1

COLETA E PROCESSAMENTO DE AMOSTRAS AMBIENTAIS

SOLOS E SEDIMENTOS

Solos são ambientes heterogêneos e descontínuos que contêm um grande número

de diferentes grupos de microrganismos. Populações microbianas do solo variam com a

profundidade e tipo de solo, sendo que a região mais superficial do solo geralmente

apresenta mais organismos que a região da subsuperfície. Populações não variam somente

com a profundidade e tipo de solo, mas também variam de local para local, e até em um

mesmo local, em decorrência de variações naturais de microsítios que podem permitir que

microrganismos bem diferentes coexistam lado a lado. Dada a grande variabilidade dos

ecossistemas, é geralmente necessário que se retire mais de uma amostra para se obter

uma análise microbiana representativa de um local. Por esta razão, a estratégia global de

amostragem vai depender de muitos fatores, incluindo o objetivo da análise, os recursos

disponíveis e as características do local. A abordagem mais precisa é tirar muitas amostras

de um dado local e realizar uma análise separada para cada uma. Contudo, em muitos

casos, tempo e esforço podem ser poupados pela combinação de amostras retiradas para

formar uma amostra composta, que é usada para limitar o número de análises a serem

realizadas. Outra abordagem utilizada com freqüência é a de se amostrar uma localidade

seqüencialmente ao longo de certo tempo a partir de um pequeno local definido para

determinar efeitos temporais sobre os microrganismos. Como tantas opções estão

disponíveis, é importante delinear uma estratégia de amostragem para garantir a

confiabilidade do estudo. Isso pode ser feito pelo desenvolvimento de um plano para o

projeto de garantia de qualidade (QAPP). Um QAPP envolve o delineamento de

detalhes da estratégia de amostragem, métodos de amostragem e o subseqüente

armazenamento de todas as amostras. Pode incluir, ainda, detalhes das análises

microbiológicas a serem empregadas na avaliação das amostras. Componentes básicos de

um QAPP incluem:

- Estratégia de amostragem: número e tipos de amostras;

- Métodos de amostragem: técnicas específicas e equipamentos a serem utilizados;

2

- Armazenamento das amostras: tipos de recipientes, métodos de preservação das

amostras e tempo máximo de armazenamento.

8.1.1) Estratégias e métodos de amostragem para solos superficiais.

Amostras de solo volumosas são facilmente obtidas com uma pá ou,

preferencialmente, com um trado (Fig 8.1). Trados são mais precisos que pás, uma vez

que garantem que as amostras são tiradas a uma mesma profundidade em cada ocasião.

Isso é importante, já que cada fator do solo pode variar consideravelmente com a

profundidade, tal como o oxigênio, umidade, conteúdo de carbono orgânico e a

temperatura do solo. Um simples trado de mão é útil para se retirar amostras rasas de solo

de áreas não saturadas. Em condições adequadas, um trado de mão pode ser usado para

profundidades de até dois metros, embora alguns solos sejam compactados demais ou

com rochas demais para permitir a amostragem a essa profundidade. Ao se retirar

amostras para análise microbiológica, deve-se considerar a contaminação que pode

ocorrer conforme o trado é empurrado dentro do solo. Neste caso, microrganismos que se

prendem aos lados do trado, na medida em que ele é inserido no solo e empurrado para

baixo, podem contaminar amostras retiradas de profundidades maiores. A fim de

minimizar tal contaminação, pode-se usar uma espátula estéril para raspar a camada mais

externa da amostra e utilizar somente a parte mais central da amostra para análise. A

contaminação também pode ocorrer entre amostras, mas isto pode ser evitado pela

limpeza do trado após a retirada de cada amostra. O procedimento de limpeza envolve a

lavagem do trado com água, enxágüe com etanol a 75% ou solução de cloro a 10%, e um

enxágüe final com água esterilizada.

Como os solos são heterogêneos e um trado possui diâmetro limitado, a amostra

coletada pode não ser verdadeiramente representativa para aquele local. Assim sendo,

várias amostras devem ser coletadas e estruturadas em uma amostra composta, a fim de

reduzir o número total de amostras e o custo associado ao número de análises que serão

3

realizadas. Amostras compostas são obtidas pela coleta de iguais quantidades de amostras

de solo retiradas ao longo de uma área ampla que são colocadas em um balde ou saco

plástico. A massa de solo é então misturada e se obtém a amostra composta. Para se

reduzir o volume de amostras a serem armazenadas, uma parte da amostra composta pode

ser removida e se tornar a amostra a ser analisada. Em todos os casos, as amostras devem

ser armazenadas sob refrigeração até serem processadas e analisadas. Dependendo do tipo

de análise que será realizada (por exemplo, as que envolvem a extração de DNA ou RNA

para estudos moleculares das comunidades microbianas), as amostras devem ser

congeladas. Quando o interesse é a atividade microbiana ou a determinação da biomassa

ou tamanho das populações microbianas, ou quando se deseja isolar microrganismos do

solo, as amostras devem ser mantidas sob refrigeração.

Fig 8.1 - Trado de mão

Em alguns casos, uma série de parcelas ou de campos experimentais precisa ser

amostrada para se testar o efeito de tratamentos dados ao solo, tal como a adição de

fertilizantes, de pesticidas ou de biossólidos obtidos em sistemas de tratamento do esgoto,

sobre populações microbianas. Neste caso, uma amostra do solo deve ser retirada de cada

uma das parcelas ou campos para comparar parcelas-controle não-tratadas com as

parcelas que receberam um dado tratamento. Por exemplo, um pesquisador pode estar

4

interessado na influência de fertilizantes nitrogenados sobre as populações nitrificantes do

solo. O pesquisador irá então amostrar uma parcela não-fertilizada (o controle) para

comparar com uma parcela que tenha sido tratada com o fertilizante inorgânico. Outro

exemplo seria o de um solo que recebeu a aplicação de biossólido de esgoto tratado, o

qual é amostrado para subseqüente análise de vírus patogênicos. Em ambos os exemplos,

múltiplas amostras ou réplicas sempre fornecem uma estimativa mais precisa dos

parâmetros de interesse. Contudo, os trabalhos de campo podem ser custosos e o número

de amostras retiradas deve ser definido de acordo com o custo das análises e com os

fundos disponíveis. Nos exemplos dados, planos de amostragem bidimensionais podem

ser utilizados para determinar-se o número e a localização das amostras que serão

retiradas. Na amostragem bidimensional, para cada parcela são atribuídas coordenadas

espaciais e um conjunto de pontos de amostragem é escolhido de acordo com um plano

estabelecido. Alguns padrões de amostragem bidimensional típicos, incluindo ao acaso,

de corte transverso, em dois estágios e amostragem em grade, são ilustrados na Fig. 8.2.

Figura 8.2 – Padrões de amostragem

5

A amostragem ao acaso envolve a escolha fortuita de pontos dentro da parcela de

interesse, os quais são então amostrados a uma profundidade definida. Amostragem de

corte transverso consiste na coleta de amostras em uma só direção. Por exemplo, a

amostragem de corte transverso pode ser útil em uma área próxima às margens de um rio,

onde os cortes transversais poderiam ser escolhidos adjacentemente ao leito do rio, e a

ângulos retos do leito do rio. Dessa forma, a influência do rio (ou córrego) nas populações

microbianas poderia ser avaliada. Na amostragem em dois estágios, uma área é dividida

em subunidades regulares chamadas unidades primárias. Dentro de cada unidade

primária, sub-amostras podem ser retiradas ao acaso ou sistematicamente. Esta

abordagem pode ser útil, por exemplo, quando um local consiste de um declive lateral de

um morro e um nível plano, e é provável que haja variabilidade entre as unidades

primárias. O exemplo final de padrão de amostragem é a amostragem em grade, na qual

as amostras são retiradas sistematicamente em intervalos regulares com espaçamento fixo.

Esse tipo de amostragem é útil para o mapeamento de uma área quando pouco se sabe

sobre a variabilidade do solo.

Amostragem bidimensional não fornece nenhuma informação sobre mudanças nas

populações microbianas de acordo com a profundidade. Assim sendo, amostragem

tridimensional é usada quando se requer informação em relação à profundidade. Tal

informação sobre profundidade é crítica quando são avaliados locais que foram

contaminados por resíduos perigosos ou por derramamento de contaminantes.

Amostragem tridimensional pode ser tão simples quanto retirar amostras a 50-cm

aumentando até 200-cm, ou pode envolver perfurações de até várias centenas de metros

na sub-superfície. Para amostragem na subsuperfície, é necessário equipamento

especializado e é essencial que se garanta que as amostragens da subsuperfície não

estejam contaminadas por solo da superfície.

Finalmente, deve-se atentar para a existência de uma zona especializada do solo

que está sob influência direta das raízes de plantas. É a chamada rizosfera, que é de

especial interesse dos microbiologistas de solo e fitopatologistas, dada a acentuada

atividade microbiana e a ocorrência de várias interações planta-microrganismos

6

específicas. O solo da rizosfera existe como uma continuação da superfície da raiz

(rizoplano) até um ponto onde a raiz não mais exerce influência nas propriedades

microbianas. Para a amostragem de solo rizosférico, normalmente escavam-se

cuidadosamente as raízes para remover excessos ou solo que não seja da rizosfera. O solo

aderido às raízes da planta é então considerado como solo da rizosfera. Embora esse seja

um mecanismo simples de amostragem de solo rizosférico, ele permanece inalterado até

os dias de hoje. Como resultado, a amostragem de rizosfera permanece como o principal

limitante experimental, indiferente à sofisticação das análises microbianas que são

realizadas subseqüentemente.

8.1.2) Estratégias e métodos de amostragem para subsuperfície.

Abordagens mecânicas usando equipamentos de perfuração são necessárias para a

amostragem do ambiente da subsuperfície. Isto aumenta significativamente o custo da

amostragem, especialmente para a subsuperfície profunda. Como resultado, poucos cores

(material que fica contido no cilindro central) foram até o momento retirados da

subsuperfície a grandes profundidades, e todas as tentativas de se realizar tal feito

envolveram grandes equipes de pesquisadores (Veja Capítulo 4, Estudo de Caso). A

abordagem usada para amostragem, tanto na subsuperfície rasa como profunda, depende

se a mesma está saturada ou não. Para sistemas não-saturados, a perfuração por

perfuratriz a ar pode ser usada para se obter amostras de profundidades de até várias

centenas de metros (Chapelle, 1992). Na perfuração por perfuratriz a ar, um grande

compressor é usado para forçar o ar para baixo em um cano perfurador, para fora da broca

de perfuração e para cima, do lado de fora do buraco escavado (Fig. 8.3). Conforme o

cilindro central vai atravessando o solo, indo para baixo, o ar serve para “assoprar” o

material trespassado primeiro para fora do buraco, bem como para resfriar o cilindro

central. Isto é importante, porque se o cilindro central se superaquecer, microrganismos

dentro da amostra podem ser efetivamente esterilizados, apresentando dificuldade para

7

análise microbiana subseqüente. Em uma perfuração normal com ar, pequenas

quantidades de água contendo um surfactante são injetadas na corrente de ar para

controlar a poeira e ajudar a resfriar o equipamento perfurante. No entanto, isto aumenta a

possibilidade de contaminação, de modo que cores como os obtidos na planície do Rio

Snake, em Idaho, foram perfurados somente com ar (Colwell, 1989). Para ajudar a manter

o cilindro central resfriado, a retirada de material é simplesmente feita lentamente, a fim

de se evitar superaquecimento. Para auxiliar a manutenção de condições estéreis e

prevenir contaminação por ar da superfície, todo o ar utilizado no processo de retirada do

core era pré-filtrado por um filtro particular de alta eficiência (HEPA) de 0,3 µm.

Imediatamente após o core ser coletado, a camada superficial foi raspada com uma

espátula estéril, e então o subcore foi retirado com uma seringa plástica estéril de 60 mL

com a extremidade removida. As amostras foram imediatamente resfriadas e enviadas a

um laboratório, onde as análises microbianas foram iniciadas dentro de 18 horas após a

coleta.

8

Figura 8.3 – Na perfuração rotatória, a rotação mecânica de uma ferramenta de perfuração é usada para criar um buraco. Ora ar (perfuração rotatória por ar) ora um fluido composto por lama de perfuração (perfuração rotatória por lama) é forçado pela haste da broca abaixo para deslocar os restos do buraco perfurado para fora da broca e para cima da superfície. Esta figura ilustra a perfuração rotatória por lama.

Ambientes saturados de subsuperfície são amostrados de forma um pouco

diferente, porque os sedimentos são bem menos coesivos que aqueles encontrados em

regiões não-saturadas. Assim sendo, o orifício deve ser mantido de forma que um core

intacto possa ser retirado e removido a cada profundidade desejada. Para amostragem a

profundidades abaixo de 30 metros, utiliza-se um trado de haste oca e um tubo para

empurrar (Fig. 8.4). O trado consiste de um tubo oco com uma parte rotatória na ponta

que perfura o buraco. Na parte externa do invólucro, o trado oco possui um espiral

reverso de forma que o material perfurado é empurrado para cima e para fora do buraco,

conforme a perfuração prossegue. Enquanto o orifício é perfurado, o invólucro do trado é

9

mantido no lugar para manter o buraco aberto. Dessa forma, o invólucro atua como uma

proteção dentro da qual o segundo tubo, o cilindro central, é inserido para coletar a

amostra quando a profundidade desejada foi alcançada. O cilindro central é basicamente

um tubo estéril que é colocado na ponta do trado de haste oca, direcionado para baixo

para coletar a amostra de sedimento e depois recuperado. A perfuração pode continuar até

a próxima profundidade desejada e o processo de retirada de amostra é repetido. Cada

core coletado é removido, resfriado e enviado a um laboratório para estudo. Para evitar a

contaminação das amostras, a parte externa é removida ou o core pode ser subcored

(dividido em subcores).

Figura 8.4 – Diagrama de trado de haste oca. Note a perfuração reversa no exterior do trado. Isto é utilizado para deslocar os retos do buraco perfurado para cima da superfície. Este tipo de trado era usado na universidade de Purdue para coletar amostras de core (núcleo) em profundidades de até 26m para análise microbiana e de solo conforme descrito por Konopca e Turco (1991) (veja fig. 4.19). Um subcore de cada core coletado é removido usando-se um amostrador de colher de ruptura ou um tubo de empurrar. Em ambos os casos a parte externa do core deve ser considerada como contaminada. Assim sendo, a aprte externa é raspada com uma espátula estéril ou o subcore pode ser removido usando-se uma seringa plástica estéril. Alternativamente, como mostrado na figura, cores intactos são automaticamente aparados para remover o material externo contaminado, deixando somente o core interno estéril..

10

Para cores de profundidades maiores que 30 metros, um perfurador rotatório de

lama é utilizado (Chapelle, 1992). Neste caso, o buraco é também perfurado usando-se

um equipamento giratório. No entanto, fluidos da perfuração são usados para remover o

material perfurado do orifício e para aplicar pressão às paredes do buraco, para evitar que

ele desmorone. Perfuratriz rotatória de lama tem sido usada para obter amostras de

sedimento a 900 metros abaixo da superfície do solo. Um exemplo de tal core é um

retirado a partir de sedimentos profundos da subsuperfície da planície costeira, na

Carolina do Sul. Durante esta perfuração, amostras foram retiradas de profundidades que

variavam de 360 a 460 metros. A fim de garantir a integridade dos cores obtidos, os

fluidos da perfuração receberam “rastreadores”, brometo de potássio e corante rodamina.

O uso desses dois marcadores permitiu que os pesquisadores avaliassem quanto os fluidos

de perfuração haviam penetrado nos cores. Qualquer área dos cores que estão

contaminadas com os marcadores devem ser descartadas. Os cores eram recuperados em

sacos de plástico, resfriados e enviados para análise imediata.

É importante enfatizar que perfurações tanto de ambientes saturados quanto não-

saturados é um processo difícil por várias razões. Primeiro, pode levar anos para se

planejar e obter fundos para proceder um core como aqueles descrito aqui para a planície

do rio Snake e a planície costeira do sudeste. A perfuração efetiva e a recuperação de

amostras é um problema de engenharia cuja sofisticação foi somente comentada nesta

seção. Também lembre-se que os cores obtidos não são sempre verdadeiramente

representativos dos sedimentos dos quais são retirados. Por exemplo, um core de 4 pés

pode ser consideravelmente comprimido durante o processo de remoção, de forma que é

difícil identificar exatamente a profundidade de qual foi retirado. Uma segunda

dificuldade na obtenção de amostras representativas deve-se à heterogeneidade no

material da subsuperfície. Tais heterogeneidades podem significar que duas amostras

retiradas a poucos pés de distância podem ter características físicas, químicas e

microbiológicas diferentes. Finalmente, para análises microbiológicas não é suficiente

simplesmente recuperar a amostra; a amostra deve ser descontaminada e a logística do

armazenamento e análise deve ser considerada também.

11

8.1.3) Processamento e armazenamento de amostragem

Análises microbianas deviam ser realizadas o mais rápido possível após a coleta de

solo para minimizar os efeitos do armazenamento sobre as populações microbianas. Uma

vez removidas do campo, populações microbianas de uma amostra podem e irão mudar

indiferentes ao método de estocagem. Reduções no número de microrganismos e na

atividade microbiana foram relatadas mesmo quando amostras de solo foram armazenadas

nas mesmas condições de humidade do campo a 4°C por somente 3 meses (Stotzky et al.,

1962). Curiosamente neste estudo, embora populações bacterianas tenham mudado,

populações de actinomicetos permaneceram inalteradas.

O primeiro passo na análise microbiana de uma amostra de superfície de solo

geralmente envolve peneiramento através de uma malha de 2 mm para remover pedras

grandes e fragmentos. Entretanto, para isso a amostra deve ser geralmente seca ao ar para

facilitar o peneiramento. Isso é aceitável contanto que a humidade do solo não fique baixa

demais, pois isto também pode reduzir a população microbiana (Sparkling & Ceshire,

1979). Após o peneiramento, o armazenamento em curto prazo deve ser a 4°C

anteriormente a analise. Se amostras forem estocadas, alguns cuidados devem ser

tomados para a garantia de que as amostras não se ressecaram e que condições

anaeróbicas não foram desenvolvidas, uma vez que isso também pode alterar populações

microbianas. O armazenamento por até 21 dias parece deixar a maioria das propriedades

microbianas do solo inalteradas (Wollum, 1994), mas novamente o tempo é a essência da

análise microbiana. Note que a amostragem rotineira da superfície do solo não requer

procedimentos estéreis. Esses solos são continuamente expostos à atmosfera, então se

pode presumir que tal exposição durante a amostragem e processamento não afetarão o

resultado significativamente.

Mais cuidado é tomado com o processamento de amostras da subsuperfície por três

razões. Primeiro, elas têm contagens de culturas mais baixas, o que significa que um

contaminante microbiano externo pode afetar significativamente os números contados.

Segundo, os sedimentos da subsuperfície não estão constantemente expostos à atmosfera,

12

assim, contaminantes microbianos da atmosfera podem contribuir substancialmente para

os tipos microbianos encontrados. Terceiro, é mais caro obter amostras subsuperficiais, e

geralmente não há segunda chance para a coleta. Amostras subsuperficiais obtidas por

coring são ora congeladas imediatamente e mandadas para o laboratório como um core

intacto ora processados no local de coring. Em ambos os casos, a parte externa do core é

normalmente raspada com uma espátula estéril ou um subcore é retirado usando-se uma

seringa plástica de diâmetro menor. A amostra é então colocada em uma sacola plástica

estéril e analisada imediatamente ou congelada para análise futura.

8.1.3.1) Processamento de amostras de solo e sedimento para bactéria

Métodos tradicionais para análise de populações microbianas geralmente envolvem

análises de cultura utilizando diluições e metodologia de plaqueamento em meios

seletivos e diferenciais ou contagem direta (veja Capítulo 10). Contagens diretas oferecem

informação sobre o número total de bactérias presentes, porém não fornece informação

sobre o número ou diversidade de populações presentes. Contagens por plaqueamento

permitem a enumeração do total de populações ou das populações selecionadas da cultura

e por essa razão provêm informações sobre as diferentes populações presentes. No

entanto, dados obtidos indicam que geralmente menos que 1% das bactérias do solo são

cultiváveis (Amann et al., 1995), então as informações culturais fornecem somente uma

parte do quadro. Em adição, o tipo de meio escolhido para contagens em cultura vai

selecionar as populações que melhor crescerem naquele meio em particular. Assim, a

escolha do meio é crucial na determinação dos resultados obtidos. Isso está ilustrado pelos

dados da Tabela 8.1, que mostra que enquanto contagens diretas de uma série de amostras

de sedimento medindo 4-9 m de profundidade eram similares, as contagens de cultura

variaram dependendo do tipo de meio utilizado. Um meio nutricionalmente rico, PTYG,

composto de peptona, tripticase, extrato de levedura, e glicose, consistentemente forneceu

contagens que eram de uma a três ordens de magnitude menores que as contagens a partir

de dois meios pobres em nutriente que foram testados. Estes eram uma diluição 1:20 de

PTYG e ágar de extrato de solo de uma suspensão 1:20 de superfície de solo. Esses dados

13

refletem o fato de que a maioria dos microrganismos do solo vive sob condições

limitantes de nutrientes.

Uma técnica poderosa que foi desenvolvida nos últimos anos envolve a obtenção e

o estudo de extratos de DNA total de bactérias de uma amostra de solo (veja Capítulo 13).

Essa abordagem permite que informação seja obtida sobre os tipos de populações

presentes e seu potencial genético. Como nas demais técnicas, há limitações nos dados

que podem ser obtidos com extração de DNA. Por conseguinte, muitos pesquisadores

utilizam a extração de DNA em conjunto com contagens diretas e contagens em cultura

para maximizar os dados obtidos de uma amostra ambiental. Há duas metodologias para o

isolamento de DNA bacteriano a partir de amostras de solo (Fig. 8.5). A primeira se

baseia no fracionamento da bactéria do solo seguido de lise celular e extração do DNA. O

segundo método envolve a lise da bactéria in situ na matriz do solo com subseqüente

extração do DNA liberado a partir das células. Ambos os métodos são discutidos mais

adiante nas próximas seções.

14

Fig 8.5 - Métodos de obtenção de DNA de comunidade do solo.

Extração de células do solo e subseqüente recuperação de DNA

Nesta abordagem, células completas são removidas da amostra e depois lisadas

para a retirada do DNA. Um protocolo de extração de bactérias do solo a certa

profundidade foi desenvolvido por Holben (1994). O primeiro passo é a homogeneização

da amostra de solo ou sedimento para quebrar agregados e desalojar fungos e células

bacterianas. Para homogeneizar uma amostra, normalmente 10g do solo são colocados em

um tampão contendo polivinilpolipirrolidona (PVPP). O PVPP forma um complexo com

os ácidos húmicos e auxilia em sua remoção, um passo importante, visto que materiais

15

húmicos geralmente interferem na análise de DNA. As partículas de solo e sedimento,

bem como células fúngicas, são removidas por centrifugação em baixa velocidade,

seguida de centrifugação em alta velocidade para recuperar as células bacterianas. Esse

processo é conhecido como centrifugação diferencial. Geralmente são necessárias várias

seqüências de centrifugação para garantir que um número máximo de bactérias seja

recuperado.

Após as células serem recuperadas, elas são lisadas pela adição da enzima

lisozima. Os fragmentos celulares são removidos por centrifugação e o DNA livre

extraído do sobrenadante é purificado. O rendimento de DNA obtido varia com a amostra,

mas geralmente fica em torno de 1-5 µg por grama de superfície de solo. Para pôr isto em

perspectiva, o protocolo vai recuperar cerca de 33% população bacteriana total de um solo

complexo contendo areia, argila e lodo (Holben et al., 1988). Solos com altas taxas de

argila, não irão produzir altas recuperações por células bacterianas firmemente agrupadas

são removidas com partículas de solo durante a etapa de centrifugação em baixa

velocidade. Agrupamento das células também afeta as populações bacterianas específicas

que são recuperadas. Bactérias de metabolismo acelerado que produzem novas células por

fissão binária são menos firmemente agrupadas e preferencialmente recuperadas. Em

contraste, células mais velhas que não estão crescendo ativamente tendem a se agruparem

mais firmemente e são perdidas (Holben, 1994). Assim sendo, esse processo seleciona

bactérias com base em sua viscosidade ou grau de agrupamento dos colóides de argila (ou

barro), e nem todos os tipos celulares são extraídos com a mesma eficiência. Finalmente,

note que esse processo é altamente trabalhoso (6-8 horas são necessárias para seis

amostras) e não auxilia propriamente em estudos nos quais muitas amostras precisam ser

analisadas.

O procedimento tem, contudo, algumas vantagens em relação ao método de lise in

situ. Primeiro, somente o DNA bacteriano é efetivamente recuperado porque as bactérias

são separadas das células fúngicas anteriormente à lise celular. O método também rende

células viáveis a partir da comunidade bacteriana do solo que poderiam ser sub-

16

amostradas e analisadas de formas variadas. Note, contudo, que células não viáveis

intactas também serão recuperadas.

Lise in situ e recuperação de DNA

Nesta metodologia, os microrganismos de interesse devem ser lisados dentro do

solo e seu DNA liberado antes de sua extração da amostra. Metodologias de lise celular

geralmente envolvem a combinação de tratamentos físicos e químicos. Para bactérias,

tratamentos físicos envolvem ciclos de congelamento-descongelamento e/ou sonication

(disruptura de material biológico por ondas sonoras) ou centrifugação de gotas, e

tratamentos químicos normalmente utilizam detergentes dodecil sulfato de sódio (SDS)

ou uma enzima tal como lisozima ou proteinase (More et al., 1994). Após a lise,

fragmentos celulares e partículas de solo são removidos por centrifugação, e o DNA no

sobrenadante é precipitado com etanol. O DNA pode ser purificado por passagem através

de colunas caseiras ou comerciais embaladas em resinas ou géis íon-transportadores.

Essas etapas são cruciais para a remoção de material húmico, que inibiria a análise do

DNA. Purificação adicional pode ser alcançada com extrações por fenol-clorofórmio/

isoamil álcool, seguidas mais uma vez de precipitações com etanol (Xia et al., 1995).

Amostras puras de DNA são necessárias para permitir análises moleculares subseqüentes

tais como a reação da cadeia de polimerase (PCR) (veja capítulo 13.3.2). No entanto,

independente de qual metodologia de purificação for empregada, cada passo do processo

de purificação causa perda de DNA. Dessa forma, DNA purificado é obtido somente às

custas do rendimento de DNA.

Uma maior vantagem da metodologia de lise direta é o fato de ser menos

trabalhosa e mais rápida que o método de fracionamento bacteriano. Além disso, também

geralmente produz maiores rendimentos de DNA (1-20µg de DNA por grama de solo).

Finalmente, essa abordagem parece representar melhor a comunidade bacteriana melhor

que o método de fracionamento uma vez que não é afetada pela fixação das células aos

colóides da argila. Como resultado, o método de lise direta é mais comumente utilizado.

Embora a lise direta tenha muitas vantagens, também apresenta alguns problemas. Um

17

problema associado à extração do DNA é a distinção do DNA livre do DNA celular. O

DNA livre liberado a partir dos microrganismos lisados naturalmente algum tempo antes

da extração do DNA pode, às vezes, estar protegido da degradação por fixação a

partículas do solo (Lorentz & Wackernagel, 1987). Contudo, a evidência disponível

indica que o DNA livre (extracelular) é ora degradado rapidamente ora se fixa à colóides

do barro e normalmente não é extraído por esses procedimentos (Holben, 1994). A

fixação do DNA de células lisadas à colóides do barro ou húmicos também pode reduzir o

rendimento de DNA extraído (Ogram et al., 1987). Na verdade, a maior desvantagem do

método de lise direta é que o DNA é geralmente mais contaminado por material húmico

que o DNA obtido pelo método de fracionamento bacteriano. Outra desvantagem é que o

DNA isolado pela lise direta tende a ser arrebentado ao acaso e de menor peso molecular

que o DNA extraído após o fracionamento celular. Originalmente, pensava-se que o DNA

obtido por lise in situ poderia também conter DNA de fungos e protozoários. Todavia, os

produtos químicos normalmente utilizados não lisam células fúngicas, os protozoários

estão presentes no solo a densidades muito mais baixas que as bactérias.

Conseqüentemente uma população de protozoários de 104 por grama é improvável de

contribuir significativamente com o DNA obtido de 108 – 109 bactérias, mesmo admitindo

o maior tamanho do genoma de protozoa.

Uma vez que uma amostra de DNA purificado é obtida a partir de uma amostra de

solo, ela pode ser quantificada por espectroscopia ultravioleta (UV). Normalmente as

leituras são feitas a comprimentos de onda de 260 nm e 280 nm a partir das quais a pureza

e quantidade do DNA podem ser estimadas (veja Quadro de Informações).

Após a quantidade de DNA por massa de solo ser conhecida, estimativas da

população microbiana podem ser feitas. Para bactérias como Escherichia coli, um

cromossomo típico contém 4-5 milhões de pares de bases, equivalente a cerca de 9 fg (9 x

10-5 g) de DNA. Contudo, a quantidade de DNA por célula varia e outras estimativas são

mais baixas, aproximadamente 4fg por célula. A quantidade de DNA por célula também

pode varia devido à replicação cromossômica ocorrer mais rápido que a divisão celular,

resultando em dois ou três cromossomos por célula (Krawiec & Riley, 1990). Estas

18

estimativas teóricas de DNA podem ser usadas para relacionar o DNA total extraído e o

número de microrganismos de uma amostra. A Tabela 8.4 mostra o DNA total extraído de

quatro solos alterados com glicose. A quantidade de DNA obtido aumentou com a quantia

de matéria orgânica no solo (mistura de lodo e loam – mistura de areia, argila e matéria

orgânica), presumivelmente em função da presença de populações bacterianas mais

abundantes. O DNA extraído também diminuiu em solos com altas concentrações de

argila (loam de argila), mais possivelmente devido à fixação do DNA por colóides do

solo (Ogram et al., 1987). Além de tudo, a influência dos melhoramentos pode ser notada

com o tempo conforme a população microbiana aumenta por crescimento, resultando em

DNA mais fácil de ser extraído. O número teórico de células bacterianas que o DNA

extraído representa pode ser calculado.

Por exemplo, no tempo zero para o solo de mistura de barro:

DNA extraído = 0.12 µg / g de solo

Assim sendo, se cada célula possuir 4 fg de DNA,

Número de células = 0.12 x 10-6 g de DNA / g de solo

4 x 10-5 g de DNA / célula

= 3.0 x 107 células / g de solo

Valores similares no tempo zero para outros solos são 1.6 x 108 células / g de solo

(mistura arenosa), 3.3 x 108 células / g de solo (mistura) e 4.5 x 109 células / g de solo

(mistura limosa).

No total, o processamento de solo para obtenção de DNA bacteriano representa um

método alternativo para análises subseqüentes das comunidades bacterianas.

Metodologias comparáveis para obter DNA de comunidades de fungos ainda não foram

alcançadas. Isso pode se dever em parte à dificuldade de se lisar hifas de fungos sem

também lisar bactérias.

19

8.1.3.2) Processamento de solos para hifas fúngicas e esporos

Como para as bactérias, também é impossível o cultivo de todas as espécies viáveis

de fungos a partir de uma amostra de solo ou sedimento. Métodos de cultura para fungos

são descritos no Capítulo 10.3. Todavia, várias abordagens foram desenvolvidas para

isolamento direto de hifas ou esporos do solo. A primeira, é uma metodologia de lavagem

do solo. Esta, envolve a saturação de pequenos volumes de solo com água estéril. Os

agregados do solo são delicadamente desfeitos com um fino jato de água, permitindo que

partículas mais pesadas de solo seja sedimentadas e que partículas finas sejam removidas

para outro recipiente. O procedimento é repetido várias vezes até que somente

permaneçam as partículas mais pesadas. Estas então são espalhadas em um filme de água

estéril e examinadas sob microscópio de dissecção. Agulhas esterilizadas ou pinças bem

finas podem ser usadas para se obter qualquer hifa observada.

Para esporos, uma metodologia diferente pode ser usada. Amostras de solo

colocadas em caixas esterilizadas separadas cada uma delas contendo peneiras de

tamanhos graduados. As amostras de solo são lavadas vigorosamente em cada caixa, e

solo de tamanho definido é retido em cada uma das peneiras. Os esporos são

determinados empiricamente por lavagens sucessivas em placa (2 minutos por lavagem)

de cada peneira. Como as hifas são retidas pelas peneiras, qualquer colônia de fungos que

apareça deverá ser devido à presença de esporos. Informação sobre os fungos presentes

como hifas pode ser obtida pelo plaqueamento das partículas lavadas retidas pelas

peneiras. No entanto estes métodos de lavagem são intensamente trabalhosos e são

baseados na tentativa e erro em termos de que tamanhos são mais relevantes com relação

ao tamanho individual do esporo.

8.1.3.3) Processamento de lodo, solo e sedimento para vírus

Para avaliar de forma completa e entender os riscos de patógenos no ambiente, é

necessário determinar sua ocorrência em lodo da água de esgoto (biosólidos), solos aos

quais a água descartada ou lodo são aplicados, ou sedimentos marinhos que podem ser

afetados por descargas de água de esgoto ou dejetos do lodo. Na verdade, Agência de

Proteção Ambienta do E.U.A atualmente requer monitoramento de lodo para

20

enteroviroses para certos tipos de aplicações na terra. Para detectar vírus em sólidos é

primeiramente necessário extraí-los por processos que causarão sua liberação do sólido.

Como acontece com filtros microporosos (veja Capítulo 8.2.2.1), acredita-se que os vírus

se liguem a esses sólidos por uma combinação de forças eletrostáticas e hidrofóbicas (veja

Capítulo 7.2.3). Para recuperar vírus a partir dos sólidos, substâncias são adicionadas e

irão romper essas forças de atração, permitindo que os vírus sejam recuperados no fluido

diluidor(Berg, 1987; Gerba & Goyal, 1982).

O procedimento mais comum para lodo envolve a coleta de 500 – 1000 mL de lodo

e a adição de AlCl3 e HCl para ajustar o pH para 3.5. Sob estas condições, os vírus se

ligam às partículas de lodo, as quais são removidas por centrifugação e ressuspendida em

uma solução de extração de pH neutro para diluir o vírus. O problema principal com

concentrados de lodo de água de esgoto preparados dessa maneira é que eles geralmente

contêm substâncias tóxicas à cultura de células. Um diagrama dos detalhes deste

procedimento é apresentado na Figura 8.6. Técnicas de extração similares são utilizadas

para a recuperação de vírus a partir de solos e sedimentos aquáticos (Hurst et al., 1997).

8.2) ÁGUA

8.2.1) Estratégias e métodos de amostragem para água

A amostragem de águas ambientais para subseqüente análise microbiana é um

pouco mais fácil do que a amostragem de solos por uma série de razões. Primeiro, porque

a água tende a ser mais homogênea que solos, há menos variabilidade local entre duas

amostras coletadas na mesma vizinhança. Segundo, em geral, é fisicamente mais fácil

coletar amostras de água porque isso pode ser feito com bombas e mangueiras. Dessa

forma, volumes conhecidos de água podem ser coletados de profundidades conhecidas

com relativa facilidade. O montante de água coletado depende da avaliação da amostra

ambiental, porém pode variar de 1 mL a 1000 litros. A estratégia de amostragem também

é menos complicada para amostras aquáticas. Em muitos casos, devido à mobilidade da

água, um número de amostras volumosas é simplesmente coletado no mesmo ponto

durante intervalos de tempo variados. Tal estratégia seria útil, por exemplo, na

21

amostragem de um rio, ou na planta de tratamento de água potável. Para águas marinhas,

amostras são geralmente coletadas em tempos seqüenciais dentro de uma área de interesse

definida.

Embora a coleta de água seja relativamente fácil, o processamento da amostra

anteriormente à análise microbiana pode ser mais difícil. O volume da amostra de água

necessário para a detecção de microrganismos pode ser de difícil manuseio, uma vez que

o número de microrganismos tende a ser menor em amostras aquáticas que em amostras

de solo (veja Capítulo 6). Assim sendo, estratégias foram desenvolvidas para permitir a

concentração de microrganismos dentro de uma amostra de água. Para microrganismos

maiores, inclusive bactérias e protozoários parasitas, amostras são geralmente filtradas

para prender os organismos e concentrá-los. Em relação a bactérias, isso normalmente

envolve a filtração usando-se um filtro de membrana de 0.45 µm (Capítulo 10.2.1.3). Para

parasitas protozoários, filtros grossos tecidos com fibras são usados. Para vírus, amostras

aquáticas também são filtradas, mas devido às partículas virais serem geralmente

pequenas demais para serem fisicamente capturadas, a coleta das partículas virais depende

da combinação de interações eletrostáticas e hidrostáticas do vírus com o filtro. Os

variados requerimentos para o processamento de amostras de água para análise de vírus,

bactérias, e protozoários são descritas nas próximas duas seções.

8.2.2) Processamento de amostras de água para análise de vírus

A detecção e análise de vírus em amostras de água é geralmente difícil devido ao

baixo número encontrado e aos diferentes tipos que podem estar presentes. Há quatro

passos básicos na análise de vírus: coleta de amostra, diluição, reconcentração, e detecção

viral. Para coleta de amostras, é geralmente necessário passar grandes volumes de água

(100 a 1000 L) através de um filtro devido ao baixo número de vírus presentes. Os vírus

são concentrados a partir da água por adsorção ao filtro. A recuperação dos vírus a partir

do filtro envolve diluição do filtro coletor bem como uma etapa de reconcentração para

reduzir o volume da amostra antes do experimento. Vírus podem ser detectados por

cultura de células ou métodos moleculares como PCR. No entanto, ambos os métodos

22

podem ser inibidos pela presença de substâncias tóxicas na água que são concentradas

juntamente com as partículas virais. Muitas estratégias foram desenvolvidas para superar

as dificuldades associadas à análise viral, mas elas geralmente demandam muito tempo, e

são trabalhosas e custosas. Por exemplo, o custo da detecção de enterovírus varia de $600

a $1000 por amostra de água potável. Outro problema da análise viral é que a precisão e

a meticulosidade dos métodos usados sofrem devido ao grande número de etapas

envolvidas. Particularmente, a eficiência da recuperação viral associada a cada etapa

depende do tipo de vírus analisado. Por exemplo, o vírus da hepatite A pode não ser

concentrado tão eficientemente como rotavirus pelo mesmo processo. A variabilidade

também resulta da extrema sensibilidade desses experimentos. Métodos para a detecção

de vírus em concentrações tão baixas quanto uma unidade formadora de placa em 1000 L

de água foram desenvolvidos. Em uma base peso-por-peso com água, esta é uma

sensibilidade de detecção de uma parte em 108. Por comparação, o limite de sensibilidade

da maioria dos métodos disponíveis para compostos orgânicos é de cerca de 1µg / litro.

Isso corresponde a uma parte em 108.

8.2.2.1) Coleta de amostras

A análise viral é realizada em uma ampla variedade de tipos de água. Os tipos de

água testados incluem água potável, água do terreno e de superfície, água marinha, e de

esgoto. Essas águas variam grandemente em sua composição físico-química e contêm

substâncias dissolvidas ou suspendidas em solução, o que pode interferir na em nossa

habilidade de empregar uma variedade de métodos de concentração. A adequabilidade de

um método de concentração viral depende da densidade provável de vírus, das limitações

de volume do método de concentração para o tipo de água, e da presença de substâncias

interferentes. Uma amostra de volume de menos de 1 litro pode ser suficiente para a

recuperação de vírus a partir de água de esgoto pura e primária. Para água bebível e águas

relativamente não poluídas, os níveis de vírus são improváveis de serem tão baixos que

centenas ou até milhares de litros devam ser amostrados para aumentar a probabilidade da

23

detecção de vírus. Vários métodos empregados para a concentração de vírus a partir de

água são mostrados na Tabela 8.5.

A maioria dos métodos usados para concentração de vírus depende da adsorção do

vírus a uma superfície, tal como um filtro ou precipitado mineral, embora hidroextração e

ultrafiltração tenham sido empregadas (Gerba, 1987). Sistemas de campo para

concentração de vírus geralmente consistem de uma bomba para passagem de água

através do filtro (a taxas de 5 a 10 galões por minuto), um suporte para o filtro, e um

medidor de fluxo (Fig. 8.7A). O sistema inteiro pode, na maioria das vezes, ser contido

em uma caixa de gelo de 20 litros de capacidade.

A classe de filtros mais comumente utilizada para concentração de vírus a partir de

grandes volumes de água é a de filtros microporosos de adsorção-diluição, mais

24

conhecidos como VIRADEL (para vírus adsorção-diluição) (APHA, 1995). VIRADEL

envolve a passagem da água através de um filtro ao qual os vírus adsorvem. O tamanho

do poro dos filtros é muito maior que os vírus, e a adsorção se dá por uma combinação de

interações hidrostáticas eletrostáticas (Gerba, 1984). Dois tipos gerais de filtro estão

disponíveis: eletronegativo (carga da superfície negativa) e eletropositivo (carga da

superfície positiva). Filtros eletronegativos são compostos de ora de ésteres de celulose

ora de fibra de vidro com resina orgânica de ligação. Como os filtros são carregados

negativamente, sais catiônicos (MgCl2 ou AlCl2) devem ser adicionados em conjunto com

a redução de pH a 3.5. Isto reduz a carga negativa da rede geralmente associada a vírus,

permitindo que a adsorção seja maximizada (veja Capítulo 2.1.4.1). Tal ajuste de pH pode

ser enfadonho, conforme requer a modificação da água anteriormente à filtração e uso de

materiais e equipamentos adicionais, tais como medidores de pH. O filtro eletronegativo

mais usado é o Filterite. Geralmente é usado como um cartucho pregueado com tamanho

de poros variado, ora de 0.22µm ora de 0.45µm.

Filtros eletropositivos são ideais para a concentração de vírus a partir da água do

mar e de águas com elevadas quantidades de matéria orgânica e turbidez (Gerba et al.,

1978). Filtros eletropositivos podem ser compostos por fibra de vidro ou celulose

contendo uma resina orgânica polimérica positivamente carregada, que cria uma rede de

cargas positivas na superfície, para acentuar a adsorção de vírus carregados

negativamente. Esses filtros adsorvem vírus eficientemente através de uma variação de

pH ampla, sem necessitar de sais polivalentes. Contudo, eles não podem ser usados com

água do mar ou água de pH excedendo 8.0-8.5 (Sobsey & Glass, 1980). 1MSD Virozorb

eletropositivo é especialmente manufaturado para concentração de vírus a partir de água.

Os métodos que utilizam filtro VIRADEL sofrem várias limitações. A matéria suspensa

na água tende a ficar presa nos filtros, limitando, dessa forma, o volume que pode ser

processado e interferindo no processo de diluição. A matéria orgânica dissolvida e

coloidal em algumas águas pode interferir na adsorção dos vírus ao filtro,

presumivelmente por competição com os vírus pelos sítios de ligação. Finalmente, a

eficiência da concentração varia dependendo do tipo de vírus, provavelmente devido às

25

diferenças de ponto isoelétricos dos vírus, o que influencia na rede de cargas dos vírus em

qualquer pH.

8.2.2.2 - Eluição da amostra e reconcentração

Vírus adsorvidos são geralmente diluídas a partir das superfícies do filtro por

pressão filtrando um pequeno volume (1-2 litros) de uma solução de diluição através do

filtro. O diluente é geralmente um fluido protéico levemente alcalino, tal como extrato de

carne 1.5% ajustado para pH 9.5 (Fig. 8.7B). O pH elevado as cargas negativas em ambos

vírus e superfície do filtro, o que resulta em desligamento do vírus do filtro. A matéria

orgânica no extrato de carne também compete como o pela adsorção ao filtro,

posteriormente auxiliando no desligamento. O volume do diluente de 1 a 2 litros é, ainda,

muito grande para permitir análise viral sensível, e assim sendo, uma segunda etapa de

concentração (reconcentração) é usada para reduzir o volume a 20-30 mL antes do

experimento. O processo de diluição-reconcentração é mostrado em detalhes na Figura

8.8. No final, esses métodos podem recuperar enterovírus com uma eficiência de 30-50%

a partir de 400-1000L de água (Gerba et al., 1978; Sobsey & Glass, 1980).

8.2.2.3) Detecção de vírus

Várias opções disponíveis para a detecção de vírus são descritas detalhadamente no

Capítulo 10.5. Resumidamente, vírus podem ser detectados pela inoculação de uma

amostra em uma cultura de células animais seguida da observação das células para efeitos

citopagotênicos (CPE) ou pela enumeração de zonas claras ou de unidades formadoras de

placa (PFU) em monocamadas de células coradas por corantes vitais (ex., corantes que

marcam somente células vivas sem infecção viral). O método de PFU permite uma

quantificação dos vírus mais adequada, pois eles podem ser enumerados. PCR também

pode ser usado para detectar vírus diretamente em concentrados da amostra, bem como

em cultura de células animais. O procedimento global para amostragem de detecção de

vírus na água é mostrado na Fig. 8.8.

26

Fig 8.8 - Procedimentos de amostragem e detecção de vírus a partir de água.

27

8.2.3) Processamento de amostras de água para detecção de bactérias

O processamento de amostras de água para bactérias é mais simples que o

processamento requerido para vírus. Tipicamente, bactérias são coletadas e contadas por

um de dois diferentes procedimentos: filtração por membrana e número mais provável

(MPN). Filtração por membrana, como o nome indica, se baseia na coleta e concentração

de bactérias via filtração. No método de MPN, amostras são geralmente não processadas

anteriormente à análise. Em ambos procedimentos, as bactérias são detectadas via

métodos de cultura que são descritos no Capítulo 10, Seções 1.3 (MPN) e 2.1.3 (técnica

de filtração por membrana).

8.2.4) Processamento de amostras de água para detecção de protozoários

parasitas

Assim como para vírus entéricos, é necessária a ingestão de somente uns pouco

protozoários parasitas para causar infecção em humanos. Como resultado, são necessários

métodos sensíveis para análise de protozoários. Os métodos atuais foram desenvolvidos

para concentração e detecção de cistos de Giardia e oocistos de Cryptosporidium (Hurst

et al., 1997). O primeiro passo geralmente envolve coleta e filtração de grandes volumes

de água (usualmente centenas de litros). Durante a filtração, cistos e oocistos são presos

em um filtro de trançadas de porosidade nominal de 1µm (25cm de comprimento) (Fig.

8.9) feito de Orlon ou polipropileno. O volume preciso de água coletado depende da

investigação. Para águas de superfície é comum coletar-se 100-400 litros, e volumes em

excesso, de 1000 litros, têm sido coletados para análise de água potável. Geralmente, uma

bomba funcionando a um fluxo de 4-12 litros por minuto é usada para coletar a amostra.

O cartucho do filtro é colocado em uma bolsa plástica, que é vedada, armazenada no gelo,

e enviada a laboratórios para análise dentro de 72h.

28

Fig 8.9 - Filtro de fibras trançadas para concentração de cistos de Giardia e oocistos de

Cryptosporidium

No laboratório, os cistos e oocistos são extraídos cortando-se o filtro ao meio,

desenrolando-se o fio, e colocando-se a fibra em uma solução diluidora de Tween 80,

sódio dodecil sulfato, fosfato salina tamponado. Os filtros são lavados à mão em béqueres

grandes ou lavados em um stomacher mecânico. O volume resultante, de 3-4 litros, é

então centrifugado para concentrar os oocistos, ao quais são depois ressuspendidos em

formalina 10% ou dicromato de potássio tamponado (para Cryptosporidium). Cistos e

ooscistos ficam estáveis por muitas semanas quando armazenados em formalina ou

dicromato de potássio. Uma grande quantidade de matéria é concentrada juntamente com

cistos e oocistos, e o grão é posteriormente purificado por centrifugação por gradiente de

densidade, com soluções de Percoll-sacarose, sacarose, ou citrato de potássio. Alíquotas

das amostras concentradas são então filtradas através de um filtro de membrana de

celulose e acetato, o qual coleta os cistos e oocistos em sua superfície. Os cisto e oocistos

são corados com anticorpos monoclonais fluorescentes e o filtro é colocado sob um

microscópio de epifluorescência (Fig. 8.10). Corpos fluorescentes de tamanhos e formar

corretas são identificados e examinados por microscopia diferencial de contraste por

29

interferência, para a presença de corpos internos (ex., trofozoitos e esporozoitos). O

procedimento correto é mostrado na Fig. 8.11.

Fig 8.10 - Imunofluorescência de cistos de Giardia, oocistos de Cryptosporidium e esporos de Microsporidia, um patógeno emergente de ambiente aquático.

Embora este método consuma tempo e incômodo, tem sido bem sucedido no

isolamento de Giardia e Cryptosporidium a partir da maioria das águas de superfície nos

EUA (Rose et al., 1997). Este método também parece ser capaz de concentrar

protozoários parasitas microsporídios a partir de água. Existem várias desvantagens

associadas a este método de análise. Estas incluem eficiências de recuperação

freqüentemente baixas (5-25%); tempo de processamento de 1-2 dias; interferência

causada por algas fluorescente; incapacidade de determinar a viabilidade; e finalmente,

limitação no volume de amostra que pode ser coletada de alguns sítios devido à alta

turbidez e entupimento do filtro. Por essas razões, métodos para melhorar a eficiência

30

estão em desenvolvimento, incluindo filtração por membrana, ultrafiltração, agregação

por carbonato de cálcio e separação imuno-magnética.

Fig 8.11 - A) Procedimento de coleta e amostragem de protozoa a partir da água.

31

Figura 8.11B - Procedimento para coloração de anticorpos e exame de Giardia e Cryptosporidium

32

8.3) Detecção de microrganismos em FOMITES

Fomites são objetos inanimados que podem estar contaminados com organismos

infecciosos e servem em sua transmissão. Roupas, louça, brinquedos, topos de mesas, e

agulhas hipodérmicas são exemplos de fomites comuns. Fomites podem variar, em

tamanho, de pequenos como uma partícula de poeira caseira a tão grandes quanto uma

superfície de chão inteira, e em complexidade, de uma estrutura plana como uma mesa a

um delicado instrumento médico. O envolvimento de fomites na transmissão de doenças

foi reconhecido muito antes da identificação de alguns microrganismos patogênicos. Na

virada do século, a dispersão de varíola entre funcionários de lavanderias não era

incomum. Em 1908, surtos de varíola foram relacionados a algodão bruto contaminado

com vírus da varíola em crostas ou cascas (England, 1984). Também acredita-se que

fomites sejam importantes na transmissão de vírus respiratórios como rinovírus. Um surto

de vírus de hepatite B, tipicamente um vírus transportado pelo sangue, associado à

transfusão sangüínea, foi associado a cartões de computador como seu provável agente de

transferência. Esses cartões, quando manuseados, infligem pequenos ferimentos nas

pontas dos dedos, permitindo a transmissão e entrada do patógeno em um novo

hospedeiro (Pattinson et al., 1974). O crescimento de bactérias entéricas patogênicas em

esponjas domiciliares e em utensílios e superfícies usadas para preparação de comida foi

há tempos reconhecido como importante rota de transferência desses organismos a outros

alimentos ou superfícies, ou mesmo auto-inoculação quando os dedos que manusearam

alguma dos utensílios ou esponjas são trazidos à boca.

Fomites podem se tornar contaminados por microrganismos patogênicos por

contato direto com secreções ou fluidos infecciosos, mãos sujas, alimentos contaminados,

ou pelo ar. Para que os fomites sirvam de veículo de doenças microbianas, os organismos

devem ser capazes de sobreviver em associação com fomites e serem transferidos com

sucesso ao hospedeiro. A sobrevivência de organismos em uma superfície é influenciada

por temperatura, humidade, evaporação, dessecação, luz, radiação ultravioleta,

propriedades físicas e químicas da superfície, e a substância na qual o organismo está

suspenso. Patógenos entéricos e respiratórios podem sobreviver por minutos a semanas

33

em fomites, dependendo do tipo de organismo e dos fatores previamente listados (Sattar

& Springthorpe, 1997).

A amostragem de fomites é essencial na indústria de manufatura de alimentos para

se avaliar as práticas sanitárias e é de uso comum nas indústrias de serviços de alimentos

e cuidados da saúde, para se avaliar a eficácia da limpeza e desinfecção. Também é útil na

investigação epidemiológica e avaliação de desinfetantes de superfícies rígidas. As

metodologias mais comumente usadas na detecção de bactérias em fomites envolvem

placas de agar Rodac e a técnica de limpeza-enxagüe. Placas de ágar Rodac são placas de

petri em que o ágar enche toda a placa para produzir uma superfície convexa, que é então

pressionada contra a superfície a ser amostrada. Meios seletivos podem ser usados para o

isolamento de grupos específicos de organismos (ex., meio m-Fc para coliformes fecais).

Após a incubação, as colônias são contadas e relatadas como unidades formadoras de

colônia (CFU) por cm2 . O método de limpeza-enxagüe foi desenvolvido em 1917 para o

estudo de contaminação bacteriana em utensílios de alimentação (England, 1984).O

método é também adequado para amostragem de vírus. Um chumaço de algodão estéril é

umedecido com um tampão ou outra solução e esfregado sobre a superfície a ser

amostrada. A ponta do chumaço é então colocada assepticamente em um recipiente

contendo uma solução coletora asséptica, o recipiente é sacudido e o fluido de enxágüe é

analisado em um meio de cultura apropriado ou por uma técnica molecular, tal como o

método de PCR.