1Procedimentos Para a Implantação de Um Laboratório de Cultivo de Tecidos

ISSN 0100-6460

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Campina Grande, PB

Dezembro, 2002

Julita Mª Frota Chagas Carvalho,Agrônoma, Dr. Pesquisadora daEmbrapa Algodão. Rua OsvaldoCruz, 1143, Centenário. CP. 174,CEP 58107-720, Campina Grande,PB.e-mail julita@cnpa.embrapa.br

Procedimentos Para a Implantação de um Laboratório de

Cultivo de TecidosCultivo in vitro de tecidosvegetais pode ser definidocomo o crescimento e amultiplicação de células,tecidos, órgãos ou parte deórgãos de uma planta sobreum meio nutritivo e emcondições assépticas. Ocultivo in vitro baseia-seprincipalmente noaproveitamento datotipotência das célulasvegetais, ou seja, nacapacidade de produzir

órgãos como brotos e/ou raízes ou embriões somáticos queregeneram uma planta completa num meio de cultivo favorável(TORRES, 1990).

O cultivo de tecidos é uma ferramenta muito signiticativa paraacelerar os programas de melhoramento, já que pode oferecer novasalternativas em suas diferentes fases e, muitas vezes oferecesoluções únicas. Também é importante na engenharia genética, poisa transformação requer que se possa cultivar in vitro protoplastos,células e tecidos de plantas aos quais serão incorporadas os genes eque a partir das células transformadas se possam regenerar plantas.

Um laboratório de cultura de tecidos não deve ser localizado emambientes sujeitos a poeira e a corrente de ar nem próximo a fontespotenciais de microrganismos ou contaminação química, já que ocultivo in vitro de células, tecidos ou órgãos vegetais se caracterizapor se realizar em condições assépticas. O interior do recipiente decultivo deve estar livre de qualquer organismo capaz de proliferar eafetar o desenvolvimento do material vegetal, daí a importância dese manter o ambiente estéril durante o processo.

Este tipo de laboratório tem algumas particularidades que odistinguem dos demais. A implantação e organização dependem desua finalidade e do número de pessoas que nele vão trabalhar; assim,um laboratório destinado exclusivamente à micropropagação combase em protocolos estabelecidos, tende a ser maior, porém maissimples em instalações e equipamentos que um laboratório destinadoà pesquisa com diferentes sistemas ou, ainda, com aspectosbioquímicos, genéticos e estruturais, entre outros; pode ser pequeno,porém, mais especializado. Um laboratório de pesquisa pode,também, ter finalidade didática caso em que se pode reservar áreaspara ensino e demonstrações.

o o o o o Estrutura Física do Laboratório de Cultivo de Tecidos

Num laboratório de cultivo de tecidos devem constar:

Ante-sala

Este ambiente servirá para proteger o laboratório das ações do

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Autores

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ambiente externo, razão por que se deve colocartapetes na entrada para as pessoas, limparem ospés.

Sala de lavagem e esterilização

É nesta sala que ficará a autoclave e, por motivode segurança, não deve haver trânsito constantede pessoas. Como em todo laboratório, os pisos eparedes devem ser branco e lisos para evitaracúmulo de poeira e facilitar a limpeza, enquantoas janelas devem ser de vidro, a fim de quepermaneçam fechadas. Em funcionamento, aautoclave aquece o ambiente; recomenda-seisolar, esta sala das outras que mantenham arcondicionamento em funcionamento. Aqui, osequipamentos necessário são: estufa grande,para secagem e esterilização do material devidro, autoclave, destilador e deionizador de águae lavador de pipetas e um exaustor, paraeliminação dos vapores desprendidos pelaautoclave. Deve-se ter especial cuidado decolocar tomadas para os equipamentos.

Sala de preparação de meios de cultivo

Nesta sala serão preparados os meios de culturaa partir de soluções estoque, que serãodistribuídos em tubos de ensaio e/ou em frascosde cultivo. Por isto, deve-se ter maior atençãocom a assepsia mais que com a sala de lavageme esterilização. Portanto, aqui, o piso e asparedes devem ser branco e lisos para evitaracúmulo de poeira e facilitar a limpeza e asjanelas devem ser de vidro, afim de quepermaneçam fechadas. Recomenda-se colocar,na sala, um aparelho de ar condicionado com ointuito de manter a temperatura agradável, umavez que o calor gerado por lâmpadas e outrosequipamentos, que eleva a temperatura. Comoequipamentos necessários nesta sala citam-se:geladeira, freezer, peagâmetro, balanças de topoe analítica, dois agitadores magnéticos, forno demicroondas e estabilizador de voltagemressaltando-se, porém, que outros equipamentospodem facilitar bastante o trabalho nolaboratório, como, um dispensador de meio quetorna mais ágil e, ao mesmo tempo, uniformiza adistribuição do meio de cultura nos frascos decultivo; uma máquina de lavar louça tambémpode ser recomendada, uma vez que a prática decultivo de tecidos gera grandes quantidades defrascos a serem lavados. Os produtos químicosem uso deverão ser aqui mantidos nessa sala,enquanto a vidraria usada no preparo dos meiosde cultura deve estar disponível, assim comotubos e frascos com respectivas tampas, parareceber o meio, quando pronto; além disso, na

sala de preparação de meio de cultivo deve-secontar, ainda, com uma mesa grande parapreparação dos meios de cultivo, bancadas paracolocar os equipamentos de mesa, armários paraguardar produtos químicos, vidrarias einstrumentos, além, de duas pias grandes efundas para facilitar a lavagem da vidraria.Colocar tomadas para os equipamentos. Osmeios de cultura ficam mais bem conservados a4 ºC que em temperatura ambiente, sendoconveniente que esta sala contenha uma câmarafria de 1,5 m x 1 m com prateleiras onde serãoarmazenados os meios de cultivo.

Sala de inoculação

Nela, os materiais serão transferidos emcondições de esterilidade; portanto, mais que emqualquer outra sala do laboratório, deve ser amais asséptica. O piso e as paredes devem serbranco e lisos; ao contrário da sala anterior, nãohá necessidade de janelas nem de portas comacesso para o exterior do laboratório, evitando ofluxo de poeira, porém devem ser instaladoscondicionador de ar, considerando-se o calorgerado pelos motores da câmara de fluxolaminar, luzes, lâmpadas etc. Os equipamentonecessários são: câmara de fluxo laminarhorizontal e esterilizador de pinças. Nesta saladeve haver bancadas, tomadas e um carrinho-de-mão de hospital, para transportar os cultivos parasala de crescimento.

Sala de crescimento dos cultivos

Recomendam-se, na sala de crescimento doscultivos, piso e paredes brancas e lisas parafacilitar a limpeza. Os acessos devem serlimitados, reduzindo a chance de entrada depoeira e contaminação. Não há necessidade dejanelas, pois dificultariam o controle de luz etemperatura, mas, devem ser instalados doiscondicionadores de ar, com temperaturacontrolada; o controle ambiental é importantepara permitir um crescimento ótimo e ofotoperíodo deve ser controlado por “timers”. Asculturas são mantidas sobre estantesdesmontáveis de aço, com seis prateleirasdistantes entre si aproximadamente 40-50 cm ea inferior, a 10 cm do chão. Cada prateleiradevem conter 6 a 8 lâmpadas fluorescentes. Osreatores que alimentam as lâmpadas dasprateleiras devem ser colocados no lado de forada sala, e colocar tomadas dentro da sala. Osequipamentos necessários são: estantes de açocom prateleiras contendo lâmpadasfluorescentes, dois aparelhos de ar condicionado.

3Procedimentos Para a Implantação de Um Laboratório de Cultivo de Tecidos

A temperatura da sala de crescimento écontrolada através de aparelhos de arcondicionado ligados a termostatos, a fim demanter a temperatura constante, com variaçãode cerca de ± 1 a 2 ºC, normalmente, utiliza-se

temperaturas ao redor de 25 °C a 27 ºC.

Sala de preparação das plantas para aclimatação

É o local no qual as plantas, após seremremovidas dos frascos, serão lavadas para aremoção dos restos de meio de cultura, etransplantadas em vasos contendo substrato. Éoportuno se ter, neste local, água em abundânciae espaço para transferência das plântulas, alémde um janelão de vidro para clarear. O piso e asparedes também devem ser branco e lisos paraevitar acúmulo de poeira e facilitar a limpeza;deve-se contar com uma mesa grande parapreparação dos vasos, bancadas e armários paraguardar o material utilizado na aclimatação. Alémdisso, duas pias grandes e fundas facilitam alavagem do material. Também deve haver, nestasala, duas portas, uma com acesso à sala decrescimento e a outra ao exterior do laboratório,

a fim de facilitar a translocação do material parao telado.

Almoxarifado

É neste compartimento que se devem sercolocadas estantes ou prateleiras nas quais serãoguardados produtos químicos e outros materiaisutilizados no cultivo de tecidos em estoque.

Copa-cozinha

Aqui, deve-se contar com um armário, bancadacom pia, fogão, geladeira e depósito de água.

Secretaria e biblioteca

São necessários, aqui, um sofá, mesa deescritório, telefone, computador e estantes.

ooooo Equipamentos

Equipamentos indispensáveis para manutenção deum laboratório de cultivo de tecidos e suasrespectivas finalidades, são apresentados naTabela 1.

Tabela 1. Lista dos equipamentos necessários para o laboratório de cultivo de tecidos.

4 Procedimentos Para a Implantação de Um Laboratório de Cultivo de Tecidos

Tabela 1. Continuação...

o o o o o Vidraria

As vidrarias a serem utilizadas num laboratóriode cultura de tecidos, nas preparações diversas e

Tabela 2. Listagem das vidrarias utilizadas num laboratório de cultivo de tecidos e suas respectivas

capacidade e quantidade.

aquelas para as culturas de tecido em si, e suasrespectivas capacidade e quantidade, estãoapresentadas na Tabela 2.

o o o o o Instrumentos e Materiais Necessários

Para o Laboratório de Cultivo de

Tecidos

Para o funcionamento eficiente de um laboratóriode cultivo de tecidos, deve-se ter sempre à mão

os instrumentos e materiais apresentados naTabela 3, repondo-os quando necessário.

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Tabela 3. Listagem dos instrumentos e materiais utilizados no laboratório de cultivo de tecidos e suas

respectivas capacidade e quantidade.

6 Procedimentos Para a Implantação de Um Laboratório de Cultivo de Tecidos

Tabela 3. Continuação...

Os reagentes mais utilizados nos meios de cultivo de tecidos são apresentados na Tabela 4 e devemser repostos quando necessários.

Tabela 4. Listagem dos reagentes utilizados no laboratório de cultivo de tecidos e suas respectivasquantidades.

7Procedimentos Para a Implantação de Um Laboratório de Cultivo de Tecidos

Tabela 4. Continuação...

Telado para aclimatação das mudas

Devido às características peculiares das plantas

propagadas in vitro, em geral a transferência

direta para as condições de campo acarreta,

grande mortalidade entre elas; desta forma, é

imprescindível uma fase intermediária entre o

laborátorio e a área de cultivo, a fim de que as

plantas propagadas adquiram resistência antes de

serem levadas para as condições de campo. Esta

fase é realizada em telado de 6 x 10m, com

sombreamento duplo, sistema de nebulização

intermitente (através de “timers”) e quatro

bancadas de alvenaria de 1 x 6m de

comprimento.

Referências Bibliográficas

BIODI, S.; THORPE, T.A. Requirements for tissue

culture facility. In: THORPE, T.A. ed. Plant

tissue. [S.l: s.n],1981. p. 1-20.

DOWNS, R.J.; HELLMERS, H. Environment and

the experimental control of plant growth.

London: Academic Press, 1975, p.14-25.

STREET, H.E. Laboratory organization. In:

STREET, H.E. ed. Plant tissue and cell culture.

Oxford: Blackwell Science, 1977. p.11-30.

TORRES, A.C.; CALDAS, L.S. Técnicas e

aplicação da cultura de tecidos de planta.

TORRES, A.C. ; CALDAS, L.S. Eds. Brasilia:

ABCTP/EMBRAPA CNPH, 1990. 433p.

Anexo I. Croquis das dependências de um

laboratório de cultura de tecidos.

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Circular

Técnica, 65

Exemplares desta edição podem ser adquiridosna: Embrapa AlgodãoRua Osvaldo Cruz, 1143 Centenário, CP 17458107-720 Campina Grande, PBFone: 0XX 83 315 4300 Fax (0XX) 83 3154367e-mail algodão@cnpa.embrapa.br1a EdiçãoTiragem: 1.000

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Expedientes: Supervisor Editorial: Nivia M.S. Gomes Revisão de Texto: Nisia Luciano Leão Tratamento das ilustrações: Maria do S. A. de Sousa Editoração Eletrônica: Maria do S. A. de Sousa