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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS

ESCOLA DE VETERINÁRIA E ZOOTECNIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA ANIMAL

CONSTRUÇÃO E SELEÇÃO DE UMA BIBLIOTECA COMBINATORIAL DE

ANTICORPOS CONTRA HERPESVÍRUS BOVINO TIPO 1

Greice Japolla

Orientador: Guilherme Rocha Lino de Souza

GOIÂNIA

2014

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GREICE JAPOLLA

CONSTRUÇÃO E SELEÇÃO DE UMA BIBLIOTECA COMBINATORIAL DE

ANTICORPOS CONTRA HERPESVÍRUS BOVINO TIPO 1

Dissertação apresentada para obtenção

do grau de Mestre em Ciência Animal

junto à Escola de Veterinária e Zootecnia

da Universidade Federal de Goiás

Área de Concentração:

Sanidade, Higiene e Tecnologia de

Alimentos

Linha de Pesquisa:

Etiopatogenia, epidemiologia, diagnóstico e

controle das doenças infecciosas dos

animais

Orientador:

Prof. Dr. Guilherme Rocha Lino de Souza - UFG

Comitê de Orientação:

Prof. Dr.ª Wilia Marta Elsner Diederichsen

de Brito - UFG

Prof. Dr. Luiz Artur Mendes Bataus - UFG

GOIÂNIA 2014

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Dedico este árduo trabalho aos meus amados pais Osvaldo e Estela, que me

apoiaram em todos os momentos e não mediram esforços para realização dos

meus sonhos.

iv

AGRADECIMENTOS

Primeiramente a Deus, por ter trilhado e iluminado meu caminho, me

proporcionado saúde, coragem, disposição e sabedoria para que eu ingressasse

e concluísse o curso de mestrado;

Aos meus pais, Osvaldo e Estela, que sofreram com minha partida, mas nunca

deixaram de me apoiar, obrigada pela vida e por terem me proporcionado todos

os meios para meu crescimento pessoal e intelectual. Vocês são meu norte e

porto seguro, sem os quais não seria possível chegar até aqui;

A minha irmã, meu cunhado e sobrinhos, aos tios e avô, que mesmo com a

enorme saudade nunca deixaram de me apoiar, amo vocês;

Ao meu amigo, noivo e marido Lucas, que calmamente acompanhou minhas

horas de tristeza, cansaço e nunca me desanimou, sempre esteve do meu lado

apoiando. Obrigada por todo esse amor;

Ao meu orientador Prof. Dr. Guilherme Rocha Lino de Souza, pela orientação

nestes dois anos, pela paciência, dedicação e por ter me acompanhado nessa

trajetória;

À minha querida co-orientadora Prof.ª Dr.ª Wilia Marta Elsner Diederichsen de

Brito, por ceder o laboratório e também o material necessário para parte

experimental. Pelos ensinamentos não só acadêmicos, mas também de vida. Este

trabalho não seria possível sem o seu primeiro “sim”, sou eternamente grata a

você. Você foi uma mãe e sabe disso;

Ao meu co-orientador Prof. Dr. Luiz Arthur e a todos do Instituto de Ciências

Biológicas da UFG, obrigada por abrirem as portas do laboratório e por sempre

estarem dispostos a ajudar;

v

Ao laboratório de virologia do Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública da

UFG, onde as professoras Fabíola e Menira, juntamente com a funcionária Keili,

sempre estiveram dispostas a me ajudar, aprendi muito com vocês;

Ao Prof. Dr. André Kipnis, do Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública da

UFG, juntamente com seus alunos: Lazáro, Fábio, Duanne, Monalisa e Abadio

por sempre sanar as inúmeras dúvidas que foram surgindo ao longo deste

trabalho;

A todos os amigos do curso de pós-graduação, Hidelbrando, Adriana, Thelma,

Thales, Patrícia, Ana Carla, Ana Flávia, e em especial a Greyciele, obrigada pela

amizade de vocês, pela ajuda e paciência, por compartilharmos muitos bons

momentos e outros tantos de desespero e dúvidas;

Ao programa de Pós-graduação em Ciência Animal da EVZ/UFG, e aos

professores que o compõe pela disponibilização do conhecimento;

À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – Capes, pela

concessão da bolsa de estudos;

A todos que direta ou indiretamente também contribuíram para a concretização

deste trabalho, todo o meu respeito e agradecimento;

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO......................................................................................................1

2 REVISÃO DE LITERATURA................................................................................4

2.1 Características gerais dos herpesvírus..............................................................4

2.2 Estrutura viral.....................................................................................................5

2.3 Enfermidades associadas ao BoHV-1...............................................................6

2.4 Latência..............................................................................................................7

2.5 Aspectos epidemiológicos no Brasil...................................................................8

2.6 Testes Diagnósticos...........................................................................................9

2.7 Estrutura geral dos anticorpos.........................................................................13

2.8 Fragmento variável em cadeia única- scFv.....................................................15

2.9 Bibliotecas de Anticorpos Apresentadas em Fagos: Phage Display ..............16

3 OBJETIVOS........................................................................................................19

4 MATERIAL E MÉTODOS...................................................................................20

4.1 Local de desenvolvimento................................................................................20

4.2 Cultivo e Manutenção do Herpesvírus Bovino.................................................20

4.3 Imunizações das galinhas com o BoHV-1.......................................................20

4.4 Ensaio Imunoenzimático..................................................................................21

4.5 Extração de RNA total e síntese de cDNA.......................................................21

4.6 Amplificação dos fragmentos das cadeias leve (VL) e pesada (VH) de

anticorpos de galinha.............................................................................................21

4.7 Produção dos fragmentos scFv – (Overlap) ...................................................22

4.8 Digestão dos fragmentos scFv e do vetor pComb3X.......................................23

4.9 Ligação dos fragmentos de DNA scFv com o vetor pComb3X........................24

4.10 Preparação de células XL1-Blue eletrocompetentes.....................................24

4.11 Transformação de células E. coli (XL1-Blue) por eletroporação....................25

4.12 Extração de DNA fagomidial e digestão das amostras para avaliação da

variabilidade da biblioteca......................................................................................25

4.13 Expressão da biblioteca de anticorpos..........................................................26

4.14 Dot blot para análise da expressão da biblioteca..........................................26

4.15 Preparação do fago auxiliar VCSM13............................................................27

4.15.1 Obtenção do fago auxiliar...........................................................................27

vii

4.15.2 Amplificação do fago auxiliar......................................................................27

4.15.3 Determinação do título da preparação de fagos auxiliares.........................28

4.16 Expressão dos fragmentos de anticorpos scFv como proteínas de fusão na

superfície de bacteriogafos filamentos – phage display........................................28

4.17 Seleção de partículas virais (scFv fusionados) ligantes ao BoHV-1-

Biopanning.............................................................................................................29

4.18 Ensaio imunoenzimático................................................................................31

4.19 Sequenciamento das cadeias variáveis pesadas dos clones selecionados..........................................................................................................31 4.20 Análise das sequências.................................................................................32

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO..........................................................................33

5.1 Imunizações das aves com o BoHV-1.............................................................33


anticorpos de galinha e amplificação dos fragmentos scFv – (Overlap)................35

5.3 Construção da biblioteca combinatorial de anticorpos (scFv) e análise da

diversidade desta biblioteca por enzima de restrição............................................36

5.4 Dot blot para análise da expressão da biblioteca............................................37


Biopanning.............................................................................................................38

5.6 Análise da biblioteca pelo ELISA.....................................................................39

5.7 Sequenciamento das cadeias variáveis pesadas dos clones

selecionados..........................................................................................................41

6 CONCLUSÕES...................................................................................................44

REFERÊNCIAS.....................................................................................................45

viii

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1:Representação esquemática da molécula de anticorpo e seus

principais fragmentos.............................................................................................13

FIGURA 2: Representação esquemática de um fago filamentoso........................18

FIGURA 3: Representação esquemática do vetor Pcomb3X................................24

FIGURA 4: Resposta de anticorpos em soros de galinhas imunizadas com o

BoHV-1 e MEIO MEM............................................................................................33

FIGURA 5: Análise estatística dos soros pré e pós imunes e do controle

negativo..................................................................................................................34

FIGURA 6: Amplificação dos fragmentos das cadeias leve (VL) e pesada (VH) de

anticorpos de galinha.............................................................................................35

FIGURA 7: Clones digeridos com enzima de restrição BstNI................................36

FIGURA 8: Análise por dot blot dos clones expressando fragmentos scFv..........37

FIGURA 9: Seleção de fagos, expressando as diferentes formas scFvs..............38

FIGURA 10: Imunoensaio dos clones do ciclo 6 contra o hespersvírus bovino tipo

1.............................................................................................................................39

FIGURA 11: Gel de agarose 2% dos DNA extraídos dos clones do sexto ciclo de

seleção...................................................................................................................41

FIGURA 12: Alinhamento das cadeias variáveis pesadas dos clones do 6º ciclo de

seleção...................................................................................................................43

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RESUMO

O herpesvírus bovino tipo 1 (BoHV-1) é reconhecido como um importante patógeno de perdas econômicas em bovinos, causando nestes animais enfermidades conhecidas como Rinotraqueite Infecciosa Bovina (IBR), vulvovaginite pustular infecciosa, balanopostite infecciosa e desordens neurológicas. Para um efetivo controle destas enfermidades, o diagnóstico correto se faz necessário, porém nenhuma dos testes disponíveis possibilita um resultado rápido feito a campo. Considerando isto, o objetivo deste estudo foi construir uma biblioteca combinatorial de anticorpos, para que esta seja futuramente utilizada no desenvolvimento de novas abordagens diagnósticas. Duas galinhas da raça White Leghorn foram imunizadas com 105,5 DICC50/mL de BoHV-1, as aves foram necropsiadas, seus baços retirados para extração de RNA total, síntese de cDNA, amplificação dos fragmentos gênicos codificantes das cadeias leve (VL) e pesada (VH) e produção de fragmentos scF(v). Estes fragmentos foram clonados em vetores fagomidiais, expressos como proteínas de fusão em bacteriófagos filamentosos e amplificados pela infecção de bactérias E.coli. Foi realizada a seleção de partículas virais (scFv fusionados) ligantes ao BoHV-1 (biopanning) através de seis ciclos. A afinidade da biblioteca de anticorpos scFv ao BoHV-1 observada no teste de ELISA mostra que os fragmentos produzidos são reativos ao vírus, sendo possível a utilização destes anticorpos no desenvolvimento de novas plataformas de diagnóstico. Os resultados de sequenciamento mostraram uma diminuição da variabilidade em comparação ao dot blot realizado anteriormente, sendo uma característica desejável neste processo, porém não foi possível sequenciar os clones de modo eficiente, verificando-se, portanto, a necessidade de analisar de forma mais aprofundada os resultados obtidos .

Palavras-chave: imunoglobulinas, fragmento scFv, phage display.

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ABSTRACT

Bovine herpesvirus type 1 ( BHV - 1 ) is recognized as an important pathogen of

economic losses in cattle , these animals causing diseases known as infectious

bovine rhinotracheitis ( IBR ) , infectious pustular vulvovaginitis , infectious

balanoposthitis and neurological disorders . For effective control of these

diseases, the correct diagnosis is necessary, but none of the available tests

enables a quick result made the field. Considering this, the aim of this study was to

construct a combinatorial antibody library, for it to be used in the future

development of new diagnostic approaches . Two breed White Leghorn chickens

were immunized with 105.5 TCID50/ml of BoHV - 1, birds were necropsied , their

spleens removed for total RNA extraction , cDNA synthesis , amplification of gene

fragments encoding the light chain ( VL ) and heavy ( VH ) and production of scFv

( v) fragments. These fragments were cloned into vectors fagomidiais expressed

as fusion proteins on filamentous phage and amplified by infection of E. coli.

Selection of viral particles ( fused scFv) binding to the BHV -1 ( biopanning ) by six

cycles were performed. The affinity of the scFv antibody library BHV -1 observed

in ELISA shows that the produced fragments are reactive to HIV, the use of such

antibodies in the development of new diagnostic platforms is possible . The

sequencing results showed a reduction of variability in comparison to the dot blot

previously performed, and a desirable feature of this process , however, it was

possible to sequence the clones efficiently, it has been found , therefore, a need to

further analyze the shape of results

Keywords: immunoglobulins, scFv fragment, phage display.

1 INTRODUÇÃO

O Brasil é um grande produtor e exportador de carne bovina, sendo o

centro-oeste brasileiro a principal região detentora de rebanho bovino, com 34,4%

do efetivo nacional. O Estado de Goiás possui o quarto maior rebanho do País

com uma população bovina de, aproximadamente, 21 milhões de animais, cerca

de 10% do total do nacional (IBGE 2010). Estas posições são ameaçadas, pois o

rebanho bovino está exposto a agentes causadores de enfermidades que afetam

diretamente a sua produtividade, destacando-se desta forma a importância em

relação à sanidade dos animais.

Os principais microrganismos causadores de doenças nos bovinos são

bactérias, protozoários e vírus. No grupo dos vírus são encontrados os

herpesvírus causadores de diversas manifestações clínicas e consequentes

prejuízos para pecuária mundial. Estima-se que as perdas geradas por

enfermidades relacionadas aos herpesvírus alcancem um bilhão de dólares por

ano em todo o mundo (DEL MÉDICO ZAJAC et al., 2010). O herpesvírus bovino

tipo 1 (BoHV-1) pertence a família Herpesviridae, sub-família Alphaherpesvirinae,

gênero Varicellovirus. Uma das características desta família refere-se à

capacidade de estabelecer infecções latentes (THIRY et al., 2005), ou seja, o

vírus persiste no organismo do animal de forma silenciosa, não detectável por

procedimentos virológicos usuais podendo ser reativado e reexcretado

possibilitando a multiplicação viral. O BoHV-1 é um vírus neurotrópico que está

associado a uma variedade de afecções clínicas, incluindo rinotraqueíte (IBR),

conjuntivite, infecções genitais e abortos (ENGELS & ACKERMANN, 1996).

Embora existam diferenças na prevalência e incidência da infecção

pelo BoHV-1, este encontra-se presente em todos os continentes (D’ARCE et al.,

2002; GUARINO et al., 2007; FRANCO & ROEHE, 2007). Em Goiás, a primeira

identificação de anticorpos contra o vírus foi na década de 80 (ANUNCIAÇÃO et

al., 1989). Posteriormente, vários levantamentos sorológicos executados no Brasil

demostraram a alta frequência de animais soropositivos (CERQUEIRA et al.,

2000; MÉDICI et al., 2000; TAKIUCHI et al., 2001; VIEIRA et al., 2003; BARBOSA

et al., 2005; DIAS, 2006; DEL FAVA et al., 2007; SOUSA et al., 2009; AFFONSO,

2010; AMARAL, 2013; DIAS et al., 2013 ).

2

Para um efetivo controle das enfermidades causadas por esses vírus é

necessário um correto diagnóstico dos mesmos, várias técnicas de diagnóstico

vêm sendo utilizadas, incluindo entre outras, testes de isolamento viral, técnicas

sorológicas como soroneutralização e ensaio imunoenzimático (ELISA), e

técnicas moleculares como a reação em cadeia pela polimerase (PCR). Na

maioria dos laboratórios, a técnica de diagnóstico utilizada é o ensaio de ELISA

(“Enzyme-Linked Immunosorbent Assay”), no entanto, o método mais seguro para

se diagnosticar uma infecção é o isolamento e a caracterização do agente

infeccioso, porém, isto nem sempre é possível ou prático por várias razões como

pela inexistência de métodos simples, práticos ou seguros para o isolamento ou

cultivo viral (WHO & TDR, 2010). O teste de ELISA possibilita a detecção de

anticorpos contra o vírus. Algumas das desvantagens dessa técnica é a

necessidade de equipamento especializado, manipulação de reagentes e custo

de aquisição de kit, levando alguns laboratórios produzir e padronizar seu próprio

material. Outra questão seria a impossibilidade de diferenciar anticorpos

produzidos em resposta à infecção natural daqueles produzidos pela vacinação,

sendo que, a vacina é uma forma de controle do vírus e é utilizada no Brasil.

(TEIXEIRA et al., 2001; SPILKI et al., 2005; BAUERMANN et al., 2010).

A utilização de fragmentos de anticorpos no desenvolvimento de testes

diagnósticos é uma opção interessante levando em consideração os pontos

negativos apresentados por algumas técnicas. Uma tecnologia que tem

contribuído com a produção destes fragmentos é a técnica de Phage Display, que

também vem sendo amplamente utilizada na busca de peptídeos e proteínas com

diversas atividades biológicas (SOUZA, 2007; NASCIMENTO, 2009; CARDOSO,

2008; OZAKI, 2011).

A técnica de Phage Display baseia-se no desenvolvimento de uma

biblioteca de apresentação de fragmentos de anticorpos monoclonais (scFv -

single chain Fv) em bacteriofagos, a fim de se selecionar clones relevantes,

produtores de anticorpos (scFv) para o antígeno desejado. Para obtenção de

anticorpos monoclonais, as aves são bastante utilizadas por apresentarem

vantagens quando comparadas aos mamíferos, uma delas é devido a maior

facilidade de obtenção das sequencias codificadoras das regiões variáveis de

anticorpos, pois possuem apenas um gene VH e um gene VL funcional, que têm

alteradas suas sequencias internas (CDRs - Regiões Determinantes de

3

Complementariedade) pela inserção de segmentos de pseudogenes. Assim,

apenas um par de iniciadores e necessário para a amplificação dos genes

codificadores de cada cadeia de imunoglobulina (leve e pesada) e, por

conseguinte, a construcao da biblioteca de anticorpos se torna relativamente mais

simples (BARBAS et al., 2001; SOUZA, 2007).

A construção de uma biblioteca de anticorpos especifica ao BoHV-1

possibilitara a utilização desta no desenvolvimento de testes diagnósticos rápidos

para detecção de antígenos do vírus em bovinos, sendo que a detecção rápida de

animais doentes feita a campo auxiliaria no controle da enfermidade evitando

maiores prejuízos.

4

2 REVISÃO DE LITERATURA

2.1 Características gerais dos herpesvírus

Os herpesvírus fazem parte da ordem Herpesvirales, família

Herpesviridae, que se divide em três sub-famílias: Alphaherpesvirinae,

Betaherpesvirinae e Gammaherpesvirinae, englobando vírus que ocorrem em

diversas espécies animais, como moluscos, peixes, anfíbios, répteis, pássaros e

mamíferos. Diferente das outras duas sub-famílias, os alfaherpesvírus

apresentam um ciclo de replicação rápido e lítico tanto in vitro quanto in vivo, e

possuem capacidade de infectar células epiteliais e nervosas, estabelecendo

infecção latente em neurônios de gânglios do sistema nervoso (ROIZMAN et al.,

1992; DAVISON et al., 2009; ICTV, 2012). Os membros da sub-família

Betaherpesvirinae replicam lentamente, também estabelecem latência e possuem

poucos hospedeiros (ROIZMAN & KNIPE, 2001). Já os vírus da subfamília

Gammaherpesvirinae infectam linfócitos de forma lítica ou latente e alguns deles

possuem potencial oncogênico (FRANCO & ROEHE, 2007; FRANCO et al.,

2012).

Os herpesvírus que mais frequentemente infectam os bovinos são:

herpesvírus bovino (BoHV) tipo 1, BoHV-2, BoHV-4 e BoHV-5. Os tipos BoHV-1 e

5 pertencem ao gênero Varicellovirus da sub-família Alphaherpesvirinae, o BoHV-

2 pertence ao gênero Simplexvirus, também um Alphaherpesvirus e é

responsável pela mamilite herpética bovina, o BoHV-4 pertence a subfamília

Gammaherpesvirina, ao qual ainda não foi atribuído ser causa de nenhuma

patologia específica. O BOHV-5 subdivide-se em BoHV-5a, BoHV-5b e BoHV-

5na/nb e causam doenças neurológicas. O BoHV-1 tem grande impacto na

bovinocultura e subdivide-se em BoHV-1.1, BoHV-1.2a e BoHV-1.2b responsáveis

pela rinotraqueíte infecciosa bovina, aborto, vulvovaginite pustular infecciosa,

balanopostite infecciosa e desordens neurológicas. O impacto econômico traduz-

se entre outros por morte embrionária, aborto, nascimento de animais debilitados,

redução da eficiência reprodutiva de matrizes e touros, diminuição de conversão

alimentar e retardo no crescimento de animais jovens, diminuição da produção

5

leiteira (D’ARCE et al., 2002; OLIVEIRA, 2006; SILVA et al., 2007; BATISTA et al.,

2010).

Os bovinos também podem ser infectados naturalmente por outros

herpesvírus animais: o herpesvírus ovino tipo 2 (OvHV-2) e o herpesvírus

alcelafino tipo 1 (AlHV-1), agentes etiológicos da febre catarral maligna, além do

hespesvírus suíno tipo 1 (SuHV-1) causador da doença de Aujeszky/pseudoraiva.

A ocorrência destas infecções em bovinos não é alta, mas quando ocorre pode

ser fatal (DAVISON et al., 2009; FRANCO et al., 2012).

A latência é uma característica marcante dos herpesvírus, aonde o

vírus persiste no organismo do animal de forma silenciosa, não detectável por

procedimentos virológicos usuais. Durante o período de latência não ocorre à

expressão de genes virais requeridos para uma infecção produtiva, não ocorrendo

assim à produção de vírus infeccioso (PASTORET & THIRY, 1985). A reativação

viral pode ocorrer após a exposição a estímulos naturais (estresse, transporte,

parto, desmame) ou por tratamento com corticosteroides (JONES et al., 2006).

2.2 Estrutura viral

A estrutura da partícula viral do BoHV-1 consiste em um núcleo (ou

core) que contém o genoma viral contendo uma molécula de DNA de fita dupla

linear; um capsídeo icosaédrico de aproximadamente 100 a 110 nm de diâmetro

envolvendo o núcleo; uma proteica camada amorfa, chamada tegumento, que

recobre o capsídeo; e um envelope lipoprotéico contendo espículas de

glicoproteínas na sua superfície. O diâmetro dos vírions varia entre 120 e 300 nm.

(ICTVDB MANAGEMENT, 2006; FRANCO & ROEHE, 2007).

O genoma viral é constituído por uma molécula de DNA linear de dupla

fita viral, pode ser dividido em uma região longa (UL) e uma região curta (US)

cercada por duas regiões repetidas e invertidas, sendo uma interna (IR) e outra

terminal (TR) (DELHON et al., 2003). O genoma codifica em torno de 70

proteínas, entre elas as glicoproteínas inseridas no envelope viral. Essas

glicoproteínas são conhecidas como: gB, gC, gD, gE, gI, gH, gL, gG, gK e gM, na

qual apresentam diferentes funções na replicação e na interação vírus-célula

(SCHWYZER & ACKERMANN, 1996).

6

A gB e a gC são as principais glicoproteínas envolvidas no processo de

adsorção dos vírions à superfície das células hospedeiras. A gD é uma

glicoproteína essencial para a replicação viral e sugere-se que também esteja

envolvida na adsorção, penetração e fusão celular. A gC vem sendo estudada

para o desenvolvimento de testes diagnósticos, como a PCR e suas variações

(nested PCR e multiplex PCR) para a detecção de BoHV-1 ou diferenciação deste

do tipo 5. (ESTEVES et al., 2003; CLAUS et al., 2005; CLAUS et al., 2007;

ESTEVES, 2007; SILVA, 2009). Há também estudos que utilizam a gC como

antígenos, produzindo anticorpos monoclonais diferenciais entre BoHV-1.1 e

BoHV-1.2, bem como provas tipo ELISA diferenciais entre BoHV-1.1 e 1.2 e

BoHV-1 e BoHV-5 ( RIJSEWIJK et al., 1999; SPILKI et al., 2005).

A gE tem sido alvo de deleção para a produção de vacinas diferenciais

(HÜBNER et al., 2005). Através da clonagem e expressão de um fragmento da

glicoproteína E do BoHV-1 é possível a realização de testes com intuito de

diferenciação sorológica entre animais vacinados e animais infectados com o

vírus de campo (OLIVEIRA, 2012).

Para que ocorra a replicação viral, a interação de algumas

glicoproteínas com a célula hospedeira é essencial. Todo processo desta

multiplicação segue as etapas de: adsorção; penetração; transporte do

nucleocapsídeo e proteínas virais contidas no tegumento ao núcleo das células

infectadas; transcrição, replicação e síntese do DNA e proteínas virais; montagem

e preenchimento dos capsídeos e por fim liberação da progênie infecciosa. A

ocorrência destas fases garante a replicação dos vírus e a possível disseminação

das doenças (ROIZMAN & KNIPE, 2001).

2.3 Enfermidades associadas ao BoHV-1

O BoHV-1 é um vírus que está associado a uma variedade de afecções

clínicas, os isolados de campo do vírus podem ser divididos em três diferentes

genótipos: 1 (BoHV-1.1), 2a (BoHV-1.2a) e 2b (BoHV-1.2b). Esta subdivisão em

genótipos foi proposta com base em características genômicas e antigênicas.

Entretanto, associações de determinados genótipos com certos quadros clínicos

foram também evidenciadas (FRANCO & ROEHE, 2007). O subtipo 1 (BoHV- 1.1)

7

geralmente está relacionado ao grupo que causa doença respiratória clássica; o

subtipo 2a (BoHV-1.2a) abrange as cepas associadas com a rinotraqueite

infecciosa bovina/vulvovaginite pustular infecciosa (IBR/IPV) e abortos, enquanto

o subtipo 2b (BoHV-1.2b) causa vulvovaginite ou balanopostite, mas geralmente

não está associado com abortos (MILLER, 1991). A forma respiratória é

caracterizada por corrimento nasal, aumento da temperatura corporal, lesões

erosivas na mucosa nasal, rinite e dispneia, quando associada a infecção

bacteriana secundária, pode desenvolver pneumonia (TAKIUCHI et al., 2001).

Na forma reprodutiva os animais podem apresentar repetição de cio,

mortalidade embrionária, natimortos, nascimento de bezerros fracos e abortos

que leva a uma redução dos índices reprodutivos dos rebanhos infectados

(TAKIUCHI et al., 2005).

Esporadicamente, o BoHV-1 também tem sido isolado de casos de

doença neurológica (ENGELS & ACKERMANN, 1996; ROIZMAN & PELLETT,

2001; SILVA et al., 2007; HENZEL et al., 2008; BATISTA et al., 2010), relatos

recentes atribuem a ocorrência de encefalites à infecção por BoHV-1 e BoHV-

1.2b, sendo este último o menos patogênico (BATISTA et al., 2010), porém a

maioria das informações sobre enfermidade neurológica, são associadas apenas

com o herpesvírus bovino tipo 5.

O vírus pode infectar fetos, ocasionando morte fetal seguido de aborto

e infecção genital em vacas prenhas e, em bezerros pode ocorrer viremia fatal na

ausência de anticorpos maternos no leite. No caso de bovinos adultos, o BoHV-1

geralmente não causa a morte do animal (AUSTRÁLIA, 2005).

2.4 Latência

Com a recuperação dos animais, estabelece-se um quadro de latência

nos gânglios nervosos sensoriais, como o gânglio trigêmeo (no caso de infecção

respiratória) e gânglios sacrais (no caso de infecção genital) por toda a vida do

animal e, sob certas condições, reativação e reinfecção dos tecidos periféricos

podem ocorrer (ROIZMAN & PELLETT, 2001; PEREZ et al., 2002). O

estabelecimento da latência ocorre durante a infecção primária, o vírus penetra

nos gânglios regionais periféricos e é transportado por fluxo axonal retrógrado até

8

os gânglios regionais (trigêmeo e sacral). Nesta fase a excreção de genes virais é

praticamente extinta, ocorrendo somente a produção de pequenos transcritos,

denominados de “transcritos relacionados a latência” ou LRT (“latency - related-

transcripts”) (WORKMAM et al., 2011). Nesta fase ocorre a manutenção da

latência, que dura por toda vida do animal. Os LRT são transcritos

abundantemente e aparentemente não são traduzidos em proteína, a sua função

na manutenção e reativação da infecção latente permanece deconhecida,

provavelmente para manutenção, estes transcritos reprimem a expressão do gene

α, que são os primeiros transcritos a serem produzidos na replicação viral, que

posteriormente são traduzidos em proteínas α, induzindo a transcrição e tradução

do gene β envolvido na replicação do genoma viral (ROIZMAN & KNIPE, 2001;

FRANCO et al., 2012). A reativação viral pode ocorrer em resposta a estímulos

como estresse, transporte, parto, desmame ou até pela aplicação de

corticosteroides. Nesta fase há uma redução da expressão de LRT e ativação dos

genes virais (JONES & CHOWDHURY, 2008). Após este processo de reativação

os vírions são transportados de volta aos locais de replicação primária, onde

replicam e são excretados, assim o hospedeiro volta a disseminar e produzir o

vírus, sendo responsáveis pela transmissão a hospedeiros susceptíveis

(PASTORET & THIRY, 1985; DEL MEDICO et al., 2010). A ocorrência de

reativação pode ser observada com (VOGEL et al., 2003) ou sem (BELKNAP et

al., 1994) sinais clínicos mas de uma maneira geral os sinais clínicos geralmente

são mais brandos do que aqueles resultantes da infecção aguda (FRANCO et al.,

2012).

2.5 Aspectos epidemiológicos no Brasil

Embora existam diferenças na prevalência e incidência da infecção

pelo BoHV-1, este encontra-se presente em todos os continentes. No Brasil o

BoHV-1 foi isolado pela primeira vez a partir de um caso de vulvovaginite no ano

de 1978, no estado da Bahia e por MUELLER no mesmo ano a partir do rim de

um feto bovino proveniente de um matadouro em São Paulo (ALICE, 1978;

MULLER, 1978) e vem sendo diagnosticado até nos dias de hoje (SILVA et al.,

9

2007; SILVA, 2009; SILVA, 2011; AMARAL, 2013; SILVA, 2013; PIOVESAN et al.,

2013, DIAS et al., 2013).

No estado de Goiás, a primeira detecção de anticorpos para esse vírus

foi na década de 80 (ANUNCIAÇÃO et al., 1989). Posteriormente vários

levantamentos sorológicos foram realizados não só em Goiás, como em outros

estados brasileiros, apontando a presença de anticorpos para o BoHV-1 em soros

de animais de propriedades com rebanhos de leite, corte e misto, e também

animais antes do abate (CERQUEIRA et al., 2000; MÉDICI et al., 2000;

TAKIUCHI et al., 2001; VIEIRA et al., 2003; BARBOSA et al., 2005; DIAS, 2006;

DEL FAVA et al., 2007; SOUSA et al., 2009; AFFONSO, 2010; AMARAL, 2013;

DIAS et al., 2013 ).

Os bovinos são os hospedeiros naturais do BoHV-1, entretanto

anticorpos já foram encontrados em ovinos, caprinos e bubalinos de animais

infectados experimentalmente (DIEL et al., 2007).

As infecções pelo BoHV-1 podem ser transmitidas pelo contato direto e

indireto entre animais, pois o vírus é disseminado através de secreções

respiratórias, oculares e genitais, sendo excretado em grandes quantidades por

animais durante a infecção aguda. Quando presente no sêmen de touros

infectados, pode ser disseminado tanto por monta natural como por inseminação

artificial (FRANCO & ROEHE, 2007). OLIVEIRA et al., (2011) encontraram

positividade em quase 50% de amostras de sêmen colhidas nos estados do Rio

Grande do Sul e de Goiás. LACERDA, 2013 também constatou o risco da

transmissão do vírus pelo sêmen no Brasil. O vírus também já foi encontrado em

leite de vacas, sendo esta mais uma possível fonte de infecção para bezerros

(CAMPOS, 2009).

2.6 Testes Diagnósticos

A diversidade dos sinais clínicos, bem como a semelhança destes

sinais com outras doenças infecciosas e parasitárias, não permite a elaboração

de um diagnóstico clínico conclusivo da infecção ocasionada pelo vírus. Mesmo

nos casos de vulvovaginite, onde as lesões são características, o diagnóstico

baseado no exame clínico é apenas presuntivo (TAKIUCHI et. al., 2001). Assim

10

sendo, o auxilio das técnicas laboratoriais são necessárias para estabelecer um

diagnóstico preciso. Os métodos disponíveis para detecção de anticorpos ou

antígenos são: isolamento viral, testes sorológicos e testes moleculares.

O isolamento viral em cultivo celular é considerado o método de

diagnóstico etiológico padrão ouro (TAKIUCHI et. al., 2001; OLIVEIRA, 2006).

Muitos vírus, quando infectam as células, promovem sua destruição e infectam

novas células, produzindo alterações e possibilitando a visualização dessas

alterações, os chamados efeitos citopáticos (ECP) (FLORES & CARGNELUTTI,

2012). O método destaca-se pela universalidade (aplicável a quase todos os

vírus) e a obtenção do vírus viável para manutenção e posteriores estudos.

Porém o método possui desvantagens por ser uma técnica laboriosa, com alto

custo e que necessita de correto acondicionamento das amostras por depender

de partículas virais viáveis. Além disto, o tempo necessário para obtenção dos

resultados pode levar alguns dias e os tecidos podem conter enzimas que são

tóxicas para o cultivo de células (FLORES, 1999; TAKIUCHI et. al., 2001).

KUNERT FILHO, 2011 utilizou o isolamento viral em encéfalos bovinos

submetidos ao diagnóstico de raiva, na busca do BoHV-1 e também do tipo 5,

todas as amostras foram negativas, porém as mesmas amostras quando

submetidas à amplificação por “nested PCR” apontaram como positivas. Estes

resultados devem ser analisados com cautela, pois mesmo com presença do

genoma dos vírus não é possível afirmar que ambos os vírus são causadores de

encefalites devido a impossibilidade de isolar o vírus em forma infecciosa.

Apenas com a observação do efeito citopático pode não ser possível a

identificação viral, sendo necessário agregar outras técnicas como a como

imunofluorescência (IF), imunoperoxidase (IPX) e técnicas moleculares (ROEHE

et al., 1997).

Os testes sorológicos podem ser usados na pesquisa de antígenos

virais ou de anticorpos. Várias técnicas têm sido aplicadas para o diagnóstico do

herpesvírus bovino, como a imunofluorescência( IF), soroneutralização (SN) e o

teste de ELISA (“Enzyme-Linked Immunosorbent Assay") (FRANCO & ROEHE,

2007).

A imunofluorescência (IF) permite a visualização de antígenos nos

tecidos ou em suspensões celulares utilizando substâncias fluorescentes

(FLORES, 1999). A especificidade e a rapidez de obtenção dos resultados são

http://pt.wikipedia.org/wiki/Ant%C3%ADgeno

http://pt.wikipedia.org/wiki/Fluorescente

11

vantagens da técnica. No entanto o sucesso da técnica depende da correta coleta

e estocagem do material, apesar de não exigirem a infecciosidade da partícula

viral, é fundamental a integridade estrutural da partícula e das proteínas virais.

(TAKIUCHI et al., 2001; KUNRATH et al., 2004). ALKAN e colaboradores (2000)

apontaram a técnica de imunofluorescência como importante ferramenta para

detectar o antígeno do BoHV-1 em suabes. KUNRATH et al., 2004 detectaram

antígenos virais do BoHV-1 em secreções nasais de bezerros por

imunofluorescência em células descamativas e compararam o resultado com a

técnica de isolamento viral, 89,6% apresentaram resultados concordantes nos

dois testes, demostrando que a IF pode representar uma alternativa para o

diagnóstico de infecções agudas pelo BoHV-1.

Outra técnica é a soroneutralização, que detecta a presença de

anticorpos neutralizantes. Alguns autores pesquisaram métodos para a realização

do teste de soroneutralização utilizando anticorpos monoclonais no intuito de uma

técnica mais rápida e obtiveram sucesso nos resultados (KUNRATH et. al, 2004).

Outro aspecto a ser levado em consideração é o fato de existir vários subtipos de

vírus, tornando difícil a escolha de qual subtipo utilizar para realização do teste.

Com relação a este fato, estudos comprovaram que existe variação na detecção

de soros positivos dependente da amostra viral utilizada, podendo alterar a

sensibilidade da técnica. Para a otimização da técnica HOLZ, 2008 realizou uma

investigação constatando que a utilização de apenas um subtipo viral nos testes

pode prejudicar a detecção de animais soropositivos, comprometendo programas

de controle. Ao utilizar apenas um cepa viral a sensibilidade mostrou-se reduzida.

Porém, quando o teste foi realizado com seis cepas virais (entre tipos e subtipos),

a sensibilidade apresentou-se bastante elevada e viável para utilização em

estudos soroepidemiológicos.

Geralmente é utilizado somente uma amostra viral para realização da

SN, sendo que o uso de várias amostras demonstrou melhorar a sensibilidade do

teste. (HOLZ et al., 2009, VARELA et al., 2010; HOLZ et al., 2010). Para

minimizar o risco da introdução de animais infectados em rebanhos, os testes

sorológicos devem ser sensíveis o suficiente para evitar resultados falso-

negativos.

O teste sorológico imunoenzimático conhecido como ELISA é bastante

utilizado, sendo uma técnica sensível e especifica, é aplicado para detectar

12

antígenos ou anticorpos, com base em interações anticorpo-antígeno, estando

disponíveis comercialmente testes que visam a detecção de anticorpos. No caso

do BoHV-1 que causa infecções persistentes, a detecção de anticorpos indica a

condição de portador, podendo ser utilizada para a detecção individual ou do

rebanho em estudos de monitoramentos epidemiológicos (FLORES &

CARGNELUTTI, 2012).

A técnica apresenta vantagens em comparação a SN, permitindo o

processamento de um grande número de amostras, é também de relativa

facilidade e de rápida execução. Uma das principais desvantagens dessa técnica

é que o uso destes testes é dificultado pelo custo de aquisição de kit para

realização do ELISA, em virtude disto alguns laboratórios produzem e padronizam

seu próprio material (TEIXEIRA et al., 2001; SPILKI et al., 2005; ESTEVES,

2007).

Outro aspecto a ser levado em consideração é a incapacidade de

diferenciação sorológica entre os animais vacinados e os naturalmente infectados.

Devido a isso, vacinas diferenciais com deleção da glicoproteína E (gE) têm sido

desenvolvidas. Na vacina o gene está deletado, desta forma, apenas animais

naturalmente infectados irão apresentar o antígeno da gE (BRUM et al., 2010;

OLIVEIRA, 2012). A utilização de testes diagnósticos capazes de diferenciar a

produção de anticorpos vacinais dos induzidos pelo vírus de campo são

necessários quando utilizadas estas vacinais. Esta diferenciação pode se

realizada por um teste de ELISA que detecta anticorpos contra a proteína ausente

no vírus vacinal (gE), mas presente no vírus de campo (OLIVEIRA, 2012).

Na Europa, há algum tempo já se utiliza testes de ELISA para detecção

da gE, devido ao uso de vacinas com vírus com deleção da gE (MUYLKENS et

al., 2007), no Brasil, OLIVEIRA et al., 2013, desenvolveram um teste diferencial

de ELISA com esta finalidade que foi capaz de diferenciar sorologicamente

animais vacinados com a cepa gE deletada do herpesvírus bovino tipo 5 dos

animais experimentalmente infectados com BoHV-1 ou BoHV-5. Apesar da

padronização da técnica por alguns autores do Brasil, o teste não é

comercializado, e as vacinas diferenciais não estão disponíveis no país.

Visando a detecção do genoma viral, a técnica molecular conhecida

como reação em cadeia da polimerase (PCR) tem bastante utilidade, apresenta

elevados índices de sensibilidade e especificidade, além da rapidez de execução

13

(ESTEVES, 2007). Existe uma ampla variedade de amostras biológicas que

podem ser utilizadas no diagnóstico, contendo partículas virais viáveis e não

viáveis, sendo que a técnica possibilita a detecção de partículas virais latentes,

pois a análise é feita por meio da identificação do genoma viral, o que confere a

técnica com de extrema importância nos casos de latência. Também pode ser

realizada em tecidos parafinizados, permitindo estudos retrospectivos (TAKIUCHI

et al., 2001, ARRUDA et al., 2010; FINO et al., 2012).

Vários protocolos de PCR (ESTEVES, 2007; FIGUEIREDO, 2009), e

suas variações como a nested PCR (CAMPOS, et al., 2009) e multiplex-PCR

(CLAUS et al., 2005; ARRUDA et al., 2010; FONSECA Jr. et al., 2011) vêm sendo

desenvolvidos e padronizados para identificação do BoHV-1.

2.7 Estrutura geral dos anticorpos

Os anticorpos ou imunoglobulinas fazem parte do sistema imune dos

vertebrados, sendo capazes de reconhecer, localizar e ligar-se a antígenos

específicos com intuito de inativar ou elimina-los. Sua produção é restrita aos

linfócitos B, existindo cinco classes de imunoglobulinas (IgM, IgG, IgA, IgD e IgE)

(MARANHÃO & BRIGIDO, 2001).

A molécula de imunoglobulina apresenta estrutura básica, simétrica,

apresentando forma de Y e pode ser caracteristicamente separada em duas

cadeias pesadas idênticas e duas cadeias leves idênticas. (MARANHÃO &

BRIGIDO, 2001). Tanto as cadeias leves quanto as cadeias pesadas possuem

regiões aminoterminais variáveis e regiões carboxiterminais constantes. A cadeia

leve é composta por uma porção variável (VL do inglês Variable Light) e uma

porção constante (CL do inglês Constant Light), e a cadeia pesada é composta de

uma porção variável (VH do inglês Variable Heavy) e três ou quatro porções

constantes, dependendo da classe de imunoglobulina, chamadas de CH (do

inglês Constant Heavy) CH1, CH2, CH3 e CH4 ( Figura 1). As cadeias pesadas e

leves são unidas entre si por pontes dissulfeto, essas pontes variam de acordo

com o tipo de anticorpo e a espécie que os produziu (PAUL, 2003; MAK &

SAUNDERS).

14

Figura 1- Representação esquemática da molécula de anticorpo e seus principais

Fragmentos. Fonte: Adaptado de MARANHÃO & BRIGIDO (2001).

A justaposição das regiões variáveis de ambas as cadeias forma os

dois sítios de ligação ao antígeno (região Fab- fragment antigenbinding),

enquanto as regiões constantes (Fc- fragment cristallizable) são separadas do

local de ligação ao antígeno e não participam do seu reconhecimento. Regiões

aminoterminais dos domínios variáveis nas cadeias leve (VL) e pesada (VH)

constituem a região variável (Fv) e representam os pontos de ligação aos

antígenos. Cada domínio variável (V) possui três regiões que são hipervariáveis

em suas seqüências de aminoácidos, e ocorrem em forma de loops. Estes loops

hipervariáveis, denominados regiões determinantes de complementariedade

(CDRs), são os principais responsáveis pelo reconhecimento antigênico e, em

conjunto, formam o paratopo do anticorpo. Os resíduos de aminoácidos presentes

nas regiões variáveis, porém fora das CDRs, são enovelados de forma a dar

suporte aos loops, assim, estes resíduos apresentam a função de manter cada

loop em posição adequada para interagir com o antígeno (KIM et al., 2005).

15

2.8 Fragmento variável em cadeia única- scFv

A molécula de anticorpo intacta possui aproximadamente 150 kDa,

uma molécula grande, estimulando pesquisadores a desenvolveram métodos

para criação de fragmentos de anticorpos – scFv (single-chain variable fragment)

para utilização em vários fins, como por exemplo no diagnóstico e tratamento de

doenças. Os primeiros scFvs foram desenvolvidos independentemente por

HUSTON et al., (1988) e BIRD et al., (1988) e foram originalmente derivados de

genes isolados de linhagens celulares de hibridomas. Os fragmentos de

anticorpos scFv são moléculas de 26 a 28 quilodalton (kDa), compostas pelas

cadeias VH e VL unidas por um peptídeo conector flexível (MAYNARD &

GEORGIOU, 2000). Os peptídeos conectores que ligam as cadeias VH e VL são

usualmente compostos por 10 a 25 aminoácidos, sendo o decapeptídeo

(Gly4Ser)3 o mais comum deles. As regiões variáveis podem ser conectadas no

sentido VH-conector-VL ou VL-conector-VH e a orientação das cadeias no scFv

pode afetar a eficiência da expressão, a estabilidade e a capacidade de ligação

do mesmo ao antígeno (DESPLANCQ et al., 1994; MERK et al., 1999; LEONG &

CHEN, 2008; WEISSER & HALL, 2009).

Os fragmentos scFv quando comparados com moléculas de anticorpos

inteiras, apresentam várias vantagens atribuídas ao tamanho reduzido e a

ausência da porção Fc, contribuindo na diminuição de ligação em alvos

inespecíficos. Outros aspectos positivos da utilização destes fragmentos são: a

maior facilidade de manipulação gênica, alta capacidade de penetração em

tecidos e tumores, curto tempo de circulação e rápida eliminação do organismo,

facilitando a administração em radioimunoterapias e desintoxicação de drogas

(LEONG & CHEN, 2008). Quando selecionados para fins diagnósticos, estes

fragmentos apresentam-se bastante eficientes, podendo ser fusionados com

fosfatase alcalina, proteínas fluorescentes e estreptoavidina, desenvolvendo

reações em menor tempo quando comparadas com moléculas inteiras fusionadas

com as mesmas substancias, pois a detecção do antígeno é feita diretamente

com a molécula marcada, diminuindo o número de incubações e reagentes

utilizados (PETRENKO & SOROKULOVA, 2004; CONROY et al., 2009)

Estudos demonstram a produção de scFv contra vários patógenos e

finalidades, como no diagnóstico hepatite B (SANCHEZ et al., 1999), da raiva

16

(RAY et al., 2001), detecção de metabólitos de drogas (MOGHADDAM et al.,

2003) e príons (NAKAMURA et al., 2004), detecção de poluentes orgânicos

(BROMAGE et al., 2007), análise de qualidade na indústria alimentícia (VICO et

al., 2010) para seleção e caracterização de antígenos do carrapato bovino-

Boophilus microplus visando posterior desenvolvimento de novas vacinas conta o

parasita (SOUZA, 2007), contra o parvovírus canino-2 (BATISTA, 2008), seleção

de clone scFv neutralizante de toxinas presentes na peçonha de Bothrops

pauloensis (CARDOSO, 2008), para seleção e caracterização de scFv ligante a

proteínas intestinais de diatraea saccharalis (NASCIMENTO, 2009), na detecção

do vírus da bronquite infecciosa aviária e diferenciação de estirpes variantes

desse vírus (FERNANDES et al., 2010) e contra toxina termo-lábil Escherichia coli

enterotoxigênica (OZAKI, 2011).

2.9 Bibliotecas de Anticorpos Apresentadas em Fagos: Phage Display

Em 1985, SMITH estabeleceu um método para exibir polipeptídeos na

superfície de bacteriófagos filamentosos. A técnica conhecida como Phage

Display baseia-se na tecnologia do DNA recombinante, que conduz a criação de

uma biblioteca de apresentação de fragmentos de anticorpos monoclonais de

cadeia única (scFv) ou peptídeos em bacteriófagos, para seleção de clones

relevantes, produtores de anticorpos scFv para o antígeno desejado (SMITH ,

1985; SCOTT & SMITH, 1990)

Para que todo este procedimento de construção de biblioteca de

anticorpos seja realizado através da técnica de Phage Display, é necessária a

imunização dos hospedeiros com o antígeno de interesse, induzindo a produção

de anticorpos específicos e aumentando significativamente as chances de

sucesso da seleção (BURTON et al., 1991). O repertório da biblioteca é

geralmente criado a partir de RNAs codificantes de imunoglobulinas obtidos de

humanos (DOUGUCHI et al., 2009), coelhos (RADER, 2009), camelídeos

(ARBABI-GHAHROUDI et al., 2009), camundongos (MAKVANDI-NEJAD et al.,

2010) e galinhas (NAKAMURA et al., 2004) e os transcritos são extraídos de

órgãos produtores de linfócitos B, como baço, medula óssea e amídalas, ou ainda

17

de células do sangue periférico (SOUZA, 2007; SCHOFIELD et al., 2007; JUNG et

al., 2008; CHEN et al., 2008; URUSHIBATA et al., 2010).

Basicamente a técnica se refere à exposição de moléculas na

superfície de vírus bacteriófagos e à seleção destas com base na sua afinidade

por uma molécula-alvo (BENHAR, 2001). Os primeiros fragmentos de anticorpos

expressos em fagos ocorreram na década de 90 (McCAFFERTY et al., 1990).

Os bacteriófagos utilizados são na grande maioria da família Inoviridae

(M13, fd, f1) (SIDHU, 2001), vírus bacteriófagos filamentosos que parasitam

bactérias gram-negativas que possuem o pílus F(Figura 2) (BRÍGIDO &

MARANHÃO, 2002; RUSSEL et al., 2004). O vírus aproveita a maquinaria de

replicação, transcrição e tradução da bactéria para se reproduzir. O bacteriófago

M13 não provoca lise na célula hospedeira, mas induz um estado no qual a célula

infectada origina e libera partículas virais, causando uma queda na taxa de

reprodução bacteriana (AZZAZY & HIGHSMITH, 2002; MCAULIFFE et al., 2007).

Estes bacteriófagos são compostos por uma fita simples e circular de DNA de

cerca de 6400 bases, envolta em um capsídeo composto pelas proteínas pIII, pVI,

pVII, pVIII e pIX (SMITH & PETRENKO, 1997), e as mais empregadas para

apresentação de moléculas são as pVIII e pIII, sendo que das cinco, a pVIII

apresenta 2800 cópias e a pIII apresenta cinco cópias. (RUSSEL et al., 2004).

Neste sistema, o gene codificador da proteína de interesse é geralmente

fusionado a um dos genes destas duas proteínas da capa protéica do fago

(PHIZICKY & FIELDS, 1995). A pVIII é a principal componente da partícula viral ,

formando o corpo cilíndrico do vírus. A proteína pIII tem papel fundamental na

reprodução viral, pois é ela a responsável pela ligação do fago ao pilus sexual da

célula bacteriana.

Neste sistema é possível o uso de fagomídeos como alternativa prática

ao uso e manipulação do DNA viral para expressão de anticorpos recombinantes.

Fagomídeos são plasmídeos que possuem origem de replicação bacteriana,

origem de replicação viral, gene de fusão (pIII ou pVIII), sítio de inserção do

fragmento codificante do anticorpo ou qualquer outra proteína de interesse e

genes de resistência a antibióticos para seleção em meio apropriado. Porém os

fagomídeos não possuem todas as proteínas necessárias para a encapsidamento

da partícula viral, desta forma, é necessário o acréscimo nas culturas de células

transformadas com o fagomídeo de fagos auxiliares (helper) contendo todos os

18

genes dos bacteriófagos, codificando assim, todas as proteínas virais

indispensáveis à replicação. Durante a infecção viral o DNA proveniente dos

fagomídeos é preferencialmente revestido pelas proteínas estruturais, pois os

fagos helper (fagos auxiliares) possuem mutações na origem de replicação,

dificultando sua reprodução e empacotamento de seu próprio material genético

(BARBAS et al., 2001).

Figura 2:

Representação esquemática de um fago filamentoso.

Partícula viral com as proteínas pIII, pVI, pVII, pVIII e

PIX com ênfase no fragmento scFv fusionado ao

fago.

19

3 OBJETIVOS

Com o presente estudo objetivou-se:

Construir uma biblioteca de anticorpos (scFv) apresentada em fagos

(Phage Display) a partir de galinhas imunizadas com herpesvírus bovino

tipo 1 (BoHV-1).

Selecionar os anticorpos específicos ao vírus para que estes possam ser

utilizados no desenvolvimento de testes diagnósticos.

Avaliar os clones reativos ao BoHV-1.

20

4 MATERIAL E MÉTODOS

Para a construção da biblioteca foram utilizados kits e suas

recomendações, e os protocolos de produção com algumas modificações de

BARBAS et al., 2001 e RADER et al., 2000.

4.1 Local de desenvolvimento

O estudo foi desenvolvido na Universidade Federal de Goiás, no

Instituto de Ciências Biológicas 2 (ICB 2) e no Instituto de Patologia Tropical e

Saúde Pública (IPTSP).

4.2 Cultivo e manutenção do herpesvírus bovino tipo 1

Os procedimentos de multiplicação, manutenção e quantificação do

BoHV-1 foram realizados utilizando células “Madin-Darby bovine kidney” (MDBK)

cultivadas em meio essencial mínimo- GIBCO® (MEM) suplementado com soro

fetal bovino 10%- GIBCO® e antibiótico- estreptomicina (10.000 ug/ml) e

penicilina (10.000 Units/ml)- GIBCO®. A titulação viral foi realizada pelo método

de Späerman-Kärber (THRUSFIELD, 1997).

4.3 Imunizações das galinhas com o BoHV-1

Duas galinhas de três semanas de idade, da raça White Leghorn foram

imunizadas com 0,5ml de uma suspensão de BoHV-1 a uma concentração de

105,5 DICC50/mL e em uma galinha foi inoculado apenas meio MEM – meio

essencial mínimo - Gibco®, como controle. As aves foram mantidas em gaiolas do

aviário da Universidade Federal de Goiás, supridas com ração própria para a

idade, assim como água foi fornecida a vontade. O esquema de imunização

seguiu o método descrito por BARBAS et al. (2001). Foi coletado soro pré-imune

21

das três aves e realizadas quatro imunizações por via intramuscular em intervalos

de 15 dias e a coleta de soro foi realizada na quarta semana das imunizações

para avaliação por imunoensaios (ELISA) do título de anticorpos específicos.

4.4 Ensaio imunoenzimático

Para o teste de ELISA, placas de microtitulação de alta afinidade

(NUNC) foram sensibilizadas com 100µl de vírus a concentração de 105,5

DICC50/mL, diluído em tampão carbonato/ bicarbonato, durante toda a noite a

4°C. Em seguida, as placas foram bloqueadas com tampão de bloqueio (tampão

carbonato/bicarbonato, leite desnatado 1%), para posterior adição das amostras

de soro das galinhas antes e após as imunizações e soro controle sendo

incubadas por 1 hora a 37°C. Após esse período, as placas foram lavadas 5

vezes com PBST 0,5% e adicionado o 50µl de conjugado (anti IgY de galinhas

marcado com peroxidase) diluído em tampão de bloqueio, durante 1 hora a 37°C.

A reação foi revelada pela adição de substrato enzimático contendo o-

fenilenodiamino (OPD). Após a constatação da reação medida visualmente entre

as reações positivas e controles negativos (cerca de 20 min após a colocação do

substrato OPD) a reação foi interrompida com ácido sulfúrico e efetuada a leitura

a 492 nm em leitor de microplaca (Flow Titertek Multiskan Plus - USA).

Verificado um título satisfatório (acima de 1:2000), as galinhas foram

sacrificadas, seus baços retirados e imediatamente acondicionados em

recipientes com nitrogênio líquido e posteriormente em ultrafreezer a uma

temperatura de – 80ºC até sua utilização.

4.5 Extração de RNA total e síntese de cDNA

Os baços das aves foram macerados em cadinho com nitrogênio

líquido e imediatamente transferidos para tubos Falcon contendo Trizol. A

extração de RNA total dos baços foi realizada conforme protocolo descrito pelo

fabricante (Invitrogen). Após a extração, o RNA foi quantificado, aliquotado,

analisado quanto a sua qualidade, em gel de agarose 2% e armazenado a –

80ºC.

22

Aproximadamente 60g/l de RNA total foram utilizados para a síntese

de cDNA pelo kit Acess Quick RT-PCR system (Promega) e oligo(dT)12-18

(invitrogen), de acordo com o protocolo descrito pelo fabricante. As condições

para a reação no termociclador foram otimizadas em 70ºC por 10 min, 4ºC por 1

min, adição da enzima transcriptase reversa (AMV) e continuação do ciclo por 1h

a 48ºC. O produto foi mantido a -20ºC.


anticorpos de galinha

Para amplificação dos fragmentos de DNA das cadeias leves e

pesadas dos anticorpos, foram realizadas cinco reações utilizando 10 μL de cDNA

como molde. Cada reação terá um volume final de 50 μL (10 μL de tampão de

PCR 10X, 8 μL de dNTPs 2,5 mM e 0,5 μL de Taq DNA polimerase 5U/ μL) com

60 pmoles dos pares de oligonucleotídeo para amplificação dos genes VH e VL

respectivamente: CSCVHo-F (senso)

5’GGTCAGTCCTCTAGATCTTCCGCCGTGACGTTGGACGAG3’ CSCG-B

(reverso)5’CGTGCCGGCCTGGCCACTAGTGGAGGAGACGATGACTTCGGTCC

3’ CSCVK (senso) 5'GTGCCCAGGCGGCCCTGACTCAGCCGTCCTCGGTGTC3'

CKJo-B (reverso) 5'GGAAGATCTAGAGGACTGACCTAGGACGGTCAGG3'. As

reações foram otimizadas em termociclador inicialmente utilizando 94ºC durante 5

min; 30 ciclos de: 94ºC durante 45s; 56ºC durante 1 min; 72ºC durante 2 min e

uma extensão final: 72ºC durante 10 min. Os fragmentos de DNA

correspondentes aos genes VH e VL foram purificados utilizando o kit Wizard SV

Gel up-System (Promega). As amostras eluídas e purificadas do gel foram

quantificadas em gel de agarose 1% utilizando um marcador padrão (Low DNA

Mass ladder - Invitrogen).

4.7 Produção dos fragmentos scFv – (Overlap)

Overlap definido como a sobreposição dos fragmentos VH e VL e

posterior amplificação do fragmento unido (scFv) só é possível pelo fato de os

23

iniciadores utilizados na amplificação dos fragmentos variáveis possuírem uma

“cauda” complementar entre os fragmentos, formando um peptídeo conector

(linker), permitindo sua ligação. Um novo par de oligonucleotídeos externos foi

utilizado para a amplificação do scFv. Dez reações de PCR foram realizadas para

um volume final de 50 μL contendo os seguintes componentes: 200ng de VH e VL

purificados, 60 pmoles de oligonucleotídeos CSC-F (senso) 5'

GAGGAGGAGGAGGAGGAGGTGGCCCAGGCGGCCCTGACTCAG 3' e CSC-B

(reverso)5'GAGGAGGAGGAGGAGGAGGAGCTGGCCGGCCTGGCCACTAGTG

GAGG 3', 10 μL de tampão de PCR 10X, 8 μL de dNTPs 2,5 mM, MgCl2 50 mM,

0,5 μL de Taq DNA polimerase 5 U/μl e água MilliQ q.s.p 50 µl. As reações de

PCR foram conduzidas em termociclador com as seguintes condições: 94ºC

durante cinco minutos; 25 ciclos de: 94ºC durante um minuto; 56ºC durante um

minuto; 72ºC durante 1,5 segundos e extensão final: 72ºC durante 11 minutos.

Os fragmentos scFv amplificados foram visualizados em gel de

agarose 1%, purificados utilizando o kit Wizard SV Gel up-System (Promega),

quantificados em nanodrop 2000 Thermo Scientific®.

4.8 Digestão dos fragmentos scFv e do vetor pComb3X

Os fragmentos scFv e o vetor pComb3x (fagomídeo) foram digeridos

separadamente em duas reações, cada uma contendo 15 unidades de enzima Sfi

I (20 U/μL - Biolabs) para cada 1 μg de DNA e tampão NEBuffer 2, em

concentração final de 1X e água destilada autoclavada q.s.p. 50 µl. As reações

foram incubadas a 50ºC durante 16 horas, e em seguida analisadas em gel de

agarose. Os fragmentos digeridos foram purificados do gel utilizando o

NucleoSpin ® (Macherey-Nagel), seguido de quantificação em nanodrop 2000

Thermo Scientific®. A Figura 3 demonstra o esquema do vetor fagomidial

pComb3X.

24

Figura 3:

4.9 Ligação dos fragmentos de DNA scFv com o vetor pComb3X

Após a digestão separada do scFv e do vetor, eles foram ligados

seguindo as condições: 20ng de pComb3X digerido com Sfi I, 18 ng de scFv

digeridos com Sfi I, 2 L de tampão da enzima 5X (Promega), 0,5L de T4 DNA

Ligase (Promega 3U/L) e água MilliQ q.s.p para 20L. As reações foram

incubadas a 16ºC durante 20 horas. Cinco sistemas de ligação idênticos foram

realizados para aumentar a variabilidade da biblioteca. As amostras foram

armazenadas no freezer -20°C para posterior transformação de células

competentes- E. coli XL1-Blue.

4.10 Preparação de células XL1-Blue eletrocompetentes

Uma colônia de células XL1-Blue foi isolada e inoculada em 10 mL de

meio SB contendo tetraciclina (20 μg/mL), este pré-inóculo foi incubado a 37ºC

durante a noite, sob agitação de 230 rpm. Foi inoculado 5 mL do pré-inóculo em

500 mL de meio SB contendo e incubado a 37ºC sob agitação de 250 rpm até

D.O.600nm de 0,6. Os frascos foram resfriados no gelo durante 15 minutos e a

cultura foi centrifugada a 5000 rpm durante 20 minutos a 4ºC. O sobrenadante foi

Representação esquemática do vetor Pcomb3X. (H6) região com seis

histidinas utilizada para purificação do fragmento em coluna de Niquel.

(HA) epítopo de hemaglutinina que possibilita a detecção por anticorpos

anti-HA, Códon âmbar (TAG) que dependendo da linhagem bacteriana

utilizada permite a produção do fragmento scFv solúvel. Fonte: SOUZA,

2007.

25

descartado e os sedimentos ressuspendidos em 20 mL de glicerol 10% gelado. A

suspensão de células foi centrifugada a 7000 rpm durante 15 minutos a 4ºC e o

sobrenadante descartado. Os sedimentos foram submetidos a mais duas

lavagens com 20 mL de glicerol 10% gelado. Após a terceira lavagem, as células

foram ressuspendidas no volume residual de glicerol e aliquotadas em volume de

50 μL e transferidas para microtubos novos e estéreis. As alíquotas foram

congeladas em banho de álcool e gelo seco e estocadas a -80ºC até serem

utilizadas para eletroporação e para os experimentos de seleção.

4.11 Transformação de células E. coli (XL1-Blue) por eletroporação

Para a transformação das células, 2 μL do sistema de ligação foi

misturado a 50 μL de células competentes. Em seguida, a mistura foi transferida

para uma cubeta de 0,2cm (Biorad®) previamente resfriada em gelo e submetida

ao choque no eletroporador com os seguintes parâmetros elétricos: 2,5 kV, 25 μF

e 200 Ω. O esperado nessas condições é entre 4,0 e 5,0 milisegundos. Após a

eletroporação, as células foram recuperadas, imediatamente, em 1 mL de meio

SOC, transferidas para um tubo Falcon de 50 mL estéril e incubadas a 37ºC sob

agitação de 250 rpm durante 1 hora. Diluições desta cultura foram semeadas em

placa de petri com meio LB ágar contendo carbenicilina 100 μg/mL para a

determinação da eficiência de transformação.

4.12 Extração de DNA fagomidial e digestão das amostras para avaliação da

variabilidade da biblioteca

Foram utilizadas 15 colônias da etapa anterior e a extração de DNA

fagomidial foi realizada utilizando o Qiaprep Spin Mini Kit. Para digestão das

amostras foi utilizado 5U- 0,5 µl de enzima BstNI (New England Biolabs®, sítio de

restrição: CCWGG), tampão- 2,4µl, BSA- 0,25µl, amostra- 1µl, e água

autoclavada 11,85µl com incubação de 2 horas a 60°C.

26

4.13 Expressão da biblioteca de anticorpos

Foi inoculado 10ml de meio SB com 200 µl da biblioteca de anticorpos

acrescido de 50 μg/mL de carbenicilina com agitação de 250 rpm a 37 ºC por 12-

14 h. Após a incubação foi transferido 10 mL da cultura para 300 mL de meio SB

+ carbenicilina + 6 ml de MgCl2 1M e incubados a 37ºC com agitação de 250 rpm

por 8 horas. Foi adicionado 800µl de IPTG 0,5M e incubados 12 horas a 37°C. A

cultura foi centrifugada por 30 minutos a 3000xg em 4°C. O pellet foi

ressuspendido em 1 ml de PBS 1X, coloca em novo frasco e sonicado em

sonicador de células (Sonics Vibra Cell, Sonics & Materials, VCX 500), no gelo

durante 3 minutos. O material foi centrifugado a 14000 rpm durante 30 minutos a

4°C e o sobrenadante transferido para tubo limpo.

4.14 Dot blot para análise da expressão da biblioteca

Para analisar a expressão da biblioteca foi realizado um ensaio de dot

blot. Para isso, uma membrana de nitrocelulose 0,45 μm (Hybridization transfer

membranes Amersham Biosciences) foi pipetada com 5μL do BoHV-1 e 5 μL da

cultura da biblioteca, deixado secar a temperatura ambiente. Em seguida, a

membrana foi bloqueada com uma solução de BSA 3% em PBS e incubada a 4ºC

sob agitação, durante a noite. A membrana foi lavada, rapidamente, 3 vezes com

PBST 0,05%, imersa com o sobrenadante da biblioteca de anticorpos scFv

sonicado na etapa anterior e deixado a temperatura ambiente por 2 horas. A

membrana foi imersa em uma solução contendo o anticorpo primário (coelho- IgG

anti-HA), diluído 1:1000 em PBS e incubada durante 2 horas a temperatura

ambiente, sob agitação. Em seguida, a membrana foi lavada três vezes,

rapidamente, com PBST e incubada com o anticorpo secundário (anti IgG de

coelho conjugado com fosfatase alcalina), diluído 1:000 em PBS. A membrana foi

lavada 3 vezes com PBST e 1 vez com APB (tampão da fosfatase alcalina). O

ensaio foi revelado com o substrato NBT/BCIP. Para parar a reação, a membrana

foi lavada em água corrente.

27

4.15 Preparação do fago auxiliar VCSM13

4.15.1 Obtenção do fago auxiliar

Foram inoculadas 5 μL de células XL1- Blue competente em 5 mL de

meio SB contendo tetraciclina 20 μg/mL, incubado a 37ºC sob agitação até atingir

D.O.600nm entre 0,6–1,0. Em seguida, foram feitas alíquotas de 50 μL de células

em microtubos, adicionado 1 Μl (1x1011ml) de fagos auxiliares diluídos (10-6, 10-7

e 10-8), para garantir a formação de placas de lises isoladas, e incubados durante

15 minutos a temperatura ambiente. Os 50 μL da cultura foram adicionados em 3

mL de meio LB top ágar liquefeito (50ºC) e vertido em uma placa de petri

contendo LB ágar. As placas foram Incubadas a 37ºC durante a noite e no dia

seguinte à incubação observou-se a formação de placas de lise.

4.15.2 Amplificação do fago auxiliar

Para a amplificação das placas de lise, foram inoculados 10 μL de

células XL1-Blue competente em 10 mL de meio SB pré-aquecido a 37ºC,

contendo tetraciclina 10 μg/mL, em um tubo Falcon de 50 mL e incubado a 37ºC

durante uma hora sob agitação. Uma placa de lise foi selecionada com o auxílio

de um palito estéril e transferida para o tubo contendo a cultura de bactérias, para

que ocorresse a infecção, incubado a 37ºC sob agitação durante 2 horas. A

cultura infectada foi então transferida para um erlenmeyer de 1litro com 250 mL

de meio SB pré-aquecido a 37ºC contendo tetraciclina 10 μg/mL e incubada a

37ºC sob agitação durante 1 hora, adicionado kanamicina 70 μg/mL e incubado a

37ºC sob agitação durante a noite. No dia seguinte, a cultura foi transferida para

tubos, centrifugado a 2500 x g durante 15 minutos e o sobrenadante coletado em

tubos novos. O sobrenadante foi submetido à incubação a 70ºC durante 20

minutos para eliminar as células residuais e centrifugado a 2500 x g durante 15

minutos. O sobrenadante foi estocado em tubos estéreis a 4ºC.

28

4.15.3 Determinação do título da preparação de fagos auxiliares

Para determinar o título da preparação dos fagos auxiliares foram

inoculados 2 mL de meio SB, contendo tetraciclina 20 μg/mL, com 2 μL de células

XL1-blue competentes e incubado a 37ºC em agitação até atingir a D.O.600nm de

0,6 a 1,0. As células foram aliquotadas em 50 μL para microtubos e adicionado

1μL de fagos auxiliares diluídos (10-6, 10-7 e 10-8) e incubado a temperatura

ambiente durante 15 minutos. Foram adicionados os 50 μL de células infectadas a

3 mL de meio LB top ágar, misturado e espalhado em placas contendo meio LB

ágar. As placas foram incubadas a 37ºC durante a noite e no dia seguinte a

incubação as placas de lise foram contadas e o título de fagos foi determinado em

unidades formadoras de placas pfu/mL de fagos.

4.16 Expressão dos fragmentos de anticorpos scFv como proteínas de fusão na

superfície de bacteriogafos filamentos – phage display

Foram adicionados 13,5 ml de meio SB em 1,5 ml de cultura de células

transformadas juntamente com 3 μL de carbenicilina (100 mg/mL) e 7,5 μL de

tetraciclina (20 mg/mL) e incubado a 250 rpm durante 1 hora a 37°C.

Em seguida, foram adicionados 4,5 μL de carbenicilina (100 mg/mL) incubando as

células por mais uma hora, nas mesmas condições anteriores. A cultura foi então

transferida para um erlenmeyer de 1 L e foram adicionados 3 mL de fago auxiliar

VCSM13 (1,52 x 108 pfu/mL) e 183 mL de meio SB pré-aquecido a 37°C,

contendo 92,2 μL de carbenicilina (100 mg/mL) e 92,5 μL de tetraciclina (20

mg/mL) e incubado em agitador durante 1,5 a 2 horas, a 300 rpm, a 37°C. Foram

adicionados 280 μL de kanamicina (50 mg/mL) e mantido nas condições descritas

anteriormente durante a noite.

No dia seguinte a cultura foi submetida à centrifugação a 3000 x g

durante 15 minutos a 4°C. O sedimento foi estocado a -20ºC para futuras

preparações plasmidiais. Ao sobrenadante foram adicionados 8g de PEG 8000

(polietilenoglicol) e 6g de cloreto de sódio e agitado a 250 rpm, durante 10

minutos, a 37°C para dissolver a fase sólida. Em seguida, o sobrenadante foi

incubado em banho de gelo durante 30 minutos. Os fagos foram coletados por

29

centrifugação a 10.000 x g durante 30 minutos a 4°C. O sobrenadante foi

descartado e a garrafa mantida invertida sobre papel toalha, por pelo menos 10

minutos. Para garantir a secagem do sedimento, as bordas da garrafa foram

enxugadas com papel toalha. O sedimento foi ressuspendido em 2 mL de

TBS/BSA 1% (p/v), a suspensão foi transferida para dois microtubos e

centrifugada a 12000 rpm, durante 5 minutos, a 4°C. Em seguida, o

sobrenadante, contendo as partículas virais, foi transferido para um tubo novo e

estocado a 4°C.


Biopanning

Em dois poços de uma placa de microtitulação foram adsorvidos 50 μL

de BoHV-1 diluídos em 75 μL de tampão bicarbonato de sódio (0,1 M pH 8,6). A

placa foi incubada a 4ºC durante a noite. No dia seguinte, a solução foi

descartada. Aos dois poços foram adicionados 200L de TBS-BSA 3% para

bloquear, seguido de incubação a 37ºC durante 1 hora. A solução bloqueadora foi

descartada e 100 L da biblioteca de anticorpos em fagos, adicionados a cada

poço. A placa foi selada e incubada durante 2 horas a 37ºC, em estufa. A solução

de fagos foi desprezada, e os poços lavados de acordo com o seguinte método: o

volume de 200L de TBST 0,5% foi pipetado vigorosamente por 5 vezes, a

solução de lavagem permaneceu nos poços por 5 minutos antes de ser

desprezada. O número de repetições deste passo variou de acordo com o ciclo de

seleção (1° e 2° ciclos – 5 lavagens, 3° e 4° ciclos – 10 e 15 lavagens,

respectivamente).

Descartada a solução de lavagem, fagos ligados foram eluídos por

incubação de 10 minutos à temperatura ambiente, com 100 L de tampão de

eluição ácido (Glicina-HCl 0,1M, pH 2,2), e vigorosas pipetagens (10X) foram

realizadas nos poços com este mesmo tampão; de imediato, o eluato foi

transferido a um novo tubo contendo 6 L do tampão de neutralização (Tris-base

2M) e incubou-se à temperatura ambiente durante 15 minutos. Nesta etapa

30

reservou-se 50 μL da bactéria e foi realizado a titulação dos fagos de entrada e e

posteriormente a titulação dos fagos de saída.

O restante da cultura foi transferida para um tubo falcon de 50 mL, no

qual foram adicionados 6 mL de meio SB pré-aquecido a 37ºC, 1,6 L de

Carbenicilina (100 mg/mL) e 3 L de tetraciclina (20 mg/mL). O tubo foi incubado

a 37C, durante 1 hora, sob agitação de 250 rpm. Após 1 hora, foi adicionado 2,5

L de Carbenicilina (100 mg/mL) e uma nova incubação foi realizada nas mesmas

condições do passo anterior. Em seguida, o volume de 2 mL de fago auxiliar

VCSM13 foi acrescido ao tubo, e a cultura foi transferida para um Erlenmeyer de

500 mL, no qual estavam 91 mL de meio SB pré-aquecido a 37C suplementado

com 46L de carbenicilina (100 mg/mL) e 46L de tetraciclina (20 mg/mL). O

erlenmeyer foi mantido durante 1,5 a 2 horas sob agitação de 300 rpm a 37C.

Seguidas 2 horas, o volume de 140 L de kanamicina (50 mg/mL) foi

acrescentado ao meio e, então, a cultura foi incubada durante a noite nas

condições descritas anteriormente.

No dia seguinte, a cultura foi submetida à centrifugação a 3.000 x g

durante 15 minutos a 4C. O sedimento foi estocado para futuras preparações

plasmidiais a -20ºC. Para precipitar fagos, foram adicionados ao sobrenadante 4 g

de PEG 8000 (polietilenoglicol) e 3 g de cloreto de sódio, esta solução foi agitada

a 250 rpm, durante 10 minutos, a 37C, para dissolver a fase sólida.

Posteriormente, o sobrenadante foi incubado em banho de gelo durante 30

minutos. A solução contendo os fagos foi submetida à centrifugação a 15000 x g,

durante 15 minutos a 4C. O sobrenadante foi descartado e o tubo mantido

invertido sobre papel toalha por, pelo menos, 10 minutos, para garantir a secagem

do sedimento. Após esse tempo, as proximidades da boca do tubo foram

enxugadas com papel toalha e o sedimento ressuspendido em 2 mL de TBS/BSA

1% (p/v). A suspensão foi transferida para dois microtubos e centrifugada a 14000

rpm durante 5 minutos a 4C. Em seguida, o sobrenadante contendo as partículas

virais foi transferido para um novo tubo e estocado a 4C. Foram realizados seis

ciclos de seleção (Biopanning) para que ocorresse um aumento da afinidade dos

anticorpos ao ligante e enriquecimento da biblioteca.

31

4.18 Ensaio imunoenzimático

O teste de ELISA foi realizado para avaliar a reatividade dos

fragmentos de anticorpos- scFv. Dois poços de uma placa de microtitulação foram

sensibilizados com 100 μL do BoHV-1 (105,5 DICC50/mL), dois poços foram

sensibilizados com meio MEM como controles negativos e dois poços foram

sensibilizados com o vírus sendo o controle “branco” da reação. A placa foi

incubada durante a noite a 4ºC. As soluções foram descartadas e os poços

bloqueados com 100 μL da solução bloqueadora (tampão carbonato/bicarbonato,

leite desnatado 1%) e incubados durante 1 hora a 37ºC. A solução bloqueadora

então foi descartada e os poços lavados 2 vezes com PBS. O sexto ciclo da

seleção foi inoculado nos poços (100 µl- aproximadamente 1011 ufp) e a placa foi

incubada durante 2 horas a 37ºC. A solução foi descartada e os poços lavados 6

vezes com PBST. Foram adicionados 50 μL do anticorpo anti-M13 conjugado com

peroxidase diluído 1:2000 em solução de bloqueio e incubado durante 1 hora a

37ºC. Após a incubação, a solução de anticorpo foi descartada e a placa lavada 6

vezes com PBST 0,05%. Foram adicionados 100 μL da solução do substrato OPD

em cada poço e incubado a temperatura ambiente até a visualização da reação

(aproximadamente 15 minutos). A placa foi lida a 492 nm em leitor de microplaca

(Flow Titertek Multiskan Plus - USA).

4.19 Sequenciamento das cadeias variáveis pesadas dos clones selecionados

Para a realização do sequenciamento, o DNA foi extraído pelo Qiaprep

Spin Mini Kit e visualizados em gel de agarose 2% corados com brometo de

etídeo. O seqüênciamento foi realizado utilizando o DyEnamic ET Dye Terminator

Cycle Sequencing Kit (Amershan Biosciences) utilizando um sequenciador

automático capilar MegaBaceTM 1000 (GE Healthcare). As amostras foram

preparadas para seqüenciamento em placas de 96 wells contendo

aproximadamente 400 ng de DNA fagomidial e 2,5 pmoles do oligonucleotídeo

mmB5 em um volume final de 10 μL. As condições da reação de sequenciamento

foram: 25 ciclos de: 95ºC por 20 segundos; 50ºC por 15 segundos e 60ºC por 1

minuto. A reação foi precipitada conforme descrito no Kit de sequenciamento e as

32

placas de sequenciamento foram injetadas imediatamente no sequenciador

automático MegaBace (GE).

4.20 Análise das sequências

O sequenciador gerou cromatogramas que foram processados e

analisados nos programas Phred basecalling. A qualidade das seqüências foi

verificada manualmente diante dos cromatogramas. As seqüências obtidas foram

traduzidas com auxílio de alinhamentos realizados com o banco de dados do

programa IgBlast no NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/) e as regiões

determinates de complementariedade (CDRs) foram definidas e alinhadas

manualmente .

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/

33

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1 Imunizações das aves com o BoHV-1

As duas aves imunizadas com o BoHV-1 apontaram no teste de ELISA

que produziram anticorpos reativos contra o vírus, a ave imunizada como controle

negativo apresentou uma reatividade no teste, provavelmente devido ao fato

desta aves serem vacinadas para doença de Marek, causada pelo vírus da

mesma família do BoHV-1, sendo provável uma reação cruzada, levando a um

resultado falso positivo. Os títulos de anticorpos observados nas diluições no soro

das galinhas imunizadas com o BoHV-1 apresentaram-se altos mesmo na diluição

de 1:4000, indicando que as aves já poderiam ser sacrificadas, uma vez que

títulos acima de 1:1000 são suficientes para a construção da biblioteca de

anticorpos (Barbas et al., 2001). Os títulos obtidos após o esquema de

imunização podem ser visualizados na Figura 4 e a análise estatista demostrando

que houve diferença significativa até a diluição 1/64000 entre os soros das

galinhas imunizadas com o BoHV-1 e as ave controle negativo na Figura 5.

.

Figura 4:

Resposta de anticorpos em soros de galinhas imunizadas com o

BoHV-1 e MEIO MEM. G1, G2 e G3 PRÉ- representam o soro pré-

imune das aves. G1- 4ª e G2- 4ª representam as aves 1 e 2

imunizadas com o BoHV-1 e a coleta de soro na quarta semana após

a primeira imunização, a G3-4ª corresponde a ave 3 controle negativo

na quarta semana de inoculação.

34

Figura 5:

A escolha de galinhas para a geração de anticorpos para construção

de uma biblioteca combinatorial de anticorpos apresentada em fagos, se deu

devido à maneira pela qual a diversidade de anticorpos é gerada. Durante os

rearranjos gênicos e o processo de conversão gênica, as cadeias leves e pesadas

são geradas diversificadas e com as extremidades terminais apresentando

sequências de aminoácidos idênticas. Neste caso, o repertório de genes variáveis

(VH e VL) pode ser amplificado utilizando apenas um par de iniciadores distintos

para cada fragmento gênico (WYNGAARDT et al., 2004). Para amplificação dos

segmentos gênicos de mamíferos, por exemplo, necessitaríamos de um maior

número de oligonucleotídeos e de reações de amplificações (DANTAS-BARBOSA

et al., 2004). Desta forma, as galinhas apresentaram-se como uma fonte

adequada de moléculas de mRNA, as quais codificam cadeias variáveis pesadas

e leves de anticorpos, e estes mRNA foram utilizados na confecção da biblioteca

de anticorpos. As aves são capazes de produzir anticorpos com alta afinidade,

altos títulos e de grande persistência na resposta imune (LEMAMY et al. 1999), o

que concorda com os elevados títulos obtidos neste trabalho.

Apenas a galinha 1 foi sacrificada para a sequencia dos

procedimentos. O RNA extraído do baço da ave foi analisado e quantificado em

gel de agarose mostrando uma concentração de 20g/l. A partir deste RNA

produziu-se a cDNA através de PCR.

Análise estatística dos soros pré e pós imunes e do

controle negativo.

35


anticorpos de galinha e amplificação do fragmento scFv (Overlap)

Para amplificar os genes da região variável da cadeia leve, foram

utilizados os oligonucleotídeos CSCVK (senso) e CKJo-B (reverso). Os amplicons

foram visualizados em gel de agarose 2% corados com brometo de etídeo. Os

tamanhos observados dos genes para cadeias leve foi em cerca de 350 pb e para

cadeia pesada de 400 pb. Neste ponto de amplificação cita-se novamente a uma

vantagem na utilização de galinhas para produção de anticorpos, utilizando

apenas um par de iniciadores distintos para cada fragmento gênico

(WYNGAARDT et al. 2004).

Posteriormente, os fragmentos VH e VL produzidos foram purificados e

utilizados como molde na montagem do gene scFv (overlap). A reação de

sobreposição é promovida por uma seqüência nucleotídica codificadora de um

peptídeo ligante (short linker) presente nos oligonucleotídeos CkJo-B (VL) e

CSCVHo-F (VH). Outros iniciadores CSC-F (senso) e CSC-B (reverso), externos

ao fragmento sobreposto, foram utilizados para amplificar o gene scFv de

aproximadamente 800 pb (Figura 6).

Figura 6: Amplificação dos fragmentos das cadeias leve (VL) e pesada (VH) de

anticorpos de galinha. Análise em gel de agarose 2% do fragmento scFv

purificado.

36

5.3 Construção da biblioteca combinatorial de anticorpos (scFv) e análise da

diversidade desta biblioteca por enzima de restrição.

Para a construção da biblioteca, os fragmentos scFv e o pComb foram

digeridos por enzima de restrição Sfi I e purificados do gel de agarose afim de

eliminar os resíduos de enzima que comprometem a eficiência da ligação. Os

fragmentos foram então clonados no vetor, o procedimento de ligação foi

realizado e utilizado na transformação em XL1-Blue eletrocompetente e

plaqueadas em placas de petri. Foram selecionadas 15 colônias para extração do

DNA fagomidial e o produto foi analisado em gel de agarose 2%. O DNA extraído

foi digerido com a enzima de restrição BstNI afim de avaliar a variabilidade da

biblioteca através da análise dos fragmentos de restrição. A variabilidade dos 15

clones foi demostrada através da visualização de diferentes bandas em gel de

agarose 2% corados com brometo de etídeo sob luz UV. Os clones 5 e 6, 7 e 8,

14 e 15 compartilham o mesmo tamanho de fragmento caracterizando o restante

dos clones (80%) como únicos e com especificidades teoricamente distintas,

necessitando da seleção de anticorpos específicos para o BoHV-1. (Figura 7).

Figura 7:

Observando o gel acima, verificou-se uma variabilidade da biblioteca,

este fato pode ser justificado pelo fato de que as aves utilizadas para a

Clones digeridos com enzima de restrição BstNI,

demostrando os diferentes tamanhos de fragmentos.

MM: marcador molecular (Amresco) de 50pb a

2000pb e em seguida os 15 clones.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 MM

37

imunização não eram livres de patógeno e nem o ambiente onde viviam era

estéril. Sendo assim, as galinhas entraram em contato com uma ampla gama de

microorganismos presentes no ambiente, alimentos e água. Este contato gera

uma resposta imunológica contra estes organismos e consequentemente a

amplificação de fragmentos gênicos de anticorpos sem especificidade ao BoHV-1,

desta forma o procedimento do Biopanning para seleção dos anticorpos se fez

necessário. Em outro estudo realizado em 2007 esta variabilidade de anticorpos

gerada pelas aves não foi verificada, provavelmente devido a imunodominância

de alguma proteína especifica do antígeno em questão (SOUZA, 2007).

5.4 Dot blot para análise da expressão da biblioteca

Foi realizado o dot blot para analisar a expressão dos fragmentos scFv

indiretamente pela observação da expressão do epítopo da hemaglutinina (HA)

fusionada ao anticorpo clonado no vetor pComb. O reconhecimento do epítopo

HA pelo anticorpo monoclonal anti-HA reflete a expressão correta deste epítopo e,

consequentemente, pela sua proximidade ao fragmento scFv, pode-se inferir a

integridade de todo o sistema de expressão. A área sensibilizada com a biblioteca

de fragmentos scFv apresentou forte marcação, demonstrando níveis de

expressão detectáveis visualmente porém a área sensibilizada com BoHV-1

apresentou-se fracamente marcada, demostrando ainda que os fragmentos de

anticorpos produzidos até o momento não eram específicos para o vírus sendo

necessário a realização dos procedimentos de seleção (Figura 8).

Figura 8:

Análise por dot blot dos clones expressando fragmentos scFv. A-

Membrana sensibilizada com BoHV-1. B- Membrana sensibilizada com

fragmentos de anticorpos scFv.

A

B

38

5.5 Seleção de partículas virais (scFv fusionados) ligantes ao BoHV-1- Biopanning

Esta fase do processo de construção da biblioteca de anticorpos teve

como objetivo a seleção dos clones gerados contra o antígeno de interesse, para

isto, o BoHV-1 foi sensibilizado em placas de microtitulação e submetido ao

reconhecimento pelos anticorpos recombinantes expressos em fagos. Os fagos

não ligantes foram lavados e os reativos eluídos e amplificados em E. coli (Figura

9) (SMITH & SCOTT, 1993). O título de entrada dos fagos no quinto e sexto ciclo

foi aproximadamente 108, o título de saída do quinto ciclo foi de 2x104, já o título

de saída do sexto ciclo foi de 1x106. Esses resultados constatam que houve um

aumento da especificidade da biblioteca de anticorpos durante os ciclos de

seleção, pois mesmo aumentando a estringência da reação (quantidades de

lavagens em cada ciclo) ocorreu enriquecimento dos clones. Nos estudos

disponíveis na literatura, 3 a 4 ciclos são suficientes para um resultado

satisfatório, no caso deste trabalho foram realizados 6 ciclos para aumentar o

enriquecimento de clones ao alvo visando o desenvolvimento de testes

diagnósticos. (SOUZA, 2007; CARDOSO, 2008; NASCIMENTO, 2009; NOLL,

2011).

Figura 9:

Seleção de fagos, expressando as diferentes formas scFvs. A

cada ciclo os ligantes específicos foram selecionados e re-

amplificados. Fonte: Adaptado de SIDHU & FELLOUSE, 2006;

SOUZA, 2007.

39

A técnica de Phage Display utilizada neste estudo apresenta vantagens

quando comparados com a outra forma de obtenção de anticorpos recombinantes

conhecida como tecnologia de hibridoma. Cita-se como ponto positivo do Phage

Display o consumo de tempo utilizado na construção, já que dispensa o passo de

imunização de animais e cultivo celular em larga escala, além de apresentarem

elevada afinidade pelo alvo (AZZAZY & HIGHSMITH, 2002).

5.6 Análise da biblioteca pelo ELISA

Após os 6 ciclos de ligação, eluição e amplificação na presença do fago

auxiliar e antibióticos adequados foi realizado o teste de ELISA para

monitoramento da reatividade da biblioteca ao vírus, para isto, duplicata das

amostras do sexto ciclo de seleção, das amostras de controle negativo (Meio

MEM) e dos brancos da reação (BR-ausência de clones scFv) foram utilizados.

A leitura (OD) demostrou a reatividade dos clones durante o último

ciclo de seleção. Nenhuma reação inespecífica ocorreu como demonstra a baixa

leitura do branco (BR-ausência de clones scFv). A baixa leitura do controle

negativo (Meio MEM) demonstra que ocorreu uma baixa especifidade da

biblioteca com o meio de cultura, demonstrando que o vírus é que gerou resposta

imune na galinha e não o meio de cultura. Os resultados podem ser observados

na Figura 10. Houve diferença significativa entre os tratamentos.

Figura 10: Imunoensaio dos clones do ciclo 6 contra o hespersvírus bovino

tipo1. B= branco, CN= controle negativo, R6= ciclo 6. Os

tratamentos foram comparados entre si pelo teste ANOVA

seguido do teste de Bonferroni e foi considerada diferença

estatística quando p<0,05.

40

A afinidade da biblioteca de anticorpos scFv ao BoHV-1 observada no

teste de ELISA mostra que os fragmentos produzidos são reativos ao vírus, sendo

possível a utilização destes anticorpos no desenvolvimento de novas plataformas

de diagnóstico, como um teste rápido de fluxo lateral. Na maioria dos laboratórios,

a técnica de diagnóstico utilizada para detecção das doenças causadas pelo

BoHV-1 é o teste de ELISA que possibilita a detecção de anticorpos contra o

vírus, porém uma das dificuldades encontradas com este tipo de diagnóstico, é a

impossibilidade de diferenciar anticorpos produzidos em resposta à infecção

natural daqueles produzidos pela vacinação, sendo que, a vacina é uma forma de

controle do vírus e é utilizada no Brasil. Diante disto, na tentativa de melhor

auxiliar nos resultados dos diagnósticos, e focar na detecção de antígenos em

oposição a anticorpos, eliminando assim o questionamento do animal apresentar-

se positivo devido à vacina ou vírus de campo, o desenvolvimento de testes

rápidos que detectem antígenos se torna importante, sendo utilizado o scFv

produzido neste trabalho. (TEIXEIRA et al., 2001; SPILKI et al., 2005;

BAUERMANN et al., 2010). Desde a década de 90, testes rápidos vem sendo

estudados e disponibilizados no mercado para diagnóstico de várias

enfermidades, como: AIDS, dengue, rotavirose, amebíase, hanseníase, entre

outras (CAVALCANTI et al., 2008). Não existe até o momento um teste rápido

para detecção de antígenos do BoHV-1 em bovinos, sendo que a detecção rápida

de animais doentes feita a campo auxiliaria no controle da enfermidade evitando

maiores prejuízos.

41

5.7 Sequenciamento das cadeias variáveis pesadas dos clones selecionados

Os clones do sexto ciclo de seleção reativos no ELISA foram utilizados

para reação de sequenciamento. O DNA para a reação de sequenciamento foi

extraído segundo o kit Qiaprep Spin Mini Kit. As amostras foram analisadas em

gel de agarose 2% para avaliação da qualidade. (Figura 11)

Figura 10:

A placa contendo amostras de DNA foi sequenciada utilizando o

iniciador mmB5 (extremidade 3’ do fragmento scFv). As reações foram injetadas

no sequenciador automático MegaBace (GE). Após o sequenciamento, as

seqüências foram analisadas utilizando o programa IgBlast e a seqüências

protéicas alinhadas manualmente (Figura 11).

Dos 48 clones sequenciados, apenas 19 (39,6%) tiveram sequencias

capazes de serem analisadas, destes 12 (63,1%) apresentaram regiões hiper-

variáveis (CDRs) com grande similaridade entre si, demostrando uma provável

diminuição da variabilidade dos anticorpos após a seleção do biopanning o que é

desejado para os ensaios futuros de diagnósticos, porém, apenas a cadeia

Amostras

Gel de agarose 2% dos DNA extraídos dos

clones do sexto ciclo de seleção.MM:

marcado molecular 1Kb Amresco.

MM

42

pesada foi sequenciada, necessitando também do sequenciamento das cadeias

leves e novamente dos clones já sequenciados. A baixa qualidade das

seqüências atribuídas possivelmente a problemas na extração do DNA com

alguns contaminantes ou no próprio equipamento. Devido a estes problemas não

foi possível determinar todas as CDRs presentes em todos os clones.

44

6 CONCLUSÕES

A clonagem em vetor pcomb3X dos genes codificadores dos

fragmentos de anticorpos contra o BoHV-1 foi bem sucedida, sendo a expressão

na forma solúvel realizada com sucesso por células de E. coli XL1-BLUE. A

utilização da biblioteca de fragmentos scFvs em fagos por seis ciclos de seleção

mostrou enriquecimento nos títulos de fagos selecionados contra a antígeno. O

imunoensaio confirmou a afinidade dos fragmentos scFv ao BoHV-1

demonstrando a validade do processo de seleção. O processo de

sequenciamento mostrou uma diminuição da variabilidade em comparação ao dot

blot realizado anteriormente, sendo uma característica desejável neste processo,

porém não foi possível sequenciar os clones de modo eficiente, verificando-se,

portanto, a necessidade de analisar de forma mais aprofundada os resultados

obtidos. Mesmo com a necessidade deste novo sequenciamento, a realização

deste estudo mostrou que os fragmentos scFv podem ser utilizados futuramente

na detecção do BoHV-1 no desenvolvimento de testes diagnósticos.

45

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construÇÃo e seleÇÃo de uma biblioteca combinatorial de … · 4.9 ligação dos fragmentos de...

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