Conflict of Interest Statement

Fisico.

Participou como consultor em projetos

voltados aimunoensaios.

PRINCIPAIS METODOLOGIAS APLICÁVEIS EM TESTES

RÁPIDOS

Dr. Stefano Spagna

Congresso, Setembro 2007

Mercado Global In Vitro Diagnostic (IVD) Imunodiagnóstico in vitro

• IVD é um mercado jáestabelecido e dominadopelo uso de testes imunológicos(imunoensaios).

• Mais de 20 bilhões de testes são feitosanualmente no mundo.

• O montante de US$ 25 bilhões é empregadonestes ensaios.

• 40% EUA • 5% América Latina.

Testes RápidosTabela de desenvolvimento e tecnologia dos imunoensaios no mundo

FDA examina as publicações de triagens clínicas com uso de biomarcadores 2003

Iniciado o projeto de mapeamento de haplótipo (SNPs – HAPMAP Project) 2002

O Projeto Genoma Humano é completado. Seqüenciamento em larga escala, automação laboratorial tecnologias de microarray entram em escala comercial

2000

O FDA aprova o Analyte Specific Reagents (ASR) para a venda a alguns laboratórios credeciados.1997

Tem início a industria do ensaio em microarray1991

A tecnologia de reação em cadeia da polimerase (PCR) usa ciclos de aquecimento e enzimas específicas para produzir cópias múltiplas de um gen, posicionand-se como ferramente em desenvolvimento de biotecnologia e desenvolvimento de bioprodutos no mudo todo.

1983

Companhias farmacêuticas compram e vendem empresas diagnósticas, consolidando um “mercado de gigantes”

1980 a 1990

Descoberta de vários biomarcadores e testes diagnósticos ligados a doenças e patógenos. Pesquisa de imunoensaios

60 e anteriores

• Testes Laboratoriais Remotos• Facilidade de execução• Inventados em 1960s• Aprimoramentos vão surgindo com o tempo

Situação atual dos imunoensaios rápidos

• Uso fácil. Resultado rápido.• Emprega pequeno volume de amostra para o

ensaio, p.ex. Saliva, urina ou sangue total.• Custo atraente para fabricação e uso dos testes.

Testes Rápidos - Metodologias

1 Fundo plástico2 Membrana3 Anticorpos4 Anticorpos5 Almofada com anticorpos

conjugados e marcadoscom ouro

6-7 Almofadas de amostra/secagem

8 Fita adesiva de cobertura9 Fita adesiva impressa

Desvantagens do método convencionalcom o uso de ouro coloidal

100 % visualmente negativo 100 % visualmente positivo

NEGATIVO POSITIVO

Negativo / Positivo dependente do operador

• Interpretação do resultado pelo técnico.• Quantificação difícil• Alto coeficiente de variação (CVs).

Tecnologia emergente: Partículas magnéticas

• Substituição direta dos ensaios de coloração, quimioluminescência ou conjugadosenzimáticos com partículas coloidais

• Vantagens imediatas– reagentes estáveis– sinal estável– matrizes biológicas apresentam baixo ruído de

fundo magnético– barreiras visuais não interferem com campos

magnéticos– química de conjugados padronizada

Ensaio imunocromatográficode fluxo lateral

Imunoensaio magnético

Partículas Superparamagnéticas60-380nm

Campo magnético oscilatórios

Medidas da magnetizaçãopelas partículas magnéticas

Substrato enzimáticoLus visível ou LASER

Excitação

VisualAbsorçãoTransmissãoReflexão

Detecção

• Ouro coloidal • Enzima• Fluoróforos• Moléculasluminescentes

Imunoensaio convencional

=Anticorpo conjugado

Detecção do sinal

Teste visualp.ex. Ouro coloidal, partículas coloridas ou fluorescentes, etc.

Testes magnético

Partículas Superparamagneticas100 a 300 nm

PartículasColoidais40 nm

Amostra Conjugado Membrana Absorvente

Amostra Conjugado Membrana Absorvente

Antígenos formandoimunocomplexos com conjugados de anticorpos portandopartículassuperparamagnéticas(SPMP)

Almofada deamostra

Almofadaconjugados

Membrana Almofada absorvente

Imunocomplexos capturados pelosegundo anticorpo

Almofada deamostra

Almofadaconjugados

Membrana Almofada absorvente

Amostra restanteabsorvida

Medida da magnetizaçãopelas partículas magnéticasem um campo magnéticooscilante.

Amostra Conjugados Membrana Absorvente

Positivo

Negativo

Vantagem da detecçãomagnética

Testes qualitativos

Identificação do sinal visual é restrito ao topo da membranaexposta

Testesqualitativos

Métodos magnéticos permitem o usode todo o volume da membrana

Intervalo típico de detecção em amostras enriquecidas de carne

Envisio PCR Teste de

fluxo lateral

Intervalo de detecção – a concentração do analito

depois do enriquecimento necessário para que todos

os sistemas indicados pudessem positivar o

teste

Problemas de saude relacionado da contaminacao de comida

Display coloridoVisualização clara dos resultadosNEGATIVOS e POSITIVOS

Instrumento completo, funcionamento total

Impressão automática dos resultados

O código de barras identifica todos os dados do ensaio

Tempo de leitura de um ensaio é de 30 segundos

Mínimo de espaço requerido para operar – uso eficiente da bancada

Tecnologia de detecção magnética – reduzidos intervalos de detecção sem prejuízo na acurácia dos resultados

Sistemas de leitura de teste de particulas magnetica

Indução Magnética

• Um magneto, se movendo ao longo de umabobina induz uma voltagem

Projeto de bobinasbalanceadas

Duas bobinas idênticas, mas com espiras de sentidosopostos, produzem um sinal oscilante sem ruído

CONCEITOO campo magnético segue o núcleo de ferrite

Vbobina

I = I0 sin ωt

Fenda de oscilação do campo magnético

Quando não há material magnético no local, a medida davoltagem entre as bobinas opostas é ZERO (V+ + V- = 0)

Hgap = H0 sin ωt

V0

Desenho do Sensor

magnético

ÁREA DE CAPTURAMEMBRANA DE FLUXO LATERAL

PARTÍCULAS MAGNÉTICAS + Pico do sinal

Ruído

- Pico do sinal

A bobina gera uma voltagem mensurável quando apresentadomagnetismo pelas partículas magnéticas aprisionadas na zonade captura do ensaioA voltagem gerada pela bobina é diretamente proporcional aonúmero de partículas magnéticas retidas pela formação de imunocomplexos na área de captura do ensaio

Detectadas 10 picogramas/ml Enterotoxina do Stafilococus B.

28 ensaios contra: Bactérias(esporos e vegetativas),Viral e várias toxinas.

Sistema pode ser 10 a 1000 X mais sensível que os ensaiosde fluxo lateral de interpretação visual.

Sinal

Ruído

United States Naval Medical Research Center: BDRDBiological Defense Research DirectorateDr. Robert Bull

US Navy Biological Research Defense DirectorateSource: http://www.darpa.mil/dso/thrust/sp/presentations/biomagnetics_bull.pdf

MICT Troponin I

MICT cTnI test in heparin plasma(0~10 ng/ml)

y = 32.505x + 24.957R2 = 0.999

0

50

100

150

200

250

300

350

400

0 2 4 6 8 10 12

cTnI, ng/ml

MA

R 5

002O3

Linear(002O3)

MICT cTnI test in heparin plasma(0~1 ng/ml)

y = 32.505x + 24.957R2 = 0.999

0102030405060708090

100

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8 2cTnI, ng/ml

MA

R 5

002O3

Linear (002O3)

Troponina I

Teste cT/nl em plasma com heparina

( 0 – 10 ng/mL)Teste cT/nl em plasma com heparina

( 0 – 1 ng/mL)

MICT THC Test

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0 2 4 6 8 10 12

THC, ng/ml

T/C

THCPoly. (THC)

Teste de THC

y = -4E-06x2 + 0.0055x + 0.0428R2 = 0.9724

0.000

0.500

1.000

1.500

2.000

2.500

0.00 200.00 400.00 600.00 800.00

CRP, ng/ml

T/C

CRPPoly. (CRP)

MICT CRP Assay Dose Response (1~700 ng/ml)

y = 0.0056x + 0.0292R2 = 0.966

0.000

0.200

0.400

0.600

0.800

1.000

1.200

0.00 50.00 100.00 150.00 200.00

CRP, ng/ml

T/C

CRPLinear (CRP)

MICT CRP Assay Dose Response (1~175 ng/ml)

CRP – Ensaio de avaliação dose-resposta

(1 a 700 ng/ml)

CRP – Ensaio de avaliação dose-resposta

(1 a 175 ng/ml)

Tecnologia nova emergenteConclusões

Resultados QuantitativosAlta sensibilidade Medições rápidasTem aplicação em imunoensaios de

base sólida ou líquidaCusto equiparavel ao convencional

Usa formatos e reações químicas jápadronizadas

• Obrigado!

stefanospagna@yahoo.com