1

CinCinééticatica EnzimEnzimááticatica

Representação termodinâmica da ação catalítica de uma enzima:

(+) reação não catalisada

(o) reaçãoenzimaticamentecatalisada

2

HipHipóótese chavetese chave--fechadurafechadura

Centro ativo complementar em tamanho, forma e natureza química à molécula do substrato, ou seja, uma cavidade geometricamente rígida.

3

HipHipóótese do encaixe induzido tese do encaixe induzido

Substrato induz mudanças conformacionais na enzima - resultam em um alinhamento preciso dos grupos catalíticos e suas ligações com o substrato

Substratos análogos podem se ligar a enzima -não induzem apropriadamente o alinhamento dos grupos catalíticos.

4

Conceitos para diminuiConceitos para diminuiçção da energia ão da energia de ativade ativaççãoão

orbital steering - alinhamento ótimo dos orbitais do substrato e dos grupos catalíticos

stereopopulation control - restrição da liberdaderotacional do substrato (“congelamento”)

rack - ligações formadas entre o substrato e a enzima são tão fortes que levam a uma alteração na molécula de substrato

5

MecanismoMecanismo rackrack (distor(distorçção do substrato)ão do substrato)

A molécula de substrato sofre alteração para se acomodar na molécula enzimática estática

6

SeqSeqüüência de ligaência de ligaçção do substrato ão do substrato em duas etapasem duas etapas

O substrato pode sofrer estas alterações por mudanças conformacionais na enzima

7

CinCinéética com tica com úúnico substratonico substratoMichaelis-Menten → equilíbrio rápido Briggs-Haldane → estado estacionário

Hipóteses de Henri:1. velocidade inicial de uma reação enzimática é proporcional a concentração da enzima 2. dependência da velocidade de reação com a concentração de substrato é característica de um fenômeno de saturação (reação química reversível)

k1 k2

E + S ES E + P k-1

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Curvas cinéticas para os componentes da reação enzimáticaEstado Estacionário

9

EquaEquaçção de ão de MichaelisMichaelis--MentenMenten

hipérbole

cinética de primeira ordem

cinética de ordem zero

]S[K]S[V

vvM

maxo +==

10

Modelos de InibiModelos de Inibiçção Competitivaão Competitiva

1. Modelo clássico, S e I competem pelo mesmo sítio de ligação

2. I e S são mutuamenteexcludentespor causa de impedimento estéreo

3. I e S possuem um sítio comum de ligação

4. Os sítios de ligação para I e S são distintos, mas se sobrepõem

5. A ligação de I em um sítioinibidor distinto causa uma mudançaconformacionalna enzima que não permite a ligação do substrato (vice-versa)

11

kS kP

E + S ES E + P + I

ki

EI

]S[k]I[1k

]S[V

v

iS

max +⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛+

= Afeta a afinidade da enzima pelo seu substrato (KKSS), sem afetar a reatividade do complexo ativo enzima-substrato (VVmaxmax)

12

Plot de v versus [S] na presença e na ausência de uma concentração fixa do inibidor competitivo

13

Modelos de InibiModelos de Inibiçção Nãoão Não--CompetitivaCompetitiva

1. S e I não são mutuamente excludentes, mas ESI écataliticamente inativo

14

2. I não pode se ligar ao complexo ES já formado, mas também forma complexos terciários enzima-inibidor-substrato cataliticamente inativos

15

3. I e S são mutuamente excludentes por causa de impedimento estéreo

16

kS kP

E + S ES E + P + + I I

ki ki kS

EI + S ESI

]S[k]S[v

S

ik]I[1

maxV +=

⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛+

Afeta a reatividade da enzima pelo seu substrato (VVmaxmax), sem afetar a afinidade do complexo ativo enzima-substrato (KKSS)

17

Plot de v versus [S] na presença e na ausência de uma concentração fixa do inibidor não-competitivo

18

Inibição irreversível (onde Vmax é diminuido) ou inibição não-competitiva reversível podem ser distinguidas

19

Modelos de InibiModelos de Inibiççãoão AcompetitivaAcompetitiva

20

kS kP

E + S ES E + P + I

ki

ESI

]S[k]I[1k

]S[V

v

iS

max⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛++

= Inibição Mista:afeta tanto a afinidade de E por S (kkSS) como a reatividade de ES (VVmaxmax )

21

Plot de v versus [S] na presença e na ausência de uma concentração fixa do inibidor acompetitivo

22

ReaReaçções Irreversões IrreversííveisveisE

S P1 + P2

P1 = produto inibidor competitivoP2 = produto inibidor não-competitivoS = substrato inibidor

k’SE SES SE + P1 + P2

K’’’ K’ K’’

K kEP1 E ES E + P1 + P2

K1 K2’ K2 K2’’

K1’ K3 k’’EP1P2 EP2 EP2S EP2 + P1 + P2

⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛++⎟

⎠⎞

⎜⎝⎛ ++⎟⎟

⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛++

⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛++

=

'KK]P[

K1

K1]P[K

'K]S[1K

KK]P[K

''K]S[1]S[

KKk]P[K''k

''Kk]S['k1]S[]E[k

v

212132

32t

Simplificação:([P]=[P1]=[P2])

23

Parâmetros para diferentes Parâmetros para diferentes modelos cinmodelos cinééticosticos

Modelo K1 K2 K1’ K2’ K2’’ K’ K’’ K’’’ K3 k k’ k’’

Simples ∞ ∞ --- --- ∞ ∞ ∞ --- --- k --- ---

Inibição competitiva porP1

K1 ∞ --- ∞ ∞ ∞ ∞ --- --- k --- ---

Inibição competitiva porP2

∞ K2 ∞ --- K2 ∞ ∞ --- K k --- 0

Inibição competitiva porP2 (parcial)

∞ K2 ∞ --- K2 ∞ ∞ --- --- k --- k’’

Inibição acompetitivapor [S] elevada (SESinativo)

∞ ∞ --- --- ∞ ∞ K’’ --- --- k 0 ---

Inibição combinadaP1P2 (sem EP1P2)

K1 K2 ∞ ∞ K2 ∞ ∞ --- K k --- 0

24

ExemplosExemplos

invertase (sacarose → glicose + frutose)inibida por alta concentração de substrato

''K]S[1K]S[

''K]S[1]S[V

K''K]S[1]S[

]S[]E[kv

max

t

++

+=

+⎟⎠⎞

⎜⎝⎛ +

=

lactase (lactose → glicose + galactose)inibida de forma competitiva total por galactose

⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛++

=++

=

1

max

1

t

K]P[1K]S[

]S[V

K]P[KK]S[

]S[]E[kv

25

Modelos de InibiModelos de Inibiççãoão

AP

APK]S[

]S[Vv

+=

Inibição Competitiva: KAP > K ; VAP = VInibição Não-competitiva: KAP = K ; VAP < VInibição Mista: KAP > K ; VAP < V

Um ativador é uma substância que aumenta a reatividade de ES (VVAPAP > V> V) ou a afinidade de E por S (KKAPAP < K< K)

26

ReaReaçções Reversões ReversííveisveisHipótese de equilíbrio rápido → não é aplicávelExemplo: glicose isomerase (glicose ↔ frutose) com constante de equilíbrio aproximadamente 1

k1 k2E + S ES E + P

k-1 k-2

1KP

KS

K]P[V

K]S[V

v

PS

P

Pmax,

S

Smax,

++

−=

S

P

Pmax,

Smax,EQ K

KVV

K =

A constante de equilíbrio global, KKEQEQ, éo quociente entre S e P no equilíbrio (velocidade de reação é zero)

27

Modelos cinModelos cinééticos com mais de um ticos com mais de um substratosubstrato

Reações com bi-substrato ou reações de transferase ou reações de oxi-redução

EP-X + B P + B-X

(a) O O⎢⎟ ⎢⎟

R1 – C – NH – R2 + H2Otripsina R1 – C – O- + H3N

+ – R2

(b) H O ⎪ ⎢⎟

CH3 – C – OH + NAD+ álcool desidrogenase CH3 – CH + NADH

H+

Exemplos:

28

Modelos SeqModelos SeqüüenciaisenciaisMecanismo Bi-Bi ordenado:

A B P Q

k1 k-1 k2 k-2 k3 k4 k-4 k5 k-5

E EA EAB k-3 EPQ EQ E

]A['KK'K]A[

]B[

]B[]E[kv

BAB

t+

+=

Mecanismo Bi-Bi aleatório:

A B P QEA EQ

E E EAB EPQ

EB EP B A Q P

'K]A['KK'K]A[

]B[

]B['K]A[]A[]E[k

v

A

BAB

A

t

++

+

+=

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Modelos OscilatModelos Oscilatóórios rios ((PingPing--PongPong))

Substratos A e B não se encontram mutuamente na superfície da enzima

Exemplos: quimiotripsina, transaminases e algumasflavoenzimas (glicose oxidase)

A P B Q

k1 k-1 k2 k3 k-3 k4 k-4 k5 k6 k-6

E EA k-2 FP F FB k-5 EQ E

BM

Bmax,AM

Amax,max

K

]B[V

K

]A[VVv ++=