1. Sobre a técnica cromatografia em camada delgada, responda:

(a) Quais os fundamentos básicos?

A cromatografia em camada delgada (ou fina) é uma técnica de adsorção líquido-sólido bastante

simples e barata, que consiste na separação de uma mistura através da migração por capilaridade

diferencial de seus componentes sobre uma camada delgada de adsorvente retido sobre uma superfície

plana.

Na cromatografia de camada delgada, a fase móvel (líquido) ascende por ação de capilaridade por

uma camada fina do adsorvente (fase estacionária) estendida sobre um suporte. O suporte mais típico é

uma placa de vidro. Sobre a placa espalha-se uma fina camada de adsorvente suspenso em água ou outro

solvente e deixa-se secar. A placa coberta chama-se “placa de camada fina ou placa cromatográfica”.

Quando a placa cromatográfica é colocada verticalmente em um recipiente fechado (cuba cromatográfica)

que contém uma pequena quantidade de solvente, este eluirá pela camada do adsorvente por ação capilar.

(b) Cite os usos mais consagrados da técnica (importância).

A cromatografia em camada delgada é usada para determinar a pureza do composto, identificar

componentes em uma mistura comparando-os com padrões, acompanhar o curso de uma reação pelo

aparecimento dos produtos e desaparecimento de um dos reagentes e ainda para isolar componentes

puros de uma mistura.

(c) Enumere as vantagens e desvantagens da técnica.

A cromatografia em camada delgada é uma técnica simples, de fácil compreensão e execução, de

baixo custo, apresenta separação relativamente rápida, é versátil, e reprodutível quando se tem prática.

Entretanto, como envolve processos manuais, como por exemplo a preparação da placa e aplicação da

amostra, pode causar erros. Essa técnica não possui, também, boa eficiência em análise quantitativa.

(d) O que é e como é calculado o Rf (Fator de Retardamento)?

Parâmetro usado frequentemente em cromatografia, o Rf é definido como a razão entre a distância

percorrida pela mancha do componente e a distância percorrida pelo eluente, ou seja:

Rf = d1d2

Onde: Rf é o fator de retardamento; d1 a distância percorrida pela mancha do componente; e d2 a

distância percorrida pelo eluente.

(e) Como o fator de retenção de um soluto pode ser alterado?

O fator de retenção pode ser alterado através de mudanças nas fases estacionária e/ou móvel;

mudanças na temperatura, no volume ou na concentração da substância aplicada.

(f) Que características deve ter um solvente para ser considerado um bom eluente de

desenvolvimento?

Para ser considerado um bom eluente, o solvente deve ser volátil, apresentar baixa viscosidade e

não interagir com o soluto.

(g) Quais artifícios podem ser utilizados quando suspeitamos que um componente da amostra a

ser analisada pode não ser visível a olho nu?

Quando algum componente da amostra não é visível a olho nu, pode ser utilizada uma cuba

reveladora para sua visualização. Essa cuba reveladora pode ser constituída de vapor de iodo que reage

com compostos orgânicos formando complexo colorido. Outras alternativas para se revelar a placa

cromatográfica, seriam a utilização de luz ultravioleta ou de reveladores energéticos como ácido sulfúrico,

tricloreto de antimônio ou permanganato de potássio seguido de aquecimento para ocorrer a reação

cromogênica.

2. Defina:

(a) eluição com gradiente: a composição da fase móvel é variada durante a eluição, ou seja, a fase

móvel é formada por dois ou mais solventes onde a razão entre estes é variada durante o processo

de eluição.

(b) eluição isocrática: eluição com composição da fase móvel constante, ou seja, eluição com um

único solvente ou com uma mistura de solventes de composição constante.

(c) cromatografia em fase estacionária normal: a fase estacionária é mais polar do que a fase

móvel.

(d) cromatografia em fase estacionária reversa: a fase móvel é polar e a fase estacionária apolar.

3. Sugira um tipo de cromatografia líquida que seja adequada para separar:

a) e

→ Cromatografia por adsorção (isômeros)

b) CH3CH2OH e CH3CH2CH2OH → Cromatografia por partição

c) Ba2+ e Sr2+ → Cromatografia por partição (papel)

d) C4H9COOH e C5H11COOH → Cromatografia por partição

e) Glicosídeos de alta massa molecular → Cromatografia por exclusão por tamanho.

4. Em uma coluna de sílica gel, encontrou-se um composto com tempo de retenção de 28 min

quando a fase móvel era tolueno. Que solvente, tetracloreto de carbono ou clorofórmio,

aparentemente diminuiria o tempo de retenção? Explique.

Como a sílica gel é polar e utilizando o tolueno que é um solvente apolar, o tempo de retenção é de

28 minutos. Para que este diminua, deve ser usado um solvente mais polar do que a fase estacionária, ou

seja, do que a sílica gel. Com isso, utilizando-se o clorofórmio que é polar, o tempo de retenção será menor

5. No preparo de um gradiente de benzeno/acetona para HPLC em coluna de sílica gel, é

desejável aumentar ou diminuir a proporção de benzeno conforme a coluna é eluída?

Explique sua resposta.

Como a fase estacionária do sistema (sílica gel) é polar, utilizando-se um solvente apolar, os

analitos polares ficarão retidos no sistema. Para que estes sejam eluídos, deve-se aumentar a polaridade

da fase móvel e, para isso, deve-se diminuir a proporção de benzeno no gradiente já que este é o

componente apolar da fase móvel, tornando-a mais polar.

6. Uma cromatografia gás-líquido foi operada com didecilftalato, um solvente de polaridade

intermediária, como líquido estacionário. Se um líquido apolar, como óleo de silicone, tivesse

sido usado, o tempo de retenção para n-pentano seria menor ou maior? Explique sua

resposta.

Como o líquido estacionário didecilftalato é um solvente de polaridade intermediária, ao ser trocado

pelo óleo de silicone que é um líquido apolar, o tempo de retenção para o n-pentano seria maior, já que este

é apolar e teria maior afinidade com a fase estacionária que também é apolar.

7. Cátions inorgânicos podem ser separados por cromatografia líquida segundo sua

capacidade de formar complexos com íons cloreto. Para a separação, a fase estacionária é

saturada com água e o solvente transportador é uma solução de HCl em acetona. As

solubilidades relativas dos seguintes cloretos em ácido clorídrico concentrado são CuCl2 >

CoCl2 > NiCl2. Prediga os valores relativos do fator de retenção dos três sais.

Como se trata de uma cromatografia em papel, a fase estacionária é saturada com água que é um

solvente polar, e a fase móvel também polar, sendo formada por uma solução de HCl em acetona, o sal que

for mais solúvel em HCl apresentará menor fator de retenção, ou seja, eluirá mais. Assim, a ordem dos

fatores de retenção será:

CuCl2>CoCl2>NiCl2

8. Explique o fundamento das técnicas de cromatografia em camada delgada em escala

analítica e em escala preparativa.

A cromatografia em escala analítica trata-se da identificação e quantificação de compostos

enquanto em escala preparativa trabalha-se com purificação de compostos, separação das substâncias

indesejáveis ou dos componentes de uma mistura.

9. Uma solução diluída de β-naftol e outra de p-toluidina foram aplicadas em placas

cromatográficas de sílica gel. Os cromatogramas foram obtidos utilizando-se 3 diferentes

eluentes: cloreto de metileno puro, cloreto de metileno contendo 25% de acetato de etila e

cloreto de metileno contendo 50% de acetato de etila. Que efeito é esperado sobre os valores

de Rf dos dois compostos, considerando o aumento da proporção do acetato de etila nas

fases móveis? Justifique sua resposta.

Como a fase estacionária (sílica gel) é polar, quanto maior a polaridade do eluente, ou seja, da fase

móvel, maior o fator de retenção do β-naftol (mais polar do que a p-toluidina), portanto, ele vai eluir mais

sobre a placa cromatográfica. O contrário ocorre com a p-toluidina, que por ser menos polar, vai eluir

menos, ou seja, apresentará o menor fator de retenção.

Para as composições dos solventes dadas, a mais polar seria o cloreto de metileno contendo 50%

de acetato de etila e o menos polar o cloreto de metileno puro.

10. Um par de aminoácidos foi separado em uma coluna na qual a fase estacionária está

saturada com água e o solvente transportador é o metanol, CH3OH. Quanto mais polar for o

ácido, mas fortemente ele é adsorvido pela fase estacionária. Os aminoácidos que foram

separados nessa coluna são: (a) HOOCH(NH2)CH2OH e (b) HOOCCH(NH2)CH3. Que

aminoácido você esperaria que tivesse o maior fator de retenção? Explique seu raciocínio.

Como a fase estacionária é saturada com água, que é um solvente polar, e a fase móvel (metanol)

também é polar, o aminoácido mais polar apresentará maior afinidade pela fase estacionária, ou seja,

apresentará o maior fator de retenção e o maior tempo de eluição. Contudo, o aminoácido A apresentará o

maior fator de retenção por ser o mais polar.

11. Como é possível verificar o fim de uma reação química utilizando-se a técnica de

cromatografia em camada delgada (CCD)?

Para se verificar o fim da reação química utilizando cromatografia em camada delgada, deve-se

montar uma placa cromatográfica contendo os padrões dos reagentes separados e do produto a ser obtido

e determinar o fator de retenção correspondente a cada uma das espécies. Em seguida, acompanha-se a

reação química utilizando-se uma placa cromatográfica até que se observe a formação de um produto com

o mesmo fator de retenção do padrão que foi estudado anteriormente

12.Como é realizada a confirmação da identidade (análise qualitativa) de compostos quando a

análise emprega CLAE (Cromatografia Líquida de Alta Eficiência)?

Cromatografia Líquida de Alta Eficiência a confirmação da identidade de um composto é feita

através da comparação entre os tempos de retenção das substâncias e dos padrões, ou seja, compostos

iguais apresentam o mesmo tempo de retenção iguais.

13.Quais espécies podem ser separadas por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência, mas não

podem ser separadas por Cromatografia Gasosa?

Substâncias não-voláteis ou termicamente frágeis podem ser separadas por Cromatografia Líquida

de Alta Eficiência e não por Cromatografia Gasosa.

14.Discuta por que a combinação da cromatografia gasosa com a espectrometria de massas é

tão vantajosa.

A combinação da cromatografia gasosa com a espectrometria de massas, por ser uma técnica

hifenizada, pode ser usada para a identificação de misturas complexas, com tempos de retenção próximos.

15.Como pode ser manipulado o fator de separação na:

(a) Cromatografia gasosa?

O fator de separação pode ser manipulado na cromatografia gasosa através de variações: na

temperatura, nos tamanhos das partículas, nas composições das fases móveis e estacionárias.

(b) Cromatografia líquida?

O fator de separação pode ser manipulado na cromatografia líquida através de variações: na

pressão, nos tamanhos das partículas, nas composições das fases móveis e estacionárias.

16. Uma mistura conhecida de compostos A e B produziu os seguintes resultados da CLAE:

Composto Concentração (mg/mL) Área relativa do pico

A 1,03 10,86

B 1,16 4,37

Uma solução foi preparada através da mistura de 12,49 mg de B com 10,0 mL de uma

amostra desconhecida, contendo apenas A, e diluindo a mistura formada a 25,0 mL. Foram

observadas áreas de picos de 5,97 e 6,38 para A e B, respectivamente. Determine a concentração de

A (mg/mL) na amostra desconhecida.

17. Responda as seguintes questões:

(a) O que é cromatografia?

A cromatografia é uma técnica para analisar, identificar ou separar os componentes de uma mistura.

É definida como a separação de dois ou mais compostos diferentes por distribuição entre fases, uma das

quais é estacionária (fixa) e a outra, móvel. Essa técnica baseia-se no princípio da adsorção seletiva.

Em todas as separações cromatográficas, a amostra é transportada por uma fase móvel, que pode

ser um gás, um líquido ou um fluido supercrítico. Essa fase móvel é, então, forçada a passar através de

uma fase estacionária imiscível fixa, colocada em uma coluna ou sobre uma superfície sólida. As duas

fases são escolhidas de modo que os componentes da amostra distribuam-se entre as fases móvel e

estacionária em graus variados. Os componentes que são retidos mais fortemente na fase estacionária

movem-se mais lentamente no fluxo da fase móvel. Ao contrário, os componentes que interagem mais

fracamente com a fase estacionária movem-se mais rapidamente. Como conseqüência dessas

velocidades de migração diferentes, os componentes da amostra são separados em bandas ou zonas

discretas, que podem ser analisadas quantitativa ou qualitativamente.

(b) Descreva fase móvel e estacionária.

Fase móvel é a fase responsável por arrastar os componentes das amostras de acordo com seu

grau de afinidade. Já a fase estacionária comporta-se como um suporte para a fase móvel que deve ser de

polaridade diferente desta.

(c) Para que é utilizada a cromatografia?

A cromatografia é um método de separação que encontra aplicação em todos os ramos da ciência.

Esta técnica pode ser utilizada para a identificação ou purificação de compostos e para a separação de

componentes de uma mistura.

18.Como se classificam os métodos cromatográficos quanto à forma física, modo de separação

e segundo a fase estacionária utilizada.

Quanto à forma física:

- Cromatografia em coluna:

Cromatografia Líquida

Cromatografia Gasosa

Cromatografia Supercrítica

- Cromatografia Planar:

Cromatografia Centrífuga

Cromatografia em Camada Delgada (CCP)

Cromatografia em Papel (CP)

Quanto ao modo de separação:

- Cromatografia por Adsorção

- Cromatografia por Partição

- Cromatografia por Troca Iônica

- Cromatografia por Exclusão

Quanto à fase estacionária:

- Cromatografia por Líquida

- Cromatografia por Sólida

- Cromatografia com fases Quimicamente Ligadas

19.Como se classificam os métodos cromatográficos segundo a fase móvel empregada?

Quanto à fase móvel:

- Utilização de gás:

Cromatografia Gasosa (CG)

Cromatografia Gasosa de Alta Resolução (CGAR)

- Utilização de líquido:

Cromatografia Líquida Clássica (CLC)

Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE)

- Utilização de Gás Pressurizado:

Cromatografia Supercrítica (CSC)

20.Qual é o princípio da cromatografia em papel?

A cromatografia em papel é uma técnica de partição líquido-líquido, estando um deles fixado a um

suporte sólido. Baseia-se na diferença de solubilidade das substâncias em questão entre as duas fases

imiscíveis, sendo geralmente a água um dos líquidos. O solvente é saturado em água e a partição se dá

devido à presença de água em celulose (papel filtro). Na cromatografia em papel, uma amostra líquida fui

por uma tira de papel adsorvente vertical. A organização molecular que compõe as cadeias de celulose do

papel é polar

21.Qual o princípio da cromatografia gasosa? Como a mesma é classificada segundo a fase

estacionária?

Na cromatografia gasosa, os componentes de uma amostra vaporizada são separados em

conseqüência de sua partição entre uma fase móvel gasosa e uma fase estacionária líquida ou sólida

contida dentro da coluna. Ao realizar uma separação por cromatografia gasosa, a amostra é vaporizada e

injetada na cabeça da coluna cromatográfica. A eluição é feita por um fluxo de fase móvel gasosa inerte.

Dois tipos de cromatografia gasosa são encontrados: a cromatografia gás-líquido e cromatografia

gás-sólido. No primeiro caso, a fase móvel é um gás enquanto a fase estacionária é um líquido retido, na

superfície de um sólido inerte, por adsorção ou ligação química. No segundo caso, a fase móvel também é

um gás e a fase estacionária é um sólido que retém os analitos por adsorção física.

22.Quais as misturas que podem ser separadas por cromatografia gasosa?

Podem ser separadas por cromatografia gasosa as misturas cujos constituintes sejam termicamente

estáveis e voláteis e que dissolva, pelo menos parcialmente, no gás da fase móvel.

23.Quais as principais características de um sistema de gás de arraste em cromatografia?

O gás do sistema deve ser quimicamente inerte e apresentar alta pureza, o que evita reações

indesejáveis com o analito.

24.Diferencie coluna tubular de parede recoberta, de coluna tubular revestida com suporte.

Colunas de parede recoberta são simplesmente tubos capilares recobertos com uma fina camada

de fase estacionária. Já as colunas com suporte revestido, a superfície interna do capilar é recoberta por

um filme fino de um material suporte. Esse tipo de coluna retém, muitas vezes, mais fase estacionária do

que uma coluna revestida tendo, portanto, maior capacidade de amostra.

25.Quais as características das colunas recheadas ou empacotadas em Cromatografia Gasosa?

As colunas recheadas ou empacotadas em cromatografia gasosa são feitas de vidro, metal ou de

teflon. São densamente empacotadas com fase estacionária de material uniforme, finamente dividido ou

com suporte sólido que é recoberto com uma fina camada de fase estacionária.

26.Na cromatografia Gasosa, quais as propriedades desejáveis para uma fase estacionária

líquida?

As propriedades desejadas para uma fase estacionária líquida são: baixa volatilidade, estabilidade

térmica, inércia química e características do solventes apropriadas.

27.Se você tivesse que realizar, numa análise cromatográfica de misturas complexas

(constituintes com volatilidade muito diferentes), qual o critério você utilizaria para escolher

a temperatura do sistema?

Numa análise cromatográfica de misturas complexas, a escolha da temperatura adequada é de

fundamental importância. Como nessas misturas encontram-se compostos com diferentes pontos de

ebulição, o ideal seria aumentar gradativamente ou por etapas, a temperatura da coluna de modo que

ocorra a eluição tanto dos componentes mais voláteis quando dos menos voláteis.

28.Quais as características para um detector ideal em cromatografia gasosa?

Um detector ideal em cromatografia gasosa deve apresentar sensibilidade adequada, boa estabilidade

e reprodutibilidade, resposta linear aos solutos que se estenda a várias ordens de grandeza, faixa de

temperatura desde ambiente até, pelo menos, 400 oC, resposta rápida independente da vazão, alta

confiabilidade e facilidade de uso, similaridade de resposta a todos os solutos e não-destrutivo (não destrua

a amostra).

29.Cite as vantagens e desvantagens dos seguintes detectores:

(a) Detector por condutividade térmica

Vantagem: grande aplicabilidade geral, ampla faixa linear de resposta, simplicidade e não destrói a amostra.

Desvantagem: baixa sensibilidade.

(b) Detector por ionização em chama

Vantagem: alta sensibilidade, ampla faixa linear de resposta, baixo ruído, fácil utilização, resistência,

resposta altamente dependente da vazão.

Desvantagem: destrói a amostra.

(c) Detector por captura de elétrons

Vantagem: alta sensibilidade, seletividade para compostos que contém halogênio e muitos outros.

Desvantagem: faixa linear estreita.

(d) Detector termiônico

Vantagem: alta sensibilidade para compostos que contenham fósforo e nitrogênio, boa faixa linear.

Desvantagem: destrói o analito, não é aplicável a muitos analitos.

(e) Detector por fotoionização

Vantagem: faixa linear alta e detector mais sensível para hidrocarbonetos aromáticos e compostos

organossulfurados ou organofosforados.

Desvantagem: compostos com potenciais de ionização mais elevados não são detectados.

30.Quais as características de um HPLC?

A cromatografia líquida de alta eficiência é a mais usada de todas as técnicas analíticas de separação

devido à sua sensibilidade, fácil adaptação para medidas quantitativas apuradas, sua adequação à

separação de espécies não-voláteis ou termicamente frágeis e, acima de tudo, sua ampla aplicabilidade a

substâncias de grande interesse para a indústria, para muitos campos da ciência.

31.Descreva as características dos seguintes métodos de separação em cromatografia líquida.

(a) Adsorção ou líquido-sólida: processo baseado em interações eletrostáticas, dipolares (Van Der

Waals) ou ligações de hidrogênio, que ocorrem entre grupos ativos presentes na superfície da fase

estacionária sólida e a fase móvel.

(b) Partição: a fase estacionária é um segundo líquido que é imiscível com o líquido da fase móvel.

Quando a fase estacionária é um líquido, espalhado na superfície de um suporte sólido e inerte ou nas

paredes de um tubo, o processo é interfacial, ocorrendo por absorção ou partição, que se baseia nas

diferentes solubilidades dos componentes da amostra na fase estacionária.

(c) Troca iônica: a fase estacionária é constituída de uma matriz onde são adicionados grupos

funcionais ionizáveis. A fase móvel é geralmente uma solução iônica com propriedades tamponantes

escolhidas de forma a ser compatível com o tipo de trocador usado.

(d) Exclusão de tamanho: baseia-se em um processo puramente mecânico. A fase estacionária é uma

matriz de composição inerte, com textura, superfície e distribuição de tamanho dos poros controlados. Os

componentes presentes na fase móvel podem ser separados pela diferença de tamanho das partículas no

qual partículas menores conseguem penetrar nos poros da fase estacionária enquanto as partículas

maiores não.

32.Quais as características da fase móvel na cromatografia líquida?

A fase móvel não pode alterar a coluna, deve ser compatível com o detector, dissolver a amostra

(diluir), permitir a recuperação da amostra, ser de alta pureza e não tóxica, ter baixa viscosidade.