Programa de Ps-Graduao em Biologia Geral e Aplicada. Defesa de Mestrado

EFEITO GENOTXICO DA ARTEMISININA E DO ARTESUNATO EM CLULAS DE MAMFEROSMestranda: Ivani Aquino Orientador: Prof. Dr. Edson Luis Maistro

Artemisinina e Artesunato - relevncia clnica (MESHNICK et al., 1996; DHIGRA et al., 2000;OLLIARO, 2001).

A malria: 300 a 500 milhes de casos clnicos e quase trs milhes de bitos a cada ano (WHO, 2008).

Resistncia teraputica cloroquina.

Artemisia annua

Princpio ativo: Artemisinina Derivado qumico: Artesunato

Potencial genotxico em clulas tumorais e clulas de roedores, in vitro (Efferth et al., 2003;Efferth et al., 2007; Hou et al., 2008; Paul et al., 2008; Cai et al., 2010; Chen et al., 2010; Du et al., 2010).

In vivo: poucos trabalhos.

Artemisinina: no h estudo publicado sobre seu potencial genotxico/mutagnico sobre clulas HepG2.

GENTICA TOXICOLGICA pesquisa de genotoxicidade e mutagenicidade de agentes aos quais os organismos esto expostos;

uso de testes que avaliam o dano que os agentes podem causar ao DNA.(COSTA, 2006)

Ensaio Cometa avalia os danos no DNA de clulas individuais causados pela substncia testada. baseada na corrida de fragmentos de DNA em relao ao ncleo principal, sob eletroforese, produzindo aspecto semelhante a um cometa:

Etapas Ensaio Cometa

Teste de Microncleo pequena massa nuclear delimitada por membrana e separada do ncleo principal.

Fragmentos cromossmicos acntricos ou de cromossomos inteirosCLASTOGENIA

ANEUGENIA

Etapas in vivo

Anlise da Expresso Gnica Amplificao e deteco em um s passo; Baseado em deteco e quantificao de um sinal fluorescente.

Anlise da Expresso Gnica Analisa se o tratamento com as substncias teste interfere na expresso de genes de interesse; CASP3 apoptose; SOD1 neutralizao de radicais livres.

Justificativa A importncia da malria; O uso da artemisinina e do artesunato; Poucas estudos quanto toxicidade e segurana.

ObjetivosAvaliar a capacidade de diferentes concentraes da artemisinina e do artesunato de induzir danos ao material gentico, in vivo e in vitro, atravs da utilizao do Ensaio Cometa e do Teste do Microncleo; e ainda avaliar se existe alterao na expresso dos genes envolvidos com o processo de apoptose (Casp 3) e neutralizao de radicais superxidos (SOD1), in vitro.

Objetivos Especficos Avaliar a citotoxidade da artemisinina e do artesunato em diferentes concentraes, em cultura de clulas HepG2, atravs de Teste com Rezasurina. Investigar a induo de danos ao material gentico em clulas HepG2 tratadas com as duas substncias, atravs do Ensaio Cometa.

Objetivos Especficos Avaliar a expresso dos genes Casp 3 e SOD1, em clulas HepG2 tratadas com artemisinina e artesunato, atravs da PCR em tempo real.

Investigar a induo de danos ao material gentico em clulas de sangue perifrico, fgado e medula de camundongos Suos albinos, tratadas com artesunato, atravs do Ensaio Cometa e do Teste do Microncleo, in vivo.

Artigo 1 Genotoxicity assessment of the antimalaric compound artesunate in somatic cells of mice.Ivani Aquino, Fbio Ferreira Perazzo and Edson Luis Maistro

Submetido ao Journal of Applied Toxicology

Material e Mtodos Artesunato Doxorrubicina 6 grupos Ensaio Cometa Teste de Microncleo

Resultados

Tabela 1 Ensaio Cometa em clulas de sangue perifrico

Treatments

Tabela 2 Ensaio Cometa em clulas de fgado.

Treatments

Tabela 3 - Teste de Microncleo em Eritrcitos Policromticos

Treatments

Discusso Ensaio Cometa: ART em baixas doses apresentou genotoxicidade baixa, mas em alta dose e aps metabolizao no fgado, apresentou alta genotoxicidade.

Li et al. (2008), utilizando clulas CHO-9 e V79-2 verificaram atravs do Ensaio Cometa que, in vitro, o artesunato induzia danos no DNA e apoptose, sugerindo estresse oxidativo.

Discusso Quando a proliferao normal das clulas de medula afetada por um agente citotxico, a relao PCE/NCE tambm diminui (Gollapudi and McFadden, 1995). Na dose de 2000 mg/kg, a relao PCE/NCE em clulas do fgado foi de 0,67 0,04 (p95%

Anlise da Expresso Gnica 106 clulas por frasco; 24 h de estabilizao; 12 h tratamento com [5 g/mL] ATM e ART; Extrao do RNA: Trizol, de acordo com o fabricante (Invitrogen); Integridade do RNA: Gel (visualizao do padro de bandas dos RNAr 18S e 28S) e quantificao em espectrofotmetro (razo A260/A280);

Anlise da Expresso Gnica

Sntese do cDNA; Reaes de PCR tempo real; Primers: CASP3: fornecedor ( http://www.idtdna.com/Scitools/Applications/Primerquest ) 2. SOD1: Ding et al. (2004) 3. GAPDH - normalizador 1.

Resultados

Fig. 1. Resultados das mdias das duplicatas do Ensaio de Citotoxicidade com Resazurina

Tabela 1 Total e scores de danos em clulas HepG2 tratadas com Artemisinina e Artesunato

Tratamentos

Amostra

Quantificao 1375 g/mL 1687 g/mL 1610 g/mL 1612 g/mL 1413 g/mL 1399 g/mL

Razo 2.04 2.01 2.03 2.03 2.04 2.04

Integridade do RNA

C1 C2 ART 1 ART 2 ATM 1 ATM 2

Ladder

C1

ART1

ATM1

C2

ART2

ATM2

28S 18S

Fig. 2. Expresso relativa dos RNAm de CASP3 e SOD1, quantificado por PCR em tempo real na linhagem HepG2.2 1,5 1 1 0,5 R 0 CASP3 -0,5 -1 -1,156 -1,5 controle artemisinina artesunato SOD1 1,151 1,105 1 1,392

Discusso Citotoxicidade: aps 24h, [7,5], [10] e [20] foram citotxicas; ATM e ART em todas as concentraes testadas, induziram a leses no DNA (p