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C.M.G. Silva, E.T. Sales, S.V. Castro, et al. 2011. Ativina intraovariana: uma atualização sobre estrutura, regula-ção e função. Acta Scientiae Veterinariae. 39(4): 989.Acta Scientiae Veterinariae, 2011. 39(4): 989.

REVIEW ARTICLEPub. 989

ISSN 1679-9216 (Online)

Ativina intraovariana: uma atualização sobre estrutura, regulação e função

Intraovarian Activin: an Update on Structure, Regulation and Function

Cleidson Manoel Gomes da Silva, Emmanuel Teles Sales, Simone Vieira Castro, Adeline de Andrade Carvalho, Ana Paula Ribeiro Rodrigues & José Ricardo de Figueiredo

ABSTRACT

Background: Important advances have been made recently that clarify our understanding of the structural basis, signaling and regulation, as well as the biological role of activin in ovaries. During folliculogenesis various growth factors are pro-duced locally in the mammalian ovary. Among these factors, activin has been a focal point in research as it has emerged as a crucial substance capable of inducing follicular development. The important actions indicate that activin has many relevant homeostatic functions in the reproduction of several species. Therefore, this review discusses the ligand protein structure, activin receptors, mechanisms of action and regulation, as well as the importance of activin on in vitro culture of preantral follicles.Review: Activin belongs to the transforming growth factor β (TGF - β) super family. It is a homodimer or heterodimer of two similar but distinct subunits (βA and βB). The dimerisation of activin subunits gives rise to three forms of activin, which are classifi ed as, activin A (βA - βA), activin B (βB - βB) and activin AB (βA - βB). The biological activity of ac-tivin occurs through its connection with two types of cell surface receptors designated type I and type II. These receptors are represented by two isoforms, activin receptor types IA (ActR - IA), IB (ActR - IB), IIA (ActR - IIA) and IIB (ActR - IIB). Activin receptors are transmembrane proteins, composed of a ligand-binding extracellular domain, a transmembrane domain and a cytoplasmic domain with serine/threonine kinase activity. The transient activation of the receptor induces phosphorylation of protein mediators called Smads. Activation of Smad 2/3 by phosphorylation causes trimerization and hetero-oligomerization with the common Smad, Smad 4. This complex translocates to the nucleus to activating and regu-lating transcription of target genes. Members of another class of Smads act as negative regulators of the signal transduction pathway. Inhibitory Smad 7 can bind to type I receptors, preventing receptor–Smad 2/3 association, or by competitively binding of Smad 4, which blocks Smad intracellular translocation. In addition, within the extracellular environment, binding proteins such as follistatin and inhibin can modulate the biological activity of activin. In the ovaries of mammals specifi cally, activin participates in several cellular events, including cellular proliferation, differentiation, and survival, as well as assisting steroidal hormones during follicular development. Activin has been localized in the oocytes and granulosa cells of rodent, porcine, caprine and bovine follicles. Activin is also within the granulosa cells of human follicles and in the thecal layers of porcine and human. In addition, activin stimulates follicle growth in-vitro, is used in pre-antral ovine and caprine follicles and enhances growth and survival of human pre-antral follicles in vitro. Conclusion: Activin is controlled by competitive substances and a dynamic interaction between the various regulatory proteins responsible for coordinating several signaling pathways. The balance between the actions of these proteins is critical for regulation of gene expression in different structures, including pre-antral follicles. However, the nature of physiological effects of activin in the ovary is still equivocal and awaits clarifi cation.

Keywords: ovary, pre-antral follicle, activin, in vitro culture.

Descritores: ovário, folículo pré-antral, ativina, cultivo in vitro.

Received: May 2011 www.ufrgs.br/actavet Accepted: July 2011

Laboratório de Manipulação de Oócitos e Folículos Pré-Antrais (LAMOFOPA). Programa de Pós-graduação em Ciências Veterinárias (PPGCV). Uni-versidade Estadual do Ceará (UECE), Fortaleza, Brasil. CORRESPONDÊNCIA: C.M.G. Silva [[email protected] - Fax: +55 (85) 3101-9840]. Av. Paranjana, 1700, Campus do Itaperi, CEP 60740-000 Fortaleza, CE, Brasil.

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C.M.G. Silva, E.T. Sales, S.V. Castro, et al. 2011. Ativina intraovariana: uma atualização sobre estrutura, regula-ção e função. Acta Scientiae Veterinariae. 39(4): 989.

I. INTRODUÇÃOII. CARACTERIZAÇÃO ESTRUTURAL DA ATIVINA1. Ligantes2. ReceptoresIII. MECANISMO DE AÇÃOIV. PRINCIPAIS MECANISMOS DE REGULAÇÃO

DA SINALIZAÇÃO CELULAR INDUZIDA POR ATIVINA

1. Folistatina2. Inibina3. Smad 7V. EFEITOS DA ATIVINA SOBRE A FOLICULOGÊ-

NESE OVARIANAVI. CONCLUSÃOVII. REFERÊNCIAS

I. INTRODUÇÃO

A foliculogênese em mamíferos é um proces-so complexo e dinâmico que requer uma coordenada interação entre gonadotrofi nas de origem hipofi sária e fatores de crescimento produzidos no ovário [54]. Além das gonadotrofi nas, como o hormônio folículo estimulante (FSH) e o hormônio luteinizante (LH), que são necessárias para dar suporte ao desenvolvimento folicular, existem fatores intragonadais que exercem importantes funções na regulação local da foliculogê-nese [74]. Dentre os fatores sintetizados nos ovários, que comprovadamente atuam como reguladores da função ovariana destacam-se as ativinas [83].

A ativina é um dos membros pertencentes à família do fator de crescimento transformante - β (TGF-β) e tem sido descrita como molécula chave que controla o desenvolvimento folicular [38]. Diversos es-tudos têm demonstrado que a ativina exerce suas ações biológicas por meio da ligação, inicialmente, com receptores de ativina do tipo IIB (ActR - IIB). A partir desta ligação ocorre a formação de um heterocomplexo com o receptor de ativina IB (ActR - IB / ALK-4), podendo suscitar diferentes respostas celulares [65]. Estas respostas culminam por induzir a diferenciação [66] e/ou multiplicação das células da granulosa [93], induzir a maturação do oócito, bem como estimular a esteroidogênese [37].

Recentemente, McLaughlin et al. [56] verifi ca-ram que a adição de ativina ao meio de cultivo manteve a morfologia e integridade de oócitos recuperados de folículos secundários bovinos, isolados a partir de tecido ovariano cultivado por um período de oito dias. Além disso, foi demonstrado que a ativina interage

positiviamente com o FSH em células da granulosa, aumentando os níveis de RNAm para os receptores de FSH, bem como para a ciclina D2 e antígeno nuclear de proliferação celular, os quais desempenham um papel importante na progressão do ciclo celular [19]. Em caprinos, a adição de 10 ou 100 ng/mL de ativina-A ao meio de cultivo estimulou a ativação, crescimento e manteve a morfologia de folículos pré-antrais iniciais após sete dias de cultivo in situ [79]. Além disso, foi ve-rifi cado que a adição de altas concentrações de ativina (100 ng/mL) reduziu signifi cativamente o percentual de folículos atrésicos pós-cultivo.

Diante do signifi cativo papel que a ativina exer ce sobre a regulação da foliculogênese ovariana nos mamíferos, esta revisão tem como objetivo des-crever e discutir aspectos relacionados à caracteriza-ção estrutural dos ligantes e receptores, incluindo os principais mecanismos de ação e regulação da ativina. Além disso, visa fornecer importantes informações sobre a utilização de ativina no desenvolvimento in vitro de folículos pré-antrais em diferentes espécies.

II. CARACTERIZAÇÃO ESTRUTURAL DA ATIVINA

Inicialmente, a ativina foi identifi cada como fator de crescimento peptídeo encontrado no fl uido folicular ovariano suíno, responsável por estimular a secreção de FSH em culturas de células da adeno-hipófi se [87]. Posteriormente, a investigação sobre os fatores que regulam a foliculogênese suscitou a hipótese de que a ativina é uma importante molécula reguladora presente nos ovários [25].

A ativina pertence a uma família de proteínas denominada superfamília do fator de crescimento transformante - β (TGF - β) [58]. Sua estrutura é for-mada por homodímeros (ativina A: βA - βA, ativina B: βB - βB) e heterodímeros (ativina AB: βA - βB) e ligados por pontes de dissulfeto [65]. Contudo, tem sido descrito outras três subunidades β de ativina de-nominadas βC, βD e βE [89], cujo papel permanece pouco conhecido e, portanto, não serão foco de dis-cussão nesta revisão.

1. Ligantes

Semelhante a outros fatores de crescimento e diferenciação, a ativina é sintetizada na forma inativa [65], sendo o zimogênio um dímero de 110 kDa, com-posto por um grupamento peptídico, um prodomínio glicosilado e um domínio C-terminal [8]. De acordo com Ethier & Findlay [20], sua atividade biológica

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tem início após um processo de clivagem proteolítica que culmina com a liberação das porções maduras C-terminal, originando as subunidades β.

Embora estudos biológicos in vitro geralmente descrevam ações idênticas entre ativina A e B [90], a ativina B, diferentemente da ativina A, mostrou ter mais afi nidade por receptores do tipo I [86], sugerindo que as ativinas A e B podem ter ações distintas. In vivo esta hipótese é apoiada pelos diferentes fenóti-pos observados com ativina A e B em camundongos knockout [53]. In vitro, estudos demonstram que a ativina A é um potente estimulador das células - β no pâncreas para produção de insulina [73]. Entretanto, Bertolino et al. [6] verifi caram que o Alk7 (presumí-vel receptor de ativina B) é um regulador negativo da função de células - β, demonstrando que as ativinas A e B possuem efeitos antagônicos em células pancreá-ticas. No ovário, a forma predominante é a ativina A [68]. Contudo, poucos estudos são direcionados para avaliar possíveis diferenças entre ativina A e B, o que difi culta o entendimento sobre o padrão de expressão, bem como da dinâmica de secreção desses ligantes no contexto da foliculogênese ovariana.

2. Receptores

A superfamília TGF - β tem suas respostas celulares obtidas através da interação com receptores do tipo serina-treonina quinase, denominados de ActR - IA, ActR - IB, ActR - IIA e ActR - IIB, presentes na superfície de diferentes células e tecidos [16]. Estes receptores são glicoproteínas que possuem peso mole-cular entre 55 e 70 kDa, caracterizados por apresentar uma estrutura composta por um domínio extracelular de ligação à ativina, um domínio transmembrana e um domínio citoplasmático com atividade tirosina-quinase [37].

O ActR - IIA foi o primeiro receptor da su-perfamília TGF - β a ser clonado a partir de células extraídas da hipófi se de camundongos [48], sendo posteriormente clonado em várias outras espécies, tais como humanos [52], bovinos [21], anfíbios [39] e peixes [60]. Posteriormente, o ActR - IIB foi clonado e caracterizado a partir de um número de espécies de vertebrados, incluindo humanos [32], camundongos [3], ratos [24] e bovinos [22]. A partir da comparação das sequências de ActR - IIB clonados nestas espé-cies, foi revelado que o domínio quinase é a região mais conservada nestes receptores. Por exemplo: no peixe-zebra o ActR - IIB apresenta 82 a 88% de

similaridade na sequência de aminoácidos presentes no domínio quinase, quando comparado a receptores ActR - IIB clonados a partir de humanos, sugerindo que a ativina pode exercer funções similares entre peixes e mamíferos [26].

Os receptores do tipo I (ActR - IA e ActR - IB) também já foram clonados a partir de várias espécies de mamíferos [51,81]. Eles apresentam como carac-terística única, a presença de uma região altamente conservada denominada “TTSGSGSG” presente na região citoplasmática, também conhecida como do-mínio GS (região rica em glicina e serina) [84]. Além dessas particularidades, acredita-se que os diferentes receptores de ativina podem sofrer splicing alternativos pós-transcripcionais, os quais podem gerar diferentes isoformas destes receptores e, consequentemente, alterar de forma considerável suas afi nidades e espe-cifi cidades pelos diferentes ligantes da superfamília TGF - β [42].

III. MECANISMO DE AÇÃO

O mecanismo de ação dos membros pertencen-tes à superfamília TGF - β é regulado por uma família de proteínas denominada Smad. Até o momento são conhecidas três subfamílias funcionalmente distintas de Smad: as Smads reguladoras ou R-Smads (Smad 1, Smad 2, Smad 3, Smad 5 e Smad 8), as Smads me-diadoras comuns ou co-Smads (Smad 4) e as Smads inibidoras ou I-Smads (Smad 6 e Smad 7) [47]. No que se refere à ativina, esta proteína se liga inicialmente no receptor do tipo IIB (ActR - IIB), que induz a fosfori-lação, recrutamento e ativação do receptor de ativina do tipo IB (ActR - IB). O ActR - IB, transitoriamente ativado, interage e fosforila as Smads 2 e 3. Uma vez fosforiladas, essas Smads formam um heterocomple-xo com a Smad 4, o qual é translocado até o núcleo, ligando-se à região promotora de genes-alvos, susci-tando respostas celulares diversas, como a proliferação e manutenção da sobrevivência ou a apoptose [15]. Quanto aos receptores ActR - IA e ActR - IIA, estudos têm demonstrado que estas moléculas são mais espe-cífi cas para outros membros da superfamília TGF - β, como as proteínas morfogéneticas ósseas (BMP) e o próprio TGF - β [47].

IV. PRINCIPAIS MECANISMOS DE REGULAÇÃO DA SINALIZAÇÃO CELULAR INDUZIDA POR ATIVINA

O processo de sinalização celular desenca-deado pelos vários membros da superfamília TGF

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- β são regulados em diferentes níveis. No meio extracelular, proteínas de ligação como a folistatina e inibina são capazes de modular a atividade bioló-gica da ativina. No meio intracelular, além da Smad inibitória 7, existem outras proteínas, por exemplo: BAMBI (proteínas inibidoras de ligação de membra-na de proteína morfogenética óssea e ativina), ARIP (proteínas de interação com receptores de ativina) e a BMP-3 (proteína morfogenética óssea - 3), capazes de regular diversas vias de sinalização [15]. Durante a transcrição, há uma infi nidade de co-ativadores e co-repressores no núcleo [47], que podem modifi car a transcrição iniciada pelas proteínas Smad [25]. Os principais processos de antagonismo de sinalização da ativina no meio extracelular e intracelular estão representados na fi guras 1. A seguir serão abordadas as principais substâncias que interferem com a ação da ativina no ovário.

1. Folistatina

A folistatina é uma proteína composta por uma cadeia polipeptídica monomérica glicosilada que se liga com alta afi nidade à ativina, inibindo a sua ação

sobre as células alvo, como por exemplo, nas células da granulosa ou mesmo diminuindo a liberação de FSH induzida pela ativina [90]. Assim, o equilíbrio entre folistatina e ativina desempenha um papel crucial na adenohipófi se para regular a produção diferencial de FSH pelas células gonadotrófi cas, assegurando a função normal do eixo reprodutivo e da fertilidade [7]. Segundo Pangas & Woodruf [65], a folistatina possui alta afi nidade para se ligar à ativina, impedindo sua interação com o receptor do tipo ActR - IIB, sendo, portanto, a principal proteína reguladora da bioativi-dade da ativina.

Atualmente são conhecidas três isoformas de folistatina: folistatinas 315, 288 e 303. As duas primeiras são oriundas de diferentes processos pós-transcricionais, enquanto a última é gerada através de clivagem proteolítica a partir da folistatina 315 [11]. A folistatina 315 é a forma mais presente no líquido folicular [17], parece ser a isoforma predominante por ser a forma mais longa e não se ligar aos pro-teoglicanos de membrana. Por outro lado, a forma mais curta, folistatina 288, que se liga fortemente aos proteoglicanos das membranas celulares, parece ter

Figura 1. Mecanismo de ação e inibição da ativina, adaptado de Ethier & Findlay [20]. Inicialmente a ativina se liga aos seus receptores ActR - IIB que, por sua vez, recrutam e fosforilam os receptores ActR - IB, os quais fosforilam as Smad 2 e 3. Contudo, esta fosforilação pode ser bloqueada de três formas: i) através da ligação entre a folista-tina e ativina, impedindo a ligação desta aos seus receptores; ii) devido a alta afi nidade da inibina aos receptores ActR - IIB após ligação ao betaglicano, impedindo que haja a ligação de ativina ao seu receptor ActR - IIB; e iii) através da Smad inibitória 7, o que culmina com a ausência de sinalização intracelular. Caso não haja a presença destas proteínas regulatórias, as Smad 2 e 3 são fosforiladas e se dimerizam com a Smad 4, e este dímero é então translocado para o núcleo, onde se associa com co-fatores transcricionais específi cos, promovendo a transcrição de genes alvos. ( - ) Pontos de regulação da sinalização induzida por ativina.

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um importante papel no processo de internalização e degradação do complexo folistatina-ativina [15,20]. Além dessas diferenças, a afi nidade das folistatinas pela ativina infl uencia na ligação de ambas. Chen et al. [15], verifi caram que existe uma diferença signifi cativa na ligação da folistatina com as isoformas de ativina, uma vez que a afi nidade da folistatina pela ativina A é cerca de 10 vezes maior que sua afi nidade pela ativina B. Essa observação evidencia que a folistatina é im-portante principalmente no antagonismo da ativina A.

2. Inibina

A inibina é uma glicoproteína produzida pelos folículos ovarianos e que tem sua atuação na hipófi se [65]. Esta glicoproteína atua inibindo a secreção de FSH e caracteriza-se por ser um potente antagonista de ativina. Sua ação parece ser mediada através da sua ligação ao receptor ActR - IIB. Esta ligação deixa o re-ceptor de ativina indisponível, interrompendo o início da cascata de eventos intracelulares que resultam no efeito fi nal da ativina [90]. Este modelo de inibição por competição, até pouco tempo, não elucidava totalmen-te a ação da inibina, visto que sua afi nidade pelo ActR - IIB é considerada muito baixa quando comparada com a ativina [27]. Contudo, alguns estudos sugerem que um composto presente na superfície celular, o betaglicano, possua a característica de se ligar à inibina A, aumentando sua afi nidade pelo ActR - IIB, o que reforça a hipótese de que o mecanismo de inibição seja realmente por competição pelo receptor [5].

Acredita-se que o betaglicano age como um co-receptor e, devido à sua alta afi nidade com a inibina, forma um complexo inativo ao se ligar aos receptores do tipo II da ativina (ActR - IIA ou ActR - IIB) [36]. Desta forma, o receptor fi ca sequestrado neste com-plexo e impedido de se ligar à ativina [27]. A inibina, na presença de betaglicano endógeno ou exógeno, blo-queia as respostas celulares para diversos membros da família TGF - β em uma variedade de tipos de células [91]. De fato, estudos indicam que a inibina compete com membros da família TGF - β pelo acesso ao ActR - IIB e esta competição é facilitada pelo betaglicano. De acordo com Wiater & Vale [91], em células trans-fectadas estavelmente com betaglicano, foi notória a ausência de resposta das mesmas quando cultivadas na presença de BMP-2. Estes resultados demonstram que a inibina, juntamente com o betaglicano, pode funcionar como um antagonista de respostas às BMPs, sugerindo um amplo papel da inibina e betaglicano na

restrição de um amplo espectro de sinais induzidos pelos membros da superfamília TGF - β [29].

3. Smad 7

A Smad 7 é uma proteína pertencente à família de proteínas transdutoras de sinal, conhecida como “Smads” [31]. A Smad 7 é uma potente inibidora da sinalização da ativina [5] e atua bloqueando a fosfo-rilação das Smads 2 e 3 [27]. Desta forma, a Smad 7 proporciona um feedback negativo na regulação para esta via de sinalização induzida pela ativina [85]. Curiosamente, a Smad 7 normalmente reside no núcleo e se move para o citoplasma em resposta ao TGF - β, sugerindo que TGF - β não só aumenta a expressão da Smad 7, mas também mobiliza um conjunto de Smads 7 nuclear pré-existente para inibir a sinalização induzida por receptores da superfamília TGF - β [34]. Além disso, estudos têm demonstrado que a ativina também induz um aumento da expressão da Smad 7 em células gonadotrófi cas na adenohipófi se, sugerindo um mecanismo de downregulation [7]. Apesar dos avanços nessa área, os exatos mecanismos celulares que coordenam as ações da ativina em células gona-dotrófi cas, bem como a cinética de expressão do FSH, ainda não são totalmente esclarecidos, evidenciando a necessidade de mais estudos nesse contexto.

V. EFEITOS DA ATIVINA SOBRE A FOLICULOGÊNESE

OVARIANA

Nossa equipe tem testado uma série de subs-tâncias com o objetivo de avaliar seus efeitos no cultivo in vitro de folículos pré-antrais. Utilizando o modelo in situ, ou seja, o cultivo in vitro de folículos pré-antrais inclusos no córtex ovariano, já foram testados hormô-nios como o ácido indol acético (IAA) [50], hormônio folículo estimulante (FSH) [45], hormônio luteinizante (LH) [72] e androstenediona [41]; bem como fatores de crescimento como o fator de crescimento epidermal (EGF) [9], Kit Ligand (KL) [l0], fator de crescimento e diferenciação - 9 (GDF - 9) [46], fator de crescimento do nervo (NGF) [14], fator de crescimento fi broblásti-co - 2 (FGF-2) [49], proteína morfogenética óssea -7 (BMP-7) [2], fator de crescimento keratinócito (KGF) [23], ativina A [79], além de antioxidantes como o ácido ascórbico [70]. Além disso, no modelo de cultivo de folículos pré-antrais isolados já testamos o efeito de diferentes concentrações de oxigênio [77], bem como a presença das gonadotrofi nas LH [76] e FSH [71], além de fatores de crescimento como o EGF [11], KL [40],

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BMP - 15 [12] e ativina A [78], sendo este último um dos fatores em teste no nosso laboratório, e, portanto, foco de discussão desta revisão. A seguir descrevere-mos os principais resultados de uma série de estudos destinados a avaliar os efeitos da ativina A no cultivo in vitro de folículos pré-antrais em diferentes espécies.

A ativina é um fator de crescimento produzido no ovário que estimula a atividade da aromatase, a for-mação da cavidade antral e a proliferação das células da granulosa [93]. A localização desta proteína, bem como de seus receptores, já foi detectada em oócitos e células da granulosa de roedores [93], suínos [88], caprinos [79], bovinos [33], humanos [69] e em células da teca de suínos [88] e humanos [69].

Apesar da maioria dos trabalhos demonstrarem efeitos positivos da ativina sobre o desenvolvimento folicular, existem fortes evidências em ratos que osci-lações na concentração de ativina intraovariana afetam diretamente o desenvolvimento folicular de forma estádio-dependente [57]. Além disso, parece existir também um efeito dose-dependente em camundongas, uma vez que a utilização de altas doses (100 ng/mL) de ativina pode estimular o aumento da produção de folistatina. Este aumento pode acarretar na redução da atividade biológica da ativina, e consequentemente alterar a diferenciação das células somáticas, modi-fi cando a ação estimulatória da ativina [62]. Apesar desses achados, ainda são necessários mais estudos para elucidar este efeito dual da ativina durante a fo-liculogênese ovariana em diferentes espécies.

Durante o cultivo in vitro de folículos pré-antrais de camundongas, a adição de ativina ao meio de cultivo propiciou a manutenção de altas taxas (92%) de sobrevivência folicular [64] e, quando foi adicio-nada no cultivo tridimensional, resultou em melhores condições para o crescimento e sobrevivência folicular in vitro [63]. Ademais, quando realizado o nocaute do gene que codifi ca a ativina em camundongas trans-gênicas, verifi cou-se uma redução signifi cativa na fertilidade destes animais, culminando posteriormente com a completa esterilidade das mesmas [66]. Além disso, durante a ovulação há um notório acúmulo de ativina, o que sugere uma ação biológica direta desta substância sobre o processo de ovulação e maturação oocitária [1].

Sabe-se, no entanto, que durante o desenvol-vimento folicular, os efeitos da ativina podem ser limitados pelo excesso da produção de inibina [61].

Os efeitos da ativina podem também ser minimiza-dos ou até mesmo ser bloqueados pela folistatina em folículos pré-antrais de camundongas imaturas [44], sugerindo que o sistema ativina-folistatina desempe-nha um papel importante no controle intraovariano da foliculogênese. A inibição da ativina pode ser crucial ao desenvolvimento folicular uma vez que a ativina A participa indiretamente da síntese de 17-β estradiol, através da transcrição da enzima 17-β hidroxiesteróide desidrogenase tipo I em células da granulosa [4].

Contrariamente aos estudos previamente des-critos, Mizunuma et al. [57] verifi caram que a adição de folistatina (antagonista de ativina) ao meio de cultivo causou um aumento signifi cativo do diâmetro de foliculos pré-antrais, demonstrando assim que a ativina está envolvida na ação inibitória do crescimen-to de folículos iniciais. Curiosamente, Liu et al. [43] demonstraram que a ativina A provocou um aumento signifi cativo no tamanho dos folículos pré-antrais de camundongas imaturas, porém, não alterou o tamanho dos folículos pré-antrais de camundongas adultas. Esses achados sugerem um efeito paradoxal da ativina nesta espécie, ou seja, estimula o desenvolvimento folicular em camundongas pré-púberes, mas não em adultas. De acordo com Yokota et al. [92], estas dife-rentes respostas ao estímulo da ativina parecem estar diretamente relacionadas com o processo de maturi-dade física da fêmea estudada.

El-Hefnawy & Zeleznik [19] demonstram que a adição de ativina e FSH aumenta consideravelmente os níveis de RNAm para a ciclina D2 e antígeno de proliferação nuclear, os quais desempenham um papel importante na progressão do ciclo celular em células da granulosa de folículos de ratas. A ativina também atua sinergicamente com o GnRH resultando em au-mento da atividade transcricional da subunidade β de FSH [28]. Adicionalmente, em folículos pré-antrais de ratas, a adição de ativina A ao meio de cultivo resultou em aumento signifi cativo no crescimento folicular de maneira dose-dependente e indução da proliferação das células da granulosa e formação de antro [93].

Na espécie humana, há fortes evidências de que a ativina possui importantes papéis durante a foliculogênese [20]. No entanto, os estádios exatos de desenvolvimento folicular que são regulados pela ativina ainda são incertos. Telfer et al. [82] observaram que apenas folículos cultivados na presença de ativina mantiveram o oócito saudável e formaram cavidade

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antral. Além disso, verifi cou-se um efeito positivo da ativina na promoção da sobrevivência e crescimento folicular, principalmente no início do cultivo, momento em que 90% dos folículos foram capazes de crescer na presença de ativina quando comparado ao grupo controle (36%).

Em outros estudos nesta mesma espécie, foram demonstrados altos níveis de RNAm para a subunidade β de ativina em células da granulosa de pequenos e grandes folículos [13], sendo esta expressão direta-mente correlacionada com a capacidade de prevenir a luteinização das células da granulosa in vitro [59]. Por outro lado, Pangas et al. [67] verifi caram por imuno-marcação que os receptores de ativina do tipo II estão presentes apenas em oócitos e células do cumulus de folículos secundários humanos. No entanto, a ativina não é produzida nesses folículos, sugerindo que estes receptores ou são inativos nesta fase, ou são utilizados por outra proteína. Contudo, a adição de 50 ng/mL de ativina A pode inibir a ativação espontânea, indicando que a ativina pode participar dos mecanismos de sina-lização que mantêm a quiescência de folículos primor-diais humanos in vitro [18]. Em bovinos, Hulshof et al. [33], através da técnica de imunohistoquímica, detec-taram tanto a presença da proteína, quanto do receptor ActR - IIB para ativina em folículos pré-antrais ini-ciais. Além disso, constataram que a adição de ativina ao meio de cultivo aumentou o crescimento folicular, bem como a proliferação das células da granulosa em associação com o FSH. Em outro estudo, Silva et al. [75] identifi caram, também por imunohistoquímica, uma ampla distribuição da subunidade βA da ativina em células do cumulus de oócitos bovinos durante os procedimentos de maturação e fertilização in vitro. Recentemente, McLaughlin & Telfer [55] observaram que a adição de ativina, sozinha ou em associação com o FSH, além de aumentar o crescimento folicular e a esteroidogênese, manteve a morfologia de folículos secundários bovinos cultivados in vitro por 21 dias. Além disso, foi demonstrado que a ativina promove o crescimento e a diferenciação de folículos pré-antrais bovinos, mantendo a morfologia do oócito normal após oito dias de cultivo in vitro [56]. Por outro lado, a adição de ativina ao meio de maturação não parece afetar a capacidade de desenvolvimento de oócitos bovinos até o estádio de blastocisto [35].

Em ovinos, durante o desenvolvimento fetal, o sistema ativina/folistatina, além de atuar sobre desen-

volvimento folicular, tem sido implicado em diversos processos reprodutivos, incluindo a morfogênese das glândulas endometriais e desenvolvimento uterino nesta espécie [30]. Em folículos pré-antrais ovinos, Thomas et al. [83] verifi caram que a adição de ativina ao meio de cultivo estimulou o crescimento folicular e oocitário in vitro, porém não acelerou a diferenciação das células foliculares durante seis dias de cultivo. A ativina também exerce um efeito diferenciado sobre a esteroidogênese das células da granulosa, uma vez que parece suprir de forma signifi cativa a produção de progesterona e aumentar a de estradiol [74]. Estes resultados também sugerem que a ativina é um regu-lador local da foliculogênese em ovinos, favorecendo a diferenciação das células da granulosa e inibindo o processo de luteinização.

Devido a importância do sistema ativina/fo-listatina, diversos estudos têm verifi cado a presença de RNAm para subunidade A da ativina, folistatina, bem como para os receptores de ativina (ActR - IIA, ActR - IIB, ActR - IA e ActR - IB) em todos os tipos de células e compartimentos foliculares em caprinos, exceto o receptor ActR - IIB, que não foi encontrado em folículos que ainda não tinham desenvolvido antro [80]. Posteriormente, verifi cou-se que o crescimento e a sobrevivência in vitro de folículos ativados inclu-sos em tecido cortical ovariano caprino, bem como o crescimento in vitro de folículos primários isolados, também são estimulados por ativina [79]. Além disso, nesta mesma espécie, após 72 h da adição de 100 ng/mL de ativina em meio de cultivo quimicamente defi -nido, para o cultivo de células da granulosa oriundas de folículos antrais (2 - 6 mm), foi detectado um aumento signifi cativo na produção de estradiol, concomitante-mente com uma redução signifi cativa nos níveis de progesterona, demostrando que a ativina exerce efeitos diretos sobre a esteroidogênese folicular caprina [74].

Em ovários suínos contendo corpo lúteo fun-cional, Van den Hurk & Van de Pavert [88] demons-traram que tanto a ativina, como seus receptores estão presentes em todas as categorias foliculares, bem como no corpo lúteo e epitélio de superfície do ovário. Além disso, esses autores demonstraram que as células da granulosa e da teca funcionam como principais locais de síntese de ativina, enquanto o oócito e as células da granulosa são os principais sítios de ligação. Esses achados indicam um papel tanto autócrino como pará-crino da ativina sobre as células foliculares em suínos.

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Apesar destes estudos, poucos trabalhos têm sido conduzidos visando avaliar o efeito da ativina sobre o desenvolvimento de folículos pré-antrais.

VI. CONCLUSÃO

Diante do exposto, torna-se evidente que as funções exercidas pela a ativina no meio extracelular são controladas tanto por inibidores competitivos, como a inibina, quanto por moléculas de adesão, como a folistatina. Por outro lado, no meio intracelular há

uma interação dinâmica entre as várias proteínas si-nalizadoras e reguladoras responsáveis por coordenar diversas vias de sinalização. O balanço entre as ações destas proteínas é fundamental para regulação da expressão gênica em diferentes estruturas, incluindo folículos pré-antrais. Assim, a relação direta entre ativina e o desenvolvimento folicular continua sendo um importante foco de estudo para elucidar diversos aspectos relacionados à foliculogênese em diferentes espécies mamíferas.

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