Conflict of Interest Statement
Fisico.
Participou como consultor em projetos
voltados aimunoensaios.
Mercado Global In Vitro Diagnostic (IVD) Imunodiagnóstico in vitro
• IVD é um mercado jáestabelecido e dominadopelo uso de testes imunológicos(imunoensaios).
• Mais de 20 bilhões de testes são feitosanualmente no mundo.
• O montante de US$ 25 bilhões é empregadonestes ensaios.
• 40% EUA • 5% América Latina.
Testes RápidosTabela de desenvolvimento e tecnologia dos imunoensaios no mundo
FDA examina as publicações de triagens clínicas com uso de biomarcadores 2003
Iniciado o projeto de mapeamento de haplótipo (SNPs – HAPMAP Project) 2002
O Projeto Genoma Humano é completado. Seqüenciamento em larga escala, automação laboratorial tecnologias de microarray entram em escala comercial
2000
O FDA aprova o Analyte Specific Reagents (ASR) para a venda a alguns laboratórios credeciados.1997
Tem início a industria do ensaio em microarray1991
A tecnologia de reação em cadeia da polimerase (PCR) usa ciclos de aquecimento e enzimas específicas para produzir cópias múltiplas de um gen, posicionand-se como ferramente em desenvolvimento de biotecnologia e desenvolvimento de bioprodutos no mudo todo.
1983
Companhias farmacêuticas compram e vendem empresas diagnósticas, consolidando um “mercado de gigantes”
1980 a 1990
Descoberta de vários biomarcadores e testes diagnósticos ligados a doenças e patógenos. Pesquisa de imunoensaios
60 e anteriores
• Testes Laboratoriais Remotos• Facilidade de execução• Inventados em 1960s• Aprimoramentos vão surgindo com o tempo
Situação atual dos imunoensaios rápidos
• Uso fácil. Resultado rápido.• Emprega pequeno volume de amostra para o
ensaio, p.ex. Saliva, urina ou sangue total.• Custo atraente para fabricação e uso dos testes.
Testes Rápidos - Metodologias
1 Fundo plástico2 Membrana3 Anticorpos4 Anticorpos5 Almofada com anticorpos
conjugados e marcadoscom ouro
6-7 Almofadas de amostra/secagem
8 Fita adesiva de cobertura9 Fita adesiva impressa
Desvantagens do método convencionalcom o uso de ouro coloidal
100 % visualmente negativo 100 % visualmente positivo
NEGATIVO POSITIVO
Negativo / Positivo dependente do operador
• Interpretação do resultado pelo técnico.• Quantificação difícil• Alto coeficiente de variação (CVs).
Tecnologia emergente: Partículas magnéticas
• Substituição direta dos ensaios de coloração, quimioluminescência ou conjugadosenzimáticos com partículas coloidais
• Vantagens imediatas– reagentes estáveis– sinal estável– matrizes biológicas apresentam baixo ruído de
fundo magnético– barreiras visuais não interferem com campos
magnéticos– química de conjugados padronizada
Ensaio imunocromatográficode fluxo lateral
Imunoensaio magnético
Partículas Superparamagnéticas60-380nm
Campo magnético oscilatórios
Medidas da magnetizaçãopelas partículas magnéticas
Substrato enzimáticoLus visível ou LASER
Excitação
VisualAbsorçãoTransmissãoReflexão
Detecção
• Ouro coloidal • Enzima• Fluoróforos• Moléculasluminescentes
Imunoensaio convencional
=Anticorpo conjugado
Detecção do sinal
Teste visualp.ex. Ouro coloidal, partículas coloridas ou fluorescentes, etc.
Testes magnético
Partículas Superparamagneticas100 a 300 nm
PartículasColoidais40 nm
Amostra Conjugado Membrana Absorvente
Antígenos formandoimunocomplexos com conjugados de anticorpos portandopartículassuperparamagnéticas(SPMP)
Almofada deamostra
Almofadaconjugados
Membrana Almofada absorvente
Imunocomplexos capturados pelosegundo anticorpo
Almofada deamostra
Almofadaconjugados
Membrana Almofada absorvente
Amostra restanteabsorvida
Medida da magnetizaçãopelas partículas magnéticasem um campo magnéticooscilante.
Vantagem da detecçãomagnética
Testes qualitativos
Identificação do sinal visual é restrito ao topo da membranaexposta
Testesqualitativos
Métodos magnéticos permitem o usode todo o volume da membrana
Intervalo típico de detecção em amostras enriquecidas de carne
Envisio PCR Teste de
fluxo lateral
Intervalo de detecção – a concentração do analito
depois do enriquecimento necessário para que todos
os sistemas indicados pudessem positivar o
teste
Problemas de saude relacionado da contaminacao de comida
Display coloridoVisualização clara dos resultadosNEGATIVOS e POSITIVOS
Instrumento completo, funcionamento total
Impressão automática dos resultados
O código de barras identifica todos os dados do ensaio
Tempo de leitura de um ensaio é de 30 segundos
Mínimo de espaço requerido para operar – uso eficiente da bancada
Tecnologia de detecção magnética – reduzidos intervalos de detecção sem prejuízo na acurácia dos resultados
Projeto de bobinasbalanceadas
Duas bobinas idênticas, mas com espiras de sentidosopostos, produzem um sinal oscilante sem ruído
CONCEITOO campo magnético segue o núcleo de ferrite
Vbobina
I = I0 sin ωt
Fenda de oscilação do campo magnético
Quando não há material magnético no local, a medida davoltagem entre as bobinas opostas é ZERO (V+ + V- = 0)
Hgap = H0 sin ωt
V0
Desenho do Sensor
magnético
ÁREA DE CAPTURAMEMBRANA DE FLUXO LATERAL
PARTÍCULAS MAGNÉTICAS + Pico do sinal
Ruído
- Pico do sinal
A bobina gera uma voltagem mensurável quando apresentadomagnetismo pelas partículas magnéticas aprisionadas na zonade captura do ensaioA voltagem gerada pela bobina é diretamente proporcional aonúmero de partículas magnéticas retidas pela formação de imunocomplexos na área de captura do ensaio
Detectadas 10 picogramas/ml Enterotoxina do Stafilococus B.
28 ensaios contra: Bactérias(esporos e vegetativas),Viral e várias toxinas.
Sistema pode ser 10 a 1000 X mais sensível que os ensaiosde fluxo lateral de interpretação visual.
Sinal
Ruído
United States Naval Medical Research Center: BDRDBiological Defense Research DirectorateDr. Robert Bull
US Navy Biological Research Defense DirectorateSource: http://www.darpa.mil/dso/thrust/sp/presentations/biomagnetics_bull.pdf
MICT Troponin I
MICT cTnI test in heparin plasma(0~10 ng/ml)
y = 32.505x + 24.957R2 = 0.999
0
50
100
150
200
250
300
350
400
0 2 4 6 8 10 12
cTnI, ng/ml
MA
R 5
002O3
Linear(002O3)
MICT cTnI test in heparin plasma(0~1 ng/ml)
y = 32.505x + 24.957R2 = 0.999
0102030405060708090
100
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8 2cTnI, ng/ml
MA
R 5
002O3
Linear (002O3)
Troponina I
Teste cT/nl em plasma com heparina
( 0 – 10 ng/mL)Teste cT/nl em plasma com heparina
( 0 – 1 ng/mL)
MICT THC Test
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.35
0 2 4 6 8 10 12
THC, ng/ml
T/C
THCPoly. (THC)
Teste de THC
y = -4E-06x2 + 0.0055x + 0.0428R2 = 0.9724
0.000
0.500
1.000
1.500
2.000
2.500
0.00 200.00 400.00 600.00 800.00
CRP, ng/ml
T/C
CRPPoly. (CRP)
MICT CRP Assay Dose Response (1~700 ng/ml)
y = 0.0056x + 0.0292R2 = 0.966
0.000
0.200
0.400
0.600
0.800
1.000
1.200
0.00 50.00 100.00 150.00 200.00
CRP, ng/ml
T/C
CRPLinear (CRP)
MICT CRP Assay Dose Response (1~175 ng/ml)
CRP – Ensaio de avaliação dose-resposta
(1 a 700 ng/ml)
CRP – Ensaio de avaliação dose-resposta
(1 a 175 ng/ml)
Tecnologia nova emergenteConclusões
Resultados QuantitativosAlta sensibilidade Medições rápidasTem aplicação em imunoensaios de
base sólida ou líquidaCusto equiparavel ao convencional
Usa formatos e reações químicas jápadronizadas