débora pereira garcia
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
ESCOLA DE VETERINÁRIA
PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA ANIMAL
NEOSPOROSE BOVINA: PREVALÊNCIA, TRANSMISSÃO E DIAGNÓSTICO EM FETOS ABORTADOS, NAS MICRORREGIÕES
DE ANÁPOLIS E GOIÂNIA -GOIÁS
Débora Pereira Garcia
Orientador: Profa. Dra. Andréa Caetano da Silva
GOIÂNIA
2005
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DÉBORA PEREIRA GARCIA
NEOSPOROSE BOVINA: PREVALÊNCIA, TRANSMISSÃO E DIAGNÓSTICO EM FETOS ABORTADOS, NAS MICRORREGIÕES DE
ANÁPOLIS E GOIÂNIA -GOIÁS
Área de Concentração:
Sanidade Animal
GOIÂNIA 2005
Dissertação apresentada para obtenção
do grau de Mestre em Ciência Animal
junto à Escola de Veterinária da
Universidade Federal de Goiás
Orientador: Profa. Dra. Andréa Caetano da Silva
Comitê de Orientação: Profa. Dra. Lígia Miranda Ferreira Borges
Prof. Dr. Dirson Vieira
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A Deus, meu esposo José Nilvan e minha família
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AGRADECIMENTOS
Durante o tempo em que estive desenvolvendo essa pesquisa, foram
muitas as pessoas e instituições que estiveram envolvidas, colaborando assim para
que hoje essa dissertação pudesse ser escrita. Espero que nessas próximas linhas
eu possa transmitir meus sinceros reconhecimentos e gratidão.
Em primeiro lugar devo agradecer a Deus por me haver criado e ter todos
os meus dias já escritos. Te agradeço Senhor, pelos meus sonhos que nasceram de
Seu coração e hoje parte deles já estão realizados, outros a caminho e outros estão
nascendo. Te agradeço Senhor, pela minha família e outras pessoas tão
maravilhosas que colocastes em meu caminho. Te agradeço pela tua criação, os
animais, concordo com o que está escrito em Gn. 1:25: “E fez Deus os animais
selváticos, segundo a sua espécie, e os animais domésticos, conforme a sua
espécie, e todos os répteis da terra, conforme a sua espécie. E viu Deus que isso
era bom”. Senhor, tudo é muito bom.
Meu especial agradecimento a minha orientadora Profa. Dra. Andréa
Caetano da Silva, pela sua enorme capacidade de trabalho, pela confiança em mim
depositada desde a graduação, por sua amizade, compreensão, paciência, e ajuda.
Obrigada Andréa, por estimular meu interesse pelos parasitos, seus hospedeiros e
ciclos; por me ensinar a pesquisar, e o mais importante, saber distinguir quem são
os verdadeiros professores e pesquisadores, e você com certeza, merece e se
enquadra nos títulos que tem. Tudo que eu tente escrever não poderia transmitir
minha gratidão e reconhecimento, só posso oferecer-te minha total dedicação como
aluna.
À Suzana, Cybelly e Natali; minhas companheiras de colheitas e
processamento de amostras, agradeço a vocês pelos momentos que passamos
juntas nas estradas e no laboratório, revezando horários. Trabalhar com vocês
realmente funcionou. Vocês têm futuro.
À professora Maria Lúcia, pessoa fantástica, verdadeira professora, por
sua inteira disposição, que não mede esforços em ajudar um aluno a crescer. Te
agradeço pelo espaço cedido no departamento de reprodução, pela impressora,
internet (você é show), cafeteira e bolachas, pelos bate - papos agradáveis pelo
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corredor juntamente com o Prof. Benedito (que também não posso deixar de
mencionar), pelos momentos de descontração com o Miró, e por ser essa pessoa
maravilhosa e agradável de se conviver.
Aos produtores, veterinários, alunos e amigos de curso, que
proporcionaram colheitas de amostras e aquisição de conhecimentos. Sem vocês
dificilmente haveria essa dissertação.
Ao professor Guido e à companheira Paula, meu sincero reconhecimento
pela ajuda com PCR, e a todos da Escola de Veterinária da Universidade Federal de
Goiás que de certa forma estiveram envolvidos no desenvolvimento dessa
dissertação, digo todos porque não gostaria de deixar de citar a nenhuma das tantas
pessoas que fizeram possível a realização desse trabalho.
Ao professor Luis Miguel Ortega-Mora e aos amigos do Laboratório de
Sanidad Animal da Universidad Complutense de Madrid pela amizade e colaboração
constantes.
Ao CNPq pelo apoio financeiro tão necessário a um aluno de pós-
graduação.
A CAPES pelo auxílio financeiro no projeto de cooperação internacional
Brasil-Espanha, do qual este projeto faz parte.
E agora em um cantinho especial, separado com amor, quero agradecer
aos meus pais que desde cedo me incentivaram a estudar e não mediram esforços,
chegando a consumir sua juventude em trabalhos e preocupações para que nada
faltasse a mim e a meus irmãos, muito obrigado pai e mãe. Ao meu hoje esposo e
antes e eternamente namorado José Nilvan, que foi privado de minha companhia
enquanto eu estava em Goiânia e não se cansou de me buscar todos os finais de
semana para passarmos poucos momentos juntos, porém especiais. Te agradeço
por ser maravilhoso e encher-me de alegria a cada dia, me fazer crescer, por
compartilhar tudo, ser meu apoio e me deixar te amar e amar muito.
Meus sinceros agradecimentos...
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“Hoje o Deus compassivo em minhas mãos colocou
algo maravilhoso, e Deus seja louvado. A seu
mando, procurando seus segredos com lágrimas e
suor, encontro as ardilosas sementes da morte
genocida. Sei que esta pequena criatura milhões de
homens salvará - Ó morte, onde está teu veneno?
Ó lápide, e a tua vitória?”
Ronald Ross (20 de agosto de 1857, dia em que
descobriu o parasito da malária)
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SUMÁRIO
1.INTRODUÇÃO................................................................................................
2. REVISÃO DA LITERATURA..........................................................................
2.1.Situação taxonômica....................................................................................
2.2. Biologia do parasito....................................................................................
2.2.1 Hospedeiros..............................................................................................
2.2.2 Ciclo biológico...........................................................................................
2.3 Neosporose bovina......................................................................................
2.3.1 Prevalência de Neosporose bovina..........................................................
2.3.2 Transmissão vertical da neosporose........................................................
2.3.3 Fetos bovinos abortados...........................................................................
2.4 Diagnóstico..................................................................................................
3 OBJETIVOS....................................................................................................
3.1 Geral............................................................................................................
3.2 Específicos...................................................................................................
4 METODOLOGIA E ESTRATÉGIA DE AÇÃO.................................................
4.1 Determinação da taxa de prevalência da infecção por N. caninum em
bovinos das microrregiões de Anápolis e Goiânia, Goiás.................................
4.2 Propriedades e animais...............................................................................
4.3 Colheita de amostras...................................................................................
4.4 Detecção de anticorpos anti-Neospora caninum.........................................
4.5 Avaliação da transmissão vertical................................................................
4.6 Pesquisa de DNA de Neospora caninum em abortos bovinos ...................
4.7 Análise estatística........................................................................................
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO......................................................................
5.1 Prevalência da infecção...............................................................................
5.2 Transmissão vertical....................................................................................
5.3 Pesquisa de DNA de Neospora caninum em abortos bovinos ...................
6 CONCLUSÕES...............................................................................................
7 REFERÊNCIAS..............................................................................................
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RESUMO
A prevalência de anticorpos anti-Neospora caninum em bovinos foi determinada em 21 fazendas das microrregiões de Anápolis e Goiânia, Goiás. Destas, 11 eram rebanhos leiteiros (Holandesa e cruzados Holandês-Zebu), nove rebanhos de corte (Nelore) e um rebanho de exploração mista (Simental). Foram colhidas 930 amostras individuais, de sangue venoso, em tubos tipo Vacutainer®, o soro obtido foi separado e mantido a -20ºC. As amostras de soro foram examinadas através da reação de imunofluorescência indireta (RIFI), usando taquizoítos do isolado NC-1 de N. caninum. Uma propriedade leiteira (Holandesas), sorologicamente positiva para N. caninum, situada no município de Nerópolis, foi selecionada para se avaliar a transmissão vertical, durante um ano. Amostras de sangue foram colhidas simultaneamente de 21 vacas, logo após o parto, e de seus bezerros, antes de ingerir o colostro. Os soros foram examinados pela RIFI. Tecidos fetais de três fetos abortados provenientes de Nerópolis, Inhumas e Anápolis foram examinados para a detecção de DNA de N. caninum, através da reação em cadeia da polimerase (Nested-PCR). Anticorpos anti-N. caninum foram observados em 283 (30,43%) das 930 amostras de sangue examinadas. Todas as fazendas foram positivas, com a prevalência para N.caninum variando de 10,3% a 89,7%. A prevalência para bovinos de corte foi de 29,61% (10,3% a 89,7%), para bovinos de leite 30,41% (14,5% a 83,3%) e para o rebanho de exploração mista, a prevalência encontrada foi de 43,33%. Não foram encontradas diferenças estatisticamente significativas entre os rebanhos de carne, leite e misto. A transmissão vertical foi verificada em cinco (62,5%) bezerros, filhos de vacas positivas. Três vacas positivas tiveram bezerros negativos. Todas as amostras de tecidos fetais examinadas foram negativas para DNA de N. caninum. Os resultados confirmaram que N. caninum está presente em diferentes tipos de população bovina das microrregiões de Anápolis e Goiânia, e que a transmissão vertical ocorre no rebanho selecionado. Palavras-chave: Neospora caninum, sorologia, prevalência, bovinos, transmissão
vertical
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ABSTRACT
The prevalence of antibodies anti-Neospora caninum in bovines was determined in 21 farms from Anápolis and Goiânia regions, in Goiás, Brazil. Out of these 11 were dairy farms (Holstein and crossbred Holstein-Zebu), nine had beef cattle (Nelore) and one was for mixed exploitation (Simental). Blood were collected from 930 animals, using Vacutainer tubes, and serum obtained were separated and stored at -20°C. Serum samples were examined by the immunofluorescent antibody technique (IFAT), using tachyzoites of the NC-1 Neospora caninum strain as antigen. One dairy herd (Holstein animals), serologically positive for N. caninum, from Nerópolis in the region of Goiânia, was selected to evaluate the vertical transmission, during one year. Blood samples were simultaneously collected from 21 cows, just after parturition, and their calves, before colostrum ingestion. Sera were examined using IFAT. Fetal tissues from three aborted fetuses from Nerópolis, Inhumas and, Anápolis were examined for detection of N. caninum DNA, using the polimerase chain reaction (Nested-PCR). Antibodies anti-N. caninum were found in 283 (30.43%) of the 930 blood samples examined. All the farms were positive, with prevalence for N. caninum varying from 10.3% to 89.7% of the examined animals. The prevalence for beef herds was 29.61% (10.3% to 89.7%), for dairy herds 30.41% (14.5% to 83.3%), and for the mixed herd, the prevalence was 43.3%.No statistically significant differences were found among animals from beef, dairy or mixed herds. Vertical transmission was found to occur in five (62.5%) calves from positive cows. Three positive cows had negative calves. All three fetal tissue samples examined were negative for N. caninum DNA. Serum samples of two cows which had aborted were negative for anti-Neospora caninum antibodies and, the last one was unknown, although the fetus came from a positive herd. Results confirmed that N. caninum is widespread in different types of bovine herds in the regions of Anápolis and Goiânia, and the vertical transmission occurred in the herd selected. Key-words: Neospora caninum, serology, prevalence, bovines, vertical transmission
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1 INTRODUÇÃO
A neosporose foi diagnosticada pela primeira vez em 1984, na Noruega,
como uma encefalopatia mortal em cães, que parecia estar associada a um parasito
similar a Toxoplasma gondii (BJERKAS & PRESTHUS, 1989). Entretanto, Neospora
caninum foi descrito pela primeira vez em 1988 por DUBEY et al., como causador de
processos neurológicos no cão, nos Estados Unidos (DUBEY et al., 1988 a e b) e
em 1989, como agente produtor de abortos e mortalidade neonatal em bovinos
(THILSTED & DUBEY, 1989). No início da década de 90, ANDERSON et al. (1991) e BARR et al. (1991) reconheceram
a neosporose como a principal causa de aborto em bovinos leiteiros da Califórnia. Desde então,
vários estudos sorológicos realizados demonstraram uma elevada prevalência em rebanhos e
individual, nas principais zonas produtoras do mundo, como Austrália, Canadá, Dinamarca, Reino
Unido, Israel, Japão, México, (DUBEY & LINDSAY, 1996; DAVISON et al., 1999 a).
Em relação a prevalência encontrada no Brasil, BRAUTIGAN et al. (1996) encontraram
15% de anticorpos anti-N. caninum em bovinos de leite do estado de São Paulo e 8% em bovinos de
corte do Mato Grosso do Sul. GONDIM et al. (1999a; 1999b) descreveram o encontro de 60% de
anticorpos em uma propriedade de bovinos de leite com antecedentes de aborto em Natal e 14,0%
em bovinos de leite na Bahia. Em Minas Gerais foi encontrado 18,4% de anticorpos anti-N. caninum
em bovinos de leite (MELO et al., 2004). No Rio Grande do Sul e Paraná verificou-se a prevalência de
11,2% e 14,3% de anticorpos anti-N. caninum, respectivamente em bovinos de leite (CORBELLINI et
al., 2002; GUIMARÃES et al., 2004).
Em Goiás, onde os problemas reprodutivos são freqüentes, a presença da
Neosporose não tem sido avaliada, colocando em evidência a necessidade de
estudos regionais sobre o tema levando em consideração impacto econômico dessa
enfermidade, uma vez que qualquer causa que altere a planificação da reprodução e
os índices reprodutivos normais, deve ser detectada e corrigida, para que a sua
repercussão nos resultados econômicos seja mínima.
2 REVISÃO DA LITERATURA
2.1 Situação taxonômica
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Estudos de morfologia através da microscopia eletrônica demonstraram que N. caninum
possui estrutura celular típica de parasitos do filo Apicomplexa, classe Sporozoea, subclasse
Coccidia, ordem Eucoccidia, subordem Eimeriina e família Sarcocystidae, junto com os gêneros
Toxoplasma, Sarcocystis, Hammondia e Besnoitia (DUBEY et al., 1988a; ELLIS et al., 1994). Os
integrantes da família Sarcocystidae se caracterizam por apresentarem ciclo biológico heteroxeno e
formarem cistos no hospedeiro intermediário. Todos eles têm como hospedeiros intermediários
diferentes espécies de herbívoros ou onívoros e como hospedeiros definitivos, carnívoros. Os
hospedeiros definitivos, com exceção do Sarcocystis; eliminam através das fezes oocistos sem
esporular, os quais, depois de esporular no meio ambiente apresentam em seu interior dois
esporocistos com quatro esporozoítos cada um. Cabe destacar quatro espécies estreitamente
relacionadas: N. caninum, T. gondii, Hammondia hammondi e Hammondia heydorni, cujos oocistos
têm um tamanho similar. Entretanto, estas espécies apresentam diferenças tanto biológicas como
estruturais que justificam a existência do gênero Neospora. O emprego de provas sorológicas
específicas permitiu diferenciar N. caninum de outras espécies graças a sua diferente composição
antigênica. Além disso, o cão é o hospedeiro definitivo de N. caninum e H. heydorni, enquanto que o
gato é o hospedeiro definitivo de T. gondii e H. hammondi (DUBEY et al., 2002a, 2002b).
Também se destacam as diferenças ultra-estruturais dos cistos e taquizoítos existentes
entre estas espécies. Os cistos de N.caninum apresentam uma parede cística mais espessa que os
de T. gondii e H. heydorni (SPEER et al., 1999). Vale ressaltar que a presença, localização e o
número de determinadas organelas no citoplasma dos taquizoítos diferem nos três gêneros
mencionados. A presença de um grande vacúolo perto do conóide determina H. heydorni,
característica que é ausente em N. caninum. Além disso, N. caninum possui mais micronemas que H.
heydorni (SPEER & DUBEY 1989; DUBEY et al., 2002b).
Finalmente, estudos sobre as seqüências genéticas e as relações filogenéticas
existentes entre esses três gêneros comprovaram o fato de N. caninum, T. gondii y H. heydorni serem
espécies diferentes (ELLIS et al., 1999b, MUGRIDGE et al., 1999; MUGRIDGE et al., 2000).
2.2 Biologia do parasito
2.2.1 Hospedeiros
A infecção natural por N. caninum foi descrita, além do cão e bovinos, em caprinos,
ovinos, eqüinos e, recentemente, no búfalo e no camelo. A infecção experimental foi estabelecida em
camundongos, gerbo, gato, cão, coiote, bovinos, ovinos e caprinos, macacos, suínos e em diversas
espécies de pássaros. O papel de cada uma dessas espécies hospedeiras no ciclo biológico do
parasito e sua importância em relação com a transmissão da infecção não estão totalmente
esclarecidos (ÁLVAREZ - GARCIA, 2003).
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2.2.2 Ciclo biológico
Até o ano de 1988 não se conheciam algumas espécies hospedeiras implicadas no ciclo
biológico de N. caninum e a única via de transmissão demonstrada era a transplacentária. Os estudos
experimentais de McALLISTER et al. (1998) foram definitivos no conhecimento da biologia desse
parasito, já que demonstraram o papel do cão como hospedeiro definitivo de N. caninum, e, assim o
modo de transmissão horizontal. O ciclo biológico de N. caninum está representado na Figura 1.
Como foi mencionado anteriormente, ocorrem três estágios no ciclo biológico de N.
caninum, o taquizoíto, o cisto com bradizoítos em seu interior e o oocisto. Os taquizoítos,
responsáveis pela fase aguda da infecção, podem invadir uma grande variedade de tipos celulares no
hospedeiro parasitado, incluindo macrófagos, neutrófilos, células nervosas, hepatócitos, fibroblastos,
miócitos e células endoteliais dos vasos sanguíneos e renais. Nos cães infectados que apresentam
quadros de paresia, os taquizoítos se encontram com freqüência na musculatura esquelética,
isolando-se facilmente do músculo quadríceps (DUBEY et al., 1988b; BJERKAS & PRESTHUS, 1989;
SPEER & DUBEY, 1989).
Neospora caninum é um parasito intracelular obrigatório, logo o reconhecimento da
célula hospedeira é um requisito necessário para que consiga invadir e se multiplicar. Os taquizoítos
penetram na célula hospedeira mediante invasão ativa em menos de cinco minutos, localizando-se no
interior de um vacúolo parasitóforo no citoplasma. O fenômeno de invasão foi amplamente estudado
em cultivos celulares e consiste em prévio reconhecimento e adesão à célula hospedeira. No interior
do vacúolo parasitóforo os taquizoítos se multiplicam mediante endodiogenia, podendo uma célula
conter mais de 100 taquizoítos. Após a ruptura celular, os taquizoítos saem para o meio extracelular e
em poucas horas iniciarão os mecanismos de adesão e invasão de novas células. A destruição
celular e, em seguida, a ocorrência de manifestações clínicas depende de um equilíbrio entre a
habilidade do taquizoíto para penetrar e multiplicar-se na célula hospedeira e a habilidade do
hospedeiro para inibir a multiplicação do parasito (HEMPHILL et al., 1996).
A descoberta dos cistos teciduais com bradizoítos em seu interior, responsáveis pela
fase crônica da infecção, foi de grande importância epidemiológica para compreensão do papel do
hospedeiro intermediário. Esses são observados tanto em tecido nervoso (cérebro, medula espinhal,
nervos periféricos e retina) de diversas espécies com infecções naturais e experimentais (DUBEY et
al., 1988b; KOBAYASHI et al., 2001), como no tecido muscular esquelético do cão e de bovinos com
infecção natural (PETERS et al., 2001). Nos cistos, os bradizoítos conservam sua capacidade
infectante durante períodos de tempo prolongados (um ano no cérebro de camundongos com
infecção experimental) e são resistentes à ação do HCl e à pepsina, o que colabora com a hipótese
demonstrada de que o hospedeiro definitivo é um carnívoro (LINDSAY & DUBEY, 1990).
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FIGURA 1: Ciclo biológico de N. caninum (DUBEY 1999)
Os mecanismos implicados na conversão do taquizoíto em bradizoíto, e, portanto na
passagem de uma fase de infecção aguda a uma crônica, têm sido objeto de estudo na atualidade.
A neosporose bovina tem sido considerada como uma enfermidade parasitária de
distribuição cosmopolita e uma das causas mais freqüentes de falhas reprodutivas nos diversos
países onde se tem estudado (GONZÁLES et al., 1999; TREES et al., 1999). A manifestação clínica
mais importante da infecção é o aborto, que pode apresentar-se de forma esporádica, endêmica ou
epidêmica geralmente, entre o 3° e o 9° mês de gestação, sendo mais freqüente em torno de 5-6
meses. Os bezerros afetados que nascem vivos costumam apresentar problemas neuromusculares,
aparecendo os primeiros sinais clínicos aos 4-5 dias pós-parto. Também pode haver o nascimento de
bezerros clinicamente sadios, mas cronicamente infectados.
Em relação à transmissão da doença, estudos indicam a pequena importância pós-natal,
mas a infecção congênita é persistente durante toda a vida do animal (DAVISON et al., 1999b;
HIETALA & THURMOND, 1999). A transmissão congênita tem um papel preponderante com
percentagens que oscilam entre 50 e 95% (WOUDA et al., 1997; SCHARES et al., 1998). A via
transplacentária é o mecanismo principal de transmissão em várias espécies, como o cão, bovino
(BARR et al., 1993; PARÉ et al., 1997) e eqüinos (LINDSAY et al., 1996). Outros métodos de
transmissão vertical, como a transmissão da mãe ao bezerro pelo leite ou colostro, são possíveis
(UGGLA et al., 1998), ainda que até o momento não se tenha demonstrado em bovinos naturalmente
infectados.
Transmissão vertical
Feto infectado
Transmissão horizontal
Hospedeiros Intermediários
Ingestão pelo hospedeiro
intermediário
Oocisto esporulado
Cistos ingeridos pelo cão
Cão Hospedeiro Definitivo
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A transmissão horizontal, não demonstrada durante mais de uma década, foi confirmada
através da eliminação fecal de oocistos sem esporular em cães experimentalmente infectados com
tecidos de camundongos contendo cistos de N. caninum. McALLISTER, et al. (1998) comprovaram
que os oocistos eliminados esporulavam no meio ambiente transcorridas 48-72 horas.
2.3 Neosporose bovina
Ainda que, inicialmente, a neosporose tenha sido descrita como uma enfermidade
neuromuscular grave no cão, o descobrimento de N. caninum como agente causal de aborto em
bovinos de leite e de corte impulsionou o desenvolvimento dos primeiros estudos sobre essa doença
nessa espécie. Desde então, a importância da neosporose bovina aumentou consideravelmente,
tendo sido realizados numerosos trabalhos para conhecer a prevalência real da infecção e a
participação de N. caninum no aborto e na mortalidade neonatal. A neosporose é a principal causa de
abortamentos em bovinos em numerosos países originando perdas econômicas significativas,
incluindo custos diretos com alteração dos parâmetros reprodutivos e custos indiretos com
diagnóstico, reposição dos animais que abortam, e alteração dos parâmetros produtivos. Não
obstante, em alguns países, a informação é ainda escassa, os dados referem unicamente a
descobertas esporádicas do agente etiológico, ou das lesões que ele origina nos fetos abortados. São
necessários mais estudos epidemiológicos que permitam conhecer a prevalência, os fatores de risco
associados a importância real, tanto econômica quanto sanitária, da enfermidade (DUBEY, 1999;
JENKINS et al., 2002).
2.3.1 Prevalência de Neosporose bovina
São relativamente numerosos os estudos de prevalência da infecção por N. caninum em
bovinos adultos, nos quais se obtiveram taxas de soroprevalência muito variadas. Além das
diferenças inerentes ao tipo de técnica de diagnóstico utilizada (Reação de imunofluorescência
indireta/Ensaio imunoenzimático), em geral se observam diferenças importantes entre as taxas de
soropositividade obtidas em diversos países, em bovinos de leite e de corte e em animais com e sem
antecedentes de patologia abortiva. SAGER et al. (2003) afirma que uma prevalência baixa de
anticorpos anti-N. caninum é um indicador de aborto crescente.
Na Europa, as taxas de soroprevalência observadas através da RIFI em bovinos de leite
oscilaram entre 4,1% na Alemanha (CONRATHS et al., 1996), 12,6% na Irlanda do Norte (McNAMEE
et al., 1996), 29% na Suécia (BJÖRKMAN et al., 1996), 83,2% na Espanha (QUINTANILLA-GOZALO
et al., 1999) e 24,3% na Itália (MAGNINO et al., 2000).
Na América, também em bovinos de leite, foram mencionadas prevalências através de
ELISA de 36% nos EUA (PARÉ et al., 1996), 16,6% no Canadá (PARÉ et al., 1998) e, através da
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RIFI, em rebanhos leiteiros no Chile (PATITUCCI et al., 2000), Peru (RIVERA et al., 2000), Argentina
(MOORE et al., 2002), e Uruguai (KASHIWAZAKI et al., 2004), com resultados variando entre 22,4%,
62,1%, 43,1% e 56,7% respectivamente.
GENNARI (2004) cita que no Brasil, as primeiras descrições da presença de anticorpos
anti-N. caninum foram feitas em bovinos e descritas em resumos de congressos, com informações
reduzidas, mas que possuem um valor histórico, por demonstrarem, pela primeira vez, a existência do
agente em nosso meio. BRAUTIGAN et al. (1996), através de ELISA, encontraram 15% de anticorpos
anti-N. caninum em bovinos de leite do estado de São Paulo e 8% em bovinos de corte do Mato
Grosso do Sul. GONDIM et al. (1999a; 1999b) descreveram, através da RIFI, o encontro de 60% de
anticorpos anti-N. caninum em uma propriedade de bovinos de leite com antecedentes de aborto em
Natal e 14,0% em bovinos de leite na Bahia. Em Minas Gerais foi encontrado através de ELISA
18,4% de anticorpos anti-N. caninum em bovinos de leite (MELO et al., 2004). No Rio Grande do Sul
e Paraná soros de bovinos de leite foram submetidos a RIFI verificando-se a prevalência de 11,2% e
14,3% de anticorpos anti-N. caninum, respectivamente (CORBELLINI et al., 2002; GUIMARÃES et al.,
2004).
A presença de N. caninum em rebanhos bovinos de corte não é tão relatada quanto em
rebanhos leiteiros (WALDNER et al., 1998; McALLISTER et al., 2000; COLLANTES-FERNANDEZ,
2003). MOORE et al. (2003) encontraram uma prevalência de 20,3%, através da RIFI, em um
rebanho com antecedente de aborto na Argentina. Também foram feitos estudos de prevalência de N.
caninum em rebanhos de corte, através de RIFI, na Bélgica (14%) e Coréia (4,1%) (De
MEERSCHMAN et al., 2000; KIM et al., 2002). Outros estudos utilizando-se da técnica de ELISA
realizados na França (KLEIN et al., 1997), Canadá (WALDNER et al., 1999), Espanha
(QUINTANILLA-GOZALO et al., 1999) e EUA (SANDERSON et al., 2000) obtiveram a prevalência de
anticorpos anti-N.caninum de 4,1%, 9,0%, 17,9% e 16,0%, respectivamente.
2.3.2 Transmissão vertical da neosporose A transmissão vertical transplacentária é o principal modo de infecção no rebanho bovino
e parece ter um papel relevante na propagação e manutenção da enfermidade (BJÖRKMAN et al.,
1996; PARÉ et al., 1996; ANDERSON et al., 1997; SCHARES et al., 1998). A ausência de variações
nas taxas de prevalência entre os distintos grupos de idade em um rebanho e a detecção de
anticorpos pré-colostrais frente a N. caninum no soro de bezerros nascidos de vacas soropositivas,
indicam a presença da infecção congênita e a importância relativamente escassa da transmissão pós-
natal (DAVISON et al., 1999b; HIETALA & THURMOND, 1999). Uma vez adquirida a infecção (intra-
uterina ou pós-natal), os animais permanecem infectados provavelmente por toda vida e podem
transmitir a infecção à sua descendência em distintas gestações, consecutivas ou não, com
porcentagens que oscilam entre 50% e 95% (PARÉ et al., 1996; SCHARES et al., 1998; WOUDA et
al., 1998; DAVISON et al., 1999b; PEREIRA-BUENO et al., 2000). A transmissão vertical
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transplacentária se produz tanto em animais em que não se observa patologia abortiva, como
naqueles que abortaram (DUBEY & LINDSAY, 1996).
A transmissão do parasito da mãe ao bezerro pelo colostro ou leite pode ocorrer, ainda
que até agora só tenha sido demonstrada experimentalmente e não é considerada importante desde
o ponto de vista epidemiológico (UGGLA et al., 1998; DAVISON et al., 2001).
HIETALA & THURMOND (1999) em um estudo desenvolvido em rebanho leiteiro na
Califórnia, monitorado sorologicamente através de ELISA, descreveram que de 456 bezerros
examinados, antes de ingerir o colostro, 172 (37,7%) eram N. caninum positivos. Em estudo feito na
Califórnia (PARÉ et al., 1996) foram encontrados 30,6% e 53,5% de bezerros, infectados
congenitamente por N. caninum, em duas propriedades leiteiras. No Reino Unido, DAVISON et al.
(1999b) encontraram em rebanho leiteiro, também através de ELISA, uma percentagem de
transmissão vertical de 95,2%. SCHARES et al. (1998) encontraram uma taxa de transmissão vertical
de 93% na Alemanha, em animais pertencentes a famílias positivas.
2.3.3 Fetos bovinos abortados Neospora caninum foi identificado em fetos abortados, tanto em gado de leite quanto de
corte, em países dos cinco continentes. Além disso, a infecção foi identificada em casos de aborto
endêmico, esporádico e em surtos de abortos epidêmicos em bovinos de leite e de carne. A
neosporose é considerada como uma das causas principais de aborto e a taxa de prevalência da
infecção por N caninum observada em fetos bovinos abortados enviados para diagnóstico e/ou
utilizados em estudos epidemiológicos em distintos países é muito variável, sendo observada uma
maior prevalência em propriedades com problemas prévios de aborto (ÁLVAREZ-GARCIA, 2003).
Na Europa alguns estudos sobre a prevalência da infecção por N. caninum em fetos
bovinos abortados foram desenvolvidos. Na Bélgica (De MEERSCHMAN et al., 2002), Espanha
(PEREIRA-BUENO et al., 2003) e Suíça (SAGER et al., 2001) foram verificados, através da histologia
convencional, percentuais de prevalência de N. caninum de 7,6%, 31,3%, 19,4% de fetos abortados,
respectivamente. Ainda na Europa, foram encontradas prevalências de infecção por N. caninum,
através de PCR, de 29% na Suíça (GOTTSTEIN et al., 1998), 15,3% na Espanha (PEREIRA-BUENO
et al., 2003) e 21,1% na Coréia (KIM et al., 2002). Na América os índices da infecção por N. caninum
em fetos bovinos abortados oscilam entre 16% (IHQ) nos EUA (BARR et al., 1991), 11,4% (IHQ) no
Canadá (PARÉ et al., 1998) e 22,8% (HC) na Argentina (MOORE et al., 2002).
No Brasil, Neospora caninum foi identificado pela primeira vez em feto abortado,
proveniente de uma exploração leiteira, onde foi encontrada uma prevalência sorológica de 14,0%
(GONDIM et al., 1999a). CORBELLINI et al., (2000; 2002) verificaram através de histologia
convencional que 10% e 47,8% dos fetos bovinos abortados, enviados para exame na Faculdade de
Veterinária da UFRGS possuiam lesões características de infecção por N. caninum.
16
2.4 Diagnóstico
O isolamento e cultivo in vitro de N. caninum conduziram ao desenvolvimento da prova
de imunofluorescência indireta (RIFI) para o diagnóstico sorológico da neosporose (DUBEY et al.
1988b), e um ano mais tarde, LINDSAY & DUBEY (1989) desenvolveram a prova de
imunohistoquímica (IHQ) para a detecção do parasito em tecidos de animais infectados. O
diagnóstico da neosporose é baseado na detecção de anticorpos específicos na população adulta
(BJÖRKMAN & UGGLA, 1999) e visualização de lesões características no cérebro, coração e fígado
de fetos abortados, combinado com exames de IHQ de tecidos positivos (ANDERSON, et al., 1991;
BARR et al., 1990; GONZÁLES et al., 1999) e sorologia fetal (BARR et al., 1995; BUXTON et al.,
1998; PARÉ et al., 1995).
A RIFI é empregada no diagnóstico da infecção e em estudos epidemiológicos em um
grande número de espécies, incluindo o cão, gato, bovinos, caprinos, ovinos e diversas espécies de
roedores e primatas, tendo sido considerada como técnica de referência (“gold standard”) em
neosporose, com a qual têm sido comparadas outras técnicas sorológicas (ÁLVAREZ-GARCIA,
2003). Esta técnica detecta, fundamentalmente, anticorpos que se unem a antígenos localizados na
superfície celular de N. caninum.
Os pontos de corte empregados na RIFI podem variar entre os diferentes laboratórios.
Em relação à sorologia bovina, se empregam pontos de corte distintos em função da idade. Na
sorologia fetal, o ponto de corte varia de 1:50 até 1:80. Em bovinos adultos, já foram empregados
pontos de corte que oscilam entre 1:200 e 1:640 (SILVA, 2004). De acordo com ATKINSON et al.
(2000), o padrão da RIFI varia quando se analisam soros com títulos baixos, reduzindo-se
consideravelmente a fluorescência ou ficando esta, restrita à parte apical do taquizoíto. Esses
resultados devem ser interpretados com cautela, uma vez que a fluorescência apical também pode
aparecer como resultado de reações cruzadas com outros coccídios, como Eimeria spp e
Toxoplasma gondii, que contêm epitopos comuns a N. caninum, associados ao complexo apical.
A imunohistoquímica é uma técnica relativamente pouco sensível para detectar o
parasito em tecidos do hospedeiro devido ao baixo número de parasitos, e algumas vezes, à baixa
qualidade do tecido fetal, que pode estar autolisado, mumificado ou macerado (BASZLER et al.,
1999, DUBEY, 1999). Como alternativa a estes problemas, vários métodos baseados em Reação em
Cadeia da Polimerase (PCR) têm sido desenvolvidos nos últimos anos, visando à região ITS1 do
parasito (PAYNE & ELLIS, 1996) e a seqüência Nc-5 específica de Neospora (KAUFMANN et al.,
1996), com diferentes modificações, como nested ou semi-nested PCR, na intenção de aumentar a
sensibilidade e especificidade da técnica (BASZLER et al., 1999; ELLIS, 1998, ELLIS et al., 1999a).
As técnicas de diagnóstico baseadas em PCR têm sido muito utilizadas na detecção do parasito em
fetos bovinos abortados (GOTTSTEIN et al., 1998; BASZLER et al., 1999; ELLIS et al., 1999a;
SCHOCK et al., 2000; COLLANTES-FERNÁNDEZ et al., 2002).
17
3 OBJETIVOS 3.1 Geral
• Estudar os aspectos da epidemiologia e transmissão de N. caninum em bovinos.
3.2 Específicos
• Determinar a prevalência de infecção por N. caninum em bovinos taurinos e zebuínos,
das microrregiões de Anápolis e Goiânia, Goiás, através da técnica de
Imunofluorescência Indireta.
• Avaliar a transmissão vertical de Neospora caninum em um rebanho bovino leiteiro, de
Nerópolis, microrregião de Goiânia, Goiás.
• Verificar a presença de DNA de Neospora caninum em tecidos de fetos bovinos
abortados, em propriedades das microrregiões de Anápolis e Goiânia, Goiás.
18
4 METODOLOGIA E ESTRATÉGIA DE AÇÃO
4.1 Determinação da taxa de prevalência da infecção por N. caninum em bovinos das microrregiões de Anápolis e Goiânia, Goiás.
4.2 Propriedades e animais
Foram visitadas 21 propriedades, selecionadas ao acaso, localizadas nas microrregiões
de Anápolis e Goiânia, Goiás (Figura 2). Destas, 11 eram rebanhos leiteiros (animais da raça
Holandesa e cruzados Holandês-Zebu), nove rebanhos de corte (raça Nelore) e um rebanho de
exploração mista (raça Simental), situadas nos municípios de Anápolis (três propriedades), Inhumas
(três propriedades), Goiânia (três propriedades), Nerópolis (duas propriedades), Itaguarí (duas
propriedades), Caturaí (uma propriedade), Itaberaí (duas propriedades), Jaraguá (uma propriedade),
Terezópolis (uma propriedade), Guapó (duas propriedades) e Hidrolândia (uma propriedade).
FIGURA 2- Localização das microrregiões de Anápolis e Goiânia, Goiás (IBGE, 2003).
Um número mínimo de 289 amostras necessárias para se calcular a prevalência de N.
caninum nas microrregiões de Goiânia e Anápolis foi estabelecido, para uma população bovina de
1.528.532 animais, das microrregiões de Goiânia e Anápolis (IBGE, 2003), através do programa Win
Episcope 2.0 (BLAS et al., 2000), com margem de confiança de 95%, erro de 5%, e prevalência
esperada de 25%.
Microrregião de Anápolis Microrregião de Goiânia
19
4.3 Colheita de amostras
Foram colhidas 930 amostras individuais, de sangue venoso, por punção da veia
coccígea, em tubos tipo Vacutainer®, sem anticoagulante. Os tubos foram levados ao laboratório de
Parasitologia Veterinária, na Escola de Veterinária da Universidade Federal de Goiás, para obtenção
de soro, que foi separado por centrifugação. De cada amostra, foram feitas duas alíquotas de soro,
que foram identificadas e mantidas a –20ºC, em tubos tipo Eppendorf de 1,5 mL, até o momento do
exame.
4.4 Detecção de anticorpos anti-Neospora caninum
A detecção de anticorpos anti- N.caninum foi feita utilizando-se a reação de
imunofluorescência indireta (RIFI). Como antígenos foram empregados taquizoítos inteiros cultivados
em células Vero, do isolado NC-1 de N. caninum, cedidos pelo Dr. Luis Miguel Ortega-Mora, da
Universidad Complutense de Madrid. Os taquizoítos foram utilizados como substrato antigênico em
lâminas demarcadas, para próprias para RIFI (Cultek®). A reação foi realizada de acordo com
ÁLVAREZ-GARCIA et al. (2002).
Resumindo, sete microlitros de uma suspensão de 107 de taquizoítos fixados em
formalina 10%, foram depositados em cada área demarcada da lâmina de imunofluorescência com 18
círculos, de quatro milímetros de diâmetro cada. Posterior à secagem da lâmina ao ar, fixou-se com
acetona durante 20 minutos a -20°C.
Depois da fixação, foi acrescentado o soro a ser pesquisado, diluído em PBS (10
µl/círculo). As lâminas foram incubadas por 30 minutos a 37°C em uma câmara úmida.
Posteriormente, foram lavadas duas vezes com PBS (pH 7,2) e duas vezes com água destilada
(cinco minutos cada vez). Depois de secas, foi adicionado o conjugado antibovino (Sigma®) na
diluição de 1:150 em PBS-azul de Evans (0,2%) e as lâminas foram então incubadas em estufa, a
37°C, em câmara úmida, durante meia hora. Novamente as lâminas foram lavadas duas vezes com
PBS e água destilada, durante cinco minutos cada vez. Logo após as lâminas secarem, à
temperatura ambiente, se procedeu à montagem das mesmas, com glicerina tamponada e lamínula.
As lâminas foram examinadas em microscópio equipado com luz fluorescente, objetiva de 40x
(Olympus PX 41).
Em todas a lâminas examinadas foram adicionados controles positivos e negativos,
constituídos por soros de bovinos previamente examinados por RIFI e Western Blotting, provenientes
da Universidade Complutense de Madrid. A reação foi considerada positiva quando foi observada
fluorescência, em toda parede do taquizoíto, em uma diluição do soro ≥ 1:250.
4.5 Avaliação da transmissão vertical
20
Das propriedades avaliadas anteriormente uma, de rebanho leiteiro de
vacas holandesas, localizada no município de Nerópolis e sorologicamente positiva,
foi acompanhada por um período de um ano. Foram colhidas amostras de sangue,
para obtenção de soro, de 21 vacas no momento do parto e de suas crias, antes da
ingestão do colostro, para a verificação da ocorrência de transmissão vertical de N.
caninum.
O soro sanguíneo de cada animal foi identificado, foram feitas alíquotas e
foram mantidos à temperatura de -20º C, até o momento do exame. Os soros foram
examinados através da RIFI, conforme descrito anteriormente.
4.6 Pesquisa de DNA de Neospora caninum em abortos bovinos
Três fetos abortados, provenientes de três criatórios acompanhados
sorologicamente, situados em Nerópolis, Anápolis e Inhumas, foram trazidos para o
laboratório de Parasitologia Veterinária da Escola de Veterinária da UFG. De cada feto foi colhida uma amostra de tecido de cérebro, coração e fígado para a de
detecção de DNA de N. caninum, utilizando-se a reação em cadeia da polimerase (PCR).
Foi feita a extração de DNA genômico dos fragmentos de tecidos fetais, após tratamento
com Proteinase K, utilizando-se um kit comercial (GenomicPrepTM cells and Tissue Isolation Kit).
A técnica utilizada foi nested-PCR da região ITS1 de N. caninum, feita
com quatro diferentes oligonucleotídeos, como descrita por BUXTON et al. (1998).
O mix utilizado para a primeira reação continha 5,0µL de DNA a ser
testado, 10,375µL de água ultrapura estéril (DNase/RNase-Free Distilled Water –
Invitrogen), 2,5µL de tampão 10x (PCR buffer 10X Invitrogen), 1,0µL de Cloreto de
magnésio (MgCl2) 50 mM (Invitrogen), 0,5µL de dNTPs 10 mM (Amersham
Biosciences), 2,5µL de primers NN1 (2µM) e 2,5µL de NN2 (2µM), e 0,625µL de Taq
Polimerase (Invitrogen). A segunda reação foi realizada para um volume final de
25µl, realizado da mesma forma descrita anteriormente, com a diferença que nessa
reação foram empregados 2,5µL de NP1 (2 µM), 2,5µL NP2 (2 µM) e 2 µl do produto
da primeira reação. A seqüência dos oligonucleotídeos específicos para o gen ITS1
ribossomal está representada no Quadro 1.
21
QUADRO 1: Seqüência dos oligonucleotídeos utilizados nas reações de Nested
PCR
Primeira amplificação Segunda amplificação
Oligonucleotídeos externos 5’-3’ Oligonucleotídeos internos 5’-3’
NN1 TCA-ACC-TTT-GAA-TCC-CAA NP1 TAC-TAC-TCC-CTG-TGA-GTT-G
NN2 CGA-GCC-AAG-ACA-TCC-ATT NP2 TCT-CTT-CCC-TCA-AAC-GCT
As reações de Nested PCR foram feitas em tubos de 0,2 mL em um
termociclador (Mastercycler personal Eppendorf), segundo as condições descritas
no Quadro 2.
QUADRO 2- Condições utilizadas nas reações de PCR da região ITS1.
Primeira Reação Segunda Reação
1 ciclo 25 ciclos 1 ciclo
94ºC/5 min
94ºC/1 min 48ºC/1 min 72ºC/1 min
72ºC/5 min 4ºC/manutenção
25 ciclos
1 ciclo
94ºC/30 s48ºC/30 s72ºC/30 s
72ºC/5 min4ºC/manutenção
Em todas reações utilizou-se com controle positivo DNA obtido de
taquizoítos de N. caninum e como controle negativo água ultrapura estéril.
Os produtos obtidos pela amplificação de DNA foram submetidos à
eletroforese em gel de agarose (Agarose NA – Amersham Biosciences) a 1,5%, em
cuba de eletroforese Horizon® 11.14 (Life Technologies).
Um volume de 10 µL dos produtos de PCR foi aplicado no gel ao lado do
marcador de massa molecular de 100 pb (DNA Ladder 100 pb – Invitrogen),
previamente homogeneizados com 2,5 µL de corante de corrida (25% Ficoll 400,
0,25% azul de bromofenol, 0,25% xileno cianol em 9 partes de glicerol).
Após a eletroforese, o gel foi transferido para um recipiente contendo 200
mL de brometo de etídio em solução a 0,4 µg/mL, e depois foi transferido para água
destilada para remoção do excesso do brometo de etídio.
22
As leituras foram realizadas sob luz ultravioleta em transiluminador
(Eletronic UV. Transilluminator, LabTrade), em sala escura, esperando-se visualizar
um fragmento de 279 pb.
4.7 Análise estatística
A análise estatística dos resultados de prevalência obtidos, relacionando o
tipo de exploração e a categoria animal foi feita pelo teste do Chi-quadrado (x2),
utilizando o programa estatístico Epi Info v.3.3 (CENTERS FOR DISEASE
CONTROL AND PREVENTION, 2004).
23
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO 5.1 Prevalência da infecção
Foram encontrados anticorpos anti-N. caninum em 283 (30,43%) das 930 amostras de
soros examinados através da técnica de imunofluorescência indireta (Tabela 1). Todas as
propriedades examinadas foram positivas para N. caninum, com prevalências entre 10,3% e 89,7%. A
prevalência individual variou de 10,3% a 89,7% nas propriedades de corte, de 14,5% a 83,3% nas
propriedades de leite e foi de 43,3% na propriedade de exploração mista.
TABELA 1- Soroprevalência de anticorpos anti-N. caninum em bovinos de rebanhos de leite, corte e
misto realizada pela RIFI em 21 propriedades das microrregiões de Anápolis e Goiânia -GO, no
período de 2002-2003. (RIFI ≥ 1: 250)
APTIDÃO POSITIVOS NEGATIVOS PREVALÊNCIA (RIFI)
CORTE 135 321 29,61%
LEITE 135 309 30,41%
MISTO 13 17 43,33%
TOTAL
283
647
30,43%
RIFI: reação de imunofluorescência indireta
São escassos os estudos de prevalência de N. caninum no estado de Goiás e a
observação de 30,43% animais soropositivos para N. caninum indica que a neosporose pode ser uma
causa importante de abortamentos em bovinos das microrregiões de Goiânia e Anápolis.
Em nosso trabalho não foi encontrada diferença estisticamente significativa (p≤ 0,05)
entre vacas e novilhas. Devemos ressaltar que o número de amostras colhidas em vacas foi superior
ao número de amostras em novilhas uma vez que, dos 283 animais positivos para N. caninum, 268
(95,5%) eram vacas e 15 (4,5%) eram novilhas (Tabela 2).
Considerando a diferença de aptidão entre os rebanhos como um fator de risco potencial
associado à infecção por N.caninum, nesse experimento não foram encontradas diferenças
estatisticamente significativas (p≤0,05) em relação à percentagem de animais com sorologia positiva
entre os rebanhos de leite (30,41%) e carne (29,61%); leite (30,41%) e misto (43,30) e carne
(29,61%) e misto (43,33%); (Tabela 2).
24
Em relação à aptidão leiteira e de corte, esses resultados diferem da afirmação feita por
PARÉ et al. (1998), que a infecção por N. caninum é diagnosticada com maior freqüência nos
rebanhos de raças de aptidão leiteira, que nos de raças de aptidão de corte, apesar de não haverem
comprovado a existência de uma maior sensibilidade à infecção das raças bovinas de aptidão leiteira.
Por outro lado ÁLVAREZ-GARCIA (2003) afirma que existe uma maior freqüência de neosporose em
rebanhos de leite devido às condições mais adequadas dessas explorações para a transmissão da
infecção, uma vez que, no rebanho leiteiro, em muitos casos, a reposição se realiza com animais da
propriedade, já que a infecção se transmite, principalmente, por via transplacentária.
TABELA 2- Soroprevalência anticorpos anti-N. caninum realizada pela RIFI, em vacas e novilhas de
rebanhos bovinos de leite, corte e misto, em 21 propriedades das microrregiões de Anápolis e Goiânia
-GO, no período de 2002-2003.
VACAS NOVILHAS APTIDÃO POSITIVO (%) NEGATIVO (%) POSITIVO (%) NEGATIVO (%)
LEITE 121 (30,0%) 282 (70,0%) 14 (34,1%) 27 (65,9%)
CORTE 134 (29,5%) 321 (70,5%) 1 (100%) 0
MISTO 13 (43,3%) 17 (56,7%) 0 0
TOTAL
268 (30,2%)
620 (69,8%)
15 (35,7%)
27 (64,3%)
RIFI: imunofluorescência indireta
A ausência de diferenças estatisticamente significativas em relação ao tipo de aptidão
encontrada em nossa pesquisa também difere dos resultados encontrados por MOORE et al. (2002)
na Argentina, onde em propriedades de bovinos de corte e leite, sem antecedentes de neosporose, a
prevalência de anticorpos anti-N. caninum nos animais leiteiros (4,7%) foi inferior àquela observada
nos animais de corte (16,6%), e em propriedades com histórico de aborto, a soroprevalência para
N.caninum em propriedades leiteiras (43,1%) foi superior as propriedades de corte (18,9%).
A soroprevalência de 30,41% de anticorpos anti-N. caninum encontrada para o rebanho
leiteiro, neste estudo, foi superior a observada por CONRATHS et al., (1996) na Alemanha (4,1%),
McNAMEE et al., (1996) na Irlanda do Norte (12,6%), MAGNINO et al., (2000) na Itália (24,3%) e
inferior a encontrada por QUINTANILLA-GOZALO et al., (1999), na Espanha (83,2%). Já BJÖRKMAN
et al., (1996), encontraram uma prevalência de 29% na Suécia, aproximando-se ao observado em
nossos resultados.
Ainda em relação à prevalência de 30,41% encontrada para o rebanho de aptidão
leiteira, quando foi comparada às prevalências encontradas em outros trabalhos, realizados no Brasil,
verificamos que nossos resultados foram superiores aos encontrados por BRAUTIGAN et al. (1996) e
GONDIM et al. (1999b) que verificaram uma soroprevalência de 15% estado de São Paulo e 14,0%
na Bahia, respectivamente.
25
Em bovinos de corte, principalmente os zebuínos, a presença de N. caninum em tem
sido pouco estudada. Portanto os dados sobre a prevalência da neosporose em bovinos de corte
referem-se, na sua maioria, a animais taurinos. A prevalência em bovinos de corte encontrada em
nosso estudo (29,61%) foi superior à prevalência encontrada na Bélgica (14%) (De MEERSCHMAN
et al., 2000), Coréia (4,1%) (KIM et al., 2002) e Argentina (20.3%) (MOORE et al. 2003). Apesar de
poucos estudos, alguns autores mostram a importância de N. caninum na exploração de bovinos de
corte, incluindo o risco de perda fetal por aborto ou vacas descartadas devido à falha reprodutiva
(WALDNER et al., 1998). Além disso, em diferentes estudos foi demonstrada uma soroprevalência
alta para N. caninum em bovinos de corte (SANDERSON et al., 2000; QUINTANILLA-GOZALO et al.,
1999). Os estudos mencionados e os resultados encontrados nas microrregiões de Goiânia e
Anápolis demonstram a importância da neosporose em bovinos de corte, podendo se constituir em
um fator de perdas econômicas.
Dentre as propriedades examinadas, uma única fazenda de bovinos de corte onde o
manejo era intensivo, apenas três animais (10,34%) dentre 29 examinados, foram negativos para N.
caninum. Fato explicado por McALLISTER et al. (1996, 2000) que diz que a exposição bovina a
oocistos de N. caninum pode acontecer mais freqüentemente em bovinos de exploração de corte
intensiva.
Não podemos deixar de mencionar que, os resultados dessa pesquisa confirmam a
presença de N.caninum em rebanhos bovinos da raça Nelore, uma vez que todos os animais de corte
examinados eram dessa raça.
Em se tratando de comparações de resultados da soroprevalência de anticorpos anti-N.
caninum obtidos em nossa pesquisa, com resultados de outros estudos, podemos observar que há
diferenças entre as prevalências obtidas, e que estas ocorrem em função do país ou da região
estudada, a técnica de diagnóstico empregada, ponto de corte utilizado, tipo de exploração e
presença de antecedentes de aborto, fato também comentado por GUIMARÃES Jr. et al. (2004).
Considerando os dados soroepidemiológicos de N. caninum escassos no estado de
Goiás e que, a neosporose tenha sido relatada recentemente no Brasil, estes resultados indicam que
a infecção por N. caninum está amplamente distribuída no rebanho bovino das microrregiões de
Goiânia e Anápolis. Mais estudos são necessários para investigar a prevalência de N. caninum em
outras regiões goianas e associar a soropositividade e a ocorrência de abortos bovinos entre as
microrregiões goianas e os outros estados do país. Portanto, os resultados deste estudo contribuem
para a caracterização da importância desta enfermidade em rebanhos do estado, uma vez que Goiás
é o segundo produtor de leite e quarto de carne do país.
5.2 Transmissão vertical
26
No presente estudo foi encontrada uma taxa de transmissão vertical de N.
caninum de 62,5%, como demonstrado na Tabela 3.
TABELA 3- Ocorrência de transmissão vertical de Neospora caninum, em 21 vacas leiteiras, do
município de Nerópolis, no período de novembro/2003 a novembro/2004, através da RIFI.
VACAS POSITIVAS VACAS NEGATIVAS
BEZERROS POSITIVOS 5 (62,5%) 0
BEZERROS NEGATIVOS 3 (37,5%) 13 (100%)
A passagem do protozoário N. caninum pela placenta, infectando assim o
bezerro é um modo de infecção bem conhecido (DUBEY, 1999). STENLUND et al.,
(1999) e PARÉ et al. (1996) afirmaram que se o bezerro é positivo para anticorpos
anti-N. caninum, então a mãe também é positiva, desde que o bezerro tenha sido
submetido à sorologia antes de ingerir o colostro. Por outro lado, a ausência de
anticorpos para o parasita em natimortos ou bezerros recém-nascidos não torna a
infecção por N. caninum improvável, pois a infecção pode ter ocorrido no final da
gestação (JENKINS et al., 2002). Devemos ressaltar que os bezerros, em nosso
estudo, foram examinados antes de mamar o colostro devido à possibilidade da
ocorrência de resultados falso positivos.
Como podemos verificar a porcentagem encontrada em nossa pesquisa foi
inferior aos estudos mencionados por DAVISON et al., 1999b e SCHARES et al.
1998, e superior ao estudo realizado por HIETALA & THURMOND, 1999. Estas
diferenças podem estar relacionadas tanto à metodologia de amostragem utilizada,
técnica de diagnóstico utilizada, que nos estudos mencionados foi o ELISA ou
refernete ao ponto de corte utilizado em nosso estudo (1:250), para a sorologia dos
bezerros recém-nascidos. No entanto, BARR et al. (1993) e ANDERSON et al.
(1997) citam que títulos precolostrais, de bezerros com infecção transplacentária,
são geralmente altos, com valores ≥ 1:1240.
Nossos resultados indicam que a transmissão congênita é um aspecto
muito importante a ser considerado no ciclo de vida de N. caninum, que ajuda a
manter a prevalência desse protozoário constante dentro da população bovina.
27
Estimativas precisas de parâmetros de transmissão de N.caninum em nossos rebanhos
bovinos, com titulação dos soros maternos e dos bezerros, são necessárias, para melhorar nossa
compreensão da disseminação dessa infecção dentro do rebanho goiano e brasileiro, para um
desenvolvimento de estratégias de controle.
5.3 Pesquisa de DNA de Neospora caninum em abortos bovinos
Em relação à verificação da participação de N. caninum em abortos nas microrregiões de
Goiânia e Anápolis, dos três fetos abortados enviados para a Escola de Veterinária da UFG, obteve-
se resultado negativo para os três, diferindo dos resultados encontrados por outros autores no Brasil
como CORBELLINI et al., (2000, 2002) que verificaram que 10% e 47,8% dos fetos bovinos enviados
para exame na Faculdade de Veterinária da UFRGS estavam infectados por N. caninum,
respectivamente.
O fato dos resultados de nossa pesquisa terem sido negativos pode ser explicado pela
ausência do parasito na amostra de tecido selecionada, já que para cada órgão examinado somente
uma amostra foi colhida, ou realmente os fetos serem negativos para N. caninum. Quanto à técnica
de Nested PCR utilizada é uma técnica que tem alta sensibilidade, tendo sido utilizada em diferentes
estudos para a detecção de DNA genômico de N. caninum em fetos e sêmen de bovinos
(COLLANTES-FERNÁNDEZ et al., 2002; ORTEGA-MORA et al., 2003; CAETANO-DA-SILVA et al.,
2004).
Dois dos fetos examinados eram provenientes de propriedades das quais, após a
realização dos PCR, tivemos acesso à identificação materna e as mesmas eram negativas para N.
caninum, justificando assim nosso resultado. Do outro feto não tivemos conhecimento a respeito da
mãe, embora soubéssemos que era de uma propriedade positiva.
6 CONCLUSÕES Através dos resultados obtidos neste trabalho podemos concluir que:
1. N. caninum está presente nos rebanho bovinos de diferentes tipos de
exploração, das microrregiões de Anápolis e Goiânia;
2. A transmissão vertical transplacentária está presente, como modo de
infecção, no rebanho bovino selecionado;
3. Não foi verificada a presença de DNA de N. caninum em fetos bovinos
abortados enviados para a Escola de Veterinária/UFG.
28
i
7 REFERÊNCIAS
1. ÁLVAREZ-GARCIA, G. Identificación y caracterización de antígenos de neospora caninum con interés inmunodiagnóstico en bovinos. 2003. 301f. Tese (Doutorado em Veterinária) – Facultad de Veterinaria, Universidad Complutense de Madrid, Espanha.
2. ÁLVAREZ-GARCIA, G.; PEREIRA-BUENO, J.; GÓMES-BAUTISTA, M.; ORTEGA-MORA, L.M. Pattern of recognition of Neospora caninum tachyzoite antigens by naturally infected pregnant cattle and aborted foetuses. Veterinary Parasitology, v.107, p. 15-27, 2002.
3. ANDERSON, M.L.; BLANCHARD, P.C.; BARR, B.C.; DUBEY, J. P.; HOFFMAN, R. L.; CONRAD, P. A. Neospora-like protozoan infection as a major cause of abortion in California dairy cattle. Journal of the American Veterinary Medical Association, v. 198, p. 241-244, 1991.
4. ANDERSON, M.L.; REYNOLDS, J.P.; ROWE, J.D.; SVERLOW, K.W.; PACKHAM, A.E.; BARR, B.C.; CONRAD, P.A. Evidence of vertical transmission of Neospora sp infection in dairy cattle. Journal of the American Veterinary Medical Association, v. 210, p. 1169-1172, 1997.
5. ATKINSON, R.; HARPER, P.A.W.; REICHEL, M.P.; ELLIS, J.T. Progress in the serodiagnosis of Neospora caninum infections of cattle. Parasitology Today, v. 16, n.3, p. 110-114, 2000.
6. BLAS, I.; ORTEGA, C.; FRANKENA, K.; NOORDHUIZEN J.; THRUSFIELD, M.
Win Episcope 2.0 [CD-ROM], Epidecon, 2000. Statistical software.
7. BARR, B.C.; ANDERSON, M.L.; BLANCHARD, P.C.; DAFT, B.M.; KINDE, H.;
CONRAD, P.A. Bovine fetal encephalitis and myocarditis associated with protozoal
infections. Veterinary Pathology, v.27, p. 354-361, 1990.
8. BARR, B. C.; ANDERSON, M. L.; DUBEY, J. P.; CONRAD, P. A. Neospora-like protozoal infections associated with bovine abortions. Veterinary Pathology, v. 28, p. 110-116, 1991.
9. BARR, B.C.; CONRAD, P.A.; BREITMEYER, R.; SVERLOW, K.; ANDERSON,
M.L.; REYNOLDS,J.; CHAUVET, A.E.; DUBEY,J.P.; ARDANS, A.A. Congenital
Neospora infection in calves born from cows that had previously aborted Neospora-
infected fetuses. Journal of American Veterinary Medical Association, v. 202, p.
113-117,1993.
ii
10. BARR, B.C.; ROWE, J.D.; ANDERSON, M.L.; SVERLOW, K.W.; CONRAD, P.A.
Diagnosis of bovine fetal Neospora infection with an indirect fluorescent antibody
test. Veterinary Record, v. 137, p. 611-613, 1995.
11. BASZLER, T.V.; LAWRENCE, J.C.; MAUREENT, T.L.; MATHISON, B. Detection
by PCR of Neospora caninum in fetal tissues from spontaneous bovine abortions.
Journal Clinical Microbiology, v. 37, p. 4059-4064, 1999.
12. BJERKAS, I.; PRESTHUS, J. The neuropathology in toxoplasmosis-like infection
caused by a newly recognized cyst-forming sporozoon in dogs. ACTA PATHOLOGICA, MICROBIOLOGICA, ET IMMUNOLOGICA SCANDINAVICA, v. 97, p. 459-468, 1989.
13. BJÖRKMAN, C.; JOHANSSON, O.; STENLUND, S.; HOLMDAHL, O. J.; UGGLA,
A. Neospora species infection in a herd of dairy cattle. Journal of American Veterinary Medical Association, v. 208, p. 1441-1444, 1996.
14. BJÖRKMAN, C.; UGGLA, A. Serological diagnosis of Neospora caninum
infection. International Journal for Parasitology, v. 29, p.1497-1507,1999.
15. BRAUTIGAM, F. E.; HIETALA, S.K.; GLASS, R. Resultados de levantamento
sorológico para a espécie Neospora em bovinos de corte e leite. In: CONGRESSO
PANAMERICANO DE CIÊNCIAS VETERINÁRIAS, 15, 1996, Campo Grande.
Anais… Campo Grande: PANVET, 1996, p. 284.
16. BUXTON, D.; MALEY, S.W.; WRIGHT, S.; THOMSON, K.M.; RAE, A.G.; INNES,
E.A. The pathogenesis of experimental neosporosis in pregnant sheep. Journal of Comparative Pathology., v. 118, p. 267-279, 1998.
iii
17. CAETANO- DA SILVA, A.; FERRE, I.; COLLANTES-FERNÁNDEZ, E.;
NAVARRO, V.; ADURIZ, G.; UGARTE-GARAGALZA, C.; ORTEGA-MORA, L. M.
Occasional detection of Neospora caninum DNA in frozen extended semen from
naturally infected bulls. Theriogenology, v. 62, n. 7, p. 1329-1336, 2004.
18. CENTERS FOR DISEASES CONTROL AND PREVENTION. Epi Info v. 3.3 [CD
ROM], C. D. C.,2004. Statistic software.
19. COLLANTES-FERNÁNDEZ, E.; ZABALLOS, A.; ÁLVAREZ GARCIA, G.; ORTEGA-MORA, L. M. Quantitative detection of Neospora caninum in bovine aborted fetuses and experimentally infected mice by real-time PCR. Journal Clinical Microbiology, v. 40, p. 1194-1198, 2002.
20. COLLANTES-FERNÁNDEZ, E. Patogenia de la neosporosis en el feto bovino y en un modelo murino experimental. 2003. 277f. Tese (Doutorado em
Veterinária) – Facutad de Veterinaria, Universidad Complutense de Madrid,
Espanha.
21. CONRATHS, F. J.; BAUER, C.; BECKER, W. Detection of antibodies against
Neospora caninum in cows on Hessian farms with abortion and fertility problems.
Deutsche tierarztliche Wochenschrift v. 103, p. 221-224,1996.
22. CORBELLINI, L.G.; DRIEMEIER, D.; CRUZ, C.F.E.; DIAS, M.M. Aborto bovino
por Neospora caninum no Rio Grande do Sul. Ciência Rural, v. 30, p. 863-
868,2000.
23. CORBELLINI, L. G.; DRIEMEIER, D.; CRUZ, C. F.; GONDIM, L. F.; WALD, V. Neosporosis as a cause of abortion in dairy cattle in Rio Grande do Sul, southern Brazil. Veterinary Parasitololgy, v. 103, p. 195-202, 2002.
24. DAVISON, H. C.; FRENCH, N. P.; TREES, A. J. Herd-specific and age-specific seroprevalence of Neospora caninum in 14 British dairy herds. Veterinary Record, v. 144, p. 547-550, 1999a. 25. DAVISON, H. C.; GUY, C.S.; MCGARRY, J.W.; GUY, F.; WILLIAMS, D.J.; KELLY, D.F.; TREES, A.J. Experimental studies on the transmission of Neospora caninum between cattle. Research in Veterinary Science, v. 70, p.163-168, 2001.
iv
26. DAVISON, H.C.; OTTER, A.; TREES, A.J. Estimation of vertical and horizontal
transmission parameters of Neospora caninum infections in dairy calves.
International Journal for Parasitology, v. 29, p. 1683-1689, 1999b.
27. De MEERSCHMAN, F.; FOCANT, C.; BOREUX, R.; LECLIPTEUX, T.; LOSSON
B. Cattle neosporosis in Belgium: A case control in dairy and beef cattle, in: Hemphill,
A., Gottstein, B. A European perspective on Neospora caninum. International Journal for Parasitology, v. 30, p. 887-890, 2000.
28. De MEERSCHMAN, F.; SPEYBROECK, N.; BERKVENS, D.; RETTIGNERA, C.;
FOCANT, C.; LECLIPTEUX, T.; CASSART, D.; LOSSON, B. Fetal infection with
Neospora caninum in dairy and beef cattle in Belgium. Theriogenology, v. 58, p.
933-945, 2002.
29. DUBEY, J.P. Recent advances in Neospora and neosporosis. Veterinary Parasitology, v. 84, p. 349-367, 1999.
30. DUBEY, J. P.; BARR, B. C.; BARTA, J. R.; BJERKAS, I.; BJÖRKMAN, C.; BLAGBURN, B. L.; BOWMAN, D. D.; BUXTON, D.; ELLIS, J. T.; GOTTSTEIN, B.; HEMPHILL, A.; HILL, D. E.; HOWE, D. K.; JENKINS, M. C.; KOBAYASHI, Y.; KOUDELA, B.; MARSH, A. E.; MATTSSON, J. G.; MCALLISTER, M. M.; MODRY, D.; OMATA, Y.; SIBLEY, L. D.; SPEER, C. A.; TREES, A. J.; UGGLA, A.; UPTON, S. J.; WILLIAMS, D. J.; LINDSAY, D. S.. Redescription of Neospora caninum and its differentiation from related coccidia. International Journal for Parasitology, v. 32, p. 929-946, 2002a.
31. DUBEY, J.P.; CARPENTER, J.L.; SPEER, C.A.; TOPPER, M.J.; UGGLA, A.
Newly recognized fatal protozoan disease of dogs. Journal American Veterinary Medical Association, v. 192, p. 1269-1285,1988a.
32. DUBEY, J.P.; HATTEL, A.L.; LINDSAY, D.S.; TOPPER, M.J. Neonatal Neospora
caninum infection in dogs: Isolation of the causative agent and experimental
transmission. Journal American Veterinary Medical Association, v. 193, p. 1259-
1263, 1988b.
v
33. DUBEY, J. P.; HILL, D. E.; LINDSAY, D. S.; JENKINS, M. C.; UGGLA, A.; SPEER, C. A. Neospora caninum and Hammondia heydorni are separate species/organisms. Trends in Parasitology, v. 18, p. 66-69, 2002b.
34. DUBEY, J.P.; LINDSAY, D.S. A review of Neospora caninum and neosporosis. Veterinary Parasitology, v. 67, p. 1-59, 1996.
35. ELLIS, J.T. Polymerase chain reaction approaches for the detection of Neospora caninum and Toxoplasma gondii. International Journal for Parasitology, v. 28, p.1053-1060,1998.
36. ELLIS, J.; LUTON, K.; BAVERSTOCK, P. R.; BRINDLEY, P. J.; NIMMO, K. A.;
JOHNSON, A. M.. The phylogeny of Neospora caninum. Molecular and Biochemical Parasitology, v. 64, p. 303-311, 1994.
37. ELLIS, J.T.; McMILLAN, D.; RYCE, C.; PAYNE, S.; ATKINSON, R.; HARPER,
P.A.W. Development of a single tube nested polymerase chain reaction assay for the
detection of Neospora caninum DNA. International Journal for Parasitology, v. 29,
p. 1589-1596, 1999a.
38. ELLIS, J. T.; MORRISON, D. A.; LIDDELL, S.; JENKINS, M. C.; MOHAMMED, O.
B.; RYCE, C.; DUBEY, J. P.. The genus Hammondia is paraphyletic. Parasitology, v. 118 ( Pt 4) , p. 357-362, 1999b.
39. GENNARI, S.M. Neospora caninum no Brasil: Situação atual da pesquisa.
Revista Brasileira de Parasitologia Veterinária, v.13, p.23-28, 2004.
40. GONDIM, L.F.P.; SARTOR, I.F.; MONTEIRO JR.; L.A., HARITANI, M. Neospora
caninum infection in an aborted bovine foetus in Brazil. New Zealand Veterinary Journal. v. 47, p. 35- 252,1999a.
41. GONDIM, L.F.P.; SARTOR, I.F.; HASEGAWA, M.; YAMANE, I. Seroprevalence
of Neospora caninum in dairy cattle in Bahia Brazil. Veterinary Parasitology, v. 86,
p. 71–75, 1999b.
vi
42. GONZÁLEZ, L.; BUXTON, D.; ATXAERANDIO, R.; ADURIZ, S.; MALEY, S.W.;
MARCO, J.C.; CUERVO, L.A. Bovine abortion associated with Neospora caninum in
northern Spain. Veterinary Record, v. 144, p. 145-150, 1999.
43. GOTTSTEIN, B.; HENTRICH, B.; WYSS, R.; THUR, B.; BUSATO, A.; STARK, K.
D.; MÜLLER, N. Molecular and immunodiagnostic investigations on bovine
neosporosis in Switzerland. International Journal for Parasitology, v. 28, p. 679-
691, 1998 .
44. GUIMARÃES Jr., J.S.; SOUZA, S.L.P.; BERGAMASCHI, D.P.; GENNARI, S.M.
Prevalence of Neospora caninum antibodies and factors associated with their
presence in dairy cattle of the north of Paraná state, Brazil. Veterinary Parasitology,
v. 124, p. 1–8, 2004.
45. HEMPHILL, A.; GOTTSTEIN, B.; KAUFMANN, H. Adhesion and invasion of
bovine endothelial cells by Neospora caninum. Parasitology, v. 112 ( Pt 2), p. 183-
197, 1996.
46. HIETALA, S.K.; THURMOND, M.C. Postnatal Neospora caninum transmission
and transient serologic responses in two dairies. International Journal for Parasitolology, v. 29, p.1669-1676, 1999.
47. INSTITUTO BRASILEIRO DE GEOGRAFIA E ESTATÍSTICA – IBGE, Produção
da pecuária municipal – Brasil - 1º Trimestre de 2002 [on line], 2002. Disponível em:
http:// www.ibge.gov.br. Acesso em: 15 de jan. 2003
48. JENKINS, M. C.; BASZLER, T.; BJÖRKMAN, C.; SCHARES, G.; WILLIAMS, D.
Diagnosis and seroepidemiology of Neospora caninum-associated bovine abortion.
International Journal for Parasitology, v. 32, p. 631-636, 2002.
vii
49. KASHIWAZAKI, Y.; GIANNEECHINI, R.E.; LUST, M.; GIL, J. Seroepidemiology
of neosporosis in dairy cattle in Uruguay. Veterinary Parasitolology, v. 120, p. 139–
144, 2004.
50. KAUFMANN, H.; YAMAGE, M.; RODITI, I.; DOBBELAERE, D.; DUBEY, J.P.;
HOLMDAHL, O.J.M.; TREES, A.; GOTTSTEIN, B. Discrimination of Neospora
caninum from Toxoplasma gondii and other Apicomplexan parasites by hybridization
and PCR. Molecular and Cellular Probes, v. 10, v. 289-897, 1996. 51. KIM, J. H.; LEE, J. K.; HWANG, E. K.; KIM, D. Y. Prevalence of antibodies to
Neospora caninum in Korean native beef cattle. Journal of Veterinary Medical Science, v. 64, p.41-943, 2002.
52. KLEIN, F.; HIETALA, S.; BERTHET, H.; VERY, P.; GRADINARU, D. Neospora
caninum: enquête sérologique sur les avortements des bovines normands et
charolais. Le Point Veterinaire, v. 88, p. 1283-1286, 1997.
53. KOBAYASHI, Y.; YAMADA, M.; OMATA, Y.; KOYAMA, T.; SAITO, A.;
MATSUDA, T.; OKUYAMA, K.; FUJIMOTO, S.; FURUOKA, H.; MATSUI, T.
Naturally-occurring Neospora caninum infection in an adult sheep and her twin
fetuses. Journal Parasitology, v. 87, p. 434-436, 2001.
54. LINDSAY, D.S.; DUBEY, J. P. Immunohistochemical diagnosis of Neospora caninum in tissue sections. American Journal of Veterinary Research., v. 50, p. 1981-1983, 1989.
55. LINDSAY, D.S; KELLY, E.J; MCKOWN, R.; STEIN, F.J; PLOZER, J; HERMAN,
J; BLAGBURN, B.L; DUBEY, J.P. Prevalence of Neospora caninum and Toxoplasma
gondii antibodies in coyotes (Canis latrans) and experimental infections of coyotes
with Neospora caninum. Journal Parasitology, v. 82, p. 657-659,1996.
56. LINDSAY, D. S; DUBEY, J. P. Infections in mice with tachyzoites and bradyzoites
of Neospora caninum (Protozoa: Apicomplexa). Journal Parasitology, v. 76, p. 410-
413, 1990.
viii
57. McALLISTER, M. M.; DUBEY, J. P.; LINDSAY, D. S.; JOLLEY, W. R.; WILLS, R. A.; McGUIRE, A. M. Dogs are definitive hosts of Neospora caninum. International Journal for Parasitology, v. 28, p. 1473-1478, 1998.
58. McALLISTER, M. M.; BJORKMAN, C.; ANDERSON SPRECHER, R.; ROGERS, D. G. Evidence of point-source exposure to Neospora caninum and protective immunity in a herd of beef cows. Journal of American Veterinary Medical Association, v. 217, p. 881–887. 2000.
59. McALLISTER, M. M.; HUFFMAN, E. M.; HIETALA, S. K.; CONRAD, P. A.; ANDERSON, M. L.; SALMAN, M. D. Evidence suggesting a point source exposure in an outbreak of bovine abortion due to neosporosis. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, v. 8, p. 355-357, 1996.
60. McNAMEE, P. T.; TREES, A. J.; GUY, F.; MOFFETT, D.; KILPATRICK, D. Diagnosis and prevalence of neosporosis in cattle in Northern Ireland. Veterinary Record, v. 138, p. 419-420, 1996.
61. MAGNINO, S.; VIGO, P. G.; ROSIGNOLI, L.; BOLDINI, M.; VEZZOLI, F.; ALBORALI, L.; CAMMI, G.; FONI, E.; COLOMBO, M.; COLOMBO, N.; BERGAMI, C.; MELLINI, A.; FABBI, M.; GENCHI, G. Neosporosi bovina in Italia: un biennio de attività diagnostica. La Selezione Veterinaria, p.515-523, 2000.
62. MELO, C.B.; LEITE, R.C.; LOBATO, Z.I.P.; LEITE, R.C. Infection by Neospora caninum associated with bovine herpesvirus 1 and bovine viral diarrhea virus in cattle from Minas Gerais State, Brazil. Veterinary Parasitology, v. 119, p. 97–105, 2004.
63. MOORE, D.P.; CAMPERO, C.M.; ODEÓN, A.C.; POSSO, M.A.; CANO, D.; LEUNDA, M.R.; BASSO, W.; VENTURINI, M.C.; SPATH, E. Seroepidemiology of beef and dairy herds and fetal study of Neospora caninum in Argentina. Veterinary Parasitology, v. 107, p. 303–316, 2002.
64. MOORE, D. P.; CAMPERO, C. M.; ODEÓN, A. C.; CHAYER R.; BIANCO M. A. Reproductive Losses due to Neospora caninum in a beef herd in Argentina. Journal of Veterinary Medicine B, v. 50, p. 304–308, 2003.
65. MUGRIDGE, N. B.; MORRISON, D. A.; HECKEROTH, A. R.; JOHNSON, A. M.;
TENTER, A. M. Phylogenetic analysis based on full-length large subunit ribosomal
RNA gene sequence comparison reveals that Neospora caninum is more closely
related to Hammondia heydorni than to Toxoplasma gondii. International Journal for Parasitology, v. 29, p. 1545-1556, 1999.
ix
66. MUGRIDGE, N. B.; MORRISON, D. A.; JAKEL, T.; HECKEROTH, A. R.;
TENTER, A. M.; JOHNSON, A. M.. Effects of sequence alignment and structural
domains of ribosomal DNA on phylogeny reconstruction for the protozoan family
sarcocystidae. Molecular Biology and Evolution, v.17, p. 1842-1853, 2000.
67. ORTEGA-MORA, L.M.; FERRE, I.; Del-POZO, I.; CAETANO-DA-SILVA, A.;
COLLANTES-FERNÁNDEZ, E.; REGIDOR-CERRILLO, J.; UGARTE-GARAGALZA,
C.; ADURIZ, G. Detection of Neospora caninum in semen of bulls. Veterinary Parasitology, v. 117, p. 301-308, 2003.
68. PARÉ, J.; HIETALA, S.K.; THURMOND, M.C. An enzyme linked immunosorbent
assay (ELISA) for serological diagnosis of Neospora sp. Infection in cattle. Journal Veterinary Diagnostic Investigation, v. 7, p. 352-359, 1995.
69. PARÉ, J.; FECTEAU, G.; FORTIN, M.; MARSOLAIS, G. Seroepidemiologic study
of Neospora caninum in dairy herds. Journal of American Veterinary Medical Association, v. 213, p. 1595-1598, 1998.
70. PARÉ, J.; THURMOND, M. C.; HIETALA, S. K. Congenital Neospora caninum
infection in dairy cattle and associated calfhood mortality. Canadian Journal of Veterinary Research. v. 60, p. 133-139, 1996.
71. PARÉ, J.; THURMOND, M.C; HIETALA, S.K. Neospora caninum antibodies in
cows during pregnance as a predictor of congenital infection and abortion. Journal Parasitology, v. 83, p. 82-87, 1997.
72. PATITUCCI, A.N.; PEREZ, M.J.; ISRAEL, K.F.; ROZAS, M.A. Prevalence of
Neospora caninum in two dairy herds of the IX Region of Chile. Archivos Medicina Veterinaria, v. 32, p. 209–214, 2000.
73. PAYNE, S; ELLIS, J. Detection of Neospora caninum DNA by the polymerase
chain reaction. International Journal for Parasitology, v. 26, p. 347-351, 1996.
x
74. PEREIRA-BUENO, J.; QUINTANILLA-GOZALO, A.; PÉREZ-PÉREZ, V.; ESPI-
FELGUEROSO, A.; ÁLVAREZ-GARCÍA, G.; COLLANTES-FERNÁNDEZ, E.;
ORTEGA-MORA, L. M. Evaluation by different diagnostic techniques of bovine
abortion associated with Neospora caninum in Spain. Veterinary Parasitology, v.
111, p.143-152, 2003.
75. PEREIRA-BUENO, J.; QUINTANILLA-GOZALO, A.; SEIJAS-CARBALLEDO, A.;
COSTAS, E.; ORTEGA-MORA, L. M. Observational studies in Neospora caninum
infected dairy cattle: pattern of transmission and age-related antibody fluctuations, in:
Hemphill, A., Gottstein, B. A European perspective on Neospora caninum.
International Journal for Parasitology, v. 30, p. 906-909, 2000.
76. PETERS, M.; LUTKEFELS, E.; HECKEROTH, A. R.; SCHARES, G. Immunohistochemical and ultrastructural evidence for Neospora caninum tissue cysts
in skeletal muscles of naturally infected dogs and cattle. International Journal for Parasitology, v. 31, p.1144-1148, 2001.
77. QUINTANILLA-GOZALO, A.; PEREIRA-BUENO, J.; TABARÉS, E.; INNES, E. A.;
GONZÁLEZ-PANIELLO, R.; ORTEGA-MORA, L. M. Seroprevalence of Neospora
caninum infection in dairy and beef cattle in Spain. International Journal for Parasitology, v. 29, p. 1201–1208, 1999.
78. RIVERA, G.H.; NELSON, D.; TABACCHI, L.N. Neospora caninum y otros
agentes en fetos abortados de bovinos lecheros del valle de Lima. Revista de Investigación. Veterinaria, v. 11, p. 1–7, 2000.
79. SANDERSON, M. W.; GAY, J. M.; BASZLER, T. V. Neospora caninum
seroprevalence and associated risk factors in beef cattle in the northwestern United
States. Veterinary Parasitology, v. 90, p. 15–24, 2000.
xi
80. SAGER, H.; FISCHER, I.; FURRER, K.; STRASSER, M.; WALDVOGEL, A.; BOERLIN, P.; AUDIGE, L.; GOTTSTEIN, B. A Swiss case-control study to assess Neospora caninum-associated bovine abortions by PCR, histopathology and serology. Veterinary Parasitology, v. 102, p. 1-15, 2001.
81. SAGER, H., GLOOR, M., BJORKMAN, C., KRITZNER, S., GOTTSTEIN, B. Assessment of antibody avidity in aborting cattle by a somatic Neospora caninum tachyzoite antigen IgG avidity ELISA. Veterinary Parasitology, v. 112, p. 1–10, 2003.
82. SCHARES, G.; PETERS, M.; WURM, R.; BÄRWALD, A.; CONRATHS, F.J. The efficiency of vertical transmission of Neospora caninum in dairy cattle analyzed by serological techniques. Veterinary Parasitology, v. 80, p. 87-98, 1998.
83. SCHOCK, A; BUXTON, D; SPENCE, J.A; LOW, J.C; BAIRD, A. Histopathological survey of aborted bovine fetuses in Scotland with special reference to Neospora caninum. Veterinary Record, v. 147, p. 687-688, 2000.
84. SILVA, A. C. Diagnóstico da neosporose bovina. Revista Brasileira de Parasitologia Veterinária, v.13, p.29-33, 2004.
85. SPEER, C. A.; DUBEY, J. P. Ultrastructure of tachyzoites, bradyzoites and tissue cysts of Neospora caninum. Journal Protozoology., v. 36, p. 458-463, 1989.
86. SPEER, C. A.; DUBEY, J. P.; MCALLISTER, M. M.; BLIXT, J. A. Comparative ultrastructure of tachyzoites, bradyzoites, and tissue cysts of Neospora caninum and Toxoplasma gondii. International Journal for Parasitology, v.29, p. 1509-1519, 1999.
87. STENLUND, S.; KINDAHL, H.; MAGNUSSON, U.; UGGLA, A.; BJORKMAN, C. Serum antibody profile and reproductive performance during two consecutive pregnancies of cows naturally infected with Neospora caninum. Veterinary Parasitology, v. 85, p. 227–34, 1999.
88. THILSTED, J.P; DUBEY, J.P. Neosporosis-like abortions in a herd of dairy cattle. Journal Veterinary Diagnostic Investigation, v.1, p.205-209, 1989.
89. TREES, A.J.; DAVISON, H.C.; INNES, E.A.; WASTLING, J.M. Towards evaluating the economic impact of bovine neosporosis. International Journal for Parasitology, v. 29, p. 1195-2000, 1999.
90. UGGLA, A.; STENLUND, S.; HOLMDAHL, O.J. Oral Neospora caninum inoculation of neonatal calves. International Journal for Parasitology, v.28, p.1467-1472, 1998.
91. WALDNER, C. L.; JANZEN, E. D.; HENDERSON, J.; HAINES, D. M. Outbreak of abortion associated with Neospora caninum infection in a beef herd. Journal of American Veterinary Medical Association, v. 215, p. 1485-1489,1999.
92. WALDNER, C. L.; JANZEN, E. D.; RIBBLE, C. S. Determination of the association between Neospora caninum infection and reproductive performance in beef herds. Journal of American Veterinary Medical Association, v. 213, p. 685–690, 1998:
xii
93. WOUDA, W; DUBEY, J.P; JENKINS, M.C. Serological diagnose of bovine fetal
neosporosis. Journal Parasitology., v. 83, p. 545-547, 1997.
94. WOUDA, W., MOEN, A. R., SCHUKKEN, Y. H. Abortion risk in progeny of cows after a Neospora caninum epidemic. Theriogenology, v. 49, p. 1311-1316, 1998.