de alterações morfológicas em
espermatozóides humanos, quando sujeitos a condições
hipoósmoticas ……………………………………………………..…
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Figura 2.2 Grelha central da câmara de Neubaeur ……………………….… 38
Figura 2.3 Intervalo de confiança de aproximadamente 95% para a
diferença entre duas contagens de espermatozóides ………..….
39
Figura 2.4 Várias formas de angulação flagelar …………………………….... 47
Figura 3.1 Efeito do chumbo na motilidade espermática humana ………….. 51
Figura 3.2 Efeito do chumbo na vitalidade espermática humana …………... 52
Figura 3.3 Vitalidade de espermatozóides humanos ………………………… 52
Figura 3.4 Efeito do chumbo na concentração de espermatozóides ………. 53
Figura 3.5 Efeito do chumbo na morfologia de espermatozóides ……….…. 54
Introdução
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Figura 3.6 Formas morfológicas de espermatozóides de trabalhadores
expostos a chumbo …………………………………………….....…
54
Figura 3.7 Efeito do chumbo na motilidade espermática do Grupo I e II ….. 56
Figura 3.8 Efeito do chumbo na vitalidade espermática do Grupo I e II ....... 57
Figura 3.9 Vitalidade de espermatozóides de ratinho ……………………….. 57
Figura 3.10 Hipoosmolaridade de espermatozóides de ratinho ……………… 58
Figura 3.11 Efeito do chumbo na motilidade espermática do Grupo III e IV ... 60
Figura 3.12 Efeito do chumbo na vitalidade espermática do Grupo III e IV ... 61
Figura 3.13 Efeito do chumbo na concentração espermática do Grupo III e
IV ……………………………………………………………………….
62
Figura 3.14 Efeito do chumbo na integridade do acrossoma de
espermatozóides de ratinhos pertencentes ao Grupo III e IV …..
63
Figura 3.15 Integridade do acrossoma de espermatozóides de ratinho …….. 63
Figura 3.16 Formas morfológicas de espermatozóides presentes no fluído
epididimal de ratinhos controlo e expostos ……………………….
65
Figura 3.17 Efeito do chumbo na motilidade espermática de ratinhos
pertencentes ao grupo V …………………………………………….
66
Figura 3.18 Efeito do chumbo na vitalidade espermática de ratinhos
pertencentes ao grupo V …………………………………………….
67
Figura 3.19 Efeito do chumbo na concentração espermática do grupo V …... 68
Figura 3.20 Efeito do chumbo na integridade do acrossoma de ratinhos
pertencentes ao grupo V …………………………………………….
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Introdução
11
ÍÍÍNNNDDDIIICCCEEE DDDEEE TTTAAABBBEEELLLAAASSS
Tabela 1.1 Efeitos do chumbo na fertilidade de ratos e ratinhos …………… 26
Tabela 1.2 Exemplos de indicadores, BEI e meios de colheita …………...… 28
Tabela 2.1 Diluição e factores de conversão para contagem de
espermatozóides com a câmara de Neubauer ………………...…
37
Tabela 3.1 Efeito do chumbo na hipoosmolaridade do Grupo I e II ………… 58
Tabela 3.2 Efeito do chumbo na hipoosmolaridade do Grupo III (4 dias de
exposição) e IV …………………………………………………...….
62
Tabela 3.3 Efeito do chumbo na morfologia dos espermatozóides de
ratinhos pertencentes ao Grupo III e IV ………………………..….
64
Tabela 3.4 Efeito do chumbo na hipoosmolaridade de espermatozóides de
ratinhos pertencentes ao grupo V ………………………………….
67
Tabela 3.5 Efeito do chumbo na morfologia dos espermatozóides de
ratinhos pertencentes ao grupo V………………………………..…
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111... IIINNNTTTRRROOODDDUUUÇÇÇÃÃÃOOO
Introdução
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111...111 ... SSSAAAÚÚÚDDDEEE RRREEEPPPRRROOODDDUUUTTTIIIVVVAAA MMMAAASSSCCCUUULLLIIINNNAAA
A saúde é um bem inquestionável, constituindo a base do desenvolvimento
pessoal, social e produtivo. Por vezes encarada numa perspectiva reducionista,
como mera ausência de doença, a Saúde, enquanto conceito, ganhou uma
dimensão mais global e holística, ao ser definida pela Organização Mundial de
Saúde (OMS), como um estado de completo bem-estar físico, mental e social e não
simplesmente a ausência de doença ou enfermidade (Ministério da Saúde, 1997).
Quando aplicada ao campo da saúde reprodutiva significa que se deve oferecer ao
indivíduo a possibilidade de procriar, de regular a sua própria fertilidade de forma
segura e efectiva. Significa também que deve ser assegurada a possibilidade de
desfrutar a sexualidade sem medo de contrair uma doença. Deve-se, sobretudo,
entendê-la como a saúde de todas as funções e processos que envolvem a
reprodução, tanto para os homens quanto para as mulheres, e em todas as suas
fases da vida (Arilha et al., 2001). Em conformidade com esta definição, a
assistência à saúde reprodutiva é definida como um conjunto de métodos, técnicas e
serviços que contribuem para a saúde e o bem-estar reprodutivo, prevenindo e
resolvendo os problemas a ela associados (Corrêa et al., 2003).
O estudo da saúde reprodutiva envolve temas variados, sendo um deles a
fertilidade humana. Este é um tema de grande importância, uma vez que a redução
da fertilidade tem-se revelado um problema mundial, especialmente nos países
industrializados, atingindo a infertilidade cerca de 13-18% dos casais. Crê-se que o
factor masculino esteja presente em cerca de metade dos casos, tendo sido já
comprovados através de estudos clínicos e epidemiológicos (Parada et al., 2004).
A redução da fertilidade masculina na população humana é um dado
comprovado e com tendência a aumentar devido à crescente exposição a poluentes.
São diversas as causas potenciais, assumindo particular relevância nos dias de hoje
factores relacionados com o ambiente de trabalho, dado que muitos trabalhadores
se encontram expostos a um grande número de substâncias químicas nocivas para
a sua capacidade reprodutiva. Refira-se a crescente exposição a metais pesados
como exemplos de agentes causadores de infertilidade masculina. A infertilidade é,
por isso, um problema crescente nos países industrializados, salientando-se ainda
Introdução
14
as suas implicações ao nível social. Como tal, a promoção da saúde reprodutiva
masculina é cada vez mais pertinente e necessária nos locais de trabalho.
Entenda-se por promoção da saúde o processo que permite aos indivíduos
aumentar o controlo sobre a sua própria saúde e melhorá-la (Carta de Ottawa, 1986).
É uma combinação de estratégias individuais e de comunidade, incluindo a
comunicação, a educação, a legislação, as mudanças organizacionais e o
desenvolvimento comunitário. Associada à promoção da saúde encontra-se o
conceito de literacia para a saúde, que representa as competências cognitivas e
sociais que determinam a motivação e a capacidade dos indivíduos conseguirem o
acesso, a compreensão e o uso da informação de forma a que promovam e
mantenham uma boa saúde (Nutbeam, 1998 in Carvalho, 2002).
Intervir nos locais de trabalho, visando a promoção da saúde e o aumento da
literacia de saúde reprodutiva, permite não só disponibilizar informação, mas
introduzir critérios de saúde nos sistemas de decisão, nas regras e procedimentos
organizacionais e nos padrões de comunicação, por forma a criar alternativas que
tornem mais fáceis as decisões mais saudáveis. Assim, contribuir-se-ia para uma
diminuição de casos de infertilidade e consequentemente para o melhoramento da
demografia e à posteriori da economia do país, uma vez que a infertilidade tem
também repercussões demográficas, diminuindo a taxa de fecundidade e
consequentemente o crescimento populacional.
A promoção da saúde reprodutiva masculina foi o tema alvo de uma
conferência internacional realizada em 2006, organizada pela Sociedade de
Andrologia Asiática, sendo por isso, um assunto actual, pertinente e de necessária
discussão, uma vez que o risco para a saúde reprodutiva masculina é um problema
cada vez mais grave nos países menos desenvolvidos, onde as indústrias são pouco
salubres e as medidas preventivas pouco usuais.
O presente trabalho aborda temas relacionados com os riscos profissionais na
saúde reprodutiva masculina causados pelo chumbo, nomeadamente os efeitos
deste composto na fertilidade humana e em ratinhos. A legislação existente a nível
da preservação da fertilidade masculina nos locais de trabalho, bem como
orientações que devem ser seguidas com vista a minimizar os efeitos causados por
metais pesados na fertilidade masculina, são também referidos.
Introdução
15
Promover a salubridade dos locais de trabalho e a prevenção da saúde
reprodutiva é fundamental para a diminuição e controlo da infertilidade.
111...222 ... CCCHHHUUUMMMBBBOOO::: PPPRRROOOPPPRRRIIIEEEDDDAAADDDEEESSS EEE CCCAAARRRAAACCCTTTEEERRRÍÍÍSSSTTTIIICCCAAASSS
O chumbo é um constituinte natural da crosta terrestre e um metal maleável e
dúctil, que funde aos 327ºC (Lauwerys, 1994). Apresenta uma cor azul-acinzentada,
um peso molecular 207,2 g/mol e densidade 11,34 g/cm3 aos 20ºC. Este metal
combina-se com outros elementos originando compostos ou sais de chumbo
(ATSDR, 1999), como é o caso do cloreto de chumbo (PbCl2). Devido à sua
resistência à corrosão, o chumbo é um dos metais fabricados mais estáveis (Howe,
1981 in ATSDR, 1999).
O cloreto de chumbo, composto utilizado no presente estudo, nos ensaios in
vitro e in vivo em ratinhos, apresenta cor branca, com peso molecular 278,11 g/mol e
densidade 5,85 g/cm3 aos 20ºC. É solúvel em água com solubilidade de 9,9 g/l aos
20ºC. (ATSDR, 1999)
111...333 ... VVVIIIAAASSS DDDEEE PPPEEENNNEEETTTRRRAAAÇÇÇÃÃÃOOO NNNOOO OOORRRGGGAAANNNIIISSSMMMOOO
Tendo em consideração que nos locais de trabalho os indivíduos poderão estar
sujeitos a numerosos riscos, várias são as vias prováveis de entrada de um agente
tóxico no organismo. A pele e mucosas assim como a via naso-oral são as mais
susceptíveis (Figura 1.1). A maioria dos tóxicos atravessa as barreiras epiteliais por
difusão simples através das membranas celulares e alcançam os capilares
sanguíneos.
A taxa de absorção está relacionada com a concentração do composto no local
de absorção, o tempo de exposição e a sua solubilidade. Também está dependente
da área de exposição, das características do epitélio onde se processa a absorção,
Introdução
16
da riqueza da microcirculação sub-epitelial, da própria estrutura de membrana
celular e das propriedades físico-químicas do composto (Klaassen e Watkins, 1999;
Hodgson e Smart, 2001).
Figura 1.1 – Entrada e destino de agentes tóxicos no corpo humano (adaptado de Hodgson e Smart, 2001).
111...333 ...111... VVVIIIAAASSS RRREEESSSPPPIIIRRRAAATTTÓÓÓRRRIIIAAASSS
É bem conhecido que as respostas tóxicas a metais pesados, pode resultar
da sua absorção após inalação de poeiras e fumos metálicos produzidos em
diversas indústrias, por via nasal ou por via oral. Tanto a mucosa nasal como a
mucosa oral são cobertas por uma camada fluida, onde as moléculas do gás
inspiradas podem ficar retidas, não alcançando o pulmão. No caso das partículas
tóxicas serem solúveis no muco nasal ou oral podem dissolver-se e entrar
directamente no epitélio ou no sangue antes de poderem ser removidas
mecanicamente. No entanto, a maioria dos gases inalados consegue alcançar os
pulmões. Assim, a absorção de gases por via nasal tem lugar principalmente nos
pulmões, dada a sua elevada área total de superfície (50-100 m2), o seu elevado
fluxo sanguíneo (4-5 L min -1) e a sua pequena distância de difusão (Klaassen e
Watkins, 1999; Sipes et al., 1997)
AGENTES TÓXICOS
ENTRADA NO ORGANISMO HUMANO
INGESTÃO P ELE INALAÇÃO
ABSORÇÃO PARA A CORRENTE SANGUÍNEA E
DISTRIBUIÇÃO PARA TECIDOS E ÓRGÃO CORPORAIS
TOXICIDADE ARMAZENAMENTO EXCREÇÃO
METABOLISMO
Introdução
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O sangue transporta as moléculas do gás dissolvido para as outras partes do
organismo. Em cada tecido, estes elementos são transferidos até que se alcance um
equilíbrio numa concentração tecidual determinada pelo coeficiente de partilha
tecido/sangue (relação entre a concentração do químico no tecido e no sangue).
Após a libertação de parte do gás para os tecidos, o sangue volta aos pulmões para
captar mais gás, se este estiver presente. O processo continua até que o gás
alcance um equilíbrio entre as concentrações no sangue e nos tecidos de acordo
com o coeficiente de partilha tecido/sangue característico de cada tecido (Klaassen
e Watkins, 1999).
Os aerossóis e outras partículas de 2 a 5 µm são depositadas principalmente
ao longo da árvore traqueo-brônquica pulmonar. Tal contacto pode resultar num
dano directo para os pulmões, ou levar à absorção do composto tóxico para a
corrente sanguínea (Sipes et al., 1997).
Um aumento da concentração média semanal da empresa de 1 µg/m3 de
chumbo no ar, provoca na população exposta laboratorialmente, um aumento de 0,6
a 1 µg/dl do metal no sangue (WHO, 1977).
111...333 ...222... VVVIIIAAA CCCUUUTTTÂÂÂNNNEEEAAA
Muitos agentes tóxicos presentes nos locais de trabalho entram directamente
em contacto com a pele, se não forem tomadas medidas de protecção adequadas.
Alguns destes podem ser absorvidos pela pele e mucosas em quantidades
suficientes para produzir efeitos sistémicos (Klaassen e Watkins, 1999; Sipes et al.,
1997).
111...444 ... RRRAAAMMMOOOSSS DDDEEE AAACCCTTTIIIVVVIIIDDDAAADDDEEE SSSUUUJJJEEEIIITTTOOOSSS ÀÀÀ EEEXXXPPPOOOSSSIIIÇÇÇÃÃÃOOO DDDEEE CCCHHHUUUMMMBBBOOO
A evolução verificada em muitos ramos da actividade humana e em especial
na indústria, tem aumentado os riscos para a saúde dos trabalhadores,
Introdução
18
nomeadamente no que respeita à toxicidade das próprias matérias-primas ou dos
produtos manufacturados a partir destas, havendo, por isso, uma maior exposição
dos trabalhadores a metais pesados e outros agentes tóxicos. Neste trabalho serão
apenas exemplificadas algumas indústrias cujos trabalhadores se encontram
expostos a compostos de chumbo.
O chumbo é o metal tóxico mais ubíquo. Os principais meios industriais de
exposição a este metal são as indústrias automóvel, de tintas, de cerâmica (aquelas
em que usam chumbo para certos tipos de cerâmicas vitrificadas), de acumuladores
eléctricos, de artigos pirotécnicos e de soldagem de objectos de chumbo (Chang,
1996; Klaassen e Watkins, 1999). Refira-se que os compostos de chumbo
constituem o topo da lista de agentes causadores de doenças profissionais de
acordo com o Decreto Regulamentar n.º 6/2001 de 5 de Maio (ANEXO I).
Tomando como exemplo a região de Aveiro, meio bastante industrializado,
muitos são os trabalhadores que se encontram expostos a este metal pesado nos
seus locais de trabalho. Citam-se as indústrias de tintas, metalúrgica, de aço
inoxidável e de automóveis.
Como tal, devem ser aperfeiçoadas as medidas de prevenção e promoção da
saúde reprodutiva nos locais de trabalho, não só nesta região como em todo o país.
111...555 ... CCCOOONNNSSSIIIDDDEEERRRAAAÇÇÇÕÕÕEEESSS GGGEEERRRAAAIIISSS SSSOOOBBBRRREEE AAA EEESSSPPPEEERRRMMMAAATTTOOOGGGÉÉÉNNNEEESSSEEE
Antes de serem abordados os efeitos dos metais pesados na fertilidade
masculina, interessa recordar sucintamente a espermatogénese (Figura 1.2 ). É o
processo pelo qual as células germinativas imaturas dão origem aos
espermatozóides. Este fenómeno ocorre no testículo, em particular, ao nível dos
tubos seminíferos e inicia-se durante a puberdade, mantendo-se por toda a vida
(Marieb, 1998). No compartimento intersticial localizam-se as células de Leydig,
produtoras de testosterona, uma das mais importantes hormonas sexuais
masculinas.
Introdução
19
Os tubos seminíferos são constituídos por uma túnica de tecido conjuntivo,
uma lâmina basal e uma camada interna formada pelo epitélio germinativo ou
seminífero, onde se originam os espermatozóides. Este epitélio é constituído por
células somáticas, as células de Sertoli e por células da linhagem espermatogénica
ou seminal. Estas dispõem-se em quatro a oito camadas, que ocupam o espaço
entre a lâmina basal e a luz do túbulo seminífero. Dividem-se, diferenciando-se em
espermatozóides (Junqueira e Carneiro, 1999).
Figura 1.2 – Espermatogénese (adaptado de Marieb, 1998).
O processo inicia-se com a célula germinativa primitiva, a espermatogónia,
célula localizada próximo da membrana basal. As espermatogónias dividem-se por
mitoses e as células formadas a partir desse processo podem seguir duas vias:
continuam semelhantes à célula-mãe, sendo designadas por células-filhas do tipo A,
sofrem novas mitoses, e são, portanto, uma fonte de espermatogónias; ou param de
Com
parti
men
to b
asal
C
ompa
rtim
ento
adl
umia
l
Espe
rmat
ogén
ese
Esp
erm
iogé
nese
M
eios
e
Espermatócito secundário
Espermatócito primário
Espermatozóides
Inicio da meiose I
Mitose
Fim da meiose I
Meiose II
Espermatogónia
Espermátides
Espermátides “madura”
Lúmen do tubo seminífero
Célula-filha do tipo B
Célula-filha do tipo A
Célula de Sertoli
Junções oclusivas Lâmina Basal Espermatogónia
Citoplasma das células de
Sertoli
Introdução
20
se dividir e crescem, sendo designadas de células-filhas do tipo B (Junqueira e
Carneiro, 1999; Marieb, 1998). Este último tipo de células desenvolve-se dando
origem a espermatócitos primários que entram em meiose. Estes são as maiores
células da linhagem espermatogénica e caracterizam-se pela presença de
cromossomas em diferentes fases de condensação. Desta primeira divisão da
meiose resultam células menores, os espermatócitos secundários. Da segunda
divisão meiótica dos espermatócitos resultam células haplóides designadas
espermátides (Creasy & Foster, 2002; Junqueira e Carneiro, 1999).
As espermátides caracterizam-se por apresentarem pequena dimensão,
núcleo com zonas de cromatina condensada, e por se localizarem quase no lúmen
dos túbulos seminíferos. As espermátides sofrem um processo de modificações
morfo-funcionais, designado de espermiogénese, que conduz à formação dos
espermatozóides. Compreende vários passos: formação do acrossoma a partir do
complexo de Golgi, condensação nuclear para formar a cabeça do espermatozóide;
formação do flagelo a partir de um centríolo, que constituirá a cauda do
espermatozóide; formação da peça intermédia com a organização das mitocôndrias;
e redução do excesso de citoplasma dos espermatídios (Marieb, 1998; Zhang, 1999).
As células de Sertoli contribuem para o normal funcionamento da
espermatogénese. São células alongadas que se apoiam sobre a membrana basal
do túbulo seminífero e apresentam numerosas reentrâncias citoplasmáticas, onde se
localizam as células da linhagem espermatogénica. Desempenham funções
relevantes: fornecem suporte e controlam a nutrição dos espermatozóides em
formação, através da regulação da passagem dos nutrientes trazidos pelo sangue;
fagocitam e digerem os restos de citoplasma que se desprendem das espermátides;
e segregam um fluido que permite o transporte dos espermatozóides. É ainda de
salientar que as células de Sertoli adjacentes unem-se por junções oclusivas,
delimitando um compartimento basal, onde se localizam as espermatogónias, com
acesso livre ao material proveniente do sangue. Durante a espermatogénese, a
“descendência” das espermatogónias atravessa as junções oclusivas e penetra no
outro compartimento, denominado adlumial. Neste, os estágios mais avançados da
espermatogénese estão protegidos de moléculas estranhas provenientes do sangue,
pela denominada barreira hemato-testicular, constituída por junções de oclusão
entre as células de Sertoli. As junções comunicantes também estão presentes entre
Introdução
21
as células de Sertoli, possibilitando a transferência de iões e moléculas entre essas
células, o que provavelmente tem importância para a coordenação a
espermatogénese (Creasy & Foster, 2002; Junqueira e Carneiro, 1999).
O produto final da espermatogénese são espermatozóides imaturos. As
estruturas pós-testiculares incluem ductos, que fazem mover os espermatozóides
em maturação dos testículos para os locais onde sofrem o fenómeno de capacitação.
O tempo necessário para a ocorrência de um ciclo espermatogénico varia
entre espécies. A duração de um ciclo espermatogénico nos ratinhos é 34,6 dias,
sendo nos humanos de 64 dias (Creasy & Foster, 2002).
111...666 ... AAASSSPPPEEECCCTTTOOOSSS MMMOOORRRFFFOOO---FFFUUUNNNCCCIIIOOONNNAAAIIISSS DDDOOO EEEPPPIIIDDDÍÍÍDDDIIIMMMOOO
O epidídimo é um órgão tubular que transporta os espermatozóides do vaso
eferente para o vaso deferente. É constituído por três segmentos anatomicamente
distintos: a cabeça, o corpo e a cauda (Figura 1.3). Nos humanos a região da
cabeça não se encontra bem definida, sendo principalmente formada pelo vaso
eferente, tal como a região da cauda que não apresenta uma forma globular como
nos ratinhos (Sullivan et al., 2005).
Corpo do epidídimo Ducto
eferente
Testículo
Cauda do epidídimo
Ducto deferente
Cabeça do epidídimo
Cauda do epidídimo Testículo
Cabeça do
epidídimo
Corpo do epidídimo
Ducto eferente
A B
Figura 1.3- Representação do epidídimo humano (A) e de ratinho (B). A – adaptado de Holstein et al., 2003; B – Tayama et al., 2006.
Introdução
22
Nos mamíferos, o epidídimo desempenha múltiplas funções como a
reabsorção dos fluidos da rede testicular, o transporte de espermatozóides, a
eliminação de gâmetas masculinos imperfeitos, a maturação dos espermatozóides e
o seu armazenamento (Sullivan et al., 2005). A composição química do fluido do
epidídimo desempenha um papel importante tanto na maturação como no
armazenamento dos espermatozóides. Numerosas substâncias químicas podem
interferir nestes processos, alterando-os, e podendo produzir efeitos adversos
(Klaassen and Watkins, 1999).
As principais modificações dos espermatozóides, que ocorrem durante a
maturação epididimal, estão relacionadas com a aquisição de movimento, a
habilidade para o reconhecimento da zona pelúcida e para a união com a membrana
plasmática do ovócito (Dacheux et al., 2003).
A fase de maturação dos espermatozóides no epidídimo resulta da sua
interacção com o fluído epididimal, principalmente com proteínas específicas
presentes no lúmen do epidídimo (Figura 1.4) (Dacheux et al., 2005).
Figura 1.4- Representação esquemática do processo de formação e controlo de gâmetas masculinos desde o testículo até ao epidídimo (Dacheux et al., 2005).
Fertilizações in vitro e inseminações artificiais demonstram um aumento do
gradiente de fertilidade para os espermatozóides localizados entre a cabeça e o
corpo do epidídimo, atingindo o máximo na cauda, onde a fertilidade é igual ou
superior à obtida para espermatozóides ejaculados (Dacheux & Paquignon, 1980).
Espermatozóide
imaturos
Espermatozóide fértil
Espermatogónia Espermatócito
Espermátide
Controlo genómico
Controlo somático
Interacções como meio envolvente
Introdução
23
O epidídimo possui uma barreira que protege o seu lúmen de células
imunológicas presentes no sangue. Esta é constituída por junções entre células
adjacentes do ducto epididimal, possuindo, no entanto, uma robustez inferior à
barreira hemato-testicular (Creasy & Foster, 2002).
111...777 ... CCCAAARRRAAACCCTTTEEERRRÍÍÍSSSTTTIIICCCAAASSS DDDOOO EEESSSPPPEEERRRMMMAAATTTOOOZZZÓÓÓIIIDDDEEE
O espermatozóide de mamíferos é constituído por três regiões morfológicas e
funcionalmente distintas: cabeça, peça intermédia e cauda (Figura 1.5). A cabeça do
espermatozóide compreende um núcleo achatado, de cromatina condensada. A
recobrir a parte superior do núcleo encontra-se uma vesícula secretora
especializada designada de acrossoma, constituída por enzimas hidrolíticas que
permitem a penetração do espermatozóide no oócito. Quando o espermatozóide
entra em contacto com o oócito o conteúdo do acrossoma é libertado por exocitose
ocorrendo assim a reacção acrossómica (Alberts et al., 1995).
Figura 1.5- Representação esquemática de espermatozóide humano (a) e de espermatozóide de ratinho (b) .
(a)- adaptado de Alberts et al., 1995; (b) – adaptado de Cao et al., 2006.
Na peça intermédia situa-se uma hélice de mitocôndrias a envolver filamentos
contrácteis da cauda. A cauda do espermatozóide é constituída por um flagelo, onde
Acrossoma Núcleo
Mitocôndrias
Membrana plasmática
Flagelo
Cabeça
Cauda
Peça intermédia
(a) (b)
Peça intermédia
Cabeça
Cauda
Acrossoma Núcleo
Mitocôndrias
Centrossoma
(b)
Introdução
24
na sua parte central, se encontra um axonema rodeado por nove fibras densas. As
mitocôndrias localizadas na peça intermédia fornecem a energia metabólica (ATP),
necessária ao movimento flagelar que propulsiona o espermatozóide ao longo tracto
reprodutivo feminino (Marieb et al., 1998; Alberts et al., 1995).
Os espermatozóides funcionais, isto é, capazes de fecundar o oócito,
apresentam-se vivos, móveis, com membrana plasmática funcional,
morfologicamente normais e com acrossoma íntegro (WHO 1999).
111...888 ... EEEFFFEEEIIITTTOOOSSS DDDOOO CCCHHHUUUMMMBBBOOO NNNAAA EEESSSPPPEEERRRMMMAAATTTOOOGGGÉÉÉNNNEEESSSEEE EEE EEEPPPIIIDDDÍÍÍDDDIIIMMMOOO
Os efeitos adversos dos metais pesados sobre a fertilidade masculina podem
ocorrer nos órgãos reprodutivos e/ou no sistema endócrino. Pode incluir alterações
no comportamento sexual, na fertilidade, no resultado da gravidez da parceira ou
modificações em outras funções dependentes da integridade do sistema reprodutor
masculino (Sipes et al., 1997).
Várias têm sido as equipas de investigadores que têm estudado a influência
do chumbo no funcionamento do sistema reprodutor masculino. Apresentam-se,
como exemplo, alguns estudos pré-clínicos relacionados com os efeitos do chumbo
na espermatogénese.
Wadi e Ahmad (1999) concluíram, da sua investigação, que o acetato de
chumbo em altas dosagens reduz a percentagem de espermatozóides móveis e
aumenta a percentagem de espermatozóides anormais.
Noutros trabalhos foram descritas alterações histológicas nos tubos
seminíferos de animais tratados com chumbo (50 e 200 mg/kg) durante três meses
(Batra et al., 2001). Estas lesões incluem a desorganização e perturbação da
espermatogénese com acumulação de células imaturas no lúmen dos tubos. Ao
nível do epidídimo, houve alterações na sua histoarquitectura, incluindo danos na
membrana basal, desorganização do epitélio e presença de vacúolos nas células.
Pereira e seus colaboradores (Graça et al., 2004) observaram os efeitos do
cloreto de chumbo na histologia e ultraestutura testicular, e na densidade de
Introdução
25
espermatozóides na cauda dos epidídimos de ratinhos sexualmente maduros.
Verificaram, então, uma diminuição significativa do peso testicular, do diâmetro dos
tubos seminíferos e da contagem de espermatozóides, três dias depois do
tratamento com cloreto de chumbo (74 mg/kg de peso corporal).
A Tabela 1.1 reúne alguns trabalhos representativos dos efeitos causados
pelo chumbo na fertilidade masculina.
Como foi já referido, muitos têm sido os estudos desenvolvidos que
comprovam as perturbações que os compostos de chumbo causam no sistema
reprodutor masculino. No entanto, existem alguns dados contraditórios. Assim,
torna-se necessário aprofundar os conhecimentos no que diz respeito à influência do
chumbo na fertilidade masculina, nomeadamente, a fim de clarificar o modo como o
chumbo actua no sistema reprodutor masculino, por via eixo hipotalamico-pituitário-
testicular ou directamente sobre os espermatozóides.
É ainda de salientar que as lesões provocadas por vários agentes no DNA de
células germinativas podem ser transmitidas à descendência (Olsen et al., 2005).
Assim, com base neste tipo de estudos, torna-se urgente actuar de forma preventiva,
a fim de evitar riscos para a saúde reprodutiva.
Introdução
26
Tabela 1.1 – Efeitos do chumbo na fertilidade de ratos e ratinhos.
111...999 ... LLLEEEGGGIIISSSLLLAAAÇÇÇÃÃÃOOO QQQUUUEEE SSSAAALLLVVVAAAGGGUUUAAARRRDDDEEE AAA EEEXXXPPPOOOSSSIIIÇÇÇÃÃÃOOO DDDOOOSSS TTTRRRAAABBBAAALLLHHHAAADDDOOORRREEESSS
AAAOOO CCCHHHUUUMMMBBBOOO
Como já foi referido anteriormente a redução da fertilidade masculina tem
tendência a aumentar devido à crescente exposição a poluentes nos locais de
trabalhos, nomeadamente a chumbo. Como tal, é fulcral a existência de legislação
COMPOSTO DE
CHUMBO
MODELO
EXPERIMENTAL
EFEITOS REFERÊNCIA
Acetato de
chumbo
Acetato de
chumbo
Cloreto de
chumbo
Ratos
Ratinhos
Ratinhos
Libertação prematura de células germinativas
Perturbações no epidídimo
Interrupção da maturação das células germinativas
Alterações nas células de Sertolli
Presença de células apoptóticas no testículo
Diminuição da concentração espermática
Diminuição da motilidade
Supressão do eixo hipotalâmico-pituitário-testicular
Supressão do nível de testosterona
Redução da mobilidade dos espermatozóides
Aumento do número de espermatozóides anormais
Diminuição do peso testicular e do diâmetro dos
tubos seminíferos
Diminuição da produção de espermatozóides
Diminuição da motilidade, vitalidade e
hipoosmolaridade espermática em estudos in vitro
Diminuição da integridade acrossómica em estudos
in vivo
Batra et al. ,
2001
Gorbel et
al., 2002
Hsu et al. ,
1997
Sokol, 1990
Wadi &
Ahmad,
1999
Graça et al.,
2004
Silva et al.,
2007
Introdução
27
que estabeleça valores limites de exposição a compostos causadores de riscos, bem
como medidas de protecção da saúde reprodutiva masculina.
O chumbo apresenta legislação própria – D.L. n.º 274/89 de 21 de Agosto
(ANEXO II) que transpõe para direito interno a Directiva do Conselho n.º 82/605/CEE
de 28 de Julho, relativa à protecção dos trabalhadores contra os riscos resultantes
da exposição ao chumbo e aos seus compostos iónicos nos locais de trabalho – que
apesar de estabelecer valores limites de concentração e biológicos (Artº 2º), não
contempla questões relacionadas com a promoção da saúde reprodutiva, como por
exemplo a necessidade de exames médicos direccionados para o diagnóstico ou
avaliação de perturbações reprodutivas, ou o dever das entidades empregadoras
informarem os trabalhadores dos potenciais riscos para a sua fertilidade.
Embora a legislação relativa a doenças profissionais – Dec. Regul. n.º 6/2001
de 5 de Maio (ANEXO I) – se refira ao metal em estudo no presente trabalho, não
faz referência a alterações da fertilidade masculina.
Refira-se, então, o facto de não se conhecer legislação nacional que
determine o procedimento dos Serviços de Segurança, Higiene e Saúde no Trabalho
(SSHST) para a promoção da saúde reprodutiva nos locais de trabalho.
111...111000 ... AAACCCTTTUUUAAAÇÇÇÃÃÃOOO DDDOOOSSS SSSEEERRRVVVIIIÇÇÇOOOSSS DDDEEE SSSEEEGGGUUURRRAAANNNÇÇÇAAA,,, HHHIIIGGGIIIEEENNNEEE EEE SSSAAAÚÚÚDDDEEE NNNOOO
TTTRRRAAABBBAAALLLHHHOOO (((SSSSSSHHHSSSTTT)))
A legislação nacional define o regime de enquadramento da Segurança e
Saúde no Trabalho, através do D.L. n.º 441/91, de 14 de Novembro (ANEXO III) que,
entre outros aspectos, estabelece os princípios do Sistema Nacional de Prevenção
de Riscos Profissionais e prevê os principais elementos do sistema de gestão de
segurança e saúde das empresas. O D.L. n.º 26/94 de 1 de Fevereiro (ANEXO IV)
prevê ainda o regime de organização e funcionamento das actividades dos SSHST.
Conforme enumerado no D.L. n.º 26/94 de 1 de Fevereiro, uma das
actividades que estes serviços devem garantir, é a identificação e avaliação dos
riscos para a segurança e saúde nos locais de trabalho e controlo periódico dos
Introdução
28
riscos resultantes da exposição a agentes químicos, físicos e biológicos. Assim, a
prevenção de riscos profissionais relacionados com a exposição a determinados
agentes químicos, como os metais pesados, pressupõe, desde logo, uma análise
das situações de trabalho e uma adequada quantificação da exposição a
substâncias químicas, utilizando a metodologia adequada da Higiene do Trabalho
(Prista e Uva, 2002).
Um dos métodos analíticos mais utilizados em Higiene do Trabalho para
quantificar o teor de metais pesados a que os trabalhadores estão expostos é a
espectrometria de absorção atómica.
Com o resultado obtido da monitorização ambiental e com base nos Valores
Limites de Exposição (VLE), estabelecidos na legislação, caso exista, ou na norma
portuguesa NP - 1796: 2004, o técnico de SSHS deve proceder à comparação dos
valores e desenvolver e implementar medidas de prevenção e de protecção, caso o
resultado obtido seja superior ao VLE da substância química em análise.
Os indicadores biológicos de exposição (BEI- Biological Exposure Indices),
que medem a substância química ou o(s) metabolito(s) na urina, no sangue ou
noutros meios, como por exemplo o ar expirado, são concebidos como um valor-
referência que deve constituir uma orientação para a avaliação de eventuais efeitos
adversos para a saúde (Tabela 1.2) (Prista e Uva, 2002). Estes indicadores
constituem um novo meio para caracterizar a exposição a substâncias perigosas e
devem ser considerados como um indicador complementar dos valores limite de
exposição (Miguel, 1991).
Tabela 1.2- Exemplos de indicadores, BEI e meios de colheita (adaptado de Prista e Uva, 2002).
TÓXICO MEIO BIOLÓGICO BEI
Cádmio Sangue 5 µg/L
Cádmio Urina 5 µg/gr. Creatinina
Chumbo Sangue 40 µg/100ml
Crómio Urina 10 µg/gr.creatinina
Introdução
29
A vigilância médica de trabalhadores, assegurada pelos SSHS,
particularmente por um médico do Trabalho, comporta desde logo, acções
sistemáticas e repetidas da avaliação do estado de saúde de cada indivíduo, em
função da exposição profissional a que se encontra sujeito (Prista e Uva, 2002). Os
exames médicos feitos ao nível da Medicina do Trabalho, englobam análises
bioquímicas ao sangue e à urina, entre outros.
Aos serviços de SSHST competem muitas outras actividades, promotoras da
saúde dos trabalhadores, citados no artigo 13º do D.L. n.º 26/94 de 26 de Fevereiro.
Destas salientam-se por exemplo a informação e formação sobre os riscos para a
segurança e saúde, bem como sobre as medidas de protecção e de prevenção; a
promoção e vigilância da saúde, bem como a organização e manutenção dos
registos clínicos e outros elementos informativos relativos a cada trabalhador; e a
elaboração de um programa de prevenção de riscos profissionais. No entanto, no
que se refere à actuação dos SSHST no âmbito da promoção da saúde reprodutiva,
não se conhecem acções desenvolvidas com esta finalidade.
111...111111 ... OOOBBBJJJEEECCCTTTIIIVVVOOOSSS DDDOOO PPPRRREEESSSEEENNNTTTEEE TTTRRRAAABBBAAALLLHHHOOO
O presente trabalho visou a abordagem da temática relacionada com os
riscos profissionais na saúde reprodutiva masculina causados pelo chumbo. A
legislação existente a nível da preservação da fertilidade masculina nos locais de
trabalho, bem como orientações que devem ser seguidas com vista a minimizar os
efeitos causados pelo chumbo na fertilidade masculina, foram outros dos temas
referidos.
Como objectivo principal, pretendeu-se, através de um estudo comparativo,
avaliar os parâmetros de fertilidade masculina (motilidade, vitalidade,
hipoosmolaridade, concentração e morfologia espermática) em indivíduos expostos
a compostos de chumbo. No entanto, devido à dificuldade de obtenção de amostras
de sémen provenientes de trabalhadores expostos, efectuaram-se, paralelamente,
ensaios experimentais em ratinhos, de forma a ampliar o estudo do efeito do
chumbo na qualidade espermática. As dificuldades no aprofundamento do estudo
Introdução
30
em humanos prenderam-se com diversos aspectos tais como a inexistência de
legislação que salvaguarde a fertilidade masculina nos locais de trabalho; a ausente
intervenção de andrologistas ao nível ocupacional; a falta de informação dos
trabalhadores e responsáveis de empresas acerca dos perigos ocupacionais para a
saúde reprodutiva, entre outros.
Por último, pretendeu-se ainda comprovar a necessidade da protecção da
saúde reprodutiva masculina de indivíduos sujeitos a riscos profissionais,
recomendando-se medidas passíveis de serem aplicadas.
222... MMMAAATTTEEERRRIIIAAALLL EEE MMMÉÉÉTTTOOODDDOOOSSS
Material e Métodos
32
Inicialmente, o presente trabalho pretendia apenas estudar os efeitos do
chumbo na fertilidade masculina de trabalhadores expostos a este composto,
utilizando uma amostra bastante significativa. Devido à baixa aderência de
empresas ao estudo e ao reduzido número de amostras obtidas, no sentido de
complementar o estudo, testou-se também o efeito in vitro e in vivo do cloreto de
chumbo na fertilidade de ratinhos. Este trabalho encontra-se, por isso, subdividido
em três partes: efeito do chumbo na fertilidade humana e efeito in vitro e in vivo do
cloreto de chumbo em ratinhos.
222...111 ... EEEFFFEEEIIITTTOOO DDDOOO CCCHHHUUUMMMBBBOOO NNNAAA QQQUUUAAALLLIIIDDDAAADDDEEE EEESSSPPPEEERRRMMMÁÁÁTTTIIICCCAAA HHHUUUMMMAAANNNAAA
222...111 ...111... DDDEEESSSIIIGGGNNN EEEXXXPPPEEERRRIIIMMMEEENNNTTTAAALLL
Com a cooperação do Centro Clínico de Medicina do Trabalho (CCMT) de
Aveiro foi solicitada a algumas empresas desta região a sua colaboração, no sentido
de permitir e incentivar os seus trabalhadores expostos a ambientes plumbíferos, a
realizarem a colheita de sémen para posterior análise. Apesar dos vários esforços
empreendidos, apenas uma empresa metalúrgica aderiu ao estudo, permitindo a
análise de sémen de seis trabalhadores da secção de oxicorte. Do grupo controlo
fizeram parte seis voluntários cujas profissões não envolvem ambientes plumbíferos,
sem anomalias aparentes do sistema reprodutor e com idades idênticas às do grupo
exposto.
A análise do sémen (espermograma) foi considerado no presente trabalho
como factor determinante no estudo da fertilidade dos dois grupos de trabalhadores.
Para o efeito utilizou-se o método de análise do sémen recomendado pela WHO
(1999) bem como os seus valores de referência (ANEXO V). Foram examinados os
seguintes parâmetros: o movimento e vitalidade dos espermatozóides,
hipoosmolaridade, outras propriedades físicas do sémen, como o tempo de
liquefacção, volume, cor, pH, odor e viscosidade, contagem e avaliação morfológica
dos espermatozóides. Estas análises foram efectuadas no Departamento de Biologia
Material e Métodos
33
da Universidade de Aveiro e no Centro de Estudos de Infertilidade e Esterilidade.
Por fim, procedeu-se à comparação estatística dos valores obtidos para os dois
grupos de trabalhadores.
222...111 ...222... PPPOOOPPPUUULLLAAAÇÇÇÃÃÃOOO EEESSSTTTUUUDDDAAADDDAAA
Uma vez seleccionada a amostra de trabalhadores expostos a ambientes
plumbíferos provenientes de uma empresa metalúrgica e respectivo grupo controlo,
efectuou-se um pequeno questionário (ANEXO VI) a cada trabalhador cooperante, a
fim de serem recolhidas todas as informações necessárias para uma correcta
análise da influência do referido metal na sua fertilidade, tais como, hábitos
tabágicos, frequência de consumo de álcool, medicação e índice de massa corporal.
Os trabalhadores foram previamente informados da condição de abstinência sexual
que teriam de respeitar, tendo sido considerado como condição ideal uma
abstinência de três a cinco dias. Segundo a WHO (1999) a duração do período de
abstinência pode ser no mínimo dois dias, não devendo, no entanto, ultrapassar os
sete dias. Se a duração do período de abstinência for curta, poder-se-á verificar um
reduzido número de espermatozóides devido à falta de tempo para repor a
população de espermatozóides. Pelo contrário, se esse período for demasiado longo,
a qualidade do esperma será influenciado, devido a uma excessiva acumulação de
espermatozóides com maior tempo de vida, ou seja, com a sua motilidade diminuída
(Wallach & Zacur, 1995).
A colheita foi realizada individualmente em instalações sanitárias adequadas,
disponíveis na própria empresa, para um recipiente apropriado de plástico de 120 ml,
largo e estéril, à temperatura de aproximadamente 37ºC.
Em cada recipiente registou-se o número do trabalhador e a respectiva hora
de recolha, sendo estes transportados para o laboratório, numa caixa térmica com
acumuladores de calor previamente aquecidos numa estufa a 37ºC.
Após a chegada ao laboratório, as amostras foram colocadas numa estufa a
37ºC, procedendo-se seguidamente à análise detalhada de cada uma delas.
Material e Métodos
34
222...111 ...333... AAAVVVAAALLLIIIAAAÇÇÇÃÃÃOOO DDDAAA MMMOOOTTTIIILLLIIIDDDAAADDDEEE EEESSSPPPEEERRRMMMÁÁÁTTTIIICCCAAA
O movimento dos espermatozóides foi o primeiro aspecto a ser estudado,
devido à sua versatilidade. Para avaliar a quantidade e qualidade do movimento dos
espermatozóides colocaram-se 10 µl de sémen num tubo de ensaio , ao qual se
adicionou 90 µl de soro fisiológico a 37ºC. Colocou-se numa lâmina, uma gota do
preparado e a respectiva lamela para observação ao microscópio óptico (Olympus
BX41). Calculou-se a percentagem de espermatozóides de cada categoria de
movimento, com a ajuda de um contador manual de laboratório, fazendo uma
contagem de duzentos espermatozóides. Sempre que se verificou, com a objectiva
de ampliação 10x um elevado número de espermatozóides, perturbador da sua
contagem e categorização, efectuou-se uma diluição de 1:20. Para tal, adicionou-se
190 µl de soro fisiológico a 37ºC a 10 µl de sémen.
Espermatozóides imóveis ou com baixa motilidade são, geralmente,
considerados incapazes de fecundar o ovócito (adaptado de Turner R., 2003). Como
tal, na avaliação da motilidade é necessário estimar não só o número de
espermatozóides móveis, como também a qualidade do seu movimento. A WHO
(1999) definiu quatro categorias para o movimento espermático:
Categoria a – movimento progressivo rápido ( = 25 µm/s a 37ºC,
correspondendo 25 µm ao comprimento aproximado de cinco cabeças de
espermatozóides)
Categoria b – movimento progressivo lento
Categoria c – movimento não progressivo - in situ (= 5 µm/s)
Categoria d – ausência de movimento.
Ainda de acordo com as recomendações da WHO (1999), foi efectuada uma
segunda avaliação em todas as contagens, fazendo-se a média com os valores
obtidos. Quando a diferença entre as duas observações se mostrou superior a 10%,
procedeu-se a uma terceira contagem.
Segundo a WHO (1999) verifica-se uma situação de astenozoospermia
(redução ou ausência do movimento dos espermatozóides) quando menos de 50%
Material e Métodos
35
dos espermatozóides têm movimento progressivo ou quando menos de 25% têm
movimento progressivo rápido.
222...111 ...444... AAAVVVAAALLLIIIAAAÇÇÇÃÃÃOOO DDDAAA VVVIIITTTAAALLLIIIDDDAAADDDEEE EEESSSPPPEEERRRMMMÁÁÁTTTIIICCCAAA
A anormal permeabilidade da membrana plasmática dos espermatozóides
mortos permite a entrada de Eosina Y a 0,5%, provocando uma coloração particular
nestas células, sendo este o princípio base do teste da vitalidade (adaptado de
Wallach & Zacur, 1995). Esta técnica permite diferenciar os espermatozóides vivos
imóveis dos espermatozóides mortos. Esta avaliação permite ainda verificar a
validade dos resultados da motilidade, uma vez que a percentagem de células
mortas não pode ultrapassar a percentagem de espermatozóides imóveis.
A solução de Eosina Y a 0,5% foi preparada, adicionando-se 5 g de Eosina Y
a 1 litro de solução de cloreto de sódio (0,9%). Em seguida, adicionou-se 10 µl
dessa solução a 10 µl de esperma. Homogeneizou-se e aguardaram-se dois minutos.
Posteriormente, efectuou-se um esfregaço, deixou-se secar e observou-se ao
microscópio. Contaram-se duzentos espermatozóides, com a ajuda de um contador
manual, diferenciando os corados de vermelho (sem vida) dos não corados (com
vida) (WHO, 1999).
A vitalidade é considerada normal, segundo a WHO (1999), quando a
percentagem de espermatozóides vivos for igual ou superior a 50% (ANEXO V).
222...111 ...555... TTTEEESSSTTTEEE DDDAAA HHHIIIPPPOOOOOOSSSMMMOOOLLLAAARRRIIIDDDAAADDDEEE
O teste da hipoosmolaridade é baseado na semi-permeabilidade da
membrana plasmática intacta de uma célula, que provoca o aumento de volume do
espermatozóide em condições hipoosmóticas, devido ao influxo de água (Drevius &
Material e Métodos
36
Eriksson, 1966 in WHO, 1999). Este teste fornece, por isso, informação relativa à
integridade da membrana celular da cauda do espermatozóide (WHO, 1999).
A solução hipoosmótica foi preparada adicionando 0,735 g de citrato de sódio
dihidratado (Na3C6H5O7.2H2O) e 1,351 g de fructose a 100 ml de água destilada.
Esta solução foi conservada a uma temperatura de -20ºC, tendo, no entanto, que ser
aquecida a 37ºC durante cinco minutos, para poder ser utilizada no presente teste.
Adicionou-se 10µl de esperma a 90µl de solução hipoosmótica e colocou-se
na estufa a 37ºC durante trinta minutos. Nos casos em que se verificou um elevado
número de espermatozóides, tal como refe rido para outros parâmetros, efectuou-se
uma diluição de 1:20, adicionando 10µl de esperma a 190µl de solução
hipoosmótica. Nos casos de reduzido número de espermatozóides efectuou-se uma
diluição de 1:5, adicionando 10µl de esperma a 40µl de solução hipoosmótica. Após
a incubação, observou-se ao microscópio uma gota da referida solução. Com a
ajuda de um contador manual, contaram-se, em duzentos espermatozóides, os que
apresentavam a forma da cauda alterada (Figura 2.1), determinando-se assim a
percentagem de hipoosmolaridade.
Figura 2.1 – Representação esquemática de alterações morfológicas em espermatozóides humanos, quando
sujeitos a condições hipoósmoticas; (a) = sem alteração; (b-g) = vários tipos de alterações na cauda dos
espermatozóides (WHO, 1999).
Segundo a WHO (1999), o teste de hipoosmolaridade é considerado normal
se a percentagem resultante for superior a 60% (ANEXO V).
Material e Métodos
37
222...111 ...666... DDDEEETTTEEERRRMMMIIINNNAAAÇÇÇÃÃÃOOO DDDAAA CCCOOONNNCCCEEENNNTTTRRRAAAÇÇÇÃÃÃOOO DDDEEE EEESSSPPPEEERRRMMMAAATTTOOOZZZÓÓÓIIIDDDEEESSS
A concentração de espermatozóides, expressa em milhões por mililitro de
ejaculado, foi determinada utilizando uma câmara de Neubauer (hemocitómetro).
Para determinar a diluição a ser utilizada na contagem de espermatozóides com a
referida câmara, foi necessária, para cada amostra, uma primeira avaliação do
número de espermatozóides existente num campo de um microscópio de contraste
de fase com ampliação de 400x. Assim, a WHO (1999) recomenda a utilização de
diversas diluições, em função do número de espermatozóides observados num
campo de ampliação de 400x, tal como referido na Tabela 2.1.
Tabela 2.1- Diluição e factores de conversão para contagem de espermatozóides com a câmara de
Neubauer (adaptado de OMS, 1999).
Espermatozóides por
Diluição
Factor de conversão
Número de quadrados contados
campo de ampliação 400x (sémen + diluente) 25 5
<15
15-40
40-200 >200
1 : 5 (1 + 4)
1 : 10 (1 + 9)
1 : 20 (1 + 19) 1 : 50 (1 + 49)
20
10
5 2
4
2
1 0.4
Após a estimativa da diluição a ser utilizada, efectuou-se para cada amostra a
diluição correspondente. Por exemplo, para uma diluição de 1:20 (a mais usual)
colocou-se num tubo de ensaio 10 µl de esperma e 190 µl de formol tamponado.
Utilizou-se como solução de diluição o formol tamponado para imobilizar os
espermatozóides, facilitando a sua contagem. A solução de formol tamponado
preparou-se adicionando 25 g de carbonito de sódio (NaHCO3) a 5 ml de formalina
3,5 %, perfazendo um volume final de 500 ml com água destilada.
Após a fixação da lamela à câmara de Neubaeur e com os anéis
birrefringentes (anéis de Newton) visíveis, colocaram-se 10µl da solução preparada
anteriormente, na margem da lamela, entre esta e a câmara. Aguardaram-se cinco
minutos para a ocorrência da sedimentação dos espermatozóides e formação de um
único plano óptico.
Material e Métodos
38
Para a determinação da concentração foram considerados os
espermatozóides completos (com cabeça e cauda) e os espermatozóides anómalos
com cabeça ou cauda de menores dimensões.
Para a contagem de espermatozóides utilizaram-se apenas 5 dos quadrados
existentes na grelha central, conforme representado na Figura 2.2. No entanto, nos
casos em que se observaram menos de 10 espermatozóides em todo o quadrado
central da grelha, efectuou-se a contagem nos 25 quadrados.
Figura 2.2 – Grelha central da câmara de Neubaeur. (a ) Os 5 quadrados utilizados na contagem de
espermatozóides, marcados pelas letras de A a E. (b ) Um dos cinco quadrados que serve para a
contagem de espermatozóides. As cabeças dos espermatozóides marcadas de preto são contadas e as
cabeças marcadas a branco são ignoradas (adaptado de Makler, 2003).
Quando os espermatozóides se localizavam na linha de divisão entre dois
quadrados adjacentes apenas foram contados os situados na margem superior e
esquerda de cada quadrado, conforme o recomendado pela WHO (1999) (Figura 2.2
b). Esta Organização recomenda também a realização de duas contagens, cuja
diferença entre elas deve ter um intervalo de confiança de aproximadamente 95%.
Através da Figura 2.3, pode verificar-se se o ponto resultante do cruzamento entre o
valor da soma das duas contagens e o valor da sua diferença, se situa acima ou
abaixo da curva representada. Caso o ponto se localize acima da curva, deve
reanalisar-se a amostra, uma vez que, o intervalo de confiança entre as duas
contagens é inferior a 95%. Se o ponto se localizar abaixo da curva, significa que o
intervalo de confiança entre as duas contagens é igual ou superior a 95%, por isso,
(a) (b)
Material e Métodos
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deve ser feita a média das duas contagens, utilizando esse valor para o cálculo da
concentração.
Figura 2.3 – Intervalo de confiança de aproximadamente 95% para a diferença entre duas
contagens de espermatozóides (adaptado de WHO, 1999).
Quando a diferença entre as duas contagens é elevada significa que pode ter
ocorrido um erro na diluição, na contagem ou que os espermatozóides não se
encontravam distribuídos aleatoriamente na solução preparada.
Para determinar a concentração de espermatozóides na amostra original de
sémen em milhões/ml, dividiu-se a média das duas contagens de espermatozóides
pelo factor de conversão respectivo, indicado na Tabela 2.1.
222...111 ...777... AAAVVVAAALLLIIIAAAÇÇÇÃÃÃOOO MMMOOORRRFFFOOOLLLÓÓÓGGGIIICCCAAA DDDOOOSSS EEESSSPPPEEERRRMMMAAATTTOOOZZZÓÓÓIIIDDDEEESSS
A avaliação morfológica de espermatozóides humanos pode ser efectuada
através de diferentes colorações. No presente trabalho, utilizou-se a coloração
papanicolau, também recomendada pela WHO (1999). No entanto de uma forma
mais simplificada e de acordo com o procedimento utilizado em laboratórios de
esterilidade, onde esta avaliação é efectuada correntemente. Assim, efectuou-se um
Soma das duas contagens
Dife
renç
a en
tre a
s co
ntag
ens
Material e Métodos
40
esfregaço com uma alíquota de 10 µl de sémen, fixando-se, depois de seco, em
metanol. Imergiu-se o esfregaço em corante papanicolau durante 15 minutos e após
uma lavagem de 5 minutos em água corrente, colocou-se o corante de Shorr durante
3 minutos. Após uma nova lavagem em água corrente, a lâmina foi desidratada em
metanol. Após secagem, analisou-se, microscopicamente com uma ampliação de
1000x, a morfologia dos espermatozóides. Os espermatozóides foram classificados
de acordo com os critérios utilizados por Kruger et al. (1986). Assim, foram avaliados
400 espermatozóides, utilizando as seguintes categorias morfológicas: normais,
macrocéfalos, microcéfalos, acéfalos, bicéfalos, alongados, pontiagudos, sem
acrossoma, com microacrossoma, cabeça amorfa, cabeça em lise, anomalias do
colo, anomalias na peça intermédia , acaudados, bicaudados, cauda curta, cauda
enrolada, imaturos e com restos citoplasmáticos. Para cada trabalhador foi
determinada a percentagem de espermatozóides normais e a percentagem de
espermatozóides com as anomalias referidas.
222...111 ...888... AAANNNÁÁÁLLLIIISSSEEE DDDEEE OOOUUUTTTRRRAAASSS PPPRRROOOPPPRRRIIIEEEDDDAAADDDEEESSS FFFÍÍÍSSSIIICCCAAASSS DDDOOO SSSÉÉÉMMMEEENNN
LLLiiiqqquuueee fffaaacccçççãããooo
A liquefacção é produzida por enzimas proteolíticas, segregadas pela
glândula prostática, e por outras designadas por fibrinogenase e aminopeptidase
(Wallach & Zacur, 1995).
Uma amostra de sémen normal liquefaz antes de 60 minutos, à temperatura
ambiente. Os casos em que a liquefacção não ocorre durante o período de tempo
acima citado ou se observam coágulos mucosos consideram-se com liquefacção
incompleta. No entanto, algumas amostras de sémen normal podem conter grânulos
gelatinosos que não liquefazem e para os quais ainda não foi encontrado significado
fisiológico (WHO, 1999).
Material e Métodos
41
Para a avaliação do parâmetro em causa, bastou observar o aspecto da
amostra de sémen após 60 minutos da sua recolha, e registou-se como liquefacção
completa ou incompleta, dependendo do observado.
VVVooollluuummmeee
O volume normal do ejaculado, de acordo com a WHO (1999), é de 2 ml ou
superior a este valor. Após a avaliação da liquefacção, determinou-se o volume,
utilizando para cada amostra uma pipeta de 10 ml, esterilizada e graduada.
CCCooorrr
A cor ou aparência de uma amostra de sémen pode ser examinada após a
sua liquefacção ou até uma hora depois da ejaculação (WHO, 1999).
Para avaliar este parâmetro, observou-se a amostra, à temperatura ambiente,
e registou-se o seu aspecto.
Uma amostra de sémen normal apresenta um aspecto homogéneo, opaco e
acinzentado. No entanto, estas características podem diferir, ocorrendo casos em
que o aspecto da amostra é pouco opaco (quando a concentração de
espermatozóides é muito baixa), a cor é vermelha-acastanhada (quando existem
glóbulos vermelhos na amostra) ou amarela (quando o tempo de abstinência é
elevado ou quando existe uma infecção) (adaptado de WHO, 1999 e Wallach &
Zacur, 1995).
pppHHH
Para uma correcta determinação do pH de uma amostra de sémen
mergulhou-se o papel indicador de pH, de escala entre 6,4 e 8,0, numa gota de
sémen, logo que foi possível. Passados 30 segundos, comparou-se a coloração da
zona impregnada com a tira de calibração e registou-se o valor de pH.
Material e Métodos
42
Segundo a WHO (1999), o valor normal de pH deve ser superior a 7,2.
OOOdddooorrr
O sémen apresenta um odor intenso característico, porém em casos anormais,
pode apresentar um cheiro fétido ou pode ser desprovido de cheiro.
As amostras de sémen normal foram classificadas com cheiro sui generis .
VVViiissscccooosss iiidddaaadddeee
Para determinar a viscosidade de uma amostra de sémen é necessário que
esta se encontre liquefeita e é medida através do comprimento de uma gota de
sémen quando ejectado de uma pipeta. Assim, com uma pipeta de 5 ml e uma pro-
pipeta aspiraram-se alguns mililitros de sémen e pressionando a pro-pipeta num
único movimento ejectou-se uma gota e observou-se o seu aspecto.
Uma amostra de sémen normal é ligeiramente viscosa e caracteriza-se por
formar uma pequena e discreta gota quando ejectada da pipeta. Nos casos de
viscosidade aumentada a gota libertada forma uma linha com mais de 2 cm de
comprimento (WHO, 1999).
222...222 ... EEEFFFEEEIIITTTOOO IIINNN VVVIIITTTRRROOO EEE IIINNN VVVIIIVVVOOO DDDOOO CCCHHHUUUMMMBBBOOO NNNAAA QQQUUUAAALLLIIIDDDAAADDDEEE EEESSSPPPEEERRRMMMÁÁÁTTTIIICCCAAA
DDDEEE RRRAAATTTIIINNNHHHOOOSSS
Procedeu-se ao estudo do espermograma de ratinhos submetidos à
exposição ao chumbo, assim como aos respectivos grupos controlo. Para o efeito,
foram analisados os mesmos parâmetros utilizados na análise da fertilidade humana
(motilidade, vitalidade, hipoosmolaridade, concentração, integridade acrossómica e
Material e Métodos
43
morfologia). No entanto, nestes ensaios, as amostras foram extraídas do fluido
epididimal.
222...222 ...111... AAANNNIIIMMMAAAIIISSS DDDEEE LLLAAABBBOOORRRAAATTTÓÓÓRRRIIIOOO
Na realização deste trabalho foram utilizados ratinhos ICR-CD1 do sexo
masculino, com dois meses de idade. fornecidos pelo biotério da Harlan Interfauna
Ibérica SA (Barcelona). Os animais foram mantidos no biotério do Departamento de
Biologia da Universidade de Aveiro em gaiolas plásticas com cobertura metálica, a
uma temperatura de 22 ± 2 ºC, humidade relativa entre 40 a 60% e com ciclo de
luz/escuridão de 12/12 horas. Os animais foram alimentados com ração granulada
apropriada e água ad libitum .
Foi registado o peso de cada um dos ratinhos numa balança PRECISA 220 M
e posteriormente, foram agrupados aleatoriamente em 5 grupos teste (2 grupos para
ensaios in vitro e 3 grupos para ensaios in vivo) e 5 grupos controlo, com n = 5 para
cada grupo. Antes do início de cada experiência os animais permaneceram cerca de
cinco dias nas condições acima referidas para aclimatização.
As experiências realizadas neste trabalho seguiram as directrizes
institucionais para a ética dos animais experimentais (Directiva 86/609/CEE –
24/11/86).
222...222 ...222... PPPRRREEEPPPAAARRRAAAÇÇÇÃÃÃOOO DDDEEE SSSOOOLLLUUUÇÇÇÕÕÕEEESSS
Preparou-se uma solução de cloreto de chumbo (PbCl2) (MERCK) em água
destilada, na concentração de 9,0 g/l. Utilizou-se esta concentração, ligeiramente
inferior ao limite de solubilidade do PbCl2 em água (9,9 g/l), para garantir uma total
dissolução do composto.
Material e Métodos
44
A análise dos parâmetros considerados determinantes na avaliação da
fertilidade masculina, foi efectuada nos ratinhos, partindo do líquido epididimal. Para
tal, após a extracção do epidídimo, os espermatozóides nele contidos foram
expostos num meio capacitante designado por Meio modificado de Tyrode (MT6).
Este meio foi preparado de acordo com Fraser (1984), sendo constituído por: 125
mM de NaCl (PRONALAB), 0,5 mM de MgCl2.6H2O (PANCREAC), 0,36 mM de
NaH2PO4.2H2O (RIEDEL-DE HAEN), 6,4 mM de Glucose (SIGMA), 100 unidade de
sódio penicilina/ml (SIGMA), 25 mM de NaHCO3 (MERCK), 0.001% de vermelho de
fenol (MERCK), 1 ,7 mM de CaCl2.2H2O (PANCREAC), 5 mM de HEPES (SIGMA), 4
mg/ml de BSA (SIGMA). Finalmente procedeu-se ao acerto do pH da solução para
7,2.
A influência do chumbo em contacto directo com os espermatozóides de
ratinhos (exposição in vitro) foi testada através da preparação de meios T6 com
diferentes concentrações de cloreto de chumbo. Para tal, adicionou-se ao meio T6
dois volumes diferentes da solução preparada de cloreto de chumbo com
concentração 9,0 g/l.
222...222 ...333... DDDEEESSSIIIGGGNNN EEEXXXPPPEEERRRIIIMMMEEENNNTTTAAALLL
No presente estudo foram efectuados diferentes ensaios, a fim de testar o
efeito do chumbo em determinados parâmetros relacionados com a fertilidade de
ratinhos. Testaram-se doses de chumbo in vitro e in vivo.
No estudo in vitro foram testadas duas doses de chumbo, adicionando-se ao
meio T6 a quantidade de cloreto de chumbo necessária para perfazer uma
concentração de 2,4 mg/l (Grupo I) e 488,9 mg/l (Grupo II) de Pb2+. A primeira dose
corresponde ao dobro do limite considerado aceitável para a concentração de
chumbo no sangue (plumbémia), de acordo com classificação do National Institute of
Health (Restrepo et al., 2000). A segunda dose (488,9 mg/l) corresponde a uma
concentração aproximadamente dezasseis vezes menor do que a dose injectada in
vivo. Nos respectivos grupos controlo os espermatozóides foram expostos em meio
Material e Métodos
45
T6 desprovido de chumbo. Para cada grupo exposto e respectivos grupos controlo,
com n=5 para cada um deles, foram analisados os seguintes parâmetros: motilidade,
vitalidade e hipoosmolaridade. Os parâmetros concentração, integridade
acrossómica e morfologia dos espermatozóides não foram analisados por não se
verificarem alterações dos mesmos neste tipo de estudo in vitro.
No estudo in vivo foi utilizada a mesma dose de 150 mg de cloreto de
chumbo /kg de peso vivo nos diferentes ensaios, variando o tempo de exposição e o
dia do sacrifício dos ratinhos. Foi, então, estudada a influência do cloreto de chumbo
em parâmetros relacionados com a fertilidade de ratinhos injectados
subcutaneamente (150 mg de PbCl2/kg de peso vivo) durante dois períodos de
tempo diferentes, 4 (Grupo III) e 6 dias (Grupo IV), com o sacrifício dos animais 24
horas após a última injecção. No terceiro ensaio um grupo de ratinhos (Grupo V) foi
injectado subcutaneamente com a dose referida anteriormente durante um período
de 4 dias, com sacrifício no 35º dia após a primeira exposição, período necessário
para a ocorrência de um ciclo espermatogénico (Creasy & Foster, 2002). Aos
respectivos grupos controlo foram administrados subcutaneamente 0,5 ml de uma
solução de cloreto de sódio (0,9%) durante os períodos correspondentes. Dos
grupos expostos e respectivos grupos controlo foram analisados os parâmetros tais
como a motilidade, a vitalidade, a hipoosmolaridade, a concentração, a integridade
acrossómica e a morfologia dos espermatozóides.
222...222 ...444... CCCOOOLLLHHHEEEIIITTTAAA DDDEEE ÓÓÓRRRGGGÃÃÃOOOSSS EEE PPPRRREEEPPPAAARRRAAAÇÇÇÃÃÃOOO DDDAAASSS AAAMMMOOOSSSTTTRRRAAASSS
Os ratinhos de cada grupo foram sacrificados e após a abertura da cavidade
escrotal, removeram-se os epidídimos. Estes foram colocados numa caixa de Petri
contendo 2 ml de meio modificado de Tyrode a uma temperatura de 35ºC. A cauda
de cada epidídimo foi cortada em 2-3 peças com ajuda de uma agulha e um bisturi,
de modo a libertar os espermatozóides no meio. Para assegurar uma distribuição
uniforme dos espermatozóides, aguardaram-se 30 minutos antes do início das
contagens, mantendo o meio à temperatura de 35ºC. Após esse tempo iniciou-se a
análise dos parâmetros referidos.
Material e Métodos
46
222...222 ...555... AAAVVVAAALLLIIIAAAÇÇÇÃÃÃOOO DDDAAA MMMOOOTTTIIILLLIIIDDDAAADDDEEE EEESSSPPPEEERRRMMMÁÁÁTTTIIICCCAAA
Para avaliar o movimento dos espermatozóides colheu-se do meio T6
contendo espermatozóides uma alíquota de 10 µl e colocou-se numa lâmina com a
respectiva lamela. A percentagem de espermatozóides de cada categoria de
movimento, referidas na avaliação da motilidade espermática em humanos, foi
estimada através da observação microscópica da alíquota com uma ampliação de
400x, efectuando uma contagem de duzentos espermatozóides.
222...222 ...666... AAAVVVAAALLLIIIAAAÇÇÇÃÃÃOOO DDDAAA VVVIIITTTAAALLLIIIDDDAAADDDEEE EEESSSPPPEEERRRMMMÁÁÁTTTIIICCCAAA
A vitalidade espermática foi avaliada misturando numa lâmina uma alíquota
de 10 µl da amostra de meio T6 a uma alíquota de 1 µl de solução de Eosina Y a
0,5%. Após a mistura das alíquotas com uma micro-pipeta, sobrepôs-se uma lamela
e procedeu-se à observação microscópica com uma ampliação de 400x passados
30 segundos. Contaram-se, com a ajuda de um contador manual, duzentos
espermatozóides, diferenciando os corados de vermelho (sem vida) dos não corados
(com vida) (WHO, 1999).
222...222 ...777... TTTEEESSSTTTEEE DDDAAA HHHIIIPPPOOOOOOSSSMMMOOOLLLAAARRRIIIDDDAAADDDEEE
Adicionou-se 10 µl do meio onde se encontram distribuídos os
espermatozóides a 20 µl de solução hipoosmótica (a mesma utilizada para a
avaliação da hipoosmolaridade em humanos) e colocou-se numa estufa a 35ºC
durante trinta minutos. Após a incubação, observou-se ao microscópio uma gota da
referida solução. Com a ajuda de um contador manual, contaram-se, em duzentos
espermatozóides, os que apresentavam a forma da cauda alterada, categorizando-
se estes em ‘angulação atenuada’, ‘angulação acentuada’ e em ‘forma de gancho’
(Figura 2.4), correspondendo a soma das percentagens destas categorias à
Material e Métodos
47
percentagem de hipoosmolaridade. A categoria ‘lisa’ corresponde à percentagem de
espermatozóides sem qualquer alteração na cauda (sem angulação flagelar), ou
seja, com cauda não funcional. Estas categorias foram baseadas na classificação
efectuada por Yeung et al. (1999).
Figura 2.4 - Várias formas de angulação flagelar: A) sem angulação, B) angulação atenuada, C) angulação
acentuada, D) forma de gancho. A barra representa 10 µm (Yeung et al., 1999).
222...222 ...888... DDDEEETTTEEERRRMMMIIINNNAAAÇÇÇÃÃÃOOO DDDAAA CCCOOONNNCCCEEENNNTTTRRRAAAÇÇÇÃÃÃOOO DDDEEE EEESSSPPPEEERRRMMMAAATTTOOOZZZÓÓÓIIIDDDEEESSS
Para determinar a concentração de espermatozóides em 1 ml de líquido
epididimal adicionou-se uma alíquota de 10 µl de meio T6 onde se encontravam
dispersos os espermatozóides do ratinho em estudo, a 10 µl de formol (imobilizador
de espermatozóides). Posteriormente, foi colocada uma gota da solução anterior
numa câmara de Neubaeur e efectuadas duas contagens nos cinco campos da
câmara, conforme representado anteriormente na Figura 2.2. Determinou-se a
Material e Métodos
48
concentração de espermatozóides em milhões/ml (C) efectuando o seguinte cálculo
para cada amostra:
C = N/2 x D x 100 000,
onde N = média do número de espermatozóides contados nos cinco quadrados e
D = ao factor de diluição (Makler, 2003).
222...222 ...999... AAAVVVAAALLLIIIAAAÇÇÇÃÃÃOOO DDDAAA IIINNNTTTEEEGGGRRRIIIDDDAAADDDEEE AAACCCRRROOOSSSSSSÓÓÓMMMIIICCCAAA
A avaliação da integridade do acrossoma foi efectuada de acordo com Lu e
Shur (1997). Como tal, retiraram-se 200 µl de meio espermático e fixaram-se em
200 µl de solução 5% formaldeído em PBS (137 mM de NaCl, 3 mM de KCl, 2 mM
de KH2PO4, 8 mM de Na2HPO4, com pH 7,2) durante 30 minutos a uma temperatura
de 23ºC. Após a fixação, a amostra foi centrifugada a 1000 g durante 5 minutos.
Depois de desprezado o sobrenadante, ressuspendeu-se em 500 µl de acetato de
amónia (SIGMA) e realizou-se nova centrifugação a 1000 g durante 5 minutos. O
pellet formado foi ressuspendido em 100 µl de acetato de amónia. Colocou-se 20 µl
desta suspensão numa lâmina e aguardou-se a sua secagem. Posteriormente,
procedeu-se à coloração com uma solução de 0,22% de Coomassie blue G250
(SIGMA) em 50% metanol/10% ácido acético glacial durante 2 minutos. Após
lavagem em água corrente procedeu-se à sua secagem ao ar, para posterior
montagem em EUKITT (O. KINDLER GMBH & CO). A avaliação da integridade do
acrossoma foi efectuada analisando 200 espermatozóides com uma ampliação de
400x. Os espermatozóides com acrossoma íntegro apresentavam uma intensa
coloração na região anterior da cabeça.
222...222 ...111000... AAAVVVAAALLLIIIAAAÇÇÇÃÃÃOOO MMMOOORRRFFFOOOLLLÓÓÓGGGIIICCCAAA DDDOOOSSS EEESSSPPPEEERRRMMMAAATTTOOOZZZÓÓÓIIIDDDEEESSS
O procedimento adoptado para a avaliação morfológica dos espermatozóides
de ratinhos foi semelhante ao da avaliação morfológica de espermatozóide humanos.
Material e Métodos
49
Assim, o referido esfregaço, efectuado com uma alíquota de 20 µl de meio
espermático, foi submetido à coloração papanicolau descrita anteriormente.
A morfologia dos espermatozóides foi analisada microscopicamente com uma
ampliação de 1000x. Os espermatozóides foram classificados de acordo com os
critérios utilizados por Wyrobek & Bruce (1975) e Otubanjo & Mosuro (2001). Assim,
foram avaliados 400 espermatozóides, utilizando as seguintes categorias
morfológicas: normal, anomalias na cabeça, anomalias no gancho, anomalias na
peça intermédia, anomalias na cauda e anomalias múltiplas. Para cada ratinho foi
determinada a percentagem de espermatozóides normais e a percentagem de
espermatozóides com anomalias referidas.
222...333 ... AAANNNÁÁÁLLLIIISSSEEE EEESSSTTTAAATTTÍÍÍSSSTTTIIICCCAAA
A análise estatística dos resultados foi efectuada comparando a média dos
valores obtidos para os grupos controlo com a média dos valores obtidos para os
grupos teste, utilizando o teste t.
333... RRREEESSSUUULLLTTTAAADDDOOOSSS
Resultados
51
333...111 ... EEEFFFEEEIIITTTOOO DDDOOO CCCHHHUUUMMMBBBOOO NNNAAA QQQUUUAAALLLIIIDDDAAADDDEEE EEESSSPPPEEERRRMMMÁÁÁTTTIIICCCAAA HHHUUUMMMAAANNNAAA
Nesta primeira parte do trabalho foram estudados os efeitos do chumbo na
fertilidade de trabalhadores ocupacionalmente expostos a este composto. Para tal,
avaliaram-se alguns parâmetros de fertilidade estipulados pela WHO (1999)
referidos anteriormente.
MMMoootttiiillliiidddaaadddeee eee VVViiitttaaallliiidddaaadddeee
Após a análise de espermogramas de trabalhadores expostos a chumbo e de
trabalhadores não expostos (grupo controlo), foi possível verificar algumas
alterações ao nível da motilidade. A percentagem de espermatozóides com
progressão rápida diminuiu significativamente (P<0,01) no grupo de trabalhadores
expostos. Neste mesmo grupo verificou-se um aumento significativo (P<0,05) da
percentagem de espermatozóides com progressão lenta, comparativamente com o
grupo controlo (Figura 3.1).
0
10
20
30
40
50
60
Nula In situ Progressivalenta
Progressivarápida
Mo
tilid
ade
(%)
Controlo
Exposição a Pb
Figura 3.1- Efeito do chumbo na motilidade espermática humana. Os valores correspondem à média ± desvio
padrão com n = 6 para cada grupo. * Significativamente diferente do grupo controlo (P<0,05), **
Significativamente diferente do grupo controlo (P<0,01).
*
**
In situ
Resultados
52
Relativamente à vitalidade espermática do grupo exposto, apesar de se ter
observado uma ligeira diminuição comparada com o grupo controlo, esta não foi
estatisticamente significativa (Figura 3.2). A avaliação da vitalidade foi feita de
acordo com a coloração apresentada pelos espermatozóides, conforme descrito no
capítulo anterior e ilustrado na Figura 3.3.
0102030405060708090
100
Controlo Exposição a Pb
Vit
alid
ade
(%)
Figura 3.2– Efeito do chumbo na vitalidade espermática humana. Os valores correspondem à média ±
desvio padrão com n = 6 para cada grupo.
Figura 3.3– Vitalidade de espermatozóides humanos. (a)- espermatozóide com vida; (b)- espermatozóide sem
vida. A barra corresponde a 10 µm.
a
b
Resultados
53
HHHiiipppoooooosssmmmooo lllaaarrriiidddaaadddeee eee CCCooonnnccceeennntttrrraaaçççãããooo
A percentagem de espermatozóides com membrana celular íntegra diminuiu
ligeiramente no grupo exposto a chumbo (71,40 ± 11,79) comparativamente com o
grupo controlo (80,40 ± 5,86). No entanto, esta diferença não foi estatisticamente
significativa.
A Figura 3.4 mostra a diferença entre a concentração média de
espermatozóides de trabalhadores expostos a chumbo e a concentração média de
espermatozóides de trabalhadores não expostos. Apesar da diferença observada,
esta não é estatisticamente significativa.
0
50
100
150
200
250
300
350
Controlo Exposição a Pb
Con
cent
raçã
o (1
0 /m
l)
Figura 3.4 - Efeito do chumbo na concentração de espermatozóides. Nota: os valores correspondem à média ±
desvio padrão com n = 6 para cada grupo.
MMMooorrrfffooolllooogggiiiaaa dddooosss eeessspppeeerrrmmmaaatttooozzzóóóiiidddeeesss
Comparando a morfologia dos espermatozóides do grupo controlo com a do
grupo de trabalhadores expostos, verificou-se não haver alterações estatisticamente
significativas, que comprovem a influência do chumbo neste parâmetro (Figura 3.5).
Na Figura 3.6 podem visualizar-se imagens de anomalias morfológicas de
espermatozóides de trabalhadores expostos a chumbo, observadas com maior
frequência.
9
Resultados
54
05
101520253035404550
Controlo Exposição a Pb
Mor
folo
gia
norm
al (
%)
Figura 3.5- Efeito do chumbo na morfologia de espermatozóides. Nota: os valores correspondem à média ±
desvio padrão com n = 6 para cada grupo.
Figura 3.6 – Morfologia de espermatozóides de trabalhadores expostos a chumbo. Morfologia normal (A),
microcéfalos (B), macrocéfalo (C ), cabeça amorfa (D ), anomalia peça intermédia (E e F), sem acrossoma (G),
cauda enrolada (H ). A barra corresponde a 10 µm .
VVVooollluuummmeee eee pppHHH
Relativamente ao volume e pH do sémen dos trabalhadores expostos a
chumbo (3,78 ± 0,66 ml e 7,67 ± 0,27 respectivamente), não foram encontradas
diferenças significativas comparando com o grupo controlo (3,87 ± 2,42 ml e 7,8 ±
0,18).
A
B C
D E
F
G H
Resultados
55
333...222 ... EEEFFFEEEIIITTTOOO IIINNN VVVIIITTTRRROOO DDDOOO CCCHHHUUUMMMBBBOOO NNNAAA QQQUUUAAALLLIIIDDDAAADDDEEE EEESSSPPPEEERRRMMMÁÁÁTTTIIICCCAAA DDDEEE
RRRAAATTTIIINNNHHHOOOSSS
A fim de observar o efeito do chumbo em contacto directo com
espermatozóides, testaram-se duas doses in vitro, adicionando cloreto de chumbo
ao meio T6, para a avaliação dos seguintes parâmetros: motilidade, vitalidade e
hipoosmolaridade.
333...222 ...111... EEEXXXPPPOOOSSSIIIÇÇÇÃÃÃOOO AAA 222,,,444 mmmggg///lll EEE 444888888,,,999 mmmggg/// lll DDDEEE CCCHHHUUUMMMBBBOOO
Após a extracção do epidídimo dos ratinhos pertencentes ao grupo I, os
espermatozóides nele contidos foram expostos ao meio T6 com concentração de 2,4
mg/l de Pb2+ durante 30 minutos. Procedeu-se de forma idêntica para o grupo II,
diferindo apenas na concentração de Pb2+, que neste caso foi de 488,9 mg/l e para
os respectivos grupos controlo .
MMMoootttiiillliiidddaaadddeee
Algumas características dos espermatozóides de ratinhos ICR (CD-1)
expostos ao meio T6 com concentração de 2,4 mg/l de chumbo (Grupo I) foram
alteradas, nomeadamente a motilidade e a vitalidade. Relativamente à concentração
de 488,9 mg/l de chumbo (Grupo II) foram observadas alterações nos mesmos
parâmetros do grupo anterior com intervalos de significância superiores, denotando-
se ainda alterações significativas na hipoosmolaridade.
No grupo exposto a 2,4 mg/l de chumbo (Grupo I) a percentagem de
espermatozóides imóveis aumentou significativamente (P<0,01) comparativamente
com o controlo , no entanto , não se verificaram alterações significativas nas
restantes categorias do movimento espermático (Figura 3.7A).
Resultados
56
No grupo exposto a 488,9 mg/l de chumbo (Grupo II), tal como no Grupo I, a
percentagem de espermatozóides imóveis aumentou significativamente (P<0,001),
comparativamente com o controlo, apresentando um intervalo de significância
superior. Ao contrário do grupo exposto a 2,4 mg/l de chumbo, verificaram-se
alterações na percentagem de espermatozóides com motilidade progressiva rápida
que diminuiu significativamente (P<0,01). Relativamente às restantes categorias do
movimento espermático, também não se observaram alterações significativas
(Figura 3.7B).
0
10
20
30
40
50
60
70
Nula In situ Progressivalenta
Progressivarápida
Mot
ilida
de (%
)
Controlo
2,4 mg/l Pb
0
10
20
30
40
50
60
70
Nula In situ Progressivalenta
Progressivarápida
Mot
ilida
de (%
) Controlo
488,9 mg/l Pb
**
**
***
A
B
2+
2+
Figura 3.7 – Efeito do chumbo na motilidade espermática do Grupo I (A) e Grupo II (B). Os valores correspondem à média ± desvio padrão com n = 5 para cada grupo. ** Significativamente diferente do grupo
controlo (P<0,01), *** Significativamente diferente do grupo controlo (P<0,001).
In situ
In situ
Resultados
57
VVViiitttaaa llliiidddaaadddeee
A Figura 3.8 mostra as alterações registadas ao nível da vitalidade dos
espermatozóides expostos ao meio plumbífero de 2,4 mg/l (Grupo I) e de 488,9 mg/l
(Grupo II). Em ambos os casos se verificou uma diminuição significativa da
vitalidade dos grupos expostos, sendo a do grupo exposto a uma maior
concentração de chumbo mais significativa (P<0,01) do que a do grupo exposto a
uma menor concentração (P<0,05).
0
20
40
60
80
100
Controlo 2,4 mg/l Pb
Vita
lidad
e (%
)
0
20
40
60
80
100
Controlo 480,6 mg/l Pb
Vita
lidad
e (%
)
Figura 3.8– Efeito do chumbo na vitalidade espermática do Grupo I (A) e do Grupo II (B). Os valores
correspondem à média ± desvio padrão com n = 5 para cada grupo. * Significativamente diferente do grupo
controlo (P<0,05), ** Significativamente diferente do grupo controlo (P<0,01).
A avaliação da vitalidade dos espermatozóides de ratinhos foi feita com base
na sua coloração, conforme descrito no capítulo anterior e ilustrado na Figura 3.9.
.
*
a
b
a
b
Figura 3.9– Vitalidade de espermatozóides de
ratinho. (a)- espermatozóide com vida; (b)-
espermatozóide sem vida. A barra corresponde a
10 µm .
**
A B
2+ 2+ 488,9
Resultados
58
HHHiiipppoooooosssmmmooo lllaaarrriiidddaaadddeee
Relativamente à percentagem de espermatozóides com membrana
plasmática da cauda danificada (hipoosmolaridade lisa) verificou-se um ligeiro
aumento no grupo exposto a 2,4 mg/l chumbo, apesar da diferença verificada entre
este grupo e o grupo controlo, não ser estatisticamente significativa. No entanto,
verificou-se, uma diferença significativa (P<0,05) apenas na categoria dos
espermatozóides com angulação acentuada. Já no grupo exposto a 488,9 mg/l de
chumbo, verificou-se uma aumento significativo (P<0,05) da percentagem de
espermatozóides com membrana plasmática danificada, comparativamente com o
respectivo grupo controlo (Tabela 3.1).
Tabela 3.1 - Efeito do chumbo na hipoosmolaridade do Grupo I (2,4 mg/l de Pb2+) e II (488,9 mg/l de Pb2+).
Chumbo (mg/l)
0 2,4 0 488,9
Hipoosmolaridade (%):
Lisa 28,2 ± 3,96 33,8 ± 8,64 33 ± 8,25 46,2 ± 6,10
Angulação atenuada 17 ± 4,69 15 ± 3,39 18,2 ± 2,49 14,8 ± 8,44
Angulação acentuada 9,2 ± 2,17 5,4 ± 1,82 7,2 ± 3,56 7,2 ± 2,49
Forma de gancho 45,6 ± 6,50 45,8 ± 11,32 41,6 ± 7,06 31,8 ± 15,64
Nota: os valores correspondem à média ± desvio padrão com n = 5 para cada grupo. * Significativamente diferente do grupo controlo (P<0,05).
A Figura 3.10 ilustra a forma como foi efectuada a avaliação da
hipoosmolaridade espermática, observando-se as quatro categorias estabelecidas
para este parâmetro.
Figura 3.10– Hipoosmolaridade de espermatozóides de ratinho: sem angulação (1), angulação atenuada (2),
angulação acentuada (3), forma de gancho (4). A barra corresponde a 10 µm.
*
*
1 2
3 4
Resultados
59
333...333 ... EEEFFFEEEIIITTTOOO IIINNN VVVIIIVVVOOO DDDOOO CCCHHHUUUMMMBBBOOO NNNAAA QQQUUUAAALLLIIIDDDAAADDDEEE EEESSSPPPEEERRRMMMÁÁÁTTTIIICCCAAA DDDEEE
RRRAAATTTIIINNNHHHOOOSSS
Para testar o efeito do chumbo na qualidade espermática de ratinhos
expostos a este composto foram efectuados três ensaios experimentais, injectando
doses de 150 mg de PbCl2/kg de peso vivo (p.v.) durante períodos de tempo
diferentes (4 e 6 dias com sacrifício dos animais 24 horas após a última injecção e 4
dias com o sacrifício dos animais 35 dias após a primeira exposição).
Os parâmetros motilidade, vita lidade, hipoosmolaridade, concentração,
morfologia e integridade do acrossoma foram avaliados 30 minutos após a
exposição dos espermatozóides ao meio T6.
333...333 ...111... AAADDDMMMIIINNNIIISSSRRRAAAÇÇÇÃÃÃOOO DDDEEE 111555000 mmmggg DDDEEE PPP bbbCCClll222 ///kkkggg DDDEEE PPPEEESSSOOO VVVIIIVVVOOO DDDUUURRRAAANNNTTTEEE 444 EEE 666 DDDIIIAAASSS
No Grupo III e IV foram estudados os efeitos do chumbo em alguns
parâmetros da fertilidade masculina de ratinhos injectados subcutaneamente durante
um período de 4 e 6 dias respectivamente, com uma dose de 150 mg/kg de peso
corporal. Os respectivos grupos controlo foram injectados subcutaneamente durante
um período de 4 dias com uma solução de cloreto de sódio (0,9%). O sacrifício dos
ratinhos de ambos os grupos ocorreu 24 horas após a última injecção.
MMMoootttiiillliiidddaaadddeee eee VVViiitttaaallliiidddaaadddeee
Após a avaliação da motilidade e da vitalidade dos espermatozóides de
ratinhos injectados com cloreto de chumbo (150 mg/kg de peso vivo) durante um
período de quatro (Grupo III) e seis dias (Grupo IV), verificou-se que estes
parâmetros sofreram alterações comparativamente com o grupo controlo.
Relativamente à motilidade dos espermatozóides, foram observadas algumas
alterações nos ratinhos injectados durante um período de quatro dias (Grupo III),
uma vez que a percentagem de espermatozóides imóveis aumentou
Resultados
60
significativamente (P<0,05) comparativamente com o controlo. Nas restantes
categorias do movimento espermático não se verificaram alterações significativas
(Figura 3.11A). Já no Grupo IV (6 dias de injecção) observou-se, para além da
mesma alteração verificada no Grupo II, uma diminuição significativa (P<0,01) da
percentagem de espermatozóides com mobilidade progressiva rápida e um aumento
significativo (P<0,05) da percentagem de espermatozóide com progressão lenta
(Figura 3.11B).
0
10
20
30
40
50
60
Nula In situ Progressiva lenta Progressivarápida
Mot
ilida
de (
%)
Controlo
150 mg dePbCl /kg dep.v. - 4 dias
0
10
20
30
40
50
60
Nula In situ Progressiva lenta Progressivarápida
Mot
ilida
de (%
)
Controlo
150 mg dePbCl /kg dep.v. - 6 dias
*
*
**
Figura 3.11 - Efeito do chumbo na motilidade espermática do Grupo III (A) e Grupo IV (B) . Os valores
correspondem à média ± desvio padrão com n = 5 para o Grupo III e n = 4 para o Grupo IV. * Significativamente
diferente do grupo controlo (P<0,05), ** Significativamente diferente do grupo controlo (P<0,01).
*
B
A
2
2
In situ
In situ
Resultados
61
A Figura 3.12 mostra as alterações registadas ao nível da vitalidade dos
espermatozóides de ratinhos pertencentes aos grupos tratados durante um período
de 4 e 6 dias. Obteve-se uma diminuição da vitalidade espermática mais significativa
(P<0,01) para o grupo III comparativamente com o respectivo controlo, do que para
o Grupo IV (P<0,05).
0102030405060708090
100
4 6
Tempo de exposição (dias)
Vit
alid
ade
(%)
Controlo
150 mg de PbCl/kg de p.v.
Figura 3.12– Efeito do chumbo na vitalidade espermática do Grupo III (4 dias de exposição) e IV (6 dias de
exposição). Os valores correspondem à média ± desvio padrão com n = 5 para o Grupo III e n = 4 para o Grupo
IV. * Significativamente diferente do grupo controlo (P<0,05), ** Significativamente diferente do grupo controlo
(P<0,01).
HHHiiipppoooooosssmmmooo lllaaarrriiidddaaadddeee eee CCCooonnnccceeennntttrrraaaçççãããooo
Relativamente à integridade da membrana celular da cauda dos
espermatozóides observou-se uma ligeira diminuição da hipoosmolaridade do grupo
exposto a chumbo durante um período de 4 dias, no entanto, a diferença verificada
entre este grupo e o grupo controlo não foi estatisticamente significativa. No grupo
exposto a chumbo durante um período de 6 dias já se observou uma diminuição
significativa da hipoosmolaridade (P<0,01), verificando-se um aumento da
percentagem de espermatozóides com membrana celular danificada, ou seja,
pertencentes à categoria ‘lisa’ (Tabela 3.2).
A Figura 3.13 mostra a diferença entre a concentração média de
espermatozóides de ratinhos expostos a chumbo e a concentração média de
espermatozóides de ratinhos não expostos. Apesar da diferença observada entre os
** *
2
Resultados
62
grupos III (4 dias de exposição a chumbo) e IV (6 dias de exposição a chumbo) e os
respectivos grupos controlo, esta não foi estatisticamente significativa.
Nota: Os valores correspondem à média ± desvio padrão com n = 5 para o Grupo III e n = 4 para o Grupo IV. ** Significativamente diferente do grupo controlo (P<0,01).
0123456789
10
4 6Tempo de exposição (dias)
Con
cent
raçã
o (x
10 )
Controlo
150 mg de PbCl/kg de p.v.
Figura 3.13– Efeito do chumbo na concentração espermática do Grupo III e IV. Os valores correspondem à
média ± desvio padrão com n = 5 para o Grupo III e n = 4 para o Grupo IV.
IIInnnttteeegggrrriiidddaaadddeee dddooo aaacccrrrooossssssooommmaaa eee MMMooorrrfffooollloooggg iiiaaa dddooosss eeessspppeeerrrmmmaaatttooozzzóóóiiidddeeesss
Não se verificou ser significativa a influência do cloreto de chumbo sobre a
integridade do acrossoma, no período de exposição de 4 dias (Grupo III). No entanto,
denotou-se uma diminuição significativa da percentagem de espermatozóides com
PbCl2 (mg/kg p.v.) - 4 dias PbCl2 (mg/kg p.v.) - 6 dias
0 150 0 150
Hipoosmolaridade (%):
Lisa 28,4 ± 6,27 34,4 ± 3,58 24,25 ± 3,59 36,25 ± 4,57
Angulação atenuada 22,2 ± 3,70 18,4 ± 9,76 28,75 ± 6,13 19,25 ± 8,85
Angulação acentuada 7,6 ± 0,55 8,2 ± 2,77 3 ± 2,58 1,75 ± 1,71
Forma de gancho 41,8 ± 6,57 39 ± 15,05 44 ± 2,94 42,75 ± 13,07
9 2
Tabela 3.2 - Efeito do chumbo na hipoosmolaridade do Grupo III (4 dias de exposição) e IV (6 dias de exposição).
**
Resultados
63
acrossoma íntegro, no grupo IV (6 dias de exposição) relativamente aos respectivos
grupos controlo (Figura 3.14).
Na Figura 3.15 é possível diferenciar os espermatozóides com acrossoma
íntegro do espermatozóide desprovido de acrossoma. Assim é feita a avaliação
microscópica da integridade do acrossoma, utilizando a coloração já descrita no
capítulo anterior.
0
20
40
60
80
100
4 6
Tempo de exposição (dias)
Inte
gri
dad
e d
o a
cro
sso
ma
(%)
Controlo
150 mg de PbCl/kg de p.v.
Figura 3.15– Integridade do acrossoma de
espermatozóides de ratinho. (I)- espermatozóide
com acrossoma; (II)- espermatozóide sem acrossoma. A barra corresponde a 10 µm .
2
I
I
II
**
Figura 3.14– Efeito do chumbo na integridade do acrossoma de espermatozóides de ratinhos pertencentes ao
Grupo III e IV. Os valores correspondem à média ± desvio padrão com n = 5 para o Grupo III e n = 4 para o
Grupo IV. ** Significativamente diferente do grupo controlo (P<0,01).
Resultados
64
Por último, na Tabela 3.3 são apresentados os valores percentuais da
morfologia dos espermatozóides dos grupos controlo e dos grupos tratados com
cloreto de chumbo durante 4 e 6 dias. Verificou-se que as doses testadas não
afectaram significativamente a morfologia dos espermatozóides dos ratinhos
tratados, apresentando estes uma idêntica percentagem de espermatozóides
normais relativamente aos respectivos grupos controlo.
Tabela 3.3 - Efeito do chumbo na morfologia dos espermatozóides de ratinhos pertencentes ao Grupo III e IV.
Nota: Os valores correspondem à média ± desvio padrão com n = 5 para o Grupo III e n = 4 para o Grupo IV.
Na avaliação morfológica dos espermatozóides, foi possível observar várias
anomalias ao nível da cabeça, do gancho, da peça intermédia, da cauda e em dois
segmentos simultaneamente (anomalias múltiplas). Na Figura 3.16 são
apresentadas algumas anomalias encontradas em espermatozóides quer do grupo
controlo, quer do grupo tratado.
PbCl2 (mg/kg p.v.) - 4 dias PbCl2 (mg/kg p.v.) - 6 dias
0 150 0 150
Morfologia (%):
Normal 70,41 ± 5,58 71,11 ± 8,26 75,08 ± 9,87 69,96 ± 9,30 Anomalias na Cabeça 7,16 ± 4,82 3,32 ± 1,70 2,86 ± 1,35 4,14 ± 1,77
Anomalias no Gancho 0,67 ± 0,69 0,04 ± 0,00 0,10 ± 0,21 0,31 ± 0,27
Anomalias na Peça Interm édia 0,79 ± 0,46 0,37 ± 0,37 0,05 ± 0,11 0,10 ± 0,12
Anomalias na Cauda 20,11 ± 5,61 24,95 ± 6,96 21,58 ± 10,20 24,87 ± 8,39
Anomalias Múltiplas 0,85 ± 0,46 0,21 ± 0,09 0,32 ± 0,22 0,61 ± 0,83
Resultados
65
C
K
H I
L M
J
G
C
C
D E F
A
B
Figura 3.16 – Morfologia de espermatozóides presentes no fluído epididimal de ratinhos controlo e expostos.
(A) Morfologia normal; Anomalias na cabeça: (B) amorfa, (C ) forma de banana, (F) acéfalo; Anomalias no
gancho: (D ) sem gancho, (E) gancho com ângulo errado; Anomalias na peça intermédia (G e J); Anomalias
na cauda: (H ) cauda enrolada, (K) cauda envolvendo a cabeça, (I) acaudado; Anomalias múltiplas: (L ) cauda
enrolada e cabeça amorfa, (M) cauda envolvendo a cabeça e cabeça amorfa. A barra corresponde a 10 µm .
Resultados
66
333...333 ...222... QQQUUUAAALLLIIIDDDAAADDDEEE EEESSSPPPEEERRRMMMÁÁÁTTTIIICCCAAA DDDEEE RRRAAATTTIIINNNHHHOOOSSS AAAPPPÓÓÓSSS 333555 DDDIIIAAASSS DDDAAA EEEXXXPPPOOOSSSIIIÇÇÇÃÃÃOOO AAA
PPP bbbCCC lll222 (((111555000 mmmggg///kkkggg DDDEEE PPPEEESSSOOO VVVIIIVVVOOO DDDUUURRRAAANNNTTTEEE 444 DDDIIIAAASSS)))
No presente grupo (Grupo V) foram estudados os efeitos do cloreto de
chumbo na fertilidade masculina de ratinhos passados 35 dias da primeira
administração do composto em causa. Este foi injectado subcutaneamente durante
um período de 4 dias, com uma dose de 150 mg/kg de peso corporal. O respectivo
grupo controlo foi injectado subcutaneamente durante um período de 4 dias com
uma solução de cloreto de sódio (0,9%), sendo o seu sacrifício de ambos os grupos
35 dias após a primeira injecção.
MMMoootttiiillliiidddaaadddeee eee VVViiitttaaallliiidddaaadddeee
Após a avaliação da motilidade e da vitalidade dos espermatozóides de
ratinhos pertencentes ao grupo V, verificou-se que estes parâmetros sofreram
alterações comparativamente com o grupo controlo. A percentagem de
espermatozóides imóveis aumentou significativamente (P<0,05) comparativamente
com o controlo, enquanto que a percentagem de espermatozóides com mobilidade
progressiva rápida diminuiu significativamente (P<0,01) aumentando
significativamente (P<0,01) a percentagem de espermatozóide com progressão lenta
(Figura 3.17).
0
10
20
30
40
50
60
Nula In situ Progressivalenta
Progressivarápida
Mot
ilida
de (
%) Controlo
150 mg de PbCl /kgde p.v - 4 diassacrifício ao 35º dia
Figura 3.17 - Efeito do chumbo na motilidade espermática de ratinhos pertencentes ao grupo V. Os
valores correspondem à média ± desvio padrão com n = 5 para cada grupo. * Significativamente diferente do
grupo controlo (P<0,05) ** Significativamente diferente do grupo controlo (P<0,01).
* **
** 2
In situ
Resultados
67
A figura 3.18 mostra as alterações registadas ao nível da vitalidade dos
espermatozóides dos ratinhos pertencentes grupo V, sendo estas significativas
(P<0,01).
0102030405060708090
100
Controlo 150 mg/kg PbCl2 - 4 dias
Vita
lidad
e (%
)
Figura 3.18– Efeito do chumbo na vitalidade espermática de ratinhos pertencentes ao grupo V. Os
valores correspondem à média ± desvio padrão com n = 5 para cada grupo. ** Significativamente diferente do
grupo controlo (P<0,01).
HHHiiipppoooooosssmmmooo lllaaarrriiidddaaadddeee eee CCCooonnnccceeennntttrrraaaçççãããooo
A percentagem de espermatozóides com membrana celular danificada
(hipoosmolaridade lisa) aumentou significativamente (P<0,01) no grupo exposto a
chumbo, ocorrendo também uma diminuição significativa (P<0,01) na percentagem
de espermatozóides com angulação atenuada no grupo exposto ao composto de
chumbo (Tabela 3.4).
Tabela 3.4 - Efeito do chumbo na hipoosmolaridade de espermatozóides de ratinhos pertencentes ao grupo V.
Controlo
PbCl2 (150mg/kg) - 4 dias
sacrifício ao 35º dia
Hipoosmolaridade (%): Lisa 32,60 ± 3,85 40,60 ± 3,29
Angulação atenuada 32,00 ± 4,74 16,60 ± 7,30
Angulação acentuada 5,00 ± 3,32 3,40 ± 1,82
Forma de gancho 30,40 ± 7,40 39,40 ± 7,89
Nota: os valores correspondem à média ± desvio padrão com n = 5 para cada grupo. ** Significativamente
diferente do grupo controlo (P<0,01).
**
** **
2 150 mg PbCl2/Kg p.v.
4 dias - sacrifício ao 35º dia
Resultados
68
Ao contrário do observado para os grupos de ratinhos expostos a chumbo
durante 4 e 6 dias, com sacrifício dos mesmo 24 horas após a última injecção, a
concentração média de espermatozóides do Grupo V (exposição de 4 dias com
sacrifício 35 dias após a primeira injecção) diminuiu significativamente (P<0,01)
comparado com o respectivo grupo controlo (Figura 3.19).
0
2
4
6
8
10
12
Controlo 150 mg/kg PbCl2 - 4 dias
Con
cent
raçã
o (x
10 )
Figura 3.19– Efeito do chumbo na concentração de espermatozóides de ratinhos pertencentes ao grupo V. Os
valores correspondem à média ± desvio padrão com n = 5 para cada grupo. ** Significativamente diferente do
grupo controlo (P<0,01).
IIInnnttteeegggrrriiidddaaadddeee dddooo aaacccrrrooossssssooommmaaa eee MMMooorrrfffooollloooggg iiiaaa dddooosss eeessspppeeerrrmmmaaatttooozzzóóóiiidddeeesss
Verificou-se uma diminuição significativa (P<0,05) da percentagem de
espermatozóides com acrossoma íntegro no grupo exposto ao cloreto de chumbo na
dose em causa, relativamente ao grupo controlo (Figura 3.20), contrariamente o
Grupo III e IV.
Comparando a morfologia dos espermatozóides do grupo controlo como a do
grupo tratado, verificou-se haver algumas alterações estatisticamente significativas,
que comprovam a influência do chumbo na morfologia dos espermatozóides após
decorrido um ciclo espermatogénico. Observou-se um aumento significativo (P<0,05)
das anomalias na cabeça e no gancho dos espermatozóides de ratinhos expostos a
chumbo (Tabela 3.5).
**
2 150 mg PbCl2/Kg p.v.
4 dias - sacrifício ao 35º dia
Resultados
69
01020
30405060708090
Controlo 150 mg PbCl /kg p.v. - 4 diassacrifício ao 35º dia
Inte
grid
ade
do a
cros
som
a (%
)
Figura 3.20- Efeito do chumbo na integridade do acrossoma de ratinhos pertencentes ao grupo V. Os
valores correspondem à média ± desvio padrão com n = 5 para cada grupo. * Significativamente diferente do
grupo controlo (P<0,05).
Tabela 3.5 - Efeito do chumbo na morfologia dos espermatozóides de ratinhos pertencentes ao grupo V.
Controlo
150 mg/kg PbCl2 - 4 dias
sacrifício ao 35º dia
Morfologia:
Normal 80,23 ± 3,32 71,34 ± 8,63
Anomalias na Cabeça 2,28 ± 1,31 6,22 ± 2,59
Anomalias no Gancho 0,21 ± 0,15 1,39 ± 1,06
Anomalias na Peça Intermédia 0,13 ± 0,12 0,40 ± 0,47
Anomalias na Cauda 16,73 ± 3,80 19,23 ± 6,59
Anomalias Múltiplas 0,42 ± 0,34 1,42 ± 0,91
Nota: os valores correspondem à média ± desvio padrão com n = 5 para cada grupo. * Significativamente
diferente do grupo controlo (P<0,05).
*
* *
2
444... DDDIIISSSCCCUUUSSSSSSÃÃÃOOO
Discussão
71
444...111 ... EEEFFFEEEIIITTTOOO DDDOOO CCCHHHUUUMMMBBBOOO NNNAAA QQQUUUAAALLLIIIDDDAAADDDEEE EEESSSPPPEEERRRMMMÁÁÁTTTIIICCCAAA HHHUUUMMMAAANNNAAA
Os compostos de chumbo têm uma ampla aplicação industrial, implicando
uma exposição ocupacional ao ião Pb2+. Já em 1977, a WHO discutiu e advertiu
para os efeitos do chumbo na saúde humana e vários têm sido os estudos
efectuados nesse campo. Ao nível da saúde reprodutiva masculina, Sallmén (2001),
baseando-se em estudos efectuados, considerou o chumbo como um tóxico
reprodutivo para níveis de plumbémia = 40 µg/dl e salientou a existência de
algumas evidências da redução da fertilidade masculina para baixos níveis de
exposição. Shiau e colaboradores (2004) verificaram também que para níveis de
plumbémia menores que 40 µg/dl, a fecundidade dos trabalhadores expostos a
chumbo diminui e aumenta o tempo necessário para uma possível gravidez. No
entanto, Bonde e seus colaboradores (2002) concluíram que para níveis de
plumbémia inferiores a 45 µg/dl não se verificam alterações nem na concentração
espermática nem na estrutura da cromatina dos espermatozóides. Existem também
estudos onde não se verificou qualquer associação entre a concentração de Pb no
fluido seminal e a concentração espermática ou o volume do ejaculado em
trabalhadores de soldagem de chumbo, com níveis de plumbémia de 22,8 µg/dl
(Alexander et al., 1996) e em trabalhadores de fábricas de baterias com níveis de
plumbémia de 53 µg/dl (Robins et al., 1997). Salienta-se, assim, o facto dos
resultados descritos na literatura sobre os efeitos do chumbo no sistema reprodutivo
masculino serem muitas vezes controversos.
No presente trabalho analisou-se a influência do chumbo em parâmetros
seminais como a motilidade, vitalidade, hipoosmolaridade, concentração e
morfologia dos espermatozóides e algumas propriedades físicas do sémen
(liquefacção, volume, cor, pH, odor e viscosidade) em trabalhadores expostos a
chumbo. De todos os parâmetros analisados apenas se observou uma alteração
significativa na percentagem de espermatozóides com motilidade progressiva rápida,
sendo menor nos trabalhadores expostos. Conclui-se assim, que os níveis de
exposição ocupacional a chumbo seriam aceitáveis, uma vez que, segundo Viskum
(1999) este tipo de exposição provoca alguns efeitos adversos na qualidade
espermática, nomeadamente na motilidade.
Discussão
72
Apesar de no presente estudo não se verificarem alterações significativas ao
nível da vitalidade, concentração e morfologia, esta relação tem sido comprovada
por outros autores. Benoff e co-autores (2003) comprovaram, no seu estudo, a
correlação inversa entre o nível de chumbo no fluído seminal e a motilidade,
concentração e morfologia, para níveis médios de 395 µg/l de chumbo no fluído
seminal. Foram, também, confirmados os efeitos adversos do chumbo na motilidade,
concentração, morfologia e ainda na vitalidade espermática em humanos expostos
ambientalmente a chumbo, por Ochoa e colaboradores (2005). Estes autores
concluíram que o nível de chumbo nos espermatozóides está negativamente
associado com os parâmetros anteriormente referidos, para níveis médios de 0,047
ng/106 células. Outros autores (Lerda et al., 1992) reportaram um decréscimo da
concentração, motilidade e vitalidade espermática, bem como um aumento da
percentagem de espermatozóides com morfologia anormal, num grupo de 30
trabalhadores de fábricas de baterias com plumbémia média de 48,6 µg/dl
comparados com 30 trabalhadores controlo.
Apesar de no presente estudo não se ter verificado uma relação entre a
exposição ao chumbo e a integridade da membrana celular (teste da
hipoosmolaridade), Naha & Chowdhury (2006) concluíram, num estudo efectuado
com trabalhadores de fábricas de baterias e pintura, que o chumbo para além de
afectar a concentração e motilidade espermática, danifica a própria estrutura do
espermatozóide e a integridade da membrana celular para níveis de plumbémia
superiores a 48,29 ± 4,91 µg/dl. A ausência desta relação neste estudo poderá ter a
ver com os possíveis baixos níveis de exposição a chumbo dos trabalhadores
estudados.
Relativamente às propriedades físicas do sémen, apesar de também não se
terem observado alterações significativas neste estudo, Naha (2005) verificou efeitos
nefastos do metal em causa sobre o volume, viscosidade e tempo de liquefacção do
sémen, indicando uma alteração na actividade secretora da vesícula seminal e da
próstata.
O chumbo foi também considerado, por Benoff e colaboradores (2000), como
responsável pela reacção acrossómica prematura. Estes investigadores explicaram
ainda que a entrada de Pb2+ nos espermatozóides maduros se efectua através dos
canais iónicos K+, por estes serem susceptíveis ao Pb2+.
Discussão
73
Conclui-se com este estudo, que a exposição ocupacional a chumbo acarreta
consequências negativas a nível da saúde reprodutiva masculina, nomeadamente a
nível da motilidade espermática. Impõe-se, por isso, necessária uma promoção da
saúde reprodutiva no local de trabalho, precavendo estes efeitos adversos e
impedindo um aumento da taxa de infertilidade que tem vindo a aumentar
significativamente a nível mundial.
444...222 ... EEEFFFEEEIIITTTOOO DDDOOO CCCHHHUUUMMMBBBOOO NNNAAA QQQUUUAAALLLIIIDDDAAADDDEEE EEESSSPPPEEERRRMMMÁÁÁTTTIIICCCAAA DDDEEE RRRAAATTTIIINNNHHHOOOSSS
444...222 ...111... EEEFFFEEEIIITTTOOO IIINNN VVVIIITTTRRROOO DDDOOO CCCHHHUUUMMMBBBOOO NNNAAA QQQUUUAAALLLIIIDDDAAADDDEEE EEESSSPPPEEERRRMMMÁÁÁTTTIIICCCAAA
No presente trabalho, efectuaram-se estudos in vitro no sentido de aprofundar
o conhecimento acerca do efeito directo do chumbo sobre os espermatozóides.
Holland e colaboradores (1980) comprovaram que a adição in vitro de iões
Pb2+ ao sémen humano pode causar redução da motilidade espermática. Também,
já foi comprovado que a fertilidade espermática de touros diminui com a adição in
vitro de acetato de chumbo (Alexaki et al.,1990). No entanto, raros são os estudos
experimentais in vitro efectuados quer em humanos quer em animais.
Nas duas doses testadas (2,4 e 488,9 mg/l) observou-se uma redução da
qualidade espermática, nomeadamente ao nível da motilidade, vitalidade e
hipoosmolaridade. As alterações registadas foram mais significativas na dose mais
elevada, demonstrando o efeito gradual do chumbo na redução da qualidade dos
espermatozóides, podendo estes tornarem-se totalmente inviáveis a altas
concentrações (2,59 g/l de PbCl2, que corresponde a aproximadamente ¼ da dose
administrada diariamente no ensaio in vivo).
Na dose mais baixa (240 µg/dl de Pb2+ sob a forma de PbCl2) verificaram-se
alterações significativas ao nível da percentagem de espermatozóides imóveis e da
vitalidade. Estas alterações não serão equivalentes às observadas em indivíduos
com nível de plumbémia de 240 µg/dl, mas sim com níveis muito inferiores, pois a
Discussão
74
exposição in vitro a esta concentração ocorreu durante um curto período de tempo
(30 minutos) ao contrário do que sucede com uma concentração endógena
equivalente.
Relativamente à dose mais elevada (488,9 mg/l de Pb2+) obtiveram-se
diferenças altamente significativas (P<0,001) para a percentagem de
espermatozóides imóveis e também significativas para a vitalidade e
hipoosmolaridade. Com esta dose apenas se quis provar o real efeito citotóxico do
chumbo sobre os espermatozóides, dado que esta concentração é impensável no
sangue humano.
Destes ensaios salienta-se a capacidade que o chumbo apresenta para
penetrar no espermatozóide, particularmente ao nível da peça intermédia, uma vez
que a motilidade foi o parâmetro mais facilmente alterado em presença do chumbo,
tal como o observado na motilidade espermática humana. Este facto está de acordo
com dados obtidos por Piasecka (1993) que estudou também o modo como o
acetato de chumbo tem efeito nefasto sobre os espermatozóides de ratos. A
conclusão acerca da apetência do chumbo à peça intermédia tem como base o facto
das mitocôndrias responsáveis pelo fornecimento de energia para o movimento do
espermatozóide se localizarem nesse segmento, sendo a função destes organitos
inibida na presença de chumbo (ATSDR, 1999; Marchlewicz, 1993). Piasecka e co-
autores (1996) comprovaram, em ensaios crónicos, que a espiral mitocondrial dos
espermatozóides de ratos tratados com acetato de chumbo foi afectada.
O efeito citotóxico do chumbo sobre os espermatozóides foi também
comprovado por Gulvick (1989). Para além das conclusões já referidas há ainda a
salientar o efeito directo do chumbo sobre a qualidade espermática sem intervenção
do eixo hipotalamico-pituitário-testicular, contrariando, a conclusão de Sokol e
colaboradores (1994). Estes autores referem que o chumbo induz alterações na
qualidade espermática através da alteração do controlo hormonal e não por acção
directa sobre os espermatozóides.
Discussão
75
444...222 ...222... EEEFFFEEEIIITTTOOO IIINNN VVVIIIVVVOOO DDDOOO CCCHHHUUUMMMBBBOOO NNNAAA QQQUUUAAALLLIIIDDDAAADDDEEE EEESSSPPPEEERRRMMMÁÁÁTTTIIICCCAAA
Na terceira parte da investigação e após a análise da qualidade dos
espermatozóides do epidídimo de ratinhos injectados por via subcutânea com 150
mg de PbCl2/kg de peso corporal, durante 4 e 6 dias com sacrifício dos animais 24
horas após a última administração (Grupo III e IV respectivamente), e durante 4 dias
com sacrifício após 35 dias da primeira exposição (Grupo V), foi possível verificar
algumas alterações.
A motilidade e vitalidade espermática foram alteradas em todos os grupos
expostos, o que permite concluir que os espermatozóides quando expostos ao
chumbo facilmente alteram a sua motilidade ou rapidamente sofrem um processo de
morte celular. O efeito nefasto do chumbo na motilidade espermática foi também
confirmado para administrações de 74 mg PbCl2/kg de peso vivo durante 3 dias
(Graça et al., 2004) e 0,5% de acetato de chumbo administrados oralmente durante
6 semanas (Wadi & Ahmad, 1999).
Relativamente à hipoosmolaridade e integridade do acrossoma dos
espermatozóides apenas se verificaram diminuições significativas para os períodos
de exposição de 6 dias (Grupo IV) e de 4 dias com sacrifício dos ratinhos ao 35º dia
(Grupo V). Estes resultados sugerem que a integridade da membrana plasmática e a
integridade do acrossoma dos espermatozóides são menos susceptíveis de serem
alterados do que a motilidade e vitalidade, sendo necessária uma maior quantidade
de chumbo ou um maior tempo de actuação do tóxico antes do sacrifício dos
animais, uma vez que, segundo Ochoa e colaboradores (2006) o chumbo é
absorvido pelos espermatozóides principalmente durante a sua formação nos
testículos, embora também ocorra absorção, em menor escala, durante a sua
maturação nos epidídimos.
A integridade do acrossoma é alterada quando ocorre a reacção acrossómica.
Na fecundação, o espermatozóide une-se com os receptores da superfície da zona
pelúcida do oócito e seguidamente ocorre a reacção acrossómica (Florman & Storey,
1982). No entanto, esta reacção pode ser induzida antes do encontro entre os dois
gâmetas, como se verificou no presente estudo, onde a integridade do acrossoma
diminuiu nos grupos expostos a chumbo acima citados. O aumento da frequência da
Discussão
76
reacção acrossómica dos espermatozóides de ratinhos expostos a cloreto de
chumbo, foi também comprovada por Johansson (1989) como resultado de uma
aceleração do processo envolvido na capacitação dos espermatozóides. Este autor,
sugeriu que o chumbo pode influenciar a actividade de enzimas acrossomais
levando a uma reacção acrossómica prematura.
A morfologia dos espermatozóides não sofreu alteração significativa nos
períodos de exposição ao chumbo de 4 e 6 dias (Grupo III e IV) ao contrário do
grupo de ratinhos expostos ao chumbo durante 4 dias com sacrifício 35 dias após a
primeira exposição (Grupo V), onde se verificou um aumento da percentagem de
espermatozóides com anomalias na cabeça e no respectivo gancho. Neste último
grupo o tempo decorrido entre a primeira exposição ao chumbo e o dia do sacrifício
foi superior ao tempo necessário para um ciclo espermatogénico (superior a 34,5
dias segundo Creasy & Foster (2002)), o que permite concluir que para a alteração
da morfologia dos espermatozóides é necessária a intervenção do elemento tóxico
na espermatogénese, o que não ocorreu no Grupo III e IV cujo período de tempo
para actuação do chumbo, foi insuficiente para a ocorrência de um ciclo
espermatogénico.
A concentração de espermatozóides nos epidídimos de ratinhos expostos a
cloreto de chumbo, tal como a morfologia, apenas sofreu alterações significativas no
grupo V (exposição durante 4 dias com sacrifício após 35 dias), sendo as alterações
nos restantes grupos não significativas. A concentração é também um parâmetro
dificilmente alte rado em curtos espaços de tempo, sendo necessário um período de
tempo superior a um ciclo espermatogénico para que se verifique uma diminuição
significativa. Estes dados sugerem que o chumbo intervém no processo
espermatogénico alterando a quantidade de espermatozóides produzidos.
Wadi & Ahmad (1999) comprovaram que a concentração de espermatozóides
no epidídimo, bem como a morfologia dos mesmos sofreram alterações significativas
em ratinhos administrados oralmente com solução aquosa de 0,5% de acetato de
chumbo, durante 6 semanas, tempo superior a um ciclo espermatogénico.
Observaram, assim, uma diminuição da concentração de espermatozóides e um
aumento da percentagem de espermatozóides com morfologia anormal nos ratinhos
expostos a chumbo. Também Marchlewicz e colaboradores (1993) observaram uma
Discussão
77
diminuição da concentração de espermatozóides nos epidídimos de ratos tratados
oralmente com acetato de chumbo (1%) durante 9 meses.
As alterações obtidas, no presente estudo, para a qualidade espermática
epididimal de ratinhos expostos a chumbo, fundamentam o estudo de Marchlewicz
(1994) relativamente ao nível de exposição ao chumbo do lúmen do ducto epididimal.
Este autor concluiu que o testículo se encontra mais protegido do chumbo e outros
tóxicos do que o epidídimo, devido à existência da barreira hemato-testicular. Esta
barreira protege o epitélio seminífero da acção tóxica de muitos compostos,
incluindo os de chumbo. Por outro lado, a barreira hemato-epididimal não
desempenha tão agilmente a mesma função, encontrando-se o lúmen do ducto
epididimal menos protegido (Creasy & Foster, 2002). Assim, o facto de se terem
obtido alterações ao nível dos espermatozóides localizados na cauda do epidídimo,
comprova a desprotecção do ducto epididimal ao chumbo, encontrando-se este
composto com fácil acesso ao órgão em causa e interferindo directamente com os
espermatozóides.
555... CCCOOONNNCCCLLLUUUSSSÕÕÕEEESSS
Conclusões
79
Do presente trabalho, concluiu-se, em primeiro lugar e devido à relutância na
recolha de amostras para o estudo do efeito ocupacional do chumbo na fertilidade
masculina, a urgente necessidade da criação de legislação que salvaguarde a saúde
reprodutiva dos trabalhadores expostos a chumbo e que permita o seu estudo e
vigilância, através de análises rotineiras, como o espermograma. Elaborar
procedimentos de avaliação do risco para a toxicidade reprodutiva, a fim de
estabelecer normas e regulamentar a exposição, tal como já foi feito em muitos
países (WHO, 2001) é outra perspectiva futura. Só assim será possível aprofundar,
no nosso país os conhecimentos acerca do assunto em causa.
Feita a análise dos resultados obtidos conclui-se que o chumbo é um
elemento tóxico para a saúde reprodutiva humana e de ratinhos ICR-CD1.
Verificaram-se alterações nos parâmetros essenciais à fertilidade masculina de
ratinhos expostos in vivo, como a motilidade, a vitalidade, a hipoosmolaridade, a
concentração, a integridade acrossómica e a morfologia dos espermatozóides,
diminuindo a sua percentagem nos ratinhos expostos a determinadas doses de
cloreto de chumbo. Concluiu-se ainda que parâmetros como a hipoosmolaridade, a
concentração, a integridade acrossómica e a morfologia espermática são alteráveis
apenas para quantidades mais elevadas de chumbo, sendo a motilidade e a
vitalidade espermática facilmente alteráveis.
Seguindo a recomendação da WHO (2001) para melhorar e validar métodos
in vitro a fim de avaliar mecanismos de uma possível toxicidade reprodutiva,
comprovou-se, neste estudo, através de ensaios in vitro em ratinhos, o efeito directo
do chumbo sobre os espermatozóides, sendo este composto capaz de alterar
directamente a motilidade, vitalidade e a integridade da membrana plasmática
(hipoosmolaridade) dos espermatozóides, diminuindo a sua percentagem.
Relativamente ao estudo em humanos, apenas se pôde concluir que a motilidade, tal
como nos ratinhos é um parâmetro facilmente alterável, uma vez que este foi o único
parâmetro que sofreu uma diminuição significativa nos trabalhadores expostos a
chumbo.
Deste trabalho ressalta a necessidade de um estudo mais aprofundado do
efeito do chumbo na qualidade espermática humana, conseguindo um maior número
de empresas colaboradoras, aumentando assim o número de amostras de
Conclusões
80
trabalhadores expostos ao metal em causa e de trabalhadores não expostos. Para
tal torna-se necessária uma sensibilização das autoridades competentes.
No que respeita ao real efeito do chumbo na saúde reprodutiva humana,
existem ainda muitos campos por explorar, nomeadamente o processo
desencadeado nos espermatozóides, quando em contacto com o chumbo, que leva
à sua morte. Seria também pertinente explorar o mecanismo que leva à alteração da
morfologia dos espermatozóides quando ocorre exposição in vivo a compostos de
chumbo.
666... PPPEEERRRSSSPPPEEECCCTTTIIIVVVAAASSS FFFUUUTTTUUURRRAAASSS PPPAAARRRAAA AAA
PPPRRROOOMMMOOOÇÇÇÃÃÃOOO DDDAAA SSSAAAÚÚÚDDDEEE RRREEEPPPRRROOODDDUUUTTTIIIVVVAAA
MMMAAASSSCCCUUULLLIIINNNAAA
Perspectivas futuras para promoção da saúde reprodutiva masculina
82
Os resultados do presente trabalho alertam para o facto da utilização de
determinadas substâncias químicas nos locais de trabalho, nomeadamente
compostos de chumbo, constitu írem um risco para a saúde reprodutiva masculina,
que importa prevenir e controlar. A melhoria das condições de trabalho constitui um
problema cada vez mais premente, com fortes reflexos na saúde dos trabalhadores.
A promoção da saúde reprodutiva no local de trabalho envolve a criação de
ambientes e condições de trabalho seguros e saudáveis e o incentivo à adopção de
estilos de vida favoráveis à saúde por parte dos trabalhadores. Neste sentido, torna-
se necessário repensar as práticas de segurança, higiene e saúde no trabalho, por
forma a reorientá-las numa perspectiva de saúde reprodutiva e não apenas de
prevenção da infertilidade (adaptado de Ministério da Saúde, 1997).
Promover a saúde reprodutiva, bem como a saúde em geral, é um processo
global, continuado e de conjunto, que necessita de um conjugar de esforços entre
empregadores, que devem proporcionar condições de trabalho adequadas e
promover acções de formação e de sensibilização; trabalhadores, que devem
cumprir todas as medidas indicadas e necessárias para uma adequada higiene e
saúde reprodutiva no local de trabalho; profissionais da saúde no trabalho,
nomeadamente os da Comissão de Higiene, Segurança e Saúde no Trabalho, que
devem monitorizar, dinamizar, consciencializar e encontrar caminhos para a
resolução de problemas relacionados com a saúde reprodutiva dos trabalhadores;
sociedades científicas, que constroem novos e mais profundos conhecimentos
científicos relacionados com as consequências adversas resultantes da exposição
dos trabalhadores a agentes de risco; educadores/professores que devem contribuir
através de palestras, acções de formação, campanhas de sensibilização, ou
utilizando metodologias participativas e de animação local, para a divulgação dos
conhecimentos científicos, e para que os indivíduos aprendam a gerir melhor a sua
saúde, optando de modo informado, consciente, responsável e autónomo;
responsáveis políticos, que definindo uma política correcta nesta matéria, dêem
simultaneamente o indispensável apoio técnico (fiscalização, licenciamento, etc.),
económico (apoio ao investimento, isenção fiscal do material de protecção) e jurídico
(apoio às Comissões de Higiene, Segurança e Saúde no trabalho e criação de nova
legislação que proteja de forma mais precisa e adequada a saúde reprodutiva dos
Perspectivas futuras para promoção da saúde reprodutiva masculina
83
trabalhadores, particularmente no que respeita à exposição a metais pesados); e a
sociedade em geral.
No âmbito da promoção da saúde reprodutiva no local de trabalho existem
algumas estratégias de intervenção a ser consideradas. No que respeita à
monitorização ambiental, deverão ser efectuadas avaliações ambientais
regularmente ou sempre que se suspeite de um aumento da concentração de metais
pesados susceptíveis de influenciar a saúde reprodutiva. Quanto à monitorização
biológica, para além dos exames médicos rotineiros dos serviços de Medicina do
Trabalho, que por vezes não têm qualquer relação inteligível com os factores de
risco em presença, devem ser feitas avaliações funcionais dos órgãos-alvo (Uva e
Feia, 2000), ou seja, para o diagnóstico e prevenção de perturbações na fertilidade
masculina, os serviços de Medicina do Trabalho devem englobar nos exames
médicos análises ao sémen (volume, motilidade e morfologia dos espermatozóides),
avaliação hormonal, testes funcionais e biópsias testiculares em eventuais situações
clínicas.
O estímulo e o desenvolvimento de iniciativas de promoção da saúde
reprodutiva no local de trabalho deve, ainda, abranger aspectos como:
Sensibilização dos responsáveis e gestores de empresas para que
passem a encarar a promoção da saúde reprodutiva dos trabalhadores
como um investimento, com repercussões positivas na melhoria da
satisfação profissional;
Formação de técnicos dos SSHS específicos e de médicos do trabalho na
área da saúde reprodutiva; intervenção de andrologistas;
Formação de trabalhadores orientada para a mudança de conhecimentos,
atitudes e comportamentos com implicações na sua saúde;
Criação de incentivos e penalizações dos trabalhadores, como a redução
ou aumento da comparticipação dos prémios de seguro de saúde/doença,
para o acréscimo do cumprimento de determinadas medidas redutoras da
exposição a riscos reprodutivos;
Perspectivas futuras para promoção da saúde reprodutiva masculina
84
Inclusão de conteúdos de SHST nos currículos escolares e de formação
profissional;
Toda estas estratégias e orientações referidas têm como base o aumento da
literacia de saúde. Esta pode ocorrer através de palestras, acções de formação,
acções de sensibilização, seminários, conferências, workshops, feiras da saúde,
material audiovisual, revistas e boletins, podendo, estes eventos, serem
dinamizados por professores, com base nos conhecimentos científicos actuais.
Assim, os formadores/professores terão um maior sucesso na educação e promoção
da saúde reprodutiva.
Um outro aspecto importante da formação e educação para a saúde,
relaciona-se com a já referida inclusão de conteúdos de Segurança, Higiene e
Saúde no Trabalho, nos currículos escolares e de formação profissional. Há a
salientar a existência do protocolo de colaboração entre o Instituto de
Desenvolvimento e Inspecção das Condições de Trabalho (IDICT), o Departamento
de Educação Básica (DEB), o Departamento do Ensino Secundário (DES) e a
Direcção-Geral de Formação Vocacional (DGFV), intitulado “Promoção da cultura de
prevenção de riscos profissionais na comunidade educativa” (ANEXO VII). Este
protocolo visa o desenvolvimento de uma “cultura de prevenção na comunidade
educativa para a segurança e saúde no trabalho”. Assim, os professores de Biologia
devem incluir nos seus programas assuntos relacionados com o tema em causa.
Refira-se, também, a oportunidade dos professores de Ciências Naturais do
9º ano de escolaridade, aquando da leccionação da temática ‘Transmissão da Vida’,
bem como os professores de Biologia do 11º ano do curso Científico-Humanístico de
Ciências e Tecnologias, aquando da leccionação da unidade 6 ‘Reprodução’,
proporem a discussão de alguns efeitos do chumbo ao nível do epidídimo,
nomeadamente o seu efeito sobre a qualidade espermática, levando os alunos a
concluir sobre as possíveis situações de exposição a esse metal nos locais de
trabalho e sobre algumas medidas para a promoção da saúde nesses locais.
Na unidade 1 ‘Reprodução e manipulação da fertilidade’, mais
especificamente na sub-unidade ‘Gametogénese e fecundação’ do 12º ano de
escolaridade, do curso Científico-Humanístico de Ciências e Tecnologias, os
Perspectivas futuras para promoção da saúde reprodutiva masculina
85
professores de Biologia têm a possibilidade de aprofundar, com os alunos, um pouco
mais esta problemática, uma vez que segundo Mendes (2004), esta unidade visa
estudar a reprodução humana e compreender a lguns processos biotecnológicos que
permitem a sua manipulação, ponderando a sua importância no controlo de
natalidade das populações humanas e a resolução de problemas de infertilidade.
Assim, e a título de exemplo, propõe-se que os alunos executem, nesta unidade,
uma actividade experimental relacionada com o efeito do chumbo na qualidade
espermática, partindo de uma situação-problema relacionada com a infertilidade
masculina (ANEXO VIII). Os alunos terão assim a possibilidade de tomarem
consciência do real efeito do chumbo na saúde reprodutiva masculina, bem como a
importância da sua promoção nos locais de trabalho.
Espera-se que as medidas, orientações e recomendações enunciadas no
presente trabalho, assim como a acção conjunta de todos os intervenientes no
processo, possam contribuir para a protecção da fertilidade masculina.
777... RRREEEFFFEEERRRÊÊÊNNNCCCIIIAAASSS BBBIIIBBBLLLIIIOOOGGGRRRÁÁÁFFFIIICCCAAASSS
Referências Bibliográficas
87
Agency for Toxic Substances and Disease Registry (ATSDR), US Department of
Health and Human Services (1999). Toxicological profile for lead. Research
Triangle Institute, Atlanta.
Alberts B, Bray D., Lewis J., Raft M., Roberts K., Watson J. D. (1994). Germ cells
and fertilization, In: Molecular biology of the cell, Chap. 20, 3th edition, Garland
Publishing, New York, pp. 1026-1031.
Alexaki E., Samara C., Alexopoulos C., Tsafaris F., Smokovitis A. (1990). Detection
of lead in blood, seminal plasma and spermatozoa of bulls. Effect in vitro of lead
acetate on sperm motility, Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology,
45: 824-828.
Alexander B. H., Checkoway H., Van Netten C., Muller C. H., Ewers T. G.,
Kaufman J. D., Mueller B. A., Vaughan T. L., Faustman E. M. (1996). Semen
quality of men employed at a lead smelter, Occupational and Environmental
Medicine, 53: 411–6.
Arilha M., Leite O., Arruda S., Cavasin S., Simonetti V. (2001). Sexualidade e
saúde reprodutiva. Projecto H, Brasil, pp. 29.
Batra N., Nehru B., Bansal M. P. (2001). Influence of lead and zinc on rat male
reproduction at 'biochemical and histopathological levels', Journal of Applied
Toxicology, 21: 507-512.
Benoff S., Jacob A., Hurley I. R. (2000). Male infertility and environmental exposure
to lead and cadmium, Human Reproduction Update, 6: 107-121.
Benoff S., Centola G. M., Millan C., Napolitano B., Marmar J. L., Hurley I. R. (2003).
Increased seminal plasma lead levels adversely affect the fertility potential of sperm
in IVF, Human Reproduction, 18: 374-383.
Referências Bibliográficas
88
Bonde J. P., Joffe M., Apostoli, Dale A., Kiss P., Spano M., Caruso F., Giwercman
A., Bisanti L., Porru S., Vanhoorne M., Comhaire F., Zschiesche W. (2002). Sperm
count and chromatin structure in men exposed to inorganic lead: lowest adverse
effect levels, Occupational and Environmental Medicine, 59: 234-242.
Cao W., Gerton‡ G. L., Moss‡§ S. B. (2006). Proteomic Profiling of Accessory
Structures from the Mouse Sperm Flagellum, Molecular & Cellular Proteomics, 5:
801–810.
Carta de Ottawa. (1986). I Conferência Internacional sobre Promoção da Saúde,
Canadá.
Carvalho G. S. (2002). Literacia para a Saúde: Um contributo para a redução das
desigualdades em saúde, In Saúde: As teias da discriminação social, Actas do
Colóquio Internacional: Saúde e Discriminação Social (Org.: Leandro M. E., Araújo
M.M.L., Costa M.S.), Braga: Universidade do Minho, pp.119-135.
Creasy D. M., Foster P. M. D. (2002). Male reproductive system, In: Handbook of
toxicologic pathology, Volume 2, 2ond edition, Academic Press, London, pp. 785-
844.
Chang L. W. (1996). Concepts on biological markers and biomonitoring for metal
toxicity, In: Toxicology of metals , Chap. 6, (Magos L., Suzuki T., eds.), Lewis
Publishers, pp. 81-105.
Corrêa S., Jannuzzi P. M., Alves J. E. D. (2003). Direitos e saúde sexual e
reprodutiva: marco teórico-conceptual e sistema de indicadores, ABEP e IBGE, Rio
de Janeiro, pp. 7 -8.
Referências Bibliográficas
89
Dacheux J. L., Castella S., Gatti J. L., Dacheux F. (2005). Epididymal cell secretory
activities and the role of proteins in boar sperm maturation, Theriogenology, 63:
319-341.
Dacheux J. L., Gatti J. L., Dacheux F. (2003). Contribuition of epididymal secretory
proteins for spermatozoa maturation, Microscopy Research and Technique, 61: 7-
17.
Dacheux J. L., Paquignon M. (1980). Relations between the fertilizing ability,
motility and metabolism of epididymal spermatozoa, Reproduction Nutrition
Development, 20: 1085-1099.
Decreto-Lei n.º 274/89 de 21 de Agosto.
Decreto-Lei n.º 441/91 de 14 de Novembro.
Decreto-Lei n.º 26/94 de 1 de Fevereiro.
Diário da República – I Série-B, N.º 104, Decreto Regulamentar n.º 6/2001 de 5 de
Maio, Ministério do Trabalho e da Solidariedade, 2613-2638.
Directiva 86/609/CEE de 24 de Novembro de 1986.
Florman H. M., Storey B. T. (1982). Mouse gamete interactions: the zona pellucida
is the site of the acrosome reaction leading to fertilization in vitro, Developmental
Biology, 91: 121.
Gorbel F., Boujelbene M., Makni-Ayadi F., Guermazi F., Croute F., Soleilhavoup J.
P., Feki A. (2002). Cytotoxic effects of lead on the endocrine and exocrine sexual
Referências Bibliográficas
90
function of pubescent male and female rats, Comptes Rendus Biologies, 325: 927-
940.
Graça A., Ramalho-Santos J., Pereira M. L. (2004). Effect of lead chloride on
spermatogenesis and sperm parameters in mice, Asian Journal of Andrology,
6: 237-241.
Grajewski B., Coble J. B., Frazier L. M., McDiarmid M. A. (2005). Occupational
Exposures and Reproductive Health: 2003 Teratology Society Meeting Symposium,
Birth Defects Research, 74:157–163.
Gulvik M. E. (1989). Spermatogenesis and maturation of spermatozoa in rats
exposed to lead, Annales Academiae Medicae Stetinensis, 35: 73-87.
Hodgson E., Smart R. C. (2001). Biochemical toxicology: definition and scope;
Reproductive and developmental toxicity, In: Introduction to biochemical toxicology,
Chap. 1 e 22, 3th edition, Wiley-Interscience, pp. 1-9, 539-546.
Holland M. K., White I. G. (1980). Heavy metals and spermatozoa. l. Inhibition of
the motility and metabolism of spermatozoa by metals- related to cooper. Fertility
and sterility, 34: 483-489.
Holstein A. F., Schulze W., Davidoff M. (2003). Understanding spermatogenesis is
a prerequisite for treatment, Reproductive Biology and Endocrinology, 1: 107.
Hsu P. C., Liu M. Y., Hsu C. C., Leon Guo Y. (1997). Lead exposure causes
generation of reactive oxygen species and functional impairment in rat sperm,
Toxicology, 122 :133-143.
Johansson L. (1989). Premature acrosome reaction in spermatozoa from lead-
exposed mice, Toxicology, 54: 151-162.
Referências Bibliográficas
91
Junqueira L.C., Carneiro J. (1999). Aparelho reprodutor masculino, In: Histologia
Básica, Cap. 21, 9ª edição, Guanabara Koogan, Rio de Janeiro, pp. 355- 362.
Klaassen C. D., Waltkins J. B. (2001). Princípios gerais de toxicologia; Disposição
de tóxicos; Toxicidade dos órgãos alvo; Agentes tóxicos, In: Toxicologia: a ciência
básica dos tóxicos, Cap. 1, 2, 4, 5, (Sancho L., ed.), 5ª edição, McGraw-Hill de
Portugal, Lisboa, pp. 29-42, 79-90, 462- 490, 578-580, 588- 599.
Kruger T. F., Menkveld R., Stander F. S. H. (1986). Sperm morphologic feature as
a prognostic factor in in vitro fertilization, Fertility and sterility, 46, 1118-1123.
Lauwerys R. R. (1994). Toxicologia industrial e intoxicaciones profesionales,
Masson S. A., Barcelona, pp. 175-179.
Lerda D. (1992). Study of sperm characteristics in persons occupationally exposed
to lead, American journal of industrial medicine, 22: 567-572.
Lu Q., Shur B. D. (1997). Sperm from 1,4 -galactotransferase-null mice are
refractory to ZP3 - induced acrossoma reactions and penetrate the zona pellucida
poorly, Development, 124 : 4121-4131
Makler A. (2003). Human seminology: semen examination and in vitro evaluation of
human seminal cells, In: Biotechnology of Human Reproduction, Chap 7, (Revelli A.,
Tur-Kaspa I., Holte J. G., Massobrio M., eds.), 1st edition, The Parthenon Publishing
Group, London, pp. 115-128.
Marchlewicz M., Protasowiki M., Rozewicka L., Piasecka M., Laszczynska M.
(1993). Effect of long-term exposure to lead on testis and epididymis in rats, Folia
Histochemica et Cytobiologica, 31: 55-62.
Referências Bibliográficas
92
Marchlewicz M. (1994). Effectiveness of blood-epididymis barriers for lead, Annales
Academiae Medicae Stetinensis, 40: 37-51.
Marieb E. N. (1998). The reproductive system, In: Human Anatomy and Physiology,
Chap. 28, (Fox D., Fogel L., Brassert C., Garl W., eds.), 4th edition,
Benjamin/Cummings Science Publishing, California, pp. 1031-1047.
Mendes A. M. P., Rebelo D. H. V., Pinheiro E. J. G. (2004). Biologia 12º - Curso
Científico-Humanístico de Ciências e Tecnologias, Ministério da Educação –
Direcção-Geral de novação e de Desenvolvimento Curricular, Lisboa, pp. 1-18.
Miguel A. S. S. R. (1991). Higiene industrial: Contaminação Química, In: Manual de
Higiene e Segurança do Trabalho, Cap. 8, Porto Editora, Porto, pp. 275-327.
Ministério da Saúde, Direcção Geral de Saúde. (1997). A saúde dos portugueses.
Lisboa, pp. 101-111.
Naha N. & Chowdhury A. R. (2005). Toxic effect of lead on human spermatozoa: a
study among pigment factory workers, Indian Journal of Occupational and
Environmental Medicine, 9: 118-123.
Naha N., Chowdhury A. R. (2006). Inorganic lead exposure in battery and paint
factory: effect on human sperm structure and functional activity, Journal of
University of Occupational and Environmental Health, 28: 157-171.
Ochoa I. H., Vargas G. V., Carrillo L. L., Andrade M. R., Martinez J. M., Cebrian M.
E., Vega B. Q. (2005). Low lead environmental exposure alters semen quality and
sperm chromatin condensation in northern Mexico, Reproductive Toxicology, 20:
221-228.
Referências Bibliográficas
93
Ochoa I. H., Gutiérrez, Heredia S., Vega B. Q. (2006). Spermatozoa nucleus takes
up lead during the epididymal maturation altering chromatin condensation,
Reproductive Toxicology, 21: 171-178.
Olsen A., Lindeman B., Wiger R., Duale N., Brunborg G. (2005). How do male germ
cells handle DNA damage?, Toxicology and Applied Pharmacology, 207 (2): 521-
531.
Otubanjo O. A., Mosuro A. A. (2001). An in vivo evaluation of induction of abnormal
sperm morphology by some anthelmintic drugs in mice, Mutation Research, 497 :
131-138.
Parada B., Requixa A., Figueiredo A., Mota A. (2004). Infertilidade Masculina e
Factores Ambientais, Acta Urológica, 21(4): 9-15.
Piasecka M. (1993). Influence of chronic use of lead ions on rat spermatozoa,
Annales Academiae Medicae Stetinensis , 39: 39-56.
Piasecka M., Wiszniewska B. B., Marchelewicz M., Rozewicka L. W. (1996).
Ultrastructure of spermatozoa from the cauda epididymis in rat chronically treated
with lead acetate Pb(II), Polish Journal of Pathology, 47: 65-71.
Prista J., Uva A. S. (2002). Penetração e absorção de tóxicos; Avaliação da
exposição aos agentes químicos, In: Aspectos gerais de toxicologia para médicos
do trabalho, Cap. 2 e 7, (Melo F. G., ed.), Escola Nacional de Saúde Pública,
Universidade Nova de Lisboa, Lisboa, pp. 45-56, 89-98.
Sallmén M. (2001). Exposure to lead and male fertility, International Journal of
Occupational Medicine and Environmental Health, 14: 219-222.
Referências Bibliográficas
94
Restrepo H. G., Sicard D., Torres M. M. (2000). DNA damage and repair in cells of
lead exposed people, American Journal of Industrial Medicine, 38: 330-334.
Robins T. G., Bornman M. S., Ehrlich R. I., Cantrell A. C., Pienaar E., Vallabh J.,
Miller S. (1997). Semen quality and fertility of men employed in a South African
lead acid battery plant, American Journal of Industrial Medicine, 32: 369–76.
Shiau C. Y., Wang J. D., Chen P. C. (2004). Decreased fecundity among male lead
workers, Occupational and Environmental Medicine, 61: 915-923.
Silva T., Almeida V., Pereira M. L. (2007). Lead Chloride in Mice Sperm Quality: In
vitro and in vivo studies, VI Simpósio de Pós-graduação do Departamento de
Biologia, Universidade de Aveiro.
Sipes I. G., McQueen C. A., Gandolfi A . J. (1997). Introduction to the principles of
toxicology, In: Comprehensive toxicology: General Principles, Chap. 1, (Bond J.,
ed.), Volume 1, Pergamon, pp. 9 -13.
Sipes I. G., McQueen C. A., Gandolfi A . J. (1997). Reproductive and
developmental toxicology studies, In: Toxicological testing and evaluation, Chap. 12,
(Williams P. D., Hottendorf G. H., eds.), Volume 2, Pergamon, pp. 146-148.
Sokol R. Z. (1990). The effect of duration of exposure on the expression of lead
toxicity on the male reproductive axis, Journal of Andrology, 11: 521-526.
Sokol R. Z., Okuda H., Nagler H. M., Berman N. (1994). Lead exposure in vivo
alters the fertility potential of sperm in vitro, Toxicology and Applied Pharmacology,
124: 310-316.
Referências Bibliográficas
95
Sullivan R., Saez F., Girouard J., Frenette G. (2005). Role of exosomes in sperm
maturation during the transit along the male reproductive tract, Blood Cells,
Molecules and Diseases, 35: 1-10.
Tayama K., Fujita H., Takahashi H., Nagasawa A., Yano N., uzawa K., Ogata A.
(2006). Measuring mouse sperm parameters using a particle counter and sperm
quality analyser: a simple and inexpensive method, Reproductive Toxicology, 22:
92-101.
Turner R. S. (2003). Tales from the tail: what do we really know about sperm
motility?, Journal of Andrology, 6: vol. 24.
Uva A. S., Faria M. (2000). Exposição profissional a substâncias químicas:
diagnóstico das situações de risco, Revista Portuguesa de Saúde Pública, 18 (1):
5-9.
Viskum S., Rabjerg L., Jorgensen P. J., Grandjean P. (1999). Improvement in
semen quality associated with decreasing occupational lead exposure, American
Journal of Industrial Medicine, 35: 257-263.
Wadi S. A., Ahmad G. (1999). Effects of lead on the male reproductive system in
mice, Journal of Toxicology and Environmental Health, 56: 513-521.
Wallach E. E., Zacur H. A. (1995). Semen evaluation, In: Reproductive: medicine
and surgery, Chap. 29, (Manning S., ed.), 1st edition, Mosby-Year-Book, Missouri,
pp. 527-535.
Wyrobek A. J., Bruce W. R. (1975). Chemical induction of sperm abnormalities in
mice, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of
America, 72: 4425-4429.
Referências Bibliográficas
96
World Health Organization (1977), Environmental Health Criteria: 3. Lead. World
Health Organization, Geneva, pp. 10, 39, 47, 55, 74, 77.
World Health Organization. (1999). Collection and examination of human semen, In:
WHO Laboratory manual for the examination of human semen and sperm-cervical
mucus interaction, Chap. 2, Cambridge University Press, Cambridge, pp. 4-30.
World Health Organization (2001), Environmental Health Criteria: 225. Principles
for evaluating health risk to reproduction associated with exposure to chemicals.
World Health Organization, Geneva, pp. 181-187.
Yeung C. H., Sonnenberg-Riethmacher E., Cooper T. G. (1999). Infertile
spermatozoa of c-ros tyrosine kinase receptor knockout mice show flagellar
angulation and maturational defects in cell volume regulatory mechanisms, Biology
of Reproduction, 61: 1062-1069.
Zhang S. X. (1999). Male reproductive system, In: An atlas of histology, Chap. 12,
Springer, New York, pp. 273-277.
888... AAANNNEEEXXXOOOSSS
Anexos
98
AAANNNEEEXXXOOO III
Decreto Regulamentar n.º 6/2001 de 5 de Maio, pp. 2613 – 2638
Legislação portuguesa relativa a doenças profissionais
(pequeno excerto)
Anexos
102
AAANNNEEEXXXOOO IIIIII
Decreto Lei n.º 274/89 de 21 de Agosto, pp. 3433 – 3439
Legislação portuguesa relativa à exposição ocupacional de chumbo
(pequeno excerto)
Anexos
105
AAANNNEEEXXXOOO IIIIIIIII
Decreto Lei n.º 441/91 de 14 de Novembro, pp. 5826 – 5833
Legislação portuguesa que define o regime de enquadramento da
Segurança e Saúde no Trabalho
(pequeno excerto)
Anexos
108
AAANNNEEEXXXOOO IIIVVV
Decreto Lei n.º n.º 26/94 de 1 de Fevereiro, pp. 480 – 486
Legislação portuguesa que prevê o regime de organização e
funcionamento das actividades dos Serviços de Segurança, Higiene e
Saúde no Trabalho (pequeno excerto)
Anexos
111
AAANNNEEEXXXOOO VVV
Valores de referência para parâmetros de um espermograma
(WHO, 1999)
VALORES DE REFERÊNCIA (WHO, 1999)
PARÂMETRO VALOR NORMAL
Volume = 2 ml Cor branco grisalho
Cheiro sui generis
Viscosidade Normal
Liquefacção Completa aos 60 minutos
pH =7,2 Concentração (nº de espermatozóides/ml) = 20 x 106
Número total de espermatozóides = 40 x 106 no ejaculado
Motilidade:
Progressão rápida
Progressão rápida + Progressão lenta
= 25%
= 50%
Morfologia normal = 15%
Vitalidade = 50%
Teste de hipoosmolaridade > 60%
Anexos
113
AAANNNEEEXXXOOO VVVIII
Questionário dirigido aos trabalhadores
TTRRAABBAALLHHAADDOORR NNºº ____
Idade: ________ Peso: ______ kg Altura: _____ m Dias de abstinência: _____
Sector da empresa onde trabalha: ________________ Nº de horas diárias de trabalho: _____
Há quanto tempo trabalha no sector da empresa onde se encontra actualmente: __________________________________________ Fumador? Sim Não
Consome álcool? Pouco Algum Muito Problemas de fertilidade? Sim Não Não sabe
Medicação: _____________________________________________________
Doenças: ______________________________________________________
Anexos
115
AAANNNEEEXXXOOO VVVIIIIII
Protocolo de colaboração entre o IDICT, o DEB, o DES e a DGFV,
intitulado “Promoção da cultura de prevenção de riscos profissionais na
comunidade educativa”
PROTOCOLO COLABORAÇÃO
IDICT - Instituto de Desenvolvimento e Inspecção das Condições de
Trabalho
*
DEB – Departamento de Educação Básica
*
DES – Departamento do Ensino Secundário
*
DGFV – Direcção-Geral de Formação Vocacional
PROMOÇÃO DA CULTURA DE PREVENÇÃO DE RISCOS PROFISSIONAIS
NA COMUNIDADE EDUCATIVA
Protocolo IDICT/DEB/DES/DGFV
2
O Instituto de Desenvolvimento e Inspecção das Condições de Trabalho - IDICT,
representado pelo Sr. Presidente da Direcção, Dr. Veiga e Moura ,
os Departamentos de Educação Básica e do Ensino Secundário representados
pelo Sr. Director dos respectivos Departamentos, Dr. Vasco Alves, e
a Direccção-Geral de Formação Vocacional representada pela Sr.a Presidente da
Comissão Instaladora, Dr.a Marina Collot, ao considerarem que:
• a abordagem de conteúdos de SHST (Segurança, Higiene e Saúde no
Trabalho) nos currículos escolares, constitui um imperativo para a melhoria
da qualidade das condições de vida e de trabalho e deve ser prosseguida
nos vários níveis de ensino, tendo em vista a adopção de uma cultura de
prevenção como preparação para a vida activa, no quadro geral do Sistema
Educativo e da Prevenção de Riscos Profissionais (Decreto-Lei n.º 441/91,
de 14/11 - Regime Jurídico de Enquadramento da SHST);
• o Governo e os Parceiros Sociais consideram prioritário desenvolver acções
que permitam uma melhoria sustentada das condições de SHST, pelo que
acordaram entre outras medidas, a inclusão progressiva de matérias de
SHST nos currículos escolares e de formação profissional (Acordo sobre
Condições de Trabalho, Higiene e Segurança no Trabalho e combate à
Sinistralidade do Conselho Económico e Social).
Neste acordo, estabelece-se um Plano Nacional de Acção para a Prevenção
(PNAP), onde se define claramente como preocupação e objectivo que:
“A influência das condições de trabalho na vida dos trabalhadores e na
capacidade competitiva das empresas foi sempre reconhecida no
quadro das sociedades modernas.
Na actualidade, considera-se que a promoção da saúde e segurança no
trabalho deve traduzir-se numa intervenção global integrada,
envolvendo os trabalhadores, todos os sectores e todas as dimensões
da empresa (...).”
Dá-se, por outro lado, como um dos objectivos prioritários, na sua alínea K,
a definição e desenvolvimento de :
Protocolo IDICT/DEB/DES/DGFV
3
“Medidas que assegurem uma efectiva integração das matérias
relacionadas com a segurança, higiene e saúde no trabalho nos
curricula escolares, incluindo a formação de professores nestes
domínios (...)”.
Considerando também:
• que a ausência de educação e formação para a prevenção de riscos
profissionais, nomeadamente ao nível do sistema educativo, constitui em
Portugal, uma das causas para a elevada sinistralidade laboral, principalmente
no que respeita à população jovem recém-chegada ao mercado de trabalho;
• que a capacidade de enfrentar os riscos profissionais depende muito da
educação recebida em matéria de prevenção a montante do processo
produtivo;
• que os percursos de educação e formação dos ensinos básico e secundário
devem contemplar a abordagem transversal integrada da SHST, no sentido da
promoção de uma verdadeira cultura de prevenção para a segurança e saúde
no trabalho na comunidade educativa, através do desenvolvimento de
competências de natureza transversal inerentes à educação para a cidadania;
• que a reforma curricular do ensino secundário, com a entrada em vigor de
novos programas escolares, constitui uma oportunidade apropriada para a
inclusão de matérias de SHST, naquela organização curricular;
e finalmente
• que a criação de uma dinâmica contínua dando visibilidade e reconhecimento
às práticas de excelência que se desenvolvem nas escolas no âmbito da SHST
podem propiciar quer ao conhecimento das realidades existentes quer ao
incentivos de novas atitudes.
Considerando ainda que o IDICT, enquanto organismo da Administração do Trabalho
para a área da prevenção, assume ser impulsionador de uma linha de acção conjunta
com a Administração da Educação e da Saúde, visando o desenvolvimento de uma
“cultura de prevenção na comunidade educativa para a segurança e saúde no
trabalho”, e que, neste contexto, tem vindo a desenvolver em parceria com as
Protocolo IDICT/DEB/DES/DGFV
4
estruturas regionais dos Ministérios da Educação e da Saúde algumas iniciativas que
visam a concretização daquela finalidade, como são o trabalho de parceria
anteriormente desenvolvido entre o IDICT/DES e os desenvolvimentos alcançados
quer com os protocolos celebrados entre o IDICT, DRE e ARSC, bem como o apoio a
projectos piloto de sensibilização e formação da comunidade educativa que têm vindo
a decorrer, desde 2000, em escolas dos Ensinos Básico e Secundário através de
parcerias com as respectivas estruturas regionais dos Ministérios da Educação e da
Saúde.
Pretende-se:
Contribuir para a prossecução dos objectivos referidos naqueles instrumentos
normativos e de política social, através da inovação e do aprofundamento daquelas
experiências no âmbito de diversos projectos, segundo os seguintes eixos
estratégicos:
- identificação dos meios e estratégias que permitam integrar em todas
as formações de nível básico e secundário abordagens de Segurança,
Higiene e Saúde no Trabalho para o desenvolvimento de competências
de natureza transversal inerentes à educação para a cidadania;
- formação em SHST de professores ou formadores que leccionam nos
vários sub-sistemas dos ensinos básicos e secundário;
- construção de módulos didácticos e sugestões metodológicas de
abordagem às questões de SHST, destinados aos vários públicos-alvo
do Sistema Educativo;
- produção de instrumentos pedagógicos para apoio à formação no
mesmo âmbito.
Nesta linha e no quadro da colaboração IDICT/DEB/DES/DGFV, visando a
implementação de diversas acções segundo os eixos estratégicos acima referidos,
estas entidades comprometem-se a fornecer os meios necessários à realização de
projectos definidos em comum, entendendo-se por meios o conjunto de apoios
financeiros, técnicos e humanos.
Protocolo IDICT/DEB/DES/DGFV
5
No âmbito deste Protocolo será criado um grupo de trabalho IDICT/DEB/DES/DGFV
que terá por missão:
- propor um Plano Anual de Actividades, no quadro da implementação do
presente Protocolo:
! levantamento dos conteúdos de SHST leccionados nos
diferentes níveis de ensino não superior;
! definição das competências transversais em SHST, por nível
de ensino não superior;
! acções de formação de professores;
! realização de instrumentos pedagógicos, e outras acções
específicas.
- assegurar o acompanhamento das actividades previstas pelo presente
Protocolo;
- promover a criação de uma rede de troca de informação e divulgação
das actividades desenvolvidas no quadro da aplicação do presente
Protocolo, nomeadamente junto dos actores do Sistema Educativo;
- elaborar em cada ano um relatório de avaliação das actividades
realizadas de modo a introduzir alterações decorrentes da experiência;
- assegurar a prossecução dos objectivos do Comité Internacional de
Educação e Formação para a Prevenção, da Associação Internacional
Segurança Social (AISS), através da:
! promoção da Educação/Formação como elemento
estratégico da acção de prevenção;
! reflexão e partilha de experiências e investigação sobre a
pedagogia dos riscos.
Neste âmbito será designado um elemento de cada entidade subscritora
do presente protocolo que funcionará como representante do organismo
de missão educativa nos trabalhos e acções a desenvolver no âmbito
da AISS para a educação e formação da prevenção, conjuntamente
com os representantes do IDICT, nomeados para o mesmo efeito.
Protocolo IDICT/DEB/DES/DGFV
6
Lisboa, 17 de Março de 2004
Anexos
122
AAANNNEEEXXXOOO VVVIIIIIIIII
Protocolo experimental: Efeito do chumbo na qualidade espermática de
ratinhos
ESCOLA _________________________________________
ANO LECTIVO 200_ / 200_
BIOLOGIA 12º ANO
PROTOCOLO EXPERIMENTAL
Nome _____________________________________ N.º: ___ Data: __/__/______
Corpo do epidídimo Ducto
eferente
Testículo
Cauda do epidídimo
Ducto deferente
Cabeça do epidídimo
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OBJECTIVO
Investigar o efeito do chumbo na motilidade e vitalidade de espermatozóides de
ratinho.
MATERIAL
Material biológico: 1 ratinho.
Soluções: Meio modificado de Tyrode (MT6); solução de cloreto de chumbo 9,0 g/l;
eosina Y 0,5%.
Outro material: 2 caixas de petri de pequeno diâmetro; placa térmica; bisturi; agulha;
micro-pipeta de 0-10 µl; lâminas; lamelas; microscópio óptico.
PROCEDIMENTO
1- Coloca as duas caixas de petri, fornecidas
pelo teu professor(a), onde se encontram
os epidídimos de ratinho, um em 2 ml de
meio T6 (caixa ‘controlo’), outro em 1,8 ml
de meio T6 com 200 µl de solução de
cloreto de chumbo (caixa ‘chumbo’), na
placa térmica regulada para os 35ºC.
2- Efectua o corte 2 representado na Figura 1,
separando a cauda dos restantes
segmentos do epidídimos (cabeça e corpo).
Figura 1
3- Corta a cauda de cada epidídimo em 2-3 peças com ajuda de uma agulha e um
bisturi, de modo a libertar os espermatozóides no meio.
4- Aguarda 30 minutos, mantendo o meio à temperatura de 35ºC, para assegurar
uma distribuição uniforme dos espermatozóides e para que o chumbo actue
sobre espermatozóides
5- Colhe da caixa de petri ‘controlo’ uma alíquota de 10 µl, coloca-a numa lâmina
com a respectiva lamela e observa ao microscópio com ampliação 400x o
movimento dos espermatozóides.
6- Procede de forma idêntica para a amostra que contem chumbo.
7- Regista as tuas observações, comparando o movimento dos espermatozóides
que estiveram em contacto com o chumbo do movimento dos espermatozóides
controlo.
8- Mistura numa lâmina uma alíquota de 10 µl da amostra ‘controlo’ a uma alíquota
de 1 µl de solução de Eosina Y. Sobrepõe-lhe uma lamela e observa ao
microscópio com ampliação 400x.
9- Procede de forma idêntica para a amostra ‘chumbo’.
10- Observa nas duas amostras a quantidade de espermatozóides corados de
vermelho (sem vida) dos não corados (com vida).
11- Regista as tuas observações.
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a. Explica porque colocaste as amostras a uma temperatura de 35ºC.
b. Explica porque razão apenas utilizaste a cauda dos epidídimos.
c. Indica o que podes concluir acerca do efeito do chumbo na motilidade e
vitalidade espermática de ratinhos.
d. Refere quais as implicações que poderão ocorrer na fertilidade de indivíduos
expostos a compostos de chumbo, quer ao nível ambiental, quer ao nível dos
locais de trabalho.