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CENTRO DE SAÚDE E TECNOLOGIA RURAL
CAMPUS DE PATOS – PB
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA VETERINÁRIA
GILDENOR XAVIER MEDEIROS
EPIDERMÓLISE BOLHOSA EM ANIMAIS
PATOS-PB
2012
GILDENOR XAVIER MEDEIROS
EPIDERMÓLISE BOLHOSA EM ANIMAIS
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação
em Medicina Veterinária da Universidade Federal
de Campina Grande como requisito parcial para a
obtenção do título de Doutor em Medicina
Veterinária.
Orientador: Prof. Dr. Franklin Riet-Correa
PATOS-PB
2012
FICHA CATALOGADA NA BIBLIOTECA SETORIAL DO CSTR UFCG – CAMPUS DE PATOS-PB
M488e 2012
Medeiros, Gildenor Xavier Epidermólise bolhosa em animais / Gildenor Xavier Medeiros Patos-PB: UFCG, CSTR, PPGMV, 2012. 64p. Bibliografia Orientador: Franklin Riet-Correa. Tese (Doutorado em Medicina Veterinária), Universidade Federal de Campina Grande, Centro de Saúde e Tecnologia Rural 1 – Dermatologia Veterinária – Tese. 2 – Doenças da pele. 3 – Caprinos. 4 – Bovinos. I Título.
CDU: 616.5:619
GILDENOR XAVIER MEDEIROS
EPIDERMÓLISE BOLHOSA EM ANIMAIS
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação
em Medicina Veterinária da Universidade Federal
de Campina Grande como requisito parcial para a
obtenção do título de Doutor em Medicina
Veterinária.
Aprovado em 29/06/2012
BANCA EXAMINADORA
Prof. Dr. Franklin Riet-Correa - Orientador
Universidade Federal de Campina Grande – Campus de Patos-PB
Unidade Acadêmica de Medicina Veterinária
Profa. Dra. Ana Lucia Pereira Schild
Universidade Federal de Pelotas – Faculdade de Veterinária – Pelotas-RS
Prof. Dr. José Augusto Bastos Afonso da Silva
Universidade Federal Rural de Pernambuco
Clínica de Bovinos - Campus de Garanhuns
Profa. Dra. Rosane Maria Trindade de Medeiros
Universidade Federal de Campina Grande – Campus de Patos-PB
Unidade Acadêmica de Medicina Veterinária
Prof. Dr. Otávio Brilhante de Sousa
Universidade Federal de Campina Grande – Campus de Patos-PB
Unidade Acadêmica de Medicina Veterinária
“Dedico este trabalho à minha esposa Lu e aos meus filhos Guilherme e Giancarlo pelo apoio, compreensão e amor. Essa conquista é nossa!”
AGRADECIMENTOS
A DEUS, que me ilumina, fortalece e protege todos os dias.
Aos meus pais, Seu Nivaldo e Dona Madazinha, com simplicidade e sabedoria, me
ensinaram a ter: honestidade, humildade, dignidade, respeito ao próximo, bom caráter,
disposição para aprender e trabalhar. Aos meus irmãos Gilberto, Gilmar e Givaldo por todo
apoio que me deram nesse momento e sempre.
À minha esposa Lu e aos meus filhos, Guilherme e Giancarlo, pela compreensão nos
momentos que precisei me ausentar para realizar as atividades do doutorado.
Ao meu orientador, Professor Dr. Franklin Riet-Correa, por acreditar na minha
capacidade de realizar este trabalho. Agradeço pelas várias horas dedicadas para me orientar,
sempre com muita sabedoria, respeito e paciência.
Ao Professor Dr. Antônio Flávio pelo apoio e orientações essenciais para a realização
deste trabalho.
Aos Doutores Severo, Mauro e Anibal pela realização da microscopia eletrônica,
indispensável para o êxito dos trabalhos.
Aos professores Eldinê, Sara, Almir, Rosane, Otávio, Verônica, Pedro, Sérgio
Azevedo, Felício, Danilo, Nara, Adriano, Sérgio Ricardo e Sônia Lima que, direta ou
indiretamente, contribuíram nessa conquista.
Ao colega Glauco que participou diretamente na realização deste trabalho. E aos
demais colegas da Patologia Animal: Fabrício, Rômulo, Luciano, Diego, Clarice, Lizanka,
Allan, Raquel, Eduardo, Andrei, Thalita, Luiza, José Carlos, Priscila, Everton, Carlos,
Gabriela, Pedroso, Malba, Temístocles, Lizziane, Valéria, Francelícia, Danilo, Jean, Jackson,
Fernando e Márcia. A todos, muito obrigado pelos momentos de aprendizado, ajuda e
companheirismo. Aos colegas de outras áreas que também foram importantes na realização do
trabalho: Evaristo, Gildeni, Tatiane, Beatriz, Adriana, Milena, Rodrigo (Digão), Ana Lucélia,
André, Fabrícia, Rodrigo Palmeira, Diego Catolé, João Marcos e Leonardo.
A todos os funcionários, em especial: Nevinha, Edinho, D. Joana, Seu Cuité, Seu Zé,
Finha, Josemar, Neide e Dal, que sempre me ajudaram no que foi necessário.
Aos Professores Dr. Alexandre Borges e Dr. José Filho da Faculdade de Medicina
Veterinária, UNESP, Botucatu, pelos ensinamentos e acolhida importantes para minha
formação profissional e pessoal.
Enfim, a todos MUITO OBRIGADO!
RESUMO
Esta tese inclui três artigos sobre epidermólise bolhosa (EB) em animais, uma doença
hereditária, cuja principal característica é a formação de bolhas e erosões na pele e mucosas
em resposta ao mínimo trauma. O primeiro capítulo é um artigo de revisão que abrange o
diagnóstico, a classificação, a epidemiologia, o modo de herança, a clínica, a patologia e as
alterações ultraestruturais e moleculares da EB em animais. Baseado no nível ultraestrutural
de separação do tecido, a EB é dividida em três tipos: simples, juncional e distrófica. Em
humanos estima-se que a EB afeta 1 em 17.000 nascidos vivos, mas em animais a frequência
de EB não é estimada. Os achados clínicos e patológicos são semelhantes em todos os tipos
de EB, variando apenas na intensidade. A EB é causada por mutações nos genes que
expressam as proteínas do citoesqueleto dos queratinócitos ou da zona da membrana basal
(ZMB). No segundo capítulo foram descritos em caprinos os achados clínicos,
histopatológicos e ultraestruturais da EB distrófica transmitida por um gene autossômico
recessivo. Os caprinos apresentaram exungulação, erosões, crostas e cicatrizes na pele e
úlceras na cavidade oral. Histologicamente, a pele apresentava uma separação subepidérmica
preenchida com fluido eosinofílico claro, restos celulares ou neutrófilos. Ultraestruturalmente,
o local de separação foi abaixo da lâmina densa na ZMB. Na pele com formação de bolhas e
na pele não envolvida clinicamente, a lâmina basal foi preservada, mas as fibrilas de
ancoragem eram escassas e rudimentares. Sugere-se que a doença é similar a EB distrófica
recessiva generalizada e severa observada em humanos. No terceiro capítulo é descrito um
caso de EB em um bezerro. Ele tinha exungulação de todos os cascos, erosões e crostas
generalizadas na pele e úlceras na cavidade oral. Na histologia da pele foi observada
separação subepidérmica. No exame ultra-estrutural foi identificado a separação ao nível da
lâmina lúcida na ZMB, deixando a lâmina densa unida às papilas dérmicas. Os
hemidesmossomos apresentavam-se pequenos, pobremente definidos e sem demarcação clara.
Os achados clínicos, histológicos e ultraestruturais encontrados no bezerro são característicos
da EB juncional.
Palavras-chave: epidermólise bolhosa; zona da membrana basal; doenças mecanobolhosas;
doenças hereditárias; doenças da pele; caprino; bovino
ABSTRACT
This thesis includes three papers on epidermolysis bullosa (EB) in animals, which is an
hereditary disease, characterized by the formation of blisters and erosions on the skin and
mucous in response to minor mechanical trauma. The first paper reviews the diagnosis,
classification, epidemiology, mode of inheritance, clinical, pathology, and ultrastructural and
molecular changes of EB reported in animals. Based on the ultrastructural level of tissue
separations EB is divided into three types: simplex, junctional, and dystrophic. In humans it is
estimated that EB affect 1 in 17000 live births, but in animal the frequency of EB is not
estimated. The clinical and pathological findings are similar in all types of EB, varying only
in intensity. EB is due to mutations in genes that express the protein constituent the
cytoskeleton of the basal keratinocytes or of the basement membrane zone (BMZ). In the
second paper, clinical, histopathological, and ultrastructural findings of dystrophic EB in
goats transmitted by an autosomal recessive gene are reported. The goats presented with
exungulation, erosions, crusts and scars on the skin and ulcers in the oral cavity.
Histologically, the skin showed subepidermal separation, with clefts filled with clear
eosinophilic fluid, cellular debris or neutrophils. Ultrastructurally, the site of blister formation
was the sub-lamina densa in the BMZ. In skin with blister formation and in clinically
uninvolved skin, the basal lamina was preserved, but the anchoring fibrils were scarce and
rudimentary. It is suggested that the disease is similar to human severe generalized recessive
dystrophic EB. In the third paper, a case of EB in a calf is reported. It was presented
exungulation of all hooves, widespread erosions and crusts on the skin, and ulcers in the oral
cavity. Histologically, the skin showed subepidermal clefts. Ultrastructurally, there was
epidermal-dermal separation at the level of the lamina lucida, with the lamina densa attached
to the papillary dermis. The hemidesmosomes were poorly defined and small. The clinical,
histological and ultrastructural findings are characteristic of junctional EB.
Keywords: epidermolysis bullosa; basal membrane zone; mechanobullous diseases; hereditary
diseases; diseases skin; goat; cattle
LISTA DE FIGURAS
CAPÍTULO I
Figura 1. Búfalo afetado com epidermólise bolhosa simples. A) São observadas
numerosas áreas de lesões crônicas com alopecia, erosões, crostas e cicatrizes na
pele. Também existem lesões recentes (setas). B) Aspecto palmar dos dedos do
membro torácico mostrando a perda do casco de um paradígito e deformidades nos
outros cascos. C) Pele com desprendimento recente da epiderme, causado por um
atrito ocasional. (A Figura 1 é uma cortesia da Dra. Cristina Fernandes da
Universidade Federal de Pelotas-RS)............................................................................
25
Figura 2. Bezerro afetado com epidermólise bolhosa juncional. A) São observadas
grandes áreas de erosões e crostas na pele, principalmente nos membros. Observe a
exungulação de todos os cascos. B) Aspecto lateral dos dedos do membro torácico
esquerdo, mostrando o desprendimento da pele e a exungulação dos cascos. C) Pele
da face interna do pavilhão auricular com desprendimento da epiderme por fricção
induzida. D) Mucosa ruminal com várias úlceras, situadas principalmente nos
pilares ruminais..............................................................................................................
26
Figura 3. Vestíbulo oral. Caprino (A) com epidermólise bolhosa distrófica e bezerro
(B) com epidermólise bolhosa juncional. A) No caprino existem úlceras e cicatrizes
na mucosa da bochecha, com perda das papilas (seta). B) No bezerro, observa-se
uma úlcera na mucosa da bochecha (seta), mas sem cicatrizes e perdas de papilas......
27
Figura 4. Fotomicrografia: Pele de um bezerro afetado com epidermólise bolhosa
juncional. A epiderme está destacada da derme, formando uma fissura
subepidérmica, contendo hemácias e neutrófilos. Hematoxilina e eosina (H&E).
Barra = 50 µm................................................................................................................
27
Figura 5. Representação esquemática da organização molecular do citoesqueleto
dos queratinócitos basais e da zona da membrana basal. E = epiderme; H =
hemidesmossomo; LL = lâmina lúcida; LD = lâmina densa; D = derme. Proteínas
dos desmossomos e da junção intercelular: Dp = desmoplaquina; Pg = placoglobina;
Pf = placofilina; C = caderinas......................................................................................
29
Figura 6. Fotomicrografia eletrônica de transmissão: A) Pele de um búfalo afetado
com epidermólise bolhosa simples. O assoalho da bolha suprabasal (estrela) é
formado por células basais unidas a derme (D). Observe as células acantolíticas
(setas) dentro da bolha. Barra = 2 µm. B) Pele de um bezerro afetado com
epidermólise bolhosa juncional. As células basais estão formando o teto da bolha
(estrela), após a separação da derme ao nível da lâmina lúcida. Observe os pequenos
hemidesmossomos (quadrado). Barra = 1 µm. C) Ampliação do quadrado da Figura
B. Observe a membrana plasmática (seta) e os hemidesmossomos pequenos e mal
definidos dentro dos quadrados. Barra = 200nm. D) Pele de um caprino afetado com
epidermólise bolhosa distrófica. A lâmina densa (setas) forma o teto da bolha
(estrela). A lâmina basal, os hemidesmossomos e os filamentos de ancoragem estão
bem preservados. Barra = 500 nm. (Figura 6A é uma cortesia do Dr. Severo S.
Barros da Universidade Federal de Pelotas-RS)............................................................
32
CAPÍTULO II
Figura 1. Pedigree dos caprinos com epidermólise bolhosa distrófica. Os quadrados
representam os machos e os círculos as fêmeas. Os quadrados e círculos pretos são
os caprinos afetados. As linhas diagonais são os animais que
morreram....................................................................................................................
45
Figura 2. Caprinos com epidermólise bolhosa distrófica. (A) Caprino I-1. Vista
lateral direita da cabeça mostrando alopecia e desprendimento da epiderme na face
externa da orelha e na pálpebra superior. (B) Caprino II-8. Face interna da orelha
mostrando o desprendimento da epiderme após o teste de Nikolsky. (C) Caprino II-
9. Gengiva e lábios com desprendimento do epitélio da mucosa. (D) Caprino I-1.
Desprendimento e deformação dos cascos…………………………............................
46
Figura 3. Caprino II-9. (A) A cavidade oral mostrando úlceras e cicatrizes no palato
duro e na mucosa da bochecha, com perda das papilas bucais (setas). Note o exudato
mucopurulento. (B) A língua com extensa ulceração e cicatrizes no dorso, com
perda de papilas linguais (setas). Algumas papilas da bochecha e da língua
permanecem normais (*)...............................................................................................
46
Figura 4. Pele. Caprino. (A) A epiderme está destacada da derme, formando uma
fissura subepidérmica (*). HE. Barra, 25 µm. (B) Micrografia eletrônica de
transmissão. A lâmina basal e os queratinócitos normais formam o teto da bolha (*),
e a derme está no assoalho. As fibrilas de ancoragem não são observadas. Barra, 2.5
µm. (C) Micrografia eletrônica de transmissão mostrando a lâmina densa (setas)
formando o teto da bolha (*). A lâmina basal, os hemidesmossomos e os filamentos
de ancoragem estão bem preservados. Barra, 1 µm. (D) Micrografia eletrônica de
transmissão. Pele sem lesões. A lâmina basal está preservada, mas as fibrilas de
ancoragem são escassas e rudimentares (setas). Barra, 0.5 µm.....................................
47
CAPÍTULO III
Figura 1. A) Bezerro afetado com epidermólise bolhosa juncional. São observadas
grandes áreas de erosões e crostas na pele, especialmente nas áreas de atrito e nos
membros. Note a exungulação de todos os cascos. B) Membro torácico mostrando
desprendimento da pele e exungulação dos cascos. C) Mucosa do palato e da
bochecha com desprendimento do epitélio...................................................................
58
Figura 2. Pele. Bezerro. A epiderme está destacada da derme, formando uma fenda
subepidérmica (*). HE, Barra 50 µm.………….…………………………...................
59
Figura 3. Micrografia eletrônica de transmissão. Pele. Bezerro. Junção dermo-
epidérmica. É observada a separação (*) ao nível da lâmina lúcida. Células basais
(BC). Derme (D). Barra, 5 µm. Inset: Secção semifina mostrando o local da
separação, observada na microscopia eletrônica (retângulo). Note a formação da
vesícula (estrela). Barra, 50 µm....................................................
59
Figura 4. Micrografia eletrônica de transmissão. Pele. Bezerro. Junção dermo-
epidérmica, com a derme separada das células basais. A lâmina densa (setas) está
unida à papila dérmica (PD). Note as fibras de colágeno com 20 nm (CF) dentro da
derme edematosa. A vesícula também é observada (estrela). Barra, 1 µm...................
59
Figura 5. Representação esquemática da ultraestrutura da zona da membrana basal
epidérmica......................................................................................................................
60
LISTA DE TABELAS
CAPÍTULO I
Tabela 1. Tipos e subtipos de epidermólises bolhosas baseado no nível ultraestrutural
de separação na zona da membrana basal.......................................................................
19
Tabela 2. Ocorrência natural de epidermólise bolhosa em animais................................ 21
Tabela 3. Resumo dos achados clínicos e patológicos da epidermólise bolhosa em
animais.............................................................................................................................
24
SUMÁRIO
INTRODUÇÃO .......................................................................................................... 12
Referências............................................................................................................ 13
CAPÍTULO I – Epidermólise Bolhosa em Animais – Revisão de Literatura...... 15
Abstract................................................................................................................. 16
Resumo................................................................................................................. 17
Introdução............................................................................................................. 17
Diagnóstico e classificação.................................................................................. 18
Epidemiologia e modo de herança...................................................................... 20
Sinais clínicos e patologia................................................................................... 22
Alterações ultraestruturais e moleculares............................................................ 28
Epidemólise bolhosa simples..................................................................... 29
Epidermólise bolhosa juncional................................................................. 30
Epidermólise bolhosa distrófica................................................................ 31
Referências............................................................................................................ 33
CAPÍTULO II – Epidermólise Bolhosa Distrófica em Caprinos.......................... 40
Summary............................................................................................................... 41
Resumo................................................................................................................. 42
Introdução............................................................................................................. 42
Material e Métodos............................................................................................... 43
Resultados............................................................................................................. 44
Discussão.............................................................................................................. 48
Referências............................................................................................................ 50
CAPÍTULO III – Epidermólise Bolhosa em um Bezerro...................................... 54
Abstract................................................................................................................. 55
Resumo................................................................................................................. 55
Referências............................................................................................................ 61
CONCLUSÕES............................................................................................................ 63
ANEXOS..................................................................................................................... 64
12
INTRODUÇÃO
A pele possui várias funções, dentre elas se destaca a proteção contra agressões físicas e
químicas. Para realizar tais funções, a pele conta com várias especializações dos
queratinócitos basais para manutenção da sua integridade. O citoesqueleto dos queratinócitos
basais e a membrana basal, que juntos formam os complexos juncionais (célula-matriz e
célula-célula), atuam na manutenção da estabilidade e integridade da pele, no bloqueio
seletivo de moléculas e no processo de diferenciação das camadas da epiderme (Christiano &
Uitto 1996). Os complexos juncionais são compostos por várias proteínas, que são produtos
de expressão de diferentes genes. A interação entre as proteínas proporciona uma forte união
entre epiderme e derme, entre os queratinócitos e entre as camadas da epiderme. Essa
intricada rede de proteínas proporciona resistência ao atrito e pressão (McMillan et al. 2003).
Alterações estruturais ou bioquímicas (primárias ou secundárias) nestas proteínas, resultam
em fragilidade da pele e desenvolvimento de lesões que caracterizam os sinais clínicos das
dermatoses bolhosas (Bruckner-Tuderman 1999, Solovan et al. 2005, Ko & Marinkovich
2010).
É importante ressaltar que a mesma proteína pode estar alterada por causa de uma
mutação no gene que a codifica ou por ação de anticorpos em desordens autoimunes, de
forma que, em ambas as situações, os sinais clínicos são semelhantes (Wozniak &
Kowalewski 2005). A compreensão da etiopatogenia das dermatoses bolhosas adquiridas e
hereditárias é essencial para o diagnóstico preciso. Um protótipo para essas condições é a
epidermólise bolhosa (EB), uma rara patologia hereditária de humanos (Sawamura et al.
2010, Sianez-Gonzáles et al. 2009) e animais (Bruckner-Tuderman et al. 2010, Natsuga et al.
2010), que pertence a um grupo heterogêneo de distúrbios mecanobolhosos, caracterizado
pela formação de bolhas na pele e mucosas, formadas em resposta a um trauma mínimo.
Baseado no nível ultraestrutural de separação do tecido, a EB pode ser dividida em três
categorias: epidermólise bolhosa simples (EBS), epidermólise bolhosa juncional (EBJ) e
epidermólise bolhosa distrófica (EBD) (Fine et al. 2008).
Diferentes formas de EB em humanos têm sido claramente definidas, entretanto, em
animais, ainda não foram definidos os critérios para a classificação das diferentes formas da
doença, nem os mecanismos moleculares de cada forma. Nos últimos seis anos foi
diagnosticado no Hospital Veterinário (HV) da Universidade Federal de Campina Grande
(UFCG), Campus de Patos-PB, um caso de EB em caprinos e dois em bovinos. Diante da
13
raridade da doença, surgiu a oportunidade de estudar a EB em animais. Esta tese teve o
objetivo de estudar os aspectos etiológicos, epidemiológicos, clínicos, patológicos, genéticos,
ultraestruturais e moleculares da EB diagnosticada em caprinos e bovinos. A mesma está
dividida em três artigos formatados de acordo com o que estabelece a NORMA Nº 01/2011 de
03 de junho de 2011 do Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária da UFCG,
Campus de Patos-PB (anexo 1). O primeiro trabalho é um artigo de revisão, submetido à
revista Veterinary Dermatology, que aborda o diagnóstico, a classificação, a epidemiologia, o
modo de herança, a clínica, a patologia e as alterações ultraestruturais e moleculares da EB
em animais. No segundo artigo, são descritos, pela primeira vez, os aspectos clínicos,
histopatológicos e ultraestruturais, e o modo de herança da EB do tipo distrófica em caprinos.
Este artigo foi aceito para publicação na revista Journal of Comparative Pathology. O terceiro
artigo foi publicado na revista Journal of Veterinary Diagnostic Investigation (DOI:
10.1177/104638711425953). O referido trabalho relata os aspectos clínicos, histológicos e
ultraestruturais de um caso de EB do tipo juncional em um bezerro.
Referências
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Matrix Biology 18: 3-4.
Bruckner-Tuderman L., McGrath J.A., Robinson E.C. & Uitto J. 2010. Animal models of
epidermolysis bullosa: update 2010. Journal of Investigative Dermatology 130: 1485-
1488.
Christiano A.M. & Uitto J. 1996. Molecular complexity of the cutaneous basement membrane
zone. Revelations from the paradigms of epidermolysis bullosa. Experimental
Dermatology 5: 1-11.
Fine J.D., Eadly R.A.J., Bauer E.A., Bauer J.W., Bruckner-Tuderman L., Heagerty A.,
Hintner H., Hovnanian A., Jonkman M.F., Leigh I., McGrath J.A., Mellerio J.E., Murrell
D.F., Shimizu H., Uitto J., Vahlquist A., Woodley D. & Zambruno G. 2008. The
classification of inherited epidermolysis bullosa (EB): Report of the Third International
Consensus Meeting on Diagnosis and Classification of EB. Journal of the American
Academy of Dermatology 58: 931-950.
Ko M.S. & Marinkovich M.P. 2010. Role of dermal-epidermal basement membrane zone in
skin, cancer, and developmental disorders. Dermatologic Clinics 28: 1-16.
14
McMillan J.R., Akiyama M. & Shimizu H. 2003. Epidermal basement membrane zone
components: ultrastructural distribution and molecular interactions. Journal of
Dermatological Science 31: 169-177.
Natsuga K., Shinkuma S., Nishie W. & Shimizu H. 2010. Animal models of epidermolysis
bullosa 28: 137-142.
Sawamura D., Nakano H. & Matsuzaki Y. 2010. Overview of epidermolysis bullosa. Journal
of Dermatology 37: 214-219.
Siãnez-Gonzáles C., Pezoa-Jares R. & Salas-Alanis J.C. 2009. Congenital epidermolysis
bullosa: A review. Actas Dermosifiliogr 100: 842-856.
Solovan C., Ciolan M. & Olariu L. 2005. The biomolecular and ultrastructural basis of
epidemolysis bullosa. Acta Dermatoven APA 14: 127-135.
Wozniak K. & Kowalewski C. 2005. Alterations of basement membrane zone in autoimmune
sub epidermal bullous disease. Dermatological Science 40: 169-175.
15
CAPÍTULO I
Epidermólise Bolhosa em Animais - Revisão de Literatura
O presente trabalho foi formatado, segundo as normas da revista Veterinary
Dermatology (anexo 2). O artigo foi submetido em 23 de junho de 2012 (anexo 3).
16
Epidermólise Bolhosa em Animais
Gildenor Xavier Medeiros* e Franklin Riet-Correa*
*Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária, Universidade Federal de campina
Grande, Patos, Paraíba, Brasil, CEP 58708-110.
Correspodência: Franklin Riet-Correa, Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária,
Universidade Federal de campina Grande, Patos, Paraíba, Brasil, CEP 58708-110. E-mail:
Fontes de Financiamento
Este estudo foi auto-financiado.
Conflitos de Interesses
Nenhum conflito de interesse foi declarado.
Abstract
Epidermolysis bullosa (EB) is a hereditary mechanobullous disease of animals and humans,
characterized by extreme fragility of the skin and mucous membranes. The main feature of the
EB, both in humans and animals, is the formation of blisters and erosions in response to minor
mechanical trauma. Based on the ultrastructural level of tissue separations EB is divided into
three broad categories: epidermolysis bullosa simplex, junctional epidermolysis bullosa, and
dystrophic epidermolysis bullosa. Based in ultrastructural changes and mode of inheritance,
human types of EB are divided in several sub-types, but in animals, subtypes are not clearly
established. In this paper sub-types of EB in domestic animals are reviewed in accordance
with human classification. In humans it is estimated that EB affect 1 in 17,000 live births, but
in animal the frequency of epidermolysis bullosa is not estimated. The clinical and
pathological findings are similar in all types of EB, varying only in intensity. EB is due to
mutations in genes that express the protein constituent of structures cytoskeleton of basal
keratinocytes or of the basement membrane zone. This paper reviews the diagnosis,
classification, epidemiology, mode of inheritance, clinical, pathology, and ultrastructural and
molecular changes of EB reported in animals.
17
Resumo
A epidermólise bolhosa (EB) é uma doença mecanobolhosa hereditária de animais e humanos,
caracterizada por extrema fragilidade da pele e membranas mucosas. A principal
característica da EB, tanto em humanos como em animais, é a formação de bolhas e erosões
em resposta ao mínimo trauma. Baseado no nível de separação do tecido, a EB é dividida em
três amplas categorias: epidermólise bolhosa simples, epidermólise bolhosa juncional e
epidermólise bolhosa distrófica. Com base nas alterações ultraestruturais e no modo de
herança, os tipos de EB em humanos são divididos em vários subtipos, mas em animais, os
subtipos não são claramente definidos. Neste artigo, os subtipos em animais são revisados de
acordo com a classificação para humanos. Em humanos é estimado que a EB afeta 1 em
17.000 nascidos vivos, mas em animais a frequência de epidermólise bolhosa não é estimada.
Os achados clínicos e patológicos são semelhantes em todos os tipos de EB, variando apenas
na intensidade. A EB é causada por mutações nos genes que expressam as proteínas que
constituem o citoesqueleto dos queratinócitos ou a zona da membrana basal. Este artigo revisa
o diagnóstico, a classificação, a epidemiologia, o modo de herança, a clínica, a patologia e as
alterações ultraestruturais e moleculares da EB em animais.
Introdução
A epidermólise bolhosa (EB) é uma doença mecanobolhosa hereditária de animais e
humanos, caracterizada por extrema fragilidade da pele e membranas mucosas. A principal
característica da EB, tanto em humanos como em animais, é a formação de bolhas e erosões
em resposta a um trauma mínimo, especialmente em áreas mais propícias ao atrito.1,2 A
fragilidade da pele e mucosa resulta de anormalidades do citoesqueleto dos queratinócitos
basais ou da zona da membrana basal (ZMB).3,4 A EB em humanos tem sido bastante
estudada; recentes pesquisas identificaram mutações em diferentes genes, responsáveis pela
heterogeneidade clínica na EB.2,5 Camundongos geneticamente modificados foram usados
como animais modelos para a compreensão da patogênese da EB em humanos. Entretanto,
estudos moleculares em animais domésticos são raros, embora algumas mutações tenham sido
identificadas.1 Considerando a raridade da doença e a escassez de literatura em animais, uma
revisão compreendendo o diagnóstico, a classificação, a epidemiologia, o modo de herança,
os sinais clínicos, a patologia e as alterações ultraestruturais e moleculares da EB contribuirá
para o diagnóstico e a pesquisa.
18
Diagnóstico e classificação
Suspeita-se de EB quando os animais têm bolhas e erosões na pele e mucosas, que se
apresentam em resposta ao mínimo atrito. Esta condição é bem identificada pela aplicação do
teste de Nikolsky,6 que é realizado pressionando e deslizando levemente a ponta do dedo ou
um objeto de ponta romba na pele. No teste positivo a epiderme desprenderá facilmente. É
importante realizar uma completa anamnese e um exaustivo exame físico, incluindo uma
criteriosa avaliação da distribuição das lesões e da presença de outros sinais clínicos ou
complicações. Também é necessário realizar uma análise genealógica dos animais afetados e
de seus ascendentes e descendentes para determinar o modo de herança. O diagnóstico
diferencial para EB inclui: penfigóide bolhoso, penfigóide cicatricial, lúpus eritematoso
sistêmico bolhoso, dermatose bolhosa por IgA linear, pênfigo vulgar, picadas de insetos e
bolhas friccionais.7 Uma vez descartados outros diagnósticos, a suspeita de EB pode ser
confirmada através da microscopia eletrônica de transmissão para identificar em que nível
ocorreu a separação na ZMB.8,9 Outras técnicas de laboratório, incluindo imunofluorescência
e análise de DNA, tornaram-se importantes no diagnóstico da EB.5,10
A classificação da EB em animais segue o mesmo critério usado para humanos, que é
o nível ultraestrutural de separação na ZMB. Dessa forma, a EB pode ser dividida em três
categorias principais: epidermólise bolhosa simples (EBS), caracterizada pela citólise dos
queratinócitos basais, formando uma fissura intraepidérmica; epidermólise bolhosa juncional
(EBJ), em que a separação ocorre na lâmina lúcida; e epidermólise bolhosa distrófica (EBD),
com separação dentro ou abaixo da lâmina densa. Cada forma de EB tem subtipos que são
definidos de acordo com as alterações ultraestruturais e o modo de herança (Tabela 1).11
Porém, em animais, os subtipos não são claramente estabelecidos.
Existe também uma forma adquirida de EB (EBA), uma rara doença autoimune
bolhosa da pele, que foi pela primeira vez relatada, em 1895, em humanos. A EBA é
classificada como uma EB porque clinicamente ela é semelhante à forma hereditária
distrófica.12 Ela é causada pela produção de imunoglobulinas G contra o colágeno VII, o
principal componente das fibrilas de ancoragem.13 Em animais, a EBA foi relatada em cães
em 1998,14,15 mas, devido à semelhança dos achados clínicos, histológicos e
imunohistológicos com o penfigóide bolhoso, essa doença foi mal diagnosticada antes de
1998.15 A EBA está incluída no grupo das doenças bolhosas subepidérmicas autoimunes,
portanto, não será abordada nessa revisão.
19
Tabela 1. Tipos e subtipos de epidermólises bolhosas baseado no nível ultraestrutural de separação na zona da membrana basal (Adaptado de Fine et al. 2008)
Tipos e subtipos de EB Nível de separação ultraestrutural Outros achados ultraestruturais
EB simples (EBS)
EBS localizada Camada basal A fenda pode se estender até a camada suprabasal EBS Dowling-Meara Camada basal Os filamentos de queratina são densos, circunscritos e
aglutinados EBS com distrofia muscular Predominantemente na camada basal, acima da placa interna
hemidesmossomal Reduzida integração dos filamentos de queratina com os hemidesmossomos
EBS autossômica recessiva Queratinócitos basais Os filamentos de queratina são reduzidos ou ausentes dentro dos queratinócitos basais
EBS superficial
Suprabasal, usualmente na interface entre as camadas granular e cornificada
-
EBS letal acantolítica Suprabasal com acantólise Retração perinuclear dos filamentos de queratina EBS com deficiência de placofilina
Suprabasal, com separação célula-célula Os desmossomos suprabasais são pequenos; ocorre retração perinuclear dos filamentos de queratina
EB juncional (EBJ) EBJ Herlitz Lâmina lúcida Os hemidesmossomos são marcadamente reduzidos ou
ausentes; a placa densa sub-basal está ausente EBJ não-Herlitz Lâmina lúcida Os hemidesmossomos podem ser normais ou pequenos e
reduzidos em número EBJ com atresia pilórica Lâmina lúcida As placas hemidesmossomais são pequenas, sempre com
placa densa sub-basal atenuada EB distrófica dominante (EBDD)
EBDD generalizada Sub-lâmina densa As fibrilas de ancoragem são normais ou reduzidas em número
EBDD-dermólise bolhosa do recém-nascido
Sub-lâmina densa Corpos estrelados eletrodensos dentro da camada basal e reduzidas fibrilas de ancoragem
EB distrófica recessiva (EBDR) EBDR generalizada severa Sub-lâmina densa As fibrilas de ancoragem são escassas, ausentes ou
rudimentares EBDR generalizada Sub-lâmina densa As fibrilas de ancoragem são reduzidas ou de aparência
rudimentar EBDR- dermólise bolhosa do recém-nascido
Sub-lâmina densa Corpos estrelados eletrodensos dentro da camada basal e reduzidas fibrilas de ancoragem
20
Epidemiologia e modo de herança
O termo epidermólise bolhosa foi usado pela primeira vez na medicina veterinária em
1974,16 embora em humanos esse termo já tenha sido usado por Koebner, em 1886, no
primeiro relato da doença.11 Doenças semelhantes a EB foram relatadas em animais com
outros nomes como: a doença do pé vermelho do ovino,17 doença mecanobolhosa hereditária
em equinos18,19 e em bovinos,20 e epiteliogênese imperfeita em equino.21 Em búfalos, uma
doença mecanobolhosa hereditária, chamada de dermatose acantolítica mecanobolhosa
suprabasilar hereditária, não foi classificada como EB porque o nível ultraestrutural de
separação é suprabasal, e as lesões orais não são observadas.22 Entretanto, com base na atual
classificação de EB em humanos (Tabela 1), esta doença pode ser definida como epidermólise
bolhosa simples com separação suprabasal. A doença é similar a EBS com deficiência de
placofilina-1, na qual as lesões orais também são mínimas ou ausentes.11 Uma separação
suprabasal semelhante é também relatada em uma doença mecanobolhosa hereditária de
bovinos da raça Angus, denominada de acantólise familiar.23
A EB é herdada através de mecanismo autossômico dominante ou recessivo. A
incidência não é afetada por raça e a doença ocorre tanto no sexo feminino quanto no
masculino.1 Até agora a EB é uma doença incurável tanto em humanos quanto em animais. A
maioria dos casos em humanos leva a morte na infância24 e os animais são eutanasiados ou
morrem durante os primeiros meses de vida.1 São raros os registros de sobrevivência por
meses ou anos em animais com EB. Uma cadela sem raça definida, diagnosticada com EBJ
não-letal, sobreviveu por pelo menos quatro anos,25 e os búfalos com EBS suprabasal22
sobrevivem até a idade adulta (Figura 1A). Estima-se que em humanos a doença afeta 1 a
cada 17.000 nascidos vivos em todo o mundo.26 Em animais, a frequência de EB não é
estimada. Entretanto, no laboratório de Patologia do Hospital Veterinário da Universidade
Federal de Campina Grande, no período de 1983 a 2012, de 861 diagnósticos de doenças em
caprinos, um cabrito foi diagnosticado com EB. No mesmo período, num total de 1.144
diagnósticos em bovinos, dois bezerros de diferentes fazendas foram diagnosticados com EB.
Um inventário atual de EB em animais é mostrado na Tabela 2.
21
Tabela 2. Ocorrência natural de epidermólise bolhosa em animais
Tipo de EB e espécie animal Modo de herança Referências EBS
Bovino Autossômica dominante 34, 36-39 Bovino Autossômica recessiva 23 Búfalo Autossômica recessiva 22 Cão Não determinada 54
EBJ Herlitz
Bovino Não determinada 40 Equino Autossômica recessiva 18, 19, 21, 29-33,70 Ovino Autossômica recessiva 42, 44 Cão Não determinada 46 Rato Autossômica recessiva 50 Camundongo Autossômica recessiva 51
EBJ não-Herlitz
Cão Autossômica recessiva 7, 25, 58, 74-77 Gato Não determinada 27
EBD
Bovino Não determinada 20,35 Ovino Autossômica recessiva 41,43 Caprino Autossômica recessiva 45 Cão Autossômica recessiva 47, 55, 84, 85 Gato Autossômica recessiva 48
22
Sinais clínicos e patologia
Os achados clínicos e patológicos são semelhantes em todos os tipos de EB, variando
apenas na intensidade. Como as descrições são baseadas em achados observados num
pequeno número de registros na literatura, o quadro completo de sinais clínicos pode ser mais
diverso (Figura 2A). É interessante notar que a fragilidade da pele e a formação de bolhas é
comum em humanos,2,24 enquanto em animais, especialmente em cães e gatos, o tegumento é
menos propenso a lesões. Uma possível explicação para esse fenômeno é que em animais o
pêlo previne o desprendimento da epiderme, não apenas por atuar como barreira mecânica,
mas também por ancorar profundamente a epiderme na derme ao nível da invaginação dos
folículos pilosos.27 Distrofia ou queda das unhas é outro sinal frequente em humanos com
EB,28 isto corresponde a deformidade e perda dos cascos em equinos,29-33 búfalos (Figura
1B),22 bovinos (Figura 2B),34-40 ovinos41-44 e caprinos45 e a onicomadese em cães7,25,46,47 e
gatos.27,48,49 Geralmente as lesões são mais severas em casos de EBJ (Figura 2A) do que em
outros tipos de EB (Figura 1A), provavelmente porque as alterações observadas em EBJ
envolvem as principais estruturas de união da ZMB (ver alterações ultraestruturais e
moleculares). Em bovinos (Figura 2A),40 equinos29 e ovinos42,44 afetados por EBJ tipo Herlitz,
as lesões de pele são severas e distribuídas pelo corpo, todos os cascos são afetados ao mesmo
tempo e os animais morrem nas primeiras semanas de vida. O mesmo é observado em cães,46
ratos50 e camundongos,51 mas as lesões são mais brandas. Em EBD, as lesões da pele e das
membranas mucosas têm uma tendência a cicatrizar, característica observada em caprinos45 e
humanos.52 A cura com cicatrizes ocorre porque a formação de bolhas é sob a lâmina densa da
ZMB, proporcionando uma cicatrização mesenquimal da derme.52,53
Em animais a intensidade das lesões está diretamente associada ao modo de vida de
cada espécie. Em animais de produção as lesões são mais intensas porque eles vivem em
rebanhos e num ambiente mais favorável a traumas. Quando os animais são contidos com as
mãos ou com cordas, ou entram em contato uns com os outros ou com os estábulos, a
epiderme se desprende facilmente (Figuras 1C e 2C). A perda dos cascos é também comum
durante o manejo.22,29,38-40,43 Em cães7,54,55 e gatos27,49 as lesões são menos graves do que em
animais de produção e são mais predominantes em áreas glabras como ápice do nariz e coxins
palmares e plantares.
As principais lesões orais são úlceras multifocais na mucosa da gengiva, do palato, dos
lábios, da bochecha e do dorso da língua.27,29,40-45,55 No entanto, as lesões em herbívoros são
mais extensas do que em outras espécies por causa do alimento fibroso. Os ruminantes podem
23
ser mais afetados por lesões orais porque passam mais tempo mastigando do que os
monogástricos, em função da ruminação. Esporadicamente, são observadas úlceras na mucosa
de outros órgãos como esôfago,41,43,45,55 ânus, vulva,45 vagina,21 córnea38,41,45 e pré-estômagos
(Figura 2D). Tal como em humanos,56,57 em caprinos com EBD45 a cura com formação de
cicatrizes é responsável por alterações da arquitetura de algumas estruturas anatômicas da
mucosa oral, incluindo papilas da bochecha e da língua, que podem reduzir o comprimento ou
desaparecer após a cicatrização, deixando uma superfície plana (Figura 3A). Essa
característica não foi observada em ruminantes com EBS23,34,36-39 e EBJ (Figura 3B).40
Hipoplasia do esmalte dentário é um achado comum em humanos57 com EBJ, mas em
animais tem sido esporadicamente observada em equinos29,30 e caninos.58
Os achados histopatológicos da pele e da mucosa são similares em todos os tipos de
EB, mas variam de acordo com a evolução da manifestação clínica, o local da lesão e as
lesões secundárias, como infecção bacteriana. A lesão inicial é a separação subepidérmica
com inflamação mínima. Nas lesões mais avançadas, são observadas extensas áreas de
epiderme separadas da derme, formando grandes fissuras contendo fluido eosinofílico,
eritrócitos e neutrófilos ocasionais (Figura 4).38,40,43 Em EBS com separação suprabasal22,23 é
observada a perda da junção intercelular e acantólise. São observadas áreas de perda do
epitélio oral e lingual (exceto em búfalos)22 associada à necrose, extensiva ulceração,
infiltração por neutrófilos e hemorragia.38,40,45 Alterações similares são observadas na mucosa
do esôfago em ovinos41,43 e caprinos45 com EBD, e na mucosa vaginal e anal em equinos com
EBJ.21 Desprendimento do epitélio da córnea com o mínimo de inflamação foi observado em
EBD41,45 e EBS.38
A Tabela 3 resume os achados clínicos e patológicos de EB em animais. Podem
ocorrer variações entre as espécies e as informações resumidas na Tabela 3, que devem ser
consideradas como diretrizes, e não como descrições definitivas de cada fenótipo possível da
EB.
24
Tabela 3. Resumo dos achados clínicos e patológicos da epidermólise bolhosa em animais
Achados clínicos e patológicos EBS EBJ EBD
Início dos sinais clínicos 1ª semana Ao nascer 1ª semana Pele
Distribuição predominante Membros, pontos de pressão,áreas glabras
Generalizada Membros, pontos de pressão,áreas glabras
Bolhas, erosões e crostas ++(bovino, búfalo), +(cão) +++(bovino, equino, ovino), ++(cão, gato, rato, camundongo) ++(ovino, caprino), +(cão, gato) Alopecia ++(bovino, búfalo), +(cão) +++(bovino, equino, ovino), ++(cão, gato, rato, camundongo) ++(ovino, caprino), +(cão, gato) Cicatriz atrófica - - ++(caprino) Milia - - +(cão, gato)
Cascos e garras Eritema da banda coronária ++(bovino, búfalo), +(cão) +++(bovino, equino, ovino), ++(cão, gato, rato, camundongo) ++(ovino, caprino), +(cão, gato) Deformidades ++(bovino, búfalo), +(cão) ++(bovino, equino, ovino), +( cão, gato, rato, camundongo) +++(ovino, caprino), +(cão, gato) Exungulação ++(bovino, búfalo), +(cão) +++(bovino, equino, ovino), ++(cão, gato, rato, camundongo) ++(ovino, caprino), +(cão, gato)
Envolvimento extra-cutâneo Retardo do crescimento ++ +++ ++ Lesões na cavidade oral +++(bovino), ++(cão) +++(bovino, equino, ovino), ++(cão, gato, rato, camundongo) +++(ovino, caprino), +(cão, gato) Úlcera na córnea +(bovino) +(gato) +(ovino, caprino)
Exame pós-morte Úlceras na cavidade oral +++(bovino), ++(cão) +++(bovino, equino, ovino), ++(cão, gato, rato, camundongo) +++(ovino, caprino), +(cão, gato) Úlceras na lingua +++(bovino), ++(cão) +++(bovino, equino, ovino), ++(cão, gato, rato, camundongo) +++(ovino, caprino), ++(cão, gato) Defeitos no esmalte dentário - Hipoplasia de esmalte, +(equino, cão) - Lesões no trato gastrointestinal - Úlceras nos pré-estômagos, + (Bovino) e ânus, +( equino) Úlcera esofágica, +(ovino, caprino, cão) Lesões no trato genitourinário - Úlceras na vagina, +( equino) Úlceras na vulva, +(caprino)
Morte 3ª semana (bovino) 1º (cão) ao 4º ano (búfalo)
Herlitz: 1ª semana Não-Herlitz: 1º (gato) ao 4º ano (cão)
1º ao 3º mês (ovino,caprino) 1º ano (cão, gato)
Escala de intensidade: -, ausente; +, esporadicamente presente; ++, frequentemente presente; +++, sempre presente
25
Figura 1. Búfalo afetado com epidermólise bolhosa simples. A) São observadas numerosas
áreas de lesões crônicas com alopecia, erosões, crostas e cicatrizes na pele. Também
existem lesões recentes (setas). B) Aspecto palmar dos dedos do membro torácico
mostrando a perda do casco de um paradígito e deformidades nos outros cascos. C) Pele
com desprendimento recente da epiderme, causado por um atrito ocasional. (A Figura 1 é
uma cortesia da Dra. Cristina Fernandes da Universidade Federal de Pelotas-RS).
26
Figura 2. Bezerro afetado com epidermólise bolhosa juncional. A) São observadas grandes
áreas de erosões e crostas na pele, principalmente nos membros. Observe a exungulação de
todos os cascos. B) Aspecto lateral dos dedos do membro torácico esquerdo, mostrando o
desprendimento da pele e a exungulação dos cascos. C) Pele da face interna do pavilhão
auricular com desprendimento da epiderme por fricção induzida. D) Mucosa ruminal com
várias úlceras, situadas principalmente nos pilares ruminais.
27
Figura 3. Vestíbulo oral. Caprino (A) com epidermólise bolhosa distrófica e bezerro (B)
com epidermólise bolhosa juncional. A) No caprino existem úlceras e cicatrizes na mucosa
da bochecha, com perda das papilas (seta). B) No bezerro, observa-se uma úlcera na
mucosa da bochecha (seta), mas sem cicatrizes e perdas de papilas.
Figura 4. Fotomicrografia: A) Pele de um bezerro
afetado com epidermólise bolhosa juncional. A
epiderme está destacada da derme, formando uma
fissura subepidérmica, contendo hemácias e neutrófilos.
Hematoxilina e eosina (H&E). Barra = 50 µm.
28
Alterações ultraestruturais e moleculares
A EB é causada por mutações nos genes que expressam as proteínas constituintes do
citoesqueleto dos queratinócitos basais e da ZMB.3,4 O citoesqueleto é formado por uma rede
citoplasmática de filamentos intermediários compostos de queratina 5 e queratina 14. Estes
filamentos estão conectados aos desmossomos e hemidesmossomos e desempenham um papel
na organização da arquitetura celular e na manutenção da integridade estrutural da epiderme.59
As células epidérmicas comunicam-se através dos desmossomos e junções intercelulares. Os
desmossomos são complexos especializados que formam as junções intercelulares entre as
células epiteliais adjacentes. As principais proteínas destas junções intercelulares são:
placoglobina, placofilina, desmoplaquina e as caderinas desmocolina e desmogleina (Figura
5).4 A ZMB está localizada na junção entre a epiderme e a derme. Sua função é manter a
adesão entre estes dois tecidos, estruturalmente diferentes, por meio de uma complexa rede de
moléculas de adesão intricadamente inter-relacionadas. A ZMB é dividida em três áreas: os
hemidesmossomos, a lâmina lúcida e a lâmina densa. Os hemidesmossomos são formados
pelas placas interna e externa. A placa interna é composta pelas proteínas hemidesmossomais
citoplasmáticas HD1/plectina e BP230. Ela está conectada aos filamentos intermediários, no
interior do citoplasma dos queratinócitos basais. A placa externa contém as proteínas integrina
α6β4 e BP180. A lâmina lúcida é formada por: membrana plasmática, placa densa sub-basal e
filamentos de ancoragem. Os filamentos de ancoragem são compostos pelas proteínas BP180
(também conhecido como colágeno XVII) e laminina 332 (antes chamada de laminina 5). A
lâmina densa é constituída principalmente pelo colágeno IV. Sob a lâmina densa estão as
fibrilas de ancoragem, elas se estendem até a papila dérmica e são compostas de colágeno VII
(Figura 5).60,61 Cada tipo de EB tem alterações ultraestruturais e moleculares específicas, que
são descritas em seguida.
29
Figura 5. Representação esquemática da organização molecular do citoesqueleto dos
queratinócitos basais e da zona da membrana basal. E = epiderme; H = hemidesmossomo; LL =
lâmina lúcida; LD = lâmina densa; D = derme. Proteínas dos desmossomos e da junção
intercelular: Dp = desmoplaquina; Pg = placoglobina; Pf = placofilina; C = caderinas.
Epidermólise bolhosa simples
Em humanos24,62 e bovinos38 a EBS é geralmente causada por mutações nos genes que
codificam as queratinas 5 e 14 (genes KRT5 e KRT14) e transmitida por herança autossômica
dominante. Em bovinos a separação acima da membrana basal é formada por lise dos
queratinócitos basais e aglutinação de filamentos intermediários;38,39 essa mesma alteração foi
descrita na forma Dowling-Meara de EBS em humanos.62 Em bovinos foi identificada uma
mutação “missense” no gene KRT5, que causou a mudança no códon GAG (ácido glutâmico)
para AAG (lisina) na posição 478. Possivelmente, essa mudança de aminoácidos (ácido para
básico) alterou a formação da queratina e dos filamentos intermediários causando fragilidade
dos queratinócitos e a separação da epiderme.38 A mesma mutação foi relatada em casos de
EBS em humanos.63 Em humanos a EBS transmitida de forma recessiva é causada por
mutações nos genes PLECTIN,64,65 DESMOPLAKIN66 e PLAKOPHILIN-1.24,67 A EB em
búfalos, transmitida através de mecanismo autossômico recessivo, é caracterizada por
separação suprabasal entre o estrato basal e o estrato espinhoso, com perda da junção
desmossomal (Figura 6A).22 Estas mudanças assemelham-se a EBS com separação
30
suprabasal, associada à deficiência de placofilina-1, conhecida como síndrome da fragilidade
da pele e displasia ectodérmica, observada em humanos.24,67 Estudos complementares
sugeriram que a doença em búfalos ocorreu, provavelmente, devido a defeitos na estabilidade,
estrutura ou função das caderinas desmossomais e não às alterações nas proteínas da placa
desmossomal.68
Epidermólise bolhosa juncional
Todos os subtipos de EBJ que afetam humanos2,11,24 e animais1 são transmitidos, por
genes autossômicos recessivos e são caracterizados por formação de bolhas na lâmina lúcida
(Figura 6B) e defeitos nas proteínas do complexo hemidesmossomos-filamentos de
ancoragem. Os hemidesmossomos são as principais estruturas de adesão na ZMB. As
anormalidades no complexo hemidesmossomos-filamentos de ancoragem podem causar
extrema fragilidade na junção entre epiderme e derme, de modo que os sinais clínicos são
mais severos em EBJ do que nos outros tipos de EB.24,69 Em bovinos,40 equinos,21,70 e ratos50
são observados filamentos de ancoragem reduzidos, hemidesmossomos pequenos e sem clara
demarcação (Figura 6C), e placa densa sub-basal atenuada. Em humanos a maioria das
mutações que causa EBJ, está situada em um dos três genes que codificam as cadeias α3, β3,
ou γ2 da laminina 332, respectivamente os genes LAMA3, LAMB3 e LAMC2.2 Essas
mutações causam a falta de expressão das respectivas cadeias de proteínas. A laminina 332
forma os filamentos de ancoragem que conecta a integrina α6β4 dos hemidesmossomos ao
colágeno VII das fibrilas de ancoragem.61 Uma mutação “frameshift” no gene LAMC2 gerou
um prematuro códon de parada em equinos Belgas29,31 e ovinos Black Headed Mutton,42
geneticamente similar a EBJ do tipo Herlitz, a forma mais severa observada em humanos.71,72
Em equinos da raça American Saddlebred foram identificadas mutações no gene LAMA3
devido a deleção de 6.589 pb na região incluindo os éxons 24-27. Esta mutação causou um
fenótipo semelhante ao dos equinos Belgas com EBJ.33 Em humanos com EBJ clinicamente
menos grave, conhecida como EBJ não-Herlitz, são identificadas mutações nos genes
COL17A1 (que codifica o colágeno XVII), ITGA6 e ITGB4 (que codificam a integrina
α6β4). Nesses casos, a microscopia eletrônica mostra os hemidesmossomos normais ou
pequenos e em menor número.11 Em cães25,73-77 são observados achados clínicos e
ultraestruturais semelhantes a EBJ não-Herlitz de humanos. Usando um anticorpo específico
para o colágeno XVII, em todos os fragmentos de pele (lesionada e não lesionada) de cães
31
com EBJ, a reação imunoistoquímica foi negativa, sugerindo uma falha na expressão do gene
COL17A1.74
Epidermólise bolhosa distrófica
A EBD é transmitida por mecanismo autossômico dominante ou recessivo, causada
por mutações no gene COL7A1 que codifica o colágeno VII, o principal componente das
fibrilas de ancoragem da junção entre epiderme e derme.52,78,79 Ultraestruturalmente, o local
da separação é abaixo da lâmina densa (Figura 6D). Em humanos,9,52,78 gatos,49 cães,45
ovinos41 e caprinos45 com EBD recessiva são observadas fibrilas de ancoragem escassas e
rudimentares. Tais alterações diminuem a adesão das fibrilas de ancoragem com as fibras de
colágeno da derme, deixando a junção entre epiderme e derme susceptível a separação.80 Na
forma dominante, relatada em humanos, mas não em animais, as fibrilas de ancoragem têm a
forma normal, mas são reduzidas em número.81 Outras estruturas da ZMB (queratinócitos
basais, lâmina lúcida, lâmina densa e hemidesmossomos) são normais. Mais de 300 mutações
são relatadas em humanos e a maioria está associada a substituições de glicinas por diferentes
aminoácidos. Estas mutações são causadas por alteração em um alelo do gene que expressa o
colágeno VII. As substituições de glicinas provavelmente têm um efeito dominante negativo
na formação do colágeno VII.81-83 Uma mutação “missense” no gene COL7A1 com
substituição de glicina por uma serina foi também observada em cães com EBD recessiva.84,85
32
Figura 6. Fotomicrografia eletrônica de transmissão: A) Pele de um búfalo afetado com
epidermólise bolhosa simples. O assoalho da bolha suprabasilar (estrela) é formado por
células basais unidas a derme (D). Observe as células acantolíticas (setas) dentro da bolha.
Barra = 2 µm. B) Pele de um bezerro afetado com epidermólise bolhosa juncional. As
células basais estão formando o teto da bolha (estrela), após a separação da derme ao nível
da lâmina lúcida. Observe os pequenos hemidesmossomos (quadrado). Barra = 1µm. C)
Ampliação do quadrado da Figura B. Observe a membrana plasmática (seta) e os
hemidesmossomos pequenos e mal definidos dentro dos quadrados. Barra = 200 nm. D)
Pele de um caprino afetado com epidermólise bolhosa distrófica. A lâmina densa (setas)
forma o teto da bolha (estrela). A lâmina basal, os hemidesmossomos e os filamentos de
ancoragem estão bem preservados. Barra = 500 nm. (Figura 6A é uma cortesia do Dr.
Severo S. Barros da Universidade Federal de Pelotas-RS).
33
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40
CAPÍTULO II
Epidermólise Bolhosa Distrófica em Caprinos
O presente trabalho foi formatado segundo as normas da revista Journal of Comparative
Pathology (anexo 4). O artigo foi aceito para publicação (anexo 5).
41
Epidermólise Bolhosa Distrófica em Caprinos
G. X. Medeiros*, F. Riet-Correa*, S. S. Barros †, M. P. Soares†, A. F. M. Dantas*,
G. J. N. Galiza*, S.V.D. Simões* and A. S. Borges ‡
*Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária, Universidade Federal de Campina
Grande, Patos, Paraíba, Brasil, CEP 58708-110, †Laboratório Regional de Diagnóstico,
Faculdade de Veterinária, Universidade Federal de Pelotas, Pelotas, Rio Grande do Sul,
Brasil, CEP 96010-900, Departamento de Clínica Veterinária, Escola de Medicina
Veterinária e Ciência Animal, Universidade do Estado de São Paulo, UNESP, FMVD,
Botucatu, SP, 18618-000, Brasil.
Summary
Clinical, histopathological, and ultrastructural findings of dystrophic epidermolysis bullosa
(DEB) in goats transmitted by an autosomal recessive gene are reported. The goats presented
with exungulation, erosions, crusts and scars on the skin and ulcers in the oral cavity.
Histologically, the skin showed subepidermal separation, with clefts filled occasionally with
clear eosinophilic fluid, cellular debris or neutrophils. Ultrastructurally, the site of blister
formation was the sub-lamina densa in the epidermal basement membrane zone. In skin with
blister formation and in clinically uninvolved skin, the basal lamina was preserved, but the
anchoring fibrils were scarce and rudimentary. A twin brother of an affected kid was mated
over five years with his mother; three out of the ten kids born presented epidermolysis
bullosa, indicating that the disease is transmitted by a recessive autosomal gene. It is
suggested that the disease is similar to human severe generalized recessive DEB.
Keywords: anchoring fibrils; basal membrane; epidermolysis bullosa; Anglonubian goats;
skin diseases
Autor para correspondência: Franklin Riet-Correa (e-mail: [email protected]).
Enviado para publicação em 20.04.2012.
Recomendado pelos revisores para publicação e reenviado com as devidas correções em 01.05.2012.
42
Resumo
Foram descritos em caprinos os achados clínicos, histopatológicos e ultraestruturais da
epidermólise bolhosa distrófica transmitida por um gene autossômico recessivo. Os caprinos
apresentaram exungulação, erosões, crostas e cicatrizes na pele e úlceras na cavidade oral.
Histologicamente, a pele apresentava separação subepidermal, com fissuras ocasionalmente
preenchidas com fluido eosinofílico claro, restos celulares ou neutrófilos.
Ultraestruturalmente, o local de separação foi abaixo da lâmina densa na zona da membrana
basal. Na pele com formação de bolhas e na pele não envolvida clinicamente, a lâmina basal
foi preservada, mas as fibrilas de ancoragem eram escassas e rudimentares. Um irmão gêmeo
do cabrito afetado foi usado para acasalamento com sua mãe, por cinco anos; desse
cruzamento, nasceram dez cabritos, três apresentaram epidermólise bolhosa, indicando que a
doença é transmitida por um gene autossômico recessivo. Sugere-se que a doença é similar a
epidermólise bolhosa distrófica recessiva generalizada e severa observada em humanos.
Palavras-chave: fibrilas de ancoragem; membrana basal; epidermólise bolhosa; caprinos da
raça Anglonubiana; doenças de pele
Introdução
A epidermólise bolhosa (EB) compreende um grupo de doenças hereditárias da pele e
membranas mucosas observada em humanos (Siãnez-Gonzáles et al., 2009; Sawamura et al.,
2010) e em diferentes espécies animais, incluindo ovinos (Bruckner-Tuderman et al., 1991;
Pérez et al., 2011), bovinos (Ford et al., 2005; Foster et al., 2010; Medeiros et al., 2012),
equinos (Spirito et al., 2002; Milenkovic et al., 2003; Georgescu et al., 2008; Graves et al.,
2009), cães (Nagata et al., 1995; Nagata et al., 1997; Palazzi et al., 2000; Baldeschi et al.,
2003; Cerquetella et al., 2005; Gache et al., 2011), gatos (White et al.,1993; Olivry et al.,
1999; Alhaidari et al., 2006), ratos (Brenneman et al., 2000) e camundongos (Kuster et al.,
1997). A principal característica da EB, tanto em humanos quanto em animais, é a formação
de bolhas e erosões em resposta a um mínimo trauma mecânico, especialmente em áreas
sujeitas a atrito e pressão, como os membros e a cavidade oral. A fragilidade da pele resulta
da pobre adesão da epiderme a derme devido aos defeitos na zona da membrana basal
(Christiano and Uitto, 1996; Bruckner- Tuderman, 1999). Baseado no nível ultraestrutural de
separação do tecido, a EB pode ser dividida em três categorias: epidermólise bolhosa simples
43
(EBS), caracterizada pela citólise dos queratinócitos, produzindo fissuras intraepidermais;
epidermólise bolhosa juncional (EBJ), na qual a separação ocorre na lâmina lúcida; e
epidermólise bolhosa distrófica (EBD), com separação dentro ou sob a lâmina densa
(Yiasemides et al., 2006; Fine et al., 2008). A EBD é herdada através de mecanismo
autossômico dominante ou recessivo, com expressividade variável. Fine et al. (2008)
dividiram a EBD em cinco subtipos: EBD dominante generalizada, EBD dominante-
dermólise bolhosa do recém-nascido, EBD recessiva generalizada, EBD recessiva
generalizada e severa, e EBD recessiva-dermólise bolhosa do recém-nascido.
Casos de EBD na medicina veterinária foram registrados em cães (Nagata et al.,
1995; Palazzi et al., 2000; Baldeschi et al., 2003; Gache et al., 2011), gatos (White et al.,
1993; Olivry et al., 1999) e ovinos (Bruckner-Tuderman et al., 1991; Pérez et al., 2011).
Ultraestruturalmente, a EBD é caracterizada por formação de bolhas, as quais se formam
devido às alterações morfológicas ou quantitativas das fibrilas de ancoragem, que são
compostas de colágeno VII (Bruckner-Tuderman, 2010). As análises mutacionais em
humanos (Järvikallio et al., 1997; Dang and Murrel, 2008) e cães (Baldeschi et al., 2003;
Gache et al., 2011) mostraram que todas as formas de EBD resultaram de mutações no gene
do colágeno VII (COL7A1).
Neste trabalho, descrevemos os aspectos clínicos, histopatológicos e ultraestruturais e
o modo de herança da EBD em caprinos.
Material e Métodos
O primeiro animal afetado (I-1; Fig. 1) pertencia a um rebanho de 110 caprinos
oriundos de uma fazenda do Estado da Paraíba, Nordeste do Brasil. O caprino era macho,
tinha um mês de idade e era descendente de um bode da raça Anglonubiana e uma cabra cruza
de Anglonubiana, ambos nascidos na própria fazenda. O proprietário relatou que, antes desse
animal afetado, outros quatro nasceram com sinais clínicos semelhantes. Devido a esse
histórico, o bode reprodutor foi castrado. A cabra genitora e um irmão gêmeo (I-2; Fig. 1) do
cabrito afetado foram transferidos para o Hospital Veterinário da Universidade Federal de
Campina Grande, Patos, Paraíba, Brasil. A partir dos seis meses de idade, o bode
assintomático (I-2; Fig. 1) acasalou com sua mãe, por cinco anos consecutivos.
O modo de herança da doença foi estudado por análise da frequência de cabritos com
EB nascidos do cruzamento do bode I-2 com sua mãe (Fig. 1). As frequências de caprinos
afetados e normais foram analisadas, através do teste binomial (Zar, 1999), com um nível de
44
significância de 5%, para testar a hipótese de que a doença foi transmitida por um gene
autossômico recessivo. A análise foi realizada pelo programa SPSS 20.0 para Windows. Os
caprinos afetados foram submetidos a um detalhado exame clínico.
Um completo exame pós-morte foi feito em todos os cabritos afetados (I-1, II-7, II-8 e
II-9; Fig. 1). Foram coletadas amostras de tecidos dos seguintes órgãos: pele, músculo
esquelético, tireóide, olhos, mucosa oral, língua, esôfago, encéfalo, medula espinhal e todos
os órgãos da cavidade torácica e da cavidade abdominal. Todas as amostras foram fixadas em
formol tamponado a 10%. Posteriormente, as amostras foram embebidas em parafina e
coradas com hematoxilina e eosina (H.E). Alguns fragmentos da pele e da mucosa oral foram
submetidos ao tratamento histoquímico do ácido periódico-reativo de Schiff (PAS), com
contra coloração nuclear pela hematoxilina de Harris.
Para microscopia eletrônica, biópsias de pele com e sem lesões, foram fixadas em
glutaraldeído a 2,5% (tampão cacodilato de sódio-0.1 M/pH 7.4). Os blocos foram pós-
fixados em solução de tetróxido de ósmio a 1% (tampão cacodilato de sódio-0.15 M/pH 7.4) e
embebidos em Epon 812. Cortes ultrafinos foram contrastados com citrato de chumbo e
acetato de uranila e examinados com um microscópio eletrônico Zeiss EM 109 de 80
kilovolts.
Resultados
O pedigree dos caprinos com EBD está apresentado na Fig. 1. Do cruzamento do bode
I-2 com sua mãe nasceram sete cabritos normais e três afetados. A frequência de caprinos
com EBD descendentes do bode I-2 (30%) foi estatisticamente (P = 0.474) igual à freqüência
esperada para uma doença de herança autossômica recessiva (Schild 2007).
Os quatro cabritos afetados nasceram aparentemente normais, mas a epiderme soltava-
se facilmente quando uma pequena pressão era exercida na pele intacta [sinal positivo de
Nikolsky (Polifka and Krusinski, 1980)]. Lesões espontâneas apareceram nas primeiras
semanas de vida, exceto no cabrito II-8, que apresentou lesões no mesmo dia em que nasceu.
Foram observadas alopecia, erosões e crostas na superfície externa da orelha (Fig. 2A), na
região ventral do tórax e do abdome, na face dorsal do carpo e na face dorsal do tarso. Um
extenso desprendimento da epiderme foi observado no cabrito II-8 após aplicação do teste de
Nikolsky (Fig. 2B) e os cascos soltavam-se facilmente em resposta ao atrito mínimo. Na
maioria dos casos, as lesões da pele curavam espontaneamente com cicatrizes distróficas. O
epitélio da gengiva e lábios estava ulcerado (Fig. 2C). Foram observadas eritemas e
45
hemorragias na banda coronária de todos os cascos, que evoluíam para desprendimento e
deformação de alguns cascos (Fig. 2D). Foram observados também desnutrição e retardo do
crescimento. No cabrito II-9 foi observada perda da epiderme da vulva e opacidade de córnea.
Devido à gravidade das lesões e ao prognóstico desfavorável, os cabritos I-1 e II-7 foram
eutanasiados. O cabrito II-8 morreu poucas horas após o parto. O cabrito II-9 foi encontrado
morto aos três meses de idade, provavelmente em consequência da desnutrição devido às
lesões na mucosa oral.
No exame pós-morte foram observadas extensas úlceras multifocais na mucosa do
palato, gengiva, lábios, bochecha e dorso da língua (Figs. 3A e B). As estruturas anatômicas,
tais como rugas palatinas, papilas da língua, papilas dos lábios e papilas das bochechas
estavam parcialmente destruídas (Figs. 3A e B). Existia um exudato mucopurulento nas
úlceras orais mais avançadas (Fig. 3A). Foi observado no cabrito II-9 um desprendimento da
mucosa do esôfago. Não havia nenhuma lesão significante nos outros órgãos.
Fig 1. Pedigree dos caprinos com epidermólise bolhosa distrófica. Os quadrados
representam os machos e os círculos as fêmeas. Os quadrados e círculos pretos são os
caprinos afetados. As linhas diagonais são os animais que morreram.
46
Fig. 2 Fig. 3
Fig 2. Caprinos com epidermólise bolhosa distrófica. (A) Caprino I-1. Vista lateral direita da cabeça
mostrando alopecia e desprendimento da epiderme na face externa da orelha e na pálpebra superior.
(B) Caprino II-8. Face interna da orelha mostrando o desprendimento da epiderme após o teste de
Nikolsky. (C) Caprino II-9. Gengiva e lábios com desprendimento do epitélio da mucosa. (D)
Caprino I-1. Desprendimento e deformação dos cascos.
Fig. 3. Caprino II-9. (A) A cavidade oral mostrando úlceras e cicatrizes no palato duro e na mucosa
da bochecha, com perda das papilas bucais (setas). Note o exudato mucopurulento. (B) A língua
com extensa ulceração e cicatrizes no dorso, com perda de papilas linguais (setas). Algumas papilas
da bochecha e da língua permanecem normais (*).
Os cabritos II-1 a II-6 e o II-10 não eram clinicamente afetados e não apresentavam
sinal de Nikolsky. Os cabritos II-2 a II-5 foram descartados ou morreram de outras causas em
diferentes idades (todos acima de um ano de idade).
As alterações histológicas na pele e na mucosa oral foram similares em todos os
caprinos afetados, com variações na gravidade dependendo dos estágios das lesões. A lesão
inicial foi separação subepidermal (Fig. 4A). Algumas bolhas eram preenchidas com fluído
eosinofílico claro e ocasionalmente com restos celulares ou neutrófilos. A separação entre
epiderme e derme ocorreu sem citólise das células epiteliais situadas no teto da bolha. Foram
observados diferentes graus de desprendimento dos folículos pilosos. Nas mucosas da boca e
da língua existiam separações subepiteliais semelhantes às observadas na pele. Foi observada
também a perda do epitélio oral e lingual, associada à necrose, extensa ulceração, infiltração
47
por neutrófilos e hemorragia. No cabrito II-9 havia perda do epitélio do esôfago e da córnea
com inflamação mínima. Nenhuma lesão significativa foi observada nos outros tecidos
examinados.
Por meio da microscopia eletrônica a separação entre epiderme e derme foi
identificada abaixo da lâmina densa, com a lâmina basal formando o teto da bolha (Fig. 4B).
A lâmina lúcida foi atravessada por filamentos de ancoragem normais e os hemidesmossomos
tinham uma clara placa densa sub-basal. Não foram observadas fibrilas de ancoragem no teto
da bolha. Os queratinócitos basais, a lâmina basal, os hemidesmossomos e os filamentos de
ancoragem estavam bem preservados (Fig. 4C). Na pele sem bolhas foram observadas fibrilas
de ancoragem, mas eram escassas e rudimentares (Fig. 4D).
Fig 4. Pele. Caprino. (A) A epiderme está destacada da derme, formando uma fissura
subepidérmica (*). HE. Barra, 25 µm. (B) Micrografia eletrônica de transmissão. A
lâmina basal e os queratinócitos normais formam o teto da bolha (*), e a derme está no
assoalho. As fibrilas de ancoragem não são observadas. Barra, 2.5 µm. (C) Micrografia
eletrônica de transmissão mostrando a lâmina densa (setas) formando o teto da bolha
(*). A lamina basal, os hemidesmossomos e os filamentos de ancoragem estão bem
preservados. Barra, 1 µm. (D) Micrografia eletrônica de transmissão. Pele sem lesões. A
lâmina basal está preservada, mas as fibrilas de ancoragem são escassas e rudimentares
(setas). Barra, 0.5 µm.
48
Discussão
Os achados clínicos, patológicos e ultraestruturais nos caprinos deste estudo são
característicos de EBD em animais e humanos. Nenhum tipo de EB foi previamente descrita
em caprinos. Em humanos, EBD pode ser transmitida por herança autossômica dominante ou
recessiva (Mallipeddi et al., 2003; Fine et al., 2008; Sawamura et al., 2010), mas em animais
domésticos, apenas formas recessivas foram descritas (Bruckner-Tuderman et al., 1991;
Olivry et al., 1999; Baldeschi et al., 2003; Gache et al., 2011; Pérez et al., 2011). O pedigree
do rebanho experimental (Fig. 1) demonstra que a doença em caprinos é transmitida por um
gene autossômico recessivo. Apesar de a doença não ter sido observada em outros rebanhos
de caprinos da raça Anglonubiana no Brasil, é provável que este gene esteja presente em
outras fazendas. Outra possibilidade é que a doença ocorreu apenas no rebanho estudado
devido a uma mutação em um caprino, seguida da disseminação do gene por consaguinidade.
Nos quatro casos de EBD descritos neste trabalho, a manifestação clínica variou de um
dia a três meses, mas todos os animais morreram ou foram eutanasiados devido às lesões na
cavidade oral e nos cascos. Geralmente, as lesões da mucosa oral e da pele, e o
desprendimento dos cascos são menos agressivos em EBD (Bruckner-Tuderman et al., 1991;
Pérez et al., 2011) e EBS (Ford et al., 2005; Foster et al., 2010) do que em EBJ. Em bovinos
(Medeiros et al., 2012) e equinos (Spirito et al., 2002) afetados por EBJ, as lesões de pele são
mais severas, todos os cascos são afetados ao mesmo tempo, e os animais morrem num curto
período, após o nascimento. Além disso, em EBD, existe uma tendência a cura das lesões com
cicatrizes distróficas (Bruckner-Tuderman, 1999), que raramente é observada em outros tipos
de EB (Foster et al., 2010; Sawamura et al., 2010; Medeiros et al., 2012). A formação de
cicatrizes ocorre porque as bolhas em EBD formam-se abaixo da lâmina densa da zona da
membrana basal, conduzindo a uma cicatrização mesenquimal na derme (Bruckner-
Tuderman, 1999; Varki et al., 2007). Igual aos humanos (Azrak et al., 2006; Wright, 2010),
nos caprinos deste estudo, a cura com formação de cicatrizes também foi responsável pela
destruição de algumas estruturas anatômicas da mucosa oral, incluindo as rugas palatinas e as
papilas linguais, que desaparecem após a cicatrização, deixando a superfície plana. O
desprendimento da mucosa esofágica, observada no cabrito II-9, também registrada em ovinos
(Bruckner-Tuderman et al., 1991; Pérez et al., 2011), é um achado comum em humanos,
especialmente na EBD recessiva generalizada e severa (Azrak et al., 2006; Wright, 2010). A
lesão de córnea, observada no cabrito II-9, foi descrita também em ovinos (Bruckner-
Tuderman et al., 1991) e humanos (Figueira et al., 2010), com EBD recessiva.
49
A morfologia ultraestrutural das áreas afetadas mostra que a formação da bolha é
claramente abaixo da lâmina densa na zona da membrana basal. A quantidade de fibrilas de
ancoragem é marcadamente reduzida, e elas exibiram uma morfologia rudimentar e
filamentosa. Estas mudanças diminuíram a adesão entre as fibrilas de ancoragem e as fibras
de colágeno da derme, deixando a união entre epiderme e derme susceptível a separação
(Bruckner-Tuderman, 2010). As fibrilas de ancoragem são formadas por colágeno VII (Chung
and Uitto, 2010), sugerindo que este colágeno esteja envolvido na patogênese da EBD dos
caprinos. As fibrilas de ancoragem em ovinos (Bruckner-Tuderman et al., 1991; Pérez et al.,
2011), cães (Nagata et al. 1995; Baldeschi et al., 2003; Gache et al., 2011), gatos (Olivry et
al., 1999), e humanos (Kon et al., 1998; Jonkman et al., 1999; Eady and Dopping-Hepenstal,
2010) mostraram mudanças semelhantes. Mais de 300 mutações foram registradas em
humanos, e EBD está estritamente associada com a substituição de glicina, devido à mutação
em um alelo do gene que codifica o colágeno VII. A substituição de glicina provavelmente
tem um efeito dominante-negativo na formação do colágeno VII (Mallipeddi et al., 2003).
Um códon de parada prematuro está presente em ambos os alelos do gene COL7A1 na forma
generalizada e severa da EBD recessiva (Dunnill et al., 1994; Kon et al., 1998; Gardella et al.,
2002; Dang and Murrel, 2008). Uma mutação “missense” no gene COL7A1 com substituição
de glicina foi observada em cães com EBD recessiva (Baldeschi et al., 2003; Gache et al.,
2011).
Não há dúvida de que a anormalidade das fibrilas de ancoragem é o defeito estrutural
primário na patogênese da EBD; entretanto, as alterações destas fibrilas variam de acordo
com o modo de herança. Na forma dominante, as fibrilas de ancoragem são normais e
reduzidas em número, mas na forma recessiva, as fibrilas de ancoragem são rudimentares e
ausentes ou escassas (Fine et al. 2008). A ausência das fibrilas de ancoragem no teto da bolha,
o pequeno número e a aparência rudimentar das fibrilas de ancoragem na pele não envolvida
clinicamente, sugerem que esta doença nos caprinos é morfologicamente similar a EBD
recessiva generalizada e severa observada em humanos (Dunnill et al., 1994; Kon et al., 1998;
Gardella et al., 2002; Dang and Murrel, 2008) e ovinos (Bruckner-Tuderman et al. 1991;
Pérez et al., 2011).
Conflitos de interesse
Os autores declaram que não existem conflitos de interesse.
50
Financiamento
Este trabalho foi financiado pelo Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e
Tecnológico (CNPq), processo 471386/2010-3.
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54
CAPÍTULO III
Epidermólise Bolhosa Juncional em um Bezerro
O presente trabalho foi formatado segundo as normas da revista Journal of Veterinary
Diagnostic Investigation (anexo 6). O artigo foi publicado em janeiro de 2012 (DOI:
10.1177/104638711425953) (anexo 7).
55
Epidermólise Bolhosa Juncional em um Bezerro
Gildenor X. Medeiros, Franklin Riet-Correa1, Anibal G. Armién, Antônio F. M. Dantas,
Glauco J. N. de Galiza, Sara V. D. Simões
Abstract. A case of epidermolysis bullosa in a calf descendent from a Gir bull and a
Gir crossbreed cow is reported. The calf presented with exungulation of all hooves,
widespread erosions and crusts on the skin, and ulcers in the oral cavity. Histologically, the
skin showed subepidermal separation with clefts occasionally filled with eosinophilic clear
fluid, cellular debris, or neutrophils. Ultrastructurally, there was epidermal-dermal separation
at the level of the lamina lucida, with the lamina densa attached to the papillary dermis. The
hemidesmosomes were poorly defined and small. The clinical, histological and ultrastructural
findings are characteristic of junctional epidermolysis bullosa.
Key words: basal membrane; cattle; epidermolysis bullosa; mechanobullous diseases;
skin diseases.
Resumo. Neste trabalho é descrito um caso de epidermólise bolhosa em um bezerro
filho de um touro da raça Gir e uma vaca cruza de Gir. O bezerro apresentava um quadro
clínico que se caracterizava por exungulação de todos os cascos, erosões e crostas
generalizadas na pele e úlceras na cavidade oral. Na histologia da pele foi observada
separação subepidérmica com formação de bolhas preenchidas com fluido eosinofílico claro,
restos celulares ou neutrófilos ocasionais. No exame ultraestrutural foi identificada separação
ao nível da lâmina lúcida na zona da membrana basal, deixando a lâmina densa unida às
papilas dérmicas. Os hemidesmossomos apresentavam-se pequenos, pobremente definidos e
com bordas sem demarcação clara. Os achados clínicos, histológicos e ultraestruturais
encontrados no bezerro são característicos da epidermólise bolhosa juncional.
1 Autor para correspondência: Franklin Riet-Correa, Hospital Veterinário, CSTR, Universidade Federal de
Campina Grande, Campus de Patos, Patos, Paraíba 58700-000, Brasil. [email protected]
Da Universidade Federal de Campina Grande, Hospital Veterinário, Patos, Paraíba, Brasil (Medeiros, Riet-
Correa, Dantas, Galiza, Simões), e do Laboratório de Diagnóstico Veterinário, Colégio de Medicina Veterinária,
Universidade de Minnesota, St. Paul, MN (Armién).
Artigo publicado: J VET Diagn Invest 2012, 24 (1): 231-234. DOI: 10.1177/104638711425953.
56
Palavras chave: membrana basal; bovino; epidermólise bolhosa; doenças
mecanobolhosas; doenças da pele.
A epidermólise bolhosa (EB) é uma dermatose neonatal hereditária observada em
animais e humanos, caracterizada por marcada fragilidade da pele e das mucosas, que
desencadeia a formação de bolhas e ulcerações em resposta a pequenos traumas. As lesões
ocorrem em função da insuficiente conexão na junção entre epiderme e derme, devido a
defeitos na zona da membrana basal.4,6 Além da formação de bolhas nas regiões de maior
atrito, observa-se perda de unhas, garras ou cascos, e desprendimento do epitélio da mucosa
oral.7,8 A classificação dos tipos de EB segue uma sistemática estudada para humanos, em que
o critério principal é o nível ultraestrutural de separação da pele na zona da membrana basal.
São basicamente três tipos: epidermólise bolhosa simples (EBS), caracterizada por citólise
dos queratinócitos basais produzindo fissuras intraepidérmicas; epidermólise bolhosa
juncional (EBJ), na qual ocorre separação na lâmina lúcida; e epidermólise bolhosa distrófica
(EBD), com clivagem dentro ou abaixo da lâmina densa.3 A maioria dos tipos de EB é de
caráter autossômico recessivo e freqüência muito baixa. Estima-se que em humanos a
enfermidade afeta 1 a cada 17.000 nascidos vivos em toda população mundial.8 Em animais, a
frequência de EB não é estimada, existindo poucos relatos da doença. O objetivo deste
trabalho foi relatar os aspectos clínicos, histológicos e ultraestruturais de um caso de EB em
um bezerro de dois meses de idade, examinado em abril de 2010, no Hospital Veterinário da
Universidade Federal de Campina Grande (HV/UFCG), Patos, Paraíba, Brasil. O bezerro
pertencia a um rebanho de 18 animais. Era descendente de um touro Gir com uma vaca cruza
de Gir. Segundo o proprietário, um bezerro com lesões semelhantes (filho do mesmo touro)
havia morrido anteriormente na propriedade.
O bezerro apresentava exungulação de todos os cascos, erosões e crostas generalizadas
na pele (Fig. 1A, 1B) e úlceras na cavidade oral (Fig. 1C). A epiderme desprendia facilmente
quando se exercia uma pequena pressão na pele intacta (sinal de Nikolsky positivo8). Devido
à severidade do quadro clínico e prognóstico desfavorável, o animal foi eutanasiado e
necropsiado. No exame pós-morte foram observados vários graus de alopecia, erosões e
crostas na pele das seguintes regiões: metacarpal, metatarsal, cotovelo, joelho, ventral do
tórax, ventral do abdome e região glútea. Também existiam úlceras multifocais distribuídas na
gengiva, nos palatos duro e mole, na mucosa dos lábios, na mucosa da bochecha, e na face
dorsal da língua. Os demais órgãos não apresentaram lesões significativas.
57
Durante o exame pós-morte foram coletadas amostras dos seguintes órgãos: pele,
músculo esquelético, mucosa oral, língua, linfonodos, tireóide, timo, pulmão, coração, fígado,
esôfago, pré-estômagos, abomaso, intestino delgado, intestino grosso, baço, rim, adrenal,
encéfalo e medula espinhal. Todas as amostras foram fixadas em formol tamponado a 10%.
Posteriormente foram embebidas em parafina e coradas com hematoxilina e eosina (HE) e
submetidos ao tratamento com ácido periódico de Schiff (PAS). Na histologia da pele a
primeira alteração observada foi a separação subepidérmica (Fig. 2), com formação de bolhas
preenchidas com fluido eosinofílico claro e ocasionalmente com restos celulares ou
neutrófilos. As células epidérmicas apresentaram degeneração evoluindo para necrose. As
papilas dérmicas estavam edematosas com marcada degeneração. Em lesões mais avançadas
existiam erosões cobertas por crostas, com edema perivascular e infiltração de neutrófilos e
células mononucleares na derme subjacente. Foram observadas lesões similares na mucosa
oral e lingual, ocasionalmente preenchidas por fluido eosinofílico. Áreas de perda total do
epitélio oral e lingual eram observadas, formando extensas úlceras infiltradas por neutrófilos e
exibindo necrose e hemorragia.
Para exame ultraestrutural, pequenos fragmentos de pele foram fixados em
glutaraldeído a 2% (tampão cacodilato de sódio-0.1 M/pH 7.4). Os blocos foram pós-fixados
em solução de tetróxido de ósmio a 1% (tampão cacodilato de sódio-0.166 M/pH 7.4) e
embebidos em resina.a Cortes de 1µm corados com azul de metileno foram usados para
avaliar as alterações histológicas. Em seguida foram selecionadas as áreas para exame
ultraestrutural (Fig. 3, inset). Cortes de 70-80nm das áreas selecionadas, foram contrastados
com acetato de uranila e soluções de citrato de chumbo e examinados com um microscópio
eletrônico.b Amostras da pele de um bezerro da mesma idade foram coletadas e processadas
para servir como controle. Ultraestruturalmente, as camadas de células basais estavam
destacadas da derme ao nível da lâmina lúcida (Fig. 3). A lâmina densa ficou unida às papilas
dérmicas (Fig. 4). Os hemidesmossomos eram pequenos e sem demarcação clara, quando
comparados com o animal controle.
Os sinais clínicos e a patologia deste caso são característicos da EB em animais e
humanos.3,4,8 Os achados ultraestruturais mostraram que a separação ocorreu ao nível da
lâmina lúcida na zona da membrana basal epidérmica, consistentes com o diagnóstico de EBJ.
Ultraestruturalmente, a membrana basal epidérmica é dividida em três áreas: os
hemidesmossomos, a lâmina lúcida e a lâmina densa (Fig. 5). Os hemidesmossomos são
compostos por uma placa interna e uma placa externa. A placa interna é composta pelas
proteínas hemidesmossomais citoplasmáticas HD1/plectin e BP230. A placa externa contém
58
as proteínas α6β4 integrina e BP180. A lâmina lúcida é formada pela membrana plasmática,
pela placa densa subdesmossomal e pelos filamentos de ancoragem. A lâmina densa é
composta pelo colágeno tipo IV e pelas fibrilas de ancoragem (colágeno tipo VII). Os
filamentos de ancoragem são formados pelas proteínas BP180 e laminina 5, que conectam os
hemidesmossos ao colágeno tipo VII das fibrilas de ancoragem (Fig. 5).3,8 Nesse caso, os
dados da microscopia eletrônica indicam anormalidades no complexo hemidesmossomos-
filamentos de ancoragem, levando a separação na lâmina lúcida. Em humanos, a EBJ é a mais
geneticamente heterogênea das epidermólises, causada por seis diferentes genes recessivos
que codificam as proteínas laminina 5 (subunidades α3, β3 e γ2) e BP180. A falta de
expressão desses genes conduz a seis subtipos de EBJ, porém a variante mais letal e mais
frequente é a EBJ Herlitz (EBJH).8
Figura 1. A) Bezerro afetado com epidermólise bolhosa juncional.
São observadas grandes áreas de erosões e crostas na pele,
especialmente nas áreas de atrito e nos membros. Note a
exungulação de todos os cascos. B) Membro torácico mostrando
desprendimento da pele e exungulação dos cascos. C) Mucosa do
palato e da bochecha com desprendimento do epitélio.
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Figura 2. Pele. Bezerro. A epiderme está destacada da
derme, formando uma fenda subepidérmica (*). HE,
Barra 50µm.
Figura 3 Figura 4
Figura 3. Micrografia eletrônica de transmissão. Pele. Bezerro. Junção dermo-epidérmica. É
observada a separação (*) ao nível da lâmina lúcida. Células basais (BC). Derme (D). Barra, 5 µm.
Inset: Secção semifina mostrando o local da separação, observada na microscopia eletrônica
(retângulo). Note a formação da vesícula (estrela). Barra, 50 µm.
Figura 4. Micrografia eletrônica de transmissão. Pele. Bezerro. Junção dermo-epidérmica, com a
derme separada das células basais: A lâmina densa (setas) está unida à papila dérmica (PD). Note as
fibras de colágeno com 20 nm (CF) dentro da derme edematosa. A vesícula também é observada
(estrela). Barra, 1 µm.
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Figura 5. Representação esquemática da ultraestrutura da zona da membrana basal
epidérmica.
A epidermólise bolhosa juncional foi diagnosticada em equinos de diferentes raças.5,6,9
Em dois estudos em potros, o diagnóstico de EBJH foi baseado em achados clínicos,
histológicos, ultraestruturais e moleculares. Em ambos os estudos foi identificada uma
mutação no gene LAMC2 que causou a falha na expressão da laminina 5 (subunidade γ2).6,9
A distribuição das lesões em neonatos humanos e nos potros com EBJH, bem como as
alterações ultraestruturais, apresenta o mesmo padrão do bezerro deste trabalho, sugerindo
que a separação entre epiderme e derme ocorreu devido a falha na expressão da laminina 5.
Os relatos anteriores de bovinos com EB foram descritos apenas com base em achados
clínicos e histopatológicos.1,2,10 Em 2009, foram diagnosticados, no Reino Unido, oito casos
de bezerros com EBS, através de exame ultraestrutural.4 Um caso de EBJ em um bezerro da
raça Chalorais foi registrado na França. O diagnóstico foi baseado em exame histopatológico
e imunomapeamento de secções de pele congelada, usando anticorpos para os principais
componentes da membrana basal cutânea de humanos, que revelou a clivagem na lâmina
lúcida; não foi realizado exame ultraestrutural (Guaguere E, Berg K, Degorce-Rubiales, et al.:
2004, Junctional epidermolysis bullosa in a Charolais calf with deficient expression of
integrin α6β4. Vet Dermatol 15 (Suppl. 1):28. Abstract). Mais estudos são necessários para
investigar os possíveis modos de herança e a caracterização molecular da EBJ.
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Produtos e fabricantes
a. EMBED 812, Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA.
b. JEOL 1200EX II, JEOL Ltd., Tokyo, Japão.
Declaração de interesses conflitantes
O(s) autor(es) declarou(ram) não ter potenciais conflitos de interesse em
relação a pesquisa, a autoria, e/ou publicação deste artigo.
Financiamento
O(s) autor(es) não recebeu(ram) nenhum financiamento para a pesquisa,
autoria, e/ou publicação deste artigo.
Referências
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in English.
63
CONCLUSÕES
As doenças mecanobolhosas hereditárias com separação suprabasilar (ex.: dermatose
acantolítica mecanobolhosa suprabasilar hereditária em búfalos e acantólise familiar em
bovinos), podem ser classificadas como EB do tipo simples, com base na atual classificação
das epidermólises.
A intensidade das lesões de pele está diretamente associada ao modo de vida de cada
espécie. Os animais de produção sofrem mais do que os cães e gatos, por causa do manejo
mais intenso e da necessidade de se deslocar para se alimentarem.
As lesões orais em herbívoros são mais extensas do que em outras espécies por causa
do alimento fibroso. Os ruminantes podem ser mais afetados por lesões orais porque passam
mais tempo mastigando do que os monogástricos.
O gene mutante, causador da EB distrófica nos caprinos estudados é transmitido por
mecanismo autossômico recessivo.
A cura espontânea das lesões, com formação de cicatrizes atróficas, é uma
característica da EB distrófica. Nos caprinos, a cicatrização causou a deformidades nos cascos
e a destruição de algumas estruturas anatômicas da mucosa oral, especialmente as papilas
linguais e bucais.
A ausência das fibrilas de ancoragem no teto da bolha, o pequeno número e a
aparência rudimentar na pele sem sinal clínico, sugerem que a doença nos caprinos é
morfologicamente similar a EB distrófica recessiva, generalizada e severa, observada em
humanos. Nenhum tipo de EB foi previamente descrito em caprinos.
Os aspectos clínicos, patológicos e ultraestruturais do bezerro são característicos da
epidermólise bolhosa juncional do tipo Herlitz. Igual ao observado em humanos, a EB
juncional, especialmente o subtipo Herlitz, é também a mais grave em animais.
Os hemidesmossomos pequenos e sem demarcação clara, observados no exame
ultraestrutural do bezerro, são fortes indícios de que a separação entre epiderme e derme
ocorreu devido a falha na expressão do gene da proteína laminina 5.
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ANEXOS