carcinoma epidermÓide de lÍngua: correlaÇÃo … · ao prof. dr. antônio de lisboa lopes costa...

ÉRICKA JANINE DANTAS DA SILVEIRA

CARCINOMA EPIDERMÓIDE DE

LÍNGUA: CORRELAÇÃO CLÍNICA,

HISTOLÓGICA E IMUNO-HISTOQUÍMICA

NATAL/RN

2004

ÉRICKA JANINE DANTAS DA SILVEIRA

CARCINOMA EPIDERMÓIDE DE

LÍNGUA: CORRELAÇÃO CLÍNICA,

HISTOLÓGICA E IMUNO-HISTOQUÍMICA

Dissertação apresentada ao Colegiado do Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como parte dos requisitos para obtenção do Título de Mestre em Patologia Oral.

Orientadora: Profª Drª Lélia Maria Guedes Queiroz

NATAL/RN

2004

Divisão de Serviços Técnicos

Catalogação da Publicação na Fonte. UFRN / Biblioteca Central Zila Mamede Silveira, Éricka Janine Dantas da. Carcinoma epidermóide de língua: correlação clínica, histológica e imuno-histoquímica / Éricka Janine Dantas da Silveira. – Natal, RN, 2004. 114 f.

Orientadora: Lélia Maria Guedes Queiroz. Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Ciências da Saúde. Programa de Pós-graduação em Patologia Oral.

1. Neoplasias bucais – Dissertação. 2. Língua – Neoplasias – Dissertação. 3. Carcinoma de células escamosas – Dissertação. I. Queiroz, Lélia Maria Guedes. II. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. III. Título.

RN/UF/BCZM CDU 616.314:616-006 (043.3)

DEDICATÓRIA

Aos meus pais Valtércio Anunciato e Julieta Isabel, pelo incentivo e amor

decisivos na minha formação humana e profissional. Em especial a minha mãe “uma

heroína”, a maior incentivadora, o amparo das quedas e obstáculos, a força que me mantém

de pé nos momentos de insegurança. Mainha, muito obrigada pelo carinho e confiança,

fazendo com que eu lute incessantemente pelos meus sonhos. Você acreditou em mim e sem

dúvida alguma representa parte dessa conquista.

Aos meus irmãos Natércia Janine, Cibele Janine e Lúcio Neto, pelo apoio,

incentivo e compreensão principalmente durante os momentos de stress.

Este trabalho não poderia deixar de ser dedicado também a todos os meus

familiares, pelos valores que sempre guardarei, e por se fazerem tão presentes na minha

vida, representados principalmente pelos anjos, vovô Antônio e vovó Dica, vovó Nicácia e

vovô Lúcio. A minha madrinha Márcia Jales, uma das pessoas mais especiais, e torcedora

em todos os momentos, a mãe de 18 sobrinhos, que hoje estão seguindo seus caminhos na

certeza de que ela tem grande participação no sucesso de cada um de nós. Tia Márcia essa

conquista não poderia deixar de ser dedicada também a você que é uma pessoa ímpar e se

faz tão presente na vida de todos os seus “filhos”... E ainda a todos os meus tios, tias,

primos e primas que acompanharam e torceram por mim nessa conquista.

“Os sentimentos verdadeiros se manifestam mais por atos que palavras”

Shakespeare

AGRADECIMENTO ESPECIAL

Meus sinceros e imprescindíveis agradecimentos a minha Orientadora e amiga Profª

Drª. Lélia Maria Guedes Queiroz, pela dedicação, paciência, integridade, transmissão de

conhecimentos científicos, importantes na orientação deste trabalho e na minha formação

humana e profissional. Muito obrigada pelos estímulos fundamentais que me fizeram sentir

capaz para continuar nessa jornada, além do carinho e da confiança dispensados a mim.

Com você aprendi que o verdadeiro conhecimento deve ser constantemente perseguido,

descoberto e construído... Sinto-me lisonjeada por ter sido sua orientanda!

AGRADECIMENTOS

Á coordenadora do Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral a Profª Drª

Roseana de Almeida Freitas, pela dedicação, competência com que conduz essa tarefa tão

árdua... A Sra. é uma das pessoas mais sensatas e íntegras que conheço. Obrigada pela

inesquecível colaboração científica, dando-me estímulos decisivos no transcorrer deste

curso. A Sra,. minha eterna admiração!

Á Profª Drª Lélia Batista de Souza, pela disponibilidade, elogios, confiança e,

ainda, grande carinho dispensados a mim.

Ao Prof. Dr. Leão Pereira Pinto, o maior responsável por tudo isso, o fundador

deste Programa tão conceituado no País.

À Profª. Drª. Hébel Cavalcanti Galvão pela forma simples, sincera e competente

com que conduz seus trabalhos, o que serve de exemplo a todos os aprendizes a sua volta.

Ao Prof. Dr. Antônio de Lisboa Lopes Costa pela expressão de sabedoria em tudo

aquilo que faz, pelos esclarecimentos e conhecimentos transmitidos.

Vocês me tornaram amante da arte da docência e da pesquisa, conduziram-me além das

teorias, tornando-se além de mestres, grandes amigos. Meus profundos agradecimentos

indeferidos a vocês, que têm sabedoria e prazer em fazer aquilo que mais gostam. Ser

pesquisadores e educadores!

Às professoras doutoras, Ana Miryan Costa de Medeiros e Patrícia Teixeira de

Oliveira, pelos ensinamentos e por tornarem a clínica de estomatologia um ambiente

prazeroso. Meus sinceros agradecimentos.

Ao Prof. Dr. Ângelo Guisepe Roncali pela realização da análise estatística deste

trabalho, tornando-o mais rico e preciso.

Aos meus amigos do mestrado, Francielli Cristine, Jamile Marinho, Leonardo

Yure, Tarsila Freitas, pela confiança no meu caráter e integridade, carinho, troca de

idéias... Nós vivemos juntos tantos momentos e carregamos a marca das experiências que

tivemos, estejamos sempre confiantes em busca dos nossos sonhos. E você Tarsila,

companheira de todas as horas, que compartilhou e sofreu junto comigo todas as

angústias, mas também comemoramos juntas todas as vitórias conquistadas durante esta

jornada... tenho certeza que amizade por nós construída ultrapassará fronteiras. Uma

despedida é necessária antes da gente se encontrar novamente... Você estará sempre no

meu coração!

A todos os colegas do doutorado, Gustavo, Márcia, Márcio, Rivadávio, Rosilene,

Simone, Sormani, Manuel, Flávio, Carmem, Antônio Luiz, Fernanda, Ruthinéia,

Emanuel Sávio e João Luiz, pelos ensinamentos, trocas de experiências, pela convivência

e momentos ímpares que desfrutamos juntos. A você Gustavo “meu grande irmão de

coração” e principal companheiro neste caminho, não tenho palavras para agradecer o

que fez e tenho certeza que continuará fazendo por mim, você é admirável em todos os

sentidos! Márcia, muito obrigada pela amizade e companherismo, você tem caráter,

inteligência e cumplicidade dignos de exemplo! Márcio, você tem sido um dos principais

estimuladores, e me ajudou a acreditar na minha capacidade, muito obrigada!

Ao Biólogo Hévio Lucena e ao Técnico Canidé pela competência e dedicação na

condução deste trabalho. Sem vocês, este trabalho não se concretizaria.

À Gracinha, Idelzuíte e Sandrinha pela disponibilidade, atenção e gentileza com

que sempre atenderam meus pedidos, agradeço de coração!

Ao CNPq, pelo apoio financeiro concedido, pela bolsa de estudos, facilitando a

realização do mestrado e elaboração deste estudo.

A todos que direta ou indiretamente contribuíram para realização deste trabalho e

para minha formação humana. Alysson Guimarães pelo incentivo constante, compreensão,

apoio e por ter ficado todo tempo ao meu lado nesta batalha. Às minhas eternas amigas

Gabriella e Lídia por fazerem com que essa bela amizade permanecesse viva durante

todos esses anos... Juntas, vivemos as etapas mais importantes da vida, a infância,

adolescência, escolha da profissão, formatura, realização profissional, e tenho certeza de

que ainda compartilharemos muitos momentos especiais... Nós somos exemplos de que

para as verdadeiras amizades não existem fronteiras. Adoro vocês!

Deus, razão da minha existência, muito obrigada por ter me dado força para concluir este

trabalho e por não desistir nos momentos difíceis que enfrentei... Obrigada pelo equilíbrio

que me deu, e por colocar em meu caminho pessoas tão especiais!

LISTA DE ILUSTRAÇÕES


QUADROS

Quadro 1 – Localização, pesos moleculares e pH dos pares de citoqueratinas no

epitélio normal. 40

Quadro 2 – Sistema de gradação de malignidade “Modo de invasão” recomendado por

Bryne (1998) 55

Quadro 3 – Quadro evidenciando especificidade para os anticorpos que foram

utilizados, diluição, tempo de incubação e fabricante. 56

Quadro 4 – Quadro evidenciando as variáveis analisadas, bem como sua

classificação e categorização. 60

FOTOS

Foto 1: Front invasivo de carcinoma epidermóide de baixo grau, de acordo com o

sistema proposto por Bryne (1998) (H/E – 40x). 65

Foto 2: Carcinoma epidermóide de baixo grau evidenciando detalhe de um ninho

tumoral com ceratinização intensa permeando intenso infiltrado inflamatório (H/E –

200x). 65

Foto 3: Front invasivo de carcinoma epidermóide de alto grau classificado segundo

sistema proposto por Bryne (1998) (H/E – 40x). 66

Foto 4: Detalhe da figura anterior evidenciando-se desgarramento de células dos

ninhos tumorais (H/E – 200x). 66

Foto 5: Imunomarcação da CK 7 em tumor de alto grau (SABC – 200x). 69

Foto 6: Negatividade para a citoqueratina 7 em células tumorais de carcinoma

epidermóide de baixo grau. Controle interno positivo representado por fragmentos de

glândula salivar menor (SABC – 100x). 69

Fotos 7-9: (7) CK 10. Positividade nas áreas centrais dos ninhos tumorais,

correspondendo a células intermediárias e superficiais (SABC – 100x). (8) Marcação

fraca e heterogênea em epitélio adjacente ao tumor (SABC – 200x). (9) Localização

imuno-histoquímica da CK 10 em mucosa normal, detectado através da marcação

citoplasmática em algumas camadas suprabasais e superficiais do epitélio estratificado

ceratinizado (SABC – 100x). 70

Fotos 10-12: (10) Expressão da CK 13 nos centros dos ninhos e lençóis celulares,

correspondendo às células intermediárias e superficiais (SABC – 200x). (11)

Marcação intensa, homogênea, acometendo todas as camadas suprabasais do epitélio

pavimentoso estratificado em área adjacente a tumor (SABC – 200x). (12)

Localização imuno-histoquímica da CK 13 em epitélio pavimentoso estratificado

normal, representado por marcação fraca e heterogênea (SABC – 100x). 71

Fotos 13-15: (13) Intensa imunopositividade à citoqueratina 14 em todas as células

tumorais (basais, suprabasais) em carcinoma epidermóide de baixo grau (SABC -

200x). (14) Perda de positividade a CK 14 em algumas células invasivas (SABC -

200x). (15) Marcação na camada basal do epitélio adjacente em área mais distante do

tumor (SABC 100x). 72

Fotos 16-18: (16) Expressão da CK 16 evidenciada principalmente nas células

intermediárias e superficiais dos ninhos tumorais (SABC - 200x). (17) Figura

evidenciando epitélio adjacente ao tumor com áreas de ausência e presença de

marcação bem como células neoplásicas positivas (SABC - 40x). (18)

Imunolocalização da CK 16 em epitélio pavimentoso estratificado normal (SABC –

100x). 73

Foto 19-21: (19) Negatividade para a CK 19 em células tumorais de carcinoma

epidermóide de baixo grau. Controle interno positivo representado por fragmentos de

glândula salivar menor (SABC – 40x). (20) Expressão da CK 19 em áreas centrais dos

ninhos tumorais, em carcinoma epidermóide de alto grau (SABC 200x). (21)

Positividade à citoqueratina 19 do epitélio pavimentoso estratificado adjacente ao

tumor (SABC 100x). 74

GRÁFICOS

Gráfico 1 - Distribuição do número de casos de acordo com o sexo dos pacientes.

Hospital Dr. Luiz Antônio, Natal/RN. 62

Gráfico 2 - Distribuição do número de casos de acordo com a idade dos pacientes.

Hospital Dr. Luiz Antônio, Natal/RN. 62

Gráfico 3. Relação entre estadiamento clínico (I e II/III e IV) e desfecho da doença

(óbito/remissão). p = 0,046 . Natal, RN. 2003. 76

Gráfico 4. Relação entre metástase (Sim/Não) e desfecho da doença (óbito/remisão). p

= 0,002. Natal, RN. 2003. 76

Gráfico 5. Relação entre estadiamento clínico (I e II/III e IV) e metástase (sim/não). p

= 0,025 . Natal, RN. 2003. 77

Gráfico 6. Relação entre gradação histológica (baixo/ alto grau) e desfecho da doença

(óbito/remissão). p = 0,426 . Natal, RN. 2003. 78

Gráfico 7. Relação entre estadiamento clínico (I e II/III e IV) e gradação histológica

(baixo/alto graus). p = 0,465 . Natal, RN. 2003. 78

Gráfico 8. Relação entre gradação histológica (Baixo/ Alto graus) e metástase

(sim/não). p = 0,264 . Natal, RN. 2003. 79

LISTA DE TABELAS

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 – Dados clínicos referentes aos pacientes portadores de carcinoma

epidermóide de língua estudados. Natal/RN - 2004 54

Tabela 2 – Escores e gradação histológica de malignidade dos carcinomas

epidermóides de língua estudados. Natal-RN 64

Tabela 3. Relação entre estadiamento clínico e desfecho da doença. Significância

obtida pelo Teste Qui2. Natal, RN. 2003. 75

Tabela 4. Relação entre metástase e desfecho da doença. Significância obtida pelo

Teste Qui2. Natal, RN. 2003. 76

Tabela 5. Relação entre estadiamento clínico e metástase. Significância obtida pelo


Tabela 6. Relação entre gradação histológica e desfecho da doença. Significância


Tabela 7. Relação entre gradação histológica e estadiamento clínico. Significância


Tabela 8. Relação entre gradação histológica e metástase. Significância obtida pelo


Tabela 9. Matriz de significância estatística, contendo os valores de “p” para as

combinações entre as variáveis. Significância obtida pelo Teste Qui2. Natal, RN. 2003.

79

Tabela 10. Relação entre a presença de marcadores e desfecho da doença.

Significância obtida pelo Teste Qui2. Natal, RN. 2003. 80

Tabela 11. Relação entre a presença de marcadores e o estadiamento clínico.


Tabela 12. Relação entre a presença de marcadores e presença de metástase.


Tabela 13. Relação entre a presença de marcadores e gradação histológica.


RESUMO

SILVEIRA, E.J.D. da. Carcinoma epidermóide de língua: correlação clínica, histológica

e imuno-histoquímica. 2004. 110f. Dissertação (Mestrado em Patologia Oral) –

Departamento de Odontologia, Centro de Ciências da Saúde, Universidade Federal do

Rio Grande do Norte, Natal, RN, 2004.

RESUMO

O carcinoma epidermóide oral é a neoplasia maligna mais freqüente na cavidade

oral. Muitas pesquisas desenvolvidas visam estabelecer critérios que determinem o

comportamento biológico dessa neoplasia, assim, objetivou-se com esse trabalho realizar

uma análise clínica, morfológica e imuno-histoquímica através da expressão das

citoqueratinas 7, 10, 13, 14, 16 e 19 em 30 casos de carcinoma epidermóide de língua

retirados dos arquivos do Hospital Dr. Luiz Antônio (Natal-RN), correlacionando essa

expressão ao estadiamento clínico e gradação histológica de malignidade proposto por

Bryne (1998), com o intuito de verificar a utilização destes filamentos intermediários como

indicadores de progressão tumoral. Após a análise clínica das informações contidas nos

prontuários desses pacientes verificamos que os dados referentes a sexo, idade e raça se

assemelham aos da literatura pertinente. Os dados obtidos em relação ao desfecho da

doença, estadiamento clínico, presença de metástase, gradação histológica de malignidade,

e expressão das citoqueratinas 7, 10, 13, 14, 16 e 19 foram submetidos a análise estatística

(teste Qui2), observando-se que somente a gradação histológica de malignidade não

apresentou correlação significativa com as variáveis clínicas estudadas. A expressão dessas

citoqueratinas foi variada nos tumores analisados. A expressão da CK 10 mostrou

correlação estatisticamente significativa com a presença de metástase, a presença da CK 16

correlacionou-se ao desfecho da doença (óbito/remissão) e ainda aos estágios III e IV do

TNM. Esses resultados evidenciaram que a metástase e o estadiamento clínico (TNM)

mostraram boa efetividade como indicadores de prognóstico. O sistema de gradação

histológica de malignidade proposto por Bryne (1998) não refletiu o comportamento

biológico dos carcinomas epidermóides de língua estudados, e a análise de alguns

filamentos intermediários de citoqueratinas parece refletir o comportamento biológico e

agressividade dos carcinomas epidermóides orais.

PALAVRAS-CHAVE: Neoplasias bucais, língua-neoplasias, carcinoma de células

escamosas.

ABSTRACT

ABSTRACT

Oral squamous cell carcinoma is the most common malignant neoplasm in oral

cavity. Several studies have been carried out to establish biologic behaviour criteria of this

neoplasm. Thus, the purpose of this experiment was to performe a clinic, morphologic and

immunohistochemical analysis, by the expression of cytokeratins 7, 10, 13, 14, 16 and 19 in

30 cases of tongue squamous cell carcinoma from the files of Dr. Luiz Antônio Hospital

(Natal-RN). It was verifeid of the immunoexpression the correlation clinic estadiament and

histologic gradation system proposed by Bryne (1998), in order to investigate the use of

these intermediate filaments as an indicator of tumour progression. Data was collected from

the patients’ file and it was observed that information regarding sex, age and race was

resemble to the literature. Data obtained from disease evolution, clinic estadiament,

metastasis and expression of cytokeratins 7, 10, 13, 14, 16 and 19 was submited to

statistical analysis (Test K2), which showed that only the histologic gradation didn’t

demonstrated significant correlation to the clinic variables. The expression the cytokeratins

presented variation in the analysed tumours. CK 10 expression showed significant

correlation to metastasis, and the presence of CK 16 was related to disease evolution

(obit/remission) and also with the T3 and T4 of TNM. These results evidenced that

metastasis and TNM showed a good efficacy as a prognostic indicator. The histologic

gradation proposed by Bryne (1998) didn’t reflect the biologic behaviour of the studied

tongue squamous cell carcinoma, and the analysis of some intermediate filaments of

cytokeratins seems to reflect the biologic behaviour and agressivity of some oral squamous

cell carcinoma.

KEY-WORDS: Oral neoplasms, tongue-neoplasms, squamous cell carcinoma

SUMÁRIO

SUMÁRIO


LISTA DE TABELAS

RESUMO

ABSTRACT

1. INTRODUÇÃO 27

2. REVISÃO DA LITERATURA 30

2.1. Carcinoma epidermóide oral – Considerações gerais 31

2.1.2. Carcinoma eipidermóide oral x SGHM 35

2.2. Citoqueratinas – Considerações gerais 38

2.2.2. Citoqueratinas x Carcinoma epidermóide 42

3. PROPOSIÇÃO 50

4. MATERIAL E MÉTODOS 52

4.1. Caracterização do estudo 53

4.2. População 53

4.3. Amostra 53

4.4. Critérios de seleção da amostra 53

4.4.1. Critérios de inclusão 53

4.4.2. Critérios de exclusão 53

4.5. Estudo clínico 53

4.6. Estudo morfológico 54

4.7. Estudo imuno-histoquímico 56

4.8. Análise das células imunomarcadas 59

4.9. Análise estatística 59

4.9.1. Delineamento da análise 60

4.9.2. Variáveis estudadas 60

4.9.3. Definição do Teste Estatístico 60

5. RESULTADOS 61

5.1. Análise descritiva dos aspectos clínicos 62

5.2. Análise descritiva dos aspectos morfológicos 63

5.3. Análise descritiva da imunorreatividade às citoqueratinas estudadas 67

5.3.1. CK 7 67

5.3.2. CK 10 67

5.3.3. CK 13 67

5.3.4. CK 14 68

5.3.5. CK 16 68

5.3.6. CK 19 68

5.4. Resultados da Análise Estatística 75

6. DISCUSSÃO 83

7. CONCLUSÕES 96

REFERÊNCIAS 99

ANEXOS

INTRODUÇÃO

1. INTRODUÇÃO

O câncer oral é uma importante causa de morbidade e mortalidade no mundo, com

taxa de incidência variando largamente de acordo com a localização geográfica, e dentro de

uma mesma localização; varia entre grupos categorizados pela idade, sexo e raça

(HOWELL, 2003). No Brasil ocupa o sexto lugar em incidência no sexo masculino, e

oitavo lugar no sexo feminino, sendo a língua e o lábio os sítios mais acometidos.

O carcinoma epidermóide é a neoplasia maligna mais freqüente da cavidade oral,

correspondendo a quase 95% destas lesões, e cerca de 38% dos tumores malignos de

cabeça e pescoço (NEVILLE et al., 1998; COSTA et al., 2000). Apesar dos estudos

desenvolvidos, esta neoplasia ainda apresenta muitos aspectos desconhecidos,

principalmente em relação a seu comportamento e prognóstico; e mesmo com o avanço da

terapêutica oncológica nos últimos anos, o prognóstico dos portadores de câncer oral ainda

é reservado.

A agressividade desses tumores está relacionada a diversos fatores, dentre os quais

cita-se o grau histológico de malignidade, tamanho da lesão, grau de comprometimento dos

tecidos vizinhos, presença de metástase no momento do diagnóstico e localização

anatômica do tumor (BRYNE, 1991, TODO; DONOFF; WONG, 1997; BRYNE, 1998).

Dentre as localizações anatômicas, o câncer de língua apresenta um alto potencial de

invasão, e grande probabilidade de desenvolver metástase para linfonodos regionais (O-

CHAROENRAT et al., 2003; OKADA et al., 2003).

A carcinogênese oral é considerada um processo de muitas etapas, a qual envolve

múltiplas alterações genéticas que iniciam as mudanças fenotípicas. Vários fatores clínicos,

patológicos e moleculares têm sido identificados, alguns dos quais fornecem informações

sobre a evolução neoplásica, podendo ser considerados como indicadores biológicos de

agressividade do tumor (CHIESA et al., 1999). Também durante a carcinogênese, ocorrem

alterações celulares no citoesqueleto que podem ser analisadas através da expressão dos

filamentos intermediários de citoqueratina, como exemplo, células neoplásicas podem

expressar filamentos que não apresentam habitualmente, e deixar de exibir filamentos

expressos em tecido normal. Assim, a expressão de tais filamentos pode auxiliar a

compreender alguns dos mecanismos associados à transformação maligna e comportamento

dos tumores.

Muitos estudos realizados visaram estabelecer a correlação entre as características

clínicas e histológicas com o prognóstico do câncer oral, porém não obtiveram resultados

satisfatórios. Baseado nos relatos anteriores, constitui objetivo desta pesquisa correlacionar

o estadiamento clínico, gradação histológica de malignidade proposto por Bryne (1998), e

expressão das citoqueratinas em carcinoma epidermóide de língua, com o intuito de

verificar a possibilidade destes filamentos intermediários serem utilizados como

indicadores de progressão nestes tumores.

REVISÃO DA LITERATURA

2. REVISÃO DE LITERATURA

2.1. Carcinoma epidermóide oral – Considerações gerais

O Ministério da Saúde (2002) define o câncer como um grupo de doenças

caracterizado pela perda do controle da divisão celular e pela capacidade de invadir

estruturas orgânicas. Este continua tendo alta incidência no Brasil, sendo registrado

337.535 novos casos em 2002, dentre os quais 171.640 casos em mulheres (50,85%) e

165.895 (49,15%) em homens, com 122.600 óbitos.

Os cânceres orais incluem neoplasias malignas dos lábios, sítios intra-orais e da

orofaringe. As lesões de nasofaringe, hipofaringe e glândulas salivares maiores não estão

incluídas neste grupo (LLEWELLYN; JOHNSON; WARNAKULASURIYA, 2001).

O câncer oral acomete aproximadamente 7% da população mundial, onde o Brasil

ocupa o 4º lugar em incidência no mundo, estimando-se que cerca de 10% dos tumores

malignos em brasileiros localizam-se na boca (Instituto Nacional do Câncer, do Ministério

da Saúde, 2002). Atinge mais homens do que mulheres, ambos com idade acima de 60

anos. Entretanto, de acordo com Moore et al. (2000) esses dados se alteraram nos últimos

anos em função da mudança dos hábitos, observando-se também aumento da incidência em

pessoas jovens, abaixo de 45 anos de idade (MACKENZIE et al., 2000; LIEWELLYN;

JOHNSON; WARNAKULASURIYA, 2001).

O carcinoma epidermóide oral, também chamado de carcinoma de células

escamosas ou carcinoma espinocelular, representa a neoplasia maligna mais freqüente na

boca e é uma doença multifatorial com diversos elementos envolvidos na sua ocorrência

(NEVILLE et al., 1998; ABDO, 2001). Fatores intrínsecos tais como alterações genéticas,

deficiências nutricionais e imunossupressão; e fatores extrínsecos como radiação solar,

tabaco, álcool, e alguns vírus, têm sido apontados dentre os agentes relacionados a sua

etiopatogenia (ABDO, 2001; UOBE et al., 2001; NAGPAL; BIBHU, 2003). Yu et al.

(1999) relataram que a influência genética familiar também é um importante agente

contribuinte para o desenvolvimento de carcinomas de cabeça e pescoço.

O fumo e o álcool representam os fatores mais significativos na etiologia do câncer

oral. O tabaco, fumado ou mascado, pode atuar isoladamente ou em sinergismo ao álcool,

estando bem documentado que o risco para o desenvolvimento da carcinogênese aumenta

proporcionalmente com a quantidade de cigarros consumidos, havendo um efeito

multiplicativo quando associado ao álcool e quando ambos são utilizados em conjunto

(ALLISON; LOCKER; FEINE, 1998; HINDLE et al., 2000; ZAVRAS et al., 2001;

ALLISON, 2002, BRAD; COLE, 2002; GREENWOOD et al., 2003).

No tocante a etiologia viral, Summergill (2001) e Miller e Johstone (2001)

sugeriram que a infecção oral por HPV pode ter um papel significativo na carcinogênese e

progressão do câncer, atuando como um fator de risco independente para o carcinoma

epidermóide oral. Kojima et al. (2002) estudaram a relação do HPV-38 em 53 casos de

carcinomas epidermóides orais e verificaram que a positividade para este vírus estava

associada à super-expressão do p53 e PCNA, concluindo que a infecção por este vírus,

concomitante a outros fatores pode, ter um papel importante na carcinogênese oral,

podendo este atuar como co-fator no referido processo.

No que diz respeito aos fatores intrínsecos, a literatura referencia os hormônios,

imunossupressão, deficiências nutricionais e mutações genéticas (Ministério da Saúde,

2002). Zain (2001) relatou que muitos estudos in vitro e in vivo enfatizaram o papel da

dieta no câncer. A combinação de pesquisas leva a evidências de que as vitaminas A, C e E,

além dos carotenos podem diminuir a incidência dessas neoplasias, já que elas possuem

atividade anti-oxidante, pois reduzem as reações dos radicais livres evitando por

conseguinte as mutações no DNA, além de mudanças na membrana celular e na atividade

enzimática.

A carcinogênese oral está associada a alterações genéticas acumulativas (PANDE et

al., 2002; NAGPAL; BIBHU, 2003), onde esta reflete a susceptibilidade e tendência do

genoma de adquirir múltiplas alterações, as quais levam ao desequilíbrio no ciclo celular

que controla suas funções tais como divisão, diferenciação e morte celular (VICENTE et

al., 2002). O desenvolvimento do carcinoma epidermóide oral relaciona-se diretamente a

alterações na estrutura e regulação genética, principalmente naqueles genes reguladores do

processo de divisão celular (RAMALHO et al., 2002), sendo essas alterações genéticas

necessárias para que o fenótipo de câncer seja expresso (IBRAHIN et al., 2003). Yamazaki

et al. (2003) citaram que dentre as alterações genéticas, as mutações no gene p53 são as

mais comuns, podendo essa ser utilizada como indicador de prognóstico nos carcinomas

epidermóides orais. Alterações tais como perda da heterozigose, instabilidades

microsatélites e repetições de seqüências contribuem para ocorrência de tais mutações

(BOLAND et al., 1998).

O câncer oral tem apresentação clínica variada, incluindo as formas ulceradas,

leucoplásicas e leucoeritroplásicas, de crescimento exofítico ou endofítico, podendo ou não

desenvolver metástases para linfonodos regionais ou à distância (JORDAN; DALEY; 1997;

NEVILLE et al., 1998).

O carcinoma epidermóide ocorre principalmente na língua e lábios, podendo

acometer outros sítios como assoalho, mucosa jugal, gengiva e palato (REGEZI;

SCIUBBA, 2000; CANTO; DEVESA, 2002). Dentre estes sítios anatômicos, o carcinoma

de língua geralmente apresenta pobre diferenciação histológica, avançado estágio clínico,

evolução rápida e maior probabilidade de desenvolvimento de metástases à distância, sendo

assim uma lesão de prognóstico reservado, quando comparado ao carcinoma epidermóide

de outros sítios anatômicos orais (SCHARTZ et al., 2000; KERDPON; SRIPLUNG, 2001).

Alguns estudos apontaram fatores que influenciam no prognóstico e sobrevida dos

pacientes portadores desta neoplasia, destacando-se: gradação histológica de malignidade,

tamanho e localização do tumor primário, comprometimento de linfonodos regionais e

presença de metástases à distância (BRYNE, 1991, TODD; DONOFF; WONG, 1997;

BRYNE, 1998; RAJHI et al., 2000). Moles et al. (2002) reportaram que a espessura do

tumor é o principal parâmetro que influencia na sobrevida de pacientes portadores de

câncer de língua. Takes et al. (2002) e Okada et al. (2003) afirmaram que a presença de

metástase em linfonodos cervicais é considerada como indicador de pobre prognóstico em

pacientes portadores desta neoplasia.

Segundo relatos de Nithya et al. (2003), a língua é a localização mais acometida

pelo carcinoma epidermóide oral, bem como a mais relacionada à baixa taxa de sobrevida e

a altas incidências de desenvolvimento de metástases para linfonodos cervicais, pois de 34

a 50% dos pacientes com tumores de pequenas dimensões e cerca de 62,3% dos pacientes

acometidos por tumores de dimensões maiores deste estudo desenvolviam metástases,

sendo verificado que este parâmetro foi um forte indicador de sobrevivência e prognóstico

em pacientes acometidos por câncer de língua.

Conforme Allison, Locker e Feine (1998), o diagnóstico tardio contribuiu para um

pior prognóstico em pacientes portadores de carcinoma epidermóide oral, baseados na

evidência de que pacientes nos quais o câncer foi diagnosticado tardiamente apresentaram

pior prognóstico do que aqueles onde o mesmo foi diagnosticado precocemente,

adicionando que a mortalidade pode ser reduzida se as lesões forem diagnosticadas e

tratadas precocemente.

Objetivando uniformizar as informações clínicas, a União Internacional Contra o

Câncer criou um sistema de estadiamento clínico para tumores malignos, o TNM, o qual se

tornou a forma de comunicação entre os centros de tratamento, baseando-se na extensão

anatômica da doença, no intuito de fornecer informações sobre o prognóstico, e auxiliar no

planejamento do tratamento (CARINCI et al., 1998). Suas variáveis significam: T –

tamanho do tumor primário, N - presença de metástase em linfonodos regionais e M -

metástases à distância; e a quantificação destes parâmetros constitui o “estadiamento” o

qual varia dos estágios I ao IV (ALLISON; LOCKER; FEINE, 1998; NEVILLE et al.,

1998).

De acordo com Dib et al. (1994), o sistema TNM é muito útil, principalmente para

avaliar características clínicas do câncer como extensão local, disseminação regional e

metástase à distância, apesar de considerá-lo falho como indicador prognóstico pelo fato de

não avaliar as características histológicas e a relação tumor-hospedeiro.

Para Hiratsuka et al. (1999) o sistema TNM representou o parâmetro prognóstico

mais exato. De acordo com Pugliano et al. (1999), os principais objetivos deste sistema são:

auxiliar no planejamento, dar alguma indicação do prognóstico, ajudar na avaliação dos

resultados do tratamento, facilitar troca de informações entre centros de tratamento e

contribuir na investigação contínua de cânceres humanos. Este sistema é baseado na

suposição de que pequenos tumores sem metástases têm melhor prognóstico que tumores

maiores com metástases, apesar de conhecer-se que alguns tumores com o mesmo

estadiamento clínico mostram diferentes padrões de crescimento e prognóstico, reforçando,

portanto, a necessidade de outros métodos para avaliação prognóstica.

2.1.2. Carcinoma eipidermóide oral x SGHM

A gradação histopatológica de malignidade do carcinoma epidermóide oral é um

recurso microscópico que visa classificar a lesão de acordo com o grau de diferenciação

celular, no intuito de fornecer subsídios que possibilitem a interpretação da agressividade

do tumor. Existem diversas gradações descritas na literatura, denominadas de sistemas de

gradação histopatológica de malignidade (SGHM), com o propósito comum de fornecer

subsídios para possibilitar a interpretação da agressividade da neoplasia (MARTINS

NETO, 1999).

Os primeiros trabalhos visando a classificação histopatológica dos carcinomas

epidermóides orais foram de Broders (1920) e Broders (1941). Neste sistema, foram

avaliados os fatores influenciadores na malignidade dos tumores, relacionando a proporção

de células anaplásicas ao grau de malignidade, ressaltando-se a associação entre a

diferenciação dos tumores com o tratamento e prognóstico. Posteriormente, muitas

classificações histológicas se seguiram, sempre procurando aperfeiçoar as anteriores,

acrescentando-se novos parâmetros, como população celular tumoral, ceratinização, atipias

nucleares além da reação do hospedeiro frente ao tumor, avaliando o padrão de invasão,

comprometimento vascular e presença de infiltrado inflamatório linfoplasmocitário

(JAKOBSSON et al., 1973).

Eneroth e Morberger (1973) analisaram as características histopatológicas em 110

casos de pacientes portadores de carcinoma epidermóide de palato pelo sistema proposto

por Jakobsson (1973), desconsiderando o estadiamento clínico, tratamento e o curso da

doença. Baseados no SGHM utilizado, tais pesquisadores observaram que dos pacientes

portadores de neoplasias consideradas de alto grau de malignidade, 93% deles foram a

óbito, enquanto apenas 7% dos acometidos por tumores de baixo grau de malignidade

faleceram em conseqüência da neoplasia.

Lund et al. (1975) realizaram um estudo envolvendo 49 pacientes portadores de

carcinoma epidermóide de língua, onde o sistema de gradação histológica de malignidade

era composto de 8 parâmetros de 4 graus cada um, verificando não existir associação

significativa entre gradação histopatológica de malignidade e o estadiamento clínico.

Holm et al. (1982) analisaram 95 casos de carcinoma epidermóide nos 2/3 anteriores

da língua, baseados nos seguintes parâmetros: diferenciação, pleomorfismo celular,

mitoses, modo e estágio de invasão, além de reação inflamatória. O sistema de gradação

histológica utilizado mostrou-se eficaz como indicador de progressão tumoral, pelo fato das

metástases serem mais freqüentes nos casos de carcinomas menos diferenciados.

Em 1987, Anneroth, Batsakis e Luna realizaram uma revisão da literatura sobre os

SGHM, e criaram um sistema de gradação histológica de malignidade para carcinomas

epidermóides orais, considerando a população tumoral em relação ao grau de ceratinização,

pleomorfismo celular e número de mitoses, bem como em relação à resposta do hospedeiro

através dos parâmetros, padrão de invasão, estágio de invasão e infiltrado inflamatório. Este

sistema estabelecia uma escala gradativa que variava dos níveis I ao IV.

Bryne et al. (1989) propuseram um novo sistema de gradação histológica de

malignidade para o carcinoma epidermóide, aplicado à biópsias incisionais, priorizando a

frente de invasão tumoral, sendo considerado morfologicamente o grau de ceratinização

celular, pleomorfismo celular, número de mitoses, padrão de invasão tumoral e reação

inflamatória, emitindo-se valores numéricos de 1 a 4 para estes cinco critérios. O escore

total foi dado pela soma dos escores. Foram classificados como grau I ou de baixo escore

de malignidade, os tumores que mostraram pontuação de 5 a 10 e grau 2 ou alto escore os

que demonstraram pontuação superior a 10.

Em 1991 esta mesma autora fez uma revisão do valor prognóstico de várias

características celulares e moleculares do carcinoma epidermóide oral, bem como

comparou os resultados obtidos no estudo utilizando o método proposto por ela e

colaboradores em 1989 com outros estudos publicados anteriormente. Esta considerou seu

método como sendo um fator prognóstico suplementar ao TNM, mas que também podia ser

utilizado isoladamente como um bom indicador de prognóstico.

Dib et al. (1994) realizaram um estudo em 59 casos de carcinoma epidermóide de

borda de língua objetivando verificar o valor prognóstico das características clínicas e

histológicas, concluindo que o grau histológico de malignidade não apresentou correlação

com a sobrevida dos pacientes, havendo correlação somente com a presença de metástase

regional.

Bryne (1998) revisou seus trabalhos sobre os sistemas de gradação histológica de

malignidade e desenvolveu um SGHM específico para as massas invasivas de carcinomas

epidermóides orais baseado no grau de ceratinização, pleomorfismo celular, padrão de

invasão tumoral e infiltrado inflamatório, aplicando escores numéricos de 1 a 4 a cada

parâmetro, método este priorizando a frente de invasão tumoral. A autora concluiu que esse

sistema tem um importante valor para o prognóstico e terapêutica, sugerindo que a

gradação do front invasivo é um dado valioso para análise histológica, uma vez que vários

eventos moleculares de importância ocorrem na interface tumor-hospedeiro, citando-se

perdas e ganhos de moléculas de adesão, secreção de enzimas proteolíticas, aumento da

proliferação celular e início da angiogênese.

Relatos de Sawair et al. (2003) indicaram que a análise do front invasivo foi

correlacionada diretamente ao desenvolvimento de metástases para linfonodos regionais em

carcinomas epidermóides orais, sendo sugerido nesse estudo que tumores que invadiam em

pequenos grupos celulares mostravam uma tendência maior a metastatizar, sendo este o

principal fator relacionado ao prognóstico, determinando dessa forma a sobrevivência em

pacientes acometidos por esta neoplasia.

Para Martins Neto (1999) os SGHM de carcinomas epidermóides orais constituem

procedimentos histológicos importantes para análise dos pacientes portadores de tal

neoplasia, devendo constituir-se numa linguagem comum entre estomatologistas,

patologistas, oncologistas e cirurgiões, pois influenciam diretamente no planejamento

terapêutico e no prognóstico do caso.

Dantas (2000) realizou um estudo em 18 casos de carcinoma de língua visando

correlacionar os escores histológicos de malignidade pelo sistema proposto por Anneroth,

Batsakis e Luna (1987) e a classificação de estadiamento clínico (TNM) para obtenção de

parâmetros indicadores de prognóstico, concluindo que não existe correlação

estatisticamente significativa entre o estadiamento clínico (TNM) e a gradação histológica

de malignidade usada. No entanto, o TNM mostrou boa efetividade como parâmetro

indicador de prognóstico.

Costa et al. (2002) estudaram a correlação entre estadiamento clínico (TNM),

gradação histológica desenvolvida por Wahi (1971) e localização anatômica da lesão em

120 pacientes acometidos pelo carcinoma epidermóide oral. Este sistema de gradação

mostrou correlação estatisticamente significativa com o TNM, e adicionalmente, hove

correlação entre TNM e localização anatômica, ressaltando-se que as lesões localizadas em

língua, palato e assoalho apresentavam uma maior tendência a exibir um pior prognóstico.

Nagler et al., neste mesmo ano, estudaram 116 pacientes acometidos por câncer de

língua e verificaram que a sobrevida em portadores desta neoplasia com estadiamento I era

de 82%, enquanto que para o IV era de 13%, observando também que em tumores bem

diferenciados, moderadamente e pobremente diferenciados a taxa de sobrevida de 5 anos

era de 72%, 35% e 0% respectivamente.

2.2. Citoqueratinas – Considerações gerais

As células neoplásicas exibem diversas alterações, sendo uma delas as variações

arquiteturais, principalmente as do citoesqueleto. Estudos têm sido realizados com

marcadores por meio de reações imuno-histoquímicas utilizando anticorpos contra as várias

citoqueratinas, já que estas representam o maior componente do citoesqueleto, com o

propósito de relacioná-las com o grau histológico de malignidade e prognóstico, na

tentativa de obter-se ferramentas que contribuam para elucidação dos mecanismos

envolvidos no desenvolvimento dos carcinomas epidermóides orais.

As citoqueratinas (CK) constituem uma complexa família de no mínimo 20

diferentes polipeptídios, de peso molecular compreendido entre 40 e 68 Kd, e pH variando

de 5,2 a 7,8. As mesmas se enquadram em duas categorias de acordo com seus pesos

moleculares, pH e determinantes antigênicos em, citoqueratinas do tipo I, ácidas (CK 9 a

CK 20) e tipo II, formada por citoqueratinas neutras e básicas (CK 1 a CK 8) (CLAUSEN

et al., 1986; MORGAN; LAN SU, 1994; HEATLEY, 1996; CHU; WEISS, 2002).

Elas constituem o maior elemento estrutural do citoesqueleto (HERRMANN et al.,

2002), e suas funções incluem a organização do complexo estrutural intramolecular, bem

como manutenção da forma da célula, conferindo estabilidade ao epitélio, e conseqüente

resistência a estresses mecânicos (HEYDEN et al., 1992; MCLEAN; LANE, 1995). Sua

expressão normal geralmente se dá aos pares, de forma que se observa numa dada célula

epitelial heteropolímeros de citoqueratinas formados por subunidades de heterodímeros do

tipo I e II, em quantidades aproximadamente equimolares. Assim, a maioria das

citoqueratinas ácidas forma par com uma básica, definindo dessa forma um padrão de

expressão (COOPER; SCHERMER; SUN, 1985; MORGAN et al., 1987).

Essas proteínas são estáveis, resistentes à degradação, mostram grande fidelidade de

expressão e antigenicidade (MORGAN et al., 1987; FUSCHS; CLAVELAND, 1998).

Diferente das outras proteínas do citoesqueleto, os filamentos intermediários de

citoqueratina mostram uma considerável especificidade tecidual. Assim, o tecido epitelial

normal apresenta um padrão característico de expressão de citoqueratinas. Entretanto, essa

expressão varia com o tipo celular, estágio de desenvolvimento, diferenciação tecidual e

mudanças patológicas (CLAUSEN et al., 1986; SWAFF; OUHAYOUN; FOREST 1991;

PELISSIER et al., 1992; HEYDEN et al., 1992).

O catálogo descrito por Moll et al. (1982) mostrou que as CKs 7, 8, 18 e 19 são

típicas de epitélios simples, enquanto que as CKs 3 e 12 foram expressas somente na córnea

humana. Verificou-se também que a CK 19 constitui o principal componente dos epitélios

simples. Estes fatos foram relatados posteriormente por Chu e Weiss (2002), em sua

revisão sobre a expressão dos filamentos intermediários de citoqueratinas em tecidos

humanos e neoplasias.

O quadro 1 mostra a distribuição das citoqueratinas, associação aos pares, peso

molecular e tipo do epitélio de acordo com Cooper, Schermer e Sun (1985).

Quadro 1 – Localização, pesos moleculares e pH dos pares de citoqueratinas no epitélio normal

CK PM (KDa)

pH LOCALIZAÇÃO

10/ 1,2 56,5/ 65-67 5,3/ 6-8 Epitélios ceratinizados 12, 3 55, 64 4,9/ 7,5 Epitélio da córnea humana 13, 4 51, 59 5,1/ 7,3 Epitélios estratificados não ceratinizados 14, 5 50, 58 5,3/ 7,4 Ceratinócitos basais 16, 6 48, 56 5,1/ 7,8 Ceratinócitos hiperproliferativos 17, 7 46, 54 5,1/ 6,0 Epitélios simples, alguns estratificados 18, 8 45, 52 5,7/ 6,1 Principalmente epitélios simples

19 40 5,2 Principalmente epitélios simples 20 42 5,4 Não está presente no epitélio oral – epitélio

intestinal, células de Merkel (Adaptado de Cooper, Schermer, Sun, 1985)

Em algumas situações este padrão se altera, como, por exemplo, nos casos de alguns

processos inflamatórios, tecidos hiperplásicos, metaplásicos, neoplásicos ou que sofreram

influências ambientais, tais como exposição a certas drogas e hormônios (COOPER;

SCHERMER; SUN, 1985; MACKENZIE; GAO, 1993; HETLEY, 1996, FUCHS;

CLEVAND 1998).

Em um estudo com 18 lesões orais clinicamente benignas, dentre elas hiperplasia,

hiperceratose, líquen plano e fibroma, quanto à expressão das CKs 8 e 18, Velden et al.

(1999) relataram que estas podem ser úteis na diferenciação de lesões benignas da mucosa

oral das potencialmente malignas.

Segundo relatos de Schulz et al. (1992), Ogden et al. (1993) e Chu e Weiss (2002),

as citoqueratinas CK 5 e CK 14 são expressas na camada basal dos epitélios estratificados,

sendo marcadores permanentes destes até mesmo na presença de processos patológicos,

como referenciado também por Turatti (1999), que detectou a imunomarcação da CK 14

em todos os casos de líquen plano oral por ela estudados, sendo tal fato associado a

influência exercida pelo infiltrado inflamatório presente, bem como uma tentativa de

manutenção da integridade estrutural do revestimento epitelial destas lesões. Boisnic et al.

(1995) relataram que as CK 4 e 13 são expressas principalmente nas camadas suprabasais

de epitélios não ceratinizados, enquanto que Morgan e Lan Su (1994) e Depondt et al.

(1999) referiram que as células suprabasais de epitélios ceratinizados expressam as CKs 1 e

10, que são específicas de diferenciação.

Conforme relatado por Weiss, Eichner e Sun (1984) e Morgan e Lan Su (1994), o

epitélio estratificado, quando encontra-se em alta renovação ou em estados

hiperproliferativos expressa o par CK 6, 16, sendo estas denominadas citoqueratinas de fast

cell turnover.

Para análise da expressão dos filamentos intermediários de citoqueratinas são

utilizados anticorpos monoclonais dirigidos contra as mesmas, através de técnicas imuno-

histoquímicas. Outra técnica de identificação inclui a eletroforese em gel (HORMIA et al.,

1988; SHABANA et al., 1989). Sawaf, Ouhayoun e Forest (1991) relataram que a

abordagem imuno-histoquímica é mais sensível do que a análise pelo gel de eletroforese,

por ter a capacidade de revelar a presença de poucas células em um tecido, uma vez que

permite a detecção individual de células positivas, o que seria impossível pelas técnicas

bioquímicas, constituindo-se a imuno-histoquímica num critério diagnóstico valioso de

identificação celular.

Löning et al. (1980) e Morgan et al. (1987) apresentaram uma contribuição

importante para o estudo da aplicação de anticorpos anti-queratina no diagnóstico oral,

através da realização de reações em várias localizações da mucosa oral, displasias, câncer

oral, tumores de glândula salivar e odontogênicos. Estes autores concluíram ser de grande

valia a utilização de tais anticorpos como marcadores de linhagem celular epitelial, ou

mesmo como indicadores de mudanças progressivas nos tumores.

Hormia et al. (1988) também ressaltaram o valor potencial das citoqueratinas no

diagnóstico oral, bem como sua utilização para verificar possíveis mudanças do padrão

normal de diferenciação em estados patológicos originados do revestimento epitelial oral.

Este fato foi confirmado por Cintorino et al. em 1990, quando afirmaram que a expressão

destas proteínas pode auxiliar na compreensão de alguns dos mecanismos associados à

transformação maligna e comportamento de alguns tumores.

Em 1990 Dale, Salonen e Jones ao estudarem o epitélio de revestimento da mucosa

oral em relação as suas modificações e diferenciação, afirmaram que as citoqueratinas são

usadas como marcadores de diferenciação, já que sua expressão é específica tanto para

determinada região epitelial como para o estágio de diferenciação celular, verificando

adicionalmente que a proximidade de áreas com diferentes características funcionais e

diferentes padrões de diferenciação na cavidade oral indicam uma excelente regulação de

diferenciação tecido-específica.

Neste mesmo estudo, Dale, Salonen e Jones relataram também que a expressão

destes filamentos intermediários nas diferentes camadas celulares epiteliais é distinta, o que

indica um programa de diferenciação específico. Como exemplo, as citoqueratinas

expressas nas células basais da língua são as CKs 5, 14 e 15, enquanto nas células

suprabasais são as CK 1, 10 e 13. Mc Lean e Lane (1995) e Heatley (1996) confirmaram

que a camada basal e as camadas suprabasais do epitélio se apresentam diferentes em

relação ao estágio de diferenciação celular e mostram conseqüentemente diferente

distribuição de citoqueratinas, achado este que prova a modificação do perfil destas

proteínas na célula, durante sua divisão e diferenciação ao longo das camadas epiteliais.

Sawaff, Ouhayoun e Forest (1991) relataram que a transformação maligna é

freqüentemente associada a alterações no padrão de expressão dos filamentos

intermediários de citoqueratinas.

Para Silveira et al. (2002) os filamentos intermediários de citoqueratinas

representam importantes marcadores de diferenciação, sendo fundamental seu emprego em

diversas patologias sediadas na cavidade oral, funcionando também como importante

instrumento no diagnóstico diferencial entre neoplasias epiteliais e mesenquimais, distinção

de diferentes tipos celulares no mesmo tecido, além de ser útil no reconhecimento de

tumores metastáticos em estudos morfogenéticos, bem como na classificação de neoplasias

pobremente diferenciadas.

2.2.2. Citoqueratinas x Carcinoma epidermóide

Como relatado anteriormente, o padrão de marcação das citoqueratinas nas células

epiteliais reflete o grau de diferenciação tecidual. Assim podem ser observadas expressões

aberrantes durante o processo de carcinogênese ou até mesmo ausência de expressão de

algumas citoqueratinas. Em outras palavras, a expressão dos filamentos intermediários de

citoqueratinas pode ser modulada por mudanças na proliferação e diferenciação das células,

sendo que a expressão destas pode ou não ser alterada depois da transformação maligna

(VAIDYA et al., 1996). De acordo com Chu, Wu e Weiss (2002), a elevada diversidade no

padrão de expressão destes filamentos intermediários tem sido relacionada a diferentes

caminhos da diferenciação epitelial.

Diversos trabalhos foram e têm sido realizados sobre a expressão destes filamentos

intermediários em lesões pré-malignas e carcinomas epidermóides orais, na tentativa de

relacionar esta expressão ao comportamento biológico destas neoplasias.

Em 1989, Lindberg e Rheiwald avaliaram a expressão da CK 19 em neoplasmas

epiteliais humanos bem como em mucosa oral normal e displasias, usando o anticorpo

monoclonal A53-B/A2. Foi observado neste estudo que em mucosas normais não

ceratinizadas havia positividade nas células basais para esta citoqueratina, já nas displasias

leves ocorreu marcação em células basais e algumas células suprabasais enquanto nas

displasias moderadas a severas a marcação envolveu todos os estratos epiteliais, e nos

carcinomas por sua vez a marcação foi dispersa. Nas mucosas ceratinizadas normais não

houve marcação para a CK 19, enquanto que nas displasias moderadas a severas nestes

locais houve marcação dispersa e nos carcinomas houve positividade principalmente nos

casos avançados. Para estes autores, a imunomarcação dessa citoqueratina não era apenas

uma simples conseqüência do estado hiperproliferativo, mas sim um marcador de atipia

celular associado a uma condição de pré-malignidade.

Em uma extensa revisão da literatura para definir o perfil das citoqueratinas no

epitélio oral normal e processos patológicos, Sawaf, Ouhayoun e Forest em 1991

verificaram que em carcinomas bem diferenciados havia expressão das CKs 10 e 13, os

moderadamente diferenciados expressaram intensamente a CK 13 nas células suprabasais e

CK 19 em células basais. Já os tumores pobremente diferenciados eram ricos em

citoqueratinas de epitélio simples, como CK 7, 8, 18 e 19.

Schulz et al. (1992) investigaram o padrão de expressão de vários tipos de

citoqueratinas em mucosa oral normal, hiperplasias fibrosas, líquen plano, leucoplasias e

carcinomas epidermóides. Eles observaram que nas lesões benignas estudadas não houve

mudança na expressão destas quando comparadas ao revestimento epitelial normal,

contrariamente aos casos de carcinomas epidermóides orais, onde foram observadas

marcação para as citoqueratinas de epitélio simples, respectivamente CKs 8, 18 e 19, sendo

verificado nesse experimento que tais alterações são vistas como um critério adicional de

diagnóstico diferencial entre lesões não agressivas e agressivas, sendo estas indicativas de

pré-malignidade e malignidade.

Neste mesmo ano, Heyden et al. mostraram que a CK 13 se expressa nas células

suprabasais e a CK 14 na camada basal de epitélios normais, enquanto que nos carcinomas

há um aumento de expressão da CK 14 em todas as células do epitélio, estando ausente nas

células neoplásicas invasivas; e a CK 13 perde sua expressão tanto no epitélio de

revestimento como nas células neoplásicas dos carcinomas, concluindo estes autores que a

CK 13 é um marcador de diferenciação da mucosa oral humana e que as citoqueratinas

podem ser úteis para definir o grau de diferenciação em carcinomas orais, servindo estas

como marcadores de alterações precoces.

Objetivando verificar se havia alteração na marcação das citoqueratinas

concomitante ao grau de diferenciação tumoral, Ogden et al. (1993) compararam a

imunomarcação das CKs 8, 13, 18 e 19 em carcinomas epidermóides orais e epitélios

normais, observando que a expressão da CK 13 é reduzida nos cânceres orais e que as CKs

8, 18 e 19 são evidenciadas tanto em tumores pobremente diferenciados como nos bem

diferenciados, não sendo estas últimas relacionadas ao grau de malignidade, apesar de

sugerirem que existe correlação entre o padrão de expressão dos filamentos intermediários

de citoqueratinas e o prognóstico do câncer oral.

Vários outros estudos imuno-histoquímicos revelaram diferenças no perfil das

citoqueratinas comparando displasias, carcinomas epidermóides e mucosa oral normal.

Morgan et al. (1991) citaram a tendência à expressão ectópica das CKs 8 e 19, enquanto

que Vaidya et al (1989) e Heyden et al (1992) referiram a redução da expressão das CKs 5

e 14 nos carcinomas.

Morgan e Lan Su (1994) detectaram mudanças no perfil dos filamentos

intermediários de citoqueratinas em displasias e carcinomas epidermóides orais. Neste

estudo, um achado freqüente foi a redução gradual na expressão das CKs 1, 10 e CKs 4 e

13 a medida que havia progressão de displasia leve para displasia severa, inferindo os

autores haver um decréscimo da capacidade de diferenciação celular concomitante com a

displasia epitelial. Os carcinomas epidermóides orais bem diferenciados avaliados exibiram

conservação dos pares CKs 1, 10 e CKs 4 e 13 apesar da sua expressão ser reduzida.

Verificou-se adicionalmente a presença das citoqueratinas de epitélios simples,

principalmente a CK 18, sugerindo-se que a síntese desta última pareceu refletir o

comportamento de malignidade, sendo isto suportado pela sua forte expressão em

linfonodos metastáticos destes tumores.

Estes mesmos autores relataram também que a verificação do perfil das

citoqueratinas em cânceres orais revela que a diferenciação do epitélio da mucosa oral

pode ser modulada pela alteração na expressão do padrão destes filamentos

intermediários durante o desenvolvimento da malignidade.

Xu et al. (1995) constataram que a CK 1 expressa normalmente em epitélios

ceratinizados estava presente também nos carcinomas epidermóides orais, e fortemente

expressa em lesões displásicas, fato este associado com a perda da diferenciação e

ceratinização dessas lesões pré-malignas. Para a CK 13 estes autores verificaram que

havia marcação tanto em epitélios normais como em hiperplasiados, displásicos e

neoplásicos, não sendo este filamento intermediário bom marcador de progressão de

malignidade, sendo este fato observado também para a CK 19, que apesar de estar

presente proporcionalmente ao avanço de mucosa normal à carcinoma, não

correlacionou-se ao grau de diferenciação tumoral. A expressão da CK 8 foi observada

em carcinomas avançados, refletindo meramente o estágio de diferenciação de lesões

epiteliais pré-malignas.

Através da imuno-histoquímica e hibridização in situ Su, Morgan e Lane (1996)

verificaram que a regulação dos filamentos intermediários de citoqueratinas estava alterada

na transformação maligna, através da avaliação da expressão das CKs 14 e 19 em epitélio

normal e carcinoma epidermóide da mucosa oral em graus histológicos distintos. No

epitélio normal, tanto a proteína como o RNAm da CK 14 estavam presentes quase que

exclusivamente na camada basal. O carcinoma epidermóide exibiu marcação irregular

destes filamentos intermediários nas células superficiais. No carcinoma epidermóide bem

diferenciado foi observada uma expressão abundante do RNAm e da proteína da CK 14,

enquanto que no indiferenciado foi detectado apenas o RNAm desta. Em relação à CK 19,

o RNAm e sua proteína estavam presentes predominantemente nas células basais do

epitélio normal não ceratinizado, enquanto que no ceratinizado foi detectado apenas seu

RNAm. O RNAm desta citoqueratina foi observado em todos os carcinomas, apesar de sua

proteína estar ausente na maioria dos casos. No carcinoma epidermóide bem diferenciado

não foi evidenciado RNAm e a proteína da CK 19. Entretanto, o tipo indiferenciado revelou

marcação positiva.

Bongers et al. (1996) constataram uma marcação significativamente maior das CKs

16 e 19 na mucosa normal adjacente aos tumores em pacientes portadores de carcinomas

epidermóides quando comparadas a mucosa normal dos pacientes do grupo controle.

Encontradas normalmente na mucosa alveolar e língua, as CKs 5 e 14 não foram

detectadas na maioria dos carcinomas orais destas localizações em um estudo desenvolvido

por Vaidya et al. (1996), ao contrário das CKs 1 e 10 que expressaram-se intensamente

nesses tumores, e a CK 18 marcador de epitélios simples, que também esteve presente na

maioria dos casos estudados. Neste trabalho foi sugerido que havia perda das CKs básicas 5

e 14 e expressão aberrante de citoqueratinas de epitélios simples durante a transformação

maligna. Os mesmos autores em 1998 estudando lesões cancerizáveis da mucosa oral,

dentre elas leucoplasia e fibrose submucosa, notaram a ausência da CK 5 na amostra,

considerando que tal fato associado à expressão da CK 18 pode ser um evento importante

na transformação maligna do epitélio oral, concluindo entretanto que a expressão destes

filamentos intermediários, que é específica para cada tipo celular, pode ser modulada por

mudanças no estado de proliferação ou diferenciação, se alterando ou não após

transformação maligna.

Estudando displasia epitelial no esôfago, Itakura et al. (1996) não encontraram

diferenças significativas na expressão das CKs 10, 13 e 14 em pacientes portadores e não

portadores de carcinoma epidermóide. Os resultados indicaram que padrões anormais da

expressão de citoqueratinas não ocorrem somente em células atípicas, mas também em

células não atípicas na displasia esofágica.

Depondt et al. (1999) objetivando verificar se as citoqueratinas representavam

marcadores de diferenciação epitelial em tecidos normais e patológicos, e se sua expressão

era reflexo do comportamento tumoral, avaliaram a imunomarcação destes filamentos

intermediários usando anticorpos monoclonais anti-CK 4, 5, 7, 8, 10, 13, 14, 17, 18 e 19

em 80 espécimes de mucosa normal e 26 carcinomas epidermóides orais. Para a mucosa

normal os autores verificaram que as CKs 4 e 13 estavam presentes nas células suprabasais,

as CKs 5 e 14 nas basais, e a CK 19 também em algumas células basais, não observando-se

imunomarcação para as CKs 7, 8, 17 e 18. Nos casos de carcinomas epidermóides orais

houve expressão atípica das CKs 7, 8, 17 e 18 além da presença da CK 10 e da 19 em

posição basal e suprabasal.

Neste mesmo estudo, os autores observaram que algumas citoqueratinas como as

CKs 10 e 19 apresentaram correlação significativa com o tamanho do tumor; a expressão da

CK 18 estava correlacionada com o envolvimento de linfonodos e a presença da CK 13

com o comportamento tumoral, sendo a expressão desta última reduzida em tumores que

desenvolveram recidivas ou metástases à distância, inferindo-se adicionalmente que as CKs

7, 8, 17 e 18 podem ser úteis no diagnóstico de carcinoma já que as mesmas foram

expressas somente nestes estados patológicos.

Diante desses achados, Depondt et al. (1999) concluíram que as citoqueratinas são

úteis no diagnóstico diferencial e confirmação de lesões pobremente diferenciadas, além de

que a marcação destas pode estar correlacionada ao comportamento tumoral.

Silva (1999) visando caracterizar o perfil da expressão das citoqueratinas em

carcinomas epidermóides orais, estudou sua imunomarcação em tumores de diversas

localizações da boca, utilizando anticorpos monoclonais para as citoqueratinas 7, 8, 10, 13,

14, 16, 18, 19 e 20. A CK 14 esteve presente em todos os carcinomas, independente do grau

de diferenciação e da localização, enquanto que as CKs 10 e 13 foram expressas somente

em regiões bem diferenciadas dos tumores. O padrão da CK 16 foi variado e independente

do grau de diferenciação histológica e da localização, contrariamente, as CKs 7, 8, 18 e 20

não foram imunomarcadas nas células neoplásicas dos casos estudados e a CK 19 esteve

presente em 20% dos casos dos carcinomas de língua, assoalho e palato. Este autor

verificou que é difícil traçar um perfil de expressão das citoqueratinas em carcinomas

epidermóides orais, devido à dificuldade inerente às variações que devem ocorrer não só

pela localização do tumor, mas também devido aos fatores carcinogênicos atuantes em cada

caso estudado. Em adição, as CKs 10 e 13 estão presentes em células bem diferenciadas, e

fatores que atuam na formação destas citoqueratinas pelas células neoplásicas poderiam

elucidar caminhos no controle e maturação celular da neoplasia.

Hanson et al. (2001) avaliaram e compararam a expressão das citoqueratinas em

culturas celulares normais e de epitélio maligno com a expressão destas em segmentos de

mucosa oral, em displasias severas e carcinomas bem diferenciados. Neste estudo foram

observadas algumas diferenças de expressão destes filamentos intermediários nestes dois

meios, sugerindo que estas diferenças são decorrentes do fenótipo embriológico de

diferenciação dos ceratinócitos e, que a cultura organotípica é um meio que pode evidenciar

as mudanças na expressão das citoqueratinas durante as várias etapas da carcinogênese.

As CKs 19 e 20 foram consideradas marcadores de diferenciação e indicadores de

prognóstico por El-Salahy (2002), através da detecção destas proteínas em carcinomas de

bexiga em estágio avançado.

Vora et al. (2003) utilizaram um painel de biomarcadores como p53, Bcl-2, ciclina

D1, c-myc, p21ras, c-erb2 e CK19 objetivando utilizá-los como indicadores de prognóstico

em tumores da região anterior e posterior da língua em estágio avançado. Foi constatado

que nessa pesquisa que a marcação da CK 19 não teve relação significativa com o estágio

avançado destes tumores de língua.

PROPOSIÇÃO

3. PROPOSIÇÃO

O presente experimento teve como objetivo avaliar a incidência de dados clínicos e

morfológicos bem como estudar através da técnica da imuno-histoquímica, a expressão das

citoqueratinas 7, 10, 13, 14, 16 e 19 em carcinomas epidermóides de língua provenientes de

peças cirúrgicas, correlacionando esta expressão a dados clínicos e gradação histológica de

malignidade proposto por Bryne (1998), com o intuito de verificar a utilização dessas

citoqueratinas como indicadoras de progressão tumoral.

MATERIAIS EMÉTODO

4. MATERIAL E MÉTODOS

4.1. Caracterização do estudo

Esta pesquisa se constituiu em um estudo clínico, morfológico e imuno-

histoquímico de correlação entre a expressão das citoqueratinas 7, 10, 13, 14, 16 e 19 com

dados clínicos e morfológicos em carcinoma epidermóide de língua.

4.2. População

A população foi composta pelos casos de câncer oral, pertencentes ao arquivo do

Hospital Dr. Luiz Antônio, Natal/RN.

4.3. Amostra

Para constituir amostra desta pesquisa, foram selecionados 30 casos de carcinoma

epidermóide de língua dos pacientes atendidos no período de 1997 a 2000 no Hospital Dr.

Luiz Antônio, Natal/RN.

4.4. Critérios de seleção da amostra

4.4.1. Critérios de inclusão

Foram selecionados os casos de carcinoma epidermóide de língua os quais as fichas

clínicas estavam preenchidas corretamente, para anotação de todos os dados clínicos de

interesse para realização do estudo clínico, e ainda aqueles casos onde os pacientes foram

submetidos a tratamento cirúrgico para análise do front de invasão, bem como selecionadas

peças cirúrgicas as quais obtiveram quantidade suficiente de material para realização do

estudo imuno-histoquímico.

4.4.2. Critérios de exclusão

Foram excluídos da amostra os casos onde os dados clínicos contidos nos

prontuários estavam incompletos, e ainda espécimes com quantidade insuficiente de

material, tanto para análise morfológica como para o estudo imuno-histoquímico, bem

como os que continham extensas áreas de necrose.

4.5. Estudo clínico

Foram obtidos os dados clínicos a partir de informações contidas nos prontuários

dos pacientes atendidos no Hospital supracitado, sendo estes dados inerentes a sexo, idade,

raça, estadiamento clínico (TNM), estágio e evolução da doença. Estes dados foram

anotados em uma ficha previamente elaborada (anexo 1), e depois computados, sendo

posteriormente utilizados alguns parâmetros para análise estatística. Os dados referentes ao

estadiamento clínico foram classificados pelo serviço Médico e Odontológico do referido

hospital de acordo com os parâmetros estabelecidos pela União Internacional Contra o

Câncer (U.I.C.C.). As variáveis clínicas analisadas podem ser observadas no quadro 2.

Quadro 2 – Dados clínicos referentes aos pacientes portadores de carcinoma epidermóide de língua estudados. Natal/RN - 2004 Paciente Sexo Idade Raça Estadiamento Estágio Evolução Metástase 1 M 77 Parda T2N0M0 II Remissão Não 2 F 72 Parda T3N0M0 III Remissão Não 3 F 61 Parda T1N0M0 I Óbito Sim 4 F 56 Branca T2N0M0 II Remissão Não 5 F 87 Parda T3N1M0 III Remissão Não 6 M 63 Parda T3N0M0 III Remissão Não 7 M 57 Parda T2N1M0 III Remissão Sim 8 M 73 Parda T4N0M0 IV Óbito Sim 9 M 54 Branca T1N0M0 I Remissão Sim 10 F 70 Parda T2N0M0 II Remissão Não 11 F 78 Parda T2N0M0 II Óbito Sim 12 F 57 Parda T2N1M0 III Óbito Sim 13 M 75 Parda T3N0M0 III Remissão Não 14 M 70 Parda T4N0M0 IV Óbito Não 15 F 40 Branca T1N0M0 I Remissão Não 16 M 59 Parda T3N0M0 IV Óbito Sim 17 M 63 Branca T1N0M0 I Remissão Não 18 M 51 Parda T3N0M0 III Remissão Não 19 M 55 Parda T4N0M0 IV Remissão Sim 20 M 46 Parda T1N0M0 I Remissão Não 21 M 61 Parda T1N0M0 I Remissão Não 22 F 56 Parda T2N0Mx III Óbito Sim 23 M 65 Branca T1N0M0 I Remissão Sim 24 F 58 Branca T1N0M0 I Remissão Não 25 M 40 Parda T3N0M0 IV Óbito Sim 26 M 60 Parda T2N1M0 III Óbito Sim 27 M 65 Branca T2N0M0 II Remissão Não 28 F 66 Parda T2N0M0 II Remissão Sim 29 F 87 Parda T1N0M0 I Remissão Não 30 M 76 Branca T2N0M0 II Remissão Não Fonte: Hospital Dr. Luiz Antônio, 1997-2000, Natal/RN

4.6. Estudo morfológico

As peças cirúrgicas obtidas a partir de biópsias excisionais constantes desta pesquisa

foram avaliadas à microscopia de luz, através da análise de cortes histológicos de 5µ de

espessura, corados pela técnica da Hematoxilina/Eosina, para confirmação de diagnóstico e

gradação histológica de malignidade.

Quadro 3 – Sistema de gradação de malignidade “Modo de invasão” recomendado por Bryne (1998)

ESCORES DE MALIGNIDADE 1 2 3 4

Grau de Altamente Moderadamente Mínima cerati- Nenhuma ceratinização ceratinização ceratinizado ceratinizado nização (5 a 20% (0-5% das células)

(+ de 50% (de 20 a 50% das das células) das células) células)

Pleomorfismo Pouco pleo- Moderado pleo- Pleomorfismo in- Pleomorfismo extremo nuclear morfismo (+ de morfismo (50-75% tenso (25-50% de (0-25% de células maduras

75% de células De células maduras) células maduras) maduras)

Padrão de Bordas infiltra- Cordões, bandas e/ou Pequenos grupos Dissociação celular espraia-invasão tivas bem deli- trabéculas sólidas ou cordões de da e pronunciada,em peque-

mitadas infiltrativas células infiltrati- nos grupos e/ou células vas(n>15) individuais (n<15)

Infiltrado infla- Intenso Moderado Escasso Ausente matório

Esta análise foi feita por dois examinadores, em um estudo duplo-cego, o qual

realizou-se no front de invasão como recomendado por Bryne (1998). Foram atribuídos

escores de 1 a 4 para cada parâmetro, conforme tal sistema. Os escores foram somados em

cada caso. Os casos que obtiverem pontuação de 4 a 8 foram classificados em baixo grau de

malignidade e aqueles com pontuação total ou superior a 8 em alto grau de malignidade.

Esta classificação consiste numa adaptação realizada por Miranda (2002) da metodologia

proposta pela autora supracitada em 1989, que utilizando este mesmo sistema, adicionando-

se o parâmetro de número de mitoses. Neste último sistema de gradação, as lesões com 5 a

10 escores são consideradas como de baixo grau de malignidade e as com pontuação

superior a 10, como de alto escore de malignidade.

Os dados obtidos através desta análise foram anotados em fichas individuais (anexo

2).

4.7. Estudo imuno-histoquímico

Foi realizada avaliação da expressão das citoqueratinas 7, 10, 13, 14, 16 e 19,

através da imuno-histoquímica pela técnica da estreptoavidina-biotina (SABC, do inglês

Streptavidin-Biotin Complex). O quadro 4 mostra os anticorpos empregados, suas diluições

e tempo de incubação.

Quadro 4 – Quadro evidenciando especificidade para os anticorpos que foram utilizados, diluição, tempo de incubação e fabricante. Clone Especificidade Diluição Fonte Rec. antigênica Incubação

OV- CK 7 1:50 Novocastra Steam 20’, citrato 60’

TL12/30

LHP1 CK 10 1:50 Novocastra1 Tripsina a 0,1%, 37º, 60’

30’

KS-1A3 CK 13 1:150 Novocastra1 Steam 20’, citrato 60’

LL002 CK 14 1:20 Novocastra1 Steam 20’, citrato 60’

LL025 CK 16 1:30 Novocastra1 Steam 20’, citrato 60’

b170 CK 19 1:100 Novocastra1 Tripsina a 0,1%, 37º, 60’

30’1 Novocastra Laboratories LTDA

Do material emblocado em parafina foram obtidos cortes de 3µm de espessura e

montados em lâminas de vidro previamente limpas e preparadas com adesivo à base de

Organosilano (3-aminopropyltriethoxi-silano, Sigma Chemical Co, CA, USA, diluição

1:150). A técnica a ser empregada consistiu dos seguintes passos:

• Desparafinização em dois banhos de xilol:

xilol 1 (30 minutos) - 570 C

xilol 2 (20 minutos) – Temperatura Ambiente (TA)

• Rehidratação em cadeia descendente de etanóis

- Etanol absoluto I (5 minutos)- TA

- Etanol absoluto I I (5 minutos)- TA

- Etanol absoluto III (5 minutos)- TA

- Etanol 950 (5 minutos)- TA


• Remoção do pigmento formólico com Hidróxido de amônia a 10% em etanol a 95%

(10 minutos)- TA

• Lavagem em água corrente (10 minutos)

• Passagem dupla em água destilada (5 minutos cada)

• Recuperação antigênica (Quadro 3)



• Bloqueio da peroxidase endógena com peróxido de hidrogênio (H2O2) 10 volumes -

2 trocas (10 minutos cada)



• Incubação em solução tampão de TRIS-HCL – pH 7,4 – (Tris-hidroxi-metil-

aminometano, Sigma Chemical CO. USA) – 2 trocas (5 minutos cada)



• Incubação dos anticorpos primários conforme determinação dos fabricantes (Quadro

3)

• Lavagem com TRIS-HCL

• Incubação com TRIS-HCL- 2 trocas (5 minutos cada)

• Incubação do anticorpo secundário polivalente* (cabra anticamundongo anti-

coelho/ Dako Corporation, Denmark), por um período de 30 minutos – TA


• Incubação com TRIS-HCL- 2 trocas (5 minutos cada)

• Incubação do complexo Estreptavidina-Biotina (Dako A/S, Glostrup, Denmark)/ 30

minutos- TA*

* O complexo Estreptavidina-Biotina utilizados, foram provenientes do Kit Dako LSAB +

peroxidase unversal K0690 (Dako Corp., Denmark)


• Incubação com TRIS-HCL - 2 trocas (5 minutos cada)

• Revelação da solução cromógena de diaminobenzidina a 0,03% (3,3-

diaminobenzina, Sigma Chemical CO, USA), diluída em 100 ml de TRI-HCL e

acrescida de 0,6 ml de peróxido de hidrogênio 20 volumes, aplicada por um período

de 3 minutos, em câmara escura


• Passagem em água destilada

• Contra-coloração com Hematoxilina de Mayer (10 minutos) – TA



• Desidratação em cadeia ascendente de etanóis:



- Etanol absoluto I (2 minutos)- TA

- Etanol absoluto I I (2 minutos)- TA

- Etanol absoluto III (2 minutos)- TA

• Diafanização em dois banhos de xilol:

- Xilol 1 (2 minutos)

- Xilol 2 (2 minutos)

• Montagem da lamínula em resina permount R (Fischer Scientific, USA) para a

observação em microscopia de luz

* O anticorpo secundário e o complexo Estreptavidina-Biotina foram diluídos em solução

tampão TRIS-HCL (pH 7,4)

4.8. Análise das células imunomarcadas

Foram consideradas positivas todas as células que exibiram coloração acastanhada

tanto no citoplasma, como em superfície celular, independente da intensidade de marcação.

Através da microscopia de luz foi feita análise da expressão das citoqueratinas 7, 10, 13,

14, 16 e 19 por dois avaliadores, que verificaram a presença (P) e ausência (A) de

marcação, além de intensidade de marcação, sendo atribuídos os escores 1+ para pouca

quantidade de células marcadas, 2+ para moderada quantidade de células marcadas, 3+ para

grande quantidade células marcadas. Avaliou-se ainda o tipo de célula marcada (célula

basais, intermediárias ou superficiais). Esta análise foi realizada nas áreas mais profundas

dos tumores, correspondentes ao front invasivo. Utilizou-se como parâmetro o epitélio

adjacente às lesões, já que se trata de peças obtidas de procedimentos cirúrgicos realizados

com margem de segurança. Os dados obtidos foram anotados em uma ficha previamente

elaborada (anexo 3).

4.9. Análise estatística

Após a realização de toda a metodologia anteriormente descrita, os resultados

obtidos foram submetidos a testes estatísticos adequados, com o intuito de testar as

hipóteses de correlação dos dados clínicos, como estadiamento clínico, evolução e

metástase a gradação histológica de malignidade e a expressão dos filamentos

intermediários de citoqueratinas. Para as demais variáveis clínicas, como sexo, idade e raça,

foi realizada análise descritiva.

4.9.1. Delineamento da análise

Os dados foram digitados originalmente em uma planilha eletrônica Excell 2000 e

posteriormente exportados para formato DBF (Data Base Format), para poder ser lido pelo

programa SPSS(1) onde foram feitas as análises.

(1)Statistical Package for Social Science. SPSS for Windows. Release 10.0.1. Oct, 1999. www.spss.com

4.9.2. Variáveis estudadas

Quadro 5 – Quadro evidenciando as variáveis analisadas, bem como sua classificação e categorização.

Variável Classificação Categorias

Estadiamento Clínico Categórica I e II, III e IV

Metástase Categórica Sim, Não

Desfecho Categórica Óbito, Remissão

Gradação Histológica Categórica Baixo Grau, Alto Grau

Presença de Anticorpos CK Categórica Presente, Ausente

Intensidade da marcação Categórica Ausente, Fraca, Moderada

4.9.3. Definição do Teste Estatístico

Considerando que, tanto as variáveis dependentes quanto independentes são do tipo

categóricas, optou-se por uma análise bivariada, tendo como teste de escolha o Qui-

Quadrado ou, eventualmente, o Exato de Fischer, quando a amostra não se apresentou

adequada. O nível de significância adotado para ambos os casos foi de 95% (α=0,05).

4.10. Implicações Éticas

Esta pesquisa foi submetida a apreciação e aprovação do Comitê de Ética e Pesquisa

da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, conforme observado em documento

anexo.

RESULTADOS

5. RESULTADOS

5.1. Análise descritiva dos aspectos clínicos:

Baseado na análise descritiva dos dados clínicos referentes aos pacientes portadores

de carcinomas epidermóides de língua estudados (Quadro 2), observamos que na amostra

em questão houve uma predominância de pacientes do sexo masculino (60%) (Gráfico 1),

com a idade variando de 31 a 87 anos, sendo a média de idade de 63,26 anos, e faixa etária

mais acometida a sexta década de vida, perfazendo 33,33% da amostra (Gráfico 2). A raça

parda foi predominante totalizando 22 (73,33%) casos, com a raça branca acometendo 8

(26,66%) casos.

60%

40% Masculino

Feminino

Gráfico 1 - Distribuição do número de casos de acordo com o sexo dos pacientes. Hospital Dr. Luiz Antônio, Natal/RN.

7% 3%

33%

30%

20%

7% 31-40

41-50

51-60

61-70

71-80

81-90

Gráfico 2 - Distribuição do número de casos de acordo com a idade dos pacientes. Hospital Dr. Luiz Antônio, Natal/RN.

De acordo com a classificação clínica TNM, a nossa amostra foi assim distribuída: 9

(30%) casos foram classificados como estadiamento I, 7 (23,33%) casos como II, 9 (30%)

casos como III e 5 (16,66%) casos como IV.

Do total de 30 casos estudados, observamos que 9 (30%) foram a óbito em

decorrência da neoplasia, enquanto que em 21 pacientes não foi observada recorrência no

período de 3 anos de acompanhamento. Dessa amostra, a metástase em linfonodos cervicais

esteve presente em 12 (40%) casos.

5.2. Análise descritiva dos aspectos morfológicos:

A análise histopatológica dos cortes histológicos corados em H/E fundamentou-se

na avaliação das seguintes variáveis: grau de ceratinização, pleomorfismo nuclear, padrão

de invasão e intensidade de infiltrado inflamatório, de acordo com Bryne (1998) sendo

atribuídos escores de 1 a 4 para cada variável, que foram posteriormente somados e

classificados em baixo grau de malignidade e alto grau de malignidade. Dos 30 casos de

carcinoma epidermóide de língua estudados, 15 enquadraram-se no grupo de baixo escore

de malignidade e 15 no grupo de alto escore de malignidade (Tabela 1, Fotos 1, 2, 3 e 4).

123456789101112131415161718192021222324252627282930

Tabela 1 – Escores e gradação histológica de malignidade dos carcinomas epidermóides de língua estudados. Natal-RN Caso Grau

ceratinização de Pleomor

nuclear fismo Pardão

deinvasão

Infiltrado Inflamatório

Escore Total

Gradação histológica

1 1 4 2 7 Baixo grau 4 3 4 2 15 Alto grau 2 2 4 1 9 Alto grau 2 1 4 3 10 Alto grau 2 1 4 1 8 Baixo grau 1 1 4 1 7 Baixo grau 4 1 2 2 9 Alto grau 1 1 4 1 7 Baixo grau 1 1 4 1 7 Baixo grau 1 1 4 1 7 Baixo grau 3 3 2 3 11 Alto grau 1 1 4 1 7 Baixo grau 4 2 4 2 12 Alto grau 1 1 3 2 7 Baixo grau 2 1 4 2 8 Baixo grau 3 3 4 1 11 Alto grau 1 2 3 1 7 Baixo grau 1 1 4 3 9 Alto grau 2 2 4 2 10 Alto grau 2 1 4 2 9 Alto grau 1 1 4 1 7 Baixo grau 4 2 2 2 10 Alto grau 1 1 4 1 7 Baixo grau 1 1 4 2 8 Baixo grau 3 2 4 1 10 Alto grau 3 2 4 1 10 Baixo grau 2 1 4 1 8 Baixo grau 3 2 4 2 11 Alto grau 4 2 4 1 11 Alto grau 2 1 4 1 8 Baixo grau

Fonte: Hospital Dr. Luiz Antônio, 1997-2000, Natal/RN

Foto 1 - Front invasivo de carcinoma epidermóide de baixo grau, de acordo com o sistema proposto por Bryne (1998) (H/E – 40x).

-/E

–

Foto 2 Carcinoma epidermóide de baixo grau evidenciando detalhe de um ninho tumoral com ceratinização intensa permeando intenso infiltrado inflamatório (H

200x).

Foto 3 - Front invasivo de carcinoma epidermóide de alto grau classificado segundo sistema proposto por Bryne (1998) (H/E – 40x).

Foto 4 - Detalhe da figura anterior evidenciando-se desgarramento de células dos ninhos tumorais (H/E – 200x).

5.3. Análise descritiva da imunorreatividade às citoqueratinas estudadas

As características do padrão de expressão dos filamentos intermediários de

citoqueratinas analisadas, descritas correspondem àquelas observadas nas áreas tumorais

mais profundas, relacionadas com o front de invasão, a qual foi citada anteriormente na

metodologia proposta para esta pesquisa.

5.3.1. CK 7

Esta citoqueratina mostrou-se positiva em 13 (43,33%) dos 30 casos estudados,

principalmente em células intermediárias, e grupamentos celulares isolados (Foto 5), não se

evidenciando imunomarcação no epitélio adjacente em nenhum dos casos. Destes, o escore

1+ foi atribuído a 9 (69,235) casos e o escore 2+ a 4 casos (30,76%). A presença de

controle interno positivo representado por fragmentos de glândula salivar menor foi útil na

demonstração da eficácia da reação (Foto 6).

5.3.2. CK 10

A imunorreatividade para a citoqueratina 10 foi observada em 19 (63,33%) casos,

sendo esta verificada em células intermediárias e superficiais situadas principalmente nos

ninhos tumorais que mostravam pérolas córneas (Foto 7). O escore 1+ foi atribuído a

maioria dos casos imunopositivos (15 casos), e o epitélio adjacente esteve marcado em 20

dos casos, verificando-se, porém, que esta marcação era predominantemente fraca e

heterogênea (Foto 8).

5.3.3. CK 13

Dos 30 casos estudados, 15 (50%) exibiram imunopositividade a CK 13, sendo esta

observada principalmente nos centros dos ninhos e lençóis celulares, correspondendo às

células intermediárias e superficiais (Foto 10). Na análise da intensidade de marcação

houve predomínio do escore 1+, o qual foi atribuído a 9 (60%) dos 15 casos analisados, em

relação ao escore 2+ que foi emitido em 6 (40%) casos. O epitélio adjacente esteve

marcado em 19 casos, sendo esta marcação intensa, homogênea, distribuindo-se por todas

as camadas suprabasais do epitélio (Foto 11). Em 6 desses casos no qual o epitélio

adjacente esteve marcado destes, o tumor não exibiu positividade para esse filamento

intermediário.

5.3.4. CK 14

Foi observada intensa imunopositividade à citoqueratina 14 em todas as células

tumorais (basais, suprabasais e superficiais) em 29 dos 30 casos estudados (Foto 13),

porém, em 14 (48,27%) destes casos, observou-se perda desta marcação em algumas

células invasivas (Foto 14), sendo nestas ocasiões atribuído o escore 2+. Foi observada

marcação no epitélio adjacente em 22 casos, sendo esta caracterizada por apresentar-se

intensa, homogênea e envolvendo todas as camadas celulares. Entretanto, em áreas mais

distantes do tumor, verificou-se marcação apenas na camada basal destes epitélios (Foto

15).

5.3.5. CK 16

Vinte e três (76,66%) casos mostraram-se positivos para a CK 16, sendo sua

expressão evidenciada principalmente nas células intermediárias e superficiais dos ninhos

tumorais (Foto 16). O escore 1+ foi atribuído a 14 (60,86%) casos e o 2+ a 9 (39,13%). A

positividade no epitélio adjacente foi evidenciada em 22 (73,33%) casos, observando-se por

vezes, áreas de ausência de marcação neste epitélio e presença camadas celulares

imunopositivas em áreas mais próximas ao tumor (Foto 17).

5.3.6. CK 19

Do total de 30 casos avaliados, 22 (73,33%) obtiveram marcação para a CK 19,

sendo esta verificada predominantemente em células isoladas (Foto 20). Naqueles tumores

negativos a essa proteína a efetividade da reação foi constatada por fragmentos de glândula

salivar menor imunomarcados (Foto 19). Quando observamos marcação nos ninhos, esta se

localizava nas áreas centrais, correspondendo às células intermediárias e superficiais (Foto

20), sendo o escore 1+ atribuído à 68,18% dos casos imunomarcados. Com relação ao

epitélio adjacente, verificamos positividade em 18 (60%) casos (Foto 21).

-Foto 5 Imunomarcação da CK 7 em tumor de alto grau (SABC – 200x).

Foto 6 - Negatividade para a citoqueratina 7 em células tumorais de carcinoma epidermóide de baixo grau. Controle interno positivo representado por fragmentos de glândula salivar menor (SABC – 100x).

7

8

9

Fotos 7-9 - (7) CK 10. Positividade nas áreas centrais dos ninhos tumorais, correspondendo a células intermediárias e superficiais (SABC – 100x). (8) Marcação fraca e heterogênea em epitélio adjacente ao tumor (SABC – 200x). (9) Localização imuno-histoquímica da CK 10 em mucosa normal, detectado através da marcação citoplasmática em algumas camadas suprabasais e superficiais do epitélio estratificado ceratinizado (SABC – 100x).

12

11

10

Fotos 10-12 - (10) Expressão da CK 13 nos centros dos ninhos e lençóis celulares, correspondendo às células intermediárias e superficiais (SABC – 200x). (11) Marcação intensa, homogênea, acometendo todas as camadas suprabasais do epitélio pavimentoso estratificado em área adjacente a tumor (SABC – 200x). (12) Localização imuno-histoquímica da CK 13 em epitélio pavimentoso estratificado normal, representado por marcação fraca e heterogênea (SABC – 100x).

13

14

15

Fotos 13-15 - (13) Intensa imunopositividade à citoqueratina 14 em todas as células tumorais (basais, suprabasais) em carcinoma epidermóide de baixo grau (SABC -200x). (14) Perda de positividade a CK 14 em algumas células invasivas (SABC -200x). (15) Marcação na camada basal do epitélio adjacente em área mais distante do tumor (SABC 100x).

16

17

18

Foto 16-18 - (16) Figura evidenciando epitélio adjacente ao tumor com áreas de ausência e presença de marcação bem como células neoplásicas positivas (SABC - 40x). (17) Expressão da CK 16 evidenciada principalmente nas células intermediárias e superficiais dos ninhos tumorais (SABC - 200x). (18) Imunolocalização da CK 16 em epitélio pavimentoso estratificado normal (SABC – 100x).

19

20

5.4. Resultados da Análise Estatística

Após obtenção dos dados do estadiamento clínico, metástase, grau histológico de

malignidade e análise da positividade das proteínas dos filamentos intermediários de

citoqueratinas (CKs 7, 10, 13, 14, 16 e 19), foi realizada a análise estatística dos dados,

utilizando-se como teste de escolha o Qui2 ou, eventualmente, o Exato de Fischer, quando a

amostra não se apresentou adequada.

Através da utilização desses testes foram realizadas inicialmente as relações entre as

variáveis, desfecho da doença, estadiamento clínico, metástase e gradação histológica de

malignidade, conforme se observa nas Tabelas de 3 a 8. No tocante ao estadiamento

clínico, optamos por agrupar os estágios I e II em um grupo e os estágios III e IV em outro,

já que os primeiros não apresentam metástase diferentemente dos últimos, para que dessa

forma fosse possível a realização da análise estatística. Na matriz ilustrada na tabela 9 e

também nos gráficos de 3 a 8, observamos que somente a gradação histológica de

malignidade não apresentou correlação estatisticamente significativa com as outras

variáveis, mediante o teste Qui-Quadrado (Qui2). Todas as outras variáveis citadas

apresentaram significância entre suas proporções como bem destaca a tabela 9.

Tabela 2. Relação entre estadiamento clínico e desfecho da doença. Significância obtida pelo Teste Qui2. Natal, RN. 2003.

Desfecho

Remissão Óbito Total Qui2 p

Estadiamento

Clínico

I e II

III e IV

13 (86,7%)

8 (53,3%)

2 (13,3%)

7 (46,7%)

15 (100%)

15 (100%)

3,968 0,046

Total 21 (70,0%) 9 (30,0%) 30 (100%)

86,7

53,3

13,3

46,7

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

I e II III e IV

Óbito

Remissão

Gráfico 3. Relação entre estadiamento clínico (I e II/III e IV) e desfecho da doença (óbito/remissão). p = 0,046 . Natal, RN. 2003.

Tabela 3. Relação entre metástase e desfecho da doença. Significância obtida pelo Teste Qui2. Natal, RN. 2003.

Desfecho


Metástase Sim

Não

4 (33,3%)

17 (94,4%)

8 (66,7%)

1 (5,6%)

12 (100%)

18 (100%)

10,060 0,002

Total 21 (70,0%) 9 (30,0%) 30 (100%)

33,3

94,4

66,7

5,6

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

Sim Não

Óbito

Remissão

Gráfico 4. Relação entre metástase (Sim/Não) e desfecho da doença (óbito/remisão). p = 0,002. Natal, RN. 2003.

Tabela 4. Relação entre estadiamento clínico e metástase. Significância obtida pelo Teste Qui2. Natal, RN. 2003.

Estadiamento Clínico

I e II III e IV Total Qui2 p

Metástase Sim

Não

3 (25,0%)

12 (66,7%)

9 (75,0%)

6 (33,3%)

12 (100%)

18 (100%)

5,000 0,025

Total 15 (50,0%) 15 (50,0%) 30 (100%)

25,0

66,7

75,0

33,3

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

Sim Não

III e IV

I e II

Gráfico 5. Relação entre estadiamento clínico (I e II/III e IV) e metástase (sim/não). p = 0,025 . Natal, RN. 2003.

Tabela 5. Relação entre gradação histológica e desfecho da doença. Significância obtida pelo Teste Qui2. Natal, RN. 2003.

Desfecho


Gradação

Histológica

Baixo

Alto

12 (80,0%)

9 (60,0%)

3 (20,0%)

6 (40,0%)

15 (100%)

15 (100%)

0,635 0,426

Total 21 (70,0%) 9 (30,0%) 30 (100%)

80,0

60,0

20,0

40,0

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

Baixo Alto

Óbito

Remissão

Gráfico 6. Relação entre gradação histológica (baixo/ alto grau) e desfecho da doença (óbito/remissão). p = 0,426 . Natal, RN. 2003.

Tabela 6. Relação entre gradação histológica e estadiamento clínico. Significância obtida pelo Teste Qui2. Natal, RN. 2003.



Gradação

Histológica

Baixo

Alto

9 (60,0%)

6 (40,0%)

6 (40,0%)

9 (60,0%)

15 (100%)

15 (100%)

0,533 0,465

Total 15 (50,0%) 15 (50,0%) 30 (1000%)

60,0

40,0

40,0

60,0

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

Baixo Alto

III e IV

I e II

Gráfico 7. Relação entre estadiamento clínico (I e II/III e IV) e gradação histológica (baixo/alto graus). p = 0,465 . Natal, RN. 2003.

Tabela 7. Relação entre gradação histológica e metástase. Significância obtida pelo Teste Qui2. Natal, RN. 2003.

Metástase

Sim Não Total Qui2 p

Gradação

Histológica

Baixo

Alto

4 (26,7%)

8 (53,3%)

11 (73,3%)

7 (46,7%)

15 (100%)

15 (100%)

1,250 0,264

Total 12 (40,0%) 18 (60,0%) 30 (100%)

26,7

53,3

73,3

46,7

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

Baixo Alto

Sim Não

Gráfico 8. Relação entre gradação histológica (Baixo/ Alto graus) e metástase (sim/não). p = 0,264 . Natal, RN. 2003.

Tabela 8. Matriz de significância estatística, contendo os valores de “p” para as combinações entre as variáveis. Significância obtida pelo Teste Qui2. Natal, RN. 2003.

Metástase Desfecho Grad. Histológica

Estadiamento 0,025 0,046 0,465

Metástase - 0,002 0,264

Desfecho - - 0,426

Como pode ser evidenciado na tabela 9 que correlacionou as citoqueratinas com o

desfecho da doença (óbito/sobrevida), destaca-se que somente a CK 16 obteve correlação

estatisticamente significativa com essa variável. Dos 9 casos que foram a óbito, 100%

exibiram marcação positiva para essa proteína.

Tabela 9. Relação entre a presença de marcadores e desfecho da doença. Significância obtida pelo Teste Qui2. Natal, RN. 2003.

Desfecho


CK7 Sim 8 (38,1%) 5 (55,6%) 13 (43,3%) 0,782 0,630

Não 13 (61,9%) 4 (44,4%) 17 (56,7%)

CK10 Sim 13 (61,9%) 6 (66,7%) 19 (63,3%) 0,062 1,000

Não 8 (38,1%) 3 (33,3%) 11 (36,7%)

CK13 Sim 10 (47,6%) 5 (55,6%) 15 (50,0%) 0,159 1,000

Não 11 (52,4%) 4 (44,4%) 15 (50,0%)

CK14 Sim 20 (95,2%) 9 (100%) 29 (96,7%) 0,443 1,000

Não 1 (4,8%) 0 (0,00%) 1 (3,3%)

CK16 Sim 14 (66,7%) 9 (100%) 23 (76,7%) 3,913 0,048

Não 7 (33,3%) 0 (0,00%) 7 (23,3%)

CK19 Sim 15 (71,4%) 7 (77,8%) 22 (73,3%) 0,130 1,000

Não 6 (28,6%) 2 (22,2%) 8 (26,7%)

Conforme observado na tabela 10, que estabelece a correlação entre estadiamento

clínico e os anticorpos utilizados neste estudo, verificamos que o único anticorpo que

apresentou relação significativa foi a CK 16 (p=0,031). Dos 15 casos agrupados nos

estágios III e IV, 14 (93,3%) expressaram esse anticorpo.

Tabela 10. Relação entre a presença de marcadores e o estadiamento clínico. Significância obtida pelo Teste Qui2. Natal, RN. 2003.



CK7 Sim 5 (33,3%) 8 (53,3%) 13 (43,3%) 1,222 0,461

Não 10 (66,7%) 7 (46,7%) 17 (56,7%)

CK10 Sim 9 (60,0%) 10 (66,7%) 19 (53,3%) 0,144 1,000

Não 6 (40,0%) 5 (33,3%) 11 (36,7%)

CK13 Sim 9 (60,0%) 6 (40,0%) 15 (50,0%) 1,200 0,465

Não 6 (40,0%) 9 (60,0%) 15 (50,0%)

CK14 Sim 15 (100%) 14 (93,3%) 29 (96,7%) 1,034 1,000

Não 0 (0,0%) 1 (6,7%) 1 (3,3%)

CK16 Sim 9 (60,0%) 14 (93,3%) 23 (76,7%) 4,658 0,031

Não 6 (40,0%) 1 (6,7%) 7 (23,3%)

CK19 Sim 10 (66,7%) 12 (80,0%) 22 (73,3%) 0,682 0,680

Não 5 (33,3%) 3 (20,0%) 8 (26,7%)

No que diz respeito à correlação entre a presença de metástase e a imunomarcação

para as CKs 7, 10, 13, 14, 16 e 19, apenas a CK 10 mostrou correlação estatisticamente

significativa (p=0,044) (Tabela 11). Nos 18 casos onde não se observou presença de

metástase, a CK 10 esteve imunomarcada em 14 (77,8%).

Tabela 11. Relação entre a presença de marcadores e presença de metástase. Significância obtida pelo Teste Qui2. Natal, RN. 2003.

Metástase

Sim Não Total Qui2 P

CK7 Sim 5 (41,7%) 8 (44,4%) 13 (43,3%) 0,023 1,000

Não 7 (58,3%) 10 (55,6%) 17 (56,7%)

CK10 Sim 5 (41,7%) 14 (77,8%) 19 (63,3%) 4,043 0,044

Não 7 (58,3%) 4 (22,2%) 11 (36,7%)

CK13 Sim 4 (33,3%) 11 (61,1%) 15 (50,0%) 2,222 0,136

Não 8 (65,7%) 7 (38,9%) 15 (50,0%)

CK14 Sim 11 (91,7%) 18 (100%) 29 (96,7%) 1,552 0,836

Não 1 (8,3%) 0 (0,00%) 1 (3,3%)

CK16 Sim 10 (83,3%) 13 (72,2%) 23 (76,7%) 0,497 0,792

Não 2 (16,7%) 5 (27,8%) 7 (23,3%)

CK19 Sim 9 (75,0%) 13 (72,2%) 22 (73,3%) 0,028 1,000

Não 3 (25,0%) 5 (27,8%) 8 (26,7%)

Nenhuma das citoqueratinas estudadas se correlacionou positivamente com a

gradação histológica de malignidade (Tabela 12), apesar da CK 7 estar presente em 9

(60%) dos 15 casos dos carcinomas epidermóides de alto grau de maliginidade.

Tabela 12. Relação entre a presença de marcadores e gradação histológica. Significância obtida pelo Teste Qui2. Natal, RN. 2003.

Gradação Histológica

Baixo Grau Alto Grau Total Qui2 p

CK7 Sim 4 (26,7%) 9 (60,0%) 13 (43,3%) 3,394 0,065

Não 11 (73,3%) 5 (40,0%) 17 (56,7%)

CK10 Sim 11 (73,3%) 8 (53,3%) 19 (63,3%) 1,292 0,449

Não 4 (26,7%) 7 (46,7%) 11 (36,7%)

CK13 Sim 9 (60,0%) 6 (40,0%) 15 (50,0%) 1,200 0,465

Não 6 (40,0%) 9 (60,0%) 15 (50,0%)

CK14 Sim 15 (100%) 14 (93,3%) 29 (96,7%) 1,034 1,000

Não 0 (0,00%) 1 (6,7%) 1 (3,3%)

CK16 Sim 12 (80,0%) 11 (73,3%) 23 (76,7%) 0,186 1,000

Não 3 (20,0%) 4 (26,7%) 7 (23,3%)

CK19 Sim 9 (60,0%) 13 (86,7%) 22 (73,3%) 2,727 0,215

Não 6 (40,0%) 2 (13,3%) 8 (26,7%)

DISCUSSÃO

6. DISCUSSÃO

O carcinoma epidermóide destaca-se por apresentar elevada incidência na cavidade

oral, representando mais de 90% das neoplasias malignas que acometem a boca. O

carcinoma epidermóide oral é a sexta neoplasia maligna mais comum no mundo, e em

alguns países se constitui num problema de saúde pública representando a maior causa de

morbidade e mortalidade (NAGPAL; DAS, 2003). Através de estudos epidemiológicos

realizados nas diversas regiões do Brasil, Wunch-Filho (2003) verificou que a incidência e

a taxa de mortalidade em pacientes acometidos por câncer oral variou entre os estados,

encontrando em São Paulo e Porto Alegre os índices mais altos dessa neoplasia, sendo

considerado um dos mais elevados da América Latina. Neste estudo foi observado também

que a taxa de sobrevivência desses pacientes é muito baixa, e que os tumores mais

agressivos com menores índices de sobrevida são aqueles sediados na língua.

Tal neoplasia caracteriza-se por ser uma doença multifatorial, com diversos

elementos envolvidos na sua ocorrência, dentre os quais citam-se alterações genéticas,

imunossupressão, deficiências de vitaminas, exposições a fatores de ação carcinogênica

comprovada como radiação solar, tabaco, álcool e alguns vírus, dentre eles o HPV

(NEVILLE et al., 1998; ABDO et al., 2001).

Vários estudos realizados como os de Allison, Locker e Fine (1998), Zavras et al.

(2001) e Greenwood et al. (2003) destacaram o papel do tabaco fumado ou mascado como

fator etiológico independente ou agindo sinergicamente com o álcool no desenvolvimento

da carcinogênese oral, estando bem documentado que o risco para tal aumenta

proporcionalmente com a quantidade de cigarros consumidos associados ao álcool ingerido,

havendo efeito multiplicativo quando ambos são utilizados em conjunto.

Conforme relatos de Canto e Devesa (2002) e Howell et al. (2003), o carcinoma

epidermóide oral ocorre principalmente em pacientes do sexo masculino, acima dos 40

anos, com média de idade de diagnóstico na sexta década de vida. Concordando com os

referidos achados, evidenciamos em nossa amostra de 30 casos de carcinoma epidermóide

de língua, provenientes dos arquivos do Hospital Dr. Luiz Antônio, Natal-RN, uma discreta

predileção pelo sexo masculino, sendo esse acometido em 60% dos casos, ocorrendo

prevalentemente em pacientes acima de 40 anos de idade, sendo a média de 63,26 anos. Em

nosso estudo a ocorrência dessa neoplasia em pessoas jovens, abaixo de 40 anos foi baixa

(7%), apesar de ter sido relatado por Moore et al. (2000) e Lilwellyn, Tohnson e

Warnakulasurya (2001) um aumento de sua incidência em adultos jovens, abaixo de 45

anos de idade.

Em pesquisa desenvolvida por Santana et al. (1999) em 2.440 casos de câncer oral,

houve predomínio dos pacientes da raça parda, com esta acometendo 68,7% dos homens e

64% das mulheres, seguido pelas raças brancas e negras. Em nosso estudo, a raça parda foi

predominante, semelhante a tal pesquisa, perfazendo 73,33% dos casos com os demais

26,66% acometidos pelos da raça branca.

Como relatado anteriormente, a carcinogênese oral é considerada um processo de

múltiplas etapas o qual envolve alterações genéticas que iniciam as mudanças fenotípicas.

Têm sido identificados fatores clínicos, histomorfológicos e moleculares que podem

fornecer informações acerca da história natural e evolução neoplásica, podendo ser

considerados como indicadores de agressividade do tumor (CHIESA et al., 1999).

Estudos realizados por Bryne (1998), Rajhi (2000) e Okada et al. (2003), apontaram

fatores influenciadores no prognóstico e sobrevida dos pacientes portadores de carcinoma

epidermóide oral, dentre os quais, tamanho e localização do tumor primário,

comprometimento de linfonodos regionais e metástases à distância, bem como gradação

histológica de malignidade.

O sistema TNM, criado pela União Internacional Contra o Câncer é o principal

meio de comunicação entre os centros de tratamento, e tem como um dos principais

objetivos fornecer informações sobre o prognóstico (CARINCI et al., 1998). Esse sistema

baseia-se nas características do tumor primário, o qual avalia o tamanho do tumor (T), a

extensão para linfonodos regionais (N) e envolvimento ou não de metástases distantes (M).

A quantificação dessas variáveis constitui o estadiamento, que varia dos estágios I ao IV

(ALLISON; LOCKER; FEINE, 1998).

A partir dessa classificação, foram realizados alguns estudos baseados na suposição

de que pequenos tumores que não emitiam metástases apresentavam melhor prognóstico

em relação àqueles maiores com metástases. Nas pesquisas desenvolvidas por Hiratsuka et

al. (1999), o sistema TNM representou o parâmetro prognóstico mais exato. Considerando

essas afirmações, no presente estudo, 9 (30%) casos foram classificados como estadiamento

I, 7 (23,33%) casos como II, 9 (30%) como III e 5 (16,66%) como IV, os quais foram

reunidos em dois grupos, I e II, e como III e IV, para que fosse possível a realização da

análise estatística, já que os estágios intermediários II e III não fornecem informações

muito precisas a respeito do prognóstico como relatado por Costa et al. (2002).

Realizando a análise estatística através do teste Qui2, entre o estadiamento clínico e

o desfecho da doença (óbito/remissão), verificamos haver correlação significativa entre

essas variáveis, onde 86,7% dos casos agrupados nos estágios I e II obtiveram remissão da

doença e dos 9 casos que foram a óbito, 7 (77,77%) foram incluídos nos estágios III e IV

(Tabela 2, Gráfico 3). Tais dados mostraram-se concordantes às afirmações de Dantas

(2000) de que o TNM é eficaz como parâmetro de prognóstico.

Um outro fator indicador de prognóstico citado em várias pesquisas como nas de

Rajhi et al. (2000), Takes et al. (2002), Okada et al. (2003) e Nithya et al. (2003) é a

presença de metástase, e como relataram O-Charoenrat et al. (2003), o carcinoma

epidermóide de língua é caracterizado por apresentar um alto poder de invasão local e

grande probabilidade de desenvolver metástases para linfonodos cervicais, o qual influencia

diretamente no controle regional da doença e na sobrevivência. O processo de metástase é

resultado de mudanças nas propriedades das células e da interação entre células tumorais

com células e estruturas adjacentes (TAKES et al., 2002). Em nossa amostra, a metástase

mostrou-se presente em 40% dos casos, o que está de acordo com as afirmações de Nithya

et al. (2003) que citaram uma taxa de incidência de metástase de 34 a 50% em pacientes

acometidos por câncer de língua.

A presença de metástase em linfonodos cervicais mostrou-se como um bom

indicador de prognóstico na presente pesquisa, já que através da aplicação do teste Qui2

observamos relação estatisticamente significativa (p=0,002) entre esta variável e o desfecho

da doença, onde dos 12 casos que desenvolveram metástase, 8 (66,7%) foram a óbito

(Tabela 3, Gráfico 4).

Outra forma encontrada por alguns pesquisadores para avaliar o comportamento

biológico do carcinoma epidermóide oral, foi obter informações a partir da análise de

características morfológicas através de várias gradações, denominadas de Sistemas de

Gradação Histológica de Malignidade (SGHM) (MARTINS NETO, 1999). Assim, uma

possível relação do grau de agressividade julgado pelos achados morfológicos tem sido

verificada desde a década de 20 por Broders, que relatou a relação do grau de ceratinização

e proporção de células anaplásicas com o prognóstico.

Desde os primeiros relatos acerca desses SGHM, observa-se que os pesquisadores

buscam cada vez mais traçar parâmetros morfológicos que possam contribuir com os

SGHM para o carcinoma epidermóide oral. Dentre esses estudos, destaca-se, além do de

Broders (1920, 1941), o qual apresentou como grande desvantagem a utilização apenas de

critérios subjetivos na realização da gradação histológica, os de Anneroth, Batsakis e Luna

(1986, 1987), Bryne et al. (1989) e Bryne (1998), sendo a vantagem desses últimos

sistemas a utilização de valores numéricos para classificar os carcinomas em grupos de

baixo e alto escore de malignidade.

O sistema proposto por Anneroth, Batsakis e Luna (1987) baseava-se em dados

histológicos que expressavam tanto as características das células neopláscias (grau de

ceratinização, pleomorfismo nuclear e figuras de mitose) como a relação entre tumor e o

hospedeiro (estágio e padrão de invasão, bem como infiltrado inflamatório). Utilizando tal

sistema, Dantas (2000) não encontrou correlação estatisticamente significativa entre o

mesmo e o estadiamento clínico, avaliando 18 casos de carcinoma epidermóide de língua,

contrariamente a Okada et al. (2003), os quais utilizaram esse mesmo método de gradação

encontraram relação significativa entre o grau histológico de malignidade e metástase,

sugerindo que as características morfológicas podem servir como indicadoras do

surgimento de metástase e conseqüentemente como indicadoras de prognóstico.

Já Bryne et al. (1989) priorizaram a frente de invasão tumoral, pelo fato de

considerarem as células neoplásicas invasivas pertencentes a um clone neoplásico mais

agressivo. Os parâmetros morfológicos adotados nesse SGHM eram representados pelo

grau de ceratinização celular, pleomorfismo nuclear, número de mitoses, padrão de invasão

tumoral e resposta inflamatória do hospedeiro, sendo atribuídos valores numéricos de 1 a 4

para cada parâmetro, o que classificava o tumor em grau 1 de malignidade (baixo escore)

para os carcinomas com pontuação de 5 a 10 e grau 2 de malignidade (alto escore), aqueles

com pontuação superior a 10. Tal método, diferente dos anteriores, apresentava a vantagem

de poder ser aplicado às biópsias incisionais.

Revisando os SGHM, Bryne (1998) verificou que seu método era extremamente

eficiente como indicador de prognóstico e de comportamento biológico em carcinoma

epidermóide oral. Nesse ano essa autora propôs que fosse omitido o parâmetro número de

mitoses, criando dessa forma um novo método baseado apenas em quatro critérios

morfológicos, dentre os quais: grau de ceratinização, pleomorfismo nuclear, padrão de

invasão e intensidade de infiltrado inflamatório, sendo da mesma forma emitidos escores de

1 a 4 para cada uma das variáveis. Entretanto, a esse método não foi adaptado a omissão da

variável número de mitoses, e assim, Miranda (2002) graduou 12 casos de carcinoma

epidermóide de lábio inferior e 12 casos de carcinoma epidermóide de língua, adaptando

esse método, o qual considerou como baixo e alto escore, os casos que obtiveram

pontuação total de 4 a 8 e superior a 8, respectivamente.

Na presente pesquisa, utilizamos o SGHM proposto por Bryne (1998) e adaptado no

estudo de Miranda (2002), em virtude de tratar-se de uma gradação fácil e de rápida

aplicação. Apesar da mesma poder ser utilizada às biópsias incisionais, optamos por

analisar espécimes provenientes de biópsias excisionais para que não houvesse riscos de

comprometer alguns desses parâmetros, e para podermos verificar se esse SGHM refletia

realmente o comportamento biológico do tumor.

Desta maneira, dos 30 casos analisados, 15 foram considerados como baixo grau e

15 como alto grau de malignidade, conforme observado na tabela 2. Contrariamente a

Sawair et al. (2003) que relataram que o SGHM proposto por Bryne (1998) somado ao

TNM poderia predizer o curso clínico das neoplasias malignas sediadas na boca, e decidir

dessa forma o melhor tratamento para cada paciente, no nosso estudo, o sistema de

gradação histológica de malignidade proposto por tal autora não mostrou correlação

estatisticamente significativa com o desfecho da doença, estadiamento clínico e presença de

metástase, como ilustrado nas tabelas 6, 7 e 8, gráficos 6, 7 e 8, bem como na matriz de

significância representada na tabela 9, sendo constatado portanto em nossa amostra que tal

parâmetro morfológico não pode ser usado como indicador de comportamento biológico

em carcinomas de língua.

Diante dos resultados conflitantes existentes na literatura pertinente em relação à

utilização de fatores clínicos e histomorfológicos como indicadores de comportamento

biológico e prognóstico em carcinomas epidermóides orais, muitos trabalhos têm buscado

outros parâmetros indicadores de agressividade e comportamento nessas neoplasias, e é

esse comportamento biológico variado o fator importante na justificativa da continuidade

desses estudos.

Encontra-se estabelecido na literatura que a transformação maligna é

freqüentemente associada à mudanças no padrão de expressão de marcadores de

diferenciação. Neste raciocínio, alguns estudos têm demonstrado o aumento ou diminuição

da expressão de citoqueratinas comumente expressas por mucosa normal durante a

transformação maligna (XU et al., 1995; SILVA, 1999). Depondt et al. (1999) citaram que

na ausência de marcadores reais para carcinomas epidermóides, as citoqueratinas

permanecem úteis na confirmação da natureza epitelial de muitas neoplasias malignas

pobremente diferenciadas, o que ressalta o interesse de se estudar a expressão desses

filamentos intermediários em tumores, sugerindo que essa expressão pode estar

correlacionada com aspectos comportamentais das referidas lesões, dependendo do seu tipo

e origem.

Seguindo essa linha de pesquisa, no presente trabalho avaliamos também a

expressão de várias citoqueratinas em 30 casos de carcinoma epidermóide de língua,

utilizando para tal, a imuno-histoquímica pela técnica da estreptoavidina-biotina,

procurando associar seu padrão de expressão ao estado de diferenciação das células

tumorais, bem como ao desfecho da doença, presença de metástase e estadiamento clínico.

A verificação da imunomarcação foi realizada por dois avaliadores em um estudo duplo-

cego, nas áreas mais profundas dos espécimes, correspondendo ao front invasivo, já que

todos os espécimes avaliados foram provenientes de biópsias excisionais como citado

anteriormente.

A literatura referencia que no epitélio oral normal, existem diversos padrões de

expressão de citoqueratinas a depender da localização anatômica, bem como da camada

epitelial. De acordo com Vaidya et al. (1998), a superfície ventral da língua expressa

normalmente as CKs 4, 5, 6, 13 e 14, enquanto que na superfície dorsal encontra-se

freqüentemente as CKs 1, 5, 6, 10 e 14. Em nosso estudo analisamos a expressão das CKs

7, 10, 13, 14, 16 e 19 em 30 casos de carcinoma epidermóide de língua, não determinando

porém a região precisa deste sítio.

Os nossos resultados mostraram que a CK 10, uma citoqueratina característica de

camadas suprabasais de epitélios ceratinizados (Foto 9), se expressou em 19 (63,33%)

casos, reagindo principalmente nas células centrais dos ninhos e lençóis de proliferação

(Foto 7). Nas pesquisas desenvolvidas por Morgan e Lan Su (1994), a presença dessa

proteína foi relacionada diretamente com a diferenciação tumoral, enquanto no estudo

desenvolvido por Depondt et al. (1999) a marcação da mesma foi correlacionada com o

tamanho do tumor, sugerindo esses últimos autores que a CK 10 poderia fornecer

informações acerca do crescimento tumoral.

Utilizando o teste Qui2 correlacionamos a expressão da citoqueratina 10 ao desfecho

da doença (óbito/remissão), presença de metástase estadiamento clínico e gradação

histológica. Constatamos que sua positividade relacionou-se inversamente ao surgimento de

metástase para linfonodos cervicais (p=0,044) (Tabela 11), já que ela estava ausente em

58,3% dos casos que desenvolveram metástase. Biologicamente, a presença desta proteína

pode evitar alterações no programa de diferenciação epitelial nas células neoplásicas,

evitando que tais células adquiram a capacidade de dissociar-se do tumor primário e

originar assim as metástases.

Verificamos também que a marcação da CK 10 no epitélio adjacente aos tumores

mostrava-se alterada exibindo-se de forma fraca e heterogênea (Foto 8), o que poderia

sugerir alterações precoces na diferenciação dessas células presentes no epitélio situado nas

proximidades do crescimento tumoral.

No tocante a CK 13, um marcador das camadas basais de epitélios pavimentosos

estratificados não ceratinizados (BOISNIC et al., 1995), nossos resultados mostraram que

houve positividade em 50% dos carcinomas examinados, onde sua presença predominou

em células mais maturadas, bem diferenciadas, situadas nos centros dos lençóis (Foto 10),

corroborando os achados de Silva (1999). Em 19 casos o epitélio adjacente esteve marcado,

porém esta positivdade era intensa, homogênea acometendo todas as camadas suprabasais

deste (Foto 11), padrão este diferente do observado em epitélios normais (Foto 12). A

expressão desta proteína não obteve correlação estatisticamente significativa com nenhum

dos parâmetros clínicos e morfológicos desse estudo. Entretanto, verificamos que dos 15

casos dos tumores considerados como alto grau de malignidade, ela esteve ausente em 9

(60%), o que refletiria a perda da diferenciação nessas células tumorais.

Morgan e Lan Su (1994) relataram haver perda da expressão da CK 13 em

carcinomas pobremente diferenciados, porém, em adição citaram que, quando presentes,

essas proteínas localizavam-se principalmente nas células espinhosas e centrais dos ninhos

tumorais, achado esse verificado em nossa pesquisa. Esses autores sugeriram também que o

perfil dos filamentos intermediários de citoqueratinas em carcinomas epidermóides orais

pode revelar que a diferenciação do epitélio de revestimento oral pode ser modulada pela

alteração no padrão de expressão dessas proteínas durante o desenvolvimento da neoplasia.

Conforme abordado por Depondt et al. (1999), a presença das CKs 4 e 13 em

epitélios pavimentosos estratificados normais, presença essa alterada, relaciona-se ao

crescimento acelerado desse epitélio, o que pode ser reflexo de uma diminuição do

programa de diferenciação. Tal fato poderia explicar as alterações observadas nos epitélios

adjacentes aos tumores na presente pesquisa, o que nos leva a sugerir que isso pode ser um

indício de alteração pré-maligna nestes epitélios, já que é uma diferenciação anormal,

fazendo com que o epitélio adquira capacidade proliferativa.

A CK 14 se expressou intensamente em 29 dos 30 casos analisados na presente

pesquisa (Foto 13), em diversos tipos celulares. Não obtivemos relação estatisticamente

significativa de sua positividade com nenhum dos parâmetros clínicos estudados, bem

como a diferenciação celular e gradação histológica utilizada, já que a mesma esteve

imunomarcada em todas as células neoplásicas independente do tipo, a não ser em algumas

células invasivas, onde observamos sua ausência em 14 (48,27%) casos (Foto 14). Esses

achados contrastam com os de Morgan e Lane (1996) que evidenciaram ausência de

marcação desta proteína em sua amostra de carcinomas epidermóides pobremente

diferenciados, levando-os a concluir que tal citoqueratina é rapidamente degradada nesses

tumores já que os mesmos ainda apresentavam seu RNAm.

Porém, Silva (1999) observou em sua pesquisa que, dentre todas as citoqueratinas

estudadas, a CK 14 foi a única presente em todos os carcinomas analisados, independente

do grau de diferenciação e da localização anatômica.

A positividade a CK 14 sugere origem a partir de epitélio estratificado, pois está

presente normalmente na camada basal de todos os sítios da boca, inclusive da língua (Foto

15) (DEPONDT et al., 1999).

No que diz respeito à ausência de positividade em algumas células invasivas,

acredita-se que isso seja decorrente da perda da manutenção da integridade estrutural dessas

células, favorecendo seu desgarramento dos ninhos e migração para estruturas adjacentes,

fato este citado por Turatti (1999) afirmadora de que o fato da CK 14 ser preservada em

todas as camadas epiteliais em lesões de líquen plano oral era uma forma de manutenção da

integridade estrutural do mesmo. A marcação no epitélio adjacente foi verificada em 22

casos, sendo caracterizada por apresentar-se intensa, homogênea, envolvendo todas as

camadas celulares. Isso pode ser explicado pela influência do infiltrado inflamatório na sua

expressão, conforme citado por alguns autores como Mackenzie e Gao (1993), e ainda pelo

fato de que, presença de alterações malignas no metabolismo celular podem levar à

expressão da CK 14 nas células tumorais independente do seu tipo, bem como em todos

estratos celulares do epitélio adjacente como descrito em nosso estudo.

A alteração de expressão da CK 14 no epitélio próximo ao tumor pode alertar para o

fato de que as margens de segurança no procedimento cirúrgico devem ser realizadas

cuidadosamente para que não haja permanência de epitélio alterado no leito cirúrgico, pois

isso pode predispor às recidivas. Sugerimos, frente a nossos achados que essa citoqueratina

pode ser utilizada como marcador de alterações precoces no epitélio servindo como

indicadora para verificar se as margens de segurança realizadas foram adequadas, já que em

áreas mais distantes do tumor o padrão de expressão dessa proteína assume aspecto de

normalidade como pode ser observado na foto 15.

A literatura considera a citoqueratina 16 como um marcador de hiperproliferação

ou de alta renovação (fast cell turnover) (WEISS; EICHNER; SUN, 1984; MORGAN;

LAN SU, 1994). Foi descrito por Scultz et al. (1992) que a mesma pode estar presente em

proporções variadas no epitélio de revestimento oral normal. Em pesquisas desenvolvidas

por Bongers et al. (1996), tal filamento intermediário esteve associado à mucosa normal

adjacente a tumores de pacientes portadores de carcinoma epidermóide oral. Essa proteína,

entretanto, não foi considerada marcadora de proliferação celular nos carcinomas

epidermóides orais analisados por Silva (1999), fato este discordante dos dados encontrados

no presente estudo, já que observamos relação estatisticamente significativa entre a

positividade da CK 16 e o estadiamento clínico, e ainda com o desfecho da doença.

Em nossa amostra, a CK 16 esteve marcada em 23 casos (76,66%), principalmente

nos centros dos ninhos tumorais (Foto 16), sendo esta expressão marcante nos pacientes

que foram a óbito, pois a mesma foi verificada 100% desses casos (Tabela 10), e ainda sua

imunomarcação foi observada em 93,33% dos casos agrupados nos estágios III e IV.

Teoricamente, neoplasias que culminam no óbito do paciente e aquelas classificadas como

T3 e T4 são mais agressivas, o que nos faz concluir, que essa proteína pode ser considerada

como um indicador de proliferação como bem descrito na literatura, além do fato de que em

nossa amostra, mostrou-se como um marcador de comportamento biológico e de

agressividade tumoral.

As citoqueratinas de epitélios simples, CKs 7, 8, 18 e 19 (COOPER; SCHERMER;

SUN, 1985) têm sido associadas a carcinomas epidermóides pobremente diferenciados em

várias pesquisas como as de Xu et al. (1995) e Depondt et al. (1999). Diferentemente desses

estudos, nós não encontramos correlação estatisticamente significativa entre a expressão

das CKs 7 e 19 com a gradação histológica e os parâmetros clínicos aqui estudados.

Todavia, observamos que a CK 7 encontrou-se imunomarcada em 13 casos, e desses, 60%

eram tumores de alto grau, de acordo com o sistema proposto por Bryne (1998) (Foto 5).

Não detectamos, porém marcação no epitélio adjacente aos tumores, contrariamente à

expressão da CK 19 que foi positiva em todas as camadas dos epitélios adjacentes às

neoplasias (Foto 21) em 18 (60%) casos. Nos tumores, observamos positividade para a CK

19 em 22 (73,33%) casos, sendo esta verificada tanto em ninhos tumorais (Foto 20) como

em células isoladas. Esta proteína tem sido descrita por alguns autores como componente

de células basais em determinados sítios da cavidade oral, embora esporadicamente

(MORGAN et al., 1987; SAWAF et al., 1991), e já que a camada basal é a de maior

atividade proliferativa em epitélios normais, sugerimos que a positividade nos epitélios

adjacentes e nos tumores seja indicativo de elevada taxa proliferativa.

Apesar de não encontrarmos relação estatisticamente significativa entre a expressão

da CK 7 e CK 19 com as variáveis clínicas e morfológicas descritas, constatamos assim

como nas pesquisas de Ogden et al. (1993), Chu et al (2000) e El-Salahy et al. (2002) a

presença anormal dessas citoqueratinas nos tumores já que, como descrito anteriormente,

essas proteínas são características de epitélios simples, sendo dessa forma, esses filamentos

sintetizados pelas células neoplásicas malignas.

Ressaltamos ainda o fato de que a CK 19 foi imunomarcada no epitélio adjacente de

18 dos 30 casos estudados, o que nos leva a sugerir que a mesma pode ser utilizada como

marcador biológico de progressão maligna, fato este bem descrito por Xu et al. (1995).

Com a realização dessa pesquisa, constatamos que o estadiamento clínico e a

presença de metástase foram eficazes como indicadores de agressividade nos carcinomas

epidermóides de língua estudados, porque essas variáveis relacionaram-se diretamente ao

resultado da doença (óbito/remissão); e contrariamente, o sistema de gradação histológica

de malignidade utilizado não se correlacionou com nenhum dos parâmetros estudados, não

sendo portanto fidedigno na determinação do comportamento biológico dos carcinomas

epidermóides de língua.

No que diz respeito aos achados imuno-histoquímicos, pudemos verificar que a

expressão de algumas citoqueratinas esteve relacionada ao comportamento biológico dos

carcinomas epidermóides estudados no presente estudo, como descrito, a ausênica de CK

10 relacionou-se à metástase, que é um dos principais determinantes de agressividade e

sobrevivência em pacientes acometidos por câncer oral, e ainda a imunomarcação da CK 16

foi correlacionada diretamente a tumores que evoluíram para óbito dos pacientes e àqueles

classificados nos estágios III e IV, os quais também são considerados como agressivos.

Adicionalmente, detectamos a expressão anormal das citoqueratinas de epitélios simples,

CKs 7 e 19 em parte dos tumores avaliados, o que nos condiciona a sugerir que a análise de

alguns filamentos intermediários de citoqueratinas pode favorecer o entendimento acerca

do comportamento biológico e agressividade dos carcinomas epidermóides orais.

CONCLUSÕES

7. CONCLUSÕES

Com base nos resultados clínicos, morfológicos e imuno-histoquímicos desse estudo

e amparados na literatura científica pertinente, podemos concluir que:

1. Os nossos dados epidemiológicos em muito se assemelham aos da literatura no

tocante ao sexo, raça e idade.

2. O estadiamento clínico (TNM) e a presença de metástases mostraram boa

efetividade como parâmetro indicador de prognóstico.

3. O sistema de gradação histológica de malignidade proposto por Bryne (1998) não se

correlacionou aos parâmetros ao desfecho da doença e aos parâmetros clínicos

estudados, não refletindo, portanto o comportamento biológico dos carcinomas

epidermóides de língua estudados.

4. A expressão da CK 10 relacionou-se á presença de metástase indicando dessa forma

que a presença de tal proteína pode ser uma barreira ao desenvolvimento de

metástase em linfonodos cervicais de carcinomas epidermóides de língua.

5. A CK 14 foi a única presente em quase todos os carcinomas independente do tipo

celular, apesar de que sua ausência em células invasivas pode ser indicativo de

perda da integridade estrutural celular, o que facilita o desgarramento das células

conseqüente migração para os sítios adjacentes.

6. A expressão da CK 13 não se relacionou a nenhum dos parâmetros descritos,

entretanto, foi encontrada predominantemente mais nas áreas bem diferenciadas dos

tumores.

7. A presença da CK 16 mostrou-se como forte indicadora de atividade proliferativa

nos tumores, já que se correlacionou diretamente a tumores que acarretaram em

óbito dos pacientes, e esteve presente predominantemente nos carcinomas

enquadrados nos estágios III e IV.

8. As citoqueratinas de epitélios simples CK 7 e CK 19 estiveram imunomarcadas em

um grande número de casos estudados apesar de não se relacionarem aos

parâmetros aqui estudados. Entretanto sugerimos que essas proteínas podem ser

utilizadas como indicadoras de transformação maligna, já que elas não se

expressam em epitélios normais.

9. As expressões alteradas dos epitélios adjacentes das citoqueratinas 13, 16 e 19

podem ser utilizadas como indicadoras de pré-malignidade.

10. A presença em todas as camadas epiteliais da CK 14 em áreas normais adjacente a

tumores pode servir tanto como indicadora precoce de malignidade como para

verificar se as margens de segurança foram realizadas adequadamente.

11. O comportamento do carcinoma epidermóide de língua pode ser reflexo do padrão

de expressão de alguns filamentos intermediários de citoqueratinas, não se

precisando, portanto se tal comportamento é conseqüência ou causa dessa

expressão.

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ANEXOS

ANEXOS

Anexo 1 – Dados clínicos obtidos a partir dos prontuários clínicos dos pacientes portadores

de câncer de língua do Hospital Dr. Luiz Antônio, Nata/RN.

Prontuário: Ano: Caso:

Sexo: Idade: Raça:

Localização anatômica:

Estadiamento clínico:

Sinais e sintomas

Número da biópsia:

Gradação histológica:

Tratamento:

Remissão: Óbito:

Metástase:

Recidivas:

Observações:

Anexo 2 – Gradação histológica de malignidade do carcinoma epidermóide de língua

segundo o sistema proposto e revisado por Bryne (1998).

Caso Nº

Grau de ceratinização

Pleomorfismo nuclear

Padrão de invasão

Infiltrado inflamatório

Escore Total

Gradação histológica

123456789101112131415161718192021222324252627282930

Anexo 3 – Achados imuno-histoquímicos referentes à expressão das citoqueratinas (CKs 7,

10, 13, 14 e 19) nos casos de carcinoma epidermóide de língua.

Caso CK 7 CK 10 CK 13 CK 14 CK 19 CK 19Nº P/A Esc. P/A Esc P/A Esc P/A Esc P/A Esc P/A Esc

123456789101112131415161718192021222324252627282930

Ausência de marcação: APresença de marcação: P

Escores (Esc): 1+ (fraca marcação); 2+ (marcação moderada); 3+ (marcação intensa)

carcinoma epidermÓide de lÍngua: correlaÇÃo … · ao prof. dr. antônio de lisboa lopes costa...

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