CROMATOGRAFIA

Anlise Instrumental

Aula 1: Princpios bsicos

1

Introduo definio e histrico

Modalidades

Mecanismos de separao

Teoria bsica

Cromatografia

2

Cromatografia

Tcnicas de separao isolar o composto de interesse dos demais compostos e impurezas presentes na amostra, possibilitando sua deteco por instrumentos analticos.

3

At a metade do sculo XX tcnicas clssicas (precipitao, extrao destilao). Avanos nos equipamentos e a descoberta de diferentes modos de separao cromatogrfica grande parte das separaes passaram a ser feitas por cromatografia. Cromatografia x tcnicas clssicas de separao Possibilidade de automao de todas as etapas da anlise. Anlises mais rpidas. Melhor desempenho.

Cromatografia

A cromatografia um mtodo fsico-qumico de separao no qual os componentes a serem separados so distribudos entre duas fases: uma que permanece estacionria (FE) e outra que se movimenta atravs dela, denominada fase mvel (FM).

Separao: interao diferencial dos componentes entre a fase estacionria e a fase mvel.

Fase estacionria

Fase mvel Componentes da mistura

4

Cromatografia

O termo cromatografia foi utilizado pela primeira vez em 1903: Mikhael Tswett

(botnico), na separao de misturas de pigmentos vegetais em colunas recheadas com

adsorventes slidos empregando hidrocarboneto como solvente (fase mvel).

Mistura de pigmentos

Solvente (FM)

CaCO3 Pigmentos separados

Origem grega: chrom (cor) e graphe (escrever) - o processo de separao no depende da cor, exceto para facilitar a identificao dos componentes.

5

Cromatografia

Critrios usados para classificao das diferentes modalidades de cromatografia:

Disposio da fase estacionria (forma fsica do sistema).

Estado fsico da fase mvel (lquido, gs ou fluido supercrtico) e da fase estacionria

(lquido ou slido).

Mecanismos de separao.

6

Cromatografia

De acordo com a disposio da fase estacionria forma fsica do sistema de separao:

Colunas

Recheadas Abertas

d.i.: de 0,02 mm (capilares) a 1,0 m (preparativas) Comprimento: de 3 cm a 100 m

Planar

Camada delgada Papel

7

Cromatografia

Cromatografia em coluna - classificao de acordo com a natureza da fase mvel e da fase estacionria:

Colunas

Lquido

Gs

FSC

Fase ligada

Slido

Lquido

Fase ligada

Slido

Fase ligada

Slido

Lquido

Fase mvel Fase estacionria Sistema Tipo de cromatografia

Gasosa (Gs-lquido CGL)

Gasosa (Gs-slido CGS)

Gasosa com FE ligada - CGFL

Supercrtica com FE slida - CSS

Supercrtica com FE ligada - CSFL

Lquida (Lquido-lquido CLL)

Lquida (Lquido-slido CLS)

Lquida com FE ligada - CLFL

FM

Lquido (amostra solvel na FM) Gs (analitos volteis e termoestveis) Fluido supercrtico (T e P > ponto crtico)

FE

Slido Lquido espalhado sobre um suporte slido Lquido imobilizado/quimicamente ligado

Classificao universal

8

Cromatografia

De acordo com o mecanismo de separao (processos fsicos, qumicos ou mecnicos):

9

Partio

Adsoro

Lquido

Gs

Gs Coluna

Coluna

Planar

FSC

Permeao e Filtrao em gel

Lquida de troca inica

Coluna

Coluna

Coluna

Coluna

Coluna

Fase mvel Sistema Mecanismo Tipo de cromatografia

Lquido

Troca inica

Excluso molecular

Lquido

Lquido

Lquida (lquido-lquido)

Fluido supercrtico-lquido

Gs-lquido

Papel

Camada delgada

Lquida (lquido-slido)

Gasosa (gs-slido)

Planar

FSC Coluna Fluido supercrtico-slido

Bioafinidade

Lquido Coluna

Lquida de bioafinidade

Cromatografia

FE slida Soluto adsorvido

Fase mvel (gs, lquido ou FSC)

Processo interfacial: ocorre na interface entre a FM e a FE slida.

ADSORO

Slidos com grandes reas superficiais (partculas finas, porosas).

Slidos com muitos stios ativos (hidroxilas, pares de eltrons etc).

Solutos polares.

10

Cromatografia

Fase mvel (gs, lquido ou FSC)

Suporte slido

Fase estacionria lquida

Soluto absorvido na FE lquida

Processo intrafacial: ocorre no interior do filme de FE lquida.

ABSORO (PARTIO)

Filmes espessos de FE lquida. Grande superfcie lquida exposta fase mvel. Interao elevada entre a FE lquida e o analito (alta solubilidade).

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Fase mvel (soluo inica - tampo)

Cromatografia

Trocador aninico +

+ +

+ + + + + +

+

+

Grupos inicos ligados fase estacionria

-

-

- - - - - -

-

-

-

-

- - - - -

-

- -

Grupos sulfnicos (-SO3-)

cidos carboxlicos (-COO-) Aminas quaternrias (-NR3

+)

nions do soluto (ctions - trocador catinico)

Adsoro reversvel e diferencial de analitos inicos ou ionizveis sobre grupos

trocadores de ons presentes na superfcie da FE (resina de troca inica).

12

Fase mvel lquida (alterao do pH ou fora inica para eluio da molcula de interesse)

Cromatografia

Suporte slido

Grupos biolgicos especficos ligados ao suporte

Substratos/enzimas Protenas/acares e protenas celulares

Molcula complementar especfica presente na amostra

Grupos com especificidade biolgica ligados ao suporte retiram da fase mvel somente

os grupos complementares, deixando passar todos os demais. Aps isolamento, a

molcula de interesse eluda da coluna por meio de mudanas nas propriedades da

fase mvel.

13

Cromatografia

Partcula porosas de FE (gel de dextrano, agarose ou poliacrilamida)

Molculas de soluto de diferentes tamanhos

Fase mvel lquida

Mecanismo de separao essencialmente MECNICO

Molculas menores conseguem penetrar nos poros das partculas de FE, e ficam retidas.

Macromolculas com tamanho suficientemente grande no entram nos poros e so arrastadas

rapidamente pela fase mvel.

Separao de protenas, enzimas, polmeros, carboidratos e outras

molculas de peso molecular elevado.

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Cromatografia

Escolha a tcnica cromatogrfica mais adequada para cada uma das aplicaes a seguir, indicando o mecanismo envolvido.

a) Anlise de hidrocarbonetos de baixa massa molar (volteis e estveis termicamente) em amostras de combustveis.

b) Anlise de polmeros para determinao da massa molar aps a sntese.

c) Isolamento de uma protena presente em clulas sanguneas.

d) Separao de uma mistura de frmacos de carter neutro, presentes na formulao de um medicamento.

e) Determinao de aminas bioativas (triptamina, tiramina, feniletilamina e histamina) em amostras de alimento.

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Cromatografia

CROMATGRAFO ANALTICO - MDULOS FUNDAMENTAIS

Sistema de propulso de fase mvel

Mdulo de injeo

Coluna cromatogrfica

Detector

Bomba de alta presso (cromatografia lquida) ou a prpria presso do gs (cromatografia gasosa).

Introduo de parte da amostra diretamente no fluxo da fase mvel.

Contm a FE - onde ocorre a separao cromatogrfica.

Dispositivo que gera um sinal eltrico proporcional quantidade de analito eluda.

Registra e processa o sinal do detector em funo do tempo de anlise: CROMATOGRAMA.

Registrador ou computador

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Cromatografia

CROMATOGRAMA (SINAL x TEMPO DE ANLISE): representa o resultado final do

processo de separao cromatogrfica.

Idealmente, cada composto separado aparece

como um nico pico cromatogrfico, com

tempo de reteno tR caracterstico e rea

proporcional a sua concentrao na amostra.

0 5 10 15 20

tR

Sin

al (r

esp

osta

)

Tempo (min)17

Cromatografia

Tempo de reteno tR o tempo necessrio, a partir da injeo da mistura na coluna, para que o composto chegue at o detector.

0 5 10 15 20

tR'

tM

tR

Re

sp

os

ta d

o d

ete

cto

r

Tempo (min)

tM = tempo de retardamento da FM (primeiro pico no cromatograma -tempo de eluio de um composto que no interage com a FE).

Tempo mdio que as molculas de soluto ficam retidas na FE.

tR = tR - tM

O parmetro diretamente mensurvel de reteno de um analito o

TEMPO DE RETENO AJUSTADO tR

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Cromatografia

Volume de reteno VR Volume de fase mvel necessrio para eluir o analito.

VM = volume de fase mvel necessrio para um composto no retido sair da coluna, representa o volume de FM contido no interior da coluna cromatogrfica.

(tR = tR tM) x FC VR = VR - VM

Embora no seja diretamente mensurvel, outro parmetro fundamental de reteno

o VOLUME DE RETENO AJUSTADO VR

vazo da faze mvel

Volume de fase mvel eludo enquanto o analito est retido na FE.

Medidas de tempo e volume utilizadas para fins qualitativos (para identificao dos

compostos) e para o clculo dos demais parmetros cromatogrficos (Resoluo, seletividade e

eficincia) que, do ponto de vista prtico, so os fatores que governam o sucesso da separao

cromatogrfica.

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Cromatografia

RELAO ENTRE RETENO E A CONSTANTE DE DISTRIBUIO(KC)

Coluna: srie de estgios hipotticos independentes onde ocorre o equilbrio entre o analito dissolvido na FE e na FM.

KC = constante de distribuio [A]S = concentrao do analito na FE [A]M = concentrao do analito na FM

Afinidade pela FE [A]S

[A]M Afinidade pela FM

MENOR RETENO

M

SC

[A]

[A]K

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Cromatografia

Razo entre as massas de analitos contidas na FE e na FM ou razo entre os tempos que o analito passa na FE e na FM.

Expressando o equilbrio em termos da MASSA do analito em cada fase, ao invs da concentrao:

M

SC

[A]

[A]K

S

SS

V

m[A]

S

M

M

S

M

M

S

S

CV

V

m

m

V

m

V

m

K

M

MM

V

m[A]

Fator de reteno ou fator de capacidade (k)

M

R

M

S

t

t'

m

mk

k

Razo entre os volumes de FM e FE na coluna

KC = k x k = KC/

O fator de reteno depende da constante termodinmica de distribuio e da razo de fases da coluna.

21

Cromatografia

Para que ocorra a separao entre dois analitos necessrio que eles sejam retidos diferencialmente pelo sistema, isto , que este seja seletivo.

A SELETIVIDADE () expressa a diferena de reteno entre dois picos adjacentes.

Seletividade ou fator de separao ()

R2

R1

t'

t' Obs.: tR1 > tR2

Como k = tR / tM M2

M1

tk

tk

2

1

k

k

Como k funo das afinidades dos analitos pela FM e FE, a escolha correta destas determina a seletividade do sistema.

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Cromatografia

Uma outra medida da separao de dois compostos adjacentes a RESOLUO (RS).

INJ

E

O

tM

tR1

tR2

t

wb1 wb2

wh1 wh2

Tempo

h 2h 1

R1R2

b 2b 1

R1R2S

ww

tt 1,177

ww

tt 2R

tR1 e tR2 = tempos de reteno de dois picos adjacentes envolvidos no clculo; wb1 e wb2 = largura dos picos na base, em unidades de tempo;

wh1 e wh2 = largura dos picos a meia-altura, em unidades de tempo. 23

Cromatografia

RESOLUO (RS)

24

Cromatografia

EFICINCIA de sistemas cromatogrficos

Tempo

Capacidade de eluio com o mnimo de disperso do analito.

A migrao do analito pela coluna provoca inevitavelmente o alargamento de sua banda.

Problemas do alargamento excessivo de picos:

Picos mais largos e de menor intensidade = menor detectabilidade.

Separao deficiente de analitos com retenes prximas.

o parmetro mais utilizado por fabricantes de equipamentos e colunas.

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Cromatografia

Quantificao da eficincia

Supondo a coluna como uma srie de estgios hipotticos e separados onde ocorre o equilbrio entre o analito, a FE e a FM: Cada estgio de equilbrio

chamado de PRATO TERICO.

O nmero de pratos tericos (N) de uma coluna pode ser calculado a partir do cromatograma por:

2

h

R

2

b

R

w

t5,545

w

t16N

tR

wb N Coluna mais eficiente

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Cromatografia

O nmero de pratos pode ser afetado por vrios fatores, incluindo as condies de anlise, o tamanho da amostra, o tipo de soluto e, principalmente, o comprimento da coluna.

Por essa razo, a comparao entre diferentes colunas feita usando-se a medida da altura equivalente a um prato (H):

H = L / N sendo L=comprimento da coluna

Coluna mais eficiente H

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Exemplo:

Coluna 1 (L:5 cm) N=10.000 pratos H=0,0005 cm

Coluna 2 (L:15 cm) N=18.000 pratos H=0,0008 cm

Cromatografia

Variveis que afetam a EFICINCIA da coluna

C

BAH

Existem vrios fatores que provocam o alargamento de picos, e consequentemente, perda de eficincia das separaes, e a relao entre estes fatores e a altura equivalente a um prato representada pela equao de van Deemter:

= velocidade linear da FM = L / tM

A alargamento dos picos devido aos mltiplos caminhos seguidos pelas molculas da amostra. (colunas recheadas)

A Colunas com d.i. pequenos.

Partculas pequenas e uniformes.

Recheio homogneo.

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Cromatografia

Variveis que afetam a EFICINCIA da coluna

B difuso molecular do soluto na FM. Quanto maior o tempo que o soluto permanece na FM, maior o valor de B. Inversamente proporcional velocidade linear da FM.

B Aumentar a vazo da FM.

C velocidade de transferncia de molculas do soluto da FE para a FM. Quanto maior a espessura do filme lquido de FE, maior o termo C e menor a eficincia. Diretamente proporcional velocidade linear da FM.

C Diminuir a vazo da FM.

Empregar FE com filmes finos.

H = A + B/ + C

C

AB/

Velocidade linear da FM (m s-1)tima

Hmnimo

H (

m)

29

Cromatografia

Simetria de pico Fator de assimetria (As) Quando o formato do pico cromatogrfico se desvia do perfil descrito por uma distribuio gaussiana ele denominado assimtrico.

O fator de assimetria (As) calculado a 10 % da altura do pico.

Picos assimtricos prejudicam a resoluo e a repetibilidade das separaes cromatogrficas. 30

Cromatografia

Equao geral da RESOLUO

Eficincia N Distribuio dos compostos dentro da coluna k Seletividade

1

kk

k

4

NR

12

2S

Otimizao da separao 1. Modificar o fator de reteno (k)

2. Modificar o fator de separao ()

3. Modificar a eficincia (N)

Cromatografia gasosa: programao de temperatura do forno da coluna. Lquida: trocar a FM; aumentar a temperatura do forno da coluna; variar a composio da FM.

Trocar a FE (coluna).

Alterar a vazo. Trocar a coluna por outra mais longa, ou com dimetro menor.

Como o objetivo principal da separao cromatogrfica resolver os compostos da amostra, para se otimizar uma separao devem-se considerar os parmetros que influenciam a resoluo, que so eficincia, seletividade e reteno relativa dos picos.

Relao entre RESOLUO, SELETIVIDADE e EFICINCIA

31

Cromatografia

Efeito do aumento da eficincia e da seletividade na resoluo

N

N

1

2

3

32

Cromatografia

O cromatograma apresentado a seguir foi obtido a partir da separao de quatro agrotxicos por cromatografia lquida de alta eficincia. O pico nmero 1 referente acetona que, neste caso, no apresenta interao com a FE. Calcule o TEMPO DE RETENO AJUSTADO, FATOR DE RETENO e EFICINCIA para todos os agrotxicos, e a SELETIVIDADE e RESOLUO para os dois compostos mais retidos.

wb5= 0,9 min wb4= 0,7 min wb3= 0,5 min wb2= 0,4 min

33

Cromatografia

Dentre as colunas listadas na tabela a seguir, qual apresenta a maior eficincia?

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Coluna Comprimento (cm)

Nmero de pratos

A 85 115.000

B 3 4.800

C 15 9.000

D 100 3.200

Fundamentos de Qumica Analtica. Douglas A.

Skoog, Donald M. West, F. James Holler e Stanley R.

Crouch; 8.ed., So Paulo, SP: Thomson, 2005.

Fundamentos de Cromatografia. Carol H. Collins, Gilberto L. Braga e

Pierina S. Bonato; Campinas, SP: Editora da UNICAMP, 2006.

Anlise Qumica Quantitativa. Daniel C. Harris; 6.ed.,

Rio de Janeiro, RJ: LTC, 2005.

Princpios de Anlise Instrumental. Douglas A. Skoog,

F. James Holler e Timothy A. Niemam; 5.ed., Porto

Alegre, RS: Bookman, 2002.

35

Aula 2 Cromatografia gasosa

Aula 3 Cromatografia lquida

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