cecilia helena vieira franco de godoy carvalhaes · médico assistente do laboratório de...

CECILIA HELENA VIEIRA FRANCO DE GODOY CARVALHAES

Padronização e Aplicação da Espectrometria de Massa por Ionização e Dessorção a Laser -

Assistida por Matriz na Detecção de Carbapenemases em Bactérias Gram-negativas

Tese apresentada à Universidade Federal de São

Paulo - Escola Paulista de Medicina para obtenção do

título de Doutor em Infectologia.

São Paulo

2014

ii




Tese apresentada à Universidade Federal de São

Paulo - Escola Paulista de Medicina para obtenção do

título de Doutor em Infectologia.

Orientadora: Profa. Dra. Ana Cristina Gales

Coorientador: Dr. Rodrigo Cayô da Silva

Este trabalho foi realizado com auxílio financeiro

fornecido pela Coordenação de Aperfeiçoamento

de Pessoal de Nível Superior (CAPES).

São Paulo

2014

iii

CARVALHAES, Cecilia Helena Vieira Franco de Godoy

Padronização e Aplicação da Espectrometria de Massa por Ionização e Dessorção a Laser - Assistida por Matriz na Detecção de Carbapenemases em Bactérias Gram-negativas. Cecilia Helena Vieira Franco de Godoy Carvalhaes - São Paulo, 2014.

xxiii, 179.

Tese (Doutorado) - Universidade Federal de São Paulo. Escola Paulista de Medicina. Programa de Pós-graduação em Infectologia.

Título em inglês: Standardization and application of matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry for carbapenemase detection in Gram-negative rods.

1. Pseudomonas spp., 2. Acinetobacter spp., 3. Enterobactérias, 4. Klebsiella pneumoniae; 5. β-lactamase; 6. OXA-carbapenemase; 7. KPC; 8. Infecção de corrente sanguínea; 9. Metalo-β-lactamase; 10. MALDI-TOF MS; 11. Hemocultura;

12. Espectrometria de massa; 13. Resistência bacteriana.

iv

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO

ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA

DISCIPLINA DE INFECTOLOGIA

Chefe do Departamento:

Profa. Dra. Maria Tereza Zanella

Coordenador do curso de Pós-graduação:

Prof. Dr. Ricardo Sobhie Diaz

Chefe da Disciplina de Infectologia:

Prof. Dr. Celso Franciso Hernandes Granato

São Paulo

2014

v




BANCA EXAMINADORA: Presidente: Profa. Dra. Ana Cristina Gales Professora Adjunta e Diretora do Laboratório ALERTA da Disciplina de Infectologia do Departamento de Medicina da Universidade Federal de São Paulo - UNIFESP. Titulares: Prof. Dr. Luis Martinez-Martinez Professor Titular do Departamento de Biología Molecular da Facultad de Medicina da Universidad de Cantabria - UNICAN e Chefe do Servicio de Microbiología do Hospital Universitario Marqués de Valdecilla - IDIVAL, Santander, Espanha. Prof. Dr. Cledir Rodrigues Santos Gerente da Qualidade da Micoteca da Universidade do Minho, Braga, Portugal e Professor Visitante Internacional no Departamento de Biologia da Universidade Federal de Lavras, Minas Gerais. Prof. Dr. Adagmar Andriolo Professor Associado e Livre Docente da Disciplina de Patologia Clínica do Departamento de Medicina da Universidade Federal de São Paulo - UNIFESP. Prof. Dr. Luis Fernando Aranha Camargo Chefe do Grupo de Infecção em Transplantes da Universidade Federal de São Paulo - UNIFESP. Suplentes: Profa. Dra. Marinês Dalla Valle Martino Professora Adjunta da Disciplina de Microbiologia do Departamento de Ciências Patológicas da Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo e Médica-coordenadora do Setor de Microbiologia do Laboratório Clínico da Sociedade Beneficente Israelita Brasileira Hospital Albert Einstein (SBIBHAE). Prof. Dr. João Nóbrega de Almeida Júnior Médico Assistente do Laboratório de Microbiologia da Divisão de Laboratório Central, Hospital das Clínicas - HC, Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo - USP.

vi

“O começo de todas as ciências é o espanto de as coisas serem o que são”

Aristóteles

vii

Dedico este trabalho ao meu pai, Prof. Dr. Cid Vieira Franco de Godoy, a quem eu tenho muito

orgulho de chamar de PAI.

viii

Agradeço à DEUS, pela Sua INTERCEDÊNCIA na minha vida, pela Sua SABEDORIA acima de

todas as coisas, e por permitir a CONFLUÊNCIA de fatores que me levaram a concretizar esta

jornada.

ix

Agradeço ao meu pai, Prof. Dr. Cid Vieira Franco de Godoy, mas para mim, MEU PAI, que

com muito amor e dedicação me ensinou o valor do ESFORÇO e da DEDICAÇÃO, e que devo

sempre ter mérito e perseverança para alcançar os meus objetivos. Pai, você me proporcionou

todos os instrumentos para que eu trilhasse meu caminho. OBRIGADA MEU PAI.

Agradeço à minha amada mãe, Maria Carmen, não há palavras no mundo que possam

expressar meu reconhecimento e retribuir seu AMOR, DEDICAÇÃO e CARINHO, sempre tão

presentes em minha vida. Mãe, você é o meu alicerce. Obrigada por procurar fazer de mim uma

pessoa melhor, por ser o exemplo do AMOR INCONDICIONAL, por me ensinar a FÉ e a buscar

minha FORÇA INTERIOR.

x

Agradeço ao meu amado marido, Marcelo, meu companheiro de uma longa jornada, pela

paciência, pela compreensão nos momentos em que estive ausente, pelos conselhos, pela

segurança na tomada de decisões. Agradeço a construção e dedicação à nossa MARAVILHOSA

FAMÍLIA e por permitir que eu buscasse meu SONHO e a minha REALIZAÇÃO.

Agradeço aos meus amados filhos, Alessandra e Lucas, que me ensinaram que a VIDA é um

milagre de DEUS e que o AMOR pode ser maior do que eu poderia imaginar. Obrigada pela

ALEGRIA que vocês me trazem, e por me fazerem entender o PROPÓSITO da VIDA.

xi

Agradeço às minhas irmãs, Cris, Carola e Silvinha, minhas amadas companheiras de vida,

cada uma um exemplo incrível de dedicação, perseverança, esforço e força. Obrigada, pelo

amor e carinho a mim dedicados, por estarem do meu lado em TODOS os momentos da minha

vida e me levantarem quando mais precisei. Somos uma IRMANDADE com toda força, amor e

união que a palavra remete. Amo vocês.

xii

AGRADECIMENTOS

À minha orientadora e amiga, Profa. Dra. Ana Cristina Gales, por quem tenho imenso

RESPEITO e ADMIRAÇÃO. Sinto-me imensamente privilegiada não apenas pelos inúmeros

conhecimentos transmitidos e grande dedicação à minha formação, mas também pela sua

essência, pela busca no aprimoramento do SER HUMANO, mente e espírito, por compartilhar

experiências de VIDA e por me dedicar seu escasso tempo com muito carinho. Tenho

ORGULHO de ser sua aluna e, muito mais, de ser sua AMIGA. OBRIGADA, Ana.

Ao meu grande AMIGO, Rodrigo Cayô, a quem eu muito ADMIRO pela DEVOÇÃO ao trabalho,

pelo ESFORÇO e MÉRITO por tudo que faz e, principalmente, o que o destaca, pela sua

capacidade de se DOAR aos outros. Eu agradeço pelos inúmeros momentos que passamos

juntos, pelo conhecimento compartilhado, pelos conselhos, pelo altruísmo e dedicação para

comigo. Agradeço do fundo do meu coração. OBRIGADA, meu AMIGO.

À UNIFESP, a minha amada ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA, que ainda jovem me acolheu,

onde apreendi e trilhei meu caminho profissional com muito orgulho. Onde agora posso retribuir

o muito que me foi ensinado.

Ao Prof. Dr. Adagmar Andriolo, por me acolher na Patologia Clínica, e compartilhar seus

conhecimentos. Agradeço pela sua dedicação e perseverança em tornar nossa especialidade

reconhecida e forte.

À Dra. Antonia Maria de Oliveira Machado, por me ensinar MICROBIOLOGIA, por me auxiliar

na busca pelo mestrado e doutorado, pelos inúmeros conselhos pessoais e profissionais, e,

principalmente, pelo sempre presente suporte profissional. OBRIGADA pelo INCENTIVO e

ORIENTAÇÃO.

À minha querida AMIGA, Eliete Frigatto, que me passou mais do que seus conhecimentos e

imensa experiência, mas também sua paixão pela nossa MICROBIOLOGIA. Uma grande amiga,

um exemplo de dedicação e altruísmo, de respeito e responsabilidade, de comprometimento e

educação. Sinto-me honrada de tê-la ao meu lado, no trabalho, mas, principalmente, na vida.

xiii

À Equipe de Microbiologia do Laboratório Central, por me acolher ainda na resisdência

médica, por compartilhar seus conhecimentos, por dividir momentos de alegria e de tristeza, por

sofrer com a falta e alegrar-se com as nossas conquistas e, principalmente, por tornarem-se a

MINHA EQUIPE, da qual eu tenho muito orgulho de estar a frente.

A todos os Médicos e Colaboradores do Laboratório Central e Disciplina de Patologia

Clínica/Medicina Laboratorial pelo apoio e incentivo, pela alegria do convívio diário.

Ao Prof. Dr. Luis Fernando Aranha Camargo, por me receber no seu competente e dedicado

grupo de Infecção em Transplante, onde tive oportunidade de adicionar à minha formação seus

preciosos conhecimentos de Infectologia, e compartilhar com profissionais de excelência, como

Dr. Alexandre Marra, Dr. Moacyr Silva Jr., Dr. Fernando Gatti Menezes e Dr. Marcelo

Mostardeiro. Obrigada a todos pela amizade, companheirismo e conhecimentos

compartilhados.

Ao Prof. Dr. Antonio Carlos Campos Pignatari, pelo exemplo do que significa a profissão de

Médico, pela dedicação aos pacientes acima de tudo, pelos ensinamentos e conselhos

fornecidos, pela experiência de vida compartilhada, por me ensinar a ser flexível e me mostrar

caminhos não antes percebidos. OBRIGADA Professor pela sua SABEDORIA.

Aos pós-graduandos do Laboratório ALERTA, Adriana Nicoletti, Adriana Pereira, Ana

Carolina Ramos, Ana Paula Streling, Anderson Santos, Bruna Nonato, Danilo Xavier,

Dandara Corsi, Eloiza Campana, Eliete Frigatto, Fernanda Petrolini, Fernanda Rodrigues,

Graziela Braun, Jéssica Werneck, Jhonatha Moura, Juliana Provasi, Lorena Fehlberg,

Lucas Andrade, Lygia Schandert, Marina Visconde, Paula Peraro, Rafael Affini, Renata

Picão, Rodrigo Cayô e Talita Barone, que me ensinaram a MICROBIOLOGIA de ponta, mas

também o respeito, a amizade e a dedicação entre companheiros de trabalho. Agradeço a todos

aqueles que hoje estão no laboratório e também àqueles que por lá passaram e plantaram suas

sementes, àqueles que participaram ativamente dos meus trabalhos e dos quais são coautores,

que me auxiliaram quando eu tinha minhas obrigações maternas e que cresceram junto comigo.

Agradeço às minhas coorientandas, Ana Carolina, Bruna e Eliete, que me proporcionaram um

amadurecimento profissional. Agradeço especialmente, as minhas amigas Raquel Girardello,

Ana Carolina Ramos e Ana Paula Streling.

xiv

Aos pós-graduandos do Laboratório Especial de Microbiologia Clínica (LEMC) pelos

ensinamentos e experiências compartilhadas. Agradeço em especial ao Dr. André Doi e à

Rosana Capecce.

Ao Prof. Dr. Luis Martínez-Martínez, por me receber em um curto estágio em seu Serviço de

Microbiologia, em Santander, Espanha. Agradeço pela oportunidade de conhecer e a almeijar

um serviço de excelência, pelos seus inúmeros conhecimentos compartilhados, pela dedicação e

conselhos em nossos projetos. Agradeço imensamente por me dar a honra de ser membro de

minha banca de doutorado.

À Equipe do Servicio de Microbiología do Hospital Universitário Marqués de Valdecilla,

Santander, Espanha, por me acolher e compartilhar seus conhecimentos, especialmente, Bélem

Ruiz del Castillo, Elena Román Paucar, Alain Ocampo Sosa e Dr. Jorge Calvo Montes.

À querida amiga María Pilar Garcillán Barcia, que acolheu a mim e a minha família em sua

casa, pelo carinho, alegria e dedicação. MUITO OBRIGADA.

Ao Departamento de Biofísica da UNIFESP, ao Prof. Dr. Luiz Juliano Neto e Profa. Dra.

Maria Juliano, pela colaboração e apoio aos nossos estudos. À toda equipe, especialmente, à

Débora e Lilian, pelos auxílios e dedicação a mim dispensados.

Ao amigo Diego Magno Assis, por acreditar e se dedicar ao nosso projeto, pelos

conhecimentos e grandes momentos de alegria compartilhados quando no sucesso do projeto.

Muito OBRIGADA, sem você este trabalho não teria se concretizado.

Ao Prof. Dr. Alberto Duarte, pelo apoio e incentivo para conclusão deste trabalho. Tenho uma

grande ADMIRAÇÃO pelo seu exemplo de que a ciência PODE e DEVE estar acima de outros

interesses.

Aos meus colegas e amigos do HCor, pela compreensão, apoio e estímulo para a conclusão

deste trabalho. Agradeço especialmente ao Dr. André Doi, Dr. Nilo Duarte, Dra. Carina

Ceneviva, Dr. Luis Gustavo, Dra. Maria Rita Elmor de Araújo, Dra. Lucilene Rodrigues e Dra.

Annelise Lopes. Agradeço também ao carinho e atenção dispensados a mim pela equipe da

secretaria e demais colaboradores, especialmente, Nata e Daniel.

xv

À minha sogra, Maria Alice, pela sua IMENSA dedicação à minha família, por me auxiliar e me

dar o suporte para que eu pudesse me ausentar muitas vezes do meu lar. OBRIGADA por estar

sempre presente, pelo seu APOIO, COMPREENSÃO, CARINHO e DEVOÇÃO.

Ao meu querido sogro, Luís Fernando, a quem eu tenho enorme apreço, AGRADEÇO o AMOR

que tem por mim e pelos meus filhos, AGRADEÇO à DEUS por permitir compartilhar destes

momentos preciosos ao seu lado, e PEÇO com muito carinho que cuide de sua sáude, para que

desfrutemos de muitos outros.

À Amara Maria Felix, que com simplicidade, muita dedicação, paciência e AMOR cuida dos

meus filhos como se fossem seus, me garantindo a segurança e confiança para exercer meu

trabalho profissional. O meu profundo AGRADECIMENTO.

O meu muito obrigado aos pacientes, que proporcionaram a execução deste trabalho, muitos

dos quais já evoluiram para outra dimensão em decorrência destas infecções. Que o fruto deste

trabalho posse reverter em benefício a muitos outros pacientes que virão.

Às bactérias, a quem tenho apreço e respeito, pois apesar de suas minúsculas dimensões,

habitam a Terra há milhares de anos antes que nós e provavelmente a habitarão por milhares de

anos a mais. Temos ainda muito que apreender com vocês.

xvi

SUMÁRIO

ÍNDICE DE ABREVIATURAS E SIGLAS ................................................................................. XVIII

ÍNDICE DE TABELAS ................................................................................................................. XX

ÍNDICE DE FIGURAS ................................................................................................................ XXI

1. INTRODUÇÃO ........................................................................................................................... 1

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA....................................................................................................... 6

2.1. A Espectrometria de Massa Aplicada à Microbiologia Clínica ............................................ 7

2.1.1. O Princípio da Técnica de MALDI-TOF MS................................................................. 9

2.1.2. A Espectrometria de Massa na Identificação de Micro-organismos .......................... 11

2.1.2.1. Identificação de Bactérias Aeróbicas....................................................................13

2.1.2.2. Identificação de Bactérias Anaeróbicas................................................................15

2.1.2.3. Identificação de Micobactérias..............................................................................15

2.1.2.4. Identificação de Fungos........................................................................................16

2.1.2.5. Identificação de Micro-organismos Diretamente de Frascos de Hemocultura......18

2.1.3. A Espectrometria de Massa na Tipagem de Micro-organimos .................................. 24

2.1.4. A Espectrometria de Massa na Resistência aos Antimicrobianos ............................. 25

2.2. Epidemiologia das Bactérias Gram-negativas no Ambiente Hospitalar ............................ 27

2.2.1. Resistência aos Antimicrobianos β-lactâmicos em Bactérias Gram-negativas ......... 31

2.3. Mecanismos Envolvidos na Resistência aos Carbapenens .............................................. 34

2.3.1. Cefalosporinases e ESβL Associadas à Impermeabilidade de Membrana ............... 35

2.3.2. Produção de β-lactamases: Carbapenemases.......................................................... 45

2.3.3.1. Carbepenemases de Classe A..............................................................................49

2.3.3.2. Carbapenemases de Classe B..............................................................................52

2.3.3.3. Carbapenemases de Classe D..............................................................................54

2.4. Impacto Clínico da Resistência aos Carbapenens ........................................................... 56

2.5. Metodologias Aplicadas à Detecção de Carbapenemases ............................................... 60

2.5.1. Teste de Sensibilidade aos Antimicrobianos ............................................................. 61

2.5.2. Teste de Hodge Modificado ...................................................................................... 64

2.5.3. Teste com Inibidores de Carbanemases ................................................................... 65

2.5.4. Testes Genotípicos ................................................................................................... 67

2.5.5. Testes Baseados na Detecção da Atividade Enzimática .......................................... 69

2.5.5.1. Testes Colorimétricos (Carba NP, CarbAcineto NP e Blue Carba)......................69

xvii

2.5.5.2. Espectrofotometria................................................................................................71

2.5.5.3. Espectrometria de Massa - MALDI-TOF MS........................................................71

3. OBJETIVOS ............................................................................................................................. 75

4. ARTIGOS CIENTÍFICOS ......................................................................................................... 77

4.1. Artigo Científico 1: Detection of SPM-1-Producing Pseudomonas aeruginosa and Class D

β-Lactamase-Producing Acinetobacter baumannii Isolates by Use of Liquid Chromatography-

Mass Spectrometry and Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass

Spectrometry………………………………………………………………………………..………....79

4.2. Artigo Científico 2: Detection of carbapenemase activity directly from blood culture vials

using MALDI-TOF MS: a quick answer for the right decision……………….……………………92

4.3. Artigo Científico 3: Detection of carbapenemase activity using VITEK® MS: Interplay of

carbapenemase type and period of incubation……………………………………………..……108

5. DISCUSSÃO .......................................................................................................................... 118

6. CONCLUSÕES ...................................................................................................................... 138

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ....................................................................................... 140

8. ANEXOS ................................................................................................................................ 165

8.1. Anexo 1: Cloverleaf test (modified Hodge test) for detecting carbapenemase production in

Klebsiella pneumoniae: be aware of false positive results………………………..………….…167

8.2. Anexo 2: Tabela 8 - Estudos da literatura que avaliaram a detecção de carbapenemases

pela ténica de MALDI-TOF MS...............................................................................................178

xviii

ÍNDICE DE ABREVIATURAS E SIGLAS

ANVISA - Agência Nacional de Vigilância Sanitária

APACHE - Acute Physiology and Chronic Health Evaluation

APBA - Ácido Aminofenil Borônico

BRCAST - Comitê Brasileiro de Teste de Sensibilidade aos Antimicrobianos

CARB - White House National Strategy for Combating Antibiotic Resistant Bacteria

CDC - Centers for Disease Control and Prevention

CIM - Concentração Inibitória Mínima

CHDL - Carbapenem-Hydrolyzing Class D β-Lactamases

CLSI - Clinical Laboratory Standard Institute

DPA - Ácido Dipicolínico

EARS-Net - European Antimicrobial Resistance Surveillance Network

ECDC - European Centrer for Disease Prevention and Control

EDTA - Ethylenediamine Tetraacetic Acid

ESβL - Extended-Spectrum β-Lactamases

EUA - Estados Unidos da America

EUCAST - European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing

HCCA - Ácido α-Ciano-4-Hidroxicinâmico

ICSP - International Committee on Systematics of Prokaryotes

ICS - Infecção de Corrente Sanguínea

IRAs - Infecção Relacionada à Assistência à Saúde

IS - Insertion Sequence

KPC - Klebsiella pneumoniae carbapenemase

LPS - Lipopolissacarídeos

xix

MALDI-TOF MS - Matrix Assisted Laser Desorption Ionization - Time Of Flight - Mass

Spectrometry

MβL - Metalo-β-Lactamases

MDR - Multirresistentes

MHT - Modified Hodge Test

MRSA - S. aureus resistente à meticilina

MSSA - S. aureus sensível à meticilina

NCBI - National Center for Biotechnology Information

NHSN - National Healthcare Safety Network

OMS - Organização Mundial da Saúde

OMPs - Proteínas de membrana externa

PAV - Pneumonia associada à ventilação mecânica

PCA - Análise dos Componentes Principais

PCR - Polymerase Chain Reaction

SBI - Sociedade Brasileira de Infectologia

SBM - Sociedade Brasileira de Microbiologia

SBPC/ML - Sociedade Brasileira de Patologia Clínica / Medicina Laboratorial

SCIHs - Serviços de Controle de Infecção Hospitalar

SCoN - Staphylococcus coagulase negativa

STs - Sequences Types

TSB - Caldo tríptico de soja

UTIs - Unidades de Terapia Intensiva

VRE - Enterococcus spp. resistentes à vancomicina

WHO - World Health Organization

xx

ÍNDICE DE TABELAS

Tabela 1. Diferenças entre os principais artigos publicados que descreveram a identificação de

bactérias diretamente do frasco de hemocultura.................................................................................... 20

Tabela 2. Característica dos estudos de vigilância epidemiológica que incluem isolados bacterianos

brasileiros............................................................................................................................................... 30

Tabela 3. Classificação das β-lactamases adaptada de Bush & Jacoby (2010).................................... 42

Tabela 4. Características das principais carbapenemases reportadas………...................................... 46

Tabela 5. Pontos de corte utilizados para triagem e para classificação da sensibiliade de

enterobactérias recomendados pelo EUCAST e CLSI...............................……………..….........…........ 63

Tabela 6. Characterization of the 73 clinical isolates and performance of carbapenemase detection

by different methodologies (Table 1 - Artigo Científico 1)………………................................................. 88

Tabela 7. Carbapenem susceptibility profile and time in days for detection of carbapenemase-

producing isolates by MALDI-TOF MS (Table 1 - Artigo Científico 2)………………............................... 107

Tabela 8. Interplay of carbapenemase type and period of incubation (IP) for detection of

carbapenemase activity by testing VITEK® MS (Table 1 - Artigo Científico 3)……................................ 114

Tabela 9. Estudos da literatura que avaliaram a detecção de carbapenemases pela ténica de

MALDI-TOF MS.................................................................................………………............................... 178

xxi

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1. Espectômetro de massa - MALDI-TOF MS............................................................................ 10

Figura 2. Espectro de massa gerado pelo MALDI-TOF MS para diferentes espécies

bacterianas............................................................................................................................................. 14

Figura 3. Fluxograma do uso da técnica de MALDI-TOF MS na identificação de micro-organismos

no laboratório de microbiologia clínica................................................................................................... 23

Figura 4. (A) The hydrolysis of ETP mediated by β-lactamases occurring in two steps. (B) Analysis

of ETP degradation by MALDI-TOF MS (Figure 1 - Artigo Científico 1)................................................ 90

Figura 5. Analysis of ETP degradation by MALDI-TOF MS from carbapenemase-producing isolate

and non-carbapenemase-producing isolate (Figure 1 - Artigo Científico 2)..…………….……….......... 106

Figura 6. Interplay of carbapenemase type and period of incubation (IP) for detection of

carbapenemase activity by testing VITEK® MS (Figure 1 - Artigo Científico 3)...................................... 114

xxii

RESUMO

A presente tese de doutorado objetivou a padronização e a aplicação do MALDI-TOF MS na detecção de carbapenemases em bacilos Gram negativos. Inicialmente, realizamos a padronização de um ensaio para detecção da atividade de diferentes carbapenemases pela técnica de MALDI-TOF MS. Foram testados para esse estudo 73 isolados clínicos produtores e não produtores de carbapenemase. O método foi comparado à LC-MS, ao MHT e à espectrofotometria. O espectro de massa do ertapenem mostrou-se superior ao do imipenem e ao do meropenem. A atividade de carbapenemase das classes A e B foi rapidamente detectada pelo MALDI-TOF MS após 2 horas de incubação, enquanto uma extensão do período de incubação foi necessária para a detecção das enzimas da classe D em isolados de A. baumannii. Embora todos os resultados obtidos pelo MALDI-TOF MS tenham sido confirmados pela LC-MS e pela espectrofotometria, o MHT detectou 55%, 100% e 68% das enzimas de classes D, A e B testadas, respectivamente. No segundo estudo, padronizamos a técnica de MALDI-TOF MS na detecção de carbapenemase diretamente de 100 frascos de hemocultura. Adicionalmente, realizamos a rápida identificação dos micro-organismos causadores de infecção de corrente sanguínea diretamente da hemocultura. O ensaio de carbapenemase no MALDI-TOF MS identificou 21 (72,4%) dos 29 isolados produtores de carbapenemase, especialmente aqueles produtores de KPC-2 (100%) e SPM-1 (100%), após um período de 4 horas de incubação. Apesar da maioria dos isolados de A. baumannii produtores de OXA-23 não terem sido identificados no primeiro dia, todos foram identificados como produtores de carbapenemases quando testados diretamente da colônia bacteriana no dia seguinte. Após a padronização da técnica de MALDI-TOF MS na detecção de diferentes carbapenemases direto da colônia bacteriana e de hemoculturas, utilizando o equipamento da Bruker Daltonics, decidimos avaliar então o desempenho do VITEK MS. Nesse terceiro estudo, 79 isolados de bacilos Gram negativos produtores e não produtores de carbapenemases foram avaliados. Taxas progressivas de detecção dos isolados produtores de carbapenemase foram observadas de acordo com o período de incubação para todas as classes. A maioria dos isolados produtores de KPC e MβL foi detectada após 1 hora de incubação. Entretanto, um período de 4 horas de incubação foi necessário para excluir a atividade de carbapenemases entre amostras produtoras de carbapenemases fracas, como as CHDLs em isolados de A. baumannii. A técnica de MALDI-TOF MS mostrou-se ser uma excelente ferramenta para a detecção de diferentes carbapenemases. As principais vantagens encontradas são a rapidez e acurácia na detecção das diferentes classes moleculares de carbapenemases, além da simplicidade de execução tanto da colônia bacteriana quanto diretamente dos frascos de hemocultura.

xxiii

ABSTRACT

Initialy, we standardize a protocol for detecting carbapenemase activity from different carbapenemase-producing Gram-negative bacilli by MALDI-TOF M. A total of 73 carbapenemase- and non-carbapenemase-producing clinical isolates were studied. The method was compared to LC-MS, MHT and spectrophotometric assays. Ertapenem mass spectrum was easier to interpret than those of imipenem and meropenem. Class A and B carbapenemases were rapidly detected by MALDI-TOF MS in a 2-h assay. However, an extended incubation time was necessary for detection of class D carbapenemases in A. baumannii. Although, all MALDI-TOF MS results were confirmed by LC-MS and espectophotometric assay, MHT detected 55%, 100%, and 68% of classes D,A and B carbapenemases, respectively. In the second study, we standardized the MALDI-TOF MS assay for detecting carbapenemase activity directly from 100 positive blood culture vials. Additionally, we performed a rapid identification of microorganism causing bloodstream infections directly from blood cultures. The MALDI-TOF MS carbapenemase assay identified 21 of 29 (72.4%) of the carbapenemase-producing isolates directly from blood culture vials, especially those producing KPC-2 (100%) and SPM-1 (100%), after a 4 h incubation period. Although the majority of OXA-23-producing A. baumannii isolates were not identified on the first day, but all isolates were identified as carbapenemase producers directly from the bacterial colony on the next day. After the standardization of the MALDI-TOF MS carbapenemase protocol from both bacterial colony and directly from blood culture vials using the Bruker Daltonics’ equipment, we evaluated the performance of the VITEK MS by applying the same protocol. In the third study, a collection of 79 carbapenem-producing and 28 non-carbapenemase-producing Gram-negative clinical isolates were evaluated. Progressive detection rates of carbapenemase-producing isolates were observed according to the extension of incubation period for all classes. The majority of KPC and MβL-producing isolates were detected by testing 1-h incubation period. However, a 4-h incubation period was necessary to exclude carbapenemase activity in strains producing weak carbapenemases, like the CHDLs in A. baumannii isolates. In conclusion, the MALDI-TOF MS showed to be an excellent tool for identifying bacterial species and different types of carbapenemase. Its main advantages are its simplicity, accuracy and speed in detecting different carbapenemases from both bacterial colony and positive blood culture vials.

Introdução

1

1. INTRODUÇÃO

Introdução

2

As doenças infecciosas são uma das principais causas de mortalidade em todo o

mundo. Uma grande diversidade de micro-organismos, desde virais, bacterianos, parasitários e

fúngicos, são capazes de acometer indivíduos tanto no ambiente hospitalar quanto na

comunidade. Apesar da euforia proveniente do decréscimo das taxas de mortalidade

relacionadas às infecções bacterianas após a descoberta do primeiro antimicrobiano e da

imunização em larga escala, vivenciamos, atualmente, a angústia da escassez de agentes

eficazes contra uma progressiva gama de micro-organismos. Diversos fatores podem estar

relacionados a este fato. O uso indiscriminado de agentes antimicrobianos não apenas na prática

médica, mas igualmente na veterinária e, principalmente, na agricultura e na pecuária, seja,

talvez, um dos maiores responsáveis pela seleção natural e disseminação de bactérias

resistentes aos antimicrobianos (Cars et al., 2011).

A crescente observação da resistência aos antimicrobianos em isolados bacterianos é

um fato que tem recebido grande destaque não apenas na comunidade médica, mas também no

âmbito governamental, econômico e social. Em 2013, no Fórum Econômico Mundial de Davos a

resistência bacteriana foi descrita como um dos poblemas que pode por em risco a existëncia da

raca humana. Em abril de 2014, a Organização Mundial da Saúde (OMS) publicou um

documento que alerta sobre o risco da era pós-antibiótica, onde não haverá antimicrobianos

disponíveis para o tratamento de infecções causadas por bacterias mutirresistentes (WHO,

2014). Assim como, em 2013, o Center for Disease Control and Prevention (CDC) publicou um

documento classificando o risco das bactérias multirresistentes e alertando sobre as taxas de

mortalidade e dos custos relacionados às infecções causadas por bactérias multirresistentes.

Neste documento, é estimado que 23.000 mortes ocorram por ano nos Estados Unidos (EUA)

em consequência das infecções causadas por bactérias resistentes. Além disto, estas infecções

representam um custo adicional de $20 bilhões de dolares (CDC, 2013). Em ambas as

publicações, do CDC e da OMS, as bactérias Gram-negativas constituem ao menos metade dos

Introdução

3

agentes bacterianos citados como de urgente ou de grave ameaça à saúde pública. Destes,

ambos os documentos citam enterobactérias, como Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae,

Salmonella não-typhi e Shigella spp., resistentes aos carbapenens, cefalosporinas de amplo

espectro e/ou fluoroquinolonas como uma grave ameaça. O CDC ainda inclui neste grupo os

isolados de Acinetobacter baumannii e Pseudomonas aeruginosa multirresistentes (MDR).

O custo adicional relacionado às infecções causadas por bactérias multirresistentes ao

sistema de saúde está relacionado à necessidade da prescrição de antimicrobianos, que podem

ser mais tóxicos, menos efetivos e/ou mais onerosos. Além disso, mesmo quando há alternativa

terapêutica, a mortalidade de pacientes acometidos por infecções causadas por micro-

organismos resistentes a múltiplas classes de antimicrobianos é mais elevada, e aqueles

pacientes que sobrevivem experienciam maior tempo de internação, recuperação prolongada e

maior morbidade.

Diversas são as estratégias consideradas fundamentais para conter a resistência

antimicrobiana. Dentre elas podemos citar, nos âmbitos sócio-econômico e veterinário, a

proteção aos suprimentos alimentícios, o uso criterioso de antimicrobianos no agronegócio, na

pecuária e na prática veterinária e, no âmbito da medicina, tanto o uso racional de

antimicrobianos como o controle da disseminação pessoa-a-pessoa através da detecção, do

tratamento e da prevenção. O entendimento da dimensão da resistência antimicrobiana em

bactérias Gram-negativas no âmbito hospitalar, assim como dos mecanismos envolvidos na sua

disseminação, constitue o ponto de partida para estabelecer as estratégias de detecção, terapia

adequada e controle, sobre as quais versa este estudo.

Desde a descoberta do primeiro agente antimicrobiano da classe, os β-lactâmicos são a

terapia de escolha para diversas infecções devido às suas propriedades favoráveis como amplo

espectro de atividade, boa penetração tecidual e baixa toxicidade. As infecções graves causadas

por bactérias Gram-negativas eram frequentemente tratadas com cefalosporinas de amplo

Introdução

4

espectro, até o surgimento e disseminação de isolados produtores de β-lactamases de espectro

extendido, quando o uso de carbapenens aumentou significativamente. Consequentemente, o

surgimento e disseminação de carbapenemases nestes agentes restringiu o uso desta classe de

antimicrobianos na prática clínica.

Atualmente, devido ao constante aumento da resistência aos antimicrobianos em

isolados clínicos de P. aeruginosa, A. baumannii e enterobactérias em todo o mundo, estamos

ingressando a era pós-antibiótica, onde a falta de opções terapêuticas disponíveis para estes

patógenos tem limitado o tratamento das infecções causadas por bactérias MDR (Peleg &

Hooper, 2010). Sabe-se, ainda, que a resistência aos antimicrobianos e a terapia inadequada

são fatores associados à mortalidade em pacientes com infecção graves por estes patógenos

(Falagas et al., 2008). Nos casos de infecções graves, como a infecção de corrente sanguínea

(ICS), somente com o conhecimento do micro-organismo causador e do seu perfil de

sensibilidade aos antimicrobianos, será possível a introdução precoce da terapia antimicrobiana

adequada, que representa a base para o sucesso clínico do tratamento destas infecções.

A produção de carbapenemases em bactérias Gram-negativas é o principal mecanismo

associado à resistência aos carbapenens. Porém, a diversidade de enzimas, assim como as

diferentes características cinéticas e distribuição geográfica heterogênea dificultam sua

detecção. Dessa forma, considerando que: (I) as bactérias Gram-negativas vêm aumentando

sua participação nas infecções nosocomiais, especialmente espécies de enterobactérias, P.

aeruginosa e Acinetobacter spp.; (II) as taxas de resistência aos antimicrobianos entre estes

isolados tem aumentado progressivamente. Apesar de múltiplos mecanismos de resistência

possam estar presentes, a produção de β-lactamases é o principal mecanismo de resistência ao

principal grupo de antimicrobianos utilizados para o tratamento de infecções graves causadas

por estes agentes; (III) os carbapenens são os compostos mais potentes deste grupo e a

produção de carbapenemases pelas espécies de bactérias Gram-negativas acima descritas

Introdução

5

inviabiliza a utilização destes compostos como opção terapêutica em monoterapia; (IV) a

frequente localização em elementos genéticos móveis dos genes que codificam as

carbapenemases facilitam a disseminação destes fatores de resistência entre diferentes

espécies bacterianas; (V) os testes disponíveis até o momento para a detecção de

carbapenemases tem importantes limitações: (i) falta de rapidez para liberação dos resultados

dificultando a administração da terapia antimicrobiana adequada e instituição de medidas de

prevenção e controle de disseminação no ambiente hospitalar, (ii) flexibilidade para detecção de

todas as inúmeras enzimas deste grupo, (iii) acurácia na detecção dos tipos e variantes de

carbapenemases, (iv) baixo custo, para que possa ser realizados em diversos cenários

econômicos, e (v) simplicidade de execução.

A espectrometria de massa consiste em uma nova ferramenta para detecção da

atividade hidrolítica de carbapenemases através da vizualização da modificação da molécula do

antimicrobiano. Dessa forma, optamos, inicialmente, pela padronização da detecção de

carbapenemases pela espectrometria de massa (MS) utilizando a técnica de dessorção e

ionização a laser assistida por matriz em um tempo de vôo (MALDI-TOF) a partir da colônia

bacteriana, para, em seguida, prosseguir com a detecção diretamente de frascos de

hemocultura.

Revisão Bibliográfica

6

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA


7

2.1. A Espectrometria de Massa Aplicada à Microbiologia Clínica

A espectrometria de massa está revolucionando a microbiologia ao redor do mundo. A

identificação de micro-organismos que antes demoravam dias agora é realizada em minutos por

um sistema automatizado e de simples utilizacao. Historicamente, a utilização da espectrometria

de massa na microbiologia ganhou seu espaço quando a identificação de bactérias foi proposta

nos anos 70, por Anhalt e Fenselau (1975). Estes autores demonstraram que espécies

bacterianas poderiam ser discriminadas pela obtenção de espectros de massas após o

aquecimento das mesmas (Anhalt & Fenselaul, 1975). Entretanto, somente com a descoberta de

uma matriz capaz de ionizar macromoléculas de forma a não fragmentá-las através da absorção

eficiente da energia do laser, pelo engenheiro japonês Kioshi Tanaka, é que esta tecnologia

pôde ser aplicada para a identificação de micro-organismos (Tanaka et al., 1988). Este trabalho

rendeu-lhe, em 2002, o Prêmio Nobel de Química. Na mesma época, Karas e Hillenkamp (1988),

reportaram a dessorção e ionização suave (ou seja, sem fragmentação das proteínas) utilizando

um composto orgânico como matriz, denominando-a de MALDI - dessorção e ionização à laser

assistida por matriz (Karas & Hillenkamp, 1988).

Mesmo após este avanço, os primeiros experimentos para a identificação de bactérias

usando a técnica de MALDI-TOF MS iniciaram-se na década de 90. Alguns pesquisadores

apresentaram o método inicialmente utilizando a correlação de cada ion gerado com uma

proteina e esta com o organismo fonte, através de um banco de dados de proteínas disponível

na internet (Krishnamurthy & Ross, 1996; Demirev et al., 1999). O método, apesar de promissor,

necessitava de aperfeiçoamentos relacionados ao preparo da matriz, da reprodutibilidade dos

espectros de massas, da presença de contaminantes, e principalmente, da acurácia, robustez e

agilidade no banco de dados. Dessa forma, muitos anos se passaram antes que a tecnologia

pudesse ser disponibilizada, mesmo que somente na pesquisa em laboratórios de microbiologia.

Vários anos foram dedicados à implementação de um banco de dados robusto, acurado que


8

permitisse a agilidade da análise realizada pelo MALDI-TOF MS. Pesquisadores de diversas

instituições participaram do desafio de criar e comparar os perfis de massas dos micro-

organismos com bancos de dados contendo os espectros de referência através da criação de

diversos algoritmos (Fenselau & Demirev, 2001; Keys et al., 2004).

A aprovação nos órgãos regulamentadores e a comercialização do MALDI-TOF MS para

os laboratórios de microbiologia clínica ocorreu apenas recentemente. A lista de micro-

organismos do sistema MALDI Bioyper (Bruker Daltonics, Bremen, Alemanha) aprovada pelo

Federal and Drug Administration (FDA) nos EUA, e pela ANVISA, no Brasil, está limitada apenas

às bactérias Gram-negativas, apesar de sua aplicação para a identificação de outros micro-

organismos estar disponível somente para fins de pesquisa. Este sistema permite a construção

personalizada de um banco de dados. O sistema VITEK® MS (bioMérieux, Marcy l'Etoile, França)

está aprovado pelo FDA e pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) para

identificação de bactérias aeróbias e anaeróbias, Gram-negativas e Gram positivas, além de

leveduras. Apesar de ambos os equipamentos serem compostos por um espectrômetro de

massa, por banco de dados e por um software, estes diferem de um equipamento para o outro.

O MALDI Biotyper é um equipamento de menor porte, de bancada, capaz de trabalhar em

sistema aberto ou fechado, utilizando o mesmo banco de dados denominado Biotyper system,

atualmente na versão 4.0. O VITEK MS é um equipamento instalado sobre o piso, e disponibiliza

dois sitemas de banco de dados, o Myla (IVD) e o Saramis (RUO), porém, estes foram

combinados recentemente no VITEK MS Plus. Algumas diferenças em relação ao manuseio dos

sistemas e amostras também ocorrem. O MALDI Biotyper analisa no máximo 96 amostras por

corrida e disponibiliza placas de metal reutilizáveis, já o VITEK MS analisa quatro placas

descartáveis de 48 amostras cada (172 amostras em uma única corrida), porém, devem ser

analisadas de 16 em 16 ou os spots remanescentes serão inutilizados (Patel, 2013).


9

2.1.1. O Princípio da Técnica de MALDI-TOF MS

Na técnica de MALDI-TOF MS, um composto, chamado de matriz, é utilizado para auxiliar

na dessorção e isonização das partículas de micro-organismos através da energia do laser. Este

se caracteriza por um laser de N2 de comprimento de onda de 336 nm, frequência de 60 Hz e

tempo de vida de milhões de disparos. A função da matriz é diluir a amostra e absorver a energia

do laser, promovendo assim a suave ionização das suas moléculas (Marvin et al., 2003).

Inúmeras matrizes estão disponíveis, e a escolha da matriz adequada para cada amostra é

fundamental para o sucesso da análise (Santos et al., 2010). Estas são compostas de derivados

de ácido cinâmico ou benzóico, diluídos em um solvente orgânico e água, ou ainda em ácido

trifluoracético. A matriz adequada permite a obtenção de espectros com melhor qualidade, pela

ótima razão entre sinal e ruído e picos estreitos, favorecendo a análise final do espectro de

massas (Santos et al., 2010).

As partículas de micro-organismos e da matriz, através da incidência do laser,

desprendem-se da superfície onde se encontram (Figura 1). A maioria da energia é absorvida

pelas moléculas da matriz, convertendo-as para um estado ionizado. Através de colisões

aleatórias, na fase gasosa, a carga elétrica é transferida da matriz para as moléculas da

amostra. Estas são aceleradas, baseadas na sua relação de massa e carga para um tubo de

vácuo, o analizador de massas (TOF; tempo de vôo) (Fenselau & Demirev, 2001). Os íons

migram pelo campo elétrico até alcançarem o detector, com velocidades inversamente

proporcionais às suas massas. O espectro de massas é gerado, representanto o número de íons

que atingem o detector através do tempo. O analisador TOF determina a razão da massa

molecular pela carga (m/z) dos íons por meio da mensuração da velocidade destes, após a

calibração do instrumento com moléculas de pesos conhecidos (Santos et al., 2010). A

separação ocorre pela razão massa/carga, entretanto, a carga é praticamente única, sendo o


10

peso molecular a variável que efetivamente separa as moléculas (Patel, 2014). Todo este

processo ocorre de forma muito rápida, em menos de 1 minuto por amostra.

Figura 1. Espectômetro de massa - MALDI-TOF MS. A placa-alvo é inserida na câmara do

espectômetro de massa. Os spots a serem analisados, são individualmente atingidos pelo feixe

de laser para dessorção e ionização das moléculas do micro-organismo e da matriz. A nuvem de

partículas ionizadas é acelerada em um analisador de massas (TOF), até atingir um detector. As

moléculas mais leves voam mais rapidamente, seguidas das de maior peso molecular. Adaptado

de Patel (2014).

As proteínas ribossomais são muito abundantes nos micro-organismos e, portanto,

constituem os principais componentes de avaliação pelo espectro de massa. Com base no perfil

das proteínas ribossomais, que variam de 2 a 20 kDa, que é único para cada espécie de micro-

organismo, o espectro de massa obtido é comparado a um banco de espectros de referência

como um todo. O micro-organismo com espectro de massa mais relacionado é identificado e a

medida da confiança desta análise é indicada por um valor, que difere de um sistema para outro


11

(Murray, 2010; Emonet et al., 2010). A identificação em espécie e gênero é avaliada com base

nestes valores de confiança.

Os principais fatores que influenciam a qualidade da identificação de micro-organismos

pela espectrometria de massa são a pureza das cepas a serem identificadas, a quantidade de

material biologico disponível para análise e a experiência do microbiologista. A interpretação e

validação dos resultados requerem sempre a avaliação de todos os resultados obtidos até

aquele momento, como as condições de crescimento do micro-organismo em meios de cultura e

as suas características morfológicas e tintoriais. A análise e a expertise do microbiologista são

fundamentais para a acurácia do diagóstico etiológico.

O sistema Bruker fornece valores entre 0 e 3,000, baseando-se na presença ou na

ausência de picos no espectro de massa e adota critérios para a identificação em espécie e

gênero, correspondentes a superior a 2,000 e entre 1,700 e 1,999, respectivamente. Valores

inferiores a 1,700 indicam que a identificação do micro-organismo não é confiável. O sistema

VITEK MS realiza a identificação baseando-se na similaridade do espectro do micro-organismo

testado com aquele de referência no banco de dado, e àquele denominado de superespectro,

que representa o espectro de picos conservados derivados de múltiplos isolados de uma espécie

ou grupo em particular. O valor atribuído relaciona-se à especificidade destes para a espécie ou

gênero em questão. Estes valores de confiança variam de 0 a 100% (Patel, 2014).

2.1.2. A Espectrometria de Massa na Identificação de Micro-organismos

Há exatamente cinco anos, foi publicado o primeiro estudo que avaliou a acurácia da

espectrometria de massa pela técnica de MALDI-TOF MS com a finalidade de identificação de

isolados bacterianos, aeróbios e anaeróbios, provenientes de amostras clínicas (Seng et al.,

2009). Neste estudo, dos 1.660 isolados bacterianos, 95,4% foram identificados corretamente

pelo MALDI-TOF MS e demonstraram que a acurácia na identificação bacteriana pela


12

espectrometria de massa se correlacionou diretamente ao número de espectros de massas

daquela espécie incluído no banco de dados.

Diversos estudos se seguiram, demonstrando a utilidade desta metodologia na prática

diária dos laboratórios de microbiologia. Entretanto, algumas espécies são muito relacionadas

entre si e apresentam um pequeno número de picos que podem ser utilizados para distinguí-las,

como Streptococcus pneumoniae do grupo Streptococcus mitis. Neste caso, o sistema VITEK

MS (IVD) demonstrou superioridade, pois pelo sistema Biotyper apesar dos isolados de S.

pneumoniae serem identificados corretamente, os isolados de S. mitis/oralis podem ser

erroneamente identificados como S. pneumoniae (Martiny et al., 2012). Entretanto, alguns micro-

organismos são extremamente relacionados e nenhum dos algoritmos propostos, até o

momento, é capaz de diferenciá-los, como E. coli e Shigella spp. (Patel, 2014). Porém, ambos os

sistemas apresentam uma nota referente a esta limitação quando estas bactérias são

identificadas.

O procedimento para a identificação requer apenas que se transfira a colônia bacteriana,

após crescimento em placa de ágar, para o spot da placa de MALDI-TOF MS com a ajuda de um

palito ou alça bacteriológica. Adiciona-se 1 µL da matriz, para a identificação bacteriana, utiliza-

se, preferencialmente, o ácido α-ciano-4-hidroxicinâmico (HCCA) dissolvido em 50% de

acetonitrila e 2,5% de ácido trifluoroacético. Em seguida o material é deixado à temperatura

ambiente até que o material fique completamente seco. A placa deve ser inserida no

equipamento para análise. Com o objetivo de se melhorar a qualidade do espectro obtido, a

extração de proteínas pode ser realizada através de um procedimento utilizando-se ácido

fórmico e acetonitrila, ou apenas com a adição de 1 µL de ácido fórmico a 70% sobre a colônia

do micro-organismo na placa de MALDI-TOF MS, auxiliando a ruptura celular. Entretanto, na

rotina laboratorial, este procedimento torna-se trabalhoso. Recomenda-se, então, que para

facilitar o fluxo de trabalho, a análise inicial de bactérias e leveduras seja realizada diretamente


13

da colônia do micro-organismo, com ou sem adição do ácido fórmico e, para aquelas nas quais o

resultado obtido não for satisfatório, a extração proteica poderá ser realizada (Patel, 2014).

2.1.2.1. Identificação de Bactérias Aeróbicas

O sistema de MALDI-TOF MS apresenta um excelente desempenho para a identificação

de bactérias aeróbicas (Figura 2). Utilizando o sistema da Bruker, Patel (2013) observou 93% e

82% de identificações corretas em gênero e espécie, respectivamente, quando avaliou 440

isolados bacterianos de bacilos Gram-negativos usuais e não-usuais. Estas taxas foram

superiores àquelas observadas para os métodos de identificação convencionais (Patel, 2013).

No mesmo estudo, Patel avaliou 217 isolados de cocos Gram positivos encontrando 98% de

identificação correta para o gênero e 79% para espécie. As maiores dificuldades relatadas estão

na diferenciação de espécies de Streptococcus, especialmente S. pneumoniae, grupo S. mitis e

grupo S. viridans, como dito anteriormente (Martiny et al., 2012; McElvania Tekippe et al., 2013).

Lau e colaboradores (2014) obtiveram 75% de identificação correta em gênero para 67

micro-organismos de difícil identificação, como Granulicatella adiacens, Micrococcus luteus,

Nocardia spp., Pantoea dispersa, Actinomyces spp., entre outros (Lau et al., 2014). Alatoom e

colaboradores (2012) mostraram que os bacilos Gram positivos também poderiam ser

identifcados por esta metodologia, já que observaram 85% de concordância em gênero ao

avaliarem 190 isolados (Alatoom et al., 2012). Entretanto, a identificação de bacilos Gram

positivos, geralmente, apresenta taxas de concordância inferiores àquelas apresentadas para

cocos Gram positivos e bacilos Gram-negativos. Bizzini e colaboradores (2010) observaram uma

concordância de 88,6% para os 1 371 micro-organismos testados, sendo que quando

estratificados mostrou 92,2% de resultados corretos para bacilos Gram-negativos, 99,2% para

cocos Gram positivos, porém, apenas 84,6% para bacilos Gram positivos (Bizzini et al., 2010).


14

Figura 2. Espectro de massa gerado pelo MALDI-TOF MS para as diferentes espécies

bacterianas. Adapatado de Liu e colaboradores (2007).

Os estudos que avaliaram o sistema VITEK MS obtiveram resultados semelhantes,

incluindo bactérias Gram-negativas, Gram-positivas e fastidiosas (91-97% de identificação em

gênero e 78% a 96% em espécie). No estudo de Richter e colaboradores (2013), este sistema

identificou corretamente 97% e 84% das enterobactérias testadas em gênero e espécie,

respectivamente (Richter et al., 2013). Martiny e colaboradores (2012) avaliaram o desempenho

dos dois sistemas e respectivos bancos de dados. Estes apresentaram resultados bastante

similares (93%) para a identificação de bactérias usualmente encontradas na rotina laboratorial,

exceto quando o banco de dados Saramis foi utilizado (83,8%) (Martiny et al., 2012). Em nossa

experiência, o sistema VITEK MS apresentou 98% e 92% de concordância em gênero e


15

espécies, quando 119 isolados bacterianos comumente encontrados no laboratório de

microbiologia foram avaliados, diretamente da colônica bacteriana. Dentre estes a concordância

em gênero e espécie foi de 97% e 86% para os 59 cocos Gram positivos, e de 100% e 98%,

respectivamente, para 60 bacilos Gram-negativos (dados não publicados).

2.1.2.2. Identificação de Bactérias Anaeróbicas

A espectrometria de massa tornou-se o método de escolha para a identificação de

bactérias anaeróbicas. Barreau e colaboradores (2013) avaliaram uma coleção de 1 325

bactérias anaeróbicas e alcançaram 100% e 93% de correta identificação direto da colônia em

gênero e espécie, respectivamente, utilizando o sistema Biotyper (v. 3.0) (Barreau et al., 2013).

Jamal e colaboradores (2013b) reportaram 89% e 100% de identificação entre 274 bactérias

anaeróbicas usando os sistemas Biotyper e VITEK MS, respectivamente (Jamal et al., 2013b).

2.1.2.3. Identificação de Micobactérias

A identificação de micobactéria é um grande desafio para o laboratório de microbiologia, e

apesar de algumas limitações, o MALDI-TOF MS é uma técnica mais rápida, de menor custo, e

mais fácil que as técnicas atualmente empregadas (testes bioquímicos e moleculares). As

espécies de micobactérias exigem, além da inativação prévia, um procedimento de extração

mais elaborado. A inativação pode ser realizada com o calor ou com exposição ao etanol,

seguida de um processo de ruptura mecânica, com auxílio de pérolas de vidro, e extração

proteica com ácido fórmico e acetonitrila, uma vez que sua parede é constituida por uma camada

de ácidos graxos que impede sua ruptura apenas com a incidência do laser (Balada-Llasat et al.,

2013; Dunne et al., 2014). Em seu estudo, Balada-Llasat e colaboradores (2013) testaram 178

isolados de micobactérias, cultivados em meios sólido e líquido, utilizando-se o calor para

inativação, seguido de tratamento com etanol e lise mecânica, como recomendado pela Bruker.


16

Os autores observaram 98% e 94% de correta identificação em gênero e espécie,

respectivamente (Balada-Llasat et al., 2013). Dunne e colaboradores (2014) demonstraram boa

efetividade na inativação de isolados de Mycobacterium spp. utilizando a lise mecânica por

cinco minutos na presença de etanol 70%, seguida de um período adicional de inativação por

dez minutos (Dunne et al., 2014). Da mesma forma, Mather e colaboradores (2014) avaliaram

198 isolados clínicos utilizaram a lise mecânica com auxílio do vórtex e pérolas de silica na

presença de etanol para inativação das amostras. Com o aprimoramento do banco de dados do

sistema Biotyper (v. 2.0) com 123 espectros de cepas clínicas, foi observada uma concordância

de 95% das espécies de Mycobacterium por este sistema e 94% utilizando-se o sistema VITEK

MS (Saramis) (Mather et al., 2014). Os bancos de dados dos sistemas VITEK MS e Biotyper têm

sido atualizados principalmente com o aumento no número e variedade de espectros de

micobactérias, o que deve melhorar o desempenho desta metodologia no futuro. A condição e

tempo de crescimento das colônias de micobactérias também podem influenciar a qualidade dos

espectros obtidos. Lotz e colaboradores (2010) observaram que quando cultivada em meio

sólido (Löwenstein-Jensen), o extrato proteico obtido apresentava qualidade supeiror no

espectro de massas do que quando as amostras eram cultivadas em meio líquido,

consequentemente a identificação correta foi obtida para 97% e 77% dos isolados cultivados em

meio sólido e líquido, respectivamente (Lotz et al., 2010).

2.1.2.4. Identificação de Fungos

A identificação de leveduras pelo MALDI-TOF MS apresenta bons resultados, sendo uma

ótima alternativa aos métodos manuais, trabalhosos e demorados ou aos métodos

automatizados e painéis comerciais, que são mais honerosos. Entretanto, há diferenças de

desempenho quando avaliamos os sistemas disponíveis. O sistema VITEK MS apresenta

excelentes resultados (97-95%), apenas com a transferência da colônia associada ao ácido


17

fórmico na própria placa do MALDI-TOF MS (Westblade et al., 2013; Pence et al., 2014;

Hamprecht et al., 2014). Entretanto, o sistema da Bruker somente apresenta bons resultados

(90%), quando a análise é precedida de extração proteica, utilizando-se ácido fórmico e

acetonitrila. Esse sistema alcançou 100% quando o sistema Biotyper (v. 3.0) foi adicionado à

construção de um banco de dados próprio (Mancini et al., 2013). Desta forma, o sistema Biotyper

requer melhorias no seu banco de dados em relação aos espectros de leveduras incluídos.

Corroborando com estes achados, De Carolis e colaboradores (2014) demonstraram

excelente desempenho (96% de 4232 leveduras) quando, além do desenvolvimento do seu

próprio banco de espectros com 156 cepas referências de leveduras, os autores realizaram um

rápido procedimento de extração, analisando o sobrenadante da combinação de uma colônia

com 50 µL de ácido fórmico a 10%, após homogenização vigorosa com auxílio de um vórtex (De

Carolis et al., 2014). Santos e colaboradores (2011) avaliaram 67 isolados de leveduras,

intimamente relacionadas, como Candida parapsilosis, C. orthopsilosis e C. metapsilosis; C.

albicans e C. dubliniensis; e C. glabrata e C. bracarensis, que somente podem ser discriminadas

entre si através de técnicas moleculares. Apesar de algumas espécies não apresentarem

espectros no banco de dados Saramis, quando os mesmos foram inseridos, o MALDI-TOF MS

foi capaz de identificar e distinguir todas as espécies, mostrando-se uma excelente ferramenta

para identificação de leveduras (Santos et al., 2011). Em nossa experiência com o sistema

VITEK MS para identificação direta da colônia de 66 leveduras, incluindo Trichosporon asahii,

Kodamaceri ohmeri e diversas espécies emergentes de Candida, obtivemos 92% e 84% de

concordância em gênero e espécies com o sistema API ID32, respectivamente (Mota et al.,

2014).

Embora a identificação de fungos filamentosos possa ser realizada pela plataforma de

MALDI-TOF MS, cuidados devem ser tomados para evitar que meios de cultura possam

favorecer a mutagênese ou a presença de inibidores que alterem o perfil proteico, e levem,


18

consequentemente, às alterações nas análises pelo MALDI-TOF MS (Santos et al., 2010). Outro

desafio é a aquisição das proteínas totais e em qual momento do crescimento fúngico a extração

proteica deverá ser realizada de modo efetivo. Diferentes protocolos foram descritos na literatura

e bons resultados foram alcançados quando banco de dados apropriados foram combinados.

Isso demonstrou, que da mesma forma como ocorre para micobactérias, os sistemas atualmente

disponíveis requerem aprimoramento dos seus respectivos bancos de espectros para fungos

filamentosos (Lau et al., 2013; Schulthess et al., 2014).

2.1.2.5. Identificação de Micro-organismos Diretamente de Frascos de Hemocultura

O diagnóstico etiológico rápido de infecção de corrente sanguínea (ICS) e a introdução

precoce da terapia antimicrobiana são a base para o sucesso clínico desta grave infecção.

Atualmente, o procedimento mais utilizado para o diagnóstico etiológico de ICS requer a cultura

em meio líquido, continuamente monitorizada, seguida da pesquisa direta pela coloração de

GRAM e subcultivo para a realização de testes fenotípicos de identificação bacteriana,

automatizados, ou não, seguido do teste de sensibilidade aos antimicrobianos. Este processo

geralmente necessita de 3 a 5 dias, retardando a adequação da terapia antimicrobiana. Algumas

limitações comprometem ainda mais o resultado deste processo como a baixa sensibilidade na

detecção de micro-organismos de difícil crescimento (Bizzini et al., 2011).

A redução no tempo de resposta dos resultados microbiológicos é muito desejada para

melhorar o desfecho clínco dos pacientes, otimizar o uso de antimicrobianos, e, reduzir custos

(Doern et al., 1994; Barenfanger et al., 1999). A comunicação da coloração de Gram é

considerada urgência para as boas práticas de microbiologia clínica, e mostrou-se de grande

valor para a adequação de terapia empírica (Munson et al., 2003). Barenfanger e colaboradores

(2008) reportaram uma redução significativa da mortalidade geral quando grupos pareados de

pacientes com ICS foram comparados em relação ao tempo de comunicação da coloração de


19

Gram. O grupo em que o Gram foi reportado em menos de 1 hora (tempo médio 0,1 hora) a

mortalidade foi de 10% enquanto que quando o Gram ultrapassou este tempo (média de 3,3

horas) a mortalidade elevou-se para 19% (Barenfanger et al., 2008). Portanto, há uma imensa

necessidade de testes que auxiliem na instituição da terapia antimicrobiana apropriada precoce.

Com este objetivo, diversos protocolos foram propostos para obter a identificação do micro-

organismo causador de ICS diretamente de frascos de hemocultura utilizando-se a técnica de

MALDI-TOF MS (Prod’hom et al., 2010; Martiny et al., 2012; Stevenson et al., 2010). A Tabela 1

sumariza alguns destes estudos.


20

Tabela 1. Diferenças entre os principais artigos publicados que descreveram a identificação de bactérias diretamente do frasco de hemocultura.

Estudo MALDI-TOF

MS Extração

Volume da HMC

N de passos e soluções utilizadas

Análise Critério Método de

comparação N° Concordância Erros

Stevenson et al., 2010 Microflex LT

"in house" utilizando tubo contendo gel

separador

8 mL

5 passos de lavagem e centrifugação; solução

de lise NH4Cl, NaHCO3, EDTA

Extração proteica

A Convencional 202 95% Espécie: S. mitis;

complexo E. cloacae

Prod'hom et al., 2010 Microflex LT "in house" 5 mL 3 passos de lavagem e centrifugação; solução de lise NH4Cl e KHCO3

Extração proteica

B Convencional 122 79% Espécie: S. caprae; Não

identificou 21%

Kok et al., 2011 Microflex LT Kit SepsiTyper 1 mL 2 passos de lavagem e

centrifugação Extração proteica

B Convencional 476 75% Espécie: S. mitis; P.

putida Não identificou: 23,7%

Vlek et al., 2012 Microflex LT "in house" 5 mL 3 passos de lavagem e


B Convencional 89 56% Não identificou: 39%

Martiny et al., 2012

Microflex LT "in house" 1 mL 2 passos de lavagem e centrifugação, solução de lise Saponina 5%

Colônia C Convencional 59 BGN: 90%; CGP:

62% Espécie: S. typhi; Não

identificou: 27%

Microflex LT Kit SepsiTyper 1 mL 2 passos de lavagem e

centrifugação

Extração proteica para

CGP e Colônia para

BGN

C Convencional 59 BGN: 68%; CGP:

73%

Espécie: S. typhi e S. marcescens; Não identificou: 29%

Chen et al., 2013 Microflex LT "in house" de Martiny et al.,

2012 1 mL

2 passos de lavagem e centrifugação, solução de lise Saponina 5%

Extração proteica

D Sequenciamento gene 16S rRNA

92 97% Não identificou: 3,3%


21

Vitek MS "in house" de Martiny et al.,

2012 1 mL

2 passos de lavagem e centrifugação, solução de lise Saponina 5%

Extração proteica

E Sequenciamento gene 16S rRNA

92 88% Não identificou: 12%

Microflex LT Kit SepsiTyper 1 mL 2 passos de lavagem e


D Sequenciamento gene 16S rRNA

202 94% Não identificou: 6,5%

Vitek MS Kit SepsiTyper 1 mL 2 passos de lavagem e


E Sequenciamento gene 16S rRNA

202 88% Não identificou: 12%

Lagacé-Wiens et al., 2012 Microflex LT Kit SepsiTyper 1 mL 2 passos de lavagem e


B Convencional 61 85% Gênero: S. mitis, SCN; Não identificou: 15%

Clerc et al., 2013 Microflex LT "in house" de

Prod'hom et al., 2010

5 mL 3 passos de lavagem e centrifugação; solução de lise NH4Cl e KHCO3

Extração proteica

B Convencional 165 87% Modificou a terapia

empírica em 35% dos casos

Jamal et al., 2013a Microflex LT Kit SepsiTyper 1 mL 2 passos de lavagem e


B Convencional e Seq. 16S rRNA

160 76%

Gênero: K. oxytoca; Espécie: Salmonella

arizonae; A. baumannii, Streptococcus e

Staphylococcus; Não identificou: 5,6%

Abreviaturas: HMC - Hemoculturas. Critérios adotados para identificação do micro-organismo: A. Score < 1,7: não identificado; 1,7-1,9: identificado em gênero; ≥ 1,9: identificado em espécie; B. Score < 1,7: não identificado; 1,7-1,99: gênero; ≥ 2: identificado em espécie; C. < 1,7: não identificado; 1,7-1,99: identificado em gênero; > 2: identificado em espécie. D. < 1,6: não identificado; 1,6-1,99: identificado em gênero; ≥ 2 : identificado em espécie; E. valor < 90%: não identificado; 90 - 98%: identificado em gênero e >98%: identificado em espécie.


22

Em seu estudo, Clerc e colaboradores (2013) utilizaram o MALDI-TOF MS para

identificação de micro-organismos diretamente dos frascos de hemocultura e avaliaram seu

impacto na adequação da terapia antimicrobiana mesmo após a comunicção da coloração de

Gram em um cenário de baixa prevalência de bactérias MDR (Clerc et al., 2013). A adequação

da terapia pelo resultado do MALDI-TOF MS foi realizada em 35% dos casos de bacteremia

apesar do resultado prévio da coloração de Gram. Vlek e colaboradores (2012) também

observaram um impacto significativo do resultado da identificação pelo MALDI-TOF MS

diretamente do frasco de hemocultura na modificação da terapia antimicrobiana de pacientes

com ICS (Vlek et al., 2012).

Apesar do benefício da identificação bacteriana precoce, o perfil de sensibilidade aos

antimicrobianos, especialmente para aqueles considerados determinantes para o tratamento de

infecções graves, como os carbapenens, é imprescindível para a adequação da terapia,

principalmente em regiões de alta prevalência de bactérias multirresistentes.

De maneira geral, a introdução da espectrometria de massa na microbiologia clínica

trouxe um grande avanço, tanto em termos de rapidez como de acurácia frente aos métodos

disponíveis até o momento (Figura 3). Pela primeira vez, o laboratório de microbiologia tem

disponível, em uma única plataforma, a possibilidade de identificar diferentes micro-organismos,

desde bactérias comumente isoladas na prática clínica, como bactérias fastidiosas ou de díficil

identificação, micobactérias, leveduras e fungos filamentosos. Adicionalmente, esta metodologia

tem sido aplicada com sucesso para a identificação de micro-organismos diretamente de

amostras clínicas, especificamente de frascos de hemoculturas.


23

Figura 3. Fluxograma do uso da técnica de MALDI-TOF MS na identificação de micro-

organismos no laboratório de microbiologia clínica. Adaptado de Carvalhaes e colaboradores

(2012).

Entretanto, aprimoramentos nos bancos de referência de espectros, assim como, em

metodologias e padronizações de extrações e análises são necessárias e devem ocorrer no

futuro próximo. Este sistema apresenta vantagens frente aos tradicionais sistemas de

identificação de micro-organismos, sendo essas: (i) facilidade de implantação; (ii) fácil manuseio

do equipamento e software; (iii) rapidez nos resultados; (iv) capacidade de identificação a partir

da colônia de bactérias e leveduras; assim como diretamente de amostras clínicas,

especificamente hemocultura (v) a acurácia semelhante ou superior a dos métodos

automatizados; (vi) baixo consumo de reagentes; (vii) poucos resíduos; (viii) baixo custo por

amostra; e (ix) com uma aplicação potencial para aplicação em tipagem de micro-organismos e

na detecção de mecanismos de resistência.


24

2.1.3. A Espectrometria de Massa na Tipagem de Micro-organimos

O princípio pelo qual a espectrometria de massa pode ser aplicada para a discriminação

de isolados pentencentes a mesma espécie se baseia na observação de que espectros de

massas podem diferir em intensidade, perda ou mudança de um sinal (ou pico de massa/carga

no espectro). As variações na intensidade do sinal podem também ser causadas por diferenças

de expressão, que por sua vez podem ser diretamente correlacionadas com as condições de

crescimento, e, não necessariamente, em relação às diferenças genéticas dos micro-

organismos. A perda de um sinal é causada pela falha na expressão de uma proteína ou

peptídeo, que por sua vez pode indicar uma mutação, causando a interrupção da transcrição do

gene. Entretanto, a perda do sinal também pode ser consequente das condições de cultivo,

mutações em fatores regulatórios ou do preparo da amostra. Portanto, até o momento, não há

um critério claro de correlação entre a perda de um sinal e a discriminação de um micro-

organismo (Josten et al., 2013).

Entretanto, a mudança de um sinal, ou seja, a perda de um sinal associado à detecção de

um novo sinal, ambos correlacionados ao mesmo peptídeo, corresponde a mutações pontuais no

gene do peptídeo correspondente. Essa mutação leva à modificação do aminoácido na

sequência proteica, modificando o peso molecular desta (Josten et al., 2013). Estas diferenças

podem contribuir para a identificação de linhagens de um isolado diretamente da análise do

MALDI-TOF MS.

A utilização de ferramentas, como a análise dos componentes principais (PCA) e

estruturação de dendogramas, auxilia na discriminação dos espectros, entretanto é muito

trabalhosa. Menacci e colaboradores (2013) utilizaram-se da PCA para discriminar isolados de A.

baumannii. Estes autores observaram boa correlação entre os achados desta técnica quando

comparados ao Rep-PCR (Menacci et al., 2013). Em seu estudo, Josten e colaboradores (2013)

identifacaram peptídeos presentes em cada linhagem de S. aureus. Estes peptídeos foram


25

capazes de correlacionar cepas clínicas de S. aureus às principais linhagens de S. aureus

conhecidas (Josten et al., 2013). Entretanto, Lasch e colaboradores (2014), utilizando as

mesmas ferramentas de análise, não obtiveram sucesso em diferenciar cepas de S. aureus e E.

faecium de acordo com seu perfil clonal (Lasch et al., 2014). Portanto, esta aplicação precisa ser

melhor avaliada antes de poder ser aplicada nos laboratórios de microbiologia.

2.1.4. A Espectrometria de Massa na Resistência aos Antimicrobianos

Visando a crescente demanda pela rápida informação quanto à sensibilidade de micro-

organismos aos agentes comumente utilizados para tratar infecções, diversas tentativas para

distinguir espectros de isolados bacterianos resistentes e sensíveis a determinados

antimicrobianos foram propostas. Considerando-se que o padrão de proteínas é um reflexo das

sequências gênicas que as codificam, diferenças são esperadas entre isolados sensíveis e

resistentes. Na tentativa de encontrar diferenças nos espectros foram realizados inicialmente

estudos com isolados de S. aureus resistentes (MRSA) e sensíveis (MSSA) à meticilina (Edward-

Jones et al., 2000). Apesar de obter sucesso na diferenciação destes isolados, esta técnica não

se mostrou reprodutível (Walker et al., 2002). Da mesma maneira, a detecção de isolados de

Enterococcus spp. resistentes à vancomicina (VRE) foi proposta, associada ao rastreamento

epidemiológico em um episódio de surto institucional, utilizando-se um modelo estatístico

baseado no espectro proteico bacteriano (Griffin et al., 2012). Os autores obtiveram 92% de

sensibilidade e 85% de especificidade na detecção de E. faecium carreador do gene vanB. Ao

incorporar este modelo na rotina laboratorial, os autores alcançaram resultados ainda melhores,

97% e 98% de sensibilidade e especificidade, respectivamente (Griffin et al., 2012). Entretanto, a

reprodutibilidade deste modelo não foi avaliada por outros grupos, o que poderia refletir apenas

em uma situação epidemiológica favorável e restrita à área geográfica avaliada (Kostrzewa et al.,


26

2013). Estes modelos assemelham-se ao acima descrito para tipagem de micro-organismos,

através da análise cuidadosa de seus espectros.

A possibilidade da detecção direta de peptídeos ou enzimas relacionadas à resistência

aos antimicrobianos também foi estudada. Entretanto, no caso da detecção direta de β-

lactamases, apesar de serem muito ativas, estas enzimas são produzidas em pequenas

quantidades. Além disso, seu peso molecular é semelhante a diversas outras proteínas

bacterianas e existem centenas de diferentes tipos de β-lactamases com pesos moleculares

similares. Até o presente momento, o modelo que melhor se estabeleceu para a detecção da

resistência aos β-lactâmicos mediada por β-lactamases, consiste em um ensaio funcional. Neste

modelo não é a bactéria que é analisada pela espectrometria de massa, mas sim, as moléculas

dos compostos β-lactâmicos. A detecção da modificação das moléculas destes compostos frente

aos fatores enzimáticos produzidos pelos micro-organismos é atualmente o método mais

próximo de ser aplicado à rotina laboratorial. Este método será melhor descrito no item 2.5.5.3.

Um interessante modelo para a detecção de resistência aos antimicrobianos pela técnica

de MALDI-TOF MS, é a utilização de nutrientes marcados com isótopos estáveis no meio de

cultura. Comparando-se o espectro obtido de um isolado após crescimento de três horas em

meio líquido, com ou sem a marcação isotópica adicionada de um antimicrobiano, é possível

diferenciar o isolado resistente, pois este ao se multiplicar incorpora os isótopos marcados que

desviam os picos de massa quando comparados ao perfil dos isolados em meio sem marcação

(Demirev et al., 2013). Acredita-se que tal método possa ser aplicado a diferentes

antimicrobianos e para rapidamente identificar as bactérias resistentes, com a construção de um

banco de espectros de referência e automação de sua interpretação. Um possível fator limitante

desta metodologia seria o custo de tais meios.

Recentemente, Lau e colaboradores (2014) demonstraram a possibilidade de rastrear a

presença do plasmidio pKpQIL, carreador do gene blaKPC, pela identificação de um pico de


27

~11.109 Da no espectro de massa correspondente a um produto clivado de uma proteina

codificada pelo plasmídio pKpQIL. Através desta determinação, a presença do gene blaKPC

poderia ser inferido prospectivamente nos isolados identificados pelo MALDI-TOF MS, através

da presença ou ausência deste pico no espectro de massa (Lau et al., 2014). Apesar da

detecção de um fator único de resistência, esta abordagem poderia ser interessante na vigência

de um surto. Entretanto, resultados falso-positivos e falso-negativos poderiam ocorrer caso o

palsmídio pKpQIL perdesse o gene blaKPC ou se a proteína detectada (~11.109 Da) sofresse

alguma mutação ou interrupção de sua expressão, respectivamente.

2.2. Epidemiologia das Bactérias Gram-negativas no Ambiente Hospitalar

Enterobactérias, P. aeruginosa e A. baumannii são as mais frequentes bactérias Gram-

negativas causadoras de infecção hospitalar em todo o mundo. As enterobactérias são

habitantes do trato gastrointestinal de seres humanos e animais, podendo também colonizar a

pele, a orofaringe e as vias aéreas superiores, vivendo em estreita relação com o hospedeiro,

porém, podem se tornar patogênicas, causando infecções graves. P. aeruginosa tem seu habitat

natural em ambientes úmidos, e assim como A. baumannii, possui grande potencial para se

estabelecer em soluções utilizadas nos cuidados médicos, como desinfetantes, fluídos de

irrigação ou de diálise, além de equipamentos de terapia respiratória e inaladores. A. baumannii

possui ainda a capacidade de persistir por longos períodos em ambientes secos (Paterson,

2006). Estas características, associadas à capacidade de aquisição de resistência aos

antimicrobianos, permitem que estes micro-organismos permaneçam no ambiente hospitalar.

Estes patógenos podem ser facilmente transmitidos de paciente para paciente por meio dos

profissionais de saúde, sendo frequente a ocorrência de surtos hospitalares por disseminação de

clones. Estudos de vigilância reportam Acinetobacter spp. como um dos patógenos mais

frequentes entre isolados causadores de infecção relacionada à assistência à saúde (IRAs) na


28

América Latina, Europa e EUA (Gales et al., 2012; Sader, 2014; Sievert et al., 2013; Tabah et al.,

2012). No Brasil, segundo dados da ANVISA, este patógeno foi o quarto patógeno mais

frequentemente isolado de infecção de corrente sanguínea (Tabela 2).

Em sua última publicação, a National Healthcare Safety Network (NHSN) do CDC,

mostrou que entre 2009-2010, P. aeruginosa (16,6%), Klebsiella spp. (10,1%), Enterobacter spp.

(8,6%), e A. baumannii (6,6%) foram responsáveis por 42% dos episódios de pneumonias

associadas à ventilação mecânica (PAV), sendo menos frequente apenas que S. aureus (24,1%)

(Sievert et al., 2013). Gales e colaboradores (2012) reportaram dados semelhantes, em um

estudo de vigilância realizado entre os anos de 2008 e 2010, onde os principais patógenos

relacionados à etiologia de pneumonias na América Latina foram P. aeruginosa (31,2%), S.

aureus (20%), Acinetobacter spp. (17,7%), Klebsiella spp. (10,2%) e Enterobacter spp. (5,1%)

(Gales et al., 2012). Entretanto, diferenças podem ser observadas na epidemiologia das ICS

entre as localidades dos estudos. Enquanto segundo o NHSN-CDC, nos EUA, os quatro

primeiros micro-organismos foram cocos Gram positivos, na América Latina, E. coli (19%) e

Klebsiella spp. (12,3%), foram encontrados nas segunda e terceira posições. P. aeruginosa e

Acinetobacter spp. foram responsáveis por 7,5% e 7,2% das ICS na América Latina, ocupando a

quinta e sexta posições, respectivamente (Gales et al., 2012).

Poucos são os estudos de vigilância exclusivos ou que incluem isolados bacterianos

brasileiros. Dentre eles, podemos citar o programa de vigilância SENTRY, o SCOPE-Brasil e,

mais recentemente, o Programa Nacional de Monitoramento da Resistência Bacteriana no Brasil

realizado pela ANVISA (Marra et al., 2011; ANVISA, 2014). As diferenças metodológicas

empregadas por cada um destes estudos podem interferir em seus resultados e devem ser

levadas em consideração. O programa SENTRY, desde 1997, monitora os patógenos mais

prevalentes e seu perfil de sensibilidade aos antimicrobianos em diversos países, incluindo

quatro centros hospitalares do Brasil desde 1997. Este programa baseado em dados de


29

vigilância laboratoriais contempla patógenos isolados de ICS, infecções respiratórias e infecções

de pele e partes moles (Gales et al., 2012). O estudo SCOPE-Brasil foi realizado entre os anos

de 2007 e 2010, considerando apenas isolados de ICS e baseando-se em critérios

epidemiológicos. Dezesseis centros hospitalares distribuídos em oito Estados brasileiros fizeram

parte do estudo (Marra et al., 2011). De maneira semelhante a ANVISA iniciou em 2005 um

programa de vigilância de isolados bacterianos de ICS, exclusivamente de unidades de terapia

intensiva (UTIs), baseado em critérios epidemiológicos, porém, abrangendo os 27 estados

brasileiros (ANVISA, 2014) (Tabela 2).


30

Tabela 2. Característica dos estudos de vigilância epidemiológica que incluem isolados

bacterianos brasileiros.

Estudo de Vigilância SENTRY Brazilian SCOPE Programa Nacional -

ANVISA

Referência Gales et al., 2012 Marra et al., 2011 ANVISA, 2014

Período 2005-2008 Jun/2007- Mar/2010 Jan a Dez/2012

Foco Laboratórial Epidemiológico Epidemiológico

Critério

20 primeiros isolados consecutivos do mês

ICS ICS em UTI

1 único isolado por paciente

Número de centros médicos

4 16 908

Estados participantes 4 8 27

Número total de isolados 3 807 2 447 19 009

10 principais patógenos (%)

S. aureus 20,2 15,4 16,5

SCoN 14,5 13,8 19,9

Klebsiella spp. 12,1 13,2 12,4

E. coli 12 - 5,9

Acinetobacter spp. 9,1 12,5 11,4

P. aeruginosa 8,7 8,9 8,9

Enterobacter spp. 6,1 6,1 4,9

Candida spp. - 5,6 6,3

Enterococcus spp. 5 4,5 5,8

Serratia spp. 3,3 3,5 2,9

S. maltophilia 1,9 - -

Proteus spp. - 1,6 -

Em todos os estudos, as bactérias Gram-negativas foram responsáveis por

aproximadamente 50% dos isolados (46,4%-51,3%), distribuidos entre espécies de

enterobactérias, P. aeruginosa e Acinetobacter spp. Dentre as espécies de enterobactérias,

destacam-se K. pneumoniae, terceiro agente mais frequente em todos os estudos, além de

Enterobacter spp., Serratia spp., E. coli e Proteus spp. (Tabela 2). Apesar das semelhanças dos

dados brasileiros em relação aos dez patógenos mais frequentemente encontrados na Europa e


31

nos EUA, nota-se uma variabilidade de prevalência regional. Biedenbach e colaboradores (2004)

observaram uma alta prevalência de E. coli em isolados de ICS na Europa, Enterococcus spp.

nos EUA e bactérias Gram-negativas entéricas e não entéricas na América Latina (Biedenbach

et al., 2004).

No Brasil, o estudo de vigilância SCOPE-Brasil, conduzido por Marra e colaboradores

(2011) durante os anos de 2007 e 2010, reportaram que 58,5% das ICS foram causadas por

micro-organismos Gram-negativos, porém, S. aureus (15,4%) e Staphylococcus coagulase

negativa (SCoN; 13,8%) foram os agentes mais isolados, seguidos de Klebsiella spp. (13,2%),

Acinetobacter spp. (12,5%), P. aeruginosa (8,9%) e Enterobacter spp. (6,1%) (Marra et al.,

2011). Neste estudo ainda, a mortalidade reportada entre estes pacientes foi muito elevada,

sendo de 31-32% entre os pacientes que apresentaram episódio de ICS por Staphylococcus

spp., de 30-52% entre aqueles com ICS por bactérias Gram-negativas e de 68% nos quais

Candida spp. foi responsável pela ICS.

2.2.1. Resistência aos Antimicrobianos β-lactâmicos em Bactérias Gram-negativas

Entre todos os micro-organismos Gram-negativos causadores de IRAs, aproximadamente

65% dos isolados de A. baumannii, 15% de Klebsiella spp. e 2% de E. coli foram considerados

multirresistentes (MDR - resistentes a três ou mais classes de antimicrobianos testados) entre

2009-2010 nos EUA (Tacconelli et al., 2014). Na Europa, houve um aumento significativo nas

taxas de resistência aos antimicrobianos em isolados Gram-negativos. Em 2011, segundo o

European Antimicrobial Resistance Surveillance Network (EARS-Net) da European Center for

Disease Prevention and Control (ECDC), 36% dos isolados de E. coli foram resistentes às

cefalosporinas de amplo espectro. Esta taxa era 50% superior àquela relatada nos últimos quatro

anos. A resistência aos carbapenens também apresentou um aumento importante, se elevando


32

de 3,2% em 2009 para 6,2% em 2012. Em países como a Grécia e a Itália estas taxas chegaram

à 60,5% e 28,8%, respectivamente (ECDC, 2012).

No Brasil, Marra e colaboradores (2011), observaram que, em isolados de ICS entre os

anos 2007 e 2010, as taxas de resistência às cefalosporinas de amplo espectro em Klebsiella

spp. foram muito elevadas (54,4% e 50,2%, respectivamente) (Marra et al., 2011). Estes

achados foram corroborados pelo relatório do programa SENTRY, onde Gales e colaboradores

(2012) reportaram o fenótipo de resistência às cefalosporinas de amplo espectro em 50% dos

isolados de Klebsiella spp. no Brasil, assim como em outros países da América Latina, Argentina

(60%) e Chile (59%) (Gales et al., 2012). Portanto, o uso de antimicrobianos da classe dos

carbapenens é elevado nestes países, tanto na terapia empirica como no tratamento definitivo de

infecções graves causadas por bactérias Gram-negativas. Consequentemente, somos

testemunhas do aumento assustador das taxas de resistência destes micro-organismos aos

carbapenens. Apesar de em seu estudo, Marra e colaboradores (2011) observarem que apenas

0,3% dos isolados de Klebsiella spp. foram resistentes a imipenem, Gales e colaboradores

(2012) reportaram taxas muito mais elevadas (Marra et al., 2011; Gales et al., 2012). Entre os

anos de 1997-1999, o programa SENTRY reportou que 0,5% dos isolados de Klebsiella eram

resistentes aos carbapenens no Brasil, porém, esta taxa elevou-se para 1,7% entre 2003-2005, e

para 8,6% entre 2008-2010 (Gales et al., 2012). As diferenças nas taxas reportadas por estes

estudos podem estar relacionadas aos desenhos dos estudos. O estudo de Marra e

colaboradores (2011) incluiram 16 centros brasileiros, e isolados apenas de ICS em UTIs,

enquanto que o programa SENTRY inclui dados dos 20 primeiros e consecutivos isolados

bacterianos mensalmente de apenas quatro centros brasileiros. Recentemente, a ANVISA

reportou, pela primeira vez, um relatório epidemiológico com dados de ICS primária confirmadas

laboratorialmente obtidos de todos os 27 estados brasileiros. Foram 908 centros médicos que

enviaram dados coletados no ano de 2012 (ANVISA, 2014). Neste boletim, os isolados de


33

Klebsiella spp. resistentes às cefalosporinas de amplo espectro atingiu 32,5% de todos os

isolados de Klebsiella spp., sendo que 16,1% destes foram resistentes aos carbapenens.

A resistência aos antimicrobianos entre os isolados de P. aeruginosa são ainda piores.

No relatório do CDC, 26,1% das ICS adquiridas no ambiente hospitalar causadas por P.

aeruginosa foram resistentes aos carbapenens, e 15,4% por isolados apresentando fenótipo

MDR (CDC, 2013; Sievert et al., 2013). Na Europa, 17,1% dos isolados de P. aeruginosa

provenientes de infecções invasivas foram resistentes aos carbapenens e 13,8% foram MDR

(ECDC, 2012). No Brasil, segundo o estudo SCOPE-Brasil (2007 a 2010), 35,8% dos isolados de

P. aeruginosa provenientes de ICS foram resistentes à imipenem, corroborando com os dados

reportados recentemente pelo boletim da ANVISA, onde esta taxa foi de 36,9% em 2012, e pelo

programa de vigilância SENTRY, onde 42,1% dos isolados de P. aeruginosa foram resistentes

aos carbapenens, entre os anos de 2008 e 2010 (Marra et al., 2011; Gales et al., 2012; ANVISA,

2014).

A. baumannii, apesar de isolado em menor frequencia que P. aeruginosa e Klebsiella

spp., apresenta taxas de resistência ainda mais elevadas aos carbapenens. Nos EUA, Sievert e

colaboradores (2013) reportaram que 62,6% das amostras de A. baumannii provenientes de ICS

adquirida no ambiente hospitalar apresentavam resistência aos carbapenens. Na Europa, o

relatório do ECDC mostrou 51% de MDR entre os isolados de Acinetobacter spp. provenientes

de infecções invasivas. Semelhante ao reportado por Marra e colaboradores (2011), no estudo

SCOPE-Brasil, onde 56% dos isolados de A. baumannii foram resistentes aos carbapenens

(Marra et al., 2011). Assim como em outros países da América Latina, o programa SENTRY,

reportou importante elevação das taxas de resistência aos carbapenens no Brasil, de 16,3% em

2003-2005, para 71,4% em 2008-2010. Na Argentina este aumento foi de 58,6% para 84,9% e

no Chile de 6,2% para 50%, nos mesmos períodos avaliados (Gales et al., 2012). Segundo o

boletim da ANVISA, incluindo todos os estados brasileiros, a taxa reportada de isolados de


34

Acinetobacter spp. resistentes aos carbapenens foi de 38,8% (ANVISA, 2014). A diferença entre

as taxas de resistência reportadas pelo boletim da ANVISA pode ser explicada pela diversidade

geográfica de um país com dimensões continentais como o Brasil, assim como pelo fato deste

programa ser baseado em dados epidemiológicos, não havendo padronização da metodologia

utilizada para os testes de sensibilidade aos antimicrobianos.

Frente aos dados apresentados, infelizmente, a resistência das bactérias Gram-

negativas, especialmente Klebsiella spp., P. aeruginosa e Acinetobacter spp. às principais

opções terapêuticas para o tratamento de infecções graves tornou-se uma das mais

desafiadoras questões de saúde pública no âmbito mundial. Em setembro de 2014, o governo

americano anunciou medidas da Casa Branca para combater a resistência bacteriana aos

antimicrobianos (White House National Strategy for Combating Antibiotic Resistant Bacteria -

CARB). Entre os objetivos do documento estão a redução da progressão da resistência

bacteriana e disseminação de infecções causadas por estes agentes, uso e desenvolvimento de

testes diagnósticos rápidos e inovadores para identificação e caracterização de bactérias

resistentes e a aceleração das pesquisas básicas e aplicadas ao desenvolvimento de novos

antimicrobianos, novas terapias e vacinas. Neste mesmo ano a OMS publicou um documento

onde afirma que cada vez mais os governos ao redor do mundo estão começando a prestar

atenção para um problema tão grave que ameaça as conquistas da medicina moderna. A era

pós-antibiótico em que infecções comuns e pequenas lesões podem ser letais está longe de ser

uma fantasia apocalíptica, mas, é sim, uma possibilidade muito real para o século XXI (WHO,

2014).

2.3. Mecanismos Envolvidos na Resistência aos Carbapenens

O desenvolvimento de técnicas moleculares e os conhecimentos adquiridos nas últimas

décadas possibilitou a melhor compreensão dos mecanismos de resistência das bactérias Gram-


35

negativas aos antimicrobianos. Conhecidas pela sua capacidade de aquisição de diferentes

estratégias para se defender da agressão antimicrobiana, as bactérias Gram-negativas

constituem um desafio clínico e laboratorial.

2.3.1. Cefalosporinases e ESβL Associadas à Impermeabilidade de Membrana

Um dos primeiros mecanismos que a bactéria se utiliza para se tornar resistente aos

antimicrobianos é reduzir o acesso destes agentes aos seus alvos, impedindo assim a sua ação.

A redução de permeabilidade de membrana externa confere uma elevação nos valores da

concentração inibitória mínima (CIM) dos antimicrobianos, porém, também amplifica a resistência

conferida por outros mecanismos, sejam estes intrínsecos, mutacionais ou adquiridos (Rice,

2006). A impermeabilidade pode ser conferida pela diminuição da expressão das porinas,

proteínas de membrana externa (OMPs) que atuam como canal de entrada de nutrientes e

excreção de produtos do metabolismo bacteriano, que seriam tóxicos para a célula, assim como

porta de entrada para os agentes antimicrobianos hidrofílicos. Além disso, a hiperexpressão de

sistemas de efluxo também contribui com a impermeabilidade de membrana, pois são capazes

de ejetar as moléculas de antimicrobianos para o exterior da célula bacteriana pelas proteínas de

membrana externa.

Elevados graus de resistência podem ser observados quando a impermeabilidade de

membrana se associa a produção de β-lactamases. Estas se constituem na principal ferramenta

das bactérias Gram-negativas para se contrapor à agressão pelos agentes β-lactâmicos. A

primeira enzima descrita desta classe foi uma penicilinase isolada de E. coli, em 1940 (Abraham

& Chain, 1940). Apesar do desenvolvimento de penicilinas, cefalosporinas e carbapenens com

crescente estabilidade à hidrólise causada pelas β-lactamases, as bactérias passaram a se

adaptar produzindo enzimas com uma capacidade hidrolítica cada vez maior (Livermore &

Woodford, 2006).


36

Vários esquemas foram propostos para a classificação das β-lactamases, mas as

classificações de Ambler (1980) e Bush e colaboradores (1995) são as mais utilizadas. (Ambler,

1980; Bush et al., 1995). A classificação de Ambler se baseia na sequência de aminoácidos que

compõe as β-lactamases. Esta classificação propõe que as β-lactamases sejam divididas em

classes moleculares A, B, C e D. Em uma tentativa de facilitar a utilização da classificação das β-

lactamases, Bush e colaboradores (1995) propuseram uma atualização da classificação de Bush

(1989) levando em consideração o substrato preferencial da β-lactamase, o seu perfil de inibição

pelos inibidores de β-lactamases e EDTA, e os principais exemplos das espécies onde estas β-

lactamases eram encontradas. Estes autores ainda correlacionaram esta nova classificação

com a classificação molecular proposta por Ambler. Em 2010, a classificação de Bush, Jacoby &

Medeiros passou por uma nova atualização devido ao aumento do número de β-lactamases

descritas (Bush & Jacoby, 2010). Esta constitui a classificação mais utilizada até o momento e

encontra-se exemplificada na Tabela 3.

As enzimas do tipo AmpC pertencem ao grupo 1, ou classe C, e são encontradas em

enterobactérias, P. aeruginosa e Acinetobacter spp. Estas podem ser cromossomais, produzidas

constitutivamente em baixos níveis e/ou induzidas na presença de β-lactâmicos. Os genes que

codificam estes enzimas podem ser encontrados no cromossomo de algumas espécies de

enterobactérias, como Enterobacter spp., Serratia spp., Citrobacter spp., entre outras. Também

conhecidas como cefalosporinases, pela sua capacidade de hidrolisar penicilinas, cefamicinas e

oximino cefalosporinas (ceftazidima, cefotaxima e ceftriaxona), porém, sua atividade é limitada

contra cefepima (Bush et al., 1985).

Assim como em enterobactérias, as enzimas do tipo AmpC descritas em P. aeruginosa

são induzidas pela exposição aos agentes β-lactâmicos, especialmente à cefoxitina e ao

imipenem. Por meio de mutações nos genes que regulam sua produção, estas enzimas passam

a ser hiperexpressas, conferindo resistência às cefalosporinas de amplo espectro, inclusive à


37

cefepima (Rodriguez-Martinez et al., 2009). Frequentemente a desrepressão do gene ampC

opera conjuntamente com a perda da função da OprD, sendo este um frequente determinante de

resistência aos carbapenens em P. aeruginosa (Gutierrez et al., 2007; Rodrigues-Martinez et al.,

2009). Cabot e colaboradores (2011) avaliaram a expressão dos genes codificadores de AmpC,

OprD, e sistemas de efluxo em uma coleção de 190 isolados de P. aeruginosa. Neste estudo, os

autores observaram que todos os isolados resistentes ao imipenem apresentavam deficiência de

expressão da OprD (Cabot et al., 2011). Esta porina é a principal porta de entrada destes

compostos na célula bacteriana, especialmente o imipenem, e sua diminuição ou ausência em

isolados clínicos demonstrou elevar a CIM de imipenem de 1-2 µg/mL para 8-32 µg/mL.

(Livermore, 2001). Entretanto, Ocampo-Sosa e colaboradores (2012) observaram que mutações

no gene oprD estavam presentes em isolados de P. aeruginosa com diferentes fenótipos de

sensibilidade aos carbapenens, inclusive em isolados apresentando sensibilidade a ambos,

imipenem e meropenem (Ocampo-Sosa et al., 2012). Portanto, segundo alguns autores, é

necessária uma ação conjunta destes mecanismos, hiperexpressão de AmpC e deficiência de

OprD, para que a resistência à carbapenem seja expressiva nos isolados de P. aeruginosa

(Livermore, 1992).

Em contraste, a produção de AmpC em isolados de Acinetobacter spp. não é induzível.

Porém, a presença de elementos de inserção, como a sequência de inserção (IS), ISAba1, a

montante do gene blaAmpC pode promover a sua hiperexpressão e, consequentemente, à

resistência às cefalosporinas de amplo espectro (Héritier et al., 2006). Entretanto, a expressão

reduzida de OMPs e/ou seu menor tamanho contribui para a menor permeabilidade da

membrana de Acinetobacter calcoaceticus-baumannii, comparada à de P. aeruginosa (2 a 7

vezes menor para cefalosporinas) e E. coli (97 a 99% menor para carbapenens) (Sato & Nakae,

1991). A redução da expressão ou ausência de porinas, como a Omp33-36 (31 kDa) e a CarO


38

(29 kDa) foi relacionada à diminuição de sensibilidade a carbapenem em isolados de A.

baumannii (Clark, 1996; Limansky et al., 2002).

Em algumas enterobactérias genes codificadores de β-lactamases do tipo AmpC foram

descritos em elementos genéticos móveis (pAmpC). Nestas a produção de AmpC é elevada,

conferindo resistência às cefalosporinas de amplo espectro (Jacoby, 2009). No Brasil, apenas

raros relatos de AmpC plasmidiais foram reportados na literatura (Pavez et al., 2008; Campana

et al., 2013).

O grupo das β-lactamases de espectro extentdido apresentam grande importância

clínica pela capacidade de hidrólise de cefalosporinas de amplo espectro, inclusive cefepima, e

pela facilidade de disseminação entre bactérias Gram negativas. Essa disseminação ocorre pelo

fato de que os genes codificadores de ESβL são frequentemente carreados por elementos

genéticos móveis, concomitantemente aos genes que conferem resistência a outras classes de

antimicrobianos, como aminoglicosídeos, cloranfenicol e sulfametoxazol-trimetropim.

Consequentemente, a terapia antimicrobiana torne-se bastante restrita. Estas enzimas foram

reconhecidas logo após a introdução das cefalosporinas de amplo espectro na prática clínica

(Sirot et al., 1988; Jacoby et al., 1988). As ESβL originaram-se de β-lactamases de espectro

restrito, como TEM-1/TEM-2 e SHV-1, diferindo-se destas pela substituição de apenas um ou

dois aminoácidos em sua sequência (Bush, 2010). Enterobactérias também podem expressar

outras ESβLs que não estão relacionadas às famílias TEM e SHV, conhecidas como CTX-M.

Atualmente, a prevalência desta família de ESβL aumentou de forma considerável tanto nos EUA

como na Europa, porém, apresentam taxas ainda mais elevadas na América Latina e no sul da

Ásia (Castanheira et al., 2014; Cantón et al., 2008).

Em diversas espécies de enterobactérias, relatos de resistência aos carbapenens

multiplicaram-se na década de 90 em consequência da expansão de isolados produtores de

cefalosporinases plasmidiais ou cromossomais induzíveis do tipo AmpC, ou da produção de


39

ESβLs, em associação com a redução ou perda de expressão das principais OMPs (Bradford et

al., 1997; Bornet et al., 2000; Martinez-Martinez et al., 1999). A resistência aos carbapenens em

isolados de enterobactérias foi primeiramente reportada no início dos anos 90 (Chow & Shlaes,

1991). Neste estudo, Chow e Shlaes (1991) reportaram a resistência à imipenem em uma cepa

de E. aerogenes isolada de ICS, onde não foi observada nenhuma atividade hidrolítica mas sim

a ausência de uma OMP de 40 kDa. Subsequentes a este estudo, diversos autores confirmaram

os achados iniciais de que a alteração da permeabilidade da membrana externa associada à

hiperprodução de AmpC ou a produção de ESβL poderiam conferir às enterobactérias

resistência aos carbapenens (Bradford et al., 1997; MacKenzie et al., 1997). Em seu estudo,

Martinez-Martinez e colaboradores (1999) demonstraram a contribuição da porina OmpK36,

assim como de diferentes ESβLs e AmpC plasmidiais, na resistência às cefalosporinas e

carbapenens em dois isolados clínicos de K. pneumoniae que não expressavam as porinas

OmpK35 ou OmpK36. A elevação das CIM para cefalosporinas foi observada com a introdução

de genes produtores de ESβL e AmpCs, porém, a CIM de cefepime demonstrou apenas um

discreto aumento na presença de AmpC, de 1 µg/mL para 2 a 8 µg/mL. A restauração da

expressão da OmpK36, através da manipulação gênica, permitiu a redução das CIMs de

cefalosporinas de amplo espectro, tanto em isolados produtores de ESβLs como de AmpC.

Somente nos isolados produtores de AmpC, as CIMs de imipenem e meropenem reduziram de 4

a 6 log (Martinez-Martinez et al., 1999). Uma das justificativas indicadas pelos autores do estudo

para a ausência de observação de efeito das ESβLs nas CIMs dos carbapenens seria o tipo de

ESβL estudado, ou seja, variantes do tipo SHV e TEM. Em contraste, a família CTX-M parece

contribuir para este fenótipo quando associada à impermeabilidade de membrana.

Carvalhaes e colaboradores (ANEXO 1) observaram uma diminuição de sensibilidade

para ertapenem (CIMs; 16 a 64 µg/mL), imipenem (CIMs; 2 a 4 µg/mL), e meropenem (CIMs; 4 a

16 µg/mL) em isolados clínicos de K. pneumoniae que apresentavam produção de ESβLs (CTX-


40

M-2, CTX-M-15 e CTX-M-59) e a ausência de uma ou ambas as porinas, OmpK35 ou OmpK36

(ANEXO 1). Da mesma maneira, outros autores demonstraram que, apesar da ausência das

porinas não ser suficiente para conferir resistência aos carbapenens, quando associadas à

produção de β-lactamases, a elevação das CIMs destes antimicrobianos pôde ser observada

(Cornaglia et al., 1995; Girlich et al., 2009). Estes achados geraram inquietação na comunidade

médica, uma vez que, os compostos da classe dos carbapenens são os agentes de primeira

escolha para o tratamento de infecções causadas por micro-organismos produtores de ESβL.

Entretanto, não há estudos randomizados e controlados para embasar a superioridade destes

para o tratamento de micro-organismos produtores de ESβL (Kanj & Kanafani, 2011). Entretanto,

alguns estudos demonstraram que o tratamento com carbapenem foi um fator independente para

redução de mortalidade quando comparado a outros agentes com atividade in vitro no

tratamento de ICS por isolados de K. pneumoniae produtores de ESβL (Paterson et al., 2004;

Paterson, 2009).

Assim como a redução da expressão de porinas, a hiperexpressão de sistemas de efluxo

tem sido associada com a resistência a múltiplas classes de antimicrobianos, entre elas os

carbapenens, especialmente em P. aeruginosa. Constitutivamente, isolados selvagens de P.

aeruginosa expressam os sistemas de efluxo MexAB-OprM e MexXY-OprM, o que lhes confere

resistência intrínseca a diversos antimicrobianos. Estes diferem de outros sistemas de efluxo,

também descritos em isolados de P. aeruginosa, por não apresentarem expressão induzida por

seus substratos, como MexCD-OprJ e MexEF-OprN (Poole, 2005). Fluoroquinolonas, penicilinas,

cefalosporinas e aminoglicosídeos são substratos comuns dos sistemas de efluxo descritos em

P. aeruginosa, e atuam como agentes na pressão seletiva de mutantes com hiper-regulação

destes sistemas quando utilizados para o tratamento destas ou de outras infecções. Além destes

antimicrobianos, diferentes especificidades de substratos podem ser observadas entre os

sistemas de efluxo, por exemplo, MexAB-OprM apresenta efetiva atividade na ejeção de


41

moléculas de meropenem, mas não de imipenem, e MexXY-OprM é capaz de extruir cefepime

mas não ceftazidima (Livermore, 2001; Farra et al., 2008; Okamoto et al., 2002).

Embora pouco estudado em isolados de Acinetobacter spp. e de enterobactérias, os

sistemas de efluxo podem ter sua eficiência elevada quando os genes reguladores de sua

expressão sofrem mutações, resultando na hiperexpressão e aumento da resistência aos

antimicrobianos (Piddock, 2006). O sistema de efluxo AdeABC, frequentemente presente em

isolados de A. baumannii, quando hiperexpresso pode conferir resistência às fluoroquinolonas,

às tetraciclinas, ao cloranfenicol, à eritromicina, à tigeciclina e ao meropenem (Peleg et al.,

2007). Da mesma maneira, Findlay e colaboradores (2012) demonstraram que a hiperexpressão

do componente acrA do sistema de efluxo AcrAB-TolC em isolados de K. pneumoniae pode

contribuir para resistência ao meropenem (Findlay et al., 2012). Esta contribuição é cada vez

mais reconhecida como decorrente não apenas da ausência ou alteração nas porinas, mas

conjuntamente com a hiperexpressão de sistemas de efluxo que agravam de maneira

substancial a impermeabilidade da membrana bacteriana aos agentes antimicrobianos (Piddock,

2006).


42

Tabela 3. Classificação das β-lactamases adaptada de Bush & Jacoby (2010).

Grupo Funcional (Bush & Jacoby)

Classe Molecular (Ambler)

Substratos Inibidoresa Características Enzimas representantes Espécies bacterianas de

importância clínica Referência

AC ou TZB EDTA

1 C Cefalosporinas Não Não

Hidrólise preferencial de cefalosporinas que

benzilpenicilinas, hidrólise cefamicinas

E. coli AmpC, P99, ACT-1, CMY-2, FOX-1, MIR-1

Enterobactérias, P. aeruginosa e

Acinetobacter spp.

Zavascki et al., 2010

1e C Cefalosporinas Não Não

Hidrólise intensa da ceftazidima e

frequentemente de outros oximino β-lactâmicos

GC1, CMY-37 Enterobacter cloacae,

Citrobacter freundii

Crichlow et al., 1999; Ahmed &

Shimamoto, 2008

2a A Penicilinas Sim Não Hidrólise preferencial de

benzilpenicilinas que cefalosporinas

PC1 Staphylococcus aureus Pieper et al., 1997

2b A Penicilinas, cefalosporinas

espectro limitado Sim Não

Hidrólise similar de benzilpenicilinas e

cefalosporinas TEM-1, TEM-2, SHV-1 Enterobactérias

Bush & Jacoby, 2010

2be A cefalosporinas de espectro

extendido, monobactâmicos

Sim Não

Hidrólise intensa de oximino β-lactâmicos

(cefotaxima, ceftazidima, ceftriaxona, cefepime e

aztreoam)

TEM-3, SHV-2, CTX-M-15, PER-1, VEB-1


Acinetobacter spp.

Bush & Jacoby, 2010; Shakil et al.,

2010

2br A Penicilinas Não Não Resistência ao ácido

clavulânico, tazobactam e sulbactam

TEM-30, SHV-10 Enterobactérias Prinarakis et al.,

1997; Bradford et al., 2004


43

2ber A Cefalosporinas de espectro

extendido, monobactâmicos

Não Não

Hidrólise intensa de oximino β-lactâmicos

combinada à resistência ao ácido clavulânico, ao

tazobactam e ao sulbactam

TEM-50 Enterobactérias Sirot et al., 1997

2c A Carbenicilina Sim Não Hidrólise intensa da

carbenicilina PSE-1, CARB-3

Enterobactérias, P. aeruginosa

Medeiros et al., 1982; Lachapelle

et al., 1991; Melano et al., 2002

2ce A Carbenicilina, cefepima Sim Não Hidrólise intensa da

carbenicilina, cefepime e cefpiroma

RTG-4 A. baumannii Potron et al., 2009

2d D Cloxacilina Variável Não Hidrólise intensa de

cloxacilina ou oxacilina OXA-1, OXA-10 P. aeruginosa

Evans & Amyes, 2014

2de D Cefalosporinas de espectro

extendido Variável Não

Hidrólise da cloxacilina, da oxacilina e dos oximino-β-

lactâmicos OXA-11, OXA-15 P. aeruginosa

Evans & Amyes, 2014

2df D Carbapenem Variável Não Hidrolise da cloxacilina, da

oxacilina e dos carbapenens

OXA-23, OXA-48 Enterobactérias e Acinetobacter spp.

Evans & Amyes., 2014

2e A cefalosporinas de espectro

extendido Sim Não

Hidrolise das cefalosporinas, inibida por ácido clavulânico, mas não

aztreonam

CepA Bacteroides fragilis Rogers et al., 1993

2f A Carbapenem Variável Não

Hidrólise intensa dos carbapenens, dos oximino

β-lactâmicos e das cefamicinas

KPC-2, IMI-1, SME-1 Enterobactérias, P.

aeruginosa e Acinetobacter spp.

Walther-Rasmussen & Hoiby, 2007


44

3a B Carbapenem Não Sim

Espectro ampliado de hidrólise incluindo

carbapenem, mas não monobactâmicos

IMP-1, VIM-1, CcrA, IND-1


Acinetobacter spp.

Cornaglia et al., 2011

3b B Carbapenem Não Sim Hidrólise preferencial de

carbapenens CphA, Sfh-1

Aeromonas spp., Serratia fonticola

Massidda et al., 1991; Saavedra et

al., 2003

NI Unknown

a. Abreviações: AC - Ácido Clavulânico; TZB - Tazobactam.


45

2.3.2. Produção de β-lactamases: Carbapenemases

Dentre os mecanismos de resistência aos carbapenens, a produção de carbapenemases

talvez seja o mais temido, pois estas enzimas apresentam o maior espectro de atividade e,

geralmente, hidrolisamtodos os β-lactâmicos. Estas enzimas pertencem às diferentes classes

moleculares, podendo ser encontradas na classe A, B e D (Tabela 4).


46

Tabela 4. Características das principais carbapenemases reportadas.a

Classe Grupo de enzima

Enzima(s) Número de

variantes no grupo

Localização Exemplos de espécies em que foram encontradas

Classe A

SME SME-1 a SME-5 5 C S. marcescens

IMI IMI-1 a IMI-8 8 C e P E. cloacae, E. asburiae

NMC-A NMC-A 1 C E. cloacae

KPC KPC-2 a KPC-22 21 C e P K. pneumoniae, Salmonella enterica, K. oxytoca,

Enterobacter spp., E. cloacae, E. aerogenes, E. coli, P. aeruginosa, C. freundii

GES GES-2, GES-4 a GES-6, GES-16 5 C e P P. aeruginosa, K. pneumoniae, E. coli

Classe B

IMP IMP-1 a IMP-48 48 C e P P. aeruginosa, Entereobactericeae, A. baumannii, A.

xylosoxidans, A. baumannii, P. aeruginosa, P. putida, A. caviae

VIM VIM-1 a VIM-43 43 C e P P. aeruginosa, Entereobactericeae, A.baumannii, A. baumannii, P. aeruginosa, P. putida, A. hydrophila

SPM SPM-1 1 C e P P. aeruginosa

GIM GIM-1 1 P P. aeruginosa, Enterobacteriaceae

SIM SIM-1 1 P A. baumannii, Enterobacteriaceae

AIM AIM-1 1 P P. aeruginosa

KHM KHM-1 1 P C. freundii

NDM NDM-1 a NDM-12 12 C e P Enterobacteriaceae e A. baumannii

DIM DIM-1 1 P P. stutzeri

TMB TMB-1 e TMB-2 2 P A. xylosoxidans


47

Classe D

OXA-23-like OXA-23, OXA-27, OXA-49, OXA-73, OXA-102, OXA-103, OXA-105, OXA-133, OXA-134, OXA-146, OXA-165, OXA-

171, OXA-225, OXA-239 19 C e P

A. baumannii, A. junii, A. radioresistens, A. pitii, P. mirabilis, A. phenon 5, A. phenon 6/ct 13TU, A.

nosocomialis, A. genomic species 10/11, A. lwoffii, K. pneumoniae, A. baylyi

OXA-40-like OXA-40, OXA-25, OXA-26, OXA-72, OXA-139, OXA-160,

OXA-207 7 C e P

A. baumannii, A. haemolyticus, A. pittii, A. baylyi, P. aeruginosa, A. calcoaceticus, K. pneumoniae

OXA-51-like

OXA-51, OXA-64 - OXA-71, OXA, 75 a OXA-80, OXA-82 - OXA-84, OXA-86 a OXA-95, OXA-98 a OXA-100, OXA-104,

OXA-106 a OXA-113, OXA-115 a OXA-117, OXA-120 a OXA-128, OXA-130 a OXA-132, OXA-138, OXA-144, OXA-

148 a OXA-150, OXA-172 a OXA-180, OXA-194 a OXA-197, OXA- 200 a OXA-203, OXA-206, OXA-208, OXA-216, OXA-217, OXA-219, OXA-223, OXA-241, OXA-241, OXA-

248 a OXA-250, OXA-254

95 C e P A. baumannii, A. noscomialis, E. clocae, E. coli, K

pneumoniae

OXA-58-like OXA-58, OXA-96, OXA-97, OXA-164 4 C e P

A. baumannii, A pittii, A. nosocomialis, A. phenon 6/ct 13TU, A. junii, Acinobacter genomic species 9, A. bereziniae, A. calcoacetius, A. radioresistens, E.

cloacae, C. testosteroni, E. coli, K. pneumoniae, D. acidovorans

OXA-134a-like OXA-134a, OXA-186 a OXA-191 7 C A. lwoffii

OXA-143-like OXA-143, OXA-182, OXA-231, OXA-253, OXA-255 5 P A. baumannii, A. pittii

OXA-213 OXA-213 17 C A. calcoacetius

OXA-214-like OXA-214, OXA-215 5 C A. haemolyticus

OXA-211-like OXA-211, OXA-212, OXA-309 6 C A. johnsonii

OXA-229-like OXA-228 a OXA-230, OXA-257 8 C A. bereziniae

OXA-235-like OXA-235 a OXA-237, OXA-278 7 C A. schindleri


48

OXA-48-like OXA-48, OXA-48b, OXA-162, OXA-163, OXA-181, OXA-199, OXA-204, OXA-232, OXA-244, OXA-245, OXA-247

11 C e P E. cloacae, K. pneumoniae, E. coli, S. xiamenensis, C.

freundii, S. marcescens, P. rettgeri, K. oxytoca, E. sakazaii, A. baumannii

a. Adaptado de Cornaglia e colaboradores (2011), Walther-Rasmussen & Hɸiby (2007), Nordmann e colaboradores (2011), Queenan & Bush (2007), Evans &

Amyes (2014) e http://www.lahey.org/Studies/. Abreviações: C - localização cromossomal; P - localização plasmidial;

http://www.lahey.org/Studies/


49

2.3.3.1. Carbapenemases de Classe A

Há uma variedade de enzimas da classe A alocadas no grupo 2f. Algumas destas

enzimas são cromossomais, como NmcA, Sme, IMI-1 e SFC-1, e outras, geralmente, codificadas

por genes localizados em plasmídios, como KPC, IMI-2 e as variantes do tipo GES. Todas essas

β-lactamases apresentam uma serina no seu sítio ativo e hidrolisam efetivamente os

carbapenens, sendo parcialmente inibidas pelo ácido clavulânico (Nordmann et al., 2011). A

principal representante do grupo, KPC, foi primeiramente isolada em 1996 na Carolina do Norte

nos EUA, de uma cepa de K. pneumoniae resistente aos carbapenens (Yigit et al., 2001). Entre

2001 e 2004, apenas alguns isolados produtores de KPC foram recuperados nesta área

geográfica. A disseminção deste determinante de resistência foi documentada pelo NHSN, entre

os anos 2006-2007, onde 10% de todas as K. pneumoniae isoladas de ICS relacionadas à

cateter ou de infecção do trato urinário apresentavam resistência aos carbapenens nos EUA

(Hidron et al., 2008). A mesma enzima doi documentada em isolados de enterobactérias em

Israel, seguido da Europa, Ásia e América Latina ainda na mesma década (Nordmann et al.,

2011).

Embora o gene blaKPC esteja associado ao transposon Tn4401, os quais por sua vez

estão inseridos plasmídeos que podem diferir em tamanho e estrutura, além do conteúdo de

genes codificadores de diferentes β-lactamases (Nordmann et al., 2011). Apesar da comprovada

mobilidade do gene blaKPC em isolados de K. penumoniae, a disseminação primária deste agente

parece ocorrer, principalmente de maneira clonal, sendo o principal complexo clonal, CC258,

detectado ao redor do mundo (Temkin et al., 2014). No Brasil, os primeiros quatro isolados de K.

pneumoniae produtores de KPC foram encontrados em Recife, em 2006. (Monteiro et al., 2009).

Novos casos surgiram no Rio de Janeiro, entre os anos 2007 e 2008 (Peirano et al., 2009).

Entretanto, Pavez e colaboradores (2009), ao estudarem isolados recuperados entre os anos de

2003 a 2008, em São Paulo, observaram a presença do gene blaKPC em uma amostra isolada


50

em São Paulo em 2005 (Pavez et al., 2009). A disseminação rápida deste fator de resistência

elevou a taxa de resistência aos carbapenens em isolados de K. pneumoniae no país. Embora o

CC258 seja ainda o mais frequente entre amostras de K. pneumoniae produtores de KPC-2, o

gene blaKPC passou a ser adquirido por outros sequences types (STs) de K. pneumoniae ao

longo de seu estabelecimento no país (Nicoletti et al., 2012), assim como em outros locais, a

maioria destes isolados pertenciam ao CC258, apesar da diversidade de “” (STs) encontrados

(Nicoletti et al., 2012).

Embora exista um predomínio de K. pneumoniae e Enterobacter spp. produtores de

KPC, a transferência do gene blaKPC para outras bactérias Gram-negativas, como E. coli,

Enterobacter spp., S. marcescens, P. putida e P. aeruginosa, foi observada no Brasil e no mundo

(Nordmann et al., 2009; Zavascki et al., 2009; D'Alincourt et al.; 2010; Almeida et al., 2012;

Jácome et al., 2012). A despeito de haver, até o presente momento, 21 variantes de KPC

descritas, a KPC-2 e KPC-3 são as mais encontradas mundialmente, e no Brasil apenas a

variante KPC-2 foi reportada, até o momento.

A primeira enzima da família GES, a GES-1, foi isolada de um isolado de K. pneumoniae

na Guiana Francesa, e apresentava perfil hidrolítico de ESβL (Poirel et al., 2000). As enzimas do

tipo GES são peculiares, pois, uma mutação pontual no seu sítio ativo pode conferir-lhes

extensão da sua atividade hidrolítica, tornando-as carbapenemases. Algumas variantes com

estas características são, primordialmente, isoladas em P. aeruginosa na Ásia, África do Sul e

Brasil, e em Acinetobacter spp. na Turquia, Tunisia, Kuwait e França (Zavascki et al., 2010; Zeka

et al., 2014; Bonnin et al., 2011; Bonnin et al., 2013; Charfi-Kessis et al., 2014). Os genes que

codificam as carbapenemases do tipo GES estão localizados em integrons, na sua maioria

inseridos em plasmídios transferíveis, porém, já foram descritos inseridos no cromossomo de

algumas bactérias, como E. coli e P. aeruginosa (Walther-Rasmussen & Hoiby, 2007). No Brasil,

a primeira enzima da família, GES-1, uma β-lactamase de espectro extendido, foi descrita em P.


51

aeruginosa por Castanheira e colaboradores em 2004 (Castanheira et al., 2004). Em 2007, da

Fonseca e colaboradores reportaram a presença do gene blaGES-5 em três isolados de P.

aeruginosa recuperados da Região Norte do país em 2001 (da Fonseca et al., 2007). Estes

isolados eram sensíveis apenas a colistina. Posteriormente, GES-5 foi observada em um isolado

de K. pneumoniae subsp. ozaenae de vigilância ativa em São Paulo (Picão et al., 2010). E mais

recentemente, uma nova variante desta classe, a GES-16, foi descrita em um isolado S.

marcescens na cidade do Rio de Janeiro (Barbosa, 2011).

De menor importância clínica, as demais serino-carbapenemases do grupo estão

localizadas no cromossomo de espécies de enterobactérias, como SME, exclusiva de S.

marcescens, com cinco variante descritas até o momento no Canadá e EUA (Walther-

Rasmussen & Hoiby, 2007). Estudos com a variante SME-1 mostraram que esta enzima pode

ser produzida em níveis basais elevados por uma subpopulação de S. marcescens, porém, um

aumento de sua expressão foi observada na presença de imipenem (Naas et al., 1995). A família

IMI-1/NMC-A, refere-se a imipenemase/não MβL-A, e são distribuídas em 2 grupos, as NMC-A

derivam por oito substituições de duas variantes de IMI, que por sua vez diferem entre si por 2

substituições de amino ácidos na sequência proteica. Estas enzimas foram encontradas

esporadicamente em isolados clínicos de E. cloacae e E. asburiae, nos EUA, França, Argentina,

China e mais recentemente em Singapura, e em um isolado de Enterobacter spp. resistente a

colistina na Irlanda (Walther-Rasmussen & Hoiby, 2007; Boo et al., 2013; Teo et al., 2013).

Apresentam até o momento apenas oito variantes, e sua expressão pode ser induzida pela

presença de imipenem. As últimas representantes do grupo, SFC-1 e SHV-38, foram reportadas

apenas em S. fonticola (Portugal) e K. pneumoniae (França), respectivamente. Ambas são

capazes de hidrolisar o imipenem, e foram encontradas no cromossomo de seus hospedeiros.

SHV-38 difere da SHV-1 pela substituição de alanina por valina na posição 146, levando a uma

modificação estrutural que favorece a hidrólise de carbapenem (Walther-Rasmussen & Hoiby,


52

2007). Geralmente, estas enzimas da classe A são capazes de hidrolizar os carbapenens, mas

não apresentam atividade contra cefalosporinas de amplo espectro (Bush, 2010).

2.3.3.2. Carbapenemases de Classe B

Pertencente ao grupo funcional 3a, as MβLs são compostas por uma vasta gama de

enzimas, que em comum necessitam de moléculas de zinco interagindo no seu sítio ativo para

excercer sua atividade hidrolítica sobre todos os compostos β-lactâmicos, incluindo carbapenem,

com exceção do aztreonam. Desta maneira, tem sua atividade inibida na presença de agentes

quelantes de íons, como EDTA e ácido 2-mercaptopropiônico. Estas enzimas foram detectadas

inicialmente, nos anos 60, no cromossomo de isolados com pouca expressão clínica, como

Bacillus cereus, Aeromonas spp., e Stenotrophomonas maltophilia (Iaconis & Sanders, 1990;

Kuwabara & Abraham, 1967; Saino et al., 1982). Entretanto, apenas na década de 90, quando os

genes codificadores destas enzimas carreados por elementos genéticos móveis se

disseminaram para os principais patógenos Gram-negativos (P. aeruginosa e S. marcescens

produtoras de IMP-1 no Japão e A. baumannii produtor de IMP-2 na Europa), estas enzimas

foram reconhecidas com importante problema clínico (Watanabe et al., 1991; Osano et al., 1994;

Cornaglia et al., 2011). Atualmente, foram descritas 48 variantes de IMP (nomeadas devido a

sua atividade contra imipenem) e 43 variantes de VIM (Verona integron-encoded metallo-β-

lactamase), as maiores famílias do grupo, que inicialmente eram encontradas em bacilos Gram-

negativos não fermentadores, porém, disseminaram-se para espécies de enterobactérias, sendo

descritas em Enterobacter spp., E. coli, C. freundii, Klebsiella spp. e S. marcescens (Bush,

2010). Outras enzimas frequentes do grupo são GIM (German imipenemase) e SIM (Seoul

imipenemase), que assim como IMP e VIM, estão localizadas em uma variedade de integrons,

onde foram incorporados como genes cassetes (Queenan & Bush, 2007). A São Paulo metalo-

carbapenemase (SPM-1), descrita e restrita, até o presente momento, em amostras de P.


53

aeruginosa isoladas no Brasil, onde foi reportada a disseminação de um clone de P. aeruginosa

produtor de SPM-1 (Toleman et al., 2002; Gales et al., 2003). A única descrição de SPM-1 fora

do território brasileiro foi na Europa, especificamente na Suiça, porém com conexão

epidemiológica com o Brasil (Salabi et al., 2010). Assim como SPM-1, outras enzimas, DIM-1

(isolada na Holanda) e AIM-1 (Austrália imipenemase) contém apenas uma variante,

identificadas apenas em Pseudomonas spp. (Poirel et al., 2010; Zavascki et al., 2010). Em 2008,

Sekiguchi e colaboradores reportaram uma nova enzima da classe B, KHM-1, isolada de um

isolado clínico de Citrobacter freundii no Japão. Este apresentava resistência aos β-lactâmicos

com exceção de monobactans, e diminuição de sensibilidade aos carbapenens (Sekiguchi et al.,

2008). Recentemente, uma nova integrante do grupo das MBL foi descrita na Líbia, TMB-1, em

um isolado de Achromobacter xylosoxidans (El Salabi et al., 2012). Posteriormente, TMB-2 e

TMB-1 foram encontradas em isolados de Acinetobacter spp. no Japão (Suzuki et al., 2013;

Kayama et al., 2014).

A mais nova enzima do grupo das MβL foi descrita em um isolado de K. pneumoniae

resistente a todos os antimicrobianos testados, exceto colistina, proveniente da Índia (Yong et

al., 2009). Trata-se da New-Delhi metallo-β-lactamase (NDM), que atualmente conta com 12

variantes descritas (http://www.lahey.org/Studies/other.asp). A localização do gene blaNDM-1 em

plasmídios altamente transferíveis, possibilitou com que rapidamente casos no Reino Unido,

EUA e no sul da Ásia se alastrassem, em diferentes espécies de enterobactérias e inclusive em

A. baumannii (Rolain et al., 2010). No Brasil, o primeiro relato de NDM-1 foi em um isolado de

Providencia rettgeri na cidade de Porto Alegre, no Estado do Rio Grande do Sul (Carvalho-Assef

et al., 2013), seguido de E. cloacae, E. homaechei e Morganella morganii, nesta mesma região,

e em A. baumannii em Londrina (Rozales et al., 2014; Carvalho-Assef et al., 2014; Pillonetto et

al., 2014). Embora não tenha sido estabelecida uma ligação epidemiológica com o subcontinente

http://www.lahey.org/Studies/other.asp


54

indiano, o Rio Grande do Sul está geograficamente próximo ao Paraguai, onde foram descritos

casos de NDM (Pasteran et al., 2014).

2.3.3.3. Carbapenemases de Classe D

O primeiro grupo de CHDL identificado em isolados de A. baumannii foi o da OXA-23 no

Reino Unido, em 1985 (Paton et al., 1993). As CHDLs compreendem um grupo de enzimas

encontrados quase que exclusivamente em Acinetobacter spp., com exceção da OXA-48,

disseminada entre as enterobactérias. Atualmente, podem ser divididas em seis grupos, sendo

os mais importantes os grupos OXA-23, OXA-24/40, OXA-48, OXA-51, OXA-58 e OXA-143. As

propriedades cinéticas das enzimas do grupo OXA-23 variam bastante entre os estudos

publicados, porém, todos concordam que estas enzimas são capazes de hidrolisar oximino

cefalosporinas (com exceção de ceftazidima), amino penicilinas, piperacilina, oxacilina e

aztreonam, além dos carbapenens, porém, com baixa afinidade (CIMs ao redor de 16 µg/mL)

(Afzal-Shah et al., 2001; Smith et al., 2013). Apresentam maior atividade contra imipenem

quando comparado aos demais carbapenens. Entretanto, valores maiores de CIMs para

carbapenens são reportados quando isolados produtores de OXA-23 também expressam o

sistema de efluxo AdeABC (CIMs; > 32 µg/mL) (Evans & Aymes, 2014). Das 19 enzimas que

compõe este grupo, apenas a OXA-146, possui atividade contra ceftazidima. Este grupo parece

ter sido adquirido de A. radioresistens (Poirel et al., 2008). Em enterobactérias, a presença do

gene blaOXA-23 somente havia sido reportado no cromossomo de isolados de P. mirabilis na

França, até que recentemente, foi também encontrado em um plasmíde isolado de E. coli em

Singapura (Bonnet et al., 2002; La et al., 2014).

A principal enzima do grupo da OXA-24/40, que leva seu nome, foi isolada de um surto

de A. baumannii na Espanha em 1997, e, apesar de frequentes nesta espécie, também foram

reportadas em isolados de P. aeruginosa e K. pneumoniae (Bou et al., 2000; Evans & Aymes,


55

2014). Em geral, este grupo de enzimas, assim como as enzimas do grupo OXA-58, possui

atividade contra penicilinas, mas fracamente hidrolisam carbapenens, e não apresentam

atividade contra cefalosporinas de amplo espectro (Poirel & Nordmann, 2006).

Assim como as enzimas do grupo OXA-51, que ocorrem naturalmente em A. baumannii,

as enzimas do grupo OXA-134 são restritas, até o presente momento, a A. lowffii. Essas enzimas

não apresentam elevada expressão, uma vez que, isolados desta espécie são sensíveis a todos

os β-lactâmicos. O maior grupo, o da OXA-51, contém 95 variantes. Estas enzimas são

intrínsecas em A. baumannii, presentes em seu cromossomo, e apresentam fraca atividade

hidrolítica contra carbapenens (Héritier et al., 2005). Entretanto, as variações no espectro de

atividade observadas entre as diferentes enzimas deste grupo, mostram a necessidade de uma

melhor caracterização do perfil hidrolítico de cada enzima (Evans & Aymes, 2014). Em 2004,

foram reportados três isolados de A. baumannii resistentes a carbapenem e produtores de OXA-

143, no Brasil (Mostachio et al., 2012). Outras variantes do grupo da OXA-143, as enzimas OXA-

231 e OXA-253, ambas isoladas em A. baumannii no Brasil e em Honduras, respectivamente, e

OXA-255 em um isolado de A. pittii nos EUA (Zander et al., 2014).

Uma importante característica dos isolados de Acinetobacter spp. é a mobilização de IS,

como ISAba-1 e ISAba-3, pelo seu cromossomo. Presentes em transposons, em únicas ou

múltiplas cópias, ISAba1, foi descrita associada aos genes blaOXA-23 e blaOXA-51 em isolados

resistentes aos carbapenens, intensificando sua expressão (Mugnier et al., 2009; Segal et al.,

2007). Já, a ISAba3 é comumente encontrada a montante do gene blaOXA-58 (Corvec et al.,

2007).

Diferentemente de todos os grupos anteriores, o grupo da OXA-48 foi inicialmente

descrito em isolado de K. pneumoniae multirresistente, inclusive a carbapenem, na Turquia em

2001 (Poirel et al., 2004). Disseminadas entre espécies de enterobactérias, porém, também

descrito em A. baumannii, as enzimas deste grupo apresentam baixa atividade hidrolítica contra


56

carbapenens, entretanto, maior afinidade ao imipenem que aos demais carbapenens. As dez

variantes deste grupo podem diferir deveras em suas características cinéticas, sendo que a

OXA-163, apresenta-se com atividade de carbapenemase muito baixa, assemelhando-se muito

mais a um perfil de ESβL, com atividade contra ceftazidima e aztreonam (Poirel et al., 2011). No

Brasil, o primeiro isolado de uma variante do grupo OXA-48, a OXA-370, foi recentemente

reportado por Sampaio e colaboradores (2014). A enzima foi encontrada em um isolado de E.

hormaechei com redução de sensibilidade para impenem e resistência à ertapenem, em Porto

Alegre (Sampaio et al., 2014). O perfil hidrolítico desta enzima ainda não foi determinado.

2.4. Impacto Clínico da Resistência aos Carbapenens

Há décadas, diversos estudos observaram que a resistência aos antimicrobianos e a

terapia inadequada são fatores associados à mortalidade em pacientes com infecção por estes

patógenos (Falagas et al., 2008). Kollef e colaboradores (1998) observaram taxas de mortalidade

superiores em pacientes com PAV quando a terapia antimicrobiana inicial não era adequada

para o agente infeccioso (23,5% vs. 7,8%; p = 0,018) (Kollef et al., 1998). Da mesma forma,

Rello e colaboradores (1997), associaram a terapia empírica inadequada para tratamento de

PAV às maiores taxas de mortalidade (37% vs 15,6%, p < 0,05) (Rello et al., 1997). Esta

diferença mostrou-se ainda maior quando Ibrahim e colaboradores (2000) analisaram a

influência da terapia antimicrobiana inadequada na mortalidade de pacientes com ICS (61,9% vs

28,4%; p < 0,001), e risco relativo de 2,18 (IC: 1,77-2,69) (Ibrahim et al., 2000).

Os carbapenens constituem a terapia de escolha contra infecções graves causadas por

bactérias Gram-negativas, principalmente, àquelas adquiridas no ambiente hospitalar. A

resistência aos carbapenens põe em risco o sucesso da terapia com os carbapenens no

tratamento de infecções causadas por bactérias Gram-negativas multirresistentes. A diminuição

de sensibilidade a um ou mais compostos do grupo dos carbapenens pode ocorrer tanto pela


57

presença de carbapenemases como pela associação de impermeabilidade de membrana

externa e produção de AmpC e/ou ESβL (Zavascki et al., 2013). Amostras produtoras de

carbapenemases podem-se apresentar como sensíveis aos carbapenens, dificultando a

identificação destas amostras e, portanto, a introdução da terapia antimicrobiana adequada e a

implementação das medidas adequadas de controle (Munhoz-Price et al., 2013; Cohen Stuart et

al., 2010).

Apesar dos estudos que avaliaram o tratamento de infecções causadas por micro-

organismos produtores de carbapenemases serem compostos apenas por série de casos e

diferentes tipos de infecção, três estudos retrospectivos avaliaram, recentemente, a mortalidade

associada à terapia antimicrobiana em ICS causadas por enterobactérias produtoras de KPC. O

primeiro, conduzido por Tumbarello e colaboradores (2012), avaliou 125 casos e os autores

observaram elevada taxa de mortalidade em 30 dias (42%). Estes autores compararam a

monoterapia com a terapia combinada com dois ou três agentes, sendo que apenas a introdução

da combinação de colistina, tigeciclina e meropenem foi associada com maior sobrevida (OR

0,27; 95% CI 0,07-1,01; p=0,009) (Tumbarello et al., 2012). De maneira semelhante, Zarkotou e

colaboradores (2011), observaram taxa de mortalidade em 30 dias de 53% e taxa de mortalidade

atribuída à infecção de 34%, entre os 53 casos avaliados naquele estudo. No geral, a terapia

antimicrobiana apropriada foi introduzida em 35 pacientes, dos quais todos os pacientes tratados

com terapia combinada apropriada sobreviveram (20), enquanto que, entre os 15 pacientes

tratados com monoterapia, mesmo que apropriada e incluindo colistina, a taxa de mortalidade

associada à infecção foi de 47% (Zarkotou et al., 2011). Por fim, Qureshi e colaboradores (2012)

avaliaram 41 pacientes apresentando bacteremia secundária à pneumonia causada por K.

pneumoniae produtora de KPC. A taxa de mortalidade em 28 dias foi de 39%, sendo de 13,3%

no grupo que recebeu terapia combinada e 57,8% no grupo tratado com monoterapia (p=0,01)

(Qureshi et al., 2012).


58

Na tangente ao tratamento de outras bactérias Gram-negativas, incluindo P. aeruginosa,

o estudo retrospectivo observacional, caso-controle, conduzido por Kofteridis e colaboradores

(2010) avaliou a terapia endovenosa de colistina com a terapia combinando colistina endovenosa

e inalatória para tratamento de PAV causada por P. aeruginosa, A. baumannii ou K. pneumoniae

sensíveis apenas à colistina. Apesar de demonstrar que a terapia de vias combinadas (EV e

inalatória) apresentou maior taxa de cura clínica (p<0,05) e tendência de superioridade em

relação ao sucesso clínico e mortalidade, a análise multivariada apresentou apenas uma

tendência em relação à cura clínica pela terapia endovenosa associada à inalatória (p=0,08)

(Kolfteridis et al., 2010). No entanto, algumas razões poderiam explicar a falha em demonstrar

superioridade do regime de vias combinadas (EV e inalatória). Inicialmente, o número da

amostragem pode não ter atingido significância estatística suficiente para demonstrar diferenças

entre os dois grupos. O número de casos de pneumonia por A. baumannii (66; 77%) foi muito

superior aos demais patógenos, e o diagnóstico de PAV, mesmo com rígidos critérios

microbiológicos, pode não ser satisfatório, ou seja, é possível que casos de colonização tenham

sido considerados como PAV, prejudicando a análise estatística. Adicionado ao fato de que por

tratar-se de um estudo retrospectivo, a decisão da equipe médica assistente possa ter sido

influenciada pela gravidade da infecção no momento da escolha ou introdução da terapia

antimicrobiana.

Da mesma forma, no estudo de Peña e colaboradores (2013), apesar de prospectivo, a

escolha da terapia a ser instituída foi determinada pelo médico assistente (Peña et al., 2013).

Neste estudo os autores compararam a monoterapia adequada (uso de um agente anti-

pseudomonas sensível in vitro, exceto aminoglicosídeo) com a terapia combinada adequada

(uso de dois agentes anti-pseudomonas sensíveis in vitro) para o tratamento de ICS por P.

aeruginosa, e não observaram diferença na mortalidade em 30 dias. Entretanto, a terapia

combinada foi instituída com maior frequência em pacientes com pontuação ≥ 2 pelo score de


59

Pitt (67%) do que naqueles pacientes que apresentaram pontuação de Pitt < 2 (7%) (Peña et al.,

2013). A pontuação no score de Pitt é uma alternativa simplificada à pontuação de APACHE II

(Acute Physiology and Chronic Health Evaluation II score) para predizer o desfecho clínico de

pacientes com sepse em UTIs, e tem obtido preferência por diversos autores, não apenas por se

correlacionar adequadamente com seu objetivo, mas por não requerer dados laboratoriais para

sua determinação (Rhee et al., 2009). Ainda no estudo de Peña e colaboradores (2013), um

maior número de pacientes com bacteremia de alto risco (Infecção primária em trato respiratório,

sítio cirúrgico ou de origem indeterminada) receberam terapia combinada em relação àqueles

que apresentaram-se com bacteremia de baixo risco (Infecção primária em trato urinário ou

cateter intravascular). Fato este que pode ter resultado em viés na análise do desfecho clínico

dos pacientes em uso de terapia combinada (Peña et al., 2013).

Recentemente, os primeiros estudos clínicos randomizados, ambos avaliando a

combinação de colistina e rifampicina versus monoterapia com colistina para tratamento de

infecções graves por A. baumannii resistentes a carbapenem, foram publicados. No primeiro,

Durante-Mangoni e colaboradores (2013) avaliaram 210 pacientes em cinco centros médicos na

Itália. Os autores observaram 43% de mortalidade geral, sem diferença entre os grupos

estudados, porém, a taxa de erradicação microbiológica foi superior no grupo da terapia

combinada (Durante-Mangoni et al., 2013). De forma similar, Aydemir e colaboradores (2013),

demonstraram menor tempo para erradicação microbiológica no grupo de terapia combinada

(p=0,029). Neste estudo, apesar de não atingir significância estatística, possivelmente pelo

pequeno número de pacientes (n=43), os autores observaram maior taxa de mortalidade para

PAV causada por A. baumannii resistente a carbapenem no grupo tratado com monoterapia com

colistina (63,6%) ante ao grupo de terapia combinada (colisitna e rifampicina; 38%) (Aydemir et

al., 2013).


60

Deste modo, a prática médica urge, atualmente, por estudos randomizados e

controlados no campo do tratamento de infecções por bactérias Gram-negativas MDR. Segundo

Paterson & Rogers (2010), a gravidade das doenças e complexidade clínicas que usualmente

afetam os pacientes com infecções graves por estes agentes, assim como o suntuoso

financiamento necessário, dificultam a execução destes estudos (Paterson & Rogers, 2010).

Talvez, a randomização destes estudos devessem incluir informações quanto aos mecanismos

de resistência presentes nos isolados resistentes à carbapenem. Poderia se questionar se a

resistência conferida pela produção de carbapenemase responderia melhor à terapia combinada,

enquanto que na ausência desta, a monoterapia fosse suficientemente adequada para o

desfecho clínico favorável. Apesar das limitações metodológicas dos estudos retrospectivos, este

fato é observado nos estudos que avaliaram a terapia combinada versus a monoterapia para o

tratamento da infecção por enterobactérias resistentes a carbapenem devido à presença de

carbapenemase, acima descritos.

2.5. Metodologias Aplicadas à Detecção de Carbapenemases

A grande variedade de carbapenemases produzidas por patógenos de importância clínica,

além de suas diferentes características cinéticas dificultam a aplicação de um único teste para a

sua detecção. Diversas metodologias foram propostas e avaliadas, porém, não há uma única

metodologia disponível na prática clínica, até o presente momento, que seja rápida, prática, com

baixo custo e que apresente 100% de sensibilidade na detecção de todas as classes de

carbapenemases. A dificuldade diagnóstica contribui para a rápida disseminação destas enzimas

no ambiente hospitalar, assim como no atraso para instituição de terapia adequada, o que

consequentemente influenciou nas altas taxas de mortalidade.


61

2.5.1. Teste de Sensibilidade aos Antimicrobianos

O teste de sensibilidade é a primeira ferramenta para predizer a adequação da terapia

instituída, entretanto, os testes de sensibilidade apesar de imprescindíveis na prática clínica,

requerem muito tempo para que seus resultados estejam prontos. É necessário que o

crescimento e o isolamento do micro-organismo, assim como um período de incubação do teste

antes que os resultados sejam reportados, em média 48 a 72 horas. Tempo este, que, na

vigência de uma infecção grave, pode comprometer o desfecho clínico do paciente. Diversos

estudos demonstram a importância da rápida e adequada introdução da terapia antimicrobiana

em casos de infecções graves como pneumonias e ICS. Kumar e colaboradores (2006)

observaram um aumento na taxa de mortalidade intra-hospitalar com a introdução da terapia

antimicrobiana efetiva realizada após duas horas do início de um episódio de hipotensão em

pacientes com sepse quando comparada à introdução desta em apenas uma hora da hipotensão

(Kumar et al., 2006). Desta maneira, a redução do tempo dispendido para a realização dos

testes de sensibilidade aos antimicrobianos a fim de guiar a terapia antimicrobiana é de

fundamental importância para o desfecho clínico de pacientes com infecções graves.

A introdução dos sistemas de automação disponíveis para a determinação do teste de

sensibilidade possibilitou a redução do tempo para obtenção destes resultados (Sanders, 2000).

Entretanto, resultados equivocados podem ter sérias implicações no desfecho clínico do paciente

(Micek et al., 2005; Jorgensen & Ferraro, 2009). Diversos estudos reportaram falhas nestes

sistemas, especialmente envolvendo P. aeruginosa e enterobactérias testados contra agentes β-

lactâmicos, inclusive carbapenens (Sader et al., 2006; Steward et al., 2003). Sugere-se que

estes fatos possam ocorrer, ao menos em parte, devido ao efeito da densidade do inóculo e ao

período de incubação empregado pelos sistemas (Bratu et al., 2005). Markelz e colaboradores

(2011) também avaliaram a acurácia dos diversos sistemas automatizados na detecção da

sensibilidade de isolados do complexo A. calcoaceticus-baumannii aos carbapenens. Neste


62

estudo os autores relatam resultados bastantes discrepantes quando foram interpretados

utilizando-se os pontos de corte recomendado pelo EUCAST ou pelo CLSI (Markelz et al., 2011).

Além desta limitação, os testes de sensibilidade aos carbapenens podem falhar na

acurácia em predizer o desfecho clínico. A categoria de sensibilidade, segundo o documento do

CLSI (CLSI, 2014) implica que o isolado bacteriano é inibido pelas concentrações usualmente

alcançadas do agente antimicrobiano quando a dose recomendada para tratar o sítio de infecção

é administrada. Porém, diversos isolados de Enterobacteriaceae produtores de carbapenemases

(KPC, NDM, VIM e OXA-48) são considerados como sensíveis quando estes pontos de corte são

empregados, colocando em risco o uso da terapia adequada e consequentemente o sucesso

clínico. O sucesso clínico raramente é atingido quando o carbapenem é utilizado como

monoterapia no tratamento de infecções causadas por estes micro-organismos (Nordmann &

Poirel, 2013; Weisenberg et al., 2009; Cornaglia et al., 2011; Nordmann et al., 2011). Entretanto,

quando a diminuição de sensibilidade a um ou mais compostos do grupo dos carbapenens

ocorre devido a impermeabilidade de membrana externa associada à produção de ESβL ou

AmpC, a utilização de carbapenem como terapia antimicrobiana definitiva pode ser adequada

(Endimiani et al., 2010). Desta forma, a detecção da presença de carbapenemases, ao menos

em enterobactérias, é fundamental não apenas para fins epidemiológicos e controle de infecção,

mas também para dirigir a terapia antimicrobiana a ser empregada, especialmente, em infecções

graves e pacientes imunocomprometidos ou com agravantes comorbidades.

Nas enterobactérias, a sensibilidade aos diferentes compostos do grupo dos

carbapenens pode diferir deveras entre os isolados com diferentes mecanismos de resistência, a

até mesmo entre aqueles que produzem as mesmas carbapenemases. O teste de triagem

utilizando o disco de ertapenem é o indicador mais sensível da produção de carbapenemases,

porém, quando testes dilucionais são utilizados, os valores das CIMs de imipenem, meropenem

e doripenem podem ser úteis para a detecção destes micro-organismos (Levy Hara et al., 2013).


63

Apesar da elevada sensibilidade, o emprego do ertapenem na triagem de enterobactérias

produtoras de carbapenemases demonstra baixa especificidade, uma vez que a resistência a

ertapenem e sensibilidade a imipenem e meropenem ocorre também em isolados que

apresentam impermeabilidade de membrana externa e produção de ESβBL ou AmpC (Anexo 1).

O CLSI e o EUCAST recomendam que a suspeita de enterobactérias produtoras de

carbapenemases ocorra quando estes isolados apresentem diminuição de sensibilidade para um

ou mais carbapenens, e que testes confirmatórios devem ser realizados apenas para fins

epidemiológicos ou de controle de infecção. A mesma recomendação foi realizada pela ANVISA,

em 2013, porém, compondo seus critérios com dados tanto do CLSI como do EUCAST. Estes

pontos de corte podem ser observados na Tabela 5.

Tabela 5. Pontos de corte utilizados para triagem e para classificação da sensibiliade de

enterobactérias recomendados pelo EUCAST e CLSI.

CIM (µg/mL)

Halo de inibição (mm) com disco 10 µg

Ponto de corte

S/I Ponto de corte

triagem

Ponto de corte S/I

Ponto de corte triagem

EUCAST

Meropenem ≤ 2 > 0,12 ≥ 22 < 25

Imipenem ≤ 2 > 1 ≥ 22 < 23

Ertapenem ≤ 0,5 > 0,12 ≥ 25 < 25

CLSI

Meropenem ≤ 1 ≥ 2 ≥ 23 ≤ 22

Imipenem ≤ 1 ≥ 2 ≥ 23 ≤ 22

Ertapenem ≤ 0,5 ≥ 1 ≥ 22 ≤ 21

ANVISA

Meropenem ≤ 1 ≥ 2 ≥ 23 ≤ 22

Imipenem ≤ 1 ≥ 2 ≥ 23 ≤ 22

Ertapenem ≤ 0,5 ≥ 1 ≥ 25 ≤ 24


64

O CLSI e o EUCAST, além de diferirem quanto aos valores de triagem, também

recomendam distintos testes fenotípicos confirmatórios, e apenas convergem quanto ao valor

dos testes moleculares como padrão-ouro na determinação e caracterização das

carbapenemases (CLSI, 2014; EUCAST, 2013). O EUCAST, assim como a ANVISA, adotou o

teste fenotípico de disco combinado com diferentes inibidores, enquanto que o CLSI recomenda

a realização do MHT, até o presente momento (ANVISA, 2013).

2.5.2. Teste de Hodge Modificado

Em 1971, Orstavik & Odegaard descreveram um teste fenotípico para a detecção de

isolados de S. aureus produtores de penicilinases. Este foi denominado de teste da folha de

trevo (Cloverleft test), devido ao formato semelhante que os isolados com resultado positivo

apresentavam no ágar (Orstavik & Odegaard, 1971). O teste foi utilizado por Hodge e

colaboradores (1978) para detecção de penicilinase em isolados de Neisseria gonorrhoeae

(Hodge et al., 1978). Em 2009, o CLSI recomendou que o teste, modificado para a detecção de

carbapenemases, fosse realizado para os isolados de enterobactérias com diminuição de

sensibilidade a um ou mais carbapenens e resistentes às cefalosporinas de amplo espectro

(CLSI, 2009). Porém, em junho de 2010, o mesmo comitê, reduzindo os pontos de corte para a

combinação de enterobactérias com carbapenens, passou a recomendá-lo apenas para fins

epidemiológicos e de controle de infecção (CLSI, 2010).

A simplicidade do teste tornou-o muito difundido nos laboratórios de microbiologia,

especialmente em regiões onde testes moleculares não estão facilmente disponíveis, como no

Brasil. Este teste apresenta excelente sensibilidade para detecção de carbapenemases das

classes A e D, inclusive para aquelas de baixa atividade como OXA-23 e GES-5 (Hornstein et al.,

1997; Vourli et al., 2004; Thomas et al., 2013). Entretanto, amostras produtoras de NDM, VIM e

OXA-48 podem não ser identificadas por esta metodologia (Castanheira et al., 2011). O teste


65

também apresenta baixa especificidade, especialmente, onde a prevalência de enterobactérias

produtoras de ESβL ou AmpC é elevada, uma vez que isolados com alteração de

permeabilidade associada à produção destas enzimas podem apresentar resultados falso-

positivos no MHT (Anexo 1). Além disto, o teste requer um período de incubação de 16 a 20

horas na liberação dos resultados, o que leva a um retardo na liberação dos resultados e

possivelmente na adequação da terapia antimicrobiana.

2.5.3. Teste com Inibidores de Carbanemases

Na presença de inibidores específicos para as classes de carbapenemases, é possível

detectar a redução da atividade destas enzimas e aumento da sensibilidade dos isolados

bacterianos aos β-lactâmicos. Diversos testes fenotípicos foram criados e avaliados, sendo uma

opção interessante para a detecção de carbapenemases das classes A e B. Estes inibidores

também podem ser empregados na detecção de cepas produtoras de carbapenemases da

classe D, porém, como estas apresentam hidrólise fraca contra os carbapenens e outros

mecanismos de resistência associados estão presentes na amostra, o teste de inibição pode

falhar na detecção destas amostras. Recentemente, foi reportado que o avibactam apresenta

atividade inibitória também às enzimas da classe D, podendo tornar-se uma alternativa para um

teste fenotípico baseado em inibição (Huang et al., 2014). O mesmo princípio de inibição pode

ser utilizado empregando-se diferentes métodos, disco combinado, dupla difusão, fita combinada

e diferença das CIMs na presença ou ausência de determinado inibidor.

A utilização de testes inibitórios para a detecção de MβLs foi avaliada por diversos

estudos, utilizando diferentes inibidores e substratos. Yong e colaboradores (2002) observaram

100% e 95,7% de sensibilidade para P. aeruginosa e A. baumannii, respectivamente, quando o

disco combinado de EDTA-Imipenem foi empregado (Yong et al., 2002). Corroborando com

estes achados, Picão e colaboradores (2008) realizou um estudo avaliando separadamente


66

diferentes metodologias, substratos e concentrações de inibidores contra isolados de P.

aeruginosa, A. baumanni e enterobactérias produtoras de diferentes MβLs (GIM, IMP, SIM, SPM

e VIM) e concluiu que o disco combinado utilizando imipenem e ácido etilenodiamino tetra-

acético (EDTA) é uma excelente estratégia para enterobactérias. Enquanto que a dupla-difusão

utilizando ácido 2-mercaptopropiônico com 20 mm de distância dos discos de imipenem e

ceftazidima foi uma ótima estratégia para detecção destas enzimas em A. baumannii e P.

aeruginosa, respectivamente (Picão et al., 2008). Mais recentemente, outros estudos

demonstraram a habilidade da combinação EDTA-Imipenem em detectar a presença de NDM-1

em bactérias Gram-negativas (Solanki et al., 2013; Bonnin et al., 2012). Entretanto, resultados

falso-positivos, com isolados produtores de AmpC e ESβL, e falso-negativos, com isolados

produtores de VIM, foram descritos (Huang et al., 2014; Cassu-Corsi et al., 2014). A vantagem

do método é a simplicidade de sua execução e alta sensibilidade, entretanto, assim como o

MHT, requer um período prolongado de incubação (16-20 horas).

Da mesma forma, os excelentes resultados obtidos utilizando-se a inibição de imipenem

ou meropenem com ácido fenil borônico para detecção de carbapenemases da classe A,

especialmente KPC, fizeram deste teste uma opção para os laboratórios de microbiologia.

Entretanto, isolados coprodutores de AmpC e/ou ESβL, podem apresentar resultados falso-

positivos, uma vez que o ácido fenil borônico também é um potente inibidor de enzimas de

classe A e C (Tsakris et al., 2009; Pasteran et al., 2009). Baseando-se nos mesmos princípios,

fitas comerciais estão disponíveis utilizando as combinações de meropenem e meropenem/ácido

fenil borônico, e, imipenem e imipenem/EDTA para a detecção de carbapenemases das classes

A e B, respectivamente. Os estudos que avaliaram estes produtos mostraram bons resultados de

sensibilidade e especificidade para enzimas da classe A (sensibilidade 92%, especificidade 97%)

e classe B (sensibilidade 94%, especificidade 95%) (Walsh et al., 2002; Girlich et al., 2013;

Bonnin et al., 2012).


67

Em dezembro de 2013, o EUCAST publicou um documento recomendando a detecção e

confirmação da produção de carbapenemases em isolados de enterobactérias, apenas para fins

epidemiológicos ou de controle de infecção. Neste documento, após a triagem com disco (halo <

25 mm) ou CIM (> 0,12 µg/mL) de meropenem, combinações deste antimicrobiano com e sem

adição de ácido fenil borônico (PBA ou ácido aminofenil borônico; APBA), de cloxacilina, e de

ácido dipicolínico ou EDTA devem ser comparadas quanto ao halo de inbição e interpretadas

com diferentes critérios (EUCAST, 2013). De forma semelhante, porém, com algumas

modificações, a ANVISA recomenda em todo território nacional que testes com inibidores sejam

utilizados para os mesmos fins (ANVISA, 2013). As limitações destes testes são a incapacidade

de detecção de enzimas da classe D em qualquer isolado bacteriano, e da classe A em presença

de isolados co-produtores de AmpC, plasmidiais ou cromossomais, o que limita sua utilização

entre algumas espécies de enterobactérias.

Recentemente, Woodford e colaboradores (2014) publicaram um estudo demonstrando

a utilidade da temocilina como marcador da presença de OXA-48 entre isolados de

enterobactérias (Woodford et al., 2014). Associado a este fato, Huang e colaboradores (2014)

propuseram um teste de inibição utilizando a temocilina como substrato e o novo e potente

inibidor de β-lactamases das classes A, C e algumas representantes da classe D, o avibactam.

Os resultados foram promissores, uma vez que, usando o critério de inibição de ≥ 8 mm,

alcançou 97% de sensibilidade e 93% de especificidade para detecção de OXA-48 (Huang et al.,

2014). Porém, como para todos os testes com inibidores, os métodos moleculares ainda são

recomendados para a confirmação e determinação da enzima presente.

2.5.4. Testes Genotípicos

Os testes moleculares são considerados como padrão-ouro para a detecção e

caracterização dos genes que codificam as carbapenemases. Os testes realizados da colônia


68

bacteriana podem gerar resultados em 2 a 6 horas. A reação em cadeia da polimerase (PCR)

pode ser realizada para detectar um único alvo ou múltiplos, e ser realizada em três etapas,

extração, amplificação e detecção com gel de agarose (PCR convencional); em duas etapas,

extração e amplificação/detecção em tempo real (RT-PCR); ou, mais recentemente, em uma

única etapa, onde plataformas totalmente automatizadas são utilizadas (amostra-resultado).

Devido à grande diversidade das carbapenemases, em geral, as reações são direcionadas a um

grupo de enzimas, por exemplo, grupo VIM, grupo KPC, grupo IMP, grupo NDM, grupo OXA-23

(Poirel et al., 2011b; Monteiro et al., 2012; Mendes et al., 2007).

Algumas plataformas comerciais compreendendo uma grande variedade de enzimas em

um mesmo teste já encontram-se disponíveis (Hyplex, CheckPoints) e outras em

desenvolvimento (Film array, X-pert Carba-R). Cada uma apresenta diferentes genes alvos e

devem ser avaliadas com cuidado antes de sua implantação. Entretanto, estes testes não estão

isentos de limitações, a principal delas é a incapacidade de detectar novas enzimas, ou variantes

com mutações no sítio de anelamento dos iniciadores, seu custo e necessidade de profissionais

especializados (Levy Hara et al., 2013). Podem ainda detectar variantes que não apresentem

cinética compatível com outras carbapenemases do mesmo grupo (Poirel et al., 2012).

Recomenda-se que um resultado negativo nos testes moleculares com fenótipo de resistência

aos carbapenens seja confirmado por métodos que detectem atividade enzimática, como a

espectrofotometria (Cohen Stuart et al., 2010). Ainda que, raramente, diversos eventos podem

interferir na expressão de um gene. A detecção do gene que codifica determinada enzima pode

não garantir a sua expressão e a compatibilidade com o fenótipo observado (Pellegrino et al.,

2008). Para fins epidemiológicos, a identificação do gene da β-lactamase ainda requer o

sequenciamento integral de sua região codificadora, e a comparação da sequência obtida com

os bancos de dados, como o National Center for Biotechnology Information (NCBI) (Queenan &

Bush, 2007).


69

2.5.5. Testes Baseados na Detecção da Atividade Enzimática

Os testes baseados na detecção da atividade enzimática são considerados referência

entre os testes fenotípicos. São capazes de detectar novas enzimas ou variantes que

apresentem o perfil cinético procurado, por exemplo, de carbapenemase, utilizando-se o

respectivo substrato. Podem ainda ser associados aos inibidores de β-lactamases para a

determinação de sua classe molecular. O primeiro teste disponível foi a espectrofotometria. Mais

recentemente, a espectrometria de massa e a detecção da atividade enzimática pela colorimetria

foram propostas.

2.5.5.1. Testes Colorimétricos (Carba NP, CarbAcineto NP e Blue-Carba)

O teste CarbaNP basea-se na detecção bioquímica da atividade enzimática contra

imipenem, através da mudança de pH gerada pela reação de hidrólise do anel β-lactâmico e

seguida da visualização colorimétrica, utilizando-se o indicador de pH vermelho-fenol (Nordmann

et al., 2012). O teste apresentou elevada sensibilidade e especificidade para detecção de

carbapenemase em P. aeruginosa (94% e 100%, respectivamente) e enterobactérias (100%),

não apresentando resultados falso-positivos para a combinação de impermeabilidade de

membrana externa com a produção de ESβL ou AmpC (Dortet et al. 2012, Nordmann et al.,

2012). Entretanto, o teste falhou na detecção de variantes da família GES e OXA-48,

possivelmente pela baixa atividade de carbapenemase destas enzimas (Dortet et al., 2012; Tijet

et al., 2013). Tijet e colaboradores (2014) observaram dois resultados falso-negativos, uma P.

rettgeri produtora de NDM-1 e um P. mirabilis produtor de IMP-27, quando este teste foi

empregado. Os autores atribuiram estes resutados ao fenótipo mucóide da primeira e a

formação do chamado véu da segunda cepa, com consequente lise celular incompleta (Tijet et

al., 2014). Entretanto, a expressão destes genes não foi avaliada.


70

Com o objetivo de superar as dificuldades na detecção de CHDLs, Dortet e

colaboradores (2014) aprimoraram o teste Carba NP com modificações no inóculo bacteriano e

na solução de lise, chamando o de CarbAcineto NP. Importante ressaltar que as colônias

utilizadas para os testes foram cultivadas por uma noite em tryptic soy agar (TSB) (Dortet et al.,

2014). Neste estudo, os autores reportaram a detecção de todos os isolados produtores de

CHDLs, com exceção de três isolados apresentando resistência aos carbapenens em

decorrência da hiperexpressão da enzima OXA-51 pela presença da ISAba1 a montante do gene

blaOXA-51, além de oito isolados produtores de carbapenemases do tipo GES (GES-11 e GES-14).

A vantagem deste teste é a possibilidade de se obter um resultado em duas horas e a

simplicidade de sua execução, pois não requer o uso de equipamentos. Este teste será

recomendado para detecção rápida de carbapenemases no próximo documento do CLSI em

2015 e futuramente terá um kit comercialmente disponibilizado pela bioMérieux.

Uma modificação no teste CarbaNP foi proposta recentemente por Pires e colaboradores

(2013). A vantagem deste em relação ao CarbaNP é a possibilidade de detecção da atividade de

carbapenemase diretamente da colônia bacteriana, sem a necessidade de lise celular. Segundo

os autores, esta modificação foi alcançada pela substituição do indicador vermelho-fenol pelo

azul de bromotimol, com pH ótimo variando de 6,0 a 7,6 o que possibilita a melhor atividade

enzimática das carbapenemases (pH 6,8) (Pires et al., 2013). Entretanto, uma maior variação

das possíveis colorações do teste negativo e positivo pode ser um fator de dificuldade na prática,

de azul para amarelo, de verde para amarelo ou ainda de azul para verde, respectivamente. O

teste apresentou 100% de sensibilidade e especificidade para carbapenemases das classes A, B

e D, revelando o resultado entre 30 minutos e 2 horas, entretanto nenhuma variante de GES foi

testada (Pires et al., 2013).


71

2.5.5.2. Espectrofotometria

Este método é utilizado para a detecção da atividade hidrolítica de diversos substratos,

inclusive carbapenens, utilizando a luz ultravioleta em comprimentos de ondas específicos para

cada substrato, em um equipamento de espectrofotometria. O teste, utilizado nos laboratórios de

referência, é capaz de detectar e quantificar a velocidade da reação de hidrólise. Entretanto, é

um método trabalhoso, que requer o crescimento bacteriano em meio líquido por 16 a 20 horas,

a extração do conteúdo proteico e visualização em tempo real da curva de hidrólise após mistura

com o substrato. Bernabeu e colaboradores (2012) reportaram 100% de sensibilidade e 98,5%

de especificidade para detecção de carbapenemases (Bernabeu et al., 2012). Porém, isolados

produtores de carbapenemase com baixa atividade hidrolítica podem não ser detectados a não

ser que intensos inóculos sejam utilizados e maiores períodos de avaliação sejam utilizados

(Queenan & Bush, 2007).

2.5.5.3. Espectrometria de Massa - MALDI-TOF MS

A espectrometria de massa através da técnica de MALDI-TOF MS foi inicialmente

utilizada para a detecção da atividade enzimática de carbapenemases por dois pesquisadores

europeus, concomitantemente (Hrábak et al., 2011; Burckhardt & Zimmermann, 2011). O

princípio do teste baseia-se na detecção dos produtos de degradação do antimicrobiano em

questão e do desaparecimento de sua molécula íntegra após a incubação com bactérias

produtoras de carbapenemase. A metodologia requer que esta solução, depositada em

superfície sólida, seja misturada a uma matriz, que confere carga às moléculas do

antimicrobiano presentes na amostra e as cristalizam. Estas, através da incidência do laser,

sofrem um processo de dessorção, ou seja, desprendimento da superfície onde se encontram e

adentram um campo elétrico a vácuo, onde um detector no final do campo negativo atrairá as

moléculas ionizadas positivamente (Fenselau & Demirev, 2001). Estas migraram pelo campo


72

elétrico até alcançarem o detector, com velocidades inversamente proporcionais às suas massas

(tempo de vôo). Todo este processo ocorre de forma muito rápida, em menos de 1 minuto por

amostra.

A calibração prévia com moléculas de massas conhecidas na faixa de detecção da

amostra em questão é necessária para que o equipamento converta o tempo de vôo adquirido

pelo detector em picos no espectro de massa/íon (m/z) correspondente (Fenselau & Demirev,

2001). Outros importantes fatores relacionados à técnica são: (i) a capacidade das moléculas

presentes na amostra em adquirir cargas elétricas, pois moléculas com maior capacidade terão

maior chance de dessorção e alcançarão o detector em maior quantidade resultando em pico de

maior intensidade, sendo importante a razão entre amostra e matriz; (ii) a quantidade de amostra

presente; (iii) a intensidade e a frequência do laser empregada sobre a amostra, o que relaciona-

se também com a capacidade e frequência com que as moléculas alcançarão o detector; (iv) o

ajuste do intervalo de valores de m/z utilizado para a obtenção do espectro; e, (v) a automação

da aquisição do espectro através de software, que torna o espectro obtido menos subjetivo

(Fenselau & Demirev, 2001). Portanto, todos estes fatores podem interferir na qualidade da

aquisição dos espectros e impedem a quantificação direta de cada pico presente na amostra por

esta metodologia.

Apesar do espectro fornecer uma intensidade do pico, é importante ressaltar que esta

intensidade é relativa aos demais picos presentes na mesma amostra. Portanto, não é uma

técnica quantitativa, e sim qualitativa, sendo que os critérios adotados até a presente data para

categorizar os resultados em positivos ou negativos baseiam-se na presença ou ausência de

determinados picos de massa esperados (Hrábak et al., 2014). A técnica requer ainda a

expertise na interpretação dos resultados, uma vez que o conhecimento prévio das massas das

moléculas intactas, de seus aditivos em solução (moléculas de Na+, K+ e/ou H+), e dos produtos

correspondentes após a reação de hidrólise são requeridos para a interpretação dos resultados


73

(Zboromyrska et al., 2014). As empresas, fabricantes dos equipamentos atualmente disponíveis,

estão desenvolvendo uma programação que permita a identificação automática da atividade

enzimática para facilitar a sua implantação nos laboratórios de rotina.

As vantagens desta metodologia são: (i) a rapidez com que o teste fornece um

resultado. O tempo requerido refere-se ao período de incubação das amostras com a solução

contendo o antimicrobiano para que a reação ocorra, este tempo é dependente da capacidade

da enzima em hidrolizar o substrato, da quantidade do inóculo e da concentração do

antimicrobiano adicionado; (ii) a capacidade de detectar qualquer enzima que apresente

capacidade de hidrolisar o substrato, seja esta conhecida ou não; e, (iii) uma vez adquirido o

equipamento, o teste para detecção de carbapenemase requer poucos insumos e de baixo custo

(Kostrzewa et al., 2013). Entre suas limitações, pode-se citar: (i) a incapacidade do teste de

identificar a enzima presente, porém, esta limitação pode ser superada, em parte, pela a adição

de inibidores específicos, resultando na classificação desta enzima quanto à sua classe; (ii) a

necessidade de profissionais capacitados para interpretação dos resultados, fator que deve ser

superado no futuro próximo, com a automação da análise e interpretação dos resultados; e (iii) a

realização apenas em laboratório que disponha do equipamento de MALDI-TOF MS (Kostrzewa

et al., 2013).

A acurácia desta metodologia foi avaliada por Burckhardt e Zimmermann (2011) para

detecção de carbapenemases utilizando um ensaio com ertapenem. Neste, uma alça

bacteriológica de 10 µL contendo as colônias bacterianas crescidas por uma noite em ágar

sangue foi adicionada a 1 mL de solução de NaCl 0,45%, com ou sem 0,5 g/L de ertapenem. A

mistura foi então incubada a 36°C por até 2 horas e meia. A solução foi centrifugada e analisada

no equipamento de MALDI-TOF MS após adição da matriz (HCCA). Os autores detectaram a

atividade de carbapenemase em todos os isolados testados (n=47), os quais consistiam em

enterobactérias e P. aeruginosa produtoras de diferentes carbapenemases (NDM-1, IMP-1 e


74

IMP-2, KPC-2, VIM-1 e VIM-2). O tempo de incubação para a detecção de diferentes enzimas

variou de 1 hora para IMP-1 e NDM-1, 1 hora de meia para IMP-2, KPC-2 e VIM-1, e de 2 horas

e meia para VIM-2 (Burckhardt & Zimmermann, 2011).

No mesmo período, Hrábak e colaboradores (2011) avaliaram a acurácia da

metodologia, agora empregando como substrato o meropenem. Os resultados obtidos no

MALDI-TOF MS foram comparados àqueles obtidos por espectrofotometria. A solução na qual foi

diluida o meropenem, Tris-HCl 20 mM com pH 6,8, diferiu daquela utilizada pelo estudo anterior,

assim como o calibrante. Neste estudo o pico correspondente ao próprio meropenem foi utilizado

como calibrante, enquanto que no primeiro estudo, os picos conhecidos da matriz HCCA foram

utilizados com este propósito. Outras diferenças foram o meio de crescimento bacteriano

previamente a execução do teste, que neste estudo foi o Müeller-Hinton ágar, o inóculo

bacteriano, escala 8 de MacFarland, a matriz utilizada, ácido 2,5-dihidroxi-benzóico (DHT), e o

tempo de incubação de 3 horas. Excelentes resultados foram obtidos (97% de especificidade e

98% de sensibilidade) quando foram testados 14 isolados de P. aeruginosa e 16 isolados de

diferentes espécies de enterobactérias, sendo todos produtores de carbapenemases (VIM, IMP,

NDM-1 e KPC-2). Apenas um resultado falso-negativo foi observado em P. aeruginosa produtora

de VIM-2 e dois resultados falso-positivos em P. aeruginosa resistente a carbapenem. Segundo

os autores, não foi possível a visualização do pico correspondente à molécula do meropenem

degradado (Hrábak et al., 2011). Frente a estes únicos estudos publicados, com inúmeras

variações metodológicas entre si, iniciamos a padronização do teste para a detecção de

carbapenemase com isolados produtores de enzimas não antes testadas pelos estudos

apresentados. Adicionalmente, a padronização de um protocolo para identificação precoce de

micro-organismos causadores de ICS, e que permitisse a detecção de atividade de

carbapenemase diretamente do frasco de hemocultura foi o segundo objetivo deste estudo.

Objetivos

75

3. OBJETIVOS

Objetivos

76

Padronizar a detecção de carbapenemase pela técnica de espectrometria de massa por

MALDI-TOF MS;

Avaliar a acurácia da metodologia na detecção de carbapenemases em isolados clínicos

de bacilos Gram-negativos;

Padronizar a detecção de carbapenemases e identificação bacteriana diretamente de

amostras de hemocultura de pacientes com ICS pela técnica de espectrometria de

massa por MALDI-TOF MS.

Artigos Científicos

77

4. ARTIGOS CIENTÍFICOS

Artigos Científicos

78

4.1. Artigo Científico 1. Detection of SPM-1-Producing Pseudomonas aeruginosa and

Class D β-Lactamase-Producing Acinetobacter baumannii Isolates by Use of Liquid

Chromatography-Mass Spectrometry and Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-

Time of Flight Mass Spectrometry. Publicado em Janeiro de 2013 no periódico Journal of

Clinical Microbiology - JCM, volume 51, número 1, páginas 287-290. Os resultados parciais

desse estudo também foram apresentados na forma de poster (D-731a) na seção de MALDI-ToF

Mass Spectrometry and Identification and Susceptibility Testing no 52th Interscience Conference

on Antimicrobial Agents and Chemotherapy - ICAAC, realizado no período de 9 a 12 de setembro

de 2012 na cidade de San Francisco, EUA.

4.2. Artigo Científico 2. Detection of carbapenemase activity directly from blood culture

vials using MALDI-TOF MS: a quick answer for the right decision. Publicado em Agosto de

2014 no periódico Journal of Antimicrobial Chemotherapy - JAC, volume 69, número 8, páginas

2132-2136. Os resultados parciais desse estudo também foram apresentados na forma de

eposter (eP680) na seção de Rapid detection of carbapenemases no 23th European Congress of

Clinical Microbiology and Infectious Diseases - ECCMID, realizado no período de 27 a 30 de Abril

de 2013 na cidade de Berlin, Alemanha.

4.3. Artigo Científico 3. Detection of carbapenemase activity using Vitek® MS: Interplay of

carbapenemase type and period of incubation. Os resultados parciais desse estudo foram

apresentados na de pôster (D-897) na no 54h Interscience Conference on Antimicrobial Agents

and Chemotherapy - ICAAC, realizado no período de 5 a 9 de setembro de 2014 na cidade de

Washington, EUA. O presente será submetido ao periódico Jornal of Global Antimicrobial

Resistance no formato de New-Data Letter.

Artigo Científico 1

79

Detection of SPM-1-Producing Pseudomonas aeruginosa and Class D β-Lactamase-1

Producing Acinetobacter baumannii Isolates by Use of Liquid Chromatography-Mass 2

Spectrometry and Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass 3

Spectrometry 4

5

Cecilia G. Carvalhaes,a Rodrigo Cayô,a Diego M. Assis,b Evelin R. Martins,a Luiz Juliano,b,c Maria 6

A. Juliano,b Ana C. Gales.a 7

8

aLaboratório Alerta, Disciplina de Infectologia, Departamento de Medicina, Universidade Federal 9

de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, São Paulo, Brazil. 10

bDepartamento de Biofísica, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, São 11

Paulo, Brazil. 12

cFundação Parque Zoológico de São Paulo, São Paulo, Brazil. 13

14

*Corresponding author. 15

Current Address: Laboratório ALERTA, Universidade Federal de São Paulo - UNIFESP, Rua 16

Pedro de Toledo, 781, 6th floor, Vila Clementino, 04039-032, São Paulo - SP, Brazil. Phone/Fax.: 17

+55 11 5576-4748. E-mail: [email protected]. 18


80

Abstract 19

This study evaluates the accuracy of liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) and 20

matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) for 21

detecting carbapenem hydrolytic activity among SPM-1-, GIM-1-, and GES-5-producing 22

Pseudomonas aeruginosa isolates and OXA-143-, IMP-10-, and OXA-58-producing 23

Acinetobacter baumannii isolates. Class A and B carbapenemase activities were rapidly detected 24

by MALDI-TOF MS in a 2-h assay. However, an extended incubation time was necessary for 25

detection of carbapenem-hydrolyzing class D β-lactamase (CHDL) activity in Acinetobacter spp. 26


81

Over the last two decades, the therapeutic options to treat infections caused by Gram-27

negative rods have been narrowed by bacterial acquisition of carbapenemase-encoding genes 28

(1). The rapid detection of clinically significant carbapenemases is important for establishing 29

adequate therapy and controlling their spread. Recently, the detection of class A or B 30

carbapenemase activity has been accomplished by matrix-assisted laser desorption ionization-31

time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) (2,3). Although MALDI-TOF MS seems to be a 32

promising tool, there is a lack of evidence showing its usefulness in testing a broader range of 33

carbapenemases. To date, the published studies have mainly focused on KPC-2- and NDM-1-34

producing Enterobacteriaceae, IMP-1-, VIM-1-, and VIM-2-producing Pseudomonas aeruginosa, 35

and OXA-23- and OXA-24-producing Acinetobacter baumannii isolates (2–4). In the current 36

study, we evaluated the performance of the MALDI-TOF MS assay in detecting carbapenemase 37

activity of GES-5-, GIM-1-, or SPM-1-producing P. aeruginosa and IMP-10-, OXA-58-, or OXA-38

143-producing A. baumannii isolates which had not been tested previously. The detection of 39

carbapenemase by MALDI-TOF MS was compared to that of the modified Hodge test (MHT) and 40

hydrolysis assay. Additionally, liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) was used to 41

confirm the results of carbapenem hydrolysis obtained by MALDI-TOF MS. 42

A total of 73 carbapenemase-producing and non-carbapenemase- producing bacterial 43

clinical isolates were studied and molecularly characterized as shown in Table 1. Generally, no 44

carbapenemase- producing isolates were susceptible to imipenem (IPM) and meropenem (MEM), 45

except for three A. baumannii isolates (one OXA-23 and two IMP-10 producers) that showed 46

imipenem and/or meropenem MICs of 4 _g/ml by the agar dilution technique (5,6). In our study, 47

MHT using ertapenem (ETP) disks (10 µg), following CLSI guidelines, detected 55%, 100%, and 48

68% of carbapenem-hydrolyzing class D β-lactamase (CHDL) and class A and class B 49

carbapenemases, respectively. No additional carbapenemase producers were identified by 50

testing with meropenem disks (7). Recently, MHT was reported to have poor sensitivity and 51


82

specificity for detecting class B and D carbapenemase activity in carbapenem-resistant A. 52

baumannii isolates (8). Indeterminate and false-positive results by MHT were observed in our 53

study fornon-carbapenemase-producing P. aeruginosa and Klebsiella pneumoniae 54

ESβL/ΔOmpK36 isolates, respectively, as was observed previously (9,10,11). All carbapenemase 55

isolates hydrolyzed imipenem according to a UV spectrometric assay using 100 mM phosphate 56

buffer (pH 7.0) (9). 57

The LC-MS and MALDI-TOF MS assays were performed by incubating fresh bacterial 58

inoculums from Mueller-Hinton agar plates (Oxoid, Basingstoke, United Kingdom) in a buffer-59

adjusted solution (20 mM Tris-HCl, pH 6.8) with or without serial dilutions of ertapenem (0.12 to 60

0.5 µg/ml; Merck Sharp & Dohme, NJ) for periods of 2 and 4 h. This buffer solution was selected 61

since a NaCl solution could inhibit the CHDL activity. After centrifugation, 1-_l aliquots of each 62

sample were overlaid with 1 µl of -cyano-4-hydroxycinnamic acid matrix solution (HCCA; Bruker 63

Daltonics, Bremen, Germany) and spotted onto a stainless steel MALDI target plate as 64

recommended by the manufacturer. The mass spectrum was obtained by using a Bruker 65

Daltonics Microflex LT instrument operating in linear, positive ion mode and using the Flex 66

Control 3.3 software with the following instrument parameters: pulsed ion extraction delay, 30 ns; 67

ion source voltage one, 20 kV; ion source voltage two, 18.65 kV; and ion source lens voltage, 68

7.00 kV. The mass spectrometer was calibrated using the HCCA matrix peaks ([M+H]+ = 189.17; 69

[2 M+H]+ = 379.35) and bradykinin fragment 1-7 ([M+H]+ = 757.40). For each sample, mass 70

spectra were acquired by accumulating 100 laser shots at 45% to 60% laser power in the m/z 71

range of 200 to 600 Da. Carbapenem hydrolysis was considered positive if the ertapenem intact-72

molecule mass peak (475 m/z) and that of its monosodium salt (497 m/z) disappeared completely 73

(Fig. 1A and B2) (2). 74

LC-MS was performed in an LCMS-2020 instrument equipped with an electrospray 75

ionization probe (ESI-145; Shimadzu, Kyoto, Japan). Aliquots of 15 µl from each reaction tube 76


83

were applied directly into the instrument. The analytical LC-MS conditions were as follows: an 77

XR-ODS C18 column (2 µm, 3.0 by 100 mm) was eluted with solvent system A 78

(water/trifluoroacetic acid[TFA], 1:1,000) and B (acetonitrile/water/TFA 900:100:1) at a flow rate of 79

1 ml/min and a 0-to-80% gradient for 10 min, monitored by absorbance at 220 nm. The mass 80

spectrum profile was considered positive using the same interpretative criteria established for the 81

MALDI-TOF MS assay. 82

The performance of the MALDI-TOF MS, LC-MS and hydrolysis assays in detecting class 83

A (KPC-2 and GES-5) and B (SPM-1, IMP-1, IMP-10, VIM-1, GIM-1, and NDM-1) 84

carbapenemase activity was excellent for both 2- and 4-h incubation times (100% sensitivity and 85

100% specificity). A similar result was observed by Burckhardt and colleagues, who tested an 86

ertapenem MALDITOF MS assay to detect carbapenemase activity of NDM-1, VIM-1, VIM-2, and 87

KPC-2 enzymes in P. aeruginosa isolates and Enterobacteriaceae (2). In our study, an extended 88

incubation period (4 h) was necessary to detect carbapenemase activity in 100% of the CHDL-89

producing A. baumannii isolates, mainly due to OXA-23-producing isolates (Table 1). Probably an 90

extended incubation period was necessary for detection of the carbapenemase activity in CHDL-91

producing isolates because these enzymes usually show a low level of carbapenem hydrolysis 92

due to poor turnover of these β-lactams, as previously noticed by Queenan and Bush (12). In 93

addition, the expression of CHDL-encoding genes is driven by an upstream-inserted insertion 94

sequence, ISAba1 (13). LC-MS confirmed all MALDI-TOF MS results. Recently, Kempf and 95

colleagues observed a similar detection rate (95% sensitivity) in a collection of OXA-23- and/or 96

OXA-24-producing A. baumannii isolates by MALDI-TOF MS using imipenem and HCCA as the 97

substrate and matrix, respectively (4). In the present study, imipenem was not selected for the 98

MALDI-TOF MS because the mass spectrum profile obtained did not show good resolution with 99

overlap of mass peaks, even when different matrices were tested. It could be due to the MALDI-100

TOFMSsystem tested in our study, the Microflex LT instrument, since Kempf and colleagues 101


84

tested the Ultraflex I mass spectrometer. However, the Microflex LT instrument has been the 102

apparatus mostly available in the European clinical laboratories. 103

Although the hydrolysis assay yielded excellent results, this method is laborious to 104

implement in routine clinical laboratories. To our knowledge, this is the first study to evaluate the 105

performance of MALDI-TOF MS in detecting carbapenemase activity in a collection of SPM-1-, 106

GES-5-, and GIM-1-producing P. aeruginosa isolates, as well as OXA-143-, IMP-10-, and OXA-107

58-producing A. baumannii isolates. In addition, the MALDI-TOF MS results were confirmed by 108

using LC-MS. MALDI-TOF MS is a rapid tool to detect class A and B carbapenemase activity, 109

including that of SPM-1-producing P. aeruginosa, in a 2-h assay. However, an extended 110

incubation period of 4 h must be used for detection of CHDL activity. MALDI-TOF MS has been 111

shown to be an easy, rapid, and cheap methodology for the detection of carbapenemase activity. 112

It can yield results before those of antimicrobial susceptibility testing can be available and 113

constitutes a very attractive methodology, especially for clinical laboratories that have already 114

used this technique for bacterial identification. 115


85

Acknowledgments 116

The authors declare no conflicts of interest. The study was carried out as part of our routine work. 117

A.C.G. is a researcher from the National Council for Science and Technological Development 118

(CNPq), Ministry of Science and Technology, Brazil (process number 307816/2009-5). 119


86

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A simple test for the detection of KPC and metallo-β-lactamase carbapenemase-153

producing Pseudomonas aeruginosa isolates with the use of meropenem disks 154

supplemented with aminophenylboronic acid, dipicolinic acid and cloxacillin. Clin. 155

Microbiol. Infect. 17:1438-1441. 156

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expressing the blaOXA-23 gene associated with ISAba4 in Belgium. Antimicrob. Agents 161

Chemother. 52:4205-4206. 162


88

Table 1. Characterization of the 73 clinical isolates and performance of carbapenemase detection by different methodologies. 163

Bacterial Species Enzymes n°

Isolates

MIC range (μg/mL) Percentage of isolates detected as carbapenemase producers (n° positive isolates/ total isolates)

ETP IMP MEM MHT IMP Hydrolysis MALDI-TOF 2

hours MALDI-TOF 4

hours LCMS 2 hours LCMS 4 hours

Acinetobacter baumannii 31

Oxa-23 16 16 - >256 4 - 64 0.5 - 128 56% (9/16) 100% (16/16) 19% (3/16) 100% (16/16) 19% (3/16) 100% (16/16) Oxa-23 and Oxa-143 4 256 - >256 32 - 256 32 - 256 100% (4/4) 100% (4/4) 75% (3/4) 100% (4/4) 75% (3/4) 100% (4/4) Oxa-24 and Oxa-143 1 > 256 128 256 100% (1/1) 100% (1/1) 100% (1/1) 100% (1/1) 100% (1/1) 100% (1/1) Oxa-25 1 > 256 128 256 100% (1/1) 100% (1/1) 0% (0/1) 100% (1/1) 0% (0/1) 100% (1/1) Oxa-26 1 > 256 128 256 100% (1/1) 100% (1/1) 100% (1/1) 100% (1/1) 100% (1/1) 100% (1/1) Oxa-58 3 64 - 128 16 8 - 32 0% (0/3) 100% (3/3) 0% (0/3) 100% (3/3) 0% (0/3) 100% (3/3) Oxa-23, Oxa-143 and IMP-1 1 > 256 128 256 100% (1/1) 100% (1/1) 100% (1/1) 100% (1/1) 100% (1/1) 100% (1/1) IMP-10 3 8 - 128 0.5 - 31 4 - 64 67% (2/3) 100% (3/3) 100% (3/3) 100% (3/3) 100% (3/3) 100% (3/3)

Negative control 11 2-8 < 0.06 -

0.25 0.25 - 1 0% (0/11) 0% (0/11) 0% (0/11) 0% (0/11) 0% (0/11) 0% (0/11)

Klebsiella pneumoniae 8

KPC-2 1 32 8 8 100% (1/1) 100% (1/1) 100% (1/1) 100% (1/1) 100% (1/1) 100% (1/1) NDM-1 1 128 64 32 100% (1/1) 100% (1/1) 100% (1/1) 100% (1/1) 100% (1/1) 100% (1/1)

ESBL/∆OmpK36a 4 0.25 0.25 - 2 <0.06 -

16 0% (0/4) 0% (0/4) 0% (0/4) 0% (0/4) 0% (0/4) 0% (0/4)

Pseudomonas aeruginosa 26

GES-5 1 256 16 256 100% (1/1) 100% (1/1) 100% (1/1) 100% (1/1) 100% (1/1) 100% (1/1) GES-1 1 64 1 4 0% (0/1) 0% (0/1) 0% (0/1) 0% (0/1) 0% (0/1) 0% (0/1)

SPM-1 11 >256 128 - >256

64 - >256

64% (7/11) 100% (11/11) 100% (11/11) 100% (11/11) 100% (11/11) 100% (11/11)

IMP-1 1 >256 32 >256 100% (1/1) 100% (1/1) 100% (1/1) 100% (1/1) 100% (1/1) 100% (1/1) VIM-1 2 256 - >256 256 256 0% (0/2) 100% (2/2) 100% (2/2) 100% (2/2) 100% (2/2) 100% (2/2)

GIM-1 4 >256 128 - 256 256 - >256

100% (4/4) 100% (4/4) 100% (4/4) 100% (4/4) 100% (4/4) 100% (4/4)

Negative control 6 4 - >256 0.5 - 16 <0.06 -

32 0% (0/6) 0% (0/6) 0% (0/6) 0% (0/6) 0% (0/6) 0% (0/6)


89

a. ETP, ertapenem; IPM - imipenem; MEM - meropenem; MHT - modified Hodge test; MALDI-TOF - matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight 164

mass spectrometry; LC-MS - liquid chromatography-mass spectrometry. 165

b. Isolates previously characterized by Carvalhaes et al. (5). 166


90

167

Figure 1. (A) The hydrolysis of ETP mediated by β-lactamases occurs in two steps: in the first 168

step, the ETP intact molecule (475 gmol-1) suffers a rupture on its β-lactam ring, resulting in a 169

hydrolyzed ETP molecule (493 gmol-1). In the second step, the hydrolyzed ETP molecule loses a 170

carboxyl group (-CO2), resulting in a metabolite with a molecular mass of 450 g mol-1 (hydrolyzed 171

and decarboxylated ETP molecule). (B) Analysis of ETP degradation by MALDI-TOF MS. (B1) 172

Results for a negative-control strain incubated with ETP solution which appears ionized with 173

hydrogen ([ETP + H]+ = 475 gmol-1) and its sodium adduct ([ETP + Na]+ = 497 gmol-1). (B2) 174


91

Results for a hydrolyzed and decarboxylated ETP after incubation with SPM-1-producing P. 175

aeruginosa. Arrows represent HCCA matrix peaks. (C) Analysis of ETP degradation by LC-MS. 176

(C1) Results for a negative-control strain incubated with ETP which appears ionized with 177

hydrogen ([EPT + H]+ = 476 gmol-1). (C2) Hydrolyzed and decarboxylated ETP after incubation 178

with SPM-1-producing P. aeruginosa ([ETP + H]+ = 450 gmol-1). 179


92

Detection of carbapenemase activity directly from blood culture vials using MALDI-TOF 1

MS: a quick answer for the right decision 2

3

Cecilia G. Carvalhaes1*, Rodrigo Cayô1, Marina F. Visconde1, Talita Barone1, Eliete A. M. 4

Frigatto2, Debora Okamoto3, Diego M. Assis3,4, Luiz Juliano3, Antonia M. O. Machado2 and Ana 5

C. Gales1. 6

7

1Laboratório Alerta, Disciplina de Infectologia, Departamento de Medicina, Universidade Federal 8

de São Paulo - UNIFESP, São Paulo - SP, Brazil. 9

2Laboratório Central, Hospital São Paulo, São Paulo - SP, Brazil. 10

3Departamento de Biofísica, Universidade Federal de São Paulo - UNIFESP, São Paulo - SP, 11

Brazil. 12

4Bruker Daltonics, Atibaia - SP, Brazil. 13

14

Short running title: Carbapenemase detection in blood cultures by MALDI-TOF MS 15

16

*Corresponding author. 17

Current Address: Laboratório ALERTA, Universidade Federal de São Paulo - UNIFESP, Rua 18

Pedro de Toledo, 781, 6th floor, Vila Clementino, 04039-032, São Paulo - SP, Brazil. Phone/Fax.: 19

+55 11 5576-4748. E-mail: [email protected]. 20

mailto:[email protected]


93

Abstract 21

Objectives: Recently, matrix-assisted laser desorption ionization–time-of-flight mass 22

spectrometry (MALDI-TOF MS) was successfully applied for the detection of carbapenemase 23

activity directly from Gram-negative colonies. Based on this principle, we evaluated the 24

performance of MALDI-TOF MS for rapid detection of carbapenemase activity directly from 25

positive blood culture vials. 26

Methods: A total of 100 blood culture vials were randomly selected. MALDI-TOF MS 27

carbapenemase assay results were confirmed by the detection of carbapenemase-encoding 28

genes. 29

Results: A total of 110 bacterial isolates were recovered. The MALDI-TOF MS carbapenemase 30

assay identified 21 of 29 (72.4%) of the carbapenemase-producing isolates directly from the 31

blood culture vials, especially those encoding KPC-2 (100%) and SPM-1 (100%), after a 4 h 32

incubation period. Although the majority of OXA-23-producing Acinetobacter baumannii isolates 33

were not identified on day 1, all isolates were identified as carbapenemase producers directly 34

from the colony on the next day. 35

Conclusions: The MALDI-TOF MS carbapenemase assay is a feasible and rapid test to identify 36

carbapenemase activity directly from blood culture vials. It may contribute to faster readjustment 37

of empirical antimicrobial therapy and implementation of infection control measures. 38


94

Introduction 39

Recently, matrix-assisted laser desorption ionization-time-offlight mass spectrometry 40

(MALDI-TOF MS) has emerged as an important tool in clinical microbiology laboratories. This 41

methodology is fast, simple, accurate and cost-effective to routinely identify bacterial isolates.1 In 42

addition, it has been also applied for rapid identification of pathogens directly from positive blood 43

culture vials.2,3 However, the time required for reporting antimicrobial susceptibility results is still 44

of crucial importance for readjustment of antimicrobial therapy. Although MALDI-TOF MS has 45

been integrated into automated antimicrobial susceptibility testing platforms, these systems 46

habitually do not accurately report the carbapenem MICs for carbapenemase-producing 47

Enterobacteriaceae.4-9 Thus, the accurate detection of carbapenemase production is still 48

necessary. 49

MALDI-TOF MS has detected activity of different carbapenemases directly from bacterial 50

colonies with great specificity and sensitivity.10-12 It has the potential to detect carbapenemase 51

activity independent of the enzyme produced, including novel enzymes. Based on these facts, we 52

focused on evaluating the performance of MALDI-TOF MS for the first time to rapidly detect 53

carbapenemase activity directly from blood culture vials. 54


95

Methods 55

Standardization of bacterial pellet for carbapenemase detection. Initially, three 56

carbapenemase-producing strains (KPC-2-producing Klebsiella pneumoniae ATCC BAA 1705, 57

SPM-1-producing Pseudomonas aeruginosa 48-1997A and OXA-23-producing Acinetobacter 58

baumannii 2387-08A) and a negative control strain (K. pneumoniae ATCC BAA 1706) were 59

inoculated into four BD BactecTM Plus Aerobic blood culture bottles (Becton Dickinson, USA) 60

with an inoculum corresponding to 1000 cfu for each strain.13,14 The vials were then introduced 61

into a Bactec 9240TM blood culture system. 62

63

Clinical samples and routine blood culture procedures. After optimization of the pellet 64

extraction and carbapenemase assay detection, clinical blood culture vials were selected 65

randomly for the study during a 2 month period (October and November 2012). Routine bacterial 66

identification and antimicrobial susceptibility testing were performed by the PhoenixTM automated 67

system (Becton Dickinson, USA) and confirmed by MALDI-TOF MS and CLSI agar dilution, 68

respectively.15 69

70

Bacterial extraction for MALDI-TOF MS experiments. The investigators were blinded to Gram 71

stain results during MALDI-TOF MS experiments. The positive blood culture vials were submitted 72

to bacterial extraction, MALDI-TOF MS carbapenemase assay and bacterial identification. An 73

aliquot of 8 mL was retrieved from each positive blood culture vial on the same day that the 74

bacterial growth was flagged on the Bactec 9240TM blood culture system and placed into a sterile 75

tube containing a separator gel and clot activator (BD Vacutainer SST II AdvanceTM, Becton 76

Dickinson, USA). The tubes were centrifuged at 10,000 rpm for 10 min. The bacterial pellet was 77

visible at the outer surface of the separator gel. The supernatant was removed and the bacterial 78

pellet was washed with 1 mL of sterile water to obtain the bacterial inoculum. This mixture was 79


96

transferred to a 1.5 mL sterile tube. The clear bacterial pellet was tested for carbapenemase 80

assay following whole bacterial protein extraction for the identification procedure as previously 81

described.2,10 82

83

Detection of carbapenemase activity by MALDI-TOF MS. A fresh ertapenem solution (0.5 g/L) 84

was prepared using Tris-HCl 20 mM pH adjusted, as previous reported.10 A 500 mL aliquot of 85

ertapenem solution was added to the bacterial pellet tube, gently mixed and incubated at 37°C 86

for 2 and 4 h. The tubes were then centrifuged at 13,000 rpm for 2 min and 1 mL of the 87

supernatant was spotted onto a stainless steel MALDI target plate (Bruker Daltonics, Bremen, 88

Germany). One microlitre of a-cyano-4-hydroxycinnamic acid matrix solution (Bruker Daltonics, 89

Bremen, Germany) was placed on each spot and allowed to dry at room temperature. A mass 90

spectrum was obtained using a Bruker Daltonics Microflex LT instrument (Bruker Daltonics, 91

Bremen, Germany) operating in accordance with the manufacturer’s instructions as 92

recommended.10 Carbapenem hydrolysis was considered positive if the corresponding 93

ertapenem intact molecule mass peak (475 m/z and its monosodium salt, 497 m/z) completely 94

disappeared.10 In each assay, a fresh inoculum of K. pneumoniae ATCC BAA1705 and of K. 95

pneumoniae ATCC BAA1706 were tested as the positive and negative controls, respectively, as 96

well as a tube containing only the ertapenem solution. The detection of carbapenemase activity 97

by MALDI-TOF MS was also performed directly from the colonies of all Gram-negative isolates to 98

confirm the initial results. 99

100

Molecular characterization of carbapenemases. PCRs targeting genes encoding KPC-like, 101

NDM-1, OXA-48, metallo-β-lactamases and carbapenem-hydrolysing class D b-lactamases 102

(CHDLs) were performed using primers previously described followed by DNA sequencing of the 103

respective amplicons.13,16-19 104


97

Results 105

During the study period, 100 blood culture vials were flagged as positive and were further 106

evaluated. Among them, the presence of two different pathogens was detected in 10 positive 107

blood culture vials resulting in a total of 110 bacterial isolates. K. pneumoniae (27; 24.5%) was 108

the most frequent pathogen isolated, followed by coagulase-negative Staphylococcus (19; 17.3%) 109

and Escherichia coli (18; 16.4%). Overall, MALDI-TOF MS correctly identified 81.8% (90/110) of 110

bacterial isolates tested directly from blood culture vials and 97.2% (107/110) after colony 111

isolation. All positive blood culture vials were submitted to carbapenemase assay, including those 112

where Gram-positive bacteria were subsequently isolated. The MALDI-TOF MS carbapenemase 113

assay detected 21 isolates as carbapenemase producers directly from blood culture vials at the 114

time of positivity (day 1). Among those, 17 isolates (13 K. pneumoniae, 2 Enterobacter cloacae, 1 115

P. aeruginosa and 1 A. baumannii) were detected within a 2 h incubation period, while the 116

remaining 4 isolates (2 K. pneumoniae and 2 A. baumannii) required an extended incubation 117

period (Table 1 and Figure 1). Among the 11 carbapenemase-producing A. baumannii isolates, 118

only 3 isolates were directly detected from blood culture vials on day 1. The eight remaining 119

isolates were successfully identified as carbapenemase producers only by testing bacterial 120

colonies on the next day (day 2), making a total of 29 carbapenemase-producing Gram-negative 121

isolates detected by MALDI-TOF MS. As expected, all Gram-positive isolates yielded negative 122

results. Molecular characterization of carbapenemase genes was performed among the Gram-123

negative isolates (76/110; 69.1%). Among these, all 29 isolates (38.2%) detected by MALDI-TOF 124

MS as carbapenemase producers were confirmed to carry carbapenemase-encoding genes by 125

PCR and DNA sequencing (Table 1). The blaKPC-2 gene was detected in 17 Enterobacteriaceae 126

isolates (15 K. pneumoniae and 2 E. cloacae), followed by CHDL-encoding genes in 11 A. 127

baumannii isolates (blaOXA-23, n=10; blaOXA-72, n=1) and the blaSPM-1 gene in 1 P. aeruginosa 128

isolate (Table 1). The carbapenem MICs for carbapenemase-producing isolates are described in 129


98

Table 1. All CHDL-producing A. baumannii and SPM-1-producing P. aeruginosa isolates were not 130

susceptible to imipenem and meropenem by agar dilution and Phoenix. Moreover, all KPC-131

producing Enterobacteriaceae were not susceptible to ertapenemby either methodology. In 132

contrast, 7 of 17 KPC-producing isolates were susceptible to imipenem and meropenem by the 133

Phoenix system (MIC ≤1 mg/L). According to CLSI agar dilution, only a single isolate was 134

confirmed to be resistant to meropenem (MIC 64 mg/L) while six isolates were not susceptible to 135

imipenem (MICs 2-32 mg/L). 136


99

Discussion 137

Currently, according to CLSI and EUCAST guidelines, clinical laboratories should report 138

the category of susceptibility to carbapenems without confirming the production of 139

carbapenemases, since Gram-negative bacteria may possess other mechanisms of carbapenem 140

resistance. However, automated systems habitually fail to determine carbapenem MICs for 141

carbapenemase-producing Enterobacteriaceae. Consequently, based only on antimicrobial 142

susceptibility results, carbapenem prescription may be disregarded, leading to the use of more 143

toxic compounds. Recently, EUCAST developed a new guideline for the detection of resistance 144

mechanisms and specific resistances of clinical and/or epidemiological importance. Phenotypic 145

double-disc synergy tests have been recommended by EUCAST to detect carbapenemase 146

activity among Enterobacteriaceae isolates. However, these tests require an overnight incubation 147

period and molecular confirmation of the results is usually necessary. Molecular-based methods, 148

although more rapid and accurate, are unable to detect new carbapenemase-encoding genes, 149

require a high degree of expertise and are still expensive for routine use in some geographic 150

regions. In addition, the detection of a carbapenemase-encoding gene by PCR does not 151

guarantee its expression.20 MALDI-TOF MS is the latest advance to detect carbapenemase 152

activity. Recently, it was successfully employed to identify carbapenem hydrolysis products 153

directly from Gram-negative bacterial colonies.10-12 In our study, we report for the first time that 154

MALDI-TOF MS was able to detect carbapenemase activity directly from positive blood culture 155

vials for all KPC-2-producing and SPM-1-producing isolates. This is in accordance with previous 156

studies that demonstrated the high sensitivity (100%) and specificity (100%) of MALDI-TOF MS 157

for detecting the carbapenemase activity of KPC-2-, KPC-3- or SPM-1-producing isolates from 158

bacterial colonies.10-12 In contrast, the detection of CHDL activitywas not so easily achieved with 159

this methodology. Carbapenem resistance in Acinetobacter spp. is mainly mediated by the 160

production of CHDLs.21,22 In our study, all but one CHDL detected was OXA-23, which is the most 161


100

disseminated CHDL in A. baumannii worldwide.23 The majority of CHDLs weakly hydrolyse 162

carbapenems, which may compromise their detection by susceptibility testing and other 163

phenotypic tests. Therefore, PCR-based methods remain the “gold standard” for the identification 164

of CHDLs.22 In our study, the MALDI-TOF MS methodology was able to identify the 165

carbapenemase activity of all CHDL-producing Acinetobacter spp. isolates only when bacterial 166

colonies were tested and the assay was incubated for an extended period (4 h) as previously 167

observed.10 Therefore, MALDI-TOF MS may constitute an alternative to PCR-based methods for 168

the detection of CHDLs, but only after isolation of bacterial colonies. 169


101

Conclusions 170

MALDI-TOF MS has been revolutionizing bacterial identification in clinical laboratories, especially 171

due to its simplicity and rapid turnaround time. Similarly, the detection of carbapenemase activity 172

by MALDI-TOF MS directly from clinical blood culture vials may provide a quick answer for faster 173

readjustment of antimicrobial therapy and implementation of infection control measures. In 174

summary, MALDI-TOF MS empowers clinical laboratories to address a clinical demand for faster 175

results.176


102

Acknowledgements 177

This work was presented in part as an ePoster (eP680) at the Twenty-third European Congress 178

of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, Berlin, Germany, 2013. We thank Dr Jussimara 179

Monteiro and Dr Lygia Schandert for their valuable support during initial tests. 180

181

Funding 182

The study was carried out as part of our routine work. A. C. G. is a researcher from the National 183

Council for Science and Technological Development (CNPq), Ministry of Science and 184

Technology, Brazil (Process number: 307816/2009-5). 185

186

Transparency declarations 187

D. M. A. is an employee of Bruker Daltonics, Brazil, but he does not own stocks or options in the 188

company. A. C. G. has received research funding and/or consultation fees from Janssen-Cilag, 189

Wyeth/Pfizer, Novartis and Sanofi-Aventis. All other authors: none to declare. 190


103

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106

258

Figure 1. Analysis of ETP degradation by MALDI-TOF MS from carbapenemase-producing 259

isolate and non-carbapenemase-producing isolate. (A) Results for a non-carbapenemase 260

producing K. pneumoniae incubated with ETP solution which appears ionized with hydrogen 261

([ETP+H] = 475 g mol-1) and its sodium adduct ([ETP+Na] = 497 g mol-1) (light grey bars). The 262

hydrolyzed and decarboxylated ETP corresponding mass peak ([M+H = 449] – dark grey bars 263

may be present. The inserted structure represents the intact ETP. (B) Results for a hydrolyzed 264

and decarboxylated ETP ([M+H = 449] – dark grey bars) represented by inserted structure after 265

incubation with SPM-1-producing P. aeruginosa Arrows indicate the β-lactam ring where the 266

hydrolysis and decarboxylation reactions occur. Note that [ETP+H] = 475 g mol-1 and its sodium 267

adduct [ETP+Na] = 497 g mol-1 (light grey bars) have complete disappear. 268


107

Table 1. Carbapenem susceptibility profile and time in days for detection of carbapenemase-producing isolates by MALDI-TOF MS. 269

MIC range (µg/mL) Isolates detected as carbapenemase

producers by MALDI-TOF MS (n°)

Enzyme Microrganism (n°) Phoenix system Agar dilution Day 1a Day 2b

ERT IMI MER ERT IMI MER 2h 4h 2h 4h

KPC-2 K. pneumoniae (15) >4 <=1 - >8 <=1 - >8 2 - >256 1 - 128 1 - 128 13 15 15 15

KPC-2 E. cloacae (2) >4 >8 >8 >256 64 - 128 128 2 2 2 2

SPM-1 P. aeruginosa (1) - >8 >8 64 32 16 1 1 1 1

OXA-23 A. baumannii (10) - >8 >8 32 - 256 8 - 128 8 - 64 0 2 9 10

OXA-72 A. baumannii (1) - >8 >8 >256 64 128 1 1 1 1

ETP, ertapenem; IPM, imipenem; MEM, meropenem. 270

a.Day 1, direct from positive blood culture vials. 271

b.Day 2, direct from bacterial colony. 272


108

Detection of carbapenemase activity using VITEK® MS: Interplay of carbapenemase type 1

and period of incubation 2

3

Cecilia Godoy Carvalhaesa,b*, Ana Carolina Ramos da Silvaa, Ana Paula Strelinga, Rodrigo 4

Cayôa, Anna Carolina Rockstrohc, Antonia Maria Oliveira Machadob, Ana Cristina Galesa. 5

6

Short running title: Carbapenemase detection by VITEK® MS. 7

8

aLaboratório Alerta, Disciplina de Infectologia, Departamento de Medicina, Universidade Federal 9

de São Paulo - UNIFESP/EPM, São Paulo - SP, Brazil. 10

bLaboratório de Microbiologia Clínica, Disciplina de Medicina Laboratorial, Departamento de 11

Medicina, Universidade Federal de São Paulo - UNIFESP/EPM, São Paulo - SP, Brazil. 12

cbioMérieux do Brasil, Brooklin Novo, Rua Ponta Delgada, São Paulo - SP, Brazil. 13

14

*Corresponding author. Current Address: Laboratório ALERTA, Universidade Federal de São 15

Paulo - UNIFESP, Rua Pedro de Toledo, 781, 6th floor, Vila Clementino, 04039-032, São Paulo - 16

SP, Brazil. Phone/Fax.: +55 11 55764748. E-mail: [email protected]. 17



109

Dear Editor, 18

Recently, carbapenemase activity of Gram-negative bacilli has been detected by matrix-19

assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) (1-3). This 20

method relies on the modification of mass spectrum profile of the carbapenem molecule by 21

carbapenemases (4). Most studies have evaluated ertapenem hydrolysis by testing the Microflex 22

LT instrument (Bruker Daltonics, Dremen, Germany) (1,4,6-8). To the best of our knowledge, only 23

one recently published study evaluated the detection of carbapenemase activity by using VITEK® 24

MS instrument (bioMérieux, Marcy l’Etoile, France) (5). The authors reported a lack of sensitivity 25

(87%) by testing imipenem as substrate. Recently, we have accessed the performance of VITEK® 26

MS for detection of carbapenemase activity by testing a well characterized collection of 27

carbapenemase-producing strains against ertapenem activity. In addition, since carbapenem 28

hydrolysis may depend on many factors, especially carbapenemase type and time required for 29

complete β-lactam hydrolysis (4), the interplay among different classes of carbapenemases and 30

period of incubation required for carbapenemase detection by VITEK® MS instrument were also 31

addressed in the present study. 32

A collection of 73 carbapenem-producing and 28 non-carbapenemase-producing Gram-33

negative clinical isolates, previously characterized, were evaluated (Table 1) (4,9). The MALDI-34

TOF MS carbapenem hydrolysis assays were performed incubating 1 µL loop of fresh bacterial 35

colonies from Müeller-Hinton agar plates (bioMérieux S/A, Rio de Janeiro, Brazil) in 100 µL of a 36

buffer adjusted solution [Tris-HCl 20 mM pH 6.8] with or without ertapenem (ETP 0.25 µg/mL; 37

Merck Sharp & Dohme, NJ, USA), as previously described (4). The mass spectrum was obtained 38

by VITEK® MS instrument using SARAMIS software v.4.1.2 (bioMérieux, Marcy l’Etoile, France) 39

operating in linear, positive ion mode. Mass spectra were acquired by accumulating 200 laser 40

shots at 50-55% laser power in the m/z range of 400 to 600 Da, after instrument calibration using 41

α-cyano-4-hydroxycinnamic acid matrix solution (HCCA; bioMérieux, Marcy l’Etoile, France) and 42


110

ertapenem solution. Carbapenem hydrolysis was considered positive if the ertapenem intact-43

molecule mass peak ([M+H+], 476 m/z) and that of its monosodium salt ([M+Na+], 498 m/z) 44

completely disappeared. 45

The majority of classes A (62%) and B (61%) carbapenemase-producing isolates could 46

be detected after 15 minutes of incubation. Increasing detection rates of carbapenemase-47

producing isolates were directly proportional to the incubation period for all β-lactamases classes, 48

with significant improvement after 60 minutes of incubation for class A (95%) and B (87%) 49

carbapenemases. Corroborating the findings of previous studies, all carbapenem-hydrolyzing 50

class D β-lactamases (CHDLs) could be detected only after a 4h-incubation period, including an 51

Acinetobacter baumannii isolate possessing ISAba1 upstream blaOXA-51 (Fig. 1) (4,10). All KPC-2-52

producing isolates and all metallo-β-lactamases (MβL)-producing isolates, except for one IMP-1-53

producing A. baumannii isolates were detected after 2h-incubation period. A new Class A 54

enzyme, Brazilian Klebsiella Carbapenemase (BKC) showed poor carbapenemase activity and 55

could only be detected by VITEK® MS after an extended incubation period (4 hours) (11). No 56

false positive results were observed even after a 4-hour incubation period. 57

The VITEK® MS platform showed excellent performance in detecting carbapenemase-58

producing isolates using ertapenem. The majority of KPC and MβL-producing isolates were 59

detected by testing 1-h incubation period. However, a 4-h incubation period was necessary to 60

exclude carbapenemase activity in strains producing weak carbapenemases like BKC-producing 61

K. pneumoniae and OXA-producing A. baumannii. 62


111

Funding 63


Council for Science and Technological Development (CNPq), Ministry of Science and 65

Technology, Brazil (Process number: 307816/2009-5). We are grateful to the Fundação de 66

Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), which gave a Post-doctoral grant to R.C. 67

(protocol 2012/15459-6). 68

69

Transparency Declarations 70

A.C.G. has recently received research funding and/or consultation fees from AstraZeneca, Merck 71

Sharp & Dhome, and Novartis. A. C. R. is an employee of bioMérieux Brazil, but she does not 72

own stocks or options in the company. Other authors have nothing to declare. This study was 73

presented in part as poster (poster number D-897) at the 54th Interscience Conference on 74

Antimicrobial Agents and Chemotherapy - ICAAC, in Washington, DC, USA, 5-9 September 75

2014.76


112

REFERENCES 77

1. Burckhardt I and Zimmermann S. 2011. Using matrix-assisted laser desorption 78

ionization-time of flight mass spectrometry to detect carbapenem resistance within 1 to 79

2.5 hours. J. Clin. Microbiol. 49: 3321-3324. 80

2. Hrabák J, Walková R, Studentová V, Chudácková E, Bergerová T. 2011. 81

Carbapenemase activity detection by matrix-assisted laser desorption ionization-time of 82

flight mass spectrometry. J. Clin. Microbiol. 49: 3222-3227. 83

3. Sparbier K, Schubert S, Weller U, Boogen C, Kostrzewa M. 2012. Matrix-assisted 84

laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry-based functional assay for 85

rapid detection of resistance against β-lactam antibiotics. J. Clin. Microbiol. 50: 927-937. 86

4. Carvalhaes CG, Cayô R, Assis DM, Martins ER, Juliano L, Juliano MA, Gales AC. 87

2013. Detection of SPM-1-producing Pseudomonas aeruginosa and class D β-88

lactamase-producing Acinetobacter baumannii isolates by use of liquid chromatography-89

mass spectrometry and matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass 90

spectrometry. J. Clin. Microbiol. 51: 287-290. 91

5. Knox J, Jadhav S, Sevior D, Agyekum A, Whipp M, Waring L, Iredell J, Palombo E. 92

Phenotypic Detection of Carbapenemase-Producing Enterobacteriaceae by Use of 93

Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry and the 94

Carba NP Test. J Clin Microbiol. 2014; 52(11):4075-7. 95

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Intersci. Conf. Antimicrob. Agents and Chemother., abstr C1-1593c. 119


114

FIGURE LEGENDS 120

Figure1. Interplay of carbapenemase type and period of incubation (IP) for detection of 121

carbapenemase activity by testing VITEK® MS. 122


115

FIG. 1 123

124


116

Table 1. Interplay between the bacterial characteristics and incubation period required to detect the different classes of carbapenemase tested by VITEK® MS. 125

Ambler Class β-Lactamases Bacterial isolates Nº

Nº of isolates detected as carbapenemase-producers by Vitek® MS according to the incubation period (min)

15' 30' 60' 120' 240'

Car

bap

enem

ase-

pro

du

cin

g is

ola

tes

Class A

KPC-2 Serratia marcescens 13 12 13 13 13 13

KPC-2 Klebsiella pneumoniae 26 12 16 25 26 26

KPC-2 Enterobacter cloacae 1 1 1 1 1 1

KPC-2 Escherichia coli 1 1 1 1 1 1

BKC Klebsiella pneumoniae 1 0 0 0 0 1

Subtotal

42 26 31 40 41 42

Class B

IMP-1 Enterobacter cloacae 1 1 1 1 1 1

IMP-1 Serratia marcescens 1 1 1 1 1 1

IMP-1 Klebsiella pneumoniae 6 1 1 6 6 6

IMP-1 Acinetobacter baumannii 3 0 1 1 2 3

NDM-1 Klebsiella pneumoniae 1 1 1 1 1 1

NDM-1 Escherichia coli 1 1 1 1 1 1

GIM-1 Pseudomonas aeruginosa 1 1 1 1 1 1

VIM-1 Enterobacter cloacae 1 1 1 1 1 1

SPM-1 Pseudomonas aeruginosa 8 7 7 7 8 8

Subtotal

23 14 15 20 22 23

CHDL

OXA-51* Acinetobacter baumannii 1 0 0 0 0 1

OXA-23, OXA-143 Acinetobacter baumannii 2 0 0 0 0 2

OXA-58 Acinetobacter baumannii 1 0 0 0 0 1


117





Subtotal

8 0 0 1 2 8

Total

73 40 46 61 65 73

No

n-C

arb

apen

emas

e-

pro

du

cin

g is

ola

tes

CTX-M2 + Δ OmpK35/OmpK36

Klebsiella pneumoniae 8 0 0 0 0 0

ESβL (CTX-M15) Klebsiella pneumoniae 2 0 0 0 0 0

OXA-51 only Acinetobacter baumannii 2 0 0 0 0 0

none Klebsiella pneumoniae 12 0 0 0 0 0

none Escherichia coli 2 0 0 0 0 0

none Proteus mirabilis 1 0 0 0 0 0

none Burkholderia cenocepacia 1 0 0 0 0 0

Total

28 0 0 0 0 0

126

Discussão

118

5. DISCUSSÃO

Discussão

119

No Brasil, o primeiro relato de um isolado de K. pneumoniae produtor de KPC ocorreu

em 2006 (Monteiro et al., 2009). Até então, a resistência aos carbapenens em bactérias Gram-

negativas era mais comumente descrita em isolados de P. aeruginosa e A. baumannii produtores

de ML e/ou CHDLs (Sader et al., 2004), os quais eram facilmente reconhecidos pelos testes de

sensibilidade empregados. Em 2009, os laboratórios brasileiros, seguindo a recomendação do

CLSI (CLSI, 2009), passaram a realizar o MHT para confirmação da produção de

carbapenemase em isolados de enterobactérias que apresentassem redução de sensibilidade

para ao menos um carbapenem, já que cepas produtoras de KPC poderiam se apresentar como

sensíveis a estes compostos no antibiograma habitualmente realizado.

Com a disseminação de enterobactérias resistentes aos carbapenens pelo país, o

Laboratório ALERTA passou a receber diversos isolados positivos no MHT para a confirmação

molecular da produção de carbapenemases. Sendo assim, um total de 28 isolados de K.

pneumoniae, provenientes de oito hospitais brasileiros, apresentando redução de sensibilidade

aos carbapenens foram investigados em nosso laboratório (ANEXO 1). Estes isolados foram

distribuídos em 7 diferentes genótipos através da técnica de eletroforese em gel de campo

pulsado (PFGE). Embora o teste de MHT tenha sido realizado segundo as recomendações do

CLSI, optamos por também realizar o teste com inóculo maior. Nesse estudo, um total de 25% e

54% dos isolados testados com o inóculo padrão e o inóculo mais alto, respectivamente,

apresentaram MHT positivo quando utilizado o disco de ertapenem. Entretanto, nenhum desses

isolados apresentou hidrólise pela espectrofotometria ou carreavam os genes codificadores de

carbapenemase. Os resultados falso-positivos do MHT foram atribuídos à produção de ESL,

confirmada por PCR e sequenciamento dos genes relacionados, principalmente o gene blaCTX-M-2

(86%), associada à alteração de permeabilidade devido à ausência de uma (18%) ou ambas

(79%) as porinas, OmpK35 e OmpK36 (ANEXO 1).

Discussão

120

Resultados similares ao nosso estudo foram reportados por Pasteran e colaboradores

(2009) que descreveram 25% de resultados falso-positivos no MHT associados à produção de

CTX-M ou à hiperprodução de AmpC (Pasteran et al., 2009). Entretanto, segundo os autores,

apesar da baixa especificidade, o MHT apresentava elevada sensibilidade para detecção de

carbapenemases da classe A, especificamente KPC (Pasteran et al., 2009). Em outro estudo,

Girlich e colaboradores (2012) reportaram 100% de sensibilidade do MHT para a detecção de

carbapenemases das classes A e D em enterobactérias. Apesar disso no mesmo estudo,

resultados falso-positivos também foram reportados (55%; 11/20) entre os isolados produtores

de ESL ou hiperprodutores de AmpC (Girlich et al., 2012). No Brasil, a prevalência de

enterobactérias produtoras de ESL é elevada, chegando a 50% em isolados clínicos

hospitalares de K. pneumoniae (Gales et al., 2012), sendo a maioria destes (>90%) produtores

de CTX-M (Seki et al., 2013).

Com o objetivo de melhorar a especificidade do MHT para isolados brasileiros, Cury e

colaboradores (2012) estratificaram os resultados positivos em “verdadeiros-positivos”, quando o

crescimento da cepa de E. coli ATCC 25922 tocava o halo do disco de ertapenem, e

“inconclusivo” quando o crescimento não chegava a tocar o disco (Cury et al., 2012). Apesar de

elevar a especificidade do teste (>90%) nos isolados classificados como “verdadeiramente-

positivos”, o gene blaKPC-2 foi detectado em apenas 51% dos isolados incluidos no grupo

“inconclusivo” (N=154; 28%). Consequentemente, apesar de muitos laboratórios no Brasil ainda

utilizarem o MHT para detecção de carbapenemase, este deve ser utilizado com parcimônia em

regiões onde a produção de CTX-M é endêmica, pois outros testes serão ainda necessários para

a confirmação da produção de carbapenemases, o que poderia retardar ainda mais a liberação

dos resultados.

Após relatos de resultados falso-negativos pelo MHT para isolados de enterobactérias

produtores de NDM-1, a confiabilidade na sensibilidade do teste diminuiu ainda mais

Discussão

121

(Castanheira et al., 2011; Girlich et al., 2012). Embora algumas tentativas de modificações no

MHT tenham sido realizadas, elevando a sensibilidade, a baixa especificidade ainda é um fator

limitante do uso clínico deste teste. Uma dessas modificações foi a execução do MHT em ágar

MacConkey ou com a adição de sulfato de zinco ao ágar Müeller-Hinton (Lee et al., 2010; Girlich

et al., 2012). Além disso, o MHT também foi avaliado para isolados de P. aeruginosa, porém um

grande número de resultados inconclusivos foi observado, devido à inibição do crescimento da

cepa de E. coli ATCC 25922 ao redor dos isolados de P. aeruginosa (Lee et al., 2003; Pasteran

et al., 2011). Desta forma, apesar do CLSI ainda recomendar o uso do MHT para fins

epidemiológicos e de controle de infecção (CLSI, 2014), o EUCAST, assim como a ANVISA,

optaram pela recomendação de testes baseados na inibição da atividade de carbapenemases

para cada uma das classes moleculares de -lactamases (ANVISA, 2013; EUCAST, 2013).

Os testes baseados na inibição de carbapenemases, utilizando discos combinados ou

por dupla difusão, foram amplamente descritos devido à sua fácil execução e alta sensibilidade

(Tsakris et al, 2009; Pasteran et al., 2011; Giske et al., 2011). Inicialmente, estes testes foram

propostos para detecção de ML em isolados de P. aeruginosa, as quais geralmente

apresentam elevadas CIMs para carbapenens (Picão et al., 2008). Entretanto, o mesmo não

ocorre com isolados de Acinetobacter spp. e espécies de enterobactérias, nos quais as MLs

podem variar tanto na habilidade de conferir resistência aos substratos, ceftazidima e imipenem,

comumente utilizados para triagem dessas enzimas, quanto no grau de inibição por certos

compostos (Walsh et al., 2005). Consequentemente, não há um inibidor perfeito para a detecção

de todas as MLs, e algumas destas carbapenemases podem não ser detectadas por

apresentarem-se sensíveis ou com discreta redução de sensibilidade aos carbapenens,

especialmente as amostras pertencentes à família Enterobacteriaceae (Walsh et al., 2005).

Segundo Lee e colaboradores (2003), o teste com discos de EDTA é o mais acurado

para detecção de ML em P. aeruginosa, enquanto que o ácido mercaptopropiônico obteve

Discussão

122

melhores resultados para Acinetobacter spp. Entretanto, quando os dois inibidores foram

testados em conjunto em um único disco observou-se maior sensibilidade comparado ao teste

com cada composto isoladamente (Lee et al., 2003). Com o aumento do número de isolados de

enterobactérias coprodutoras de MLs (VIM e IMP) e KPC na Grécia, e relatos na Alemanha,

Itália, China e Colombia, a combinação de inibidores, como o EDTA e o APBA, foi proposta para

evitar resultados falso-negativos com os inibidores utilizados isoladamente (Giakkoupi et al.,

2009; Miriagou et al., 2013; Rojas et al., 2013). Apesar do tempo necessário de 24 horas para a

leitura dos resultados, os testes com inibidores são uma alternativa para a detecção de

carbapenemases em enterobactérias. Baseado nestes dados, o EUCAST recomendou o uso de

discos de meropenem associados ou não aos seguintes inibidores: (i) EDTA ou ácido dipicolínico

(DPA) para triagem de ML; (ii) PBA ou APBA para a detecção de carbapenemases da classe

A; e (iii) cloxacilina para distinguir isolados hiperprodutores de AmpC que poderiam falsear o

teste com PBA ou APBA (EUCAST, 2013). Segundo o estudo de Giske e colaboradores (2011),

o DPA apresentou menos resultados falso-positivos para isolados produtores de KPC, OXA-48 e

CTX-M-15 associada à alteração de porina em enterobactérias do que o EDTA (Giske et al.,

2011).

Embora discos combinados com inibidores estejam disponíveis comercialmente na

Europa, Doyle e colaboradores (2012) observaram baixa sensibilidade (78-80%) para a detecção

de ML em enterobactérias, devido ao grande número de isolados produtores de IMP e VIM (42-

50%) não terem sido detectados, apesar de alcançarem 100% de sensibilidade e especificidade

para aqueles isolados produtores de NDM-1 e 98-100% de sensibilidade e 93% de

especificidade para detecção de KPC (Doyle et al., 2012). Igualmente, Giske e colaboradores

(2011) reportaram 100% de sensibilidade do teste com APBA para a detecção de KPC, apesar

de resultados falso-positivos terem sido observados em isolados apresentando hiperprodução de

AmpC associado à alteração de porina. Entretanto, os autores relataram que tais isolados foram

Discussão

123

discriminados quando a cloxacilina foi testada, alcançando uma especificidade de 98% (Giske et

al., 2011).

Atualmente, não existe um inibidor eficiente capaz de detectar todas as CHDLs.

Entretanto, segundo van Dijk e colaboradores (2014), a presença de OXA-48 pode ser sugerida

pela ausência de sinergismo com inibidores de classe A e B, associada à resistência de alto grau

à temocilina (CIM ≥ 32 µg/mL) (van Dijk et al., 2014; Hartl et al., 2013; EUCAST, 2013).

Recentemente, a associação desse antimicrobiano ao novo inibidor de β-lactamase avibactam

(potente para classe A e alguns representantes da classe D, como a OXA-48) pode se tornar

uma alternativa para detecção de isolados produtores de OXA-48 em um futuro próximo (Huang

et al., 2014).

Atualmente, o récem-criado Comitê Brasileiro de Teste de Sensibilidade aos

Antimicrobianos (BrCAST) recomendará as diretrizes nacionais para a execução e interpretação

do teste de sensibilidade aos antimicrobianos. O BrCAST é composto por representantes das

quatro sociedades brasileiras, Sociedade Brasileira de Patologia Clínica/Medicina Laboratorial

(SBPC), Sociedade Brasileira de Microbiologia (SBM), Sociedade Brasileira de Infectologia (SBI)

e Sociedade Brasileira de Análises Clínicas (SBAC). Além disso, o comitê brasileiro traduzirá e

publicará os documentos do EUCAST para o público brasileiro, permitindo a ampla divulgação

dessas informações no âmbito nacional. As recomendações deste comitê para a suspeita e

confirmação da produção de carbapenemases ainda não estão disponíveis.

Até o momento, de acordo com as recomendações da ANVISA, testes com os inibidores

PBA e EDTA devem ser utilizados para a detecção inicial de cepas produtoras de

carbapenemases das classes A e B, respectivamente. O teste com cloxacilina também é

indicado para inibir a atividade de AmpC plasmidial (ANVISA, 2013). Entretanto, a mesma nota

técnica recomenda que testes moleculares sejam utilizados quando houver suspeita de produção

de carbapenemase entre isolados produtores de AmpC cromossomais (grupo CESP -

Discussão

124

Citrobacter spp., Enterobacter spp., Serratia marscescens, Proteus vulgaris, Providencia spp.,

entre outros).

No Brasil, o uso de testes moleculares ainda está restrito a poucos laboratórios de

microbiologia. Como Enterobacter spp. constitui a segunda espécie mais frequente de isolados

produtores de KPC no Brasil, o uso do teste com inibidores tem seu valor limitado para os

laboratórios de microbiologia em geral. Além desta limitação, os testes com inibidores, assim

como o MHT, requer tempo prolongado para confirmação do resultado, o que prejudica a rápida

liberação dos resultados e, consequentemente, a introdução de terapia adequada e a aplicação

de medidas de controle de infecção. Dessa forma, testes alternativos que apresentem maior

sensibilidade, especificidade e rapidez são necessários na prática laboratorial (Carmeli et al.,

2010).

Dentro deste cenário, uma nova metodologia revolucionou a microbiologia clínica pela

sua rapidez e acurácia na identificação de patógenos, a espectrometria de massa. Porém, o

teste de sensibilidade aos antimicrobianos ainda constitui uma limitação dessa técnica, e por

isso, atualmente, a detecção de resistência em isolados bacterianos é um dos maiores desafios

para a espectrometria de massa por MALDI-TOF MS (Kostrzewa et al., 2013).

A maioria dos estudos da literatura se concentrou na detecção da hidrólise de

compostos β-lactâmicos, especialmente os carbapenens (ANEXO 2), provavelmente devido a

urgente demanda por testes rápidos e acurados para detecção de um dos mecanismos de

resistência bacterianos mais temidos na prática clínica. Diferentemente dos ensaios acima

propostos, este representa um ensaio funcional, baseado no monitoramento molecular da

atividade enzimática das β-lactamases (Kostrzewa et al., 2013). O teste baseia-se na clivagem

enzimática do anel β-lactâmico, caracterizada pela adição de uma molécula de H2O, resultando

em um acréscimo de 18 Da no peso molecular do antimicrobiano. Entretanto, para alguns

antimicrobianos o produto originado é instável e a reação química, após a hidrólise, se completa

Discussão

125

com a perda de um grupo carboxila (CO2), resultando em um decréscimo de 44 Da no peso

molecular do produto final do antimicrobiano. Esta mudança de massa pode ser facilmente

monitorada pelo MALDI-TOF MS (Sparbier et al., 2012; Kostrzewa et al., 2013), como

demonstrado na Figura 1 do Artigo Científico 1.

Como toda reação química, o tempo necesário para ocorrer a hidrólise de qualquer

antimicrobiano presente em uma solução depende: (i) da concentração inicial do antimicrobiano;

(ii) da quantidade de enzima presente na amostra; e (iii) da velocidade de hidrólise da enzima

em questão (kcat/Km). O pré-requisito desta reação é a presença da enzima com atividade

hidrolítica sobre a molécula do antimicrobiano testado, outros mecanismos de resistência como

alteração de porina ou efluxo não são detectados (Sparbier et al., 2012).

Alguns pontos são críticos em relação a utlização desta técnica para a detecção de

carbapenemases, e a falta de padronização entre os diversos estudos pode ser observada na

Tabela 9 (ANEXO 2). O primeiro deles é o ajuste inicial do equipamento de MALDI-TOF MS,

cujo software deve permitir a adequação da faixa de massa a ser analisada. A identificação de

micro-organismos nestes equipamentos utiliza a faixa de massa entre 2 000 e 20 000 Da, sendo

que a molécula dos antimicrobianos possuem peso molecular abaixo de 500 Da. A otimização do

equipamento é necessária para obter resolução e sensibilidade suficiente na faixa de 0 a 1.000

Da. A calibração nesta faixa de massa com três ou mais massas conhecidas torna-se crítico para

a máxima acurácia do teste (Sparbier et al., 2012). Em nosso estudo, três pontos foram

utilizados para a calibração do equipamento, permitindo uma elevada acurácia dos espectros de

massas observados.

Em seu estudo, Sparbier e colaboradores (2012) monitoraram a mudança de massa de

diferentes β-lactâmicos após incubação com cepas controles, caracterizadas como produtoras

de ESL e KPC, além de controles negativos (E. coli DH5α e K. pneumoniae não produtora de

KPC) (Sparbier et al., 2012). Neste estudo, os autores demonstraram as massas esperadas de

Discussão

126

cada molécula de antimicrobiano testada (ampicilina, piperacilina, cefotaxima, ceftazidima,

ertapenem, imipenem e meropenem), assim como de seus aditivos de cátions (Na+ e K+) e

respectivos produtos após reação de hidrólise e descarboxilação. Ao testar os carbapenens, os

autores observaram diferentes comportamentos destes compostos em relação à adição de

cátions, descarboxilação das moléculas após a hidrólise e visualização dos produtos da hidrólise.

No momento da padronização de nosso ensaio de carbapenemase, os três compostos,

ertapenem, imipenem e meropenem foram testados e diluídos em concentrações crescentes

(Tris-HCl 20 mM), ajustando-se o pH para 6,8 (pH ideal para atividade das β-lactamases) (Artigo

Científico 1). A análise do espectro do imipenem mostrou um pico de 300 Da, correspondente a

sua massa molecular [M+H+]. Entretanto, não foram visualizadas adição de moléculas de cátions

(Na+ ou K+) ou dos seus produtos de hidrólise esperados após a incubação com isolados

produtores de carbapenemase (SPM-1 e KPC-2), apesar do pico de 300 Da ter claramente

desaparecido. Da mesma maneira, quando testado o meropenem, apesar da visualização dos

picos correspondentes a sua massa molecular ([M+H+], 384) e à adição de Na+ ([M+Na+], 406),

não foram visualizados picos esperados correspondentes aos produtos da hidrólise após

incubação com isolados produtores de KPC-2 e SPM-1. Porém os picos de 384 e 406 Da

desapareceram. Outros autores apresentaram resultados semelhantes, com desaparecimento

dos picos correspondentes às massas das moléculas intactas, porém sem visualização dos

produtos de hidrólise para imipenem e meropenem (Sparbier et al., 2012; Hrábak et al., 2011;

Knox et al., 2014). As possíveis explicações para este fenômeno são de que trata-se de produtos

instáveis ou de difícil ionização (o que seria um pré-requisito para a técnica de MALDI-TOF MS),

ou ainda que estes produtos poderiam se ligar às estruturas celulares e não estarem presentes

no sobrenadante analisado pela técnica (Sparbier et al., 2012).

Com o objetivo de melhorar a técnica, utilizando o ensaio com meropenem, Hrábak e

colaboradores (2012) sugeriram modificações na solução de diluição do meropenem,

Discussão

127

adicionando SDS a 0,01%, para evitar a aderência dos produtos às estruturas celulares.

Segundo o estudo, com este ajuste foi possível a visualização dos picos correspondentes às

moléculas de meropenem hidrolisada e descarboxilada adicionadas ou não a mol[eculas de

sódio ([Mhidr./desc.+H+], 358 Da; [Mhidr./desc.+Na+], 380 Da) (Hrábak et al., 2012). A interpretação dos

espectros de massas é o ponto mais crítico deste ensaio. Desta forma, a facilidade da clara

visualização dos picos das moléculas de ertapenem ([M.+ H+], 476 Da) assim como seu aditivo

de sódio ([M + Na+], 498 Da) e dos produtos de hidrólise correspondentes ([Mhidr.+H+], 494 Da;

[Mhidr./desc.+ H+], 450 Da e [Mhidr./desc.+ Na+], 472 Da), fazem com que este carbapenem seja a

molécula preferencial para ser testada contra isolados produtores de carbapenemases (K.

pneumoniae produtora de KPC-2, P. aeruginosa produtora de SPM-1 e Acinetobacter spp.

produtor de OXA-23) (Artigo Científico 1). O uso do ertapenem em um ensaio para detecção de

carbapenemases em isolados de P. aeruginosa e Acinetobacter spp. poderia ser questionável,

uma vez que este composto não tem atividade contra estes patógenos. Entretanto, a inatividade

deste composto ocorre por impermeabilidade da membrana nestes dois patógenos, sendo que

em P. aeruginosa é consequente à hiperexpressão de sistemas de efluxo e em Acinetobacter

spp. pela redução do tamanho das porinas. O princípio da detecção de carbapenemase pelo

MALDI-TOF MS está na capacidade das bactérias em modificar a molécula do ertapenem, o que

somente ocorrerá na presença de uma carbapenemase. Porém, como as β-lactamases

encontram-se no espaço periplasmático das bactérias Gram-negativas, o ertapenem precisa

entrar na célula bacteriana para sofrer modificação, o que pode justificar o maior tempo

necessário para a detecção de carbapenemases em isolados de Acinetobacter spp., onde o

influxo pode ser mais lento (Artigo Científico 1; Kempf et al., 2012; Lee et al., 2013). Este fato

associado à lenta capacidade hidrolítica das CHDL em geral, poderia explicar a demanda por um

período de incubação mais prolongado para isolados de Acinetobacter spp (Artigo Científico 1;

Queenan & Bush, 2007).

Discussão

128

Em nosso estudo, o ensaio utilizando o ertapenem como substrato durante 2 horas de

incubação, apresentou 100% de sensibilidade e especificidade para a detecção de

carbapenemase em enterobactérias e P. aeruginosa produtoras de diferentes enzimas, inclusive

as variantes de GES, para as quais resultados falso-negativos foram reportados com o teste

CarbaNP (Tijet et al., 2013; Artigo Científico 1). Até o momento, todos os estudos que

avaliaram a atividade de carbapenemase pela técninca de MALDI-TOF MS, utilizando o

ertapenem como substrato, reportaram 100% de sensibilidade e especificidade (Burkhradt &

Zimmermann, 2011; Sparbier et al., 2012; Hoyos-Mallecot et al., 2014; Lee et al., 2013; Vogne et

al., 2014). Portanto, este parece ser um excelente substrato para a detecção de

carbapenemases em enterobactérias e P. aeruginosa. Da mesma maneira, tais estudos

utilizaram o mesmo critério para a interpretação dos resultados, ou seja, a ausência dos picos

correspondentes à massa molecular do ertapenem e seus aditivos de cátion. Dessa forma, estes

estudos, apesar de diferirem em relação à concentração do antimicrobiano (de 0,25 a 0,5 g/L, ou

disco de 10 µg em 1 mL de solução), à solução utilizada (Tris-HCl 20 mM pH ajustado, NaCl

0,45% ou citrato de amônio) e ao tempo de incubação (de 1 a 12 horas), tornam-se comparáveis

quanto aos critérios interpretativos. Tornando-os mais próximos de uma possível padronização

inter-laboratorial do que aqueles que utilizaram como substrato o imipenem ou meropenem.

Os estudos que utilizaram imipenem como substrato, além de variarem quanto à

concentração do antimicrobiano (de 0,25 a 0,5 g/L), à solução utilizada (Tris-HCl 20 mM pH

ajustado ou NaCl 0,45% ou citrato de amônio) ou ao tempo de incubação (de 1 a 4 horas),

também diferiram quanto aos critérios de interpretação de positividade, possivelmente em

consequência à dificuldade de visualização dos picos correspondentes às moléculas

hidrolisadas, o que torna difícil a comparação entre os seus resultados (Sparbier et al., 2012;

Kempf et al., 2012; Alvarez-Buylla et al., 2013; Sauget et al., 2014; Knox et al., 2014). Entretanto,

a seleção deste substrato poderia trazer benefício para a detecção de CHDLs, especialmente em

Discussão

129

isolados de Acinetobacter spp., uma vez que constitui-se no substrato preferencial destas

enzimas (Queenan & Bush, 2007).

Entre os cinco estudos que avaliaram isolados de Acinetobacter spp., apenas dois

utilizaram imipenem como substrato (Kempf et al., 2012; Alvarez-Buylla et al., 2013). Kempf e

colaboradores (2012) testaram 63 isolados de Acinetobacter spp. produtores de OXA-23 (n=57),

OXA-24 (n=3) e coprodutores de OXA-23 e OXA-24 (n=3), alcançando 95% de sensibilidade

após duas horas de incubação e 100% quando o período de incubaçao foi ampliado para 4 horas

(Kempf et al., 2012). Da mesma forma, em nosso estudo, a incubação por quatro horas foi

suficiente para detecção de todos os isolados de Acinetobacter spp. produtores de CHDLs (OXA-

23, OXA-24, OXA-143, OXA-25, OXA-26 e OXA-58) utilizando ertapenem como substrato.

Porém, com duas horas de incubação, apenas 33% destes isolados teriam sido reconhecidos

como produtores de carbapenemase. O mesmo período foi reportado por Lee e colaboradores

(2013), em ensaio semelhante ao nosso (Lee et al., 2013). Já no estudo de Alvarez-Buylla e

colaboradores (2013), os autores compararam diferentes soluções, inóculos bacterianos e

concentrações de imipenem com objetivo de potencializar a reação e minimizar o tempo de

detecção de isolados de Acinetobacter spp. produtores de IMP e diferentes CHDLs (Alvarez-

Buylla et al., 2013). A melhor combinação encontrada, segundo os autores, constituiu-se no

conjunto de Tris-HCl ou NaCl, 1 g/L de imipenem e 1010 UFC/mL de inóculo bacteriano com uma

hora de incubação. Nessas condições, os autores detectaram 100% dos isolados testados.

Entretanto, diferentemente do critério utilizado por Kempf e colaboradores (2012)

(desparecimento do pico 300 Da), Alvarez-Buylla e colaboradores (2013) utilizaram critérios mais

subjetivos, como a redução significativa dos picos de 300 Da e 489 Da, sendo a massa de 489

Da correspondente à composição do imipenem com a matriz. Esta modificação no critério de

positividade poderia explicar a diferença no tempo de detecção entre os dois estudos, uma vez

Discussão

130

que no estudo de Alvarez-Buylla e colaboradores (2013) a hidrólise de todo conteúdo de

imipenem pela amostra foi necessária para classificá-la como positiva.

Entre os estudos que avaliaram a detecção da atividade de carbapenemase de isolados

produtores de OXA-48, dois utilizaram o imipenem como substrato. Sauget e colaboradores

(2014) detectaram 99% dos 92 isolados de enterobactérias produtoras de OXA-48, com 97% de

especificidade, utilizando uma hora de incubação, e a razão entre as áreas dos picos do

imipenem e de seu metabólito como critério de positividade (Sauget et al., 2014). Entretanto,

este é o único estudo na literatura que reporta o pico de 254 Da como correspondente a um

metabólito da hidrólise do imipenem. Knox e colaboradores (2014) também utilizaram o

imipenem para detectar a produção de carbapenemases em enterobactérias, dentre as quais a

OXA-48 (n=4). Naquele estudo, os autores compararam estes resultados com o teste CarbaNP

(Knox et al., 2014). Os autores consideraram apenas o desaparecimento do pico de 300 Da,

como critério de positividade. Todos os isolados produtores de OXA-48 foram detectados pela

técnica de MALDI-TOF, enquanto que três destes não foram detectados pelo teste CarbaNP.

O ensaio com meropenem foi utilizado apenas por dois estudos desenvolvidos pelo

mesmo grupo de pesquisa (Hrábak et al., 2011; Hrábak et al., 2012). No segundo estudo, Hrábak

e colaboradores (2012) realizaram modificações no ensaio, como diminuição do inóculo

bacteriano testado, adição de SDS à solução tampão e redução no tempo de incubação de 3

para 2 horas. Estas modificações aprimoraram o desempenho do teste, resultando em 100% de

sensibilidade e especificidade para detecção de carbapenemases em 110 isolados de

enterobactérias e Acinetobacter spp. produtores de diferentes enzimas, incluindo OXA-48 (n=6)

(Hrábak et al., 2011; Hrábak et al., 2012).

Recentemente, Vogne e colaboradores (2014) mostraram excelente desempenho do

MALDI-TOF MS quando comparado às metodologias fenotípicas, como MHT e Etest, e

genotípicas, como os painéis comerciais Check MDR Carba e o Check MDR CT103 microarray

Discussão

131

(Vogne et al., 2014). Além de ser o primeiro estudo a utilizar o equipamento VITEK MS para esta

finalidade, foi também testado um disco de ertapenem de 10 µg, comumente utilizado pelos

laboratórios de microbiologia, como fonte deste antimicrobiano, em uma solução de 1 mL de

NaCl 0,45% em tubo de vidro. Os autores ainda relatam que a técnica de MALDI-TOF MS foi a

única a alcançar 100% de sensibilidade e especificidade. Os painéis moleculares não detectaram

dois isolados de Aeromomas spp. produdores da MβL cromossomal CphA (Vogne et al., 2014).

Outro importante fator é o meio de cultura utilizado para o crescimento das colônias

bacterianas, que pode resultar em variação no desempenho do teste. Em nosso primeiro estudo

(dados não mostrados), inicialmente todas as colônias bacterianas haviam crescido em ágar

MacConkey e testadas para o ensaio de carbapenemase no MALDI-TOF MS, sendo que apenas

35% dos isolados produtores de CHDLs haviam sido detectados. Entretanto, ao repetirmos os

testes com colônias isoladas no ágar Müeller-Hinton, todas foram positivas (Artigo Científico 1).

Baseados nesses dados, a influência de outros meios de cultura utilizados nos laboratórios de

rotina poderiam influir no desempenho deste teste. Com o objetivo de esclarecer esta hipótese,

no pôster apresentado no 54th ICAAC, em Washington - DC, avaliamos 64 isolados produtores

de carbapenemase e 32 não produtores de carbapenemase, com crescimento em diferentes

meios de cultura (ágar sangue, ágar MacConkey, ágar Müeller-Hinton e ágar cromogênico -

CPS) e observamos uma sensibilidade de 100% para todos os meios, exceto ágar MacConkey

(81%) (Ramos et al., 2014).

Apesar das grandes variações metodológicas entre os estudos que avaliaram a hidrólise

dos carbapenens por carbapenemases, a detecção de carbapenemase por MALDI-TOF MS é

bastante promissora, principalmente pela sua rapidez e acurácia em detectar diferentes enzimas.

A rapidez do ensaio pode estar relacionada à enzima presente na amostra, como observado no

estudo de Burkhardt & Zimmermann (2011), no qual diferentes tempos de positividade foram

atribuídos para as enzimas IMP-2, KPC-2 e VIM-1 (1,5 horas) e VIM-2 (2,5 horas) (Burkhardt &

Discussão

132

Zimmermann, 2011). Da mesma maneira, em nosso terceiro estudo, avaliamos a detecção de

diferentes classes moleculares de carbapenemases (A, B e D), para a validação do equipamento

VITEK MS, variando o tempo de detecção de 15 minutos, 30 minutos, 1 hora, 2 horas e 4 horas.

Para esse estudo, utilizamos o software Saramis (v.4.1.2). A detecção da maioria das enzimas

de classe A (63%) e B (56%) ocorreu em apenas 15 minutos, seguido de 95% (classe A) e 81%

(classe B) em 1 hora, e finalmente 100% de todas as enzimas, incluindo as CHDLs, em 4 horas

(Artigo Científico 3).

A identificação de micro-organismos pela técnica de MALDI-TOF MS diretamente de

amostras clínicas foi reportada por diversos autores, tanto de urina como de hemocultura. O

maior desafio é a obtenção de quantidade suficiente do micro-organismo com menos

interferentes, como proteínas humanas e células sanguíneas. Os protocolos utilizaram uma série

de centrifugações e lavagens com este fim. Adicionalmente, a maioria dos autores preconizou o

uso de uma solução de lise para melhorar a recuperação de micro-organismos, especialmente

de patógenos intracelulares (Prod’hom et al., 2010; Stevenson et al., 2010; Martiny et al., 2012).

As taxas de identificação correta de micro-organismos diretamente dos frascos de hemocultura

variaram de 62% a 97% para os protocolos que utilizaram métodos “in house” com solução de

lise (Tabela 1). Todos os estudos mostraram que a identificação de bactérias Gram positivas era

inferior aquelas obtidas para bactérias Gram-negativas. Entretanto, as taxas obtidas por esses

estudos foram determinadas após a exclusão de hemoculturas polimicrobianas e daquelas, cujo

espectro de massa não foi obtido pela escassez de material para análise, demonstrando,

portanto, um viés na análise dos resultados.

No estudo realizado por Stevenson e colaboradores (2010) foram utilizadas diluições

seriadas e foi reportado que ao menos 106 UFC/mL devem estar presentes na amostra para a

obtenção de espectro de massa com score acima de 1,7 (Stevenson et al., 2010). Em nosso

estudo, a contagem de células bacterianas foi realizada após a separação e limpeza do inóculo

Discussão

133

do frasco de hemocultura. A contagem para isolados Gram-negativos variou de 107 a >108

UFC/mL, entretanto; porém, contagens de UFC inferiores foram observadas para isolados Gram

positivos (105 a 107 UFC/mL) (dado não publicado). Esta diferença poderia explicar a melhor

performance do método para a identificação de bactérias Gram-negativas diretamente dos frasco

de hemocultura.

O desempenho do MALDI-TOF MS em nosso estudo foi semelhante ao previamente

reportado. O MALDI-TOF MS identificou corretamente 86% dos 110 isolados bacterianos

recuperados de bacteremias, incluindo oito de 10 amostras polimicrobianas, onde o MALDI-TOF

MS obteve a correta identificação de pelo menos um dos agentes presentes (Artigo Científico

2). Uma adaptação do protocolo de Stevenson e colaboradores (2010) foi realizada para a

obtenção do inóculo bacteriano no nosso estudo, no qual o tubo contendo gel separador auxilia

na separação das células sanguíneas, e as células dos micro-organismos permanecem em uma

camada logo acima do gel separador, facilitando a sua recuperação e limpeza com apenas uma

lavagem com água estéril. Este método é simples e rápido para ser implantado facilmente na

rotina do laboratório de microbiologia. No estudo de Stevenson e colaboradores (2010), os

autores obtiveram 80% de identificação correta, realizando cinco etapas de lavagem e

centrifugação, em uma delas com adição de solução de lise (NH4Cl, NAHCO3 e EDTA), além do

uso do tubo com gel separador (Stevenson et al., 2010).

Alguns estudos avaliaram o kit comercial Sepsityper® (Bruker Daltonics) para a extração

do inóculo bacteriano dos frascos de hemocultura. Entretanto, além de honeroso, o mesmo

apresentou desempenho similar ou inferior aos métodos desenvolvidos “in house” (68-94% de

identificação correta) (Kok et al., 2011; Chen et al., 2013). Martiny e colaboradores (2012)

demonstraram discreta melhora na identificação de bactérias Gram positivas quando o

Sepsityper (73%) foi comparado ao método “in house” (62%), porém, este último foi muito

Discussão

134

superior ao Sepsityper para identificação de bactérias Gram-negativas (90% versus 68%)

(Martiny et al., 2012).

A maioria dos estudos reportados na literatura comparou o desempenho do MALDI-TOF

MS aos métodos automatizados rotineiramente utilizados nos laboratórios de microbiologia

(VITEK 2 e PHOENIX). Entretanto, assim como o estudo aqui apresentado, quando resultados

discordantes entre estas metodologias foram comparados com métodos moleculares

considerados padrão-ouro para identificação de micro-organismos, o desempenho da

espectrometria de massa foi superior ao dos sistemas automatizados rotineiramente

empregados pelos laboratórios de rotina (Artigo Cientifico 2; Patel et al., 2013).

Apesar de poucos estudos na literatura terem avaliado o impacto clínico da rápida

intervenção na identificação de micro-organismos diretamente dos frascos de hemocultura, eles

apresentaram muitas diferenças. Entre elas, diferentes end-points, inclusão de todas as

hemoculturas positivas ou apenas aquelas com presença de bactérias Gram-negativas e a

associação da intervenção ou não da equipe de infectologia após o resultado do MALDI-TOF MS

(Huang et al., 2013). Os resultados destes estudos podem ainda ser altamente dependentes das

taxas de resistência apresentadas por cada região geográfica.

Em nossa instituição, a prevalência de enterobactérias produtoras de KPC é elevada,

Durante o período de 01 de janeiro a 30 de setembro de 2014, foram recuperados 457 (6,8%)

isolados de enterobactérias produtoras de KPC de um total de 6759 enterobactérias isoladas

neste período, confirmados por biologia molecular, provenientes de 308 pacientes, dos quais 62

apresentaram ICS (dados não publicados). No Artigo Científico 2 propusemos a identificação

do agente causador de ICS associada à detecção precoce de carbapenemase diretamente do

frasco de hemocultura. Os objetivos desse estudo foram motivados pelo fato de que o

reconhecimento da expressão de carbapenemase é fundamental para o manejo de infecções

causadas por bactérias Gram-negativas resistentes aos carbapenens (Kanj & Kanafi, 2011) Além

Discussão

135

disso, o atraso na adequação da terapia correlaciona-se com o aumento na mortalidade, mesmo

quando o paciente é considerado estável em sua avaliação inicial (Tam et al., 2010). Utilizando-

se de um protocolo simples de extração do inóculo bacteriano a partir dos frascos de

hemocultura, e incubação com ertapenem, todos os isolados produtores de KPC-2 e SPM-1

foram detectados após duas horas de incubação, totalizando três horas de ensaio até a liberação

do resultado. Entretanto, isolados de Acinetobacter spp. produtores de CHDLs somente foram

identificados quando testados a partir da colônia bacteriana. O teste apresentou 100% de

especificidade (Artigo Científico 2).

Recentemente, Hoyos-Mallecot e colaboradores (2014) avaliaram a detecção de

carbapenemase a partir de frascos de hemocultura inoculados com cepas caracterizadas como

produtoras e não produtoras de carbapenemases, entre elas IMP, VIM, KPC e OXA-48 (Hoyos-

Mallecot et al., 2014). Os autores observaram 100% de sensibilidade para as enzimas testadas,

entretanto, em dois isolados, de E. cloacae e E. coli, para os quais os testes moleculares para

enzimas acima foram negativos, o MALDI-TOF MS apresentou atividade de carbapenemase.

Apesar dos autores considerarem estes como resultados falso-positivos, os mesmos deveriam

terem sido confirmados por outra metodologia, preferencialmente por espectrofotometria, uma

vez que a presença de outra carbapenemase não pode ser descartada.

Recentemente, Oviaño e colaboradores (2014) realizaram um ensaio de detecção de

ESβL e AmpC pelo MALDI-TOF MS inoculando 128 frascos de hemocultura (Oviaño et al.,

2014). Os autores utilizaram ceftaxima e ceftazidima como substrasto e ácido clavulânico como

inibidor para confirmar a presença de ESβL. O ensaio não foi capaz de detectar apenas um

isolado produtor de CTX-M-14 e dois isolados produtores de CMY-2. Os isolados produtores de

CMY-2 não apresentaram hidrólise no teste confirmatório através da espectrofotometria, e o

isolado produtor de CTX-M-14 apresentou apenas uma fraca hidrólise utilizando-se cefotaxima.

Neste caso, o ensaio de MALDI-TOF MS poderia ser realizado extendendo-se o tempo de

Discussão

136

incubação com cefotaxima (apenas de uma hora) para detecção de isolados com menor taxa de

hidrólise. No total, os autores observaram 99% de sensibilidade e 100% de especificidade para

isolados produtores de ESβL, e 83% e 100% para isolados produtores de AmpC,

respectivamente.

A utilização da técnica de MALDI-TOF MS para a detecção diretamente dos frascos de

hemocultura de isolados produtores de carbapenemase ou ESβL e AmpC, dependendo da

epidemiologia local, traz rápidos resultados sem necessitar da execução de técnicas

moleculares, que limitam o número de alvos. A técnica de MALDI-TOF MS tem a vantagem de

ser capaz de detectar novas enzimas ou variantes, desde que apresentem o perfil hidrolítico

estudado. Adicionalmente, quando apropriadamente transferida para a rotina laboratorial,

caracteriza-se por um método simples e de baixa demanda. A presença de carbapenemases,

ESβL ou AmpC são determinantes da escolha terapêutica em isolados de bactérias Gram-

negativas, principlamente na presença de infecções graves, como infecção de corrente

sanguínea. Entretanto, a realização do teste de sensibilidade para determinação da CIM, não

apenas dos carbapenens como também de outros antimicrobianos que possam constituir-se em

alternativas terapêuticas, ainda será necessária para a melhor adequação da terapia

antimicrobiana prescrita e suas doses.

Diante de todos estes fatores, a possibilidade de padronização e avaliação de um teste

rápido, de fácil execução e capaz de detectar todos os representantes do grupo de

carbapenemases diretamente de hemocultura, motivou a execução deste trabalho. Isso representa

um grande potencial para a redução, a baixo custo, da mortalidade associada à infecção. A

detecção de carbapenemases direto de colônias bacterianas ou mesmo diretamente de amostras

clínicas, pode ser utilizada nos laboratórios de microbiologia clínica, onde a identificação de micro-

organismos por MALDI-TOF MS já estiver implantada, fato que é realidade na Europa e EUA, e

está em crescente expansão na América Latina, inclusive no Brasil. O real impacto deste teste no

Discussão

137

desfecho clínico do paciente, assim como no tempo de hospitalização e modificação da terapia

antimicrobiana constituem nossos futuros projetos.

Conclusões

138

6. CONCLUSÕES

Conclusões

139

A espectrometria de massa por MALDI-TOF MS, através do ensaio com ertapenem,

demonstrou ser uma metodologia rápida e acurada para detecção de carbapenemase em

bactérias Gram-negativas. Porém, a interpretação dos espectros requer ainda a expertise de

profissionais treinados;

A técnica de MALDI-TOF MS apresentou uma excelente sensibilidade e especificidade

para a detecção de carbapenemases das classes moleculares A e B em duas horas. Já os

isolados de Acinetobacter spp. requerem um período de incubação maior chegando a quatro

horas;

A sensibilidade do método pode variar de acordo com o meio de cultura utilizado, sendo

o ágar MacConkey o que apresentou maior taxa de resultados falso-negativos e, portanto, não

deve ser recomendado para o cultivo das amostras antes da realização dos experimentos de

MALDI-TOF MS;

A detecção da atividade de carbapenemase pode ser realizada diretamente do frasco

positivo de hemocultura para enterobactérias e P. aeruginosa, porém, resultados negativos

devem ser confirmados para os isolados de Acinetobacter spp. após o isolamento da colônia

bacteriana.

A metodologia de MALDI-TOF MS apresentou boa acurácia para identificação de

bactérias diretamente dos frascos positivos de hemocultura.

Referências Bibliográficas

140

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS


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Anexos

165

8. ANEXOS

Anexos

166

8.1. Anexo 1. Cloverleaf test (modified Hodge test) for detecting carbapenemase

production in Klebsiella pneumoniae: be aware of false positive results. Publicado em

Fevereiro de 2010 no periódico Journal of Antimicrobial Chemotherapy - JAC, volume 65, número

2, páginas 249-251.

Anexo 1

167

Cloverleaf test (modified Hodge test) for detecting carbapenemase production in 1

Klebsiella pneumoniae: be aware of false positive results 2

3

Cecilia G. Carvalhaes1*, Renata C. Picão1, Adriana G. Nicoletti1, Danilo E. Xavier1 and Ana C. 4

Gales1. 5

6

1Laboratório Alerta, Universidade Federal de São Paulo, São Paulo, Brazil. 7

8

Running title: False-positive carbapenemase detection in Klebsiella pneumoniae. 9

10

*Corresponding author. Mailing adrress: Laboratório ALERTA, Rua Pedro de Toledo, n°781, 11

6°andar, fundos. Vila Clementino, São Paulo-SP. CEP 04039-032. Phone: 55-11-5084-6538. 12

Fax: 55-11-5081-2965. E-mail: [email protected]. 13


Anexo 1

168

Abstract 14

Objectives: The aim of this study was to evaluate the presence of carbapenemases in a 15

Klebsiella pneumoniae collection and the performance of the modified Hodge test (MHT) to 16

correctly identify this phenotype. 17

Methods: Twenty-eight K. pneumoniae clinical isolates with reduced susceptibility to 18

carbapenems were evaluated. Antimicrobial susceptibility and molecular typing were performed 19

by agar dilution and PFGE, respectively. The MHT was performed using both standard and high 20

inoculum of test organisms. Imipenem hydrolysis was investigated by spectrophotometric assays 21

and carbapenemase-encoding genes were identified by PCR and amplicon sequencing. Porin 22

loss was investigated by both PCR and SDS-PAGE. 23

Results: Susceptibility rates for imipenem, meropenem and ertapenem were 93%, 57% and 24

11%, respectively. The PFGE analysis showed seven unrelated genotypes. By testing standard 25

inoculum and ertapenem or meropenem discs, 25% (n=7) and 21% (n=6) of the isolates were 26

classified as carbapenemase producers, respectively. When a higher inoculum was employed, 27

these rates increased to 54% (n=15) and 43% (n=12), respectively. No imipenem hydrolysis was 28

detected. PCRs identified blaCTX-M in 27 (96%) isolates, of which 2 isolates also carried blaGES-1. 29

SDS-PAGE and PCR assays revealed that all isolates had lost at least one outer membrane 30

protein, except for a single isolate that was found to express both OmpK35 and OmpK36. 31

Conclusions: False detection of carbapenemase production was observed by the MHT possibly 32

as a result of extended-spectrum β-lactamase (ESβL) production coupled with porin loss as 33

reported before. Clinical laboratories must be aware of this fact, especially in geographical areas 34

where ESβL-producing isolates are highly prevalent. 35

Anexo 1

169

Introduction 36

Infections due to Klebsiella pneumoniae have emerged as an important challenge in 37

healthcare settings. In Brazil, K. pneumoniae has been the fourth most frequent pathogen 38

isolated from bloodstream infections according to the SENTRY Antimicrobial Surveillance 39

Program.1 High rates of extended-spectrum β-lactamase (ESβL) production have been observed 40

in this species, making the carbapenems the main therapeutic option for treatment of serious 41

infections caused by such pathogens. Although the rates of resistance to carbapenems are low, 42

they have been increasing. The most common mechanism for carbapenem resistance in 43

Klebsiella spp. is the production of carbapenemases belonging to Ambler class A, especially K. 44

pneumoniae carbapenemase (KPC), or B, metallo-β-lactamases (MβLs) such as IMP and VIM 45

types. Production of ESβL and/or AmpC β-lactamases coupled with porin loss has also been 46

shown to be responsible for carbapenem resistance.2,3 47

The detection of KPC has become a real challenge for clinical laboratories since some 48

carbapenemase-producing Enterobacteriaceae may have carbapenem MICs that are elevated 49

but still within the susceptible category according to currently defined breakpoints.4 To address 50

this challenge, in January 2009, the CLSI published a recommendation in which carbapenem-51

susceptible Enterobacteriaceae with elevated MICs or reduced disc diffusion inhibition zones 52

should be tested for the production of carbapenemases.4 For this purpose, the Cloverleaf test5 53

[modified Hodge test (MHT)] was suggested due to its acceptable sensitivity and specificity for 54

carbapenemase detection.4,5 To date, the BSAC and the European Committee on Antimicrobial 55

Susceptibility Testing (EUCAST) do not routinely recommend carbapenemase detection in 56

Enterobacteriaceae. 57

The aim of this study was to evaluate the presence of carbapenemase production in a K. 58

pneumoniae collection with reduced susceptibility to carbapenem, and the performance of the 59

MHT in correctly identifying the presence of such resistance determinants. 60

Anexo 1

170

Methods 61

Collection. In 2009, the Laboratório ALERTA, a research laboratory from the Universidade 62

Federal de São Paulo, received 28 K. pneumoniae clinical isolates with reduced susceptibility to 63

carbapenems. These isolates were recovered from eight hospitals located in three distinct 64

Brazilian regions. A PFGE assay was performed to study the genetic relatedness among these 65

isolates. 66

67

Antimicrobial susceptibility testing and MHT. Antimicrobial susceptibility testing was 68

performed using the CLSI agar dilution technique. Cefepime, ceftazidime, ertapenem, imipenem 69

and meropenem MICs were interpreted following the CLSI recommendations.4 All isolates fulfilled 70

the CLSI criterion for performing carbapenemase detection by the MHT. MHT was performed with 71

both a CLSI standard inoculum (three to five colonies) and a high inoculum (a full 1 µL loop) of 72

test organisms. Results were interpreted by two blinded observers. 73

74

β-Lactamase detection. Investigation of carbapenemase activity in crude extracts was 75

performed by UV spectrophotometric assays. Briefly, a full 10 mL loop of the test organism was 76

inoculated into 500 mL of 100 mM phosphate buffer (pH 7.0) and disrupted by sonication. The 77

cells were removed by centrifugation and the supernatants were used for further experiments. 78

Protein quantification in crude extracts was performed using the Bradford stain, and the results 79

were used to normalize the volume to be tested for each isolate. The hydrolytic activity of crude 80

extracts was determined against 100 mM imipenem in 100 mM phosphate buffer (pH 7.0), and 81

measurements were carried out at a wavelength of 297 nm. Positive controls included SPM-1-82

producing Pseudomonas aeruginosa and GES-5-producing P. aeruginosa for high- and low-level 83

hydrolysis, respectively. CTX-M-2-producing P. aeruginosa was included as a negative control.6 84

PCRs targeting genes encoding CTX-M, GES, KPC, plasmid-mediated AmpCs, MBL and OXA-85

Anexo 1

171

type carbapenemases were performed using primers described previously.6,7 For direct DNA 86

sequencing, PCR productswere purified using PCR purification columns (Qiagen, Hilden, 87

Germany). Sequencing reactions were performed using the Big Dye Terminator v3.1/1.1 cycle 88

sequencing kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) and an automated ABI 3130 89

sequencer (Applied Biosystems). The nucleotide and deduced protein sequences were analysed 90

with software available at the National Center for Biotechnology Information website 91

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov). 92

93

Outer membrane proteins.The presence of outer membrane proteins (OMPs) was analysed by 94

SDS-PAGE as previously described.8 Altered OmpK35- and OmpK36-encoding genes were 95

investigated by PCR.7 96

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

Anexo 1

172

Results 97

Twenty-eight K. pneumoniae clinical isolates were investigated. None of these isolates 98

was susceptible to cefepime but 7% were susceptible to ceftazidime. Susceptibility rates for 99

imipenem, meropenem and ertapenem were 93%, 57% and 11%, respectively. MIC50/MIC90 100

values (mg/L) were as follows: cefepime, 128/.256; ceftazidime, 32/128; ertapenem, 16/64; 101

imipenem, 2/4; and meropenem, 4/16. PFGE, interpreted according to Tenover et al.,9 showed 102

seven unrelated genotypes. By testing standard inoculums and ertapenem or meropenem discs, 103

25% (n=7) and 21% (n=6) of the isolates were classified as carbapenemase producers, 104

respectively. When a higher inoculum was employed, these rates increased to 54% (n=15) and 105

43% (n=12), respectively. Carbapenemase production by MHT was detected among K. 106

pneumoniae isolates belonging to distinct genotypes. No imipenem hydrolysis was detected 107

among the isolates classified as carbapenemase producers by the MHT. PCRs targeting genes 108

encoding KPC, plasmid-mediated AmpCs, MBL and OXA-type carbapenemases did not show 109

any amplicons. blaCTX-M was detected in 27 (96%) isolates, in which 24 (89%) were blaCTX-M-2, 2 110

(7%) were blaCTX-M-15 and 1 (4%) was blaCTX-M-59. Two blaCTX-M-2-positive isolates also carried 111

blaGES-1. Both OmpK35 and OmpK36 were expressed in a single isolate (Kpn 27) according to the 112

SDS-PAGE results. Interestingly the MICs of imipenem, meropenem and ertapenem for this 113

isolate were ≤ 0.12 mg/L, ≤ 0.12 mg/L and 2 mg/L, respectively. Five isolates (18%) presented 114

two bands, probably corresponding to OmpA and either OmpK35 or OmpK36. Finally, 22 isolates 115

(79%) presented one single band, probably corresponding to OmpA, suggesting that they have 116

lost both porins. These findings were corroborated by PCR analysis of OMP-encoding genes, in 117

which 24 isolates (86%) presented altered amplicons of at least one OMP-encoding gene, being 118

either the lack of amplification or enhanced amplicon size. 119

Anexo 1

173

Discussion 120

In this study, we have observed the occurrence of false detection of carbapenemase 121

production by the MHT among isolates in which carbapenem reduced susceptibility or resistance 122

was detected. Therefore, a false positive MHT probably results from low-level carbapenem 123

hydrolysis by ESβLs, particularly those of the CTX-M type.10 This hypothesis is strengthened by 124

the fact that the frequency of false positive results was directly related to the inoculum tested.11 125

Our results corroborated with those observed by Doumith et al.3 in which carbapenem resistance 126

due to ESβL production coupled with porin loss was reported. 127

When testing true carbapenemase producers, Escherichia coli ATCC 25922 usually 128

grows better within the carbapenem disc inhibition zones. For this reason, we thought that the 129

true production of carbapenemase could be discriminated by looking at the growth size produced 130

in the MHT. However, we have observed that KPC-producing K. pneumoniae isolates might also 131

show a weak positive result on MHT, as shown in Figure 1. 132

Clinical laboratories must be aware that false positive results may occur, especially in 133

geographical areas where ESβL-producing isolates are prevalent. Currently, a new study is being 134

carried out to determine the frequency of false detection of carbapenemase production in 135

Enterobacteriaceae by the MHT in the clinical microbiology routine setting. 136

Anexo 1

174

Funding 137


Council for Scientific and Technological Development (CNPq), Ministry of Science and 139

Technology, Brazil (307714/2006-3). 140

141

Transparency declarations 142

None to declare. 143

Anexo 1

175

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9. Tenover FC, Arbeit RD, Goering RV et al. Interpreting chromosomal DNA restriction 166

patterns produced by pulsed-field gel electrophoresis: criteria for bacterial strain typing. J 167

Clin Microbiol 1995; 33: 2233-9. 168

Anexo 1

176

10. Girlich D, Poirel L, Nordmann P. Do CTX-M β-lactamases hydrolyse ertapenem? J 169

Antimicrob Chemother 2008; 62: 1155-6. 170

11. Queenan AM, Foleno B, Gownley C et al. Effects of inoculum and β-lactamase activity in 171

AmpC- and extended-spectrum b-lactamase (ESβL)-producing Escherichia coli and 172

Klebsiella pneumoniae clinical isolates tested by using NCCLS ESβL methodology. J Clin 173

Microbiol 2004; 42: 269-75. 174

Anexo 1

177

175

176

Figure 1. Phenotypic carbapenemase detection by MHT applying the inoculum recommended by 177

CLSI for ertapenem (a) and meropenem discs (b). 1, K. pneumoniae ATCC BAA-1705, positive 178

result; 2, K. pneumoniae ATCC BAA-1706, negative result; 3, CTX-M-producing K. pneumoniae 179

clinical isolate; 4, KPC-producing K. pneumoniae clinical isolate. Arrows indicate the similar size 180

of E. coli ATCC 25922 grown within the carbapenem disc inhibition zones when testing both 181

carbapenemase producer and carbapenemase non-producer isolates. 182

(A)

(A)

(B)

(A)

1

(A)

4

(A)

2

(A)

3

(A)

1

(A)

4

(A)

3

(A)

2

(A)

Anexo 2

178

Tabela 9. Estudos da literatura que avaliaram a detecção de carbapenemases pela ténica de MALDI-TOF MS.

Estudo Bactérias N Enzimas Meio de cultura

Inóculo Solução Inibidores

Tempo de incubação

Matriz Equipamento Calibração Range

de massa

Critério de Positividade

Resultados (Sens/Esp)

Burkhardt & Zimmermann,

2011

Enterobactérias e P. aeruginosa; cepas

controles 87

NDM, IMP, KPC, VIM, não-

carbapenemases

ágar sangue

alça 10 µL 1 mL 0,45%

NaCl -

Ertapenem 0,5 g/L

2,5 horas HCCA Microflex LT HCCA 438-530 Δ 476, 498 e

521 Da 100%/100%

Hrábak et al., 2011


controles 124

NDM, IMP, KPC, VIM, não-

carbapenemases ágar MH

sç adicional - McFarland 8

50 µL 20 mM Tris-HCl pH 6,8

- Meropenem

0,1 mM 3 horas DHB Microflex LT ? 375-475

Δ 383 ou 405 Da

97%/98%

Sparbier et al., 2012

Enterobactérias; cepas controles

3 KPN, 6 E. coli

ágar

sangue alça 1 µL

Citrato de amônio 10 mM

pH 7,0 APBA

Ertapenem, 0,5 g/L; Imipenem,

0,5 g/L; Meropenem,

0,5 g/L

3 horas HCCA Microflex LT

HCCA; Bradicinina (1-

5) e Bradicinina (1-

7)

100 - 1000

Picos M/ Picos Mh; R, I, S

100%/100%

Kempf et al., 2012

Acinetobacter spp.,Enterobactérias, P.

aeruginosa (cepas controles)

149 OXA-23; OXA-24;

OXA-23 e 24 ágar

sangue alça 10 µL

1 mL 0,45% NaCl

- Imipenem-

cilastatina 0,25 - 2 g/L

4 horas HCCA Ultraflex Imipenem 0 - 1000 Δ 300 e

aumenta 254 Da

Sensibilidade 95% em 2 horas

100% em 4 horas;

Especificidade 100%

Carvalhaes et al., 2012

Acinetobacter spp., P. aeruginosa,

Enterobactérias (cepas controles)

61

OXA-23; OXA-23 e 143; OXA-24 e 143; OXA-25; OXA-26;

OXA-58; IMP-1; IMP-10; GES-5; SPM-1; VIM-1; GIM-1; KPC-

2; NDM-1

ágar MH alça 10 µL 1 mL 20 mM

Tris-HCl pH 6,8 -

Ertapenem 0,12 - 0,5 g/L

2 e 4 horas HCCA Microflex LT HCCA; e

Bradicinina (1-7)

400-600 Δ 476 e 498 Da 100% Classe A e

B em 2 horas; CHDL em 4 horas

Hrábak et al., 2012

Enterobactéria e Acinetobacter spp.

145 NDM-1, KPC 2 e 3, VIM-1, OXA-48 e

OXA-162 ágar MH

sç adicional - McFarland 3

50 µL 20 mM Tris-HCl pH 7,0 + 0,01% SDS

- Meropenem

0,1 mM 2 horas DHB Microflex LT Meropenem 350-480

Δ 383 ou 405 Da; e presença

358 e 380 100%/100%

Hoyos-Mallecot et al., 2013


controles 63 IMP, VIM, KPC ágar MH ?

50 µL 20 mM Tris-HCl pH 7,0 + 0,01% SDS

EDTA Ertapenem

0,25 g/L 4 horas HCCA Microflex LT



7)

100 -1000

Δ 476, 498 e 521 Da

100%/100%

Lee et al., 2013



101 IMP, SIM, VIM, OXA-

23, NDM, KPC, ISAba1-OXA-51

ágar MH alça 1 µL

20 e 50 µL 20 mM Tris-HCl pH 7,0; ou 0,45%

NaCl

- Ertapenem

0,5 g/L 2, 4, 6 e 12

horas HCCA Microflex LT HCCA ?

Δ 476, 498 e 521 Da

20 µL Tris-HCL 100% Classe A e B em 2 horas; e 100% CHDL em

4 horas

Anexo 2

179

Alvarez-Buylla et al., 2013

Acinetobacter spp. 70 IMP, OXA-23, OXA-24, OXA-58, ISAba1-

OXA-51 ?

109-1010 UFC/mL

0,45% NaCl; ou 20 mM Tris-HCl

pH 7,0; ou Citrato de

amônio 10 mM pH 7,0;

todos ± SDS

DPA Imipenem-

cilastatina 0,25 - 5 g/L

1 hora HCCA Microflex LT



7)

100 -1000

Redução significativa dos picos 300 e 489

Da

Melhor: Tris-HCl ou NaCl sem

SDS; 1g/L imipenem/

inóculo 1010 UFC/mL; 1 hora

de incubação

Sauget et al., 2014

Enterobactérias 372 OXA-48 ágar MH alça 10 µL 1 mL 0,45%

NaCl -

Imipenem-cilastatina 0,25

g/L 1 hora HCCA Microflex LT HCCA 200-500

Razão das áreas M/Mh;

positivo ≤ 0,46 99% / 97%

Vogne et al., 2014



47 KPC, VIM,NDM,

OXA-48 ágar

sangue McFarland 7

1 mL 0,45% NaCl (tubo de

vidro) -

Disco ertapenem

10 µg 1 hora HCCA Microflex LT ? 400-600

Δ 476 e 498; e presença do

478, 496 100%/100%

Knox et al., 2014

Enterobactérias 105 KPC, NDM, IMP,

VIM,OXA-48 ágar

sangue alça 1 µL

100 µl 0,45% NaCl

- Imipenem 0,25

g/L 4 horas HCCA Vitek MS Imipenem 200-700

Δ 300 Da; AUC 300 < 5% AUC

controle 87%/100%

Carvalhaes et al., 2014

Frascos positivos de HMC 100

KPC-2, OXA-23, OXA-72, SPM-1

- 8 mL Tubo gel

separador, H2O estéril

- Ertapenem 0,5

g/L 2 e 4 horas HCCA Microflex LT

HCCA; e Bradicinina (1-

7) 400-600 Δ 476 e 498 Da

D1: 100% classe A e B em 4 horas, D2: 100% CHDL

em 4 horas

Hoyos-Mallecot et al., 2014

Frascos de HMC inoculados com cepas

controles 39

IMP, VIM, KPC, OXA-48

- 8 mL

4 passos de centrifugação e lavagem com H2O estéril

- Ertapenem

0,25 g/L 4 horas HCCA Microflex LT



7)

100 -1000

Δ 476, 498 e 521 Da

100%/95%

cecilia helena vieira franco de godoy carvalhaes · médico assistente do laboratório de...

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