Deconstrução por Enzimas 2:Celulase

PROPRIEDADES DAS ENZIMAS CELULOLÍTICASPROPRIEDADES DAS ENZIMAS CELULOLÍTICAS

MECANISMO GERAL :

Hidrólise do laço b-1,4-glicosídico por um mecanismo de catálise ácido-base, com retenção ou inversão da configuração do C anomérico

Mecanismo de reaçãoReaçao de hidrólise via mecanismo ácido-base envolvendo dois resíduos, um catalisador ácido e um nucleófilo.

Asp-201 Asp-201

Glu-555 Glu-555

Catalytic mechanism of C. thermocellum endoglucanase CelD as a paradigm of -glucanase acting(Beguin and Aubert, 1992))

Resíduos de aminoácidos envolvidos na catálise de celulases e xilanases de T. reesei

• Cristalinidade da celulose• Área superficial•Tamanho das partículas •Presença de outros componentes (xilana/lignina)• Grau de polimerização• Porosidade do material• Tamanho da partícula

• Adsorção de enzimas• Inibição pelo produto• Sinergismo

O que governa a hidrólise enzimática da celulose?

Indice de Cristalinidade

Ajuda na diferenciação e classificação dos polímeros celulósicos

Como medir?

Ic = 1 – Iam

I002

1) Celulose amorfa é hidrolisada preferencialmente?

2) A hidrólise de celulose amorfa produz mais açúcares solúveis?

Fica dificil separar os efeitos (cristalinidade, DP, área superficial, tamanho de partícula)

Cristalinidade aumenta com a hidrolise enzimática

Area superficial e cristalinidade

Medida da área superficial da celulose

Simons (1950) - TAPPI

• Coloração diferencial com dois corantes (azul e laranja) para investigar a fibrilação e danos mecânicos de fibras refinadas

Direct Blue 1 (992.82 Da)

Direct Orange 15 (corante polimérico)

• O corante laranja (HMW) possui maior afinidade pela celulose que o corante azul

• 455 nm é o máximo de absorção do corante laranja, e 624 nm, máximo de absorção do corante azul

• No entanto, o corante laranja só se ligará à celulose se os poros do material forem maiores ou iguais a 5 nm

• A quantidade do corante laranja adsorvido dá informações sobre a celulose acessível

• A combinação da adsorção dos dois corantes dá informações sobre a porosidade do material

Yu et al. (1995) - TAPPI

Retenção de água e técnica de exclusão de soluto

Ponto de Saturação de Fibra e Valor de Retenção de Água como Parâmetros Indicativos da Reatividade da Celulose

•Em 1944, G. Jayme introduziu a medida do valor de retenção de água (WRV) para mensurar a hornificação de polpas celulósicas

•O cálculo do WRV utiliza os valores em massa da quantidade de água que a fibra consegue reter, sendo que a perda da capacidade de retenção de água é atribuída à ocorrência de hornificação no material.

•Em 1996, Bendzalova e colaboradores observaram que o WRV também é uma boa estimativa do ponto de saturação da fibra, ou seja, permite determinar se um determinado material apresenta ou não maior volume de poros em relação a outro.

Inace

ssib

le w

ate

r (m

L/g)

Probe size (Å)

Lignina + Hemicelulose

Celulose

agua

Sonda 4 = 5000 Da Sonda 5 = 10000 Da Sonda 6 = 20000 Da Cf(1) < Cf(2) < Cf(3) < Cf(4)

Cf(4) ≈ Cf(5) ≈ Cf(6)

1. A técnica de exclusão de solutos

Stone and Scallan (1968)

Baseada na acessibilidade de diferentes materiais a moleculas de soluto com diferentes massas molares...

2. Determinação do valor de retenção de água (WRV)

•As amostras imersas em água destilada por 24 h com cerca de 1% (m/m) de teor de sólidos, e então centrifugadas a 4500 rpm por 15 min à 25 ºC.

•secas até peso constante em estufa à 105ºC. Utilizando o valor das massas da amostra úmida e seca em estufa, o WRV foi calculado pela equação 2:

Onde, m0 é a massa de bagaço úmido, e m1 a massa de bagaço seco em estufa

Determinação do ponto de saturação da fibra (FSP)

• um corpo poroso úmido apresenta seus poros completamente cheios de água.

•quando adicionado a ele uma solução de solutos pequenos, o esperado é que boa parte destes solutos se difunda para dentro dos poros de tamanho maior ou igual ao seu, equilibrando a concentração dentro e fora dos poros e consequentemente acarretando numa redução no valor

O FSP foi determinado utilizando a equação (Ishizawa et al., 2007):

W é a massa da solução, q é a massa de água na amostra,p é massa seca da amostra, Ci e Cf são as concentrações inicial e final da solução de dextrana, respectivamente.

Pontos de saturação da fibra (FSP), valores de retenção de água (WRV) e conversões de celulose (CC) de amostras de bagaço in natura e deslignificadas por 1 e 4 horas.

AmostraFSP (mL/g) WRV (%)

CC (%)

In natura 0,91 99,10 12,5

Deslignificado 1h 1,21 140,91 52,6

Deslignificado 4h 2,09 188,84 81,7

Sinergismo

1. Endo-exo

2. Exo-exo

3. Intramolecular

Artigos:1) Effect of Cellulase Mole Fraction and Cellulose Recalcitrance on Synergism in Cellulose Hydrolysis and BindingTina Jeoh, David B. Wilson,and Larry P. WalkerBiotechnol. Prog. 2006, 22, 270-277

2) Synergism between corn stover protein and cellulaseYeJun Han, HongZhang ChenEnzyme and Microbial Technology 41 (2007) 638–645

Enzimas de Trichoderma reesei

Inibição de B-glucosidase

Modelo de LangmuirC- concentração de celulase livre (mg/ml)

T - celulase adsorvida (mg/g substrato)

Tmax - max celulase adsorvida (mg/g substrato)

K - cte Langmuir (ml/mg enzima)

T max - 54,77 mg/g substrato, K - 4,53 ml/g Kr (coef. Distribuição) = Tmax x K

Adsorção de celulase em EPMS (Biotechnol. Prog. 2007, 23, 398-406)

Efeito da lignina na dessorção de celulases

20 FPU de cellucast e 2% Avicel