conceitos prévios o que é dna? aonde se localiza o dna numa célula ? do que são formadas as...
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Conceitos Prévios
• O que é DNA?
•Aonde se localiza o DNA numa célula ?
•Do que são formadas as membranas celulares ?
• Qual a estrutura do DNA?
• DNA determina as características de todos os seres vivos.
• DNA é composto de um alfabeto de 4-letras (nucleotídeo/ molécula) referido como A, T, C, and G.
• A ordem do alfabeto determina as características do organismos, como as letras de nosso alfabeto determinam as palavras.
• Cada célula do corpo humano contém >3 BILHÕES de letras.
A única diferença entre os organismos vivos é a quantidade e ordem do alfabeto de DNA.
Cloroplasto
Mitocôndria
Vacúolo
Membrana celular
Parede celular
Citoplasma
Núcleo(DNA)
Componentes do DNA
DNA é um polímero, sendo os monômeros os nucleotídeos, chamado então de polinucleotídeo.
Cada nucleotídeo consiste de um açúcar de 5 carbonos(desoxiribose), uma base nitrogenada ligada ao açúcar e um
grupo fosfato.
Quatro nucleotídeos, que diferem somente na basenitrogenada.
A = adeninaG = guanina C = citosinaT = timina
Definições A combinação de uma desoxirribose e uma base constitue um desoxinucleosídeo.
A combinação de um fosfato, de uma desoxirribose e uma base constitue um desoxinucleotídeo.
http://www.blc.arizona.edu/Molecular_Graphics/DNA_Structure/Purines_BS_Labels.GIF
Adenina e Guanina são Purinas. As Purinas são as maiores bases.
9 átomos cada
http://www.blc.arizona.edu/Molecular_Graphics/DNA_Structure/Purines_BS_Labels.GIF
Timina e Citosina são chamadas Pirimidinas.
6 átomos cada
A Hidroxila do carbono-3 da pentose do primeiro nucleotídeo se liga ao grupo fosfato ligado à hidroxila do carbono-5 da pentose do segundo nucleotídeo através de uma ligação fosfodiéster (ligação covalente)
http://www.universitario.com.br/celo/topicos/subtopicos/genetica/dna/Image27.gif
Com base na estrutura de dupla hélice do DNA e nas características de hidrofobicidade das moléculas, a estrutura do DNA fica da seguinte forma:
O grupo fosfato e o açúcar (parte hidrofílica) – estão localizados na parte externa da molécula. As bases nitrogenadas (parte hidrofóbica) – estão localizadas na parte interna da molécula.
http://upload.wikimedia.org/wikipedia/en/c/c8/FirstSketchOfDNADoubleHelix.jpg
Primeiro rascunho do Francis Crick da estrutura do DNA
Pontos importantes
•Por convenção, um polinucleotídeo é lido da extremidade 5´para a 3´.
•As orientações das duas fitas é antipararela: suas direções 5' - 3' são opostas.
•As duas fitas são mantidas unidas pela energia de muitas pontes de hidrogênio (A=T e G=C) e interações hidrofóbicas.
Ácidos Nucleicos
Extração e Quantificação
DNA na minha comida???
DNA na minha comida???
CURIOSIDADE:
Cada célula contém cerca de 3 metros de DNA.
Refeição = 55.000.000 células ou Cerca de 150.000 km de DNA.
DNA na minha comida???• DNA está presente nas células de todos os
organismos vivos.
• O processo de extração de DNA de uma célula é o primeiro passo em vários procedimentos de um laboratório.
• Deve-se separar o DNA de substâncias indesejáveis da célula, gentilmente, para que o DNA não se desnature (“quebre”).
Introdução
DNA na minha comida ???• Pode-se extrair o DNA, preparando-se uma
solução de banana tratada com sal, água destilada, e shampoo (detergente) .
• O detergente quebra a membrana celular, dissolvendo os lipídeos (moléculas de gordura) e proteínas da célula, além de quebrar as ligações que mantêm a membrana celular intacta.
Introdução
DNA in minha comida ???• O detergente forma então um
complexo com os lípídeos e proteínas, permitindo que sejam filtrados para fora da solução com um filtro de café.
• O DNA das células ficam no filtrado.
• O sal permite que o DNA precipite com a adição de álcool (íons Mg e Cl).
Introdução
DNA na minha comida???
Extração de DNA
DNA na minha comida???Passo 1
• Em um liquidificador, misturar uma banana com um copo de água destilada (250ml).
Extração de DNA
DNA na minha comida???Passo 1 (cont.)
• Bater por for 15-20 segundos, até a solução virar uma mistura.
Extração de DNA
DNA na minha comida??? Passo 2
• Num copinho de café, fazer uma solução contendo 1 colher de chá de shampoo ou detergente e 2 pitadas de sal de cozinha.
Extração de DNA
DNA na minha comida??? Passo 2 (cont.)
• Adicionar 20 ml (4 colheres de chá) de água destilada.
• Dissolver o sal e o shampoo/ detergente mexendo devagar para evitar fazer espuma.
Extração de DNA
DNA na minha comida??? Passo 3
• À solução do passo 2, adicionar 3 colheres cheias da solução de banana do passo 1.
• Misturar a solução com a colher por 5-10 minutos.
Extração de DNA
DNA na minha comida??? Passo 4
• Enquanto uma pessoa mistura a solução de banana, outra coloca um pedaço (cone) de filtro de café dentro do outro copo de plástico. Dobre as abas do filtro para fora para que não encoste no fundo do copo.
Extração de DNA
DNA na minha comida??? Passo 5
• Filtre a mistura no filtro e deixe a solução drenar por vários minutos até ter cerca de 5 ml (cobrindo o fundo do copo) do filtrado para testar.
Extração de DNA
DNA na minha comida??? Passo 6
• Pegar um tudo com álcool gelado. Para melhores resultados, o álcool deve estar o mais gelado possível.
Extração de DNA
DNA na minha comida??? Passo 7
• Encher a pipeta de plástico com a solução de banana.
Extração de DNA
DNA na minha comida??? Passo 8
• Adicionar a solução ao álcool.
• Deixe descansar por 2 a 3 minutos sem mexer o tubo. É muito importante não agitar o tubo.
Extração de DNA
DNA na minha comida???Resultados
• Você pode assistir o precitado branco de DNA na camada de álcool. O DNA tem uma aparência de um muco esbranquiçado e como se fosse uma nuvem.
Extração de DNA
Extração com Fenol• Fenol é usado para desnaturar e
remover proteínas de soluções que contêm ácidos nucléicos.
1. Homogeneização do material (nitrogênio líquido ou banho de gelo seco e etanol), com tampão.
2. Adicionar o mesmo volume de fenol à amostra, colocar no vortex ou agitar.
3. Centrifugar para separar 2 fases (de fenol embaixo e aquosa acima). Transferir fase aquosa para novo tubo.
Repetir 2 e 3.
Extração com Fenol (Cont.)4. Repetir a extração agora com 24:1 Clorofórmio:
álcool isoamílico. Centrifugar, recolher fase aquosa e repetir 4.
5. Adicionar 0,1 volume de NaOAc 3M + 1,8 volumes de etanol 95% gelado, inverter tubo algumas vezes (passo para livrar o DNA dos sais e concentrar o DNA).
6. Se houver precipitação ou “nuvem”, centrifugar 5 a 10 min. Se não conseguir ver DNA, -20ºC 15’ a o/n e centrifugar. Retirar EtOH
7. Lavar precipitado com 70% etanol e centrifugar
8. Retirar etanol, secar ao ar e ressuspender em TE ou ddH20 (50 a 500 µl)
Pontos Importantes• O fenol é usado para remover proteínas e outros
contaminantes da solução aquosa do DNA.
• O clorofórmio ajuda desnaturar proteínas e a remover o fenol residual.
• O álcool isoamílico é geralmente adicionado ao clorofórmio para reduzir espuma.
Extração Simples
• Material + Tampão de Lise: Tris, EDTA, SDS, NaCl e proteinase K.
• Digestão a 37 ºC (células, 2-3 hs) ou 55 ºC (tecido, overnight) sob agitação.
• Precipitação com isopropanol
• Resgatar o precipitado (nuvem) e ressupender em água ou TE.
Extração de DNA plasmidial
•Plasmídeos: pedaços de DNA extracromossômicos, covalentemente fechados;
•Codificam genes de resistência à antibióticos ou metais pesados, produçãode pigmentos, de virulência, etc.Também possuem genes para sua própria replicação
• 1-20 kb x ~ 5000 kb em E. coli, sendo fácil a separação dos DNAs
Extração de DNA plasmidial•Depois de crescer o plasmídeo recombinante em bactéria, temos que nos livrar dos outros componentes das células bacterianas (membranas, parede celular, ribossomos, RNA e DNA cromossomal
• Então adicionamos uma solução com NaOH (que aumentao pH e desnatura o DNA cromossomal e não o do plasmídeo) e SDS (que vai solubilizar as membranas e causar a lise das células).
•Centrifugar cultura e ressuspender pellet em tampão Tris EDTA (que liga divalentemente a cátions Ca e Mg e com isto ajuda a desestabilizar a membrana de E. coli).
Extração de DNA plasmidial (cont.)
•Decrescemos o pH com acetato de potássio (o DNA cromossomal não poderá a voltar a sua estrutura original e sairá de solução)
• Purificar o DNA com extração com fenol e clorofórmio, seguido de precipitação com etanol ou com uma membrana de sílica gel (o DNA vai se ligar à membrana sob altas concentrações de sais e se “desligar” com a redução da concentração de sais, ao contrário das proteínas e sais que passarão direto. Após lavagem com etanol para lavar os sais o DNA pode ser eluído
• Ao centrifugarmos, o DNA cromossomal precipitará e o plasmidial ficará em solução junto com proteínas e sais.
•O DNA pode se livrar do RNA pelo tratamento com RNAse A
Extração de RNA
Solução Desnaturante:• Tiocianato de Guanidina 4M• Citrato de Sódio 25 mM • 0.5% Sarcosil • Beta-Mercaptoetanol 0.1 M
• Envolve lise das células, desnaturação das proteínas da membrana celular e depois os passos normais como em DNA
• Envolve desnaturante forte para quebrar células, solubilizar seus componentes e desnaturar RNAses endógenas simultaneamente.
Extração de RNAm
• Usada para RNAm raros, para fazer sondas ou para bibliotecas de cDNA.
• Eucariotos: usa-se colunas de celulose e oligo dT ou magnetic beads e oligo dT (uma cadeia sintética de 20-30 timinas)
• Já possível para procariotos
• 1,5 a 5% do RNA celular
O RNA está INTACTO???
Gel de agarose desnaturante: paradesfazer a estrutura secundária do RNA
QuantificaçãoPara quê:
• Sintetizar cDNA para produção de biblioteca
• Purificação de fragmentos de DNA para subclonagem
• Quantificação de produtos amplificados
• Detecção de moléculas de DNA em preparações de drogas.
Quantificação• Mais usada com Espectrofotômetro
A260 dá estimativa da concentração• Leitura da absorbância a 260 e 280 nm
• OD260 = 1.0, dsDNA = 50 µg/mL; RNA = 40 µg/mL
• Desvantagens: interferência com material para extração, inabilidade de diferenciar entre DNA e RNA, sensibilidade: 50-250 ng DNA/ mL
• RNA e pH (>7,5): pH ácido afeta a absorção com A260, ajustar com Na2HPO4 (conc. final de1mM)
Quantificação
Como fazer
• Reagentes e Equipamento
Espectrofotômetro UV, cubetas de quartzo, ddH20
• 1 Zerar o aparelho com ddH20
• 2 Diluir um volume conhecido de ácido nucleico em água.
• 3 Realizar a leitura em OD260 e OD280. • 4 Calcular a concentração.
Cálculos
DNA [ ] (µg/µL) = OD260 x F. D. x 50 (µg/mL)
1000
F.D. = fator de diluição
Ex.: 3µl de DNA + 97µl H20; OD260 =0,0157
DNA [ ]= 0,0157 x 33,33 x 50 / 1000 = 26,16 ng/ µl
Pureza
DNA: Razão A260/A280 >= 1,75 - 1,80
< 1,75 contaminação com lipídeos ou proteínas
RNA: Razão A260/A280 ~ 2,0
< 2,0 contaminação com guanidina (da extração)
> 2,0 contaminação com fenol ou clorofórmio
OUTROS MÉTODOS• Fluorímetro: utiliza material fluorescente
que se liga ao ácido nucléico sem problemas com proteínas (picoGreen; sondas de cianina). Seletivos para dsDNA.
• Vantagem maior é a sensibilidade: 0,5 ng/ mL (100 a 1000 vezes maior que o espectrofotômetro)
OUTROS MÉTODOS• Gel de agarose:
aplicando-se as amostras de DNA juntamente com padrões de concentração conhecida
100 a 300 ng de plasmídeo
http://www.neb.com/nebecomm/productfiles/778/images/N3231.gif
Por meio decorrida juntoa um marcadorde DNA
Ácidos Nucléicos
• Estabilidade DNA versus RNA
• Nucleases
• Cuidados: autoclavagem de materiais e tampões; estocagem (DNA e RNA).
• TE (10 mM tris-HCl, pH 8,1, 1 mM EDTA) x nucleases e DEPC x RNAses
Armazenagem de DNA e RNA
DNA: 4°C (em TE) ou - 20°C (maior tempo)
RNA: manter sempre no gelo quando manipulado ea - 70°C (maior tempo)
Pontos Importantes• Maioria das nucleases precisam de Mg para
atividade, o EDTA ajuda na inativação delas.
• RNA é normalmente armazenado em ddH20 que foi previamente tratada com DEPC (0,1%) para inativar as RNAses.
• Muitas RNAses sobrevivem à autoclavagem então DEPC deve ser usado também para soluções.
• Importante inativar DEPC antes de usar pois pode modificar o RNA e inativar enzimas (RT e quinases)
• DEPC é altamente tóxico para humanos !!!• DEPC é incompatível com TRIS !!!
ANIMAÇÃO
• http://gslc.genetics.utah.edu/units/biotech/extraction/
ANIMAÇÃO
• http://www.jove.com/Details.htm?ID=246&VID=238