“caracterização do perfil de hidrocarbonetos cuticulares
TRANSCRIPT
UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FFCLRP - DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENTOMOLOGIA
“Caracterização do perfil de hidrocarbonetos cuticulares de operárias, rainhas
virgens e rainhas fisogástricas de Melipona marginata Lepeletier, 1836.”
(Hymenoptera, Apinae, Meliponini)
Maria Juliana Ferreira Caliman
Dissertação apresentada à Faculdade de Filosofia,
Ciências e Letras de Ribeirão Preto-USP, como
parte das exigências para obtenção do título de
Mestre em Ciências - Área: Entomologia.
RIBEIRÃO PRETO / SP
2008
UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FFCLRP - DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENTOMOLOGIA
“Caracterização do perfil de hidrocarbonetos cuticulares de operárias, rainhas
virgens e rainhas fisogástricas de Melipona marginata Lepeletier, 1836.”
(Hymenoptera, Apinae, Meliponini)
Maria Juliana Ferreira Caliman
Orientador: Prof. Dr. Ronaldo Zucchi
Dissertação apresentada à Faculdade de Filosofia,
Ciências e Letras de Ribeirão Preto-USP, como
parte das exigências para obtenção do título de
Mestre em Ciências - Área: Entomologia.
RIBEIRÃO PRETO / SP
2008
FICHA CATALOGRÁFICA
Ferreira-Caliman, Maria Juliana Caracterização do perfil de hidrocarbonetos cuticulares de operárias, rainhas virgens e rainhas fisogástricas de Melipona marginata Lepeletier, 1836. (Hymenoptera, Apinae, Meliponini) Ribeirão Preto, 2008. Dissertação de Mestrado, apresentada à Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto – USP, Área de concentração: Entomologia. Orientador: Zucchi, Ronaldo 1. Insetos sociais. 2. Hidrocarbonetos cuticulares. 3. Meliponíneos. 4. Cromatografia gasosa-espectrometria de massa.
Agradeço,
Ao Prof Dr Ronaldo Zucchi pela oportunidade, paciência, orientação e amizade.
Ao Sr. Sidnei Mateus, mestre e doutor em entomologia, especialista em laboratório
de insetos, informalmente meu co‐orientador e principalmente meu grande amigo, pela
ajuda incondicional durante a realização deste trabalho.
À amiga Izabel Cristina Casanova Turatti, técnica do laboratório de química
orgânica da Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto, pela realização das
amostras químicas.
Ao amigo Prof. Dr. Fabio dos Santos Nascimento pela orientação durante a
montagem do projeto e pelo incentivo durante a realização do mesmo.
À CNPq pelo auxilio financeiro.
Aos meus filhos, Letícia e Pedro, e ao meu esposo, Wellington, pelo carinho e pela
paciência incondicionais durante a realização deste trabalho.
Aos meus pais, Sônia e Assis, e à minha irmã, Silvia, que sempre estiveram comigo
apesar da distância física que nos separa.
À senhora Neuza Caliman por me ajudar sempre que necessário.
À Gisele, amiga de todas as horas e ouvinte paciente, que sempre me confortou e
me deu ânimo para continuar mesmo nas horas mais difíceis.
À Patrícia, amiga que conquistei durante esse último ano e que desejo manter
eternamente.
Ao grande amigo Leo, sempre presente e dedicado.
Ao colega de trabalho Túlio pelo auxílio durante a realização dessa dissertação e
pela ajuda na correção da mesma.
À amiga Cidinha pela amizade e por cuidar sempre com carinho de nosso ambiente
de trabalho.
A todos os colegas de laboratório: Cristiano, Michael Hncir, Denise, Plésio, Victor,
Rafael, Ayrton, Elinton, Carolina, Janaina, Elynor, Marco, Cyro, Yara e em especial às
amigas Giovanna e Juliana Alonso.
Thatʹs What It Takes (George Harrison)
And now it begins to shine And you found the eyes to see Each little drop at dawn of every day Your smile, it comes back to me And whatever you may say Donʹt let it stop, never fade away As we got to get out in this world together, doesnʹt matter if we start to make some changes. If thatʹs what it takes Then Iʹve got to be strong Donʹt want to be wrong If thatʹs what it takes The closer I get Into that open door Iʹve got to be sure If thatʹs what it takes And now that itʹs shining through And you can see all this world Donʹt let it stop, never fade away If we got to be in this life forever, Then weʹd better be taking all the chances, If thatʹs what it takes …
Ao senhor Cícero Caliman, exemplo de bondade e alegria,
dedico.
Índice
Resumo.................................................................................................................................................1
Abstract................................................................................................................................................2
Introdução............................................................................................................................................3
Objetivos..............................................................................................................................................7
Material e Métodos............................................................................................................................8
Espécie e Colônias...............................................................................................................................8
Extração de hidrocarbonetos cuticulares de operárias..................................................................8
Extração de hidrocarbonetos cuticulares de rainhas virgens.......................................................9
Extração de hidrocarbonetos cuticulares de rainhas fisogástricas..............................................9
Análise das amostras........................................................................................................................10
Análises do desenvolvimento ovariano de rainhas virgens.......................................................11
Análise dos resultados.....................................................................................................................11
Resultados.........................................................................................................................................13
Caracterização do perfil de hidrocarbonetos cuticulares de operárias.....................................13
Influência da origem da população sobre o perfil de
hidrocarbonetos cuticulares de operárias. .........................................................................22
Composição cuticular de rainhas virgens.....................................................................................23
Composição cuticular de rainhas fisogástricas.............................................................................29
Discussão e Conclusões..................................................................................................................37
Bibliografia.......................................................................................................................................42
Apêndice............................................................................................................................................48
1
Resumo
Os feromônios desempenham um papel chave em muitos aspectos da vida dos
insetos e os membros de uma colônia utilizam uma grande variedade de compostos
químicos durante a sua existência. Os hidrocarbonetos cuticulares são importantes para os
insetos sociais porque possibilitam o reconhecimento de coespecificos, companheiras de
ninho, ou mesmo indivíduos de diferentes castas. O presente estudo teve como objetivos
principais a caracterização das variações do perfil químico de operárias e de rainhas da
abelha sem ferrão Melipona marginata, relacionando‐as com a idade e o comportamento
apresentados pelos indivíduos. Para a identificação dos compostos cuticulares utilizou‐se
cromatografia gasosa associada à espectrometria de massa. A composição de
hidrocarbonetos da cutícula dos indivíduos da espécie consistiu em alcanos, alcenos,
alcadienos e alcanos ramificados, e variou de 21 até 33 átomos de carbono. Esses compostos
variaram quantitativamente e qualitativamente entre e dentro das castas, de acordo com a
idade dos indivíduos (exceto rainha fisogástrica). Os perfis cuticulares de operárias e
rainhas virgens foram caracterizados principalmente por alcanos e alcenos, enquanto o de
rainhas fisogástricas foi caracterizado por alcanos, alcenos, alcadienos e metil alcanos. O
fator que mais influenciou o perfil cuticular das rainhas fisogástricas foi a ausência de
postura. Além disso, observou‐se a existência de variações da composição química cuticular
de acordo com a origem da população, ou seja, colônias provenientes de uma mesma região
tiveram indivíduos com perfil de hidrocarbonetos semelhantes.
2
Abstract
Pheromones play a key role in many aspects of the life of insects. Members of social
insect colonies employ a large variety of chemical signals during their life. Among these,
cuticular hydrocarbons are of primary importance for social insects since they allow the
recognition of conspecifics, nestmates, or even members of different castes. The aims of the
present work were (1) to characterize the variation of the chemical profile among workers,
virgin queens, and physogastric queens of the stingless bee Melipona marginata, and (2) to
investigate the dependence of the chemical profiles on the age and the behaviour of the
studied individuals. The cuticular compounds were identified using gas chromatography
coupled to mass spectrometry (GC‐MS). The cuticular hydrocarbon profile of M. marginata
was composed of alkanes, alkenes, alkadienes and branched alkanes, varying from 21 to 33
carbons atoms. These compounds varied quantitatively and qualitatively within the
investigated castes according to age of the respective individuals (except for the
physogastric queens). The cuticular profiles of workers and virgin queens were
characterized mainly by alkanes and alkenes, whereas the profiles of the physogastric
queens were characterized by alkanes, alkenes, alkadienes and methil alkanes. The factor
that predominantly influenced the cuticular profile of the physogastric queens was the
absence/presence of oviposition. In addition to observed the variations within a colony, the
cuticular chemical profile of M. marginata differed between different populations, that is,
colonies originating from same region had individuals with similar hydrocarbon profiles,
whereas those from different regions had not.
3
1‐INTRODUÇÃO
Aspectos Gerais do grupo Melipona.
Os Meliponini correspondem ao grupo de abelhas sociais que não apresentam
ferrão e encontram‐se amplamente distribuídos pelos trópicos e subtrópicos (Sakagami
1982). Entre esses insetos, a organização social avançada é evidenciada por uma
complexidade de comportamentos que proporcionam às colônias uma unidade social
coerente (e.g. processo de aprovisionamento e oviposição – POP; revisado em Zucchi et al.
1999).
As eussociedades de insetos são constituídas tipicamente por duas castas, sendo a
rainha especializada em realizar a postura de ovos, e as operárias responsáveis pelas tarefas
de manutenção do ninho (Michener 1974). Na maioria das espécies de abelha sem ferrão
ocorre desenvolvimento dos ovários de operárias mesmo na presença da rainha (Sakagami
et al. 1963), e esses ovos frequentemente são utilizados na alimentação da rainha fisogástrica
(Sakagami & Zucchi 1963). Além disso, em algumas espécies de Melipona, ocorre a produção
de machos pelas operárias durante certas fases de desenvolvimento da colônia (revisado
por Velthuis et al 2005).
As diferentes tarefas entre as operárias não estão rigidamente estabelecidas, mas
freqüentemente ocorre uma tendência para a execução de atividades em certas idades (Wille
1983). Simões & Bego (1979) e Mateus et al. (2007) verificaram que as atividades
desempenhadas por operárias de Scaptotrigona postica e Melipona marginata,
respectivamente, modificam‐se de acordo com a idade dos indivíduos, havendo uma
sequência de atividades desempenhadas pelas operárias.
Dentre os Meliponini, as Melipona são caracterizadas pela ausência de células reais,
ou seja, rainhas e operárias emergem de células de mesmo tamanho e forma (Sakagami
1982). Assim, a determinação de castas é realizada através de uma somatória de fatores
genéticos e alimentares (Kerr 1950, Kerr & Nielsen 1966) e a produção de rainhas virgens
pode chegar a 25% das fêmeas produzidas em colônias com boas condições de alimento
(Kerr 1948). Embora essa proporção varie de acordo com a condição colonial, ocorre uma
constante produção de rainhas virgens, fato que assegura a substituição da rainha em casos
de orfandade (Michener 1974, Sakagami 1982, Engels & Imperatriz‐Fonseca 1990).
4
Entretanto, a produção excessiva de rainhas virgens pelas Melipona é o método mais
dispendioso entre as abelhas eussociais (Michener 1974). Segundo Wenseleers & Ratnieks
(2004) a expectativa de vida desses indivíduos é muito baixa, sendo quase todas mortas
pelas operárias, com exceção dos casos de substituição da rainha fisogástrica ou de
produção de enxame (Sakagami 1982). Certos comportamentos podem propiciar a
sobrevida de rainhas virgens de algumas espécies, como andar rapidamente pela colônia e
esconder‐se entre os potes e frestas da caixa, ambos observados em M. marginata por
Kleinert & Imperatriz‐Fonseca (1994).
Aspectos Ecológicos e Comportamentais dos Hidrocarbonetos cuticulares em Insetos Sociais.
A comunicação recíproca de natureza cooperativa é um critério essencial para a
manutenção da integridade das sociedades de insetos (Wilson 1971). Para tanto, são
utilizados mecanismos que envolvem compostos químicos denominados feromônios e
receptores olfativos amplamente distribuídos pelos apêndices, especialmente nas antenas
(Atkins 1980).
Estudos mostram que as respostas comportamentais dos insetos estão intimamente
relacionadas às variações quantitativas e qualitativas dos feromônios no meio em que vivem
(revisado por Howard & Blomquist 2005). No caso dos insetos sociais, grande parte dos
estímulos químicos e conseqüentes respostas comportamentais ocorrem dentro da própria
colônia, entre companheiras de ninho.
Comportamentos que requerem dispersão rápida dos sinais químicos, como os de
alarme, podem envolver feromônios constituídos por moléculas pequenas e que são
altamente voláteis. Entretanto, os insetos sociais desenvolveram vários outros mecanismos
de comunicação nos quais estão envolvidos compostos não voláteis como muitos
hidrocarbonetos (revisado por Howard & Blomquist 2005).
A cutícula dos insetos é revestida por hidrocarbonetos que oferecem uma barreira
de proteção contra a desidratação (Lockey 1988). Durante o processo evolutivo, esses
compostos foram sendo cada vez mais empregados para a comunicação, principalmente,
entre os insetos sociais (Le Conte & Hefetz 2008). Howard & Blomquist (2005) consideram
essa atuação secundaria dos hidrocarbonetos uma das razões da diversidade de compostos
5
cuticulares encontrados entre os grupos e as conseqüentes combinações altamente
específicas.
Os hidrocarbonetos cuticulares atuam como feromônios moduladores e
desencadeadores de comportamentos. Segundo Wilson (1963), feromônios desencadeadores
são aqueles que provocam mudanças imediatas e reversíveis no comportamento de outro
organismo e moduladores são aqueles envolvidos em processos comportamentais a longo
prazo. A ocorrência desses compostos mostra‐se característica entre os grupos de insetos
(espécie ou colônia), podendo variar dentro deste de acordo com a idade, casta ou sexo dos
indivíduos (Blonquist et al. 1998, Monnin & Peters 1999, Sledge et al. 2001)
Estudos recentes mostram que os hidrocarbonetos presentes na cutícula de formigas
Ponerine atuam em processos comportamentais como sinais de fertilidade e dominância (Le
Conte & Hefetz 2008). Esses compostos agiriam como feromônios moduladores do
comportamento, ou seja, sua produção durante a atividade ovariana de rainhas ou operárias
férteis provocaria a inibição do desenvolvimento ovariano de outras operárias (revisado por
Monnin 2006). Testes sobre a influência da presença da rainha no desenvolvimento
ovariano de formigas mostram que a inibição só ocorre quando as operárias estão muito
próximas da rainha, ou seja, por meio de feromônios de contato como, por exemplo, os
hidrocarbonetos cuticulares (Liebig et al. 2000).
Esse efeito modulador também foi observado em Bombus terrestris por Lopez‐
Vaamonde et al. (2007). Os autores demonstraram que feromônios não voláteis inibem tanto
o comportamento de postura de operárias quanto o desenvolvimento de outras rainhas em
colônias da espécie. Entretanto, em muitas espécies de insetos sociais as operárias são
capazes de modificar a razão sexual produzindo sua própria prole de machos (Velthuis et al.
2002, Tóth et al. 2002, Koedam et al. 2005, Ratnieks et al. 2006).
Os hidrocarbonetos agem como feromônios desencadeadores em processos de
reconhecimento de companheiras de ninho e de distinção de indivíduos intrusos (Breed
1983, Singer et al. 1998, Blomquist et al. 1998, Nunes 2008). Além disso, também são
atribuídas a eles funções relacionadas à identificação dos indivíduos dentro da colônia, ou
seja, a qual casta pertence, quais são os indivíduos geneticamente relacionados, qual a sua
função na colônia e outras respostas comportamentais (Breed & Bennett 1987, Jungnickel et
al. 2004).
6
Segundo Breed et al. (1995, 2004), os recém emergidos apresentam um perfil
químico cuticular que será influenciado ao longo do tempo pelo contato destes com material
do ninho onde se encontram. Abdalla et al. (2003) e Nunes et al. (2008) mostram que
operárias de Melipona bicolor e Schwarziana quadripuntacta, respectivamente, apresentam
variações na composição de hidrocarbonetos de acordo com a idade dos indivíduos.
Gamboa et al. (1986) classificam os odores de reconhecimento presentes na
superfície corporal de insetos sociais, de acordo com a sua origem, em “ambientais” e
“hereditários”. Os ambientais seriam aqueles adquiridos pelos indivíduos a partir das
condições ambientais como alimento e material levado para o ninho, e os hereditários
estariam relacionados a fatores genéticos e fatores maternais não genéticos
(extracromossomais). Deste modo, o perfil químico cuticular dos indivíduos de colônias sob
condições idênticas pode convergir sob influência do meio ambiente comum, ou
permanecerem diferenciados quando os odores endógenos (hereditários) prevalecerem
sobre os primeiros. Sabe‐se que os perfis de hidrocarbonetos cuticulares das abelhas
melíferas são, em grande parte, geneticamente determinados, atuando assim como pistas de
reconhecimento entre subfamílias (Arnold et al. 2000).
Os hidrocarbonetos cuticulares também fornecem pistas do status reprodutivo das
rainhas em insetos sociais. Operárias de formigas são capazes de distinguir a produtividade
e a idade das rainhas através de seus perfis de hidrocarbonetos (Hannonen et al. 2002).
Dietemann et al. (2003) mostram que os hidrocarbonetos cuticulares também atuam no
reconhecimento de operárias de formigas com atividade de postura. Sugere‐se ainda que
haja uma correlação entre atividade ovariana e perfil de hidrocarbonetos cuticulares e que
esse perfil seria utilizado por operárias para discriminarem fêmeas férteis de não férteis
(Monnin et al. 1998, Peeters et al. 1999, Liebig et al. 2000, Cuvillier‐Hot et al. 2001, Sledge et al.
2001).
Um dos fatores que influenciam a aceitação da rainha por uma colônia são os
compostos que ela emite para comunicar sua presença (Breed 1981, Breed & Stiller 1992).
Rainhas produzem e emitem numerosos compostos de glândulas e regiões de seus corpos
que as operárias utilizam apara identificá‐la como rainha (Velthuis 1970). Acredita‐se que o
grau de fertilidade possa variar entre as rainhas virgens de Melipona e que isso influenciaria
no processo de escolha daquela acompanhará o enxame (Koedam et al. 1995a). Durante os
ataques de operárias às rainhas virgens dessas abelhas o abdômen parece ser a parte mais
7
suscetível aos ataques (Silva 1972, Bego 1989). Cruz‐Landim (1967) e Mota (1988) mostraram
que o abdômen dessas abelhas concentra um grande número de glândulas tegumentares.
Os conhecimentos sobre as características dos hidrocarbonetos cuticulares em
meliponíneos vêm crescendo nos últimos anos graças às descobertas de novas técnicas de
extração e análise químicas. A cromatografia gasosa associada à espectrometria de massa
(CG‐MS) tem sido amplamente utilizada e, juntamente com o estudo do comportamento,
vem fornecendo subsídios para o entendimento dos aspectos sociobiológicos desses insetos.
OBJETIVOS
O trabalho realizado teve por finalidade:
A) Caracterizar os perfis de hidrocarbonetos cuticulares de operárias de
Melipona marginata em três diferentes idades e verificar como o perfil
químico cuticular varia entre populações de diferentes localidades;
B) Caracterizar os perfis químicos cuticulares de rainhas virgens de diferentes
idades, além de caracterizar o perfil quando estas estão envolvidas em dois
diferentes comportamentos: sofrendo agressão por parte das operárias e
agrupando‐se em um refúgio comum;
C) Avaliar como o perfil químico de rainhas fisogástricas dessa espécie se
apresenta em relação à idade e à atividade de postura.
8
2‐MATERIAL E MÉTODOS
2.1 Espécie e colônias.
A espécie Melipona marginata encontra‐se distribuída por todos os estados das
regiões sudeste e sul, além do estado da Bahia (Silveira et al 2002). Possui nome popular de
manduri, manduri menor, minduri, gurupu do miúdo ou taipeira (Nogueira‐Neto 1970).
Para a caracterização do perfil químico cuticular de operárias e rainhas foram
utilizadas quatro colônias provenientes de Cunha‐SP (colônias 1, 2, 4 e 5) e duas colônias
provenientes de Itanhaém‐SP (colônias 3 e 6), mantidas no Laboratório de Ecologia e
Evolução da FFCLRP‐USP em caixas de madeira com tampa de vidro e um tubo plástico
transparente que possibilitou a conexão da colônia com o exterior do laboratório. As
colônias foram alimentadas quando necessário com solução açucarada a 50% e, nos
períodos de baixa temperatura, foram aquecidas em estufa à 28ºC.
2.2 Extração de hidrocarbonetos cuticulares de operárias.
Foi caracterizado o perfil de hidrocarbonetos de operárias de duas colônias
provenientes de Cunha (Colônias 1 e 2) e uma colônia proveniente de Itanhaém (Colônia 3).
A coleta dos indivíduos ocorreu sob as mesmas condições, durante o mesmo período, para
que não houvesse influência no perfil relacionada às variações ambientais. Além disso, as
colônias utilizadas já se encontravam instaladas no laboratório há mais de três meses,
minimizando a possibilidade de influência de materiais coletados no local de origem.
Para a amostragem de indivíduos com idade intermediária e idade avançada foram
coletadas operárias com postura de ovo trófico e atividade no campo, respectivamente.
Estima‐se, para a espécie, que a idade de operárias ovipositando (ovo trófico) seja de 9 a 10
dias de vida (Mateus et al. 2007). Para a coleta de operárias recém‐emergidas, foram
separados favos de cada colônia e mantidos em incubadora BOD modelo MA 415 à 28ºC.
Durante o estudo, algumas colônias passaram por orfandade, tendo sido observada
neste período a postura por operárias. Na colônia 1 esse comportamento iniciou‐se 7 dias
após a morte da rainha, sendo coletadas 10 operárias no momento seguinte à postura.
A extração dos compostos ocorreu por meio de banhos em solvente apolar hexano
(500μl) por um minuto.
9
A caracterização dos grupos amostrais fará referência à atividade que os indivíduos
desempenhavam no momento da coleta, exceto para operárias recém emergidas. As
operárias com postura de ovos tróficos (idade intermediária) serão caracterizadas como
operárias com atividade no favo de cria e aquelas com postura na ausência da rainha como
operárias poedeiras. As operárias mais velhas serão chamadas de campeiras.
2.3 Extração de hidrocarbonetos cuticulares de rainhas virgens.
Para a caracterização do perfil cuticular de rainhas virgens foram utilizadas três
colônias de M. marginata. Foram coletadas rainhas virgens recém emergidas (N=10 para
uma colônia) e com 2 dias de idade (N=20 para a colônia 1 e N=15 para as colônias 2 e 3). Os
favos de cria foram previamente retirados e mantidos em incubadora BOD modelo MA 415
à 28ºC e à medida que operárias e machos emergiam eram devolvidos para as colônias de
origem. As rainhas virgens receberam marcação com tinta plástica (cuidadosamente
retirada no momento da extração dos compostos) e mantidas juntamente com o favo até o
terceiro dia de vida quando foram coletadas e congeladas para análise dos compostos
cuticulares.
Além da caracterização do perfil de acordo com a idade caracterizou‐se o perfil de
rainhas virgens envolvidas em dois diferentes comportamentos. Foram coletadas 7 rainhas
virgens agrupadas em um refúgio comum (entre o cerúmen depositado no vidro da caixa
de observação) e outras 10 no momento em que eram agredidas pelas operárias. As rainhas
desse último grupo apresentavam abdômen inflado, característica de rainhas virgens desta
e de outras espécies de Melipona durante a execução (Imperatriz‐Fonseca e Zucchi 1995, van
Veen et al. 1999).
Os compostos cuticulares foram extraídos por meio de banhos em solvente apolar
hexano (500 μl) por 1 minuto.
2.4 Extração de hidrocarbonetos cuticulares de rainhas fisogástricas.
Todas as amostras do perfil químico de rainhas fisogástricas foram obtidas através
da técnica não‐destrutiva de micro‐extração em fase sólida (SPME), de modo que elas
permanecem ativas no ninho após a coleta das amostras. A extração de hidrocarbonetos
10
ocorreu por meio do contato e leve fricção de fibra de polidimetilsiloxano SUPELCO (30 μm
bounded) por cerca de 10 segundos no abdômen dessas rainhas.
Foram coletadas amostras de rainhas com produtividade considerada com
freqüência normal para essas colônias, além daquelas que, em alguns períodos do ano
permaneceram sem ovipositar. Em determinada fase de desenvolvimento das colônias 5 e 6,
as rainhas não eram vistas sob o favo de cria, sugerindo inclusive que as colônias estivessem
órfãs. Entretanto, eventualmente passou‐se a observá‐las caminhando sob os potes de
alimento e invólucro do favo de cria. Nesse período não houve construção de células pelas
operárias. Foram coletadas amostras da composição de hidrocarbonetos cuticulares dessas
rainhas durante esse período. A rainha da colônia 5 também foi analisada após a retomada
da atividade de postura (54 dias), sendo que a rainha da colônia 6 morreu 35 dias após
reiniciar essa atividade. Uma vez que as 2 rainhas já haviam sido analisadas quando
ovipositavam normalmente, puderam‐se comparar as mudanças no perfil químico durante
as diferentes situações de postura.
Para análise da variação do perfil de hidrocarbonetos cuticulares das rainhas
fisogástricas em relação à idade realizou‐se a amostragem dos compostos cuticulares no 6º,
32º e 65º dia após o início da atividade de postura de uma rainha.
As rainhas das 6 colônias foram analisadas, sendo que para três colônias obtiveram‐
se amostras de rainhas sucessoras (Colônia 1, Colônia 2 e Colônia 5).
As análises realizadas com o método SPME possibilitam, além da manutenção do
indivíduo na colônia, a coleta gradual de amostras. Entretanto, apenas uma pequena fração
da cutícula desse indivíduo é amostrada, diferente do que obtem‐se com técnicas que
utilizam solventes. Deste modo, duas rainhas foram analisadas por meio de banhos em
hexano (500 μl) por 1 minuto a fim de se comparar os resultados obtidos pelas duas
diferentes técnicas, além de utilizar esse perfil para comparar a composição de
hidrocarbonetos cuticulares de rainhas virgens e rainhas fisogástricas.
2.5 Análise das amostras.
As amostras diluídas em hexano e as fibras de polidimetilsiloxano foram levadas
para análise no Laboratório de Produtos Naturais da Faculdade de Ciências Farmacêuticas
de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, local onde se encontra instalado um sistema
11
de Cromatografia Gasosa acoplado à Espectrometria de Massas SHIMADZU, modelo
GCMS‐QP2010, equipado com coluna DB‐5MS 30m e hélio como gás carreador à 1 ml/min,
utilizando o método ionização eletrônica (EI).
O protocolo de temperatura usado foi: 150oC‐ 280oC a uma taxa de 3oC/min
(mantido 15 minutos). Análises são feitas em modo splitless.
2.6 Análises do desenvolvimento ovariano de rainhas virgens.
Após a obtenção dos compostos cuticulares, as rainhas virgens foram dissecadas
para a caracterização do desenvolvimento ovariano. Foi utilizada Lupa LEICA modelo DFC
500 acoplada a um microcomputador contendo um programa de captura de imagem IM50
Versão 4.0 (Leica Microsystens Imaging Solutions Ltd). Não foram avaliados os diferentes
graus de desenvolvimento dos ovários, sendo classificado como presente a partir do estágio
inicial de desenvolvimento.
2.7 Análise dos resultados.
Os dados obtidos foram analisados com o auxílio do programa GCMSsolutions for
Windows (Shimadzu Corporation). Os cromatogramas apresentaram vários picos
cromatográficos em diferentes posições devido aos diferentes tempos de retenção (TR) de
cada soluto na coluna cromatográfica. Cada pico cromatográfico, por sua vez, contém todas
as informações obtidas pelo espectrômetro de massa. A quantificação foi realizada com base
nas áreas de pico obtidas pelos cromatogramas (Singer & Espelie 1992).
Após detectar possíveis contaminantes da amostra, como ftalato (composto
proveniente do plástico) as concentrações relativas foram ajustadas. Substâncias presentes
em menos de quatro indivíduos foram representadas como traços nas tabelas de
concentrações relativas.
Utilizou‐se análise estatística multivariada para comparar os grupos experimentais.
Análise dos principais componentes (PCA) foi usada para definição dos principais picos de
compostos a serem comparados. Posteriormente, análise discriminante stepwise foi utilizada
para se contrastar o perfil químico dos grupos experimentais. Substâncias ausentes na maior
parte dos indivíduos de um grupo foram excluídas das analises estatísticas. Os compostos
12
apontados pela análise dos componentes principais como responsáveis por menos de 5% de
contribuição para os dois primeiros fatores dessa análise não foram utilizados na análise
discriminante, sendo as porcentagens dos compostos utilizados reajustadas para 100%. Para
se evitar erros na composição dos dados amostrais (Aitchison 1986), a área de cada pico
apontado pelo cromatograma foi transformado de acordo com a seguinte fórmula:
Z = ln [ Ap / g (Ap) ]
onde, Ap é a área do pico, g (Ap) é a média geométrica do pico em cada grupo de
operárias e Z é a área transformada do pico.
Todas as os testes estatísticos dessa dissertação foram feitos com auxílio do pacote
Statistica for Windows 7.0 (Statsoft, inc).
13
3‐RESULTADOS
3.1 Caracterização do perfil de hidrocarbonetos cuticulares de operárias em
relação à idade.
Os resultados mostram que as operárias das três colônias analisadas possuem
composição cuticular semelhante quanto à diversidade de hidrocarbonetos. Os
hidrocarbonetos variaram entre o C22 e o C31, sendo os mais representativos os alcanos,
seguidos de alcenos e, em menor freqüência, alcadienos.
Observa‐se que alguns compostos estão presentes somente em uma ou duas faixas
etárias das operárias. As recém emergidas foram caracterizadas pela presença do
heneicosano e ausência dos alcadienos (ZZ‐nonacosadieno e ZZ‐hentriacontadieno). As
operárias do favo, de modo geral, apresentaram a maior variedade de compostos. As
operárias campeiras caracterizam‐se principalmente pela ausência do octacosano.
Tricosano e pentacosano foram os compostos que aumentaram a concentração
relativa durante a idade das operárias nas três colônias analisadas.
Colônia 1
As operárias da colônia 1 apresentaram um total de 23 hidrocarbonetos, sendo a
maioria alcenos e alcanos (tabela 1). Aqueles com maior representatividade durante toda a
fase de vida das operárias foram: tricosano, pentacosano, Z‐heptacoseno (Tempo de
Retenção 33,295), heptacosano e Z‐nonacoseno (TR 38,016).
Foram analisados 4 grupos de operárias desta colônia, entretanto, as operárias com
postura de ovo na ausência da rainha (operárias poedeiras) não foram coletadas sob as
mesmas condições que os outros 3 grupos. Assim, estas não foram utilizadas para efeito de
análise da ocorrência dos compostos na cutícula das operárias ao longo do tempo. O perfil
de hidrocarbonetos dessas operárias apresentou‐se bem diferenciado daquele caracterizado
para operárias ovipositando na presença da rainha, com variação em quase todos os
compostos.
Entre os 3 grupos restantes o Z‐pentacoseno (TR 28,453) aumentou sua
concentração relativa enquanto outros compostos foram perdidos gradativamente com a
idade da operária, como o Z‐heptacoseno (TR 33,295) e Z‐hentriaconteno (TR 42,350).
O Fator 1 da Análise dos Componentes Principais (PCA) descreveu 52,60% da
variação encontrada. A soma dos dois primeiros fatores (Fator 1 + Fator 2) descreveu
14
83,33% e dos três primeiros (Fator 1 + Fator 2 + Fator 3) descreveu 96,13% dessa variação. A
análise discriminante stepwise dos compostos analisados separou significativamente os
grupos de operárias dessa colônia (Modelo Global: Wilk’s Lambda= 0,00016; F21,66= 63,933;
p < 0,001). Os compostos responsáveis pela separação entre os grupos foram: tricosano,
tetracosano, Z‐pentacoseno (TR 28,253), Z‐pentacoseno (TR 28,453), pentacosano, Z‐
heptacoseno (TR 33,295), heptacosano e Z‐nonacoseno (TR 38,016).
Tabela 1: Valores médios e desvio padrão da concentração relativa dos hidrocarbonetos cuticulares de operárias recém emergidas (ORE), com atividade no favo de cria (OF), operária ovipositando na ausência da rainha (OP) e com atividades no campo (OC) de Melipona marginata COLÔNIA 1 (Cunha-SP). Tempo de Retenção
Hidrocarboneto ORE (n=10)
OF (n=10)
OP (n=10)
OC (n=10)
18,200 Heneicosano 1,05 ± 0,333 ‐ ‐ ‐
23,708 Tricosano 17,40 ± 4,41 14,13 ± 6,48 8,46 ± 12,449 23,40 ± 2,56
26,385 Tetracosano 0,40 ± 0,10 0,54 ± 0,16 ‐ 0,88 ± 0,083
28,253 Z‐Pentacoseno ‐ 1,22 ± 0,73 1,14 ± 1,573 1,03 ± 0,23
28,453 Z‐Pentacoseno 1,56 ± 0,59 2,90 ± 0,68 ‐ 5,01 ± 1,04
28,975 Pentacosano 14,09 ± 1,11 25,46 ± 3,86 22,33 ± 8,947 26,73 ± 3,28
31,497 Hexacosano 0,45 ± 0,14 0,47 ± 0,10 2,16 ± 1,376 ‐
33,163 Z‐Heptacoseno 0,71 ± 0,10 ‐ 3,77 ± 1,530 ‐
33,295 Z‐Heptacoseno 29,29 ± 5,28 7,28 ± 2,09 1,82 ± 0,619 6,53 ± 1,33
33,477 Z‐Heptacoseno 0,56 ± 0,55 2,17 ± 1,01 0,46 ± 0,400 2,37 ± 0,47
33,935 Heptacosano 9,16 ± 1,59 11,43 ± 3,08 17,1 ± 7,086 7,90 ± 0,85
36,423 Octacosano 0,55 ± 0,18 0,74 ± 0,54 6,41 ± 3,727 ‐
37,838 ZZ‐Nonacosadieno ‐ 4,75 ± 2,04 6,06 ± 3,510 ‐
37,909 ZZ‐Nonacosadieno ‐ 5,70 ± 1,76 4,79 ± 1,889 4,28 ± 0,96
38,016 Z‐Nonacoseno 17,06 ± 1,36 0,72 ± 0,26 8,06 ± 4,276 4,23 ± 0,81
38,192 Z‐Nonacoseno ‐ 0,95 ± 0,38 1,70 ± 1,021 0,66 ± 0,16
38,589 Nonacosano 1,09 ± 0,31 5,00 ± 1,41 5,41 ± 2,522 3,68 ± 1,04
41,977 ZZ‐Hentriacontadieno ‐ 0,55 ± 0,14 0,61 ± 0,530 0,68 ± 0,19
42,122 ZZ‐Hentriacontadieno ‐ 8,53 ± 2,57 8,58 ± 3,135 6,57 ± 1,40
42,350 Z‐Hentriaconteno 4,56 ± 0,63 1,14 ± 0,34 3,71 ± 2,022 ‐
42,442 Z‐Hentriaconteno ‐ 0,80 ± 0,18 ‐ ‐
42,962 Z‐Hentriaconteno ‐ 2,40 ± 0,69 2,16 ± 1,138 ‐
43,177 Hentriacontano ‐ ‐ 3,40 ± 0,750 1,43 ± 0,34
A classificação da matriz apontou um total de 100% de correta alocação das
operárias dentro do grupo previsto. A tabela 2 e a figura 1 ilustram os resultados da
análise discriminante e canônica, respectivamente, para todas as combinações entre
diferentes idades.
15
Tabela 2: Resultado da análise discriminante aplicada para os compostos químicos cuticulares de operárias da colônia 1. ORe-operária recém emergida, OF-operária do favo, OC-operária campeira, OP-operária poedeira (na ausência da rainha)
Combinações Distância de Mahalanobis
F 7,23 P
ORe x OF 788,82 378,52 < 0,001 ORe x OC 855,14 430,61 < 0,001 ORe x OP 582,85 226,31 < 0,001 OF x OC 13,92 7,47 < 0,001 OF x OP 178,05 72,62 < 0,001 OC x OP 278,35 118,26 < 0,001
Raiz 1 vs. Raiz 2
-15 -10 -5 0 5 10 15 20 25
Raiz 1
-14
-12
-10
-8
-6
-4
-2
0
2
4
6
8
Rai
z 2
ORe OF OC OP
Figura 1: Gráfico do resultado da análise canônica realizada com os compostos químicos cuticulares de operárias de M. marginata, Colônia 1. ORe- Operária Recém-emergida, OF- Operária do Favo (com postura de ovo trófico), OC- Operária Campeira, OP- Operária poedeira (produzindo machos na ausência da rainha).
Colônia 2
As operárias da colônia 2 apresentaram um total de 25 hidrocarbonetos (tabela 3).
Aqueles com maior representatividade durante toda a fase de vida das operárias foram:
tricosano, pentacosano, heptacosano e Z‐hentriaconteno (TR 42,350).
16
Tabela 3: Valores médios e desvio padrão da concentração relativa dos hidrocarbonetos cuticulares de operárias recém emergidas (ORE), com atividade no favo de cria (OF) e com atividades de campo (OC) de Melipona marginata COLÔNIA 2 (Cunha-SP). Tempo de Retenção
Hidrocarboneto ORE (n=10)
OF (n=10)
OC (n=10)
18,200 Heneicosano 0,97 ± 0,28 ‐ ‐
23,142 Z‐Tricosene ‐ 1,64 ± 0,99 2,88 ± 0,45
23,708 Tricosano 13,33 ± 2,47 13,31 ± 8,99 18,94 ± 1,52
26,385 Tetracosano 0,37 ± 0,06 ‐ 0,95 ± 0,07
28,253 Z‐Pentacoseno 1,31 ± 0,33 0,81 ± 0,28 1,70 ± 0,33
28,453 Z‐Pentacoseno 1,19 ± 0,26 4,52 ± 2,07 7,04 ± 0,51
28,975 Pentacosano 14,40 ± 1,49 20,51 ± 6,70 25,87 ± 1,72
31,497 Hexacosano 0,37 ± 0,06 0,39 ± 0,08 0,34 ± 0,06
33,163 Z‐Heptacoseno 0,68 ± 0,09 0,89 ± 0,80 1,02 ± 0,54
33,295 Z‐Heptacoseno 29,17 ± 2,13 0,75 ± 0,55 0,79 ± 0,18
33,477 Z‐Heptacoseno 0,69 ± 0,09 3,28 ± 0,71 3,83 ± 0,44
33,935 Heptacosano 8,38 ± 1,55 7,65 ± 3,52 5,47 ± 0,67
36,423 Octacosano 0,63 ± 0,17 0,61 ± 0,44 ‐
37,838 ZZ‐Nonacosadieno ‐ 0,85 ± 0,64 0,75 ± 0,47
37,909 ZZ‐Nonacosadieno ‐ 0,88 ± 0,56 0,96 ± 0,31
38,016 Z‐Nonacoseno 16,93 ± 1,28 0,70 ± 0,71 0,61 ± 0,56
38,192 Z‐Nonacoseno 0,64 ± 0,08 9,40 ± 3,07 13,30 ± 1,99
38,589 Nonacosano 1,61 ± 0,35 2,62 ± 1,48 1,93 ± 0,60
41,977 ZZ‐Hentriacontadieno ‐ 1,08 ± 0,46 1,00 ± 0,19
42,122 ZZ‐Hentriacontadieno ‐ 0,79 ± 0,36 0,70 ± 0,15
42,350 Z‐Hentriaconteno 8,16 ± 0,93 3,12 ± 2,00 2,59 ± 0,70
42,442 Z‐Hentriaconteno ‐ 1,61 ± 1,21 ‐
42,647 Z‐Hentriaconteno ‐ 0,88 ± 0,46 0,62 ± 0,28
42,962 Z‐Hentriaconteno ‐ 3,17 ± 1,39 4,37 ± 0,41
43,177 Hentriacontano 0,57 ± 0,15 2,26 ± 0,89 1,64 ± 0,37
Assim como entre as operárias da colônia 1, os compostos Z‐pentacoseno (TR
33,477) e Z‐nonacoseno (TR 38,192) aumentaram as concentrações relativas enquanto outros
compostos foram sendo perdidos gradativamente com a idade: Z‐heptacoseno (TR 33,295),
heptacosano, Z‐nonacoseno (TR 38,016) e Z‐hentriaconteno (TR 42,350). O grupo das
operárias recém emergidas foi aquele que apresentou menor variedade de hidrocarbonetos
em relação àquelas com idade mais avançada.
O Fator 1 da Análise dos Componentes Principais (PCA) descreveu 65,74% da
variação encontrada. A soma dos dois primeiros fatores (Fator 1 + Fator 2) descreveu 86,80%
17
e dos três primeiros (Fator 1 + Fator 2 + Fator 3) descreveu 97,90% dessa variação. A análise
discriminante stepwise dos compostos analisados separou significativamente os grupos de
operárias dessa colônia (Modelo Global: Wilk’s Lambda= 0,00052; F10,42= 180,56; p < 0,001).
Os compostos responsáveis pela separação entre os grupos foram: tricosano, pentacoseno
(TR 28,453), pentacosano, Z‐heptacoseno (TR 33,295), heptacosano, Z‐nonacoseno (TR 38,016
e TR 38,192), nonacosano e Z‐hentriaconteno (TR 42,962).
A figura 2 ilustra os resultados da análise canônica entre os grupos. A tabela 4
mostra o resultado da análise discriminante para todas as combinações possíveis entre os
grupos analisados. A classificação da matriz apontou um total de 100% de correta alocação
dos indivíduos.
Raiz 1 vs. Raiz 2
-15 -10 -5 0 5 10 15 20
Raiz 1
-6
-4
-2
0
2
4
6
8
10
Rai
z 2
ORe OFOC
Figura 2: Gráfico do resultado da análise canônica realizada com os compostos químicos cuticulares de operárias de M. marginata, Colônia 2. ORe- Operária Recém-emergida, OF- Operária com atividade no favo de cria, OC- Operária Campeira.
18
Tabela 4: Resultado da análise discriminante aplicada para os compostos químicos cuticulares de operárias da colônia 2. ORe-operária recém emergida, OF-operária com atividade no favo de cria OC-operária campeira
Combinações Distância de Mahalanobis
F 5,21 P
ORe x OF 544,68 406,69 < 0,001 ORe x OC 601,84 505,55 < 0,001 OF x OC 71,49 53,37 < 0,001
Colônia 3
As operárias dessa colônia apresentaram menor variedade de hidrocarbonetos em
relação às colônias 1 e 2, totalizando 19 compostos (tabela 5). Aqueles com maior
representatividade durante toda a fase de vida das operarias foram: tricosano, pentacosano,
Z‐heptacoseno (TR 33,295), heptacosano e Z‐nonacoseno (TR 38,192).
Os compostos que foram sendo perdidos gradativamente com a idade da operária
foram: Z‐heptacoseno (TR 33,295), octacosano, Z‐nonacoseno (TR 38,192) e Z‐hentriaconteno
(TR 42,442).
O Fator 1 da Análise dos Componentes Principais (PCA) descreveu 51,90% da
variação encontrada. A soma dos dois primeiros fatores (Fator 1 + Fator 2) descreveu 73,85%
e dos três primeiros (Fator 1 + Fator 2 + Fator 3) descreveu 89,51% dessa variação. A análise
discriminante stepwise dos compostos analisados separou significativamente os grupos de
operárias dessa colônia (Modelo Global: Wilk’s Lambda= 0,00149; F10,42= 104,46; p < 0,001).
Os compostos responsáveis pela separação entre os grupos foram: tricosano,
pentacoseno, pentacosano, Z‐heptacoseno (TR 33,500), Z‐nonacoseno (TR 38,069).
A classificação da matriz apontou que todos os grupos são significativamente
separados entre si, sendo 100% de correta alocação dos indivíduos.
A tabela 6 mostra o resultado da análise discriminante para todas as combinações
entre os grupos analisados. A Figura 3 mostra o resultado da analise canônica entre as
operárias da colônia 3.
19
Tabela 5: Valores médios e desvio padrão da concentração relativa dos hidrocarbonetos cuticulares de operárias recém emergidas (ORE), com atividade no favo de cria (OF) e com atividades de campo (OC) de Melipona marginata COLÔNIA 3 (Itanhaém-SP). Tempo de
Retenção
Hidrocarboneto ORE
(n=10)
OF
(n=10)
OC
(n=10)
18,200 Heneicosano 0,83 ± 0,41 ‐ ‐
23,708 Tricosano 12,20 ± 2,20 7,26 ± 1,89 13,45 ± 2,33
26,385 Tetracosano 0,34 ± 0,05 0,48 ± 0,11 0,87 ± 0,06
28,253 Z‐Pentacoseno 1,09 ± 0,42 2,10 ± 0,62 1,94 ± 0,29
28,975 Pentacosano 12,22 ± 1,46 17,38 ± 2,53 27,88 ± 1,26
31,497 Hexacosano 0,47 ± 0,12 0,55 ± 0,10 0,85 ± 0,12
33,163 Z‐Heptacoseno 0,33 ± 0,11 1,89 ± 0,28 1,17 ± 0,27
33,295 Z‐Heptacoseno 32,56 ± 3,74 12,06 ± 1,78 10,37 ± 1,30
33,477 Z‐Heptacoseno ‐ ‐ 0,23 ± 0,03
33,935 Heptacosano 11,74 ± 4,26 10,41 ± 1,38 15,46 ± 2,21
36,423 Octacosano 0,78 ± 0,46 0,44 ± 0,09 ‐
38,016 Z‐Nonacoseno 0,52 ± 0,12 9,08 ± 2,25 4,59 ± 0,91
38,192 Z‐Nonacoseno 19,53 ± 2,13 8,44 ± 2,18 5,50 ± 0,57
38,589 Nonacosano 1,73 ± 1,01 1,73 ± 0,34 2,56 ± 0,60
41,977 ZZ‐Hentriacontadieno ‐ 3,83 ± 0,63 1,86 ± 0,23
42,122 ZZ‐Hentriacontadieno ‐ 2,69 ± 0,50 1,76 ± 0,29
42,350 Z‐Hentriaconteno 0,32 ± 0,34 1,36 ± 0,75 0,97 ± 0,29
42,442 Z‐Hentriaconteno 5,95 ± 0,94 1,45 ± 0,94 0,67 ± 0,28
43,177 Hentriacontano 0,42 ± 0,215 0,82 ± 0,326 0,39 ± 0,124
Tabela 6: Resultado da análise discriminante aplicada para os compostos químicos cuticulares de operárias da colônia 3. ORe-operária recém emergida OF-operária com atividade no favo de cria OC-operária campeira
Combinações Distância de Mahalanobis
F 5,21 P
ORe x OF 517,95 391,57 < 0,001 ORe x OC 592,58 471,56 < 0,001 OF x OC 23,34 18,57 < 0,001
20
Raiz 1 vs. Raiz 2
-15 -10 -5 0 5 10 15 20
Raiz 1
-5
-4
-3
-2
-1
0
1
2
3
4
5
Rai
z 2
ORe OF OC
Figura 3: Gráfico do resultado da análise canônica realizada com os compostos químicos cuticulares de operárias de M. marginata, Colônia 3. ORe- Operária Recém-emergida, OF- Operária com atividade no favo de cria, OC- Operária Campeira. Caracterização geral das operárias em relação à atividade desempenhada no
momento da coleta.
A partir dos dados obtidos para cada colônia individualmente realizou‐se a análise
estatística para verificar a semelhança entre os indivíduos, independente de sua colônia de
origem. Os resultados mostram que as operárias estão separadas significativamente em
grupos de acordo com a idade (e conseqüente atividade). A análise dos componentes
principais (PCA) descreveu 48,09% (Fator 1), 71,30% (Fator 1 + Fator 2) e 83,20% (Fator 1 +
Fator 2 + Fator 3).
A análise discriminante stepwise dos compostos separou os grupos de operárias
recém emergidas, com atividade no favo de cria e coma atividade no campo (Modelo
Global: Wilk’s Lambda= 0,00361; F14,154= 171,95; p < 0,001), sendo os compostos responsáveis
pela separação: tricosano, pentacoseno (TR 28,253), pentacosano, Z‐heptacoseno (TR
33,477), Z‐nonacoseno (TR 38,016) e o hentriaconteno (TR 42,350).
21
As análises estatísticas mostram que, mesmo pertencendo a três diferentes colônias,
as operárias apresentam‐se caracterizadas pela atividade que desempenham, sendo 100%;
95,60% e 90% de correta alocação para recém emergidas, operárias com atividade no favo e
campeiras, respectivamente. O valor esperado para uma distribuição ao acaso é de 33,33%.
A tabela 7 e a figura 4 ilustram os resultados das análises discriminante e canônica
obtidos, respectivamente.
Raiz 1 vs. Raiz 2
-12 -10 -8 -6 -4 -2 0 2 4 6 8
Raiz 1
-5
-4
-3
-2
-1
0
1
2
3
4
5
6
Rai
z 2
ORe OF OC
Figura 4: Resultado da análise canônica realizada com os compostos químicos cuticulares de operárias de três colônias de M. marginata. ORe- Operária Recém-emergida, OF- Operária com atividade no favo de cria, OC- Operária Campeira.
22
Tabela 7: Resultado da análise discriminante aplicada para os compostos químicos cuticulares das operárias de três colônias de M. marginata. ORe-operária recém emergida OF- operaria com atividade no favo de cria OC- operária do campo
Combinações Distância de Mahalanobis
F 7,77 P
ORe x OF 90,41 167,54 < 0,001 ORe x OC 260,07 508,25 < 0,001 OF x OC 83,28 156,84 < 0,001
3.2 Influência da origem da população sobre o perfil de hidrocarbonetos
cuticulares de operárias.
Todos os grupos amostrais de operárias foram comparados entre si para a
verificação da influência da origem da população sobre o perfil de hidrocarbonetos
cuticulares. Os resultados mostram que os perfis das operárias das colônias 1 e 2
provenientes de Cunha‐SP são mais próximos entre si do que em relação à colônia 3,
originaria de Itanhaém‐SP (tabela 8), sendo bem evidente entre as operárias recém
emergidas e do campo. A tabela 9 mostra a classificação da matriz e a figura 5 ilustra o
resultado da análise canônica. A análise dos componentes principais (PCA) descreveu
53,44% (Fator 1), 72,82% (Fator 1 + Fator 2) e 84,98% (Fator 1 + Fator 2 + Fator 3).
Tabela 8 :Distâncias de Mahalanobis entre as colônias 1, 2 e 3. ORe-operária recém emergida, OF-operaria com atividadede no favo de cria, OC-operária campeira
Grupos Distâncias de Mahalanobis
F 8,70 p
ORe1 x ORe 2 16,814 9,55 < 0,001 ORe 1 x ORe 3 101,135 54,43 < 0,001 ORe 2 x ORe 3 130,164 70,06 < 0,001 OF 1 x OF 2 187,863 96,06 < 0,001 OF 1 x OF 3 194,080 99,24 < 0,001 OF 2 x OF 3 177,638 90,83 < 0,001 OC 1 x OC 2 20,516 11,65 < 0,001 OC 1 x OC 3 210,622 119,67 < 0,001 OC 2 x OC 3 191,575 108,85 < 0,001
Tabela 9: Classificação da matriz das operárias de acordo com atividade e colônia de origem. Valor esperado para distribuição ao acaso=11,12%. Grupo Amostral ORe
col 1 ORe col 2
ORe col 3
OF col 1
OF col 2
OF col 3
OC col 1
OC col 2
OC col 3
Porcentagem de correta alocação
100% 100% 100% 88,9% 100% 87,50 100% 100% 100%
23
Scatterplot (Spreadsheet10 10v*86c)
Var2
Var3
ORe col 1OF col 1OC col 1ORe col 2OF col 2OC col 2ORe col 3OF col 3OC col 3-14 -12 -10 -8 -6 -4 -2 0 2 4 6 8 10 12 14 16
-8
-6
-4
-2
0
2
4
6
8
10
Figura 5: Gráfico do resultado da análise canônica entre operárias das 3 colônias de M.marginata.
ORe-recém emergida, OF-operária do favo, OC-operária campeira, Col- colônia.
3.2. Composição cuticular de rainhas virgens
A análise dos compostos cuticulares de rainhas virgens mostrou que, assim como
ocorre em operárias, existe uma modificação no perfil de hidrocarbonetos em relação à
idade dos indivíduos. Os hidrocarbonetos encontrados apresentaram de 23 a 33 átomos de
carbonos e cada grupo de rainha foi caracterizado por apresentar formas diferentes destes
compostos (tabela 10).
As recém emergidas foram caracterizadas pela baixa presença de alcadienos
(somente traços) e pela pouca diversidade dos alcenos, sendo os alcanos: tricosano,
pentacosano, heptacosano, nonacosano e hentriacontano, e três alcenos Z‐heptacoseno (TR
32.962), Z‐nonacoseno (TR 37.532) e Z‐hentriaconteno (TR 41.840) os compostos com maior
concentração relativa.
24
As rainhas virgens com 2 dias de idade apresentaram maior diversidade de
compostos em relação àquela encontrada em recém emergidas. Estão presentes na cutícula
desses indivíduos principalmente alcanos seguidos por alcenos, sendo que não foram
encontrados hidrocarbonetos metilados e somente um alcadieno, este último em
concentrações muito baixas em duas das três colônias. Os hidrocarbonetos com maior
representatividade nesses grupos foram: Tricosano, Pentacosano, Heptacosano,
Nonacosano, Z‐Heptacoseno (TR 32.962), Z‐Nonacoseno (TR 37.532) e Z‐Hentriaconteno
(TR 41.840).
A composição de hidrocarbonetos cuticulares de rainhas virgens coletadas em um
refúgio comum mostra que estas apresentam perfis semelhantes aquele encontrado em
rainhas com dois dias de vida, exceto pela alta concentração de Z‐nonacoseno (TR 32.761) e
Z‐heptacoseno (TR 33.159).
As rainhas coletadas no momento em que eram agredidas pelas operárias
apresentaram maior diversidade de hidrocarbonetos em relação àquelas recém emergidas e
com 2 dias de vida. Além dos alcanos e alcenos, foram encontrados alcanos metilados e
alcadienos, além de uma maior variedade de alcenos. Os compostos mais representativos
foram os mesmos encontrados nas recém emergidas e com dois dias, além do Z‐
heptacoseno (TR 32.827), Z‐nonacoseno (TR 37.437 e TR 37.470), Z‐hentriaconteno (TR
42.010) e Z‐hentriaconteno (TR 42.020). Esse grupo foi bem caracterizado pela presença de
alcenos e alcadienos de cadeia longa (C29, C31 e C33) e por alcanos metilados (C27 e C29).
As análises estatísticas revelaram que os grupos de rainhas virgens com 2 dias estão
significativamente separados por colônias, sendo 95%, 61,54% e 100% de correta alocação
dos indivíduos nas colônias 1, 2 e 3, respectivamente. O esperado em uma distribuição ao
acaso para três grupos é de 33,3%. Os compostos responsáveis por essa separação foram:
tricosano, pentacosano, Z‐heptacoseno (TR 32.962), heptacosano, nonacosano e Z‐
hentriacontene (TR 41.840).
O Fator 1 da Análise dos Componentes Principais (PCA) descreveu 46,39% da
variação encontrada. A soma dos dois primeiros fatores (Fator 1 + Fator 2) descreveu 67,80%
e dos três primeiros (Fator 1 + Fator 2 + Fator 3) descreveu 80,97% dessa variação. A análise
discriminante stepwise dos compostos analisados separou significativamente os grupos de
operárias dessa colônia (Modelo Global: Wilk’s Lambda= 0,05635; F10,58= 18,634; p < 0,001).
25
Tabela 10: Valores médios e desvio padrão da concentração relativa dos hidrocarbonetos cuticulares de rainhas virgens de Melipona marginata. Re-recém emergida.
TR Hidrocarboneto Re Col 1 (N=10)
2 dias Col 1 (N=20)
2 dias Col 2 (N=15)
2 dias Col 3 (N=15)
Refugiadas Col 2 (N=7)
Agredidas Col 1 (N=14)
18.237 Heneicosano 0,63 ± 0,294 0,72 ± 0,368 1,37 ± 0,228 0,56 ± 0,191 0,61 ± 0,466 ‐
22.633 Z‐Tricoseno ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ 0,18 ± 0,099
22.834 Z‐Tricoseno ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ 0,17 ± 0,183
23.426 Tricosano 8,93 ± 2,774 6,96 ± 3,40 12,53 ± 8,44 11,1 ± 2,506 6,37 ± 3,713 3,96 ± 2,267
26.100 Tetracosano ‐ 0,36 ± 0,223 0,10 ± 0,193 0,31 ± 0,078 ‐ 0,17 ± 0,067
27.811 Z‐Pentacoseno ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ 0,27 ± 0,182
27.943 Z‐Pentacoseno 0,87 ± 0,402 0,47 ± 0,226 1,60 ± 2,358 1,00 ± 0,425 0,72 ± 0,53 0,61 ± 0,323
28.150 Z‐Pentacoseno 1,47 ± 0,426 1,06 ± 0,391 ‐ 0,83 ± 0,486 1,17 ± 0,578 0,78 ± 0,926
28.693 Pentacosano 10,9 ± 2,247 8,94 ± 2,246 12,5 ± 2,20 13,36 ± 2,17 9,74 ± 2,74 10,7 ± 4,504
29.266 ? ‐ ‐ ‐ 0,31 ± 0,195 ‐ 0,10 ± 0,031
30.812 Hexacosano 0,56 ± 0,277 0,42 ± 0,166 0,35 ± 0,101 0,27 ± 0,086 1,39 ± 0,81 ‐
31.174 ? ‐ ‐ 0,43 ± 0,107 0,38 ± 0,212 ‐ 0,36 ± 0,198
32.417 ZZ‐Heptacosadieno ‐ ‐ ‐ ‐ 0,46 ± 0,08 0,48 ± 0,115
32.587 ZZ‐Heptacosadieno ‐ traços ‐ ‐ ‐ 0,24 ± 0,2
32.827 Z‐Heptacoseno ‐ 1,13 ± 2,365 0,58 ± 0,258 0,49 ± 0,141 ‐ 5,02 ± 3,691
32.900 Z‐Heptacoseno ‐ ‐ ‐ 0,66 ± 0,318 ‐ ‐
32.962 Z‐Heptacoseno 29,25 ± 0,22 23,4 ± 8,184 33,04 ± 9,22 35,61± 6,01 18,86 ± 16,1 11,1 ± 7,379
33.159 Z‐Heptacoseno 1,10 ± 0,824 1,11 ± 0,432 0,59 ± 0,244 0,47 ± 0,200 10,58 ± 12,5 0,92 ± 1,079
33.636 Heptacosano 10,76 ± 3,44 13,11 ± 5,84 11,26 ± 7,02 10,53 ± 4,28 13,4 ± 5,75 16,47 ± 3,96
34.364 Metil Heptacosano ‐ 1,37 ± 1,105 ‐ ‐ ‐ 0,24 ± 0,199
34.756 Metil Heptacosano ‐ traços ‐ ‐ ‐ 0,19 ± 0,129
35.674 Octacosano 0,63 ± 0,149 1,03 ± 0,792 0,53 ± 0,192 0,50 ± 0,215 1,51 ± 0,826 0,25 ± 0,141
36.875 ZZ‐Nonacosadieno ‐ 0,61 ± 0,366 ‐ ‐ ‐ 0,77 ± 0,53
37.035 ZZ‐Nonacosadieno ‐ 0,57 ± 0,301 ‐ ‐ traços 0,55 ± 0,215
37.184 ZZ‐Nonacosadieno ‐ traços 0,34 ± 0,091 ‐ traços 0,51 ± 0,342
37.437 Z‐Nonacoseno 0,93 ± 0,409 traços traços 0,77 ± 0,114 traços 3,49 ± 2,22
37.470 Z‐Nonacoseno ‐ traços 0,48 ± 0,125 0,78 ± 0,205 traços 5,81 ± 3,694
37.532 Z‐Nonacoseno 19,2 ± 2,27 16,63 ± 4,24 15,6 ± 3,491 16,45 ± 2,61 15,5 ± 7,525 10,32 ± 7,67
37.761 Z‐Nonacoseno 1,06 ± 0,423 1,59 ± 0,952 0,95 ± 0,795 ‐ 9,22 ± 7,56 2,34 ± 2,38
37.859 Z‐Nonacoseno ‐ traços 1,06 ± 0,459 ‐ 1,43 ± 0,08 2,04 ± 2,23
38.251 Nonacosano 4,93 ± 3,613 6,25 ± 3,824 4,81 ± 4,503 1,66 ± 1,307 6,94 ± 4,67 7,89 ± 9,027
38.901 Metil Nonacosano ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ 0,30 ± 0,197
41.275 ZZ‐Hentriacontadieno ‐ 4,395 ± 5,36 ‐ ‐ traços 0,69 ± 0,437
41.499 ZZ‐Hentriacontadieno ‐ traços ‐ ‐ ‐ 1,10 ± 0,609
41.508 ZZ‐Hentriacontadieno traços traços traços ‐ ‐ 0,61 ± 0,396
41.570 ZZ‐Hentriacontadieno traços traços 1,09 ± 0,306 0,91 ± 1,316 ‐ 0,41 ± 0,493
41.840 Z‐Hentriaconteno 8,25 ± 1,355 8,47 ± 3,064 5,88±1,815 4,42 ± 1,318 traços 6,94 ± 3,913
26
TR Hidrocarboneto Re Col 1 (N=10)
2 dias Col 1 (N=20)
2 dias Col 2 (N=15)
2 dias Col 3 (N=15)
Refugiadas Col 2 (N=7)
Agredidas Col 1 (N=14)
42.010 Z‐Hentriaconteno traços 2,15 ± 2,048 0,19 ± 0,272 ‐ traços 3,44 ± 2,05
42.020 Z‐Hentriaconteno ‐ ‐ ‐ ‐ 3,61 ± 5,15 4,49 ± 2,047
42.166 Z‐Hentriaconteno ‐ ‐ ‐ ‐ 7,51 ± 1,89 1,07 ± 0,445
42.256 Z‐Hentriaconteno ‐ ‐ ‐ ‐ traços 1,11 ± 0,974
42.592 Hentriacontano 4,61 ± 1,875 2,95 ± 2,586 3,62±1,539 0,72 ± 0,720 4,17 ± 1,97 1,76 ± 1,813
43.568 ? ‐ 1,36 ± 1,275 ‐ ‐ ‐ 1,43 ± 4,082
43.935 ? ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ 0,26 ± 0,295
45.714 ZZ‐Tritriacontadieno ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ 0,4 ± 0,312
45.858 ZZ‐Tritriacontadieno ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ 0,26 ± 0,183
46.342 Z‐Tritriaconteno ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ 1,47 ± 1,47
46.601 ? ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ 0,43 ± 0,317
47.317 ? ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ 0,31 ± 0,18
A figura 5 e a tabela 11 ilustram os resultados das análises discriminante e
canônica realizada entre rainhas virgens com 2 dias de idade.
Raiz 1 vs. Raiz 2
-10 -5 0 5 10 15
Raiz 1
-10
-8
-6
-4
-2
0
2
4
Rai
z 2
col 1 col 2 col 3
Figura 5: Resultado da análise canônica entre rainhas virgens com dois dias de idade, de 3 colônias diferentes, a partir dos hidrocarbonetos presentes na cutícula. Colônia 1 (N=20) e 2 (N=15), proveniente de Cunha-SP; Colônia 3 (N=15), proveniente de Itanhaém- SP.
27
Tabela 11: Resultado da análise discriminante aplicada para os compostos químicos cuticulares de rainhas virgens com dois dias de idade de 3 colônias.
Combinações Distância de Mahalanobis
F 5,29 P
Col 1 x Col 2 3,69754 4,780 < 0,001 Col 1 x Col 3 67,07308 46,663 < 0,001 Col 2 x Col 3 68,99964 42,802 < 0,001
Ainda, a análise discriminante stepwise dos compostos analisados separou
significativamente as rainhas virgens de uma mesma colônia de acordo com os 3 grupos
amostrais formados (Modelo Global: Wilk’s Lambda= 0,07779; F14,50= 9,2339; p < 0,001). Os
testes apontam valores de 100%, 92,31% e 88,89% de correta alocação dos indivíduos nos
grupos de rainhas virgens recém emergidas, com dois dias e agredidas, respectivamente.
Os compostos responsáveis por essa separação foram: tricosano, Z‐heptacoseno (TR
32.962), heptacoseno (TR 33.159), hentriacontano.
O Fator 1 da Análise dos Componentes Principais (PCA) descreveu 29,84% da
variação encontrada. A soma dos dois primeiros fatores (Fator 1 + Fator 2) descreveu
54,51% e dos três primeiros (Fator 1 + Fator 2 + Fator 3) descreveu 70,52% dessa variação. A
tabela 12 e a figura 6 ilustram os resultados da análise canônica para todas as combinações
entre diferentes idades das rainhas.
Tabela 12: Resultado da análise discriminante aplicada para os compostos químicos cuticulares de rainhas de diferentes idades.
Combinações Distância de Mahalanobis
F 7,25 P
RV re x RV 2 dias 60,86749 21,03715 < 0,001 RV re x RV agred 22,07219 8,32215 < 0,001
RV 2 dias x RV agred 14,53920 12,06017 < 0,001
Apesar das semelhanças entre a presença de compostos e das altas freqüências de
correta alocação encontradas para os grupos de rainhas virgens foram encontrados perfis
cuticulares com concentrações relativas muito diversas. Deste modo, o perfil individual das
rainhas virgens foi descrito nas tabelas 18, 19 e 20 (Apêndice).
28
Raiz 1 vs. Raiz 2
-6 -4 -2 0 2 4
Raiz 1
-2,5
-2,0
-1,5
-1,0
-0,5
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
Rai
z 2
RV recém emergidas RV agredidas RV com 2 dias
Figura 6: Resultado da análise canônica de 3 grupos de rainhas virgens de uma colônia de M. marginata (recém emergidas N=10, com dois dias de idade N=20 e agredidas N=14), a partir dos hidrocarbonetos presentes na cutícula.
Caracterização do padrão de desenvolvimento ovariano das rainhas virgens
quimicamente analisadas.
O resultado da caracterização do desenvolvimento ovariano das rainhas virgens
mostra não haver correlação entre a atratividade que resulta em comportamento agressivo
por parte das operárias. No grupo onde se observou essa atratividade a porcentagem de
indivíduos com desenvolvimento ovariano presente foi menor que aquele encontrado
naquelas com 2 dias (colônia 2), entretanto, não foi observado nenhum comportamento
agressivo por parte das operárias no último grupo. A tabela 13 mostra porcentagens de
rainhas virgens com ovário desenvolvido.
29
Tabela 13: Resultado da caracterização do padrão de desenvolvimento ovariano das rainhas virgens. Desenvolvimento
do ovário Recém
Emergidas 2 dias Col 1
2 dias Col 2
2 dias Col 3
Agrupadas em refugio
Agredidas
Ausente 10 20 2 14 7 11 Presente ‐ ‐ 13 ‐ ‐ 3 Total 10 20 15 14 7 14
3.3 Composição cuticular de rainhas fisogástricas.
Amostras em fibra de polidimetilsiloxano.
O resultado das análises da cutícula de rainhas fisogástricas revelou a presença de
uma grande variedade de hidrocarbonetos em relação ao que foi observado em rainhas
virgens (exceto rainhas virgens agredidas) e operárias da espécie. Estão presentes nesse
grupo compostos contendo de 25 até 33 carbonos, sob a forma de alcanos, alcenos,
alcadienos e alcanos ramificados (metil e dimetil alcanos).
Uma rainha fisogástrica foi analisada em três diferentes idades, sendo produzidos
três cromatogramas apresentados na figura 7 (Apêndice). Os picos foram identificados e
estão relacionados na tabela 13. Os perfis obtidos foram semelhantes entre as três idades
analisadas, exceto pela presença de alguns compostos na primeira análise, realizada no 6º
dia após o inicio da atividade de postura: tricosano, pentacoseno, octacoseno, octacosano, o
composto não identificado com tempo de retenção igual a 37,017 e o 9‐metil nonacoseno.
Todos esses compostos não foram encontrados nas rainhas fisogástricas com idades
desconhecidas analisadas e, quando presentes apresentaram baixas concentrações relativas
(tabela 14). O tricosano e o pentacoseno puderam ser observados no grupo de rainhas
virgens e em todos os grupos de operárias, e sua perda provavelmente não está relacionada
com a idade, mas com a fisogastria.
As nove rainhas com postura analisadas apresentaram concentrações relativas
variáveis para a grande maioria dos compostos, principalmente aqueles com as maiores
concentrações. As diferenças existentes entre as colônias referentes à origem da população,
como pôde ser observado para operárias e rainhas virgens, não favoreceram a análise
estatística das rainhas fisogástricas. Deste modo, os dados obtidos individualmente estão
expostos na tabela 15. Os resultados mostram que existe grande semelhança entre as rainhas
30
sucessoras de uma mesma colônia (colônias 1, 2 e 5), principalmente, quanto à ausência de
compostos.
Tabela 14: Concentrações dos hidrocarbonetos encontrados no abdômen de uma rainha fisogástrica após 6, 32 e 65 do início da postura. Dp-Desvio padrão Tempo de Retenção Hidrocarboneto 6 dias 32 dias 65 dias
1 23,665 Tricosano 2,80 ‐ -
2 28,212 Z‐Pentacoseno 0,62 0,20 -
3 29,013 Pentacosano 4,60 4,25 7,04 4 29,842 11,13‐Dimetil pentacosano 1,03 1,18 1,25 5 30,242 5‐Metil pentacosano 1,26 1,58 1,55 6 31,123 ? 1,27 1,37 1,05 7 33,309 Z‐Heptacoseno 1,06 1,36 1,66 8 33,961 Heptacosano 4,53 4,34 8,68 9 34,716 11‐Metil heptacosano
13‐Metil heptacosano 2,30 3,16 3,22
10 34,792 9‐Metil heptacosano 1,12 1,29 1,41 11 35,110 5‐Metil‐heptacosano 0,56 0,72 0,56 12 35,855 3,13‐Dimetil heptacosano
3,11‐Dimetil heptacosano 3,9‐ Dimetil heptacosano 3,7‐Dimetil heptacosano 5,13‐Dimetil heptacosano
4,33 4,82 4,33
13 36,041 Z‐Octacoseno 0,13 0,16 -
14 36,418 Octacosano 0,39 0,22 -
15 37,017 ? 0,15 0,23 -
16 37,243 ZZ‐Nonacosadieno 0,33 0,42 0,35 17 37,363 ZZ‐Nonacosadieno 1,89 2,32 2,29 18 37,529 ZZ‐Nonacosadieno 5,80 7,14 7,61 19 37,808 Z‐Nonacoseno 1,15 1,42 1,48 20 38,033 Z‐Nonacoseno 11,25 12,35 11,74 21 38,593 Nonacosano 0,59 0,46 0,94 22 39,263 11‐Metil nonacosano
13‐Metil nonacosano 15‐Metil nonacosano
6,34 6,78 6,62
23 39,477 9‐Metil nonacosano 0,18 0,17 ‐ 24 39,811 9,13‐Dimetil nonacosano
11,15‐Dimetil nonacosano 13,17‐Dimetil nonacosano
1,08 0,85 0,54
25 40,269 ? 0,32 0,36 ‐ 26 41,430 3‐Metil nonacosano 0,67 0,56 0,33 27 41,744 ZZ‐Hentriacontadieno 5,22 5,60 5,17 28 41,863 ZZ‐Hentriacontadieno 8,33 8,48 8,26 29 42,012 ZZ‐Hentriacontadieno 2,65 2,68 2,20 30 42,215 Z‐Hentriaconteno 5,89 5,66 5,00 31 42,457 Z‐Hentriaconteno 11,61 9,90 9,19 32 43,542 13‐Metil‐hentriacontano
15‐Metil‐hentriacontano 9,25 8,78 7,54
33 44,068 13,17‐Dimetil hentriacontano 1,01 0,93 ‐
31
Os compostos com concentrações relativas mais representativas encontrados em
rainhas com postura foram: pentacosano, heptacosano, ZZ‐nonacosadieno ‐ TR 37,603
(exceto Rainha 4), Z‐nonacoseno ‐ TR 38,089 (exceto Rainha 1), as três diferentes formas do
ZZ‐hentriacontadieno, as três formas do Z‐hentriaconteno, e a somatória dos compostos
dimetil‐heptacosano, metil‐nonacosano e metil‐hentriacontano, cujas concentrações
encontradas apresentaram um pico cromatográfico único.
Duas das rainhas puderam ser analisadas em condições de ausência de postura,
fato observado simultaneamente em quase todas as colônias de M. marginata do laboratório.
As rainhas diminuíram gradativamente a freqüência de oviposição, e células construídas e
aprovisionadas eram desfeitas pelas operárias até o momento de ausência total de postura.
As rainhas eram alimentadas normalmente, entretanto deixaram de permanecer próximas à
região do favo e passaram a caminhar por toda a colônia, inclusive sob potes de alimento.
Todas as rainhas retomaram a atividade de postura após períodos que variaram de 26 a 59
dias. O perfil químico da rainha da colônia 5 pôde ser refeito após o reinício da postura. A
colônia 6 ficou órfã após 68 dias do reinício, não sendo possível a análise dessa rainha.
As concentrações apresentadas por essas rainhas antes e durante esse período foram
significativas, segundo teste de análise de variância entre os compostos, sendo p<0,05 e
p<0,001 para as rainhas das colônias 5 e 6, respectivamente. Os cromatogramas da rainha da
colônia 5 foram reproduzidos na figura 8 (Apêndice).
Os compostos que aumentaram suas concentrações relativas na ausência da postura
foram: nonacosadieno (TR 37,603) e Z‐hentriaconteno (TR 42,525). Aqueles que diminuíram
foram: heptacosano, os dimetil‐heptacosano (tempo de retenção único), ZZ‐nonacosadieno
(TR 37,411), ZZ‐hentriacontadieno (TR 41,838) e Z‐hentriaconteno (tempo de retenção
42,291). A maioria dos compostos manteve a concentração relativa e alguns compostos se
comportaram de maneira diferenciada em cada rainha de acordo com sua condição de
postura.
32
Tabela 15: Concentração relativa individual (%) dos hidrocarbonetos cuticulares encontrados no abdômen de rainhas fisogástricas de 6 colônias de Melipona marginata com atividade normal de postura. Col- colônia, RF- rainha fisogástrica RF* referem-se às rainhas sucessoras das colônias 1, 2 e 5. Dp- desvio padrão TR Hidrocarboneto RF
Col 1 RF* Col 1
RF Col 2
RF* Col 2
RF Col 3
RF Col 4
RF Col 5
RF* Col 5
RF Col 6
Média e d.p.
29,066 Pentacosano 3,71 6,45 9,31 5,18 3,95 7,51 6,89 7,04 4,66 5,96 ± 1,931 29,875 11,13 Dimetil pentacosano ‐ 0,95 1,78 1,10 1,00 0,46 1,55 1,25 1,30 1,16 ± 0,431 30,273 5 Metil pentacosano 1,13 1,35 2,32 1,09 1,08 1,25 1,32 1,55 1,68 1,40 ± 0,418 31,157 ? ‐ 0,51 0,46 1,15 1,63 ‐ 0,98 1,05 2,02 1,12 ± 0,614 33,200 Z‐Heptacoseno 0,86 0,18 ‐ 0,14 0,73 0,24 ‐ ‐ 0,54 0,45 ± 0,306 33,346 Z‐Heptacoseno 0,85 1,77 1,17 1,03 1,06 2,34 1,65 1,66 1,26 1,39± 0,495 34,017 Heptacosano 6,25 10,88 8,77 6,38 2,57 10,68 5,37 8,68 5,71 7,08 ± 2,843 34,761 11‐Metil heptacosano
13‐Metil heptacosano 2,06 1,25 ‐ 3,06 ‐ ‐ 2,94 3,22 3,15 2,49 ± 0,820
34,842 9‐Metil heptacosano 0,47 0,50 3,29 1,14 ‐ 3,01 1,29 1,41 1,55 1,61 ± 1,127 34,940 7‐Metil heptacosano ‐ ‐ 1,86 ‐ ‐ 0,13 ‐ ‐ ‐ 0,99 ± 1,225 35,145 5‐Metil heptacosano 1,51 1,16 1,26 0,94 0,70 1,64 0,87 0,56 0,81 1,11 ± 0,340 35,918 3,13‐Dimetil lheptacosano
3,11‐Dimetil heptacosano 3,9‐Dimetil heptacosano 3,7‐Dimetil heptacosano 5,13‐Dimetil heptacosano
4,33 4,56 2,89 6,03 4,41 4,44 6,78 4,33 5,23 4,83 ± 1,182
36,460 ? ‐ ‐ ‐ 0,86 0,40 ‐ ‐ ‐ 0,78 0,68 ± 0,246 37,275 ZZ‐Nonacosadieno ‐ ‐ ‐ 0,60 ‐ ‐ 0,61 0,35 0,72 0,64 ± 0,066 37,411 ZZ‐Nonacosadieno 0,49 0,30 2,10 2,10 0,31 0,29 2,24 2,29 6,15 1,75 ± 1,991 37,603 ZZ‐Nonacosadieno 2,99 2,77 6,49 4,91 2,67 0,78 6,09 7,61 1,85 3,57 ± 2,043 37,842 Z‐Nonacoseno 1,07 1,48 1,73 1,52 1,28 1,29 3,22 1,48 1,58 1,64 ± 0,669 38,089 Z‐Nonacoseno 1,37 6,11 7,66 5,10 4,12 5,41 4,19 11,74 7,81 5,22 ± 2,092 38,175 Z‐Nonacoseno 10,73 10,78 0,94 0,47 0,65 ‐ 0,36 ‐ ‐ 3,99 ± 5,245 38,300 Z‐Nonacoseno 6,14 2,95 0,55 ‐ 8,28 0,41 ‐ ‐ ‐ 3,67 ± 3,473 38,650 Nonacosano 1,27 ‐ 0,79 0,51 0,61 1,29 ‐ 0,94 0,85 0,89 ± 0,328
33
TR Hidrocarboneto RF Col 1
RF* Col 1
RF Col 2
RF* Col 2
RF Col 3
RF Col 4
RF Col 5
RF* Col 5
RF Col 6
Média e d.p.
39,316 11‐Metil nonacosano 13‐Metil nonacosano 15‐Metil nonacosano
9,15 4,34 6,39 5,07 3,94 4,18 4,54 6,62 7,79 5,67 ± 1,918
39,400 9 Metil‐nonacosano 0,20 0,16 ‐ 0,20 0,13 0,49 ‐ ‐ 2,00 0,53 ± 0,734 39,858 9,13 Dimetil‐nonacosano
11,15 Dimetil‐nonacosano 13,17 Dimetil‐nonacosano
‐ ‐ 1,25 0,34 0,29 0,27 0,54 0,71 0,57 ± 0,42
40,142 ? ‐ ‐ ‐ ‐ 0,20 0,37 ‐ ‐ 0,72 0,43 ± 0,262 40,367 3 Metil‐nonacosano 1,37 1,96 ‐ 0,15 0,65 2,25 ‐ 0,33 0,59 1,16 ± 0,83 41,838 ZZ‐Hentriacontadieno 1,93 1,12 6,85 12,38 3,07 3,97 12,85 5,17 6,73 6,11 ± 4,5 41,983 ZZ‐Hentriacontadieno 8,98 5,76 7,75 11,71 12,25 12,40 12,59 8,26 7,03 9,81 ± 2,755 42,096 ZZ‐Hentriacontadieno 4,97 3,96 2,00 2,65 7,25 6,21 2,82 2,20 2,20 4,01 ± 1,96 42,291 Z‐Hentriaconteno 1,86 3,43 7,36 8,96 5,27 4,06 8,47 5,00 6,65 5,76 ± 2,527 42,525 Z Hentriaconteno 16,73 13,49 7,20 5,03 15,05 15,68 5,28 9,19 6,88 10,7 ± 5,018 42,667 Z Hentriaconteno 1,47 2,54 ‐ ‐ 2,27 ‐ ‐ ‐ ‐ 2,09 ± 0,556 43,615 13 Metil‐hentriacontano
15 Metil‐hentriacontano 7,65 8,80 9,09 7,69 12,14 8,03 6,82 7,54 9,38 8,70 ± 1,63
44,108 13, 17 Dimetil‐hentriacontano 0,46 0,50 ‐ 1,61 1,98 0,92 ‐ ‐ 1,67 1,19 ± 0,65
34
Tabela 16: Concentrações dos hidrocarbonetos encontrados no abdômen de duas rainhas fisogástricas (colônias 5 e 6) durante a presença e ausência de atividade de postura. RCP- rainha com postura, RSP- rainha sem postura, RCP- rainha após a retomada da postura TR Hidrocarboneto RCP
Colônia 5 RSP
Colônia 5 RCP*
Colônia 5 RCP
Colônia 6 RSP
Colônia 6 1 29,066 Pentacosano 6,89 4,89 5,04 4,66 4,30
2 29,875 11,13 Dimetil pentacosano 1,55 1,10 1,09 1,30 1,20
3 30,273 5 Metil pentacosano 1,32 1,34 1,68 1,68 1,60
4 31,157 ? 0,98 1,35 0,28 2,02 1,39
5 33,200 Z‐Heptacoseno ‐ 0,23 0,77 0,54 0,14
6 33,346 Z‐Heptacoseno 1,65 1,13 1,47 1,26 1,38
7 33,400 Z‐Heptacoseno ‐ ‐ 1,05 ‐ ‐
8 34,017 Heptacosano 5,37 4,82 4,36 5,71 4,40
9 34,761 11‐Metil heptacosano 13‐Metil heptacosano
2,94 2,44 1,31 3,15 3,20
10 34,842 9‐Metil heptacosano 1,29 1,19 0,90 1,55 1,31
11 35,145 5‐Metil heptacosano 0,87 0,59 1,20 0,81 0,73
12 35,918 3,13‐Dimetil lheptacosano 3,11‐Dimetil heptacosano 3,9‐Dimetil heptacosano 3,7‐Dimetil heptacosano 5,13‐Dimetil heptacosano
6,78 4,60 3,19 5,23 4,88
13 36,460 ? ‐ 0,42 0,17 0,78 0,22
14 37,275 ZZ‐Nonacosadieno 0,61 ‐ 0,44 0,72 0,42
15 37,411 ZZ‐Nonacosadieno 2,24 0,35 2,37 6,15 2,35
16 37,603 ZZ‐Nonacosadieno 6,09 6,17 1,64 1,85 7,23
17 37,842 Z‐Nonacoseno 3,22 1,23 2,83 1,58 1,43
18 38,089 Z‐Nonacoseno 4,19 11,96 0,69 7,81 12,51
19 38,175 Z‐Nonacoseno 0,36 ‐ 1,02 ‐ ‐
20 38,300 Z‐Nonacoseno ‐ ‐ 8,72 ‐ ‐
21 38,420 Z‐Nonacoseno ‐ ‐ 0,67
22 38,650 Nonacosano ‐ 0,63 0,72 0,85 0,47
23 39,316 11‐Metil nonacosano 13‐Metil nonacosano 15‐Metil nonacosano
4,54 6,74 4,89 7,79 6,87
24 39,400 9 Metil‐nonacosano ‐ 0,29 0,22 2,00 0,17
25 39,858 9,13 Dimetil‐nonacosano 11,15 Dimetil‐nonacosano 13,17 Dimetil‐nonacosano
0,27 1,15 0,41 0,71 0,86
26 40,142 ? ‐ 0,34 1,05 0,72 ‐
27 40,367 3 Metil‐nonacosano ‐ 0,28 1,48 0,59 0,36
28 41,838 ZZ‐Hentriacontadieno 12,85 5,55 9,93 6,73 5,67
29 41,983 ZZ‐Hentriacontadieno 12,59 8,85 6,02 7,03 8,59
30 42,096 ZZ‐Hentriacontadieno 2,82 2,82 5,83 2,20 2,72
31 42,291 Z‐Hentriaconteno 8,47 6,28 11,84 6,65 5,73
32 42,525 Z Hentriaconteno 5,28 12,34 2,21 6,88 10,02
33 42,667 Z Hentriaconteno ‐ ‐ 1,09 ‐ ‐
34 43,000 ? traços traços 0,28 ‐ ‐
35 43,215 ? traços traços traços ‐ ‐
36 43,615 13 Metil‐hentriacontano 15 Metil‐hentriacontano
6,82 9,84 12,96 9,38 8,89
37 44,108 13, 17 Dimetil‐hentriacontano ‐ 1,07 1,20 1,67 0,95
35
Amostras em hexano
Os compostos cuticulares encontrados em rainhas fisogástricas foram os mesmos
tanto com o uso de fibra de fibra de polidimetilsiloxano, quanto com o solvente apolar
hexano. Os resultados mostram, entretanto, que as concentrações variam de acordo com a
técnica utilizada, sendo o alcano e os alcenos do C23 (tricosano e tricoseno) somente
encontrados na amostra em hexano. Alguns compostos apresentaram concentrações
relativas maiores na amostra em hexano como o pentacosano e o heptacosano (Rainha 2).
Outros apresentaram concentrações menores quando extraídas com solvente como os
alcanos ramificados (mono e metil alcanos). Os alcenos e alcadienos comportaram‐se de
maneira variada de acordo com a técnica utilizada (tabela 17).
Tabela 17: Concentrações relativas de hidrocarbonetos cuticulares de 2 rainhas (R1 e R2) analisadas com fibra de polidimetilsiloxano e posteriormente com solvente hexano. TR Hidrocarboneto R1 fibra R1 hexano R2 fibra R2 hexano
23,048 Tricoseno ‐ 1,44 ‐ ‐ 23,275 Tricoseno ‐ 1,35 ‐ ‐ 23,665 Tricosano ‐ 0,18 ‐ 0,29 29,066 Pentacosano 5,04 27,04 6,45 15,33 29,875 11,13 Dimetil pentacosano 1,09 0,82 0,95 0,08 30,273 5 Metil pentacosano 1,68 1,41 1,35 0,90 31,157 ? 0,28 0,63 0,51 ‐ 33,200 Z‐Heptacoseno 0,77 0,38 0,18 ‐ 33,346 Z‐Heptacoseno 1,47 1,12 1,77 ‐ 34,017 Heptacosano 1,05 0,91 10,88 25,46 34,761 11‐Metil heptacosano
13‐Metil heptacosano 4,36 0,61 1,25 1,35
34,842 9‐Metil heptacosano 1,31 1,08 0,50 0,87
34,94 7‐Metil heptacosano 0,90 0,46 ‐ ‐
35,145 5‐Metil heptacosano 1,2 1,62 1,16 0,61 35,918 3,13‐Dimetil lheptacosano
3,11‐Dimetil heptacosano 3,9‐Dimetil heptacosano 3,7‐Dimetil heptacosano 5,13‐Dimetil heptacosano
3,19 1,94 4,56 1,45
36,460 ? 0,17 0,56 ‐ 0,34 37,275 ZZ‐Nonacosadieno 0,44 1,10 ‐ ‐
37,411 ZZ‐Nonacosadieno 2,37 1,22 0,30 0,50
37,603 ZZ‐Nonacosadieno 1,64 0,98 2,77 1,71
37,842 Z‐Nonacoseno 2,83 1,32 1,48 4,19
38,089 Z‐Nonacoseno 0,69 0,83 6,11 2,10
38,175 Z‐Nonacoseno 1,02 ‐ 10,78 4,01
38,300 Z‐Nonacoseno 8,72 7,43 2,95 0,78
38,420 Z‐Nonacoseno 0,67 ‐ ‐ ‐
38,650 Nonacosano 0,72 7,71 ‐ 3,62
36
TR Hidrocarboneto R1 fibra R1 hexano R2 fibra R2 hexano
39,316 11‐Metil nonacosano 13‐Metil nonacosano 15‐Metil nonacosano
4,89 3,12 4,34 3,25
39,400 9 Metil‐nonacosano 0,22 0,17 0,16 0,16
39,858 9,13 Dimetil‐nonacosano 11,15 Dimetil‐nonacosano 13,17 Dimetil‐nonacosano
0,41 ‐ ‐ ‐
40,142 ? 1,05 0,45 ‐ 0,25
40,367 3 Metil‐nonacosano 1,48 0,64 1,96 0,74
41,838 ZZ‐Hentriacontadieno 9,93 4,40 1,12 6,18
41,983 ZZ‐Hentriacontadieno 6,02 3,17 5,76 6,03
42,096 ZZ‐Hentriacontadieno 5,83 3,90 3,96 1,63
42,291 Z‐Hentriaconteno 11,84 7,34 3,43 6,04
42,525 Z Hentriaconteno 2,21 1,71 13,49 5,09
42,667 Z Hentriaconteno 1,09 6,09 2,54 1,71
43,000 ? 0,28 ‐ ‐ ‐
43,215 ? traços ‐ ‐ ‐
43,615 13 Metil‐hentriacontano 15 Metil‐hentriacontano
12,21 6,91 8,80 4,98
44,108 13,17 Dimetil‐hentriacontano 1,20 ‐ 0,50 0,34
37
4‐DISCUSSÃO E CONCLUSÕES
Os resultados obtidos mostram que a cutícula de operárias, rainhas virgens e
rainhas da espécie Melipona marginata é constituída por hidrocarbonetos de cadeia variando
entre C21 e C33, geralmente apresentando número ímpar de átomos de carbono. Foram
caracterizados alcanos, alcenos, alcadienos, metil e dimetil alcanos, sendo os compostos
mais freqüentes aqueles com número ímpar de carbonos. As análises químicas não foram
restritivas aos hidrocarbonetos, entretanto outros compostos como ésteres e álcoois
encontrados em operárias de outras espécies de meliponíneos (Frieseomelitta varia e
Lestrimelitta limao ‐Nunes et al 2008) não foram observados.
Entre as três colônias analisadas houve semelhanças quanto à composição cuticular
de operárias. Foram encontrados hidrocarbonetos variando entre 21 e 31 carbonos. O perfil
químico foi caracterizado principalmente por alcanos, alcenos e alcadienos, sendo que em
nenhuma das idades analisadas observou‐se a presença de alcanos ramificados, como
observado por Abdalla et al. (2003) em operárias da espécie Melipona bicolor.
As análises discriminantes mostram que as operárias recém emergidas são, quanto à
composição cuticular, aquelas que mais se distanciam dos outros grupos, havendo muito
mais semelhanças entre operárias com atividade no favo de cria e operárias campeiras
(tabelas 2, 4 e 6). Esses resultados estão de acordo com o proposto por Breed et al. (1995,
2004) da existência de um perfil cuticular que é fortemente influenciado pelo meio,
principalmente pela cera. Entretanto, o perfil cuticular das operárias recém emergidas
apresentou uma diversidade de hidrocarbonetos tão rica quanto o das operárias do favo e
campeiras, e a maioria das modificações nesse perfil ocorreram, portanto, nas concentrações
relativas desses compostos. Operárias da espécie Frieseomelitta varia apresentam somente
quatro alcanos em concentrações significantes na ocasião da emergência enquanto as mais
velhas possuem cerca de 40 compostos entre hidrocarbonetos (alcanos saturados e
insaturados, alcenos, um alcino e alcadienos), e alguns álcoois e ácidos Nunes (2008).
Todos os resultados observados mostram que o perfil de hidrocarbonetos de
operárias varia de acordo com a atividade que elas desempenham na colônia (figura 4) e,
como em abelhas sociais as atividades no ninho estão fortemente relacionadas com a idade
podemos relacionar cada atividade desempenhada a uma faixa etária. Observa‐se que
alguns compostos estão presentes somente em um ou dois grupos de operárias, o que
38
sugere que o contato com compostos como cera, feromônios de rainha e alimento possam
estar atuando diferentemente de acordo com a proximidade dos indivíduos com estes.
As operárias apresentaram variação em relação à origem das colônias. As colônias 1
e 2 apresentaram‐se, segundo o perfil de hidrocarbonetos cuticulares, mais próximas entre
si do que em relação à colônia 3, exceto para o grupo de operárias do favo. Um dos motivos
que pode ter promovido a divergência entre os perfis de hidrocarbonetos de operárias do
favo pode ser a maior exposição desses indivíduos aos compostos da colônia. Os indivíduos
se desenvolvem dentro de células fechadas, sem contato com o meio externo até a
emergência. Já as campeiras são mais susceptíveis a perdas de compostos por volatilização
quando forrageiam, além de estarem em contato com os mesmos recursos.
O fato de operárias das colônias 1 e 2 (Cunha‐SP) serem muito próximas e ambas
divergirem da colônia 3 (Itanhaém‐SP) quanto a composição de hidrocarbonetos cuticulares
pode ser explicado pela influência de ‘odores hereditários’. Apesar dos indivíduos terem
sido coletados tempos depois da chegada das colônias no laboratório, ou seja, os fatores
ambientais atuantes eram idênticos, não houve convergência do perfil químico dos
indivíduos.
As operárias coletadas durante a postura de ovos que originaram machos (colônia
1) apresentaram um perfil de hidrocarbonetos muito diferenciado em relação aquelas com
postura de ovo trófico da mesma colônia. A ausência da rainha pode ter sido o fator
causador dessa diferença, sendo que os compostos desta são constantemente espalhados
pela colônia pela movimentação ativa das operárias (Seeley, 1979). Outro fator ser a
ocorrência de uma diferenciação na fisiologia dessas operárias, uma vez que compostos
encontrados em suas cutículas não foram encontrados em rainhas fisogástricas, como o
hexacosano, o octacosano e o hentriacontano. Além disso, compostos como os encontrados
na cutícula de rainhas como Z‐heptacoseno, heptacosano, ZZ‐nonacosadieno e Z‐
nonacoseno tiveram suas concentrações aumentadas consideravelmente, indicando que não
foram adquiridos por contato com a rainha (tabela 1).
Entre os insetos sociais, os compostos de rainha são considerados, direta ou
indiretamente, os responsáveis pela dominância reprodutiva desses indivíduos (revisado
por Keller e Nonacs, 1993) e promoverem a inibição da reprodução de operárias. A ausência
desses compostos poderia iniciar um comportamento de ‘disputa’ pela reprodução, fato que
foi observado durante a coleta dessas operárias. As possíveis modificações fisiológicas
39
decorrentes desse comportamento associadas à ausência de compostos da rainha agregados
à cutícula podem explicar o perfil químico encontrado nessas operárias.
Os resultados obtidos entre as rainhas virgens mostram que, assim como em
operárias, as recém emergidas têm seus perfis cuticulares modificados ao longo dos dias. As
rainhas com dois dias de vida apresentaram perfis muito semelhantes aos das recém
emergidas provavelmente porque a produção de compostos atrativos deva iniciar‐se após
esse período. Durante esse estudo verificou‐se que, em colônias órfãs de Melipona marginata,
rainhas virgens permaneciam no ninho até 7 dias após a emergência (foram marcadas 10
rainhas recém emergidas e 3 delas foram vistas até o 8º dia).
Os resultados também comprovam que as rainhas virgens das colônias 1 e 2, assim
como as operárias recém emergidas e campeiras dessas colônias, possuem perfil de
hidrocarbonetos cuticulares muito semelhantes entre si, e ambas consideravelmente
distantes entre as rainhas virgens da colônia 3 (figura 5).
As rainhas virgens agredidas foram aquelas que apresentaram mais picos
cromatográficos em relação aos outros grupos de rainhas, inclusive às rainhas fisogástricas.
Segundo Koedam et al. (1995b) os feromônios produzidos nas glândulas abdominais seriam
liberados durante no momento em que essas rainhas inflam seus abdomens, sendo que este
comportamento desempenharia um importante papel na aceitação pelas operárias.
O perfil químico das rainhas virgens agredidas parece corresponder ao pico de
atratividade desses indivíduos, embora não se tenha verificado quais fatores dão início a
esse comportamento (a idade ou mesmo a agressão de operárias). As rainhas virgens que
foram coletadas no refúgio não apresentaram perfil semelhante ao das agredidas, sugerindo
que essa possa ser somente uma forma de evitar o contato com operárias. Não se sabe ainda
como as operárias se comportam diante da variedade de perfis cuticulares encontrados
entre as rainhas virgens (tabelas 18, 19, 20, 21, 22 e 23 – Apêndice), entretanto, fica evidente
a presença de certos compostos (principalmente alcenos e alcadienos com 29, 31 e 33 átomos
de carbono) somente nas rainhas que foram coletadas no momento em eram agredidas pelas
operárias (tabela 10).
A caracterização do desenvolvimento ovariano das rainhas virgens mostrou não
haver relação deste com a atratividade das rainhas agredidas. É provável que a retirada do
favo da colônia tenha influenciado nesse desenvolvimento por conseqüente diminuição dos
40
compostos da rainha, mas esse fato foi observado somente em uma das três colônias
analisadas.
Embora as operárias estejam susceptíveis a aquisição de compostos provenientes do
meio, a rainha fisogástrica analisada não apresentou modificação do perfil, ao menos até o
segundo mês após o início da postura. A ausência de variação do perfil de hidrocarboneto
em relação à idade da rainha fisogástrica observada pode ser em decorrência da
metodologia empregada para essa análise. Somente amostras dos compostos abdominais da
rainha foram coletadas, e por ser o abdômen local de grande secreção glandular em rainhas
fisogástricas (Mota 1988) certamente outros compostos não foram adsorvidos pela fibra, ou
foram em pequenas concentrações. Alguns compostos (tricosano, Z‐pentacoseno,
octacosano) presentes em rainhas virgens foram encontrados na rainha com 6 dias após o
início da postura, indicando a transição do perfil para rainha fisogástrica (tabela 14). Esses
compostos não foram encontrados em nenhuma outra rainha fisogástrica.
Os compostos mais representativos quanto à variedade de suas formas foram os
alcenos e alcadienos, compostos também encontrados em outras rainhas de abelhas sem
ferrão como Melipona bicolor (Abdala et al 2003) e Frieseomelitta varia (Nunes 2008). Também
estão presentes alcanos como pentacosano e heptacosano, mas a ocorrência alcanos
ramificados (metil e dimetil alcanos) foi característica do grupo.
Entre as rainhas observaram‐se diferenças no perfil de acordo com as condições de
postura das mesmas (tabela 16). Os fatores que promoveram essa ausência de postura não
foram identificados claramente (as colônias não apresentaram déficit de alimento e
populacional) e as operárias não excluíram nenhuma dessas rainhas mesmo no período de
ausência total de postura, apesar da emergência de várias rainhas virgens.
A fertilidade da rainha é um fator de extrema importância para a manutenção do
equilíbrio dinâmico da colônia em vespas e formigas (revisado por Howard 2004). Estudos
relativos à produtividade da rainha e mudanças no perfil em vespas e formigas
demonstram que rainhas indicam a queda da produtividade através dos compostos
cuticulares e são substituídas por novas rainhas (Peeters et al 1999, Cuvillier‐Hot et al 2004).
Entretanto, os resultados obtidos demonstram que as operárias da espécie M. marginata são
influenciadas pelo status da rainha bem mais do que sua produtividade.
41
Os perfis de rainhas obtidos com as duas diferentes técnicas de extração (SPME e
solvente) foram muito semelhantes quanto à presença dos compostos, mas as concentrações
encontradas variaram de acordo com a técnica.
Através dos resultados apresentados podemos concluir a importância dos
hidrocarbonetos cuticulares nos processos de reconhecimento entre castas e atividades nos
insetos sociais. As várias hipóteses apresentadas nessa discussão sugerem a necessidade de
mais estudos a respeito da atuação dos hidrocarbonetos como mediadores ou indicadores
de comportamento entre o grupo.
42
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Abdalla F. C.; Jones, G. R.; Morgan, D.; Cruz‐Landim, C. 2003. Comparative study of the
cuticular hydrocarbon composition of Melipona bicolor Lepeletier, 1836
(Hymenoptera, Meliponini) workers and queens. Genet. Mol. Res., 2: 191‐199.
Aitchison, J. 1986. The Statistical Analysis of Compositional Data. London: Chapman &
Hall.
Arnold, G., Quenet, B. & Masson, C. 2000. Influence of social environment on genetically
based subfamily signature in the honeybees. Journal of Chemical Ecology, 26: 2331‐2333.
Atkins, M. D. 1980. Introduction to insect behaviour. Macmillan Publi., New York.
Bego, L. R. 1989. Behavioral interactions among queens of the polygynic stingless bee
Melipona bicolor bicolor Lepeletier. Braz. J. Med. Biol. Res. 22: 587 – 596.
Blomquist, G. J.; Tillman, J. A.; Mpuru, S. and Seybold S. J. 1998. The cuticule and cuticular
hydrocarbons of insects: structure, function, and biochemistry. In: Pheromone
communication in social insect (Vander Meer RK, Breed MD, Winston ML and
Espelie KE, eds.). Westview Press, Boulder, 35‐54.
Breed, M. D. 1981. Individual recognition and learning of queen odors by worker
honeybees. Proc. not. Aead. Sci. U.S.A., 78: 2635‐2637.
Breed, M. D. 1983. Nestmate recognition in honeybees. Anim. Behav.31: 86– 91.
Breed, M. D. & Bennett, B. 1987. Kin recognition in highly eussocial insects. In: Fletcher,
D.J.C. & Michener, C.D. (eds.), Kin recognition in animals, John Wiley & Sons,
Chichester, 243‐285p.
Breed, M. D. e Stiller, T. M. 1992. Honey bees, Apis mellifera, nestmate discrimination:
hydrocarbon effects and the evolutionary implications of comb choice. Anim.
Behav., 43, 875–883.
Breed, M. D.; Garry, M. F.; Pearce, A. N.; Hibbard, B. E.; Bjostad, L. B. e Page, R. E., Jr. 1995.
The role of wax comb in honey bee nestmate recognition. Anim. Behav., 50: 489–496.
Breed, M. D.; Perry, S. e Bjostad, L. B. 2004. Testing the blank slate hypothesis: why honey
bee colonies accept young bees. Insectes Sociaux, 51: 12‐16.
Cruz‐Landim, C. 1967. Estudo comparativo de algumas glândulas das abelhas
(Hymenoptera, Apoidea) e Respectivas Implicações Evolutivas. Arq. Zool. São Paulo,
15: 177‐290.
Cruz‐Landim, C. da and M.H.V.B. Mota, 1990. Occurrence of tegumentary glands in
stingless bees (Hymenoptera: Apidae: Meliponinae). In: Social Insects and the
43
Environment (G.K. Veeresh, B. Mallik and C.A. Viraktamath, Eds.), Oxford and IBH
Publishing Co., Bombay, pp. 587–588.
Cuvillier‐Hot, V. V.; Cobb, M; Malosse, C.; Peeters, C. 2001. Sex, age and ovarian activity
affect cuticular hydrocarbons in Diacamma ceylonense, a queenless ant. J. Insect Physiol.
47: 485‐493.
Cuvillier‐Hot, V. V.; Lenoir, A.; Crewe, R.; Malosse, C.; Peeters, C. 2004. fertility signalling
and reproductive skew in queenless ants. Anim. Behav. 68: 1209 – 1219.
Dietemann V, Peeters C, Liebig J, Thivet V, 2003. Cuticular hydrocarbons mediate
discrimination of reproductives and nonreproductives in the ant Myrmecia gulosa.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100: 10341‐10346.
Engels, W. & Imperatriz‐Fonseca, V. L. 1990. Caste development, reproductive strategies,
and control of fertility in honey bees and stingless bees. In: Social Insects. An
Evolutionary Approach to Castes and Reproduction (Ed. by W. Engels), pp. 167—230.
Berlin: Springer Verlag
Gamboa, J. G.; Grudzien, T. A.; Espelie, K. E. e Bura, E. A. 1996. Kin recognition in social
wasps: combining chemical and behavioural evidence. Animal Behaviour, 51, 625‐629.
Hannonen, M., Sledge, M. F., Turillazzi, S., Sundström, L. 2002. Queen reproduction,
chemical sinalling and worker behaviour in polygyne colonies of the ant Formica fusca.
Anim. Behav. 64: 477 – 485.
Howard, R. W. & Blomquist, G. J. 1982. Chemical ecology and biochemistry of insect
hydrocarbons. Annual Review in Entomology, 27: 149—172.
Howard, R. W. & Blomquist, G. J. 2005. Ecological, behavioural, and biochemical aspects of
insect hydrocarbons. Annu. Rev. Entomol. 50, 371—393.
Imperatriz‐Fonseca, V. L. & Zucchi, R. 1995. Virgin queens in stingless bees (Apidae,
Meliponinae) colonies: a review. Apidologie, 26: 231—244.
Jungnickel H, da Costa AJS, Tentschert J, Patrício EFLRA, et al. (2004). Chemical basis for
inter‐colonial aggression in the stingless bee Scaptotrigona bipunctata (Hymenoptera:
Apidae). J. Insect Physiol. 50: 761‐766.
Keller, L. & Nonacs, P. 1993. The role of queen pheromones in social insects: queen control
or queen signal? Anim. Behav. 45: 787 – 794.
Kerr, W. E. 1948. Estudos sobre o gênero Melipona. An. Esc. Super. Agric. ʺLuiz de Queirozʺ,
5 : 182‐276.
Kerr, W. E. 1950. Genetic determination of castes in the genus Melipona. Genetics 35: 143‐152.
44
Kerr, W. E. & Nielsen, R. A. 1966. Evidences that genetically determined Melipona queens
can become workers. Genetics, 54: 859‐866.
Kleinert, A. de M. P. & Imperatriz‐Fonseca, V. L. 1994. Virgin queens refuges in colonies of
Melipona marginata (Apidae, Meliponinae). Revista Brasileira de Biologia 54: 247—251.
Koedam, D., Aguilar Monge, I. and M. J. Sommeijer, 1995a. Social interactions of gynes and
their longevity in queenright colonies of Melipona favosa (Apidae, Meliponinae). Neth.
J. Zool. 45: 480 ‐494.
Koedam, D.; T. Aarts and M. J. Sommeijer, 1995b. Queen acceptance in Melipona favosa
(Apidae: Meliponinae); morphological changes and behavioural development of
virgin queens. In: Behavioural and Physiological Implications of Queen Dominance in
Stingless Bees (D. Koedam). PhD‐Thesis Utrecht University, the Netherlands.
Drukkerij Elinkwijk BV, Utrecht, pp. 83–106.
Koedam, D.; Contrera, F. A. L.; Fidalgo, A. O.; Imperatriz‐Fonseca, V. L. 2005. How queen
and workers share in male production in the stingless bee Melipona subnitida Ducke
(Apidae,Meliponini). Insect. Soc. 52: 114–121.
Le Conte, Y.; Hefetz, A. 2008. Primer pheromones in social hymenoptera. Annu. Rev.
Entomol. 53: 523 – 542.
Liebig, J., Peeters, C., Oldham, N. J., Markstädter, C., Hölldobler, B. 2000. Are variations in
cuticular hydrocarbons of queens and workers a reliable signal of fertility in the ant
Harpegnathos saltator? Proc.Natl. Acad. Sci. USA. 97: 4124 – 4131.
Lockey, K. H. 1988. Lipids of the insect cuticle: origin, composition and function. Comp.
Biochem. Physiol., 89B: 595‐645p.
Lopez‐Vaamonde, C.; Brown, R. M.; Lucas, E. R.; Pereboom, J. J. M.; Jordan, W. C. 2007.
Effect of the queen on worker reproduction and new queen production in the bumble
bee Bombus terrestris. Apidologie 38: 171–180.
Mateus, S.; Alonso, J. D. S.; Zucchi, R. 2007. Polietismo etário de operárias de Melipona
marginata, participação no processo de aprovisionamento e postura (POP)
(Hymenoptera: Apidae: Meliponini). Caderno de resumos do XXV Encontro Anual de
Etologia. p. 240.
Michener, C.D. 1974. The social behavior of the bees. Cambridge; Harward University Press.
v.12, p.404.
Monnin T, Peeters C. 1999. Dominance hierarchy and reproductive conflicts among
subordinates in a monogynous queenless ant. Behav. Ecol. 10:23 – 32
45
Monnin, T. 2006. Chemical recognition of reproductive status in social insects. Ann. Zool.
Fennici 43: 515‐530.
Monnin, T.; Malosse, C.; Peeters, C. 1998. Solid‐phase microextration and cuticular
hydrocarbon differences related to reproductive activity in queenless ant Dinoponera
quadriceps. Journal of Chemical Ecology, 24: 473 – 490.
Mota, M. H. V. B.1988. Estudo comparativo das glândulas abdominais relacionadas com o
comportamento social em Apidae (Apinae e Meliponinae). Dissertação de Mestrado.
Instituto de Biociências de Rio Claro, Universidade Julio de Mesquita Filho. Rio Claro.
Nogueira‐Neto, P. 1997. Vida e Criação de Abelhas Indígenas Sem Ferrão. Nogueirapis, São
Paulo, 445 p.
Nunes, T. M. 2008. Reconhecimento parental em abelhas eussociais Neotropicais
(Hymenoptera: Apinae, Meliponini): uma análise dos mediadores químicos e seus
determinantes em Frieseomelitta varia. Dissertação de Mestrado em Entomologia,
Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto‐USP.
Nunes, T. M.; Nascimento, F. S.; Turatti, I. C. Lopes, N. P. e Zucchi, R. 2008. Nestmate
recognition in a stingless bee: does the similarity of chemical cues determine guard
acceptance? Animal Behaviour, 75: 1165 – 1171.
Nunes, T. M.; Turatti, I. C.; Mateus, S.; Nascimento, F. S.; Lopes, N. P. e Zucchi, R. 2008.
Cuticular hydrocarbons in the stingless bee Schwarziana quadripunctata
(Hymenoptera, Apidae, Meliponini): differences between colonies, castes and age.
Submetido para publicação no periódico Genetics and Molecular Research.
Peeters, C.; Monnin, T. and Marlosse, C. 1999. Cuticular hydrocarbons correlated with
reproductive status in a queenless ant. Proc. R. Soc. Lond. B. 266: 1323‐1327.
Ratnieks, F. L. W.; Foster, K. R.; Wenseleers, T. 2006. Conflict resolution in insect societies.
Annu. Rev. Entomol. 51: 581 – 608.
Sakagami, S. F. 1982. Stingless bees. In: Henry R. Herman (ed.), Social Insects, vol. III,
Academic Press, London, 361 ‐ 423p.
Sakagami, S. F. and R. Zucchi, 1963. Oviposition process in a stingless bee, Trigona
(Scaptotrigona) postica Latreille. Studia Entomol. (Rio de Janeiro) 6497 – 510.
Sakagami, S. F., Beig, D., Zucchi, R., Akahira, Y. 1963. Occurrence of ovary‐developed
workers in queenright colonies of stingless bees. Rev. Brasileira Biol. 23: 115 – 129.
Seeley, T. D. 1979. Queen substance dispersal by messenger workers in honeybee colonies.
Behav. Ecol. Sociobiol. 5: 391 – 415.
46
Silva D.L.N. da (1972) Considerações em torno de um caso de substituição de rainha de
Plebeia (Plebeia) droryana (Friese, 1900) (Hymenoptera, Apidae), Homenagem a W.E.
Kerr, Rio Claro, SP, Brasil, pp. 267–273.
Silveira, F. A.; Melo, G. A. R.; Almeida, E. A. B. 2002. Abelhas Brasileiras, Sistemática e
Identificação, Belo Horizonte.
Simões, D.; Bego, L. R. 1979. Estudo da regulação social em Nannotrigona (Scaptotrigona)
postica Latreille, em duas colônias (normal e com rainhas virgens), com especial
referência ao polietismo etário. (Hym., Apidae, Meliponinae). Bol. Zool. , Universidade
de São Paulo 4: 89 – 98.
Singer, T. L. & Espelie, K. E. 1992. Social wasps use nest paper hydrocarbons for nestmate
recognition, Animal Behavior, 44: 63‐68.
Singer, T. L.; Espelie, K. E.; Gamboa, G. J. 1998. Nest and nestmate discrimination in
independent‐founding wasps. In: Vander Meer, R.K.; Breed, M.D.; Winston; M.L.;
Espelie, E.K. (eds.), Pheromone communication in social insects, Westview, Boulder,
p.57 – 78.
Sledge, M. F., Dani, F. R., Cervo, R., Dapporto, L., Turillazzi, S. 2001. Recognition of social
parasites as nest‐mates: adoption of colony‐specific host cuticular odours by the paper
wasp parasite Polistes sulcifer. Proc. Roy. Soc. London Series B – Biol. Sci. 268: 2253 –
2260.
Tóth, E., J.E. Strassmann, P. Nogueira‐Neto, V.L. Imperatriz‐Fonseca and D.C. Queller, 2002.
Male production in stingless bees: variable outcomes of queen‐worker conflict. Mol.
Ecol. 11: 2661–2667.
van Veen, J. W.; Sommeijer, M. J. and Aguilar Monge, I. 1999. Behavioural development
and abdomen inflation of gynes and newly mated queens of Melipona beecheii (Apidae,
Meliponinae). Insectes Sociaux 46: 361–365.
Velthuis, H. H. W. 1970. Queen substances from the abdomen of the honeybee queen.
Zeitschr. Vergl. Physiol. 70: 210 – 222.
Velthuis, H. H. W., Koedam, D., Imperatriz‐Fonseca, V. L. 2005. The males of Melipona and
other stingless bees, and their mothers. Apidologie 36: 169 – 185.
Velthuis, H. H. W.; Araújo Alves, D. de; Imperatriz‐Fonseca, V. L.; Duchateau, M. J. 2002.
Worker bees and the fate of their eggs. Proc. Exp. Appl. Entomol., NEV Amsterdam
13: 97 – 102.
47
Wensellers, T. & Ratnieks, F. L. W. 2004. Tragedy of the commons in Melípona bees. Proc.
R. Soc. B. 271, S310 – S312.
Wille, A. 1983. Biology of the stingless bees, Annu. Rev. Entomol. 28: 41–64.
Wilson, E. 1963. Pheromones. Sci. Amer. 208: 100‐114.
Wilson, E. O. 1971. The insect societies. Belknap Press. Harvard University Press.
Cambridge Massachusetts, 548p.
Zucchi, R.; da Silva‐Matos, E. V.; Nogueira‐Ferreira, F. H.; Azevedo, G. G. 1999. On the cell
provisioning and oviposition process (POP) of the stingless bees – Nomenclature
reappraisal and evolutionary considerations (Hymenoptera, Apidae, Meliponinae),
Sociobiology 34, 65–86.
48
APÊNDICE
49
Figura 7: Cromatogramas sobrepostos de uma rainha fisogástrica de M. marginata em diferentes idades. Linha preta-6 dias após o início da postura, linha rosa-32 dias após o início da postura e linha azul-65 dias após o início da postura. Os números correspondem aos hidrocarbonetos identificados na tabela 14.
Figura 8: Três cromatogramas sobrepostos de uma rainha fisogástrica (Colônia 5) de M. marginata em diferentes condições de postura. Linha preta-com postura; linha rosa-sem postura; linha azul- após a retomada da postura. Os números correspondem aos hidrocarbonetos identificados na tabela 16.
50
Tabela 18: Perfil de hidrocarbonetos de rainhas virgens recém emergidas, colônia 1. TR Hidrocarbonetos RV 1 RV 2 RV 3 RV 4 RV 5 RV 6 RV 7 RV 8 RV 9 RV 10
18,237 Heneicosano 0,77 ‐ 0,60 ‐ ‐ 0,33 0,16 0,93 0,71 0,94
23,426 Tricosano 11,04 4,21 5,68 11,60 9,19 10,66 7,01 11,51 6,83 11,59
27,943 Z‐Pentacoseno 0,69 ‐ 1,15 1,35 0,40 1,32 0,79 0,43 1,25 0,43
28,150 Z‐Pentacoseno 1,64 0,98 1,02 2,13 ‐ ‐ ‐ 1,51 ‐ 1,52
28,693 Pentacosano 11,85 7,74 8,18 11,47 12,70 13,44 8,91 12,92 8,73 13,00
30,812 Hexacosano ‐ ‐ 0,41 ‐ 0,63 0,43 1,09 0,41 0,38 ‐
32,962 Z‐Heptacoseno 36,27 21,49 27,85 39,45 19,37 30,13 30,53 31,37 24,47 31,58
33,159 Z‐Heptacoseno ‐ 0,80 0,58 ‐ ‐ 2,82 0,25 1,13 0,99 1,14
33,634 Heptacosano 7,54 13,52 9,54 9,96 18,64 10,57 11,79 7,37 11,28 7,42
35,674 Octacosano ‐ 0,38 0,63 ‐ 0,51 0,49 0,78 0,75 0,72 0,75
37,437 Z‐Nonacoseno ‐ 0,66 1,59 0,89 1,41 0,73 ‐ 0,60 ‐ 0,60
37,532 Z‐Nonacoseno 21,27 19,26 20,58 14,54 19,09 16,18 21,81 20,03 18,63 20,26
37,761 Z‐Nonacoseno ‐ 1,50 0,77 ‐ 0,40 ‐ 1,35 1,00 1,36
38,251 Nonacosano 1,16 11,12 7,19 2,73 5,90 2,71 5,57 1,49 9,81 1,50
41,508 ZZ‐Hentriacontadieno ‐ 0,1 ‐ ‐ 0,1 ‐ 0,08 ‐ ‐ ‐
41,570 ZZ‐Hentriacontadieno ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ 0,12 0,1 ‐
41,840 Z‐Hentriaconteno 7,75 10,81 9,40 5,89 7,81 7,11 8,84 7,86 9,10 7,91
42,010 Z‐Hentriaconteno ‐ ‐ 0,10 ‐ ‐ ‐ ‐ 0,09 ‐ ‐
42,592 Hentriacontano ‐ 7,49 4,71 ‐ 3,92 3,11 2,46 ‐ 6,00 ‐
51
Tabela 19: Perfil de hidrocarbonetos cuticulares de rainhas virgens de M. marginata com 2 dias de vida (colônia 1). TR Hidrocarboneto RV 1 RV 2 RV 3 RV 4 RV 5 RV 6 RV 7 RV 8 RV 9 RV 10 RV 11 RV 12 RV 13 RV 14 RV 15 RV 16 RV 17 RV 18 RV 19 RV 20
18,208 Heneicosano 0,71 ‐ 1,07 ‐ 0,67 0,15 0,11 0,72 0,93 0,33 0,62 ‐ 0,71 1,52 0,64 ‐ 0,61 0,59 0,9 1,26
23,696 Tricosano 6,83 3,09 10,87 2,89 8,92 3,14 1,88 11,68 11,51 5,8 5,13 2,79 7,61 7,28 7,73 3,58 8,65 6,19 11,93 11,73
26,350 Tetracosano ‐ 0,24 ‐ ‐ 0,16 ‐ ‐ 0,25 0,23 0,27 0,38 0,2 0,35 1,04 0,28 0,38 0,43 0,27 0,57 ‐
28,096 Z‐Pentacoseno ‐ 0,45 0,86 0,29 0,59 0,34 0,19 0,76 0,43 ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ 0,3
28,430 Z‐Pentacoseno 1,25 0,65 2,02 ‐ 1,36 0,64 0,45 1,5 1,51 0,87 1,15 0,79 1,21 1,18 1,08 0,73 0,67 0,86 1,33 0,82
28,947 Pentacosano 8,73 10,84 11,78 8,27 11,51 6,69 3,65 10,53 12,92 9,35 6,93 7,67 7,87 8,02 9,29 6,69 7,64 8,68 9,63 12,17
31,452 Hexacosano ‐ 0,61 ‐ 0,65 0,31 0,53 0,47 0,68 ‐ 0,36 0,26 0,66 ‐ 0,25 0,26 0,31 0,33 0,27 0,22 0,5
32,539 ZZ‐Heptacosadieno ‐ 0,21 ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐
33,117 Z‐Heptacoseno 0,38 9,64 0,29 3,93 0,33 0,36 0,24 0,75 ‐ 0,34 0,25 0,9 0,24 0,31 ‐ 0,54 0,15 0,18 0,33 ‐
33,250 Z‐Heptacoseno 24,47 13,85 32,5 15,25 31,55 15,42 7,57 32,45 31,37 24,36 25,98 13,56 31,98 20,87 25,07 15,72 25,29 24,64 38,23 17,61
33,442 Z‐Heptacoseno 0,99 0,65 1,56 0,66 1,54 0,57 0,48 1,64 1,13 0,92 1,43 1,79 1,48 1,09 1,76 1,01 0,64 1,04 1,27 0,53
33,895 Heptacosano 11,28 19,79 8,24 26,58 8,97 16,82 25,95 9,98 7,37 11,92 8,67 16,94 7,24 11,93 9,46 16,86 11,75 11,41 6,11 14,93
34,630 Me C27 ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ 2,71 0,18 ‐ ‐ 0,67 ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ 1,66 0,43 ‐ 2,57
34,837 Me C27 ‐ 0,22 ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐
35,633 Octacosano ‐ 0,39 0,52 0,56 0,79 2,65 0,27 0,78 0,75 1,07 0,72 0,45 0,85 1,48 0,83 0,41 2,82 0,88 0,72 2,64
36,372 ZZ‐Nonacosadieno 0,72 0,15 ‐ 0,34 ‐ 0,95 0,77 0,86 0,6 0,16 ‐ ‐ ‐ 1,26 ‐ 0,12 0,75 0,32 ‐ 0,98
36,360 ZZ‐Nonacosadieno ‐ 0,17 0,59 0,39 0,45 0,76 0,25 ‐ ‐ 0,45 0,42 0,39 0,38 1,45 0,76 0,42 0,67 0,6 0,52 0,96
37,157 ZZ‐Nonacosadieno ‐ 0,91 ‐ 0,56 ‐ 0,64 ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐
37,299 Z‐Nonacoseno ‐ 1,65 ‐ 0,66 ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐
37,451 Z‐Nonacoseno ‐ 0,87 ‐ 0,80 ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐
37,734 Z‐Nonacoseno 18,73 12,81 16,19 20,71 17,89 10,61 7,59 15,00 20,13 19,86 19,96 14,75 22,59 15,19 22,53 16,93 12,65 21,08 16,89 10,53
37,953 Z‐Nonacoseno 1,00 0,98 ‐ 0,9 0,93 0,78 1,01 1,58 1,11 1,81 3,9 1,85 3,87 1,65 1,95 0,67 1,55 1,56 ‐
38,134 Z‐Nonacoseno ‐ 4,95 ‐ 3,02 ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐
38,529 Nonacosano 9,81 3,63 3,63 8,2 3,24 10,98 16,98 3,22 1,68 6,96 6,65 8,52 2,84 8,14 4,78 10,41 4,25 4,67 1,56 4,82
41,560 ZZ‐Hentriacontadieno ‐ 0,81 ‐ 0,57 ‐ 10,10 14,90 0,50 2,02 0,62 0,78 0,42 11,64 1,41 ‐ 8,96
41,691 ZZ‐Hentriacontadieno ‐ 0,83 ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐
41,792 ZZ‐Hentriacontadieno ‐ 0,15 ‐ ‐ ‐ ‐ 0,35 ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐
42,128 Z‐Hentriaconteno 9,10 4,42 7,13 3,54 8,75 6,54 5,7 6,44 7,86 9,24 11,83 14,84 10,67 7,92 10,25 13,88 5,56 12,21 7,65 5,96
42,367 Z‐Hentriaconteno ‐ 6,97 ‐ 1,39 ‐ 0,76 0,8 ‐ ‐ ‐ 0,93 2,55 ‐ 1,79 ‐ 1,99 ‐ ‐ ‐ ‐
42,873 Hentriacontano 6,00 0,76 1,77 0,27 1,69 5,34 5,61 0,61 ‐ 2,92 5,38 8,95 1,6 2,43 1,96 6,9 0,42 2,03 0,58 0,85
43,455 ? ‐ 0,29 ‐ 0,47 0,38 2,37 4,83 0,64 ‐ 1,02 0,89 0,35 0,53 2,98 0,89 0,75 2,74 0,69 ‐ 1,89
52
Tabela 20: Perfil de hidrocarbonetos cuticulares de rainhas virgens de M. marginata com 2 dias de vida (colônia 2). TR Hidrocarboneto RV 1 RV 2 RV 3 RV 4 RV 5 RV 6 RV 7 RV 8 RV 9 RV 10 RV 11 RV 12 RV 13 RV 14 RV 15
18.237 Heneicosano 1,14 ‐ ‐ 1,19 ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ 1,50 1,17 1,52 1,68
23.633 Tricosano 14,20 3,54 4,91 17,83 6,16 15,13 6,37 9,37 8,10 5,60 5,48 23,04 13,45 33,04 21,66
24.834 Tetracosano 0,39 ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐
27.943 Z‐Pentacoseno 1,71 0,47 0,28 2,18 9,19 ‐ 0,49 0,51 ‐ 0,50 0,48 1,59 0,71 1,49 1,20
28.693 Pentacosano 10,38 11,40 9,59 12,08 ‐ 14,56 9,14 12,12 11,00 11,40 12,71 14,53 14,59 15,85 15,62
30.812 Hexacosano 0,38 ‐ ‐ 0,44 ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ 0,24 ‐ ‐ ‐
31.174 ? ‐ 0,56 0,40 ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ 0,50 ‐ ‐ ‐ ‐ 0,30
32.827 Z‐Heptacoseno 0,68 0,90 0,83 0,69 ‐ ‐ 0,41 ‐ ‐ 0,30 0,27 ‐ ‐ ‐ ‐
32.962 Z‐Heptacoseno 46,42 15,54 20,89 41,76 37,53 40,08 33,04 36,91 33,81 22,20 21,75 37,77 41,93 27,94 38,00
33.159 Z‐Heptacoseno 0,55 1,02 0,49 0,47 ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ 0,40 ‐ ‐ ‐ ‐ ‐
33.636 Heptacosano 4,11 22,64 21,07 4,20 10,35 6,11 11,69 9,24 14,28 21,90 20,51 5,13 6,14 5,89 5,68
35.674 Octacosano 0,75 0,25 ‐ 0,62 0,71 ‐ ‐ 0,69 0,32 0,40 ‐ ‐ 0,50 ‐ ‐
37.184 ZZ‐Nonacosadieno 0,24 0,40 0,44 0,36 ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ 0,20 ‐ ‐ ‐ ‐ ‐
37.437 Z‐Nonacoseno ‐ 0,57 0,39 ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐
37.470 Z‐Nonacoseno ‐ 0,42 ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐
37.532 Z‐Nonacoseno 14,17 13,24 14,61 12,81 22,33 18,04 19,38 21,33 17,84 14,40 14,3 11,89 16,39 10,84 12,34
37.761 Z‐Nonacoseno ‐ 1,49 1,33 ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ 0,04 ‐ ‐ ‐ ‐
37.859 Z‐Nonacoseno ‐ 1,67 1,07 ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ 1,00 0,56 ‐ ‐ ‐ ‐
38.251 Nonacosano 0,53 10,69 10,92 0,53 4,25 9,01 2,68 6,16 8,80 11,42 0,46 0,66 0,66 0,60
41.508 ZZ‐Hentriacontadieno ‐ 0,57 ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐
41.657 Z‐Hentriaconteno ‐ 1,38 1,14 ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ 0,80 ‐ ‐ ‐ ‐ ‐
41.840 Z‐Hentriaconteno 4,36 7,82 7,36 4,85 7,52 6,09 7,54 7,14 7,03 7,40 7,00 3,85 4,45 2,76 2,92
42.010 Z‐Hentriaconteno ‐ 0,38 ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐
42.592 Hentriacontano ‐ 5,07 4,27 ‐ 1,96 ‐ 2,93 ‐ 1,46 4,20 5,49 ‐ ‐ ‐ ‐
53
Tabela 21: Perfil de hidrocarbonetos cuticulares de rainhas virgens de M. marginata com 2 dias de vida (colônia 3). TR Hidrocarboneto RV 1 RV 2 RV 3 RV 4 RV 5 RV 6 RV 7 RV 8 RV 9 RV 10 RV 11 RV 12 RV 13 RV 14 RV 15
18.237 Heneicosano
0,56 0,59 0,12 0,59 0,74 0,27 0,78 0,51 0,57 0,34 0,83 0,62 0,59 0,71 0,58
23.426 Tricosano
11,09 14,78 8,00 10,38 11,39 6,81 10,52 9,10 13,84 8,27 11,18 9,73 12,37 14,90 13,94
26.100 Tetracosano
0,24 0,44 0,24 ‐ ‐ ‐ ‐ 0,28 0,28 0,19 0,36 0,26 0,32 0,43 0,28
27.943 Z‐Pentacoseno
1,00 1,85 0,69 1,08 1,75 0,42 0,38 0,77 0,88 0,77 1,00 1,28 1,44 0,91 0,89
28.150 Z‐Pentacoseno
0,38 0,31 0,12 ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ 0,96 1,07 1,42 1,08 ‐
28.693 Pentacosano
13,36 15,74 12,05 13,27 15,72 15,02 17,05 14,80 12,40 9,24 13,00 10,27 11,32 14,75 12,49
29.266 ?
0,24 0,25 ‐ 0,30 0,14 0,11 0,24 0,44 0,29 0,20 0,85 0,36 0,21 ‐ ‐
30.812 Hexacosano
0,12 0,24 ‐ 0,40 ‐ ‐ ‐ 0,23 ‐ ‐ ‐ 0,20 0,22 ‐ 0,29
31.174 ?
0,32 0,71 0,23 ‐ 0,83 0,27 0,14 0,32 0,18 ‐ 0,30 0,58 0,43 0,33 0,18
32.827 Z‐Heptacoseno
0,49 0,59 0,63 0,57 0,54 0,64 0,66 0,70 0,43 0,45 0,40 0,23 0,29 0,33 0,43
32.900 Z‐Heptacoseno
0,66 0,86 0,80 0,88 0,64 1,63 0,56 0,57 0,33 0,46 0,50 0,50 0,70 0,47 0,33
32.962 Z‐Heptacoseno
35,61 39,77 31,03 38,66 45,29 30,91 28,58 38,48 31,03 26,52 34,09 47,51 39,85 35,59 31,26
33.159 Z‐Heptacoseno
0,47 0,51 0,33 0,59 0,40 0,36 0,30 0,37 0,28 0,20 0,70 0,80 0,81 0,70 0,28
33.636 Heptacosano
10,53 7,10 16,54 9,56 5,88 14,11 16,13 11,25 12,88 16,79 8,50 4,50 4,90 6,25 12,97
35.674 Octacosano
0,43 0,37 0,30 0,82 0,39 0,55 0,21 0,32 0,60 0,72 0,72 0,76 0,20 ‐ ‐
37.437 Z‐Nonacoseno
0,60 0,65 0,79 ‐ 0,70 0,93 0,78 0,89 0,85 0,87 ‐ ‐ 0,73 0,66 0,61
37.470 Z‐Nonacoseno
0,78 0,89 0,60 1,01 0,52 0,46 0,69 0,64 0,49 0,82 1,00 0,99 0,95 1,07 0,86
37.532 Z‐Nonacoseno
16,44 11,42 19,34 17,57 11,84 20,65 17,53 16,26 15,99 20,49 16,66 14,90 16,31 15,25 16,11
38.251 Nonacosano
1,42 0,64 0,21 ‐ ‐ 1,15 1,50 1,03 2,98 4,84 2,32 0,60 0,69 0,97 3,00
41. 657 Z‐Hentriaconteno
0,45 ‐ 4,03 1,06 0,45 0,36 0,12 0,17 0,18 ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐
41.840 Z‐Hentriaconteno
4,42 2,28 3,91 3,28 2,50 5,21 3,85 2,86 4,45 6,56 5,93 4,84 6,06 5,61 4,49
42.592 Hentriacontano
0,41 ‐ ‐ ‐ ‐ 0,13 0,19 0,16 1,01 2,36 0,71 ‐ 0,19 ‐ 1,01
54
Tabela 22: Perfil de hidrocarbonetos de rainhas virgens coletadas em um refúgio, colônia 2. TR Hidrocarboneto RV 1 RV 2 RV 3 RV 4 RV 5 RV 6 RV 7
18.240 Heneicosano ‐ 0,58 ‐ 1,09 ‐ 0,16 ‐
23.759 Tricosano 11,6 5,49 4,2 11,01 1,92 6,86 3,49
28.167 Z‐Pentacoseno 1,35 1,11 ‐ 0,77 0,26 0,12 ‐
28.297 Z‐Pentacoseno 2,13 0,99 1,26 1,68 0,42 0,98 0,74
29.035 Pentacosano 11,47 7,91 7,65 11,75 14,12 8,72 6,58
29.594 Hexacosano ‐ 1,51 ‐ ‐ 0,96 0,62 2,46
31.533 ZZ‐Heptacosadieno ‐ 0,4 ‐ ‐ 0,48 0,39 0,56
33.198 Z‐Heptacoseno 39,45 26,93 21,55 35,35 6,86 1,07 0,79
33.331 Z‐Heptacoseno ‐ 0,56 0,78 ‐ 5,45 29,87 16,23
33.991 Heptacosano 9,96 9,33 13,55 7,78 17,26 11,53 24,36
36.407 Octacosano 0,89 1,54 0,95 ‐ 2,67 ‐ ‐
37.241 ZZ‐Nonacosadieno ‐ ‐ ‐ ‐ 0,82 ‐ ‐
37.401 ZZ‐Nonacosadieno ‐ ‐ ‐ ‐ 1,2 ‐ ‐
37.536 Z‐Nonacoseno ‐ ‐ ‐ ‐ 0,53 ‐ 0,47
37.817 Z‐Nonacoseno ‐ ‐ ‐ ‐ 2,27 ‐ 0,45
37.914 Z‐Nonacoseno 14,54 21,03 18,87 21,55 9,11 21,51 1,96
38.047 Z‐Nonacoseno ‐ ‐ ‐ ‐ 3,87 ‐ 14,56
38.131 Z‐Nonacoseno ‐ 1,34 1,47 ‐ 1,48 ‐ ‐
38.615 Nonacosano 2,73 7,25 11,01 1,32 5,6 5,85 14,79
41.643 ZZ‐Hentriacontadieno ‐ ‐ ‐ ‐ 0,99 ‐ ‐
41.787 Z‐Hentriaconteno ‐ ‐ ‐ ‐ 1,72 ‐ ‐
41.883 Z‐Hentriaconteno ‐ ‐ ‐ ‐ 0,7 ‐ ‐
42.235 Z‐Hentriaconteno ‐ ‐ 0,78 ‐ 11,32 0,97 1,35
42.396 Z‐Hentriaconteno 5,89 9.09 10,59 7,69 5,68 8,65 6,56
42.546 Z‐Hentriaconteno ‐ 9,39 ‐ ‐ 1,8 ‐ 0,97
42.963 Hentriacontano ‐ 4,65 7,34 ‐ 2,51 2,69 3,68
55
Tabela 23: Perfil de hidrocarbonetos de rainhas virgens coletadas durante o ataque de operárias, colônia 1. TR Hidrocarboneto RV 1 RV 2 RV 3 RV 4 RV 5 RV 6 RV 7 RV 8 RV 9 RV 10 RV 11 RV 12 RV 13 RV 14
22.633 Z‐Tricoseno ‐ 0,11 ‐ ‐ ‐ 0,06 0,20 ‐ ‐ ‐ 0,31 0,21 ‐ ‐
22.834 Z‐Tricoseno 0,15 0,65 0,04 0,09 ‐ 0,07 0,11 ‐ 0,05 ‐ 0,19 0,29 ‐ 0,07
23.426 Tricosano 1,60 5,38 3,86 4,92 4,38 3,50 5,55 2,93 2,57 2,19 10,21 4,78 1,56 2,02
26.100 Tetracosano ‐ 0,27 0,21 0,17 0,28 0,15 0,12 0,14 0,13 0,11 0,29 0,16 0,08 0,10
27.811 Z‐Pentacoseno ‐ 0,42 0,49 0,07 0,51 0,12 0,10 ‐ 0,41 0,47 0,00 0,15 0,21 0,25
27.943 Z‐Pentacoseno ‐ 1,27 0,98 0,43 0,96 0,36 0,46 0,27 0,60 0,57 0,91 0,52 0,29 0,26
28.150 Z‐Pentacoseno 0,19 3,57 0,06 0,57 0,09 0,43 0,69 0,84 ‐ 0,09 1,26 1,18 0,48 0,63
28.693 Pentacosano 2,64 14,99 15,24 7,56 20,00 8,14 7,35 10,22 15,32 10,83 12,87 9,04 7,45 8,30
29.266 ? ‐ 0,12 ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ 0,11 0,08 0,14 ‐ ‐ 0,06 ‐
31.174 ? 0,30 0,38 0,52 0,50 0,49 0,60 0,52 0,49 0,06 0,08 0,22 ‐ 0,08 ‐
32.417 ZZ‐Heptacosadieno ‐ 0,27 ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ 0,48 0,52 0,41 0,46 0,55 0,64
32.587 ZZ‐Heptacosadieno ‐ 0,59 ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ 0,13 0,22 ‐ ‐ 0,09 0,19
32.827 Z‐Heptacoseno ‐ 2,79 8,02 1,98 8,01 3,69 1,67 1,64 8,73 11,56 0,15 1,59 7,19 8,22
32.962 Z‐Heptacoseno 6,18 2,41 6,37 18,48 4,06 12,17 15,46 8,31 6,44 7,54 28,85 20,81 10,35 8,01
33.159 Z‐Heptacoseno 0,22 3,47 0,04 0,57 0,03 0,39 0,54 2,13 0,14 0,07 2,70 0,97 0,68 0,86
33.636 Heptacosano 14,53 12,56 16,42 16,77 12,96 21,56 19,80 19,77 14,35 17,42 10,12 13,75 19,17 21,47
34.364 Metil Heptacosano 0,06 ‐ 0,10 ‐ 0,07 0,25 0,38 ‐ 0,14 0,09 ‐ 0,71 0,33 0,24
34.756 Metil Heptacosano 0,17 ‐ 0,06 ‐ ‐ 0,18 0,24 ‐ 0,10 0,06 0,45 0,35 0,17 0,07
35.674 Octacosano 0,36 0,15 ‐ 0,62 0,13 0,33 0,32 0,18 0,12 0,15 ‐ 0,18 0,23 0,24
36.875 ZZ‐Nonacosadieno ‐ 0,11 1,01 0,50 ‐ 0,86 0,48 0,18 0,77 0,79 ‐ ‐ 0,97 1,99
37.035 ZZ‐Nonacosadieno ‐ 0,57 0,52 0,49 0,67 0,63 0,43 0,66 0,18 0,42 ‐ 0,27 0,86 0,91
37.184 ZZ‐Nonacosadieno ‐ 1,02 0,31 0,41 0,14 ‐ ‐ 0,67 ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐
37.437 Z‐Nonacoseno ‐ ‐ 5,41 1,29 4,84 1,49 1,69 0,67 6,94 5,01 ‐ 1,18 5,01 4,87
37.470 Z‐Nonacoseno 4,30 1,22 8,63 ‐ 7,35 3,06 ‐ 1,73 10,81 9,76 0,70 ‐ 8,72 7,63
37.532 Z‐Nonacoseno 0,19 2,40 5,57 23,18 3,26 12,61 21,69 7,96 4,85 5,45 15,49 22,03 11,26 8,59
37.761 Z‐Nonacoseno 9,02 1,12 1,63 ‐‐ 1,01 2,35 ‐ 1,37 1,57 1,91 ‐ ‐ 1,84 1,60
37.859 Z‐Nonacoseno 0,21 6,24 ‐ 0,12 ‐ ‐ 0,17 5,21 ‐ ‐ 1,07 2,00 1,35 1,95
38.251 Nonacosano 38,26 6,56 5,59 8,48 2,59 8,82 9,39 7,17 3,47 3,64 2,59 4,72 4,78 4,36
38.901 Metil Nonacosano ‐ ‐ 0,11 0,49 0,10 0,32 0,43 0,21 0,12 0,10 0,57 0,66 0,22 0,22
41.275 ZZ‐Hentriacontadieno 0,10 0,23 0,78 0,60 0,79 0,92 0,52 0,17 0,76 1,04 ‐ 0,22 1,17 1,58
56
TR Hidrocarboneto RV 1 RV 2 RV 3 RV 4 RV 5 RV 6 RV 7 RV 8 RV 9 RV 10 RV 11 RV 12 RV 13 RV 14
41.499 ZZ‐Hentriacontadieno ‐ 2,62 1,27 0,67 1,39 0,75 ‐ 0,48 1,00 1,49 ‐ 0,46 0,96 0,99
41.508 ZZ‐Hentriacontadieno ‐ ‐ ‐ ‐ 0,21 0,74 0,83 1,26 0,07 ‐ ‐ ‐ 0,54 0,62
41.570 ZZ‐Hentriacontadieno ‐ 1,55 0,01 ‐ ‐ 0,19 0,13 0,87 ‐ 0,08 ‐ 0,27 0,26 0,31
41.840 Z‐Hentriaconteno ‐ 6,92 9,94 2,71 13,06 5,51 2,35 5,67 13,24 10,01 ‐ 1,61 6,63 5,68
42.010 Z‐Hentriaconteno ‐ 4,65 ‐ ‐ 1,29 2,27 6,67 3,99 ‐ 1,76 ‐ ‐ ‐ ‐
42.020 Z‐Hentriaconteno ‐ ‐ 2,78 6,66 1,71 4,78 ‐ 5,06 2,63 2,03 6,80 7,83 4,76 4,35
42.166 Z‐Hentriaconteno ‐ 1,21 ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ 1,43 ‐ 0,57 ‐ ‐ ‐ ‐
42.256 Z‐Hentriaconteno 2,09 2,86 ‐ 0,05 ‐ ‐ 0,31 1,40 ‐ ‐ ‐ 0,79 0,30 1,09
42.592 Hentriacontano 1,34 6,44 1,35 0,73 1,75 1,46 0,59 4,87 1,01 0,81 2,97 0,38 0,54 0,39
43.568 ? 14,99 0,07 0,07 0,57 0,18 0,35 0,49 0,25 0,15 0,15 ‐ 0,85 0,19 0,28
43.935 ? 0,98 0,13 0,12 ‐ 0,30 ‐ ‐ ‐ 0,13 0,10 ‐ 0,14 ‐ 0,19
45.714 ZZ‐Tritriacontadieno ‐ 0,31 0,25 ‐ 0,99 0,14 ‐ ‐ 0,21 0,47 ‐ ‐ ‐ ‐
45.858 ZZ‐Tritriacontadieno ‐ 0,33 0,31 ‐ 0,61 0,03 ‐ 0,14 0,20 0,19 ‐ ‐ ‐ ‐
46.342 Z‐Tritriaconteno 0,89 3,11 1,69 0,07 5,24 0,62 ‐ 1,31 1,80 1,79 ‐ 0,25 0,438 0,46
46.601 ? 1,23 0,54 0,23 0,24 0,41 0,09 0,32 ‐ 0,18 0,29 0,84 0,67 0,240 0,37
47.317 ? ‐ 0,39 ‐ ‐ 0,11 ‐ ‐ 0,23 ‐ ‐ ‐ 0,52 ‐ ‐