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Desequilíbrio de Ligação Estrutura Populacional Modelos estatísticos Referências

LGN5830 - Biometria de Marcadores GenéticosTópico 14: Mapeamento Associativo em Plantas

Antonio Augusto Franco Garciahttp://[email protected]

Departamento de GenéticaESALQ/USP

2019


Conteúdo

1 Desequilíbrio de LigaçãoIntroduçãoDefiniçõesDL: alelos de ummesmo locoDL: alelos de dois locos

2 Estrutura PopulacionalIntroduçãoCoeficiente de parentescoMarcadores Moleculares

3 Modelos estatísticosModelo estatístico I - QTLsModelo estatístico II - GSModelo estatístico III - Map. Assoc. (GWAS)

4 Referências


Introdução

Mapeamento de QTL’sZhu et al., The Plant Genome, 2008.


Introdução

Cruzamentos controlados vs grupo de genótipos

Germoplasma: coleção de indivíduos, coleta, genitores, corecollection, ...

Base mais ampla, maior possibilidade de aplicação dos resultados nalocalização de genes ou seleção assistida

http://augustogarcia.me

[email protected]


Introdução

Populações experimentais

Até momento, estudamos populações provenientes de cruzamentoscontrolados (ex: RILs, F2, RC, F1)

Buscamos marcadores ligados entre si e com QTLs.

Princípio: gametas parentais ou recombinantes (mesmo que com anecessidade de estimar a fase de ligação)

Nesses casos, as frequências alélicas/genotípicas são conhecidas apriori

Exemplo: F2

p(A) = p(a) = 1/2

AB e ab: parentais;Ab e aB: recombinantes

As frequências dos diferentes tipos é função da fração de recombinação


Introdução

Populações experimentais

Estrutura populacional: conhecida (todos pertencem a mesmapopulação)

O parentesco entre os indivíduos é sempre o mesmo

Exemplo: F2

f = 14 (genitores não aparentados)


Introdução

População qualquer, loco bialélico

No caso do mapeamento associativo (painel), é necessárioconsiderar outras situaçõesPara os genótiposAA,Aa e aa (com frequências PAA, PAa e Paa,respectivamente, é necessário investigar se há maior tendência deassociação entre os alelos

Intraloco: A-A,A-a ou a-aInterloco: A eB,A e b, a eB, a e b

Desequilíbrio de fase gamética, ou de haplótipos

Desequilíbrio de ligação: pode ser quantificado usando algumamedida de associação entre os estados alélicos de pares de locos

Pode haver desequilíbrio devido a outras causas que não a ligaçãogenética!


Definições

Desequilíbrio de Ligação (DL)(João Ricardo B F Rosa)

Definição

DL é qualquer desvio das frequências alélicas em relação às frequênciasesperadas sob independência, indicando associação preferencial entrealelos de diferentes locos numa população (Lewontin & Kojima, 1960).

Fonte: Mackay, Nature Reviews Genetics, 2001.


Definições

Desequilíbrio de Ligação (DL)

DL e Ligação Física não são sinônimos

Locos em DL podem não estar ligadosTermos mais apropriados:

Desequilíbrio Gamético; Desequilíbrio da Fase Gamética.

Locos ligados podem ou não estar em DL (função do número derecombinações)


Definições

Fatores que Afetam o DL

1 Recombinação (crossing-overs)2 Mutação3 Deriva Genética4 Seleção5 Migração6 Estrutura Populacional

População

DL entre locos ligados e não ligados

Mapeamento: DL devido à ligação


Definições



Definições


DL necessariamenteentre locos ligados!


DL: alelos de ummesmo loco

Modelo

AA Aa aa

Freq. genotípica PAA PAa Paa

Gameta A A, a a

pA = PAA +1

2PAa

pa = Paa +1

2PAa



Cruzamentos ao acaso

pA papA p2A pApapa papA p2a

PAA = p2A

PAa = 2pApa

Paa = p2a

Numa população qualquer, não sabemos se os cruzamentos ocorremao acasoÉ necessário portanto definir alguma medida que verifique se osalelos se associam ao acaso, ou se há alguma tendência deassociação preferencialEstatística: covariância (correlação)



Variância

Alelo X Freq.(j = 1) A 1 pA(j = 2) a 0 pa

E(X) =∑j

pjxj = pA.1 + pa.0 = pA

E(X2) =∑j

pjx2j = pA.(1)

2 + pa.(0)2 = pA

V (X) = E(X2)− [E(X)]2 = pA − p2A

= pA(1− pA)



Covariância

Alelo X Freq.(j = 1) A 1 pA(j = 2) a 0 pa

xixj Freq.x1 = A, x2 = A 1× 1 PAA

x1 = A, x2 = a 1× 0 PAa

x1 = a, x2 = A 0× 1 PaA

x1 = a, x2 = a 0× 0 Paa

Cov(x1, x2) = E(x1x2)− E(x1)E(x2)

= PAA − pA.pA

= PAA − p2A



Medidas de Associação entre os alelos

Cov(x1, x2) = Cov(A, a) = PAA − p2A

r(A, a) =Cov(A, a)

V (X)

=PAA − p2ApA(1− pA)



Equilíbrio de Hardy-Weinberg

Como visto anteriormente, sob H-W, PAA = p2ALogo,

r(A, a) =PAA − p2ApA(1− pA)

=0

pA(1− pA)= 0

Em outras palavras, não há associação preferencial entre os alelos, ouseja, as combinações são formadas ao acaso

Note que testar se a população está em H-W é o mesmo que testarse alelos de ummesmo loco estão correlacionados



FIS

r(A, a) é também conhecida com coeficiente de endogamiaintra-populacional

Notação: FIS , fA

fA =PAA − p2ApA(1− pA)

logoPAA = p2A + fApApa



Estimadores de máxima verossimilhança

Note que as frequências genotípicas podem ser modeladas usando adistribuição multinomial

Assim, a obtenção dos MLE’s é muito simples:

P̂AA =n1

n

P̂Aa =n2

n

P̂aa =n3

n

p̂A = P̂AA − 1

2P̂Aa

p̂a = P̂aa −1

2P̂Aa

f̂A = 1− P̂Aa

2p̂Ap̂a



Testes de hipóteses

Usualmente,H0 : fA = 0

Teste de qui-quadrado: χ2A = nf̂2

A ∼ χ2[1]

Teste exato de Fisher (amostras reduzidas)


DL: alelos de dois locos

População qualquer

Faz sentido também avaliar se os alelosA eB possuem algumaassociação

Gametas AB Ab aB abFrequências PAB PAb PaB Pab

Associações ao acaso:

pB pbpA pApB pApbpa papB papb

Note que há relação com a ideia de ligação genética, mas em umoutro contexto (haplótipos)



Medidas de associação

AleloA X Freq.(j = 1) A 1 pA(j = 2) a 0 pa

E(X) = pA

E(X2) = pA

V (X) = pA(1− pA)

AleloB Y Freq.(j = 1) B 1 pB(j = 2) b 0 pb

E(Y ) = pB

E(Y 2) = pB

V (Y ) = pB(1− pB)

XY Freq.A,B 1 PAB

A, b 0 PAb

a,B 0 PaB

a, b 0 Pab



Covariância

Cov(X,Y ) = E(XY )− E(X)E(Y )

= PAB − pApB

= DAB

Portanto

PAB = pApB +DAB

Expansão:

PAB = pApB +DAB

PAb = pApb +DAb

PaB = papB +DaB

Pab = papb +Dab



Covariância

Seguindo o mesmo raciocínio usado anteriormente:

DAB = −DAb = −DaB = Dab

Logo:

PAB = pApB +D

PAb = pApb −D

PaB = papB −D

Pab = papb +D

Obviamente:

DAB = PAB − pApB



Correlação

ComoD é uma covariância, é possível usá-la para medir também acorrelação entre os alelos:

rAB =Cov(X,Y )√V (X) V (Y )

=DAB√

pA(1− pA)pB(1− pB)

=DAB√

pApBpapb

Como em situações reais o sinal de r não tem grande importância, éusual usar r2 como medida de associação (coeficiente dedeterminação)



População F2

Relações interessantes podem ser observadas entreD e r2 com afração de recombinação (que tambémmede associação entre osalelos)Em um F2, pA = pa = 1/2 e pB = pb = 1/2

Ainda, as freq. dos diferentes gametas sãoGametas PAB PAb PaB Pab

Frequências 1−ρ2

ρ2

ρ2

1−ρ2

Assim,

DAB =1− ρ

2− 1

4=

1− 2ρ

4

rAB =1−2ρ4√

(1/4)(1/4)= 1− 2ρ

Cuidado! Em pop. naturais, o desequilíbrio pode surgir mesmo entrelocos não ligados (seleção; oscilação, migração, etc).



D′

Por ser uma covariância,D depende das frequências alélicas,dificultando comparações entre populações diferentes

Uma alternativa muito usada é fazer um re-escalonamentoconsiderando o máximo valor queD pode apresentar na populaçãoem questão

Dmin = min{−pApB ; − (1− pA)(1− pB)}Dmax = max{pA(1− pB); pB(1− pB)}

D′ = DDmax



r²,D eD′

Note que os valores necessários para os cálculos são obtidos emsimples tabelas:

A a

B n1 n2

b n3 n4

P̂AB =n1

n

p̂A =n1 + n3

n

p̂a =n2 + n4

n

p̂B =n1 + n2

n

p̂b =n3 + n4

n



Por que medir o desequilíbrio de ligação?

Extensão na população em questão

Número de marcadores para cobrir as regiões em DL

A: marcador;B: QTL (ou QTN)



Exemplo

Milho 1



Exemplo

Milho 2


Introdução

Painel (População)

Possivelmente, principal causa de DL além de ligação

No mapeamento associativo, é muito importante ter informaçõessobre a estrutura populacional existente no painel

Essa estrutura é considerada nos modelos, de forma a controlar apresença de falsos positivos

Isto ficará mais claro quando estudarmos os modelos estatístico paramapeamentoVários métodos podem ser utilizados:

Genética de populações: FIS , FST , FIT

Genealogias (coef. parentesco)Marcadores molecularesAnálises multivariadasStructure. . .


Coeficiente de parentesco

Parentesco

O coeficiente de parentesco θXY é a probabilidade de que um alelotomado ao acaso no indivíduoX seja idêntico por descendência aum alelo também tomado ao acaso no indivíduo Y

SejaX com genótipo ab e Y com genótipo cd. Então,

θXY =1

4[P (a = c) + P (a = d) + P (b = c) + P (b = d)]

Os cálculos são feitos de forma recursiva, com base nas genealogias



A B

C D

E

F

library(kinship)Genealogia <- data.frame(ind=c("A","B","C","D","E","F"),

P1=c(0,0,"A","A","A","B"),P2=c(0,0,"B","B","D","E"))

attach(Genealogia)cfam <- makefamid(ind, P1, P2)kmat <- makekinship(cfam, ind, P1, P2)detach(Genealogia)



A B

C D

E

F

> Genealogiaind P1 P2

1 A 0 02 B 0 03 C A B4 D A B5 E A D6 F B E

> kmatA B C D E F

A 0.5000 0.0000 0.25 0.2500 0.375 0.1875B 0.0000 0.5000 0.25 0.2500 0.125 0.3125C 0.2500 0.2500 0.50 0.2500 0.250 0.2500D 0.2500 0.2500 0.25 0.5000 0.375 0.3125E 0.3750 0.1250 0.25 0.3750 0.625 0.3750F 0.1875 0.3125 0.25 0.3125 0.375 0.5625


Marcadores Moleculares

Similaridade, distância genética

Obviamente, marcadores moleculares podem ser usados paraestudar a estrutura populacional e também para estimar ocoeficiente de parentesco

É importante separar identidade por descendência de identidadepor estado (várias abordagens)

Conceitos: similaridade (Jaccard, Dice,...), distâncias genéticas

Análises de agrupamentos (dendrogramas, componentesprincipais,...)

Structure



Structure

Sorgo



Componentes Principais

Arroz


Modelo estatístico I - QTLs

Modelo fixo - QTLs

F = G+ E

yj = µ+Gi + ejy = Xθ + e

Que tipo de análise é feita se o modelo considerar apenas um único i(marcador)?Único i, mas agora modelando um QTL?E se i > 1, sendo um deles um QTL e os demais marcadores?E para i > 1, apenas QTLs?


Modelo estatístico II - GS

Modelo mistoModelo infinitesimal, R. A. Fisher

F = G+ E

yi = µ+Gi + ei

Gi: múltiplos genes, todos com pequeno efeito

Você concorda que faz sentido assumir que os efeitosGi sãoaleatórios (amostra de uma população) neste cenário?

Var-cov:

Vij =

{σ2e + σ2

G se i = j

2θijσ2G se i ̸= j

Duas variâncias para estimar

Atenção especial para θij


Modelo estatístico III - Map. Assoc. (GWAS)

Artigo

Yu, J.; Pressoir, G.; Briggs, W. H.; Bi, I. V.; Yamasaki, M.; Doebley, J. F.;McMullen, M. D.; Gaut, B. S.; Nielsen, D. M.; Holland, J. B.; Kresovich, S.;Buckler, E. S.A unified mixed-model method for association mapping thataccounts for multiple levels of relatednessNature Genetics 38(2): 203-208, 2005



Contexto



Contexto

• Ideal para análise associativa: não há estrutura nem relacionamento recente

• Tempo de coalescência muito longo: MRCA muito antigo

• Pouco realístico em plantas

Relacionamento familiar intragrupo. Coancestralidade recente

Estrutura de população e relacionamento familiar em graus variados (adaptação local e seleção diversificadora). Comum em plantas

Estrutura de População

Curr Opin Biotech 17:155-160 (2006)



Cenário (a)

yi = µ+Gi + ei

yi = µ+ Sα+Gi + ei

Sα: efeito do SNP em questão (QTN, ou QTL)



Q +KCenário (c)

No mapeamento associativo (QTN’s), apenas uma pequena parte davariação é devida ao loco em questão

Caso a variação dos outros efeitos (normalmente poligenes) não sejacontrolada, há redução do poder do teste

Há ainda grande chance de detecção de falsos positivos caso aestrutura populacional não seja considerada nas análises

O modeloQ +K busca aumentar a eficiência do mapeamento nessecontexto

Q: estrutura populacional

K : parentesco (“kinship”), associada ao background genético.Indivíduos aparentados têmmaior chance de compartilhar osmesmos genes. Aleatório: cada indivíduo é uma amostra do poolgênico



Q +K

Abordagem: modelos mistosQ: inferida normalmente usando o Structure ou (mais recentemente)análise de componentes principaisK : marcadores

Modelo

y = Xβ + Sα+Qv+ Zu+ e

y: fenótipos;Xβ: efeitos fixos além do efeito do SNP e da populaçãoexperimental (delineamento);α: efeito do SNP (QTN); v: efeito (fixo) daestrutura populacional; u: efeitos (aleatórios) dos poligenes dobackground genético; e: vetor dos resíduos. V (u) = 2KVg (K : kinship).

Note que os efeitos do background genético serão incluídos namatriz de parentesco, que pode ser facilmente considerada nomodelo misto



Resultados


Principais Referências

Yu, J.; Pressoir, G.; Briggs, W. H.; Bi, I. V.; Yamasaki, M.; Doebley, J. F.;McMullen, M. D.; Gaut, B. S.; Nielsen, D. M.; Holland, J. B.; Kresovich, S.;Buckler, E. S.A unified mixed-model method for association mapping thataccounts for multiple levels of relatednessNature Genetics 38(2): 203-208, 2005

Zhu C., Gore M., Buckler E. S., Yu J.Status and Prospects of Association Mapping in PlantsPlant Genome 1: 5-20, 2008

Ersoz, E.S., J. Yu, and E.S. Buckler.Applications of linkage disequilibrium and association mapping incrop plantsGenomic assisted crop improvement: Vol. I: Genomics approaches andplatforms In R. Varshney and R. Tuberosa (ed.). Springer, 2008

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