caracterização de transcritos de ancilostomídeos
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
Caracterização de transcritos de
ancilostomídeos envolvidos no
parasitismo
Ana Flávia Dias Vieira da Costa
Belo Horizonte
2012
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Ana Flávia Dias Vieira da Costa
Caracterização de transcritos de
ancilostomídeos envolvidos no
parasitismo
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Parasitologia do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais, como requisito parcial à obtenção do título de Doutor em Ciências.
Orientadora: Prof.ª Dr.ª Élida Mara Leite Rabelo
Belo Horizonte
2012
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AGRADECIMENTOS
Ao Programa de Pós-Graduação em Parasitologia do ICB/UFMG, na pessoa da
coordenadora Profª. Érika Martins Braga.
À CAPES pelo apoio financeiro.
À minha orientadora Élida Rabelo, por tudo o que fez por mim nestes 9 anos de
convivência. Agradeço pela oportunidade de ser sua aluna de Iniciação Científica,
Mestrado e Doutorado, por tudo que me ensinou durante esses anos, pela confiança
que sempre teve em mim e, principalmente, por todo apoio e carinho. Sinto-me uma
pessoa privilegiada por ter você como orientadora e, sobretudo amiga em todos os
momentos.
A todos os amigos do Laboratório de Parasitologia Molecular que tive o prazer de
conhecer e conviver durante estes anos. Aos antigos Leandra, Lívio, Érlisson,
Ariadna, Fábio, Denilson, Flaviane e, em especial, ao Rodrigo, que me orientou
durante a Iniciação Científica. Aos atuais Willian, Thayse, Júlia, Diana, Carina,
Bruna, Luciana, Ana Cristina, pela convivência e por me ajudarem nos meus
experimentos. Agradeço especialmente à Bruna, Luciana e Ana Cristina, que
sempre estiveram dispostas a me ajudar e sem as quais este trabalho não seria
concluído.
A duas ex-LPM Carina e Sílvia, que são colaboradoras deste trabalho, mas são
acima de tudo grandes amigas. Agradeço por tudo o que me ensinaram e por toda a
ajuda que vocês me deram.
A todos os professores, funcionários e alunos do Departamento de Parasitologia do
ICB/UFMG. Em especial ao Hudson, pela identificação dos helmintos, à Rosa e ao
Joãozinho que sempre me socorreram quando precisei pedir algo emprestado.
Ao Dr. Gabriel da Rocha Fernandes, por me ajudar nas análises das sequências de
N. americanus.
Aos integrantes do Laboratório de Biodiversidade e Evolução Molecular do
Departamento de Biologia Geral do ICB/UFMG que colaboraram para o
sequenciamento feito neste trabalho.
3
Ao Núcleo de Análise de Genoma e Expressão Gênica (NAGE) do ICB/UFMG, na
pessoa da coordenadora Prof.ª Santuza Maria Ribeiro Teixeira.
Aos laboratórios de Genética e Bioquímica, na pessoa da Prof.ª Glória Franco, e de
Imunologia das Doenças Infecciosas, na pessoa do Prof. Sérgio Costa, do
Departamento de Bioquímica e Imunologia do ICB/UFMG.
Ao funcionário do Departamento de Bioquímica e Imunologia do ICB/UFMG Jamil,
pela grande disposição em me ajudar sempre que recorri a ele.
Ao Prof. Alan Lane de Melo, do Laboratório de Taxonomia e Biologia de
Invertebrados do Departamento de Parasitologia do ICB/UFMG, pelos soros
cedidos.
Ao Laboratório de Imunologia e Genômica de Parasitos, coordenado pelos
professores Daniella Bartholomeu e Ricardo Fujiwara, por disponibilizarem o uso do
ÄKTA, e em especial ao Tiago Mendes, pela ajuda nas análises de epitopos, e ao
Rodrigo Lourdes, grande amigo dentro e fora da UFMG.
Ao Laboratório de Fisiologia de Insetos Hematófagos do Departamento de
Parasitologia do ICB/UFMG, meu segundo laboratório. Aos professores
responsáveis Marcos Horácio Pereira, Ricardo Araújo e em especial ao Nelder
Gontijo por disponibilizarem a estrutura do laboratório sempre que precisei, além dos
conselhos e ensinamentos sempre bem-vindos. Ao César e aos alunos/amigos do
LFIH pela amizade, companheirismo e disponibilidade em me ajudar. Além das
festas, Arthromint’s, jogos de futebol...
Aos amigos que fiz durante a minha jornada na UFMG. Aos amigos da graduação,
em especial à Lara, e aos remanescentes da minha turma de Mestrado, Família
Mexicana, Priscila, Kelly, Camila e em especial ao Sydnei, grande amigo e consultor
pessoal de estatística.
A duas pessoas muito especiais que conheci aqui, mas serão minhas amigas
inseparáveis para o resto da vida: Ceres e Helen. Amo muito vocês! Agradeço pela
companhia, amizade, dedicação e preocupação que vocês têm por mim.
Aos amigos do Departamento de Parasitologia do ICB/UFMG, pelos vários
momentos agradáveis que me proporcionaram, sobretudo os “churrascos na laje”.
4
Aos colegas do Centro de Controle de Zoonoses e Endemias/Betim e à Direção, por
flexibilizar meus horários, folgas e férias para que eu pudesse concluir meus
experimentos.
Aos meus pais e irmãos, pelo carinho, incentivo e apoio incondicional em todos os
momentos. Por serem o meu berço e serem as pessoas mais amadas da minha
vida.
Ao meu sobrinho Pedrinho, que é o xodó da família e faz os meus finais de semana
muito mais agradáveis, mesmo fazendo bagunça no quarto da tia Aninha.
Aos meus amigos extra-UFMG e familiares que sempre me apoiaram e se
orgulharam de mim, mesmo sem saber muito bem o que eu faço no Doutorado. Em
especial, ao meu afilhado João Pedro, que é um menino de ouro, que eu amo muito
e desde pequeno acompanha minha jornada na Pós-Graduação quando vem passar
férias comigo.
A todos que, de alguma forma, contribuíram na elaboração e execução dessa Tese.
E, finalmente, a Deus. Por colocar todas essas pessoas no meu caminho e por me
fazer ser a pessoa que sou.
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RESUMO
Neste trabalho foi avaliado o perfil de transcrição e expressão diferencial de
duas classes de genes envolvidos no parasitismo por ancilostomídeos: asps e
inibidores de proteases tipo Kunitz, previamente identificados como sendo mais
transcritos em machos de A. braziliense. A transcrição diferencial foi avaliada
através da RT-PCR e RT-PCR em tempo real, para as asps 4, 5 e 6 de A.
braziliense e A.caninum, asps 4 e 5 de A. ceylanicum e dois genes de inibidores de
proteases tipo Kunitz para as três espécies. Em todas as espécies os genes em
análise se mostraram com transcrição enriquecida nos vermes machos. Para a
análise nas diferentes espécies, novos genes foram sequenciados tendo sido
produzidas sete novas sequências parciais de asps e genes de inibidores de
proteases tipo Kunitz para as três espécies de Ancylostoma. Como não havia
sequências destes genes para adultos de N. americanus disponíveis no banco de
dados, foram geradas in silico 94 sequências consenso, a partir do banco de ESTs,
baseadas na similaridade com estas proteínas já descritas para A. caninum e A.
ceylanicum. Domínios KU originários de sequências das quatro diferentes espécies
de ancilostomídeos foram expressos e usados para a produção de anticorpos. Estes
anticorpos foram utilizados para comparação da expressão diferencial de inibidores
de proteases tipo Kunitz presentes nos produtos ES e extratos protéicos totais entre
machos e fêmeas das quatro espécies, por western blot. Foi observada a expressão
diferencial de algumas destas proteínas entre machos e fêmeas de A. braziliense, A.
caninum, A. ceylanicum e N. americanus, sendo reconhecidas 14 proteínas distintas
que contêm o domínio conservado, algumas específicas dos produtos ES de N.
americanus que poderão ser alvos de estudos futuros. Além disso, foi demonstrado
que os domínios KU recombinantes não conferiram proteção em hamsters contra a
infecção por A. ceylanicum. Entretanto, tendo em vista o potencial antigênico
apresentado pelos domínios abre-se a perspectiva de que estes possam ser usados
em associação com outros peptídeos para ensaios de vacinação. Por fim, os
domínios KU recombinantes foram utilizados para avaliar o potencial imunogênico
das proteínas produzidas por ancilostomídeos que possuem tais domínios, através
de ELISA, utilizando soros de hamsters e cães infectados ou não por
ancilostomídeos. Apenas o soro de cães infectados com A. caninum foi capaz de
reconhecer os domínios KU recombinantes.
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ABSTRACT
This study evaluated the transcription profile and differential expression of two
classes of genes involved in parasitism by hookworms: asps and Kunitz protease
inhibitors. These two classes of genes have been previously identified by presenting
a higher level of transcription in males of A. braziliense. The differential transcription
was assessed by RT-PCR and qRT-PCR, for asps 4, 5 and 6 of A. braziliense and
A.caninum, asps 4 and 5 of A. ceylanicum and two Kunitz proteinase inhibitors genes
for the three species. In all species analyzed these genes presented as
transcriptionally enriched in male worms. To analyze the different species, new
genes were sequenced having been produced seven new partial sequences of asps
and Kunitz protease inhibitors genes for the three Ancylostoma species. Since there
were no available sequences of these genes for adults N. americanus in the
database, 94 consensus sequences were generated “in silico” from the EST
database, based on similarity with the orthologous proteins already described for A.
ceylanicum and A. caninum. KU domain sequences originating of four different
species of hookworms were expressed and used for antibody production. These
antibodies were used to compare the differential expression of Kunitz protease
inhibitors present in ES products and in total protein extracts between males and
females of all four species, by western blot. It was observed a differential expression
to some proteins between males and females of A. braziliense A. caninum, A.
ceylanicum and N. americanus, and 14 distinct proteins containing the conserved
domain have been recognized, some as specific to ES products of N. americanus.
The characterization of these proteins can be addressed in future studies.
Furthermore, it was shown that recombinant domains KU did not provide protection
in hamsters against infection by A. ceylanicum. However, in view of the potential
antigenic profile presented by the domains, it opens the prospect that they can be
used in combination with other peptides for vaccination trials. Finally, KU
recombinants domains were used to assess the immunogenic potential of proteins
produced by hookworms possessing such domains, by ELISA using sera from
hamsters and dogs infected or not by hookworms. Only sera from dogs infected with
A. caninum was able to recognize the recombinant KU domains.
7
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1: Representação esquemática do ciclo de vida dos ancilostomídeos.
Adaptado de Hotez et al., 2005. ................................................................................ 23
FIGURA 2: Distribuição e prevalência mundial da ancilostomose. Ilustração:
Margaret Shear, Public Library of Science, adaptado de de Silva et al., 2003 .......... 27
FIGURA 3: Estutura esquemática dos domínios das ASPs inferidas a partir das
sequências obtidas asps 4, 5 e 6 de A. braziliense.. ................................................. 72
FIGURA 4: Estutura esquemática dos domínios de inibidores de protease tipo Kunitz
12D e 1D inferidos a partir das sequências de A. caninum, A. ceylanicum e A.
braziliense obtidas com as respectivas identidade e similaridade com as sequências
para as quais foram desenhados os iniciadores.. ..................................................... 73
FIGURA 5: Transcrição diferencial de genes codificadores de inibidores de
proteases tipo Kunitz em machos de A. braziliense, A. caninum e A. ceylanicum, por
RT-PCR. .................................................................................................................... 74
FIGURA 6: Comparação dos dados da RT-PCR quantitativa (log2) de genes
codificadores de inibidores de proteases tipo Kunitz. Quantificação relativa da
transcrição em machos versus fêmeas. .................................................................... 75
FIGURA 7: Transcrição diferencial de asps em machos de A. braziliense, A. caninum
e A. ceylanicum, por RT-PCR. .................................................................................. 76
FIGURA 8: Comparação dos dados da RT-PCR quantitativa (log2) de asps.
Quantificação relativa da transcrição em machos versus fêmeas. ............................ 77
8
FIGURA 9: Constituição de aminoácidos dos domínios KU das sequências de
inibidores de proteases tipo Kunitz ............................................................................ 80
FIGURA 10: Amplificação dos domínios KU, através de RT-PCR, para as espécies
A. braziliense, A. caninum e A. ceylanicum ............................................................... 81
FIGURA 11: Amplificação dos domínios KU, através de RT-PCR, para N.
americanus ................................................................................................................ 82
FIGURA 12: Resultado da PCR de colônias provenientes de transformações com
plasmídeos recombinantes contendo domínios KU amplificados .............................. 83
FIGURA 13: Lise bacteriana e purificação dos domínios KU recombinantes com
tampões com e sem NaCl (0,5 M), apresentado em SDS-PAGE 12% corado com
azul de coomasie R250. ............................................................................................ 85
FIGURA 14: Domínios KU recombinantes após purificação e concentração
analisados por SDS-PAGE 12% corado com azul de coomasie R250 (a) e western
blot com anticorpo primário anti-histidina (b) ............................................................. 86
FIGURA 15: Epitopos lineares de células B (aminoácidos sublinhados) dos domínios
KU AyD1, AbD2, AcD5 e Na16D1, preditos pelo programa Bepipred (corte 0,35). ... 86
FIGURA 16: Western blot dos domínios KU recombinantes (0,5 µg) contra os soros
de camundongos anti-AyD1 (a), anti-AbD2 (b), anti-AcD5 (c), anti-Na16D1 (d) e pré-
imune (e) diluídos 1:250. ........................................................................................... 87
FIGURA 17: Perfis eletroforéticos dos produtos excretados/secretados (2 µg) de
machos e fêmeas de N. americanus, A. ceylanicum e A. caninum (a) e do extrato
protéico total (5 µg) de machos e fêmeas de N. americanus, A. ceylanicum, A.
9
caninum e A. braziliense (b), analisados por SDS-PAGE 12% corado com nitrato de
prata. ......................................................................................................................... 88
FIGURA 18: Western blot dos produtos excretados/secretados (15 µg) de machos e
fêmeas de N. americanus, A. ceylanicum e A. caninum e domínios KU
recombinantes (0,5 µg) contra os soros de camundongos anti-AyD1 (a), anti-AbD2
(b), anti-AcD5 (c), anti-Na16D1 (d) e pré-imune (e) diluídos 1:250. .......................... 90
FIGURA 19: Western blot dos extratos protéicos totais (25 µg) de machos e fêmeas
de N. americanus, A. ceylanicum, A. caninum e A. braziliense e domínios KU
recombinantes (0,5 µg) contra os soros de camundongos anti-AyD1 (a), anti-AbD2
(b), anti-AcD5 (c), anti-Na16D1 (d) e pré-imune (e) diluídos 1:100. .......................... 94
FIGURA 20: Níveis de anticorpos IgG de hamsters do ensaio de vacinação frente ao
domínio KU recombinante AyD1 e mix dos quatro domínios KU recombinantes –
AyD1, AbD2, AcD5 e Na16D1 ................................................................................... 96
FIGURA 21: Níveis de anticorpos IgG de hamsters do ensaio de vacinação frente ao
antígeno bruto total e produtos de excreção e secreção de A. ceylanicum.. ............ 97
FIGURA 22: Eliminação de ovos por grama de fezes dos hamsters dos quatro
grupos do ensaio de vacinação ao longo da infecção com 100 L3 de A. ceylanicum.
.................................................................................................................................. 98
FIGURA 23: Peso, em gramas, dos hamsters do ensaio de vacinação ao longo da
infecção com 100 L3 de A. ceylanicum. .................................................................... 98
FIGURA 24: Volume de hemácias e níveis de hemoglobina de hamsters do ensaio
de vacinação antes e ao final da infecção por A. ceylanicum. .................................. 99
10
FIGURA 25: Recuperação de vermes adultos, machos e fêmeas, de A. ceylanicum
do intestino delgado dos hamsters do ensaio de vacinação, infectados com 100 L3
de A. ceylanicum. .................................................................................................... 100
FIGURA 26: Níveis de anticorpos IgG de cães infectados por A. braziliense, A.
caninum e A. ceylanicum frente a mix dos quatro domínios KU recombinantes –
AyD1, AbD2, AcD5 e Na16D1 – e ao domínio KU recombinante AbD2, AcD5 e
AyD1... .................................................................................................................... 101
FIGURA 27: Níveis de anticorpos IgG de hamsters infectados por A. ceylanicum
frente a mix dos quatro domínios KU recombinantes – AyD1, AbD2, AcD5 e Na16D1
– e ao domínio KU recombinante AyD1. ................................................................. 101
FIGURA 28: Níveis de anticorpos IgG de hamsters infectados por N. americanus
frente ao antígeno bruto total e produtos de excreção e secreção de N. americanus e
frente a mix dos quatro domínios KU recombinantes – AyD1, AbD2, AcD5 e Na16D1
– e ao domínio KU recombinante Na16D1 .............................................................. 102
11
LISTA DE QUADROS
QUADRO 1: Principais espécies de parasitos do gênero Ancylostoma com suas
características morfológicas, morfométricas e hospedeiros definitivos ..................... 21
QUADRO 2: Oviposição diária e tamanho dos ovos dos ancilostomídeos que
acometem humanos .................................................................................................. 22
QUADRO 3: Grupos experimentais de hamsters para imunização com domínios KU
recombinantes. .......................................................................................................... 65
QUADRO 4: Dados da RT-PCR quantitativa para genes codificadores de inibidores
de proteases tipo Kunitz. Quantificação relativa da transcrição gênica entre machos
(M) e fêmeas (F) ........................................................................................................ 75
QUADRO 5: Dados da RT-PCR quantitativa para asps. Quantificação relativa da
trascrição gênica entre machos (M) e fêmeas (F) ..................................................... 77
QUADRO 6: ESTs de N. americanus do banco de dados dbEST e SRA, disponíveis
no NCBI, similares aos genes de inibidores de protease tipo Kunitz e asps de A.
caninum e A. ceylanicum .......................................................................................... 78
QUADRO 7: Domínios KU de A. braziliense, A. caninum, A. ceylanicum e N.
americanus selecionados para amplificação, clonagem, sequenciamento e
expressão.. ................................................................................................................ 84
12
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS Ab – Ancylostoma braziliense
Ac – Ancylostoma caninum
Ad – Ancylostoma duodenale
Ay – Ancylostoma ceylanicum
APR – cathepsin D-like Aspartic Protease
asp - Ancylostoma Secreted Protein gene
ASP – Ancylostoma Secreted Protein
BLAST – Basic Local Alignment Search Tool
CCZ – Centro de Controle de Zoonoses
cDNA – DNA complementar
CETEA – Comitê de Ética em Experimentação Animal
dbEST – Expressed Sequence Tags database
DEPC – dietil pirocarbonato
DNA – ácido desoxirribonucléico
DNAse - desoxirribonuclease
dNTP – desoxirribonucleotídeo 5’ fosfato
dsRNA – doubled-stranded RNA
DTT – ditiotreitol
EDTA – ácido etilenodiaminotetracético
ELISA – Enzyme Lynked Immunossorbent Assay
ES – produtos de excreção/secreção
EST – Expressed Sequence Tags
FAPEMIG – Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas
FPLC – Fast Protein Liquid Chromatography
13
GET – solução de glicose, EDTA e Tris
h – hora
ICB – Instituto de Ciências Biológicas
IgG – Imunoglobulina G
IPTG – isopropil-β-D-tiogalactopiranosídeo
KCl – cloreto de potássio
kV – kilovolt
L1 – larva de primeiro estádio
L2 – larva de segundo estádio
L3 – larva de terceiro estádio
L4 – larva de quarto estádio
LMC – Larva Migrans Cutânea
log - logaritmo
M – molar
µg – micrograma
MgCl2 – cloreto de magnésio
µl – microlitro
ml – mililitro
µm – micrômetros
µM – micromolar
mm – milímetros
mM – milimolar
mRNA – RNA mensageiro
Na – Necator americanus
NaCl – cloreto de sódio
14
NaOH – hidróxido de sódio
NCBI – National Center for Biotechnology
ng – nanograma
nm – nanômetro
nM – nanomolar
pb – pares de base
PBS – Phosphate Buffer Saline
PCR – Polymerase Chain Reaction
pH – potencial hidrogeniônico
PM – padrão de peso molecular
PVDF – Polyvinylidene fluoride
qRT-PCR – RT-PCR quantitativa
RBS – Ribosome Binding Site
RNA – ácido ribonucléico
RNAi – interferência por RNA
rpm – rotações por minuto
RPMI – desenvolvido pelo Instituto Roswell Park Memorial
RT-PCR – Reverse Transcriptase PCR
SDS – duodecil sulfato de sódio
SDS-PAGE – sodium dodecyl sulfate - polyacrylamide gel electrophoresis
SRA – Sequence Read Archive
Taq – Thermophillus aquaticus
TMB – 3,3’,5,5’-tetrametilbenzidina
TRIS-HCL – tris hidrocloreto
UFMG – Universidade Federal de Minas Gerais
15
V – volts
X – vezes
xg – vezes gravidade
X-GAL – 5-bromo-4-chloro-3-indolyl- beta-D-galactopyranoside
16
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ................................................................................. 20
1.1. Morfologia e classificação dos ancilostomídeos ....................................... 20
1.2. Ciclo biológico .............................................................................................. 22
1.3. Ancilostomídeos zoonóticos ....................................................................... 25
1.4. Ancilostomose humana ............................................................................... 27
1.5. Resposta imune contra ancilostomídeos ................................................... 29
1.6. Vacina para ancilostomose humana e utilização de modelos
experimentais ....................................................................................................... 30
1.7. Genômica e proteômica dos ancilostomídeos ........................................... 32
2. JUSTIFICATIVA ............................................................................... 38
3. OBJETIVOS ..................................................................................... 41
3.1. Geral ............................................................................................................... 41
3.2. Específicos .................................................................................................... 41
4. MATERIAL E MÉTODOS ................................................................. 44
4.1. Análise das sequências gênicas de N. americanus................................... 44
4.2. Seleção das sequências gênicas de Ancylostoma ssp. ............................ 45
4.3. Obtenção dos parasitos ............................................................................... 45
4.4. Extração do RNA total .................................................................................. 47
4.5. Síntese de cDNA total ................................................................................... 48
4.6. Comparação transcricional entre vermes adultos machos e fêmeas de
ancilostomídeos .................................................................................................. 49
4.6.1. RT-PCR e RT-PCR em tempo real .......................................................... 49
4.6.2. Sequenciamento e análise das sequências ............................................. 51
4.7. Comparação da expressão protéica de inibidores de protease tipo Kunitz
entre vermes adultos machos e fêmeas de ancilostomídeos .......................... 53
4.7.1. Obtenção dos domínios KU ..................................................................... 53
4.7.2. Clonagem e transformação ...................................................................... 53
4.7.3. Extração do DNA plasmidial ..................................................................... 54
4.7.4. Expressão de proteínas ........................................................................... 56
4.7.5. Purificação e confirmação da expressão de proteínas ............................. 59
17
4.7.6. Produção de anticorpo policlonal ............................................................. 60
4.7.7. Obtenção de proteínas excretadas/secretadas e extrato protéico total.... 61
4.7.8. Caracterização do perfil protéico por “Western blot” ................................ 63
4.8. Ensaio de vacinação de hamsters ............................................................... 64
4.8.1. Imunização e desafio ............................................................................... 65
4.8.2. Avaliação da imunização .......................................................................... 67
4.8.3. Avaliação da vacinação ............................................................................ 68
4.9. Teste de imunogenicidade ........................................................................... 69
4.10. Análise estatística ....................................................................................... 70
5. RESULTADOS ................................................................................. 72
5.1. Obtenção de sequências parciais para Ancylostoma ssp. ....................... 72
5.2. Comparação do perfil de transcrição para inibidores de proteases tipo
Kunitz e asps entre vermes adultos machos e fêmeas de Ancylostoma ssp.74
5.2.1. Perfil de transcrição de inibidores de proteases tipo Kunitz ..................... 74
5.2.2. Perfil de transcrição de asps .................................................................... 76
5.3. Análise das sequências gênicas de N. americanus................................... 78
5.4. Comparação da expressão protéica de inibidores tipo Kunitz entre
vermes adultos machos e fêmeas de ancilostomídeos ................................... 80
5.4.1. Amplificação dos domínios KU ................................................................. 80
5.4.2. Clonagem e sequenciamento dos domínios KU ...................................... 82
5.4.3. Expressão e purificação dos domínios KU ............................................... 84
5.4.4. Predição de epitopos e produção de anticorpos policlonais ..................... 86
5.4.5. Análise dos perfis eletroforéticos de proteínas excretadas/secretadas e
extrato protéico total ........................................................................................... 88
5.4.6. Caracterização do perfil protéico de inibidores de protease tipo Kunitz por
“Western blot” ..................................................................................................... 89
5.5. Ensaio de vacinação de hamsters ............................................................... 95
5.5.1. Avaliação da imunização .......................................................................... 95
5.5.2. Avaliação da vacinação ............................................................................ 97
5.6. Teste de imunogenicidade ......................................................................... 100
6. DISCUSSÃO .................................................................................. 104
7. CONCLUSÕES .............................................................................. 117
18
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................. 120
APÊNDICES ...................................................................................... 131
19
INTRODUÇÃO
20
1. INTRODUÇÃO
1.1. Morfologia e classificação dos ancilostomídeos
Os ancilostomídeos estão inclusos no Reino Metazoa, Filo Nematoda, Classe
Secernentea, Ordem Strongylida, Família Ancylostomatidae (BLAXTER et al., 1998;
CHILTON et al., 2006). Os nematódeos pertencentes a essa família apresentam
nítido dimorfismo sexual e duas estruturas bastante características: cápsula bucal,
nas fêmeas e machos, e bolsa copuladora, nos machos (REY, 2001). As espécies
de interesse para a medicina humana e veterinária pertencem a duas subfamílias:
Ancylostomatinae, a qual contém as espécies do gênero Ancylostoma, e
Bunostominae, com a principal espécie Necator americanus (ANDERSON, 1992). A
principal diferença morfológica entre as espécies das duas subfamílias é a presença
de dentes na cápsula bucal dos Ancylostomatinae e de placas cortantes nos
Bunostominae. Além disso, na subfamília Bunostominae, duas estruturas comuns
aos Ancylostomatinae são ausentes: espinho caudal nas fêmeas e gubernáculo nos
machos (REY, 2001; NEVES, 2003).
Os indivíduos da família Ancylostomatidae, em sua maioria, parasitam o
intestino delgado e se alimentam de sangue do hospedeiro. Esses parasitos têm
como hospedeiros definitivos canídeos, felídeos e humanos, dependendo da espécie
parasita. Os principais parasitos humanos são N. americanus, Ancylostoma
duodenale, A. ceylanicum. A. caninum e A. braziliense, sendo os dois últimos
parasitos definitivos do intestino de cães e gatos.
As espécies do gênero Ancylostoma são muito semelhantes
morfologicamente, necessitando grande perícia na identificação de seus indivíduos,
que é feita principalmente pelo tamanho, disposição e quantidade de dentes
21
presentes na cápsula bucal (QUADRO 1). Mesmo com análise minuciosa à lupa,
pode haver casos de identificação incorreta, principalmente no caso de A.
braziliense e A. ceylanicum, espécies que eram anteriormente considerados
sinônimos, mas foram finalmente diferenciados por Biocca (1951). Além de
possuírem a mesma quantidade de dentes na cápsula bucal, essas espécies são
simpátricas em algumas áreas geográficas e é possível que haja identificação
equivocada entre estas (TRAUB et al., 2007).
Espécie Comprimento (mm) Número de dentes na
cavidade bucal Hospedeiros
Macho Fêmea
A. caninum 11 - 13 14 – 20 6 grandes canídeos, felídeos
A. duodenale 8 - 11 10 – 18 4 grandes e 2 pequenos humanos
A. braziliense 5 - 7,5 6,5 – 9 2 grandes e 2 pequenos canídeos, felídeos
A. ceylanicum 5 - 7,5 6,5 – 9 2 grandes e 2 pequenos canídeos, felídeos
A. tubaeforme 9,5 - 11 12 – 15 6 grandes felídeos
(adaptado de FREITAS, 1977)
Alguns estudos vêm sendo feitos a fim de estabelecer relações filogenéticas
entre os membros da família Ancylostomatidae e entre as famílias de nematódeos
(PARKINSON et al., 2004; TRAUB et al., 2004; MITREVA et al., 2005). A grande
questão em torno dos ancilostomídeos é se as subfamílias são intimamente
relacionadas ou se o parasitismo humano surgiu em dois momentos distintos dentro
da superfamília Ancylostomatoidea (BLAXTER, 2000). Isso se deve ao fato de o A.
QUADRO 1: Principais espécies de parasitos do gênero Ancylostoma com suas
características morfológicas, morfométricas e hospedeiros definitivos
22
duodenale e o N. americanus serem parasitos humanos, mas possuírem grandes
diferenças não só morfológicas, mas também fisiológicas, como diferenças na
quantidade de sangue ingerido pelos adultos e de ovos postos pelas fêmeas de
cada espécie, e também nas vias de infecção do hospedeiro (ALBONICO et al.,
1998; HAAS et al., 2005; BETHONY et al., 2006). Apesar dos esforços feitos até o
momento, são necessários mais dados genéticos e proteômicos para se postular
qualquer teoria sobre a evolução biológica dos membros da superfamília
Ancylostomatoidea, como sugerido no trabalho mais recente de BLAXTER (2000).
1.2. Ciclo biológico
Os vermes adultos se fixam, através dos dentes (Ancylostomatinae) ou
lâminas (Bunostominae) da cápsula bucal, na mucosa do intestino delgado do
hospedeiro. Após a cópula, as fêmeas realizam a ovoposição de milhares de ovos
diariamente (QUADRO 2), que são eliminados juntamente com as fezes do
hospedeiro. Os ovos de ancilostomídeos são bastante semelhantes, apresentando
pouca variação de tamanho entre eles, não se constituindo em critérios para
diagnóstico diferencial em fezes (QUADRO 2 e FIGURA 1).
Espécie Oviposição p/ dia Tamanho dos ovos
A. braziliense 4 mil 75 a 95 µm
A. ceylanicum 4 mil 55 a 60 µm
A. caninum 16 a 17 mil 56 a 75 µm
A. duodenale 20 a 30 mil 56 a 76 µm
N. americanus 6 a 11 mil 64 a 76 µm
(adaptado de SOULSBY, 1965; FREITAS, 1977; REY, 2001)
QUADRO 2: Oviposição diária e tamanho dos ovos dos ancilostomídeos que acometem
humanos
23
A larva rabditóide de primeiro estádio, chamada L1, eclode entre 24 e 48
horas após o ovo ter entrado em contato com o meio externo. Esse processo ocorre
sob temperatura (23 – 30°C) e umidade adequadas. Essa larva se alimenta de
microrganismos e detritos orgânicos presentes nas fezes e no solo. A larva L1 sofre
uma muda, se transformando na larva rabditóide L2. Há uma nova muda e surge a
larva L3, que não se alimenta e é a forma infectante. O desenvolvimento do ovo até
a larva de terceiro estádio acontece no período de cinco a oito dias, sob condições
ambientais favoráveis (SOULSBY, 1965).
A infecção intestinal pelas espécies do gênero Ancylostoma – A. ceylanicum e
A. duodenale, nos casos humanos, e A. braziliense, A. caninum e A. ceylanicum em
canídeos e felídeos – pode acontecer pela penetração das larvas L3 através da pele
ou pela ingestão das mesmas por seus hospedeiros, sendo a segunda via mais
FIGURA 1: Representação esquemática do ciclo de vida dos ancilostomídeos. Adaptado de
Hotez et al., 2005.
24
eficiente. Já na infecção de humanos por N. americanus, o contágio se dá
predominantemente pela penetração das larvas L3 através da pele (FREITAS, 1977;
REY, 2001; NEVES, 2003).
Na infecção oral, as larvas L3 são ingeridas pelo hospedeiro e perdem sua
cutícula ao passar pelo estômago, devido à ação do suco gástrico. Após,
aproximadamente, três dias de infecção elas migram para o intestino delgado e
invadem a mucosa intestinal, onde ocorre a muda para larva L4. Depois de um ou
dois dias, as larvas L4 migram para o lúmen do intestino delgado, onde se
transformam em adultos jovens, fixam-se à mucosa intestinal por meio de suas
cápsulas bucais para realizar hematofagia e posterior cópula.
Na infecção percutânea, as larvas L3 entram em contato e penetram na pele
do hospedeiro através dos folículos pilosos, podendo chegar aos vasos sangüíneos
e/ou linfáticos. A ação de enzimas, como a hialuronidase, é importante neste
processo de invasão (HOTEZ et al., 1992). Após atingirem a circulação sanguínea,
as larvas L3 são levadas para a microcirculação pulmonar, onde penetram nos
alvéolos, passam pelo sistema respiratório, são expelidas ou deglutidas. As larvas
L3 da maioria das espécies de ancilostomídeos, ao passar pelo sistema respiratório,
sofrem a muda para L4. As larvas que atingem o sistema digestivo passam pelo
estômago e chegam ao intestino delgado, onde se desenvolvem até vermes adultos,
alimentam-se e se reproduzem. Essa rota de infecção é denominada via clássica.
Alternativamente, as larvas L3 podem atingir a circulação sistêmica e migrar pelos
tecidos (migração somática), ficando instaladas em fibras musculares esqueléticas
como larvas L3 hipobióticas (dormentes) (CURY & LIMA, 2002). Ainda não se sabe
ao certo se larvas L3, ou talvez L4, posam ficar dormentes na mucosa intestinal
(PROCIV & CROESE, 1990).
25
1.3. Ancilostomídeos zoonóticos
Como já mencionado, as espécies A. braziliense e A. caninum parasitam o
intestino delgado de canídeos e felídeos. A patologia provocada por estes parasitos
é semelhante a que ocorre na ancilostomose humana, sendo mais aguda em
filhotes, cujo sistema imune é pouco eficiente. As larvas também acarretam danos à
saúde do animal através da penetração cutânea e durante a migração que antecede
à instalação dos vermes adultos no intestino delgado. Nos locais de invasão –
principalmente pele, pulmões e músculos – há uma ação irritativa, levando a um
processo inflamatório. Ao penetrarem na pele, as larvas produzem lesões
pruriginosas e, no pulmão, causam pneumonite hemorrágica (FREITAS, 1977;
CURY & LIMA, 2002; RIBEIRO, 2004).
Além de parasitar o intestino delgado de animais, A. braziliense e A. caninum
provocam a larva migrans cutânea (LMC) em humanos, sendo o A. braziliense o
principal causador dessa zoonose (SCHANTZ, 1991; HENDRIX et al., 1996;
MALGOR et al., 1996; MORRISON, 2001). Isso é parcialmente explicado pela maior
atividade da enzima hialuronidase – uma das enzimas produzidas pela larva que
atuam no processo de invasão – do A. braziliense, quando comparadas às enzimas
produzidas por A. caninum e A. tubaeforme (HOTEZ et al., 1992).
A LMC é uma dermatite provocada pela migração de larvas de nematódeos,
sob a pele, em um hospedeiro não habitual. As larvas de terceiro estádio, presentes
em solos contaminados com fezes de cães e gatos infectados, penetram na pele
humana e migram pelo tecido subcutâneo, não havendo a continuidade de seu ciclo
biológico (SCHANTZ, 1991; MORRISON, 2001). A migração da larva L3 sob a pele
humana provoca erupções serpiginosas, com produção de prurido e áreas de
eritrema (hiperemia da pele). A reação inflamatória local é responsável pelo
26
aparecimento da lesão. Algumas reações podem ser mais graves, provocando
reações alérgicas locais ou generalizadas (DAVIES et al., 1993) e hipereosinofilia
(JELINEK et al., 1994). Além disso, o intenso prurido gerado pode resultar em
escoriações ou infecções secundárias, agravando o quadro.
A doença dura geralmente semanas ou poucos meses, raramente persiste
por mais de um ano, e pode ser tratada. Os tratamentos mais eficientes para essa
doença são de administração oral ou tópica de drogas anti-helmínticas. A maior
vantagem do uso de tratamentos tópicos é a ausência de efeitos colaterais
sistêmicos, entretanto eles são menos eficientes para múltiplas lesões e são
necessárias muitas aplicações diárias durante um longo período (CAUMES, 2000).
Além da LMC, o A. caninum pode causar a enterite eosinofílica humana. Essa
infecção é caracterizada pelo aumento de eosinófilos no sangue periférico, podendo
causar dor abdominal. Parasitos imaturos foram encontrados no intestino delgado de
15 pacientes australianos, sendo que em nenhum caso foi detectado mais de um
verme (PROCIV & CROESE, 1996). Landmann e Prociv (2003) demonstraram,
através de infecção experimental, que a eosinofilia sanguínea é provocada pela
presença de vermes adultos (no intestino delgado), pois a infecção percutânea
produziu inflamação local, mas não provocou aumento no número de eosinófilos no
sangue periférico. Em contrapartida, infecções orais com diferentes doses de larvas
L3, desencadearam significativa eosinofilia sanguínea, além de dor abdominal
moderada. Portanto, a enterite eosinofílica humana é provavelmente provocada pela
ingestão de larvas L3 de A. caninum (LANDMANN & PROCIV, 2003).
27
1.4. Ancilostomose humana
A ancilostomose humana é uma das doenças parasitárias mais prevalentes
do mundo, acometendo 576-740 milhões de pessoas em regiões tropicais e
subtropicais (BETHONY et al., 2006). A maior parte das infecções é causada por N.
americanus, ancilostomídeo predominante na África Subsaariana, sudeste da Ásia e
América, enquanto o A. duodenale é mais restrito geograficamente, sendo endêmico
em regiões da China e Índia (HOTEZ et al., 2004, 2005). Já o A. ceylanicum, que
infecta cães e gatos, pode também infectar humanos, mas esta é considerada uma
ancilostomose de menor importância (HOTEZ et al., 2004) (FIGURA 2).
A patogenia da ancilostomose é uma consequência direta da perda
sanguínea, que ocorre durante a fixação e alimentação dos ancilostomídeos na
mucosa intestinal. Em um grande número de países em desenvolvimento, a
ancilostomose é a principal causa da perda de sangue intestinal, anemia por
deficiência de ferro e desnutrição protéica que, dependendo do estado nutricional do
FIGURA 2: Distribuição e prevalência mundial da ancilostomose. Ilustração: Margaret Shear,
Public Library of Science, adaptado de de Silva et al., 2003
28
hospedeiro e da carga parasitária, podem causar retardo mental e físico, óbitos em
crianças e danos à saúde materno-fetal em mulheres grávidas (DE SILVA et al.,
2003; BROOKER et al., 2004; HOTEZ et al., 2005; WHO, 2005). Além disso, a
espécie causadora da infecção também influencia no grau de debilidade do
hospedeiro, já que o A. duodenale causa cinco vezes mais perda de sangue que o
N. americanus (ALBONICO et al., 1998).
Apesar da importância do diagnóstico diferencial específico da ancilostomose
humana, principalmente nas áreas endêmicas para mais de uma espécie de
ancilostomídeos, habitualmente o diagnóstico é feito através detecção de ovos nas
fezes do hospedeiro, entretanto, os ovos dos ancilostomídeos são indistinguíveis
entre si e muito semelhantes aos de outros estrongilídeos. Alternativamente, o
método de coprocultura – desenvolvimento de larvas L3 a partir dos ovos – pode ser
utilizado, mas este é capaz de identificar apenas o gênero do parasito (REY, 2001;
NEVES, 2003). Estudos recentes baseados em diferentes técnicas de biologia
molecular têm trazido grandes avanços para o desenvolvimento de um diagnóstico
específico para a ancilostomose (revisado por GASSER et al., 2008).
O controle da doença nas regiões endêmicas é feito através do uso drogas
anti-helmínticas, como albendazol, mebendazol, pamoato de pirantel e/ou levamisol
(WHO, 2005; BETHONY et al., 2006). Entretanto, as altas taxas de reinfecção após
o tratamento, a diminuição da eficácia dos anti-helmínticos utilizados devido ao seu
uso frequente e o surgimento de uma possível resistência dos ancilostomídeos a
essas drogas – baseado na experiência com nematódeos de gado (revisado por
WOLSTENHOLME et al., 2004) –, têm demonstrado a necessidade de buscar novas
alternativas, dentre elas, o desenvolvimento de vacinas recombinantes (HOTEZ et
al., 2006). Atualmente, tem sido proposto o desenvolvimento de uma vacina anti-
29
helmíntica multivalente, utilizando antígenos dos dois parasitos, que seja capaz de
combater a ancilostomose e a esquistossomose humanas, devido à similaridade da
patogenia e biologia desses helmintos, à habilidade de ambos em causar anemia
nos seus hospedeiros e à coendemicidade dos parasitos na África Subsaariana,
Brasil e Ásia Oriental (HOTEZ et al., 2008).
1.5. Resposta imune contra ancilostomídeos
A complexidade do ciclo de vida dos ancilostomídeos oferece numerosas
oportunidades para o parasito e o hospedeiro interagirem molecularmente. Assim, o
contato do parasito com suas barreiras críticas, como durante a invasão cutânea e
passagem através dos tecidos pulmonares, bem como durante a chegada e
penetração na mucosa intestinal, expõem o hospedeiro a uma diversidade
antigênica muito grande (LOUKAS & PROCIV, 2001). Alem disso, cada fase de
desenvolvimento do parasito, larvas e adultos, expressa um perfil de proteínas
antigênicas, provocando respostas imunes distintas no hospedeiro (GEIGER et al.,
2007). Esses dois fatores representam um desafio para o sistema imune do
hospedeiro vertebrado.
Os ancilostomídeos geram uma resposta imunológica típica de nematóides
gastrointestinais em seus hospedeiros definitivos. Pacientes infectados por
ancilostomídeos produzem altos níveis de imunoglobulina (Ig) E, com eosinofilia
sistêmica e localizada (pulmões e intestino), se caracterizando como uma resposta
do perfil T helper tipo 2 (Th2) (LOUKAS et al., 2006).
Uma resposta humoral exacerbada é montada contra adultos e larvas de
ancilostomídeos, mas o efeito que esta tem sobre os parasitos ainda não é muito
claro. Ancilostomídeos sobrevivem relativamente bem em um ambiente
30
imunologicamente hostil, onde o ambiente com fenótipo Th2 (com predomínio das
interleucinas IL-4 e IL-5) está associado com proteção parcial do hospedeiro. No
entanto, esta resposta não protege contra reinfecções. Os mecanismos pelos quais
isso ocorre ainda são desconhecidos (LOUKAS et al., 2006). O parasito pode
promover sua sobrevivência secretando agentes imunossupressores e estimulando
o aparecimento de populações T regulatórias (Treg) (PRITCHARD et al., 2007;
RICCI et al., 2011).
Os produtos de excreção e secreção de adultos são potentes moduladores de
citicinas e quimiocinas, especialmente TNFα, que possivelmente atuam como
mecanismo de evasão, prolongando a sobrevida do parasito no hospedeiro
(GEIGER et al., 2007).
Estudos mostram que a infecção por ancilostomídeos tem um efeito
imunomodulatório que pode afetar a resposta imunológica do hospedeiro (homem)
infectado, quando exposto a antígenos exógenos, tais como vacinas. Nesses
estudos foram evidenciados diminuição da resposta linfocitária no sangue periférico
de pacientes (KALINKOVICH et al., 1998; ONYEMELUKWE et al., 2001) e altos
níveis de IL-10 (GEIGER et al., 2004). Entretanto, foi demonstrado que pacientes
recém-curados pelo uso de anti-helmínticos podem recuperar a resposta
imunológica celular contra os ancilostomídeos (GEIGER et al., 2004).
1.6. Vacina para ancilostomose humana e utilização de modelos experimentais
Nos últimos anos, houve um significativo aumento nos esforços para a
produção de uma vacina recombinante eficaz contra ancilostomídeos (HOTEZ et al.,
2003, 2005, 2006; LOUKAS et al., 2006), fundamentada na biologia dos parasitos e
na interação molecular parasito-hospedeiro (ABUBUCKER et al., 2008; DATU et al.,
31
2008; RABELO et al., 2009). Portanto, o desenvolvimento de vacinas recombinantes
envolve o conhecimento da função de várias proteínas do parasito e sua possível
capacidade imunogênica.
Para N. americanus, já foram feitos alguns testes, em hamsters (Mesocricetus
auratus), com proteínas envolvidas na infecção pela larva L3, proteínas envolvidas
no processo de digestão da hemoglobina e antígenos de superfície (XIAO et al.,
2008). Baseado nos resultados encontrados até o momento, acredita-se que a
vacina ideal, para humanos, seja um coquetel contendo dois antígenos, um derivado
da larva infectante (L3) e outro de adulto (LOUKAS et al., 2006).
Estudos já demonstraram que vacinas recombinantes de ASP-2 protegeram
parcialmente cães e/ou hamsters contra infecções por A. caninum (BETHONY et al.,
2005), A. ceylanicum (GOUD et al., 2004; MENDEZ et al., 2005) e N. americanus
(XIAO et al., 2008).
As proteínas Na-ASP-2 (N. americanus - ancylostoma secreted protein 2) e
Na-APR-1 (N. americanus - cathepsin D-like aspartic protease 1), expressas em
larvas L3 e adultos, respectivamente, foram por algum tempo, consideradas, as
principais candidatas a comporem uma vacina recombinante, sendo que Na-ASP-2
passou pela fase 1 de testes em humanos. Embora a vacina recombinante tenha
apresentado uma boa proteção em animais de laboratório (BETHONY et al., 2005) e
bem tolerada imunogenicamente em humanos, vacinados na fase 1 nos EUA
(BETHONY et al., 2008), quando testada em indivíduos de áreas endêmicas no
Brasil, se mostrou extremamente alergênica provocando fortes reações de urticária
nos voluntários (BETHONY et al., 2011). Posteriormente, foi demonstrado que essas
reações de urticária foram associadas com níveis elevados de anticorpos IgE
32
específicos para Na-ASP-2, presentes na população de área endêmica em
decorrência de infecções prévias por ancilostomídeos (BETHONY et al., 2011).
Os ancilostomídeos parasitos de animais – A. caninum, A. ceylanicum e A.
braziliense – são modelos úteis e práticos para o estudo do controle ancilostomose
humana, pois podem ser mantidos em laboratório em linhagens de hamsters, cães
ou gatos (CARROL & GROVE, 1984; MITTRA et al., 1984; GARSIDE & BEHNKE,
1989), assim como a manutenção de N. americanus em hamsters, desde que seja
uma cepa adptada à esses roedores (JIAN et al., 2003a; 2003b), permitindo portanto
a produção de parasitos para estudos moleculares, além de elucidar muitas
questões acerca da infecção e da interação parasito-hospedeiro, que não poderiam
ser reveladas pelas infecções humanas, devido às evidentes limitações
experimentais (revisado por FUJIWARA et al., 2006; SEN et al., 2000; XIAO et al.,
2008).
1.7. Genômica e proteômica dos ancilostomídeos
Várias sequências gênicas e proteínas já foram descritas para
ancilostomídeos, incluindo membros das duas subfamílias, Ancylostominae, com
sequências para A. ceylanicum e, principalmente, para A. caninum, e para a
subfamília Bunostominae, com um grande número de sequências para N.
americanus. São conhecidas 104 mil sequências genômicas de A. caninum, geradas
no projeto genoma do parasito (ABUBUCKER et al., 2008) e existem mais de 80 mil
ESTs (Expressed Sequence Tags) disponíveis no banco de dados de DNA do NCBI
(National Center for Biotechnology Information). Recentemente, foram
disponibilizadas um grande número de sequências para N. americanus (RABELO et
al., 2009; CANTACESSI et al., 2010), totalizando mais de 530 mil sequências
33
disponíveis no banco de dados do NCBI, que ainda foram pouco exploradas, sendo
que destas apenas 169 são sequências completas e a grande maioria são relativas
a diferentes alelos da proteína mitocondrial citocromo oxidase I, utilizada em estudos
de filogenia.
A maior parte das proteínas já estudadas, em ancilostomídeos, está envolvida
no processo de invasão do parasito no hospedeiro, na digestão da hemoglobina
ingerida pelo ancilostomídeo e na proteção do ancilostomídeo contra o sistema
imune e a ação das enzimas digestivas do hospedeiro (HAWDON et al., 2003;
WILLIAMSON et al., 2003; ZHAN et al., 2003), dentre as quais se destacam as ASPs
e os inibidores de serino-proteases tipo Kunitz.
As ASPs (Ancylostoma Secreted Protein) são membros da família de
proteínas SCP/Tpx/Ag5/PR-1/Sc7 (SCP/TAPS) (VAN LOON & VAN STRIEN, 1999),
caracterizada pela presença do domínio Pfam PF00188 (SCP-like), que possui uma
ampla variedade de proteínas, como venenos alérgenos de vespas (LU et al., 1993),
proteínas relacionadas à patogênese em plantas (VAN LOON & VAN STRIEN, 1999)
e glicoproteínas encontradas no testículo e epidídimo de mamíferos
(KRÄTZSCHMAR et al., 1996).
As ASPs são secretadas e específicas de nematódeos e já foram descritas
em nove espécies do Filo (VISSER et al., 2008). Atualmente, já foram descritas
quinze ASPs de várias espécies de ancilostomídeos, sendo que para A. caninum,
foram descritas seis ASPs: duas são expressas apenas por larvas de terceiro
estádio (ASP-1 e ASP-2), duas são expressas apenas por adultos (ASP-5 e ASP-6)
e duas por ambos (ASP-3 e ASP-4) (ZHAN et al., 2003). Além disso, foram
identificadas 25 novas proteínas homólogas a ASPs nos produtos ES de A. caninum
(MULVENNA et al., 2009). Dentre as outras espécies, já foram descritas as ASP-1 e
34
ASP-2 de N. americanus (ZHAN et al., 1999; ASOJO et al., 2005), de A. duodenale
(ZHAN et al., 1999) e A. ceylanicum (GOUD et al., 2004), além das ASP-3, ASP-4 e
ASP-5 de A. ceylanicum (disponíveis no NCBI).
Nas larvas de ancilostomídeos, essas proteínas são abundantes nos
produtos de excreção/secreção (ES) de L3 submetidas à transição para a fase
parasitária. Em particular, as ASP-1 e ASP-2 de A. caninum são duas proteínas
dominantes em tais produtos de L3 soroativadas (HAWDON et al., 1996, 1999) e
estudo recente mostrou um substancial aumento da transcrição das ASPs durante a
fase inicial de transição para o parasitismo em A. caninum, sugerindo a participação
dessas proteínas em um ou mais mecanismos envolvidos na interação parasito-
hospedeiro e/ou desenvolvimento (DATU et al., 2008).
Apesar da eminente importância das ASPs e dos estudos promissores em
relação à vacina, pouco se sabe sobre esse grupo de moléculas e a função das
ASPs em adultos é desconhecida. Entretanto, a presença delas em outros membros
da família e a secreção para o microambiente do hospedeiro sugere que elas sejam
importantes para o parasitismo e/ou sobrevivência do nematódeo no hospedeiro
(ZHAN et al., 2003). Além disso, a estrutura tridimensional da Na-ASP-2 revelou uma
conformação semelhante à adotada por algumas quimiocinas, instigando
especulações sobre uma função imunomoduladora para essa proteína (ASOJO et
al., 2005).
Em estudo recente, foi demonstrado em A. braziliense, a expressão
diferencial em machos de uma EST (Expressed Sequence Tag) similar à Ac-ASP-5,
quando comparados a fêmeas deste parasito (COSTA et al., 2008). Outro estudo
também revelou que algumas ASPs eram diferencialmente transcritas ou expressas
35
em machos de Ostertagia ostertagi, nematódeo parasito de bovinos (VISSER et al.,
2008). Entretanto, a importância biológica desse fato ainda é desconhecida.
Costa e colaboradores (2008) também demonstraram a expressão diferencial
de duas ESTs, similares ao inibidor de serino-proteases tipo Kunitz de A. caninum,
em machos de A. braziliense.
Inibidores tipo Kunitz são proteínas ubíquas entre os eucariotos, que possuem
atividade inibitória contra serino-proteases, podendo conter um ou mais domínios
característicos (cd00109), que contem seis resíduos de cisteína possibilitando a
formação de três pontes dissulfeto (HAWDON et al., 2003; WILLIAMSON et al.,
2003; PEARSON et al., 2012). Para nematódeos, existem 44 proteínas disponíveis
no banco de dados contendo esse(s) domínio(s) (HAWDON, et al., 2003), sendo que
para ancilostomídeos, já foram descritos em A. ceylanicum (MILSTONE et al., 2000),
A. caninum (HAWDON, et al., 2003) e A. duodenale (disponível no NCBI), além de
A. braziliense (COSTA et al., 2008).
Chu e colaboradores (2004) demostraram a atividade inibitória da proteína já
descrita para A. ceylanicum contra três serino-proteases digestivas – tripsina,
quimiotripsina e elastase pancreática – além de inibição contra elastase de
neutrófilos, sugerindo assim que inibidores tipo Kunitz estão envolvidos na proteção
do parasito contra a digestão pelas enzimas do hospedeiro, além de poderem estar
envolvidos na evasão do sistema imune. Além disso, um esaio de vacinação
demonstrou que a ação destes inibidores é um dos fatores envolvidos no atraso de
crescimento do hospedeiro (CHU et al., 2004).
Assim como para as ASPs, estudos já demonstraram que alguns inibidores de
serino-proteases são específicos ou mais expressos em machos de outro
36
nematódeo, neste caso, o parasito de suínos Oesophagostomum dentatum (BOAG
et al., 2002).
Considerando o que já se conhece sobre ASPs e inibidores de proteases tipo
Kunitz, incluindo o perfil macho-específico observado para algumas dessas
proteínas em estudos anteriores, e o grande número de sequências disponibilizadas
recentemente para N. americanus (CANTACESSI et al., 2010), contendo uma alta
quantidade de sequências parciais de asps e genes tipo Kunitz, torna eminente a
possível importância dessas moléculas para a sobrevivência do parasito em seu
hospedeiro. Deste modo, o estudo de inibidores de protease tipo Kunitz e ASPs é de
grande importância para o entendimento da relação parasito/hospedeiro, além de
fornecer potenciais alvos para quimioterapia e desenvolvimento de vacinas.
37
JUSTIFICATIVA
38
2. JUSTIFICATIVA
Apesar do grande impacto da ancilostomose nos países em desenvolvimento,
os estudos moleculares de caracterização e função de proteínas, para membros da
família Ancylostomatidae, ainda são escassos.
Em estudo anterior, cujo objetivo era sequenciar novas ESTs e avaliar a
transcrição diferencial de genes entre machos e fêmeas de A. braziliense, foi
observada maior transcrição de uma EST similar à proteína ASP-5 e duas ESTs
similares ao inibidor de serino-proteases tipo Kunitz, ambos de A. caninum, em
machos de A. braziliense.
Estes resultados, além do grande número de ESTs de ancilostomídeos
depositadas nos bancos de dados de DNA similares a ASPs e inibidores de
proteases, evidenciam a importância dessas moléculas para o parasitismo,
justificando a continuidade do trabalho, a fim de avaliar a transcrição diferencial de
asps e inibidores de proteases tipo Kunitz em outras espécies de ancilostomídeos,
além de confirmar a expressão diferencial de tais genes.
A descoberta da função de novas proteínas é essencial para uma melhor
compreensão dos vários mecanismos de interação entre parasito e hospedeiro,
abrindo-se novas de opções de moléculas alvos para intervenção do ciclo dos
ancilostomídeos, aumentando as possibilidades de controle da doença.
Para isso, faz-se necessário um estudo minucioso de tais proteínas, sendo
necessário que haja não só o conhecimento de suas sequências gênicas e seu
potencial imunogênico, mas também se há diferença de transcrição e expressão
entre os sexos e, em estudos futuros, determinar as implicações fenotípicas
provocadas pelo silenciamento dessas moléculas.
39
Sendo assim, este estudo pretende caracterizar em maior profundidade as
asps e inibidores de proteases tipo Kunitz, nos principais membros da família
Ancylostomatidae, com possíveis desdobramentos para a seleção de novos alvos a
serem usados em programas de vacinação e controle imunoterápicos.
40
OBJETIVOS
41
3. OBJETIVOS
3.1. Geral
• Estudar o perfil de transcrição gênica das proteínas ASPs (Ancylostoma
Secreted Protein) e de transcrição e expressão gênica de inibidores de
proteases tipo Kunitz de ancilostomídeos.
3.2. Específicos
• Obter novas sequências, completas ou parciais, de asps e genes de inibidores
de proteases tipo Kunitz para A. braziliense, A. caninum e A. ceylanicum;
• Identificar prováveis sequências nucleotídicas de ASPs e inibidores de
proteases tipo Kunitz para N. americanus, a partir do banco de dados do NCBI,
em comparação com as sequências já descritas para A. caninum e A.
ceylanicum;
• Analisar a transcrição de ASPs e inibidores de proteases tipo Kunitz de A.
braziliense, A. caninum e A. ceylanicum, para vermes adultos machos e
fêmeas, através da RT-PCR e RT-PCR em tempo real;
• Clonar e expressar os domínios de genes de inibidores de proteases tipo Kunitz
de A. braziliense, A. caninum, A. ceylanicum e N. americanus, para posterior
produção de anticorpos;
• Analisar a expressão de inibidores de proteases tipo Kunitz em A. braziliense,
A. caninum, A. ceylanicum e N. americanus, para vermes adultos machos e
fêmeas, através de Western blot com extrato protéico total e produtos de
excreção e secreção, utilizando soro contra os domínios expressos;
42
• Realizar ensaio vacinal em hamsters, com os domínios de inibidores de
protease tipo Kunitz recombinantes e posterior desafio com A. ceylanicum;
• Avaliar a imunogenicidade dos inibidores de proteases tipos Kunitz, através de
ELISA, com os domínios expressos e soros de cães e hamsters infectados.
43
MATERIAL E MÉTODOS
44
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1. Análise das sequências gênicas de N. americanus
O banco de sequências gênicas de N. americanus foi analisado para se obter
as possíveis sequências gênicas de ASPs e inibidores de proteases tipo Kunitz, que
foram selecionadas a partir do banco de dados dbEST e SRA (Sequence Read
Archive - SRA012052) (CANTACESSI et al., 2010), disponíveis no NCBI, por
homologia aos genes já descritos para A. caninum e A. ceylanicum.
Foram selecionadas todas ESTs similares a asps e genes de inibidores de
protease tipo Kunitz, baseado na similaridade, em aminoácidos, destas com os
genes: asp-4 (número de acesso AY217005), asp-5 (AY217006) e asp-6
(AY217007) de A. caninum; asp-4 (AY423766) e asp-5 (DQ250680) de A.
ceylanicum; tipo Kunitz (um domínio – 1D) de A. ceylanicum (AF172651) e de A.
caninum (12D) (AF533590). Isso foi feito utilizando o Basic Local Alignment Search
Tool program (BLAST) (ALTSCHUL et al., 1990) para ESTs traduzidas (TBLASTX).
A partir das ESTs selecionadas, foram geradas sequências consenso para
asps e genes de inibidores de protease tipo Kunitz, tendo como parâmetros a
sobreposição de 70%, tamanho maior que 40 bases e identidade superior a 94% na
região sobreposta. Com as sequências consenso geradas, foi feita a busca por
domínios conservados – SCP-like (cd05380), para as asps, e KU (cd00109), para os
genes de inibidores de protease tipo Kunitz –, predição de proteínas através do
programa GeneMark™ (BESEMER & BORODOVSKY, 2005), utilizando C. elegans
como modelo, e busca por peptídeo sinal, utilizando o SignalP 4.0 Server
(BENDTSEN et al., 2004).
45
A partir das sequências consenso geradas para prováveis inibidores de
protease tipo Kuintz, foram selecionados alguns domínios KU destas, para desenho
de iniciadores e posterior amplificação e expressão.
4.2. Seleção das sequências gênicas de Ancylostoma ssp.
As sequências gênicas de ASPs e inibidores de proteases tipo Kunitz
analisadas em Ancylostoma ssp. foram obtidas a partir do banco de dados do NCBI.
Foram selecionadas sequências gênicas codificadoras dessas proteínas disponíveis
para adultos de A. caninum e A. ceylanicum e, a partir destas, foram obtidas novas
sequências parciais para as três espécies.
4.3. Obtenção dos parasitos
Os vermes adultos de A. caninum foram obtidos através da necropsia de cães
capturados no perímetro urbano da cidade de Belo Horizonte pelo centro de controle
de zoonose (CCZ) da Secretaria Municipal de Saúde deste município. O sacrifício
dos cães é um procedimento de rotina do CCZ realizado pelos veterinários
responsáveis. Após o sacrifício, os animais foram levados à sala de necropsia para
retirada do intestino delgado. Em seguida, estes órgãos foram transportados em
sacos plásticos ao Laboratório de Parasitologia Molecular, onde foram abertos em
salina 0,85%, seguindo-se a raspagem da mucosa intestinal, para desprendimento
dos vermes adultos fixados e lavagem do conteúdo intestinal em tamis de 0,25 mm.
O material filtrado foi transferido para um recipiente transparente, sob jato de
água, para separação dos vermes adultos machos e fêmeas e posterior
identificação, utilizando um microscópio estereoscópio, sem o uso de fixadores ou
diafanizadores.
46
Os vermes adultos de A. ceylanicum e N. americanus foram obtidos após
necropsia de hamsters (M. auratus) infectados com cepas originárias da George
Washington University, cedidas pelo Dr. Peter Hotez, mantidos pelo Laboratório de
Parasitologia Molecular do Departamento de Parasitologia da UFMG, seguindo as
recomendações do Comitê de Ética em Experimentação Animal da Universidade
Federal de Minas Gerais (CETEA/UFMG), conforme projeto aprovado sob o número
66/2008.
Para manutenção de A. ceylanicum, são inoculadas 50 larvas infectantes (L3)
previamente recuperadas e preparadas, via oral, com auxílio de gavage, no tubo
digestivo superior de hamsters (M. auratus) fêmeas, nascidos no Biotério de
Reprodução do Departamento de Parasitologia (ICB/UFMG), com idades entre
quatro e seis semanas. Os animais são mantidos à temperatura ambiente, em
gaiolas plásticas, em grupos de cinco animais, sendo oferecidas água e ração
comercial para camundongos ad libitum.
Quinze dias após o inóculo, é iniciada a coleta de fezes dos animais
infectados para obtenção de larvas infectantes (L3), através de coprocultura
(ROBERTS & O´SULLIVAN, 1950) e do exame de Baermann Moraes modificado
(BARÇANTE et al., 2003).
A fim de evitar a eliminação espontânea dos vermes adultos, 30 dias após a
infecção os animais são sacrificados com sobredose de anestésico (150 mg/kg de
Thiopental sódico®), conforme recomendações do CETEA/UFMG.
A manutenção de N. americanus é feita em hamsters (M. auratus) machos,
com idades entre seis e oito semanas. Para infecção, 250 larvas infectantes (L3)
previamente preparadas são inoculadas pela via subcutânea, com seringa e agulha
25x7, na região da nuca dos hamsters. Os procedimentos de recuperação de larvas,
47
manutenção e sacrifício dos hamsters são semelhantes aos descritos para A.
ceylanicum, sendo que, neste caso, o sacrifício é feito 60 dias após a infecção.
Após o sacrifício dos hamsters infectados com A. ceylanicum ou N.
americanus, o intestino delgado foi retirado e colocado imediatamente em solução
salina tamponada (PBS, pH 7,4) de onde foram coletados os vermes adultos. Após a
separação e identificação, os parasitos foram incubados em solução salina
tamponada (PBS, pH 7,4) para eliminação de material exógeno aparente presente
na cápsula bucal dos ancilostomídeos.
Os vermes adultos utilizados para extração de RNA foram acondicionados em
tubos de microcentrífuga (1,5 ml) e armazenados em freezer -80ºC até sua
utilização, enquanto os vermes adultos recuperados para a produção de antígenos –
produtos excretados/secretados (ES) e extrato protéico total – foram utilizados logo
após sua recuperação.
Os parasitos adultos machos e fêmeas de A. braziliense utilizados neste
estudo foram obtidos em estudo prévio desenvolvido no Laboratório de Parasitologia
Molecular (COSTA, 2007) e estavam armazenados em freezer -80ºC. Deste modo,
só puderam ser utlizados para extração de RNA e produção de extrato protéico total.
4.4. Extração do RNA total
O RNA total de 10-20 vermes adultos – A. braziliense, A. caninum, A.
ceylanicum e N. americanus – machos e fêmeas separadamente, foi extraído em
tubo de microcentrífuga (1,5 ml) estéril com o auxílio de um pistilo, utilizando 1 ml do
reagente Trizol (GIBCO-BRL) e nitrogênio líquido.
Após a homogeneização tecidual, foi feita uma centrifugação a 12000xg por
10 minutos a 4ºC para sedimentação de produtos indesejáveis como, por exemplo,
48
restos de tecidos. O sobrenadante foi transferido para um novo tubo de
microcentrífuga (1,5 ml) estéril e incubado por 5 minutos a temperatura ambiente.
Decorrido este tempo, 200 µl de clorofórmio foram adicionados aos tubos. Esses
foram agitados vigorosamente por 15 segundos e incubados a 25 ºC por 3 minutos,
seguindo-se uma centrifugação a 12000xg por 15 minutos a 4ºC para separação da
mistura em três fases, sendo a fase superior, incolor, transferida para um novo tubo
de microcentrífuga (1,5 ml) estéril. Nesse tubo foram adicionados 500 µl de álcool
isopropanol para precipitação do RNA. As amostras foram incubadas por 15 minutos
a -20 ºC e posteriormente centrifugadas a 12000xg por 20 minutos a 4ºC. O produto
precipitado foi lavado com 1 ml de etanol 75% acrescido de DEPC (dietil
pirocarbonato) (0,01%) e o RNA foi ressuspendido em água DEPC (0,01%),
proporcionalmente a quantidade inicial de vermes. Posteriormente, as amostras de
RNA foram quantificadas em espectrofotômetro NanoDrop™ (Thermo Scientific) e
armazenadas a -80 ºC.
4.5. Síntese de cDNA total
As amostras de RNA foram submetidas à ação da DNAse I
(Deoxyribonuclease I, Amplification Grade – Invitrogen) para degradação de
possíveis traços de DNA. Essa reação foi realizada em um volume final de 10 µl
contendo 20 mM Tris-HCl (pH 8,4), 2 mM MgCl2, 50 mM de KCl, 0,1 unidade da
DNAse I e 1µg da amostra de RNA, a temperatura ambiente (25ºC) por 15 minutos.
Depois disso, a enzima DNAse I foi imediatamente inativada pela adição de 1µL de
EDTA (25 mM) e incubação a 65ºC por 15 minutos.
Após o tratamento com DNAse, 1 µg de RNA total foi utilizado como molde
para a síntese de cDNA. Essa ocorreu em um volume final de 20 µl contendo 25
49
ng/µl de oligo dT12-18, 500 µM de cada dNTP, 50 mM Tris-HCl (pH 8,3), 75 mM KCl, 3
mM MgCl2, 10 mM de DTT e 200 unidades da transcriptase reversa (SuperScript™ II
Reverse Transcriptase - Invitrogen), com incubação a 42ºC por 50 minutos.
Posteriormente, a enzima foi desnaturada a temperatura de 70ºC por 15 minutos.
Simultaneamente, foram preparados controles de transcrição sem adição da enzima
transcriptase reversa (SuperScript™ II Reverse Transcriptase - Invitrogen) para
atuarem como controle negativo.
4.6. Comparação transcricional entre vermes adultos machos e fêmeas de
ancilostomídeos
4.6.1. RT-PCR e RT-PCR em tempo real
Para amplificação de asps e genes codificadores de inibidores de protease
tipo Kunitz das três espécies de Ancylostoma, foram desenhados iniciadores
baseados nas sequências de A. caninum e A. ceylanicum disponíveis no banco de
dados do NCBI, utilizando o programa Primer Express® v2.0 (Applied Biosystems,
EUA).
Pares de oligonucleotídeos (direto e reverso) foram feitos para os genes: asp-
4 (AY217005), asp-5 (AY217006) e asp-6 (AY217007) de A. caninum; asp-4
(AY423766) e asp-5 (DQ250680) de A. ceylanicum; tipo Kunitz (1D) de A.
ceylanicum (AF172651) e de A. caninum (12D) (AF533590). Para o RT-PCR em
tempo real, os iniciadores foram desenhados/combinados para gerar fragmentos
menores que 150 pb. Todos os iniciadores e tamanhos dos respectivos fragmentos
estão listados no APÊNDICE A. Foram desenhados também dois pares de
iniciadores para o gene asp-3 (AY217004) de A. caninum, mas estes não
50
amplificaram o cDNA. Por este motivo, não foram desenhados iniciadores para o
gene asp-3 (AY423765) de A. ceylanicum.
O cDNA anteriormente sintetizado foi submetido à uma RT-PCR para
amplificar as sequências selecionadas, verificando assim a transcrição de tais genes
em vermes adultos machos e fêmeas de A. braziliense, A. caninum e A. ceylanicum.
As reações foram feitas em um volume final de 10 µl contendo 10 mM Tris-
HCl pH 8,4, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 0,1% Triton®X-100, 200 µM de cada dNTP,
0,6 µM de cada um dos dois iniciadores e 0,5 unidades de Taq DNA Polimerase
(Phoneutria, MG, Brasil). Como alvo da amplificação, foram utilizados 1 µl de cDNA
de machos ou fêmeas de A. braziliense, A. caninum e A. ceylanicum. A reação foi
executada em um termociclador sob as seguintes condições: um passo inicial de
95ºC por 3 minutos para desnaturação, seguido por 30 ciclos de 95ºC por 1 minuto
para nova desnaturação, 60ºC por 1 minuto para anelamento e 72ºC por 1 minuto
para extensão, realizando-se posteriormente um passo com 72ºC por 7 minutos para
extensão final. Os produtos dessa amplificação foram analisados em gel de agarose
1% acrescido de brometo de etídio (0,5 µg/ml).
As amostras de cDNA foram também amplificadas utilizando Power SYBR®
Green PCR Master Mix (Applied Biosystems), composto pelo marcador SYBR®
Green I, AmpliTaq Gold® DNA Polimerase, dNTPs, referência passiva e tampão
otimizado. As reações ocorreram em um volume final de 25 µl contendo Power
SYBR® Green PCR Master Mix (Applied Biosystems) 1X, 0,45 µM de cada iniciador
e 1 µl de cDNA, além de água deionizada. As reações foram realizadas em duplicata
para todas as amostras e reações sem cDNA (contendo água) foram utilizadas como
controle negativo. Três réplicas biológicas foram feitas para todos os genes
avaliados.
51
As reações foram feitas no sistema de PCR em tempo real ABI PRISM
7900HT, em placas de polipropileno para 96 amostras cobertas por adesivos
ópticos, todos da empresa Applied Biosystems. As condições de amplificação foram:
95°C por 10 minutos para ativação da AmpliTaq Gold® DNA Polimerase, seguido de
40 ciclos com 95°C por 15 segundos para desnaturação, 60°C por 45 segundos para
anelamento dos iniciadores e 72°C por 30 segundos para extensão. O estágio de
dissociação foi adicionado ao programa para que sejam feitas análises de
amplificação específica ao término das reações. O método 2-∆∆Ct foi utilizado para
determinar a quantidade relativa dos transcritos (LIVAK & SCHMITTGEN, 2001).
O gene da proteína ribossomal 60S (TRIVEDI & ARASU, 2005) foi utilizado
como controle interno na RT-PCR e RT-PCR em tempo real, para todas as espécies.
4.6.2. Sequenciamento e análise das sequências
Os amplicons produzidos foram sequenciados segundo método descrito
originalmente por Sanger e colaboradores (1977). Para isso, os fragmentos
amplificados foram purificados para remoção de produtos indesejáveis como
nucleotídeos e iniciadores não incorporados, utilizando o kit GFX® (GE Healthcare)
conforme instruções do fabricante.
As reações de sequenciamento foram feitas utilizando-se o DYEnamic™ET
dye terminator kit MegaBACE™ (GE Healthcare) e ocorreram em placas (96 poços)
com um volume final de 10 µl contendo 0,5 µM do iniciador direto ou reverso, 100 ng
do fragmento de DNA purificado, 4 µl de ETkit (pré-mix para sequenciamento) e
água pura suficiente para completar o volume. As reações foram realizadas em um
termociclador com 30 ciclos de 95ºC por 20 segundos, 55ºC por 15 segundos e 60ºC
por 1 minuto. Posteriormente, os nucleotídeos não incorporados foram retirados,
adicionando-se 1 µl de acetato de amônio (7,5 M) e 25 µl de etanol 95% e, após
52
incubação a 25ºC por 15 minutos, foi feita centrifugação a 4000xg por 45 minutos a
25ºC. O sobrenadante foi descartado e 150 µl de etanol 70% adicionado às
amostras seguindo-se uma centrifugação a 4000xg por 15 minutos a 25ºC. O
sobrenadante foi descartado e o sedimento re-dissolvido por agitação em vortex com
10 µl do tampão de solubilização contendo 70% de formamida e 1 mM de EDTA.
Os produtos do sequenciamento foram submetidos à leitura no sequenciador
automático capilar MegaBACE 1000™ com uma injeção de 2 kV por 100 segundos e
corrida de 6 kV por 240 minutos. Cada amostra foi sequenciada duas vezes, nos
dois sentidos – direto e reverso.
O alinhamento e geração de sequências consenso foram feitos utilizando-se
os softwares Phred v.0.20425 (EWING et al., 1998; EWING & GREEN, 1998), Phrap
v.0.990319 (http://www.phrap.org) e Consed 12.0 (GORDON et al., 1998). As
sequências nucleotídicas foram comparadas às disponíveis no banco de dados não
redundante do GenBank, utilizando o Basic Local Alignment Search Tool program
(BLAST 2.0) (ALTSCHUL et al., 1990) para nucleotídeos (BLASTN), peptídeos
(BLASTX) ou ESTs traduzidas (TBLASTX), disponíveis no NCBI
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST).
As sequências obtidas foram traduzidas com o auxílio do programa MEGA -
versão 4.0 (TAMURA et al., 2007) e estas sequências de aminoácidos, preditas a
partir do cDNA, foram examinadas quanto a presença de domínios conservados,
utilizando a ferramenta de busca “Conserved Domain’’ do NCBI
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi).
53
4.7. Comparação da expressão protéica de inibidores de protease tipo Kunitz
entre vermes adultos machos e fêmeas de ancilostomídeos
A comparação do perfil de expressão de inibidores de protease tipo Kunitz
entre machos e fêmeas de A. braziliense, A. caninum, A. ceylanicum e N.
americanus será feita a partir da expressão do domínio conservado KU (cd00109)
presente nas sequências selecionadas.
4.7.1. Obtenção dos domínios KU
A partir das sequências nucleotídicas dos inibidores de protease tipo Kunitz
previamente selecionadas/obtidas para A. braziliense, A. caninum, A. ceylanicum e
N. americanus, foram desenhados iniciadores para amplificação dos domínios KU
dessas sequências (APÊNDICE B).
O cDNA anteriormente sintetizado para A. braziliense, A. caninum, A.
ceylancium e N. americanus foi submetido à uma RT-PCR para amplificação dos
domínios KU, assim como descrito anteriormente.
4.7.2. Clonagem e transformação
Os fragmentos amplificados foram clonados no vetor pGEM®-T Easy
conforme protocolo do kit pGEM®-T Easy Vector Systems (Promega, EUA). Uma
alíquota de 2 µl do produto de ligação foi submetida a termo-transformação em 30 µl
de bactérias E. coli XL1-blue quimiocompetentes (Phoneutria, MG, Brasil). As
amostras foram transformandas com incubação em gelo por 10 minutos, seguida de
um choque térmico por um minuto e meio a 42ºC e nova incubação em gelo por dois
minutos.
As células bacterianas potencialmente transformadas foram incubadas por 1
hora a 37ºC em 500 µl de meio circlegrow® (MP Biomedicals) líquido pH 7,0, com
54
posterior plaqueamento das mesmas em meio circlegrow® (MP Biomedicals) sólido
seletivo, contendo ampicilina (100 µg/ml), IPTG (100 mM) e X-GAL (500 µg/ml). As
placas foram incubadas a 37ºC por 16 horas.
A presença dos insertos de interesse nos plasmídeos recombinantes foi
confirmada por meio de uma reação de PCR utilizando diretamente uma pequena
amostra de algumas colônias brancas retirada com o auxílio de um palito de madeira
estéril e transferida para um tubo de reação contendo 10 mM Tris-HCl (pH 8.4), 50
mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 0,1% Triton®X 100, 200 µM de cada dNTP, 0,6 µM dos
iniciadores M13 direto (5’CGC CAG GGT TTT CCC AGT CAC GAC3’) e reverso
(5’TCA CAC AGG AAA CA G CTA TGA C3’), ou dos iniciadores específicos, e 0,5
unidade de Taq DNA Polimerase (Phoneutria, MG, Brasil) em um volume final de 10
µl. Da mesma forma, foram preparadas reações de PCR com colônias azuis que
funcionaram como controle positivo da reação de PCR para verificar a eficiência da
clonagem. Os produtos da amplificação foram visualizados em gel de agarose 1%
acrescido de brometo de etídio (0,5 µg/ml).
4.7.3. Extração do DNA plasmidial
Após a confirmação da presença dos insertos recombinantes esperados pela
PCR de colônia, foram inoculadas, com o auxílio de palitos de madeira estéreis,
fragmentos destas colônias em placas de cultura de 96 poços contendo 1,2 ml de
meio de cultura circlegrow® (MP Biomedicals) líquido acrescido de ampicilina (100
µg/ml) em cada poço. As placas foram incubadas por 22 horas, a 37ºC, sob agitação
constante (250 rpm – incubadora refrigerada com agitação TECNAL modelo TE-
421). Decorrido este prazo, as amostras foram centrifugadas a 4000xg por 6 minutos
a 25ºC para sedimentação das células. O sobrenadante foi descartado e 240 µl de
solução aquosa GET (0,9% glicose, 0,01% EDTA pH 8, 26 mM Tris-HCl pH 7,4)
55
adicionados em cada poço para ressuspensão das células em agitador vortex por 2
minutos. As amostras foram centrifugadas a 4000xg por 9 minutos a 25ºC. O
sobrenadante foi descartado e 80 µl de solução aquosa GET adicionados em cada
poço, sendo as células re-suspendidas por agitação em vortex. A suspensão de
células foi transferida para uma microplaca (96 poços) de polipropileno com fundo
redondo, com capacidade para 250 µl. Foram adicionados em cada poço 80 µl de
NaOH 0,2 N e SDS 10%, seguindo-se incubação das amostras por 10 minutos a
25ºC. Foram acrescentados em cada poço 80µl de acetato de potássio 3 M com
posterior homogeneização do conteúdo por inversão da placa (30 vezes), a qual foi
incubada por 10 minutos a 25ºC e, subseqüentemente, a 90ºC por exatos 30
minutos, seguido de resfriamento em gelo picado por 10 minutos. As amostras foram
centrifugadas à 4000xg por 9 minutos a 20ºC.
Finalmente, uma placa Millipore foi fixada, com fita adesiva, no topo de uma
microplaca de fundo em “V” de polipropileno com capacidade para 250 µl, para
filtração das amostras. Após a realização deste procedimento, todo o volume do
sobrenadante foi transferido para a placa Millipore, evitando-se transferir os debris
celulares. As amostras foram centrifugadas a 4000xg, por 6 minutos a 20ºC, e 100 µl
de isopropanol adicionado ao produto da centrifugação. Essas foram novamente
centrifugadas a 4000xg por 45 minutos a 20ºC, e o precipitado lavado com 200 µl de
etanol 70% gelado onde foram submetidas a uma última centrifugação a 4000xg, por
10 minutos a 20ºC, seguindo-se o descarte do sobrenadante. As amostras ficaram
em repouso à temperatura ambiente por 20 minutos para evaporação de etanol
residual. Posteriormente, as amostras foram ressuspendidas em 30µl de água isenta
de nucleases e alíquotas foram analisadas por eletroforese em gel de agarose 0,8%
56
acrescido de brometo de etídio (0,5 µg/ml), para verificar a eficiência da extração
plasmidial e ausência de RNA.
As amostras foram sequenciadas, como já descrito anteriormente, para
certificação da identidade e integridade das sequências amplificadas e clonadas.
4.7.4. Expressão de proteínas
Após as análises das sequências codificadoras dos domínios clonadas no
vetor pGEM®-T Easy, as sequências dos domínios selecionados foram inseridas no
vetor pJexpress414 pela empresa DNA 2.0, utilizando o códon otimizado par
expressão em E. coli. Foram adicionadas às sequências codificadoras dos domínios,
sítios para as enzimas de restrição NdeI (CATATG) e XhoI (CTCGAG) nas
extremidades C e N-terminal, respectivamente, além de sequência codificadora para
seis resíduos de histidina e o códon de terminação TAA na extremindade N-terminal
(APÊNDICE C).
Os vetores sintetizados foram eluídos segundo instruções do fabricante e
quantificados em espectrofotômetro NanoDrop™ (Thermo Scientific). Estes
plasmídeos foram termo-transformados em bactérias E. coli XL1-blue
quimiocompetentes (Phoneutria, MG, Brasil) para posterior criopreservação em
freezer -80 ºC e transformados por eletroporação em bactérias E. coli BL21 (DE3)
para expressão.
As bactérias E. coli BL21 (DE3) eletro-transformadas foram incubadas por 1
hora a 37ºC em 500 µl de meio circlegrow® (MP Biomedicals) líquido, com posterior
plaqueamento das mesmas em meio circlegrow® (MP Biomedicals) sólido seletivo,
contendo ampicilina (100 µg/ml). As placas foram incubadas a 37ºC por 16 horas.
A indução da expressão em pequena escala foi realizada para a padronização
das melhores condições de expressão e lise bacteriana que seriam aplicadas na
57
expressão em larga escala. As colônias selecionadas foram inoculadas em tubos de
15 ml contendo 5 ml de meio de cultura líquido circlegrow® (MP Biomedicals)
suplementado com ampicilina (100 µg/ml) e, em seguida, foram incubadas por
aproximadamente 16 horas a 37ºC sob agitação constante (150 rpm - incubadora
refrigerada com agitação TECNAL modelo TE-421). Posteriormente, 500 µl desta
cultura foram inoculados em tubos de 50 ml contendo 15 ml de meio de cultura
líquido circlegrow® (MP Biomedicals) suplementado com ampicilina (100 µg/ml) e
incubados a 37ºC sob agitação constante (150 rpm - incubadora refrigerada com
agitação TECNAL modelo TE-421) até atingir a densidade ótica (A600nm) 0,4-0,6. Em
seguida, foi retirada uma alíquota de 1 ml da cultura e adicionado 0,5 ou 1 mM do
indutor IPTG. Essa indução foi realizada durante 4 horas, retirando-se alíquotas a
cada hora. As alíquotas foram submetidas à leitura da densidade ótica (A600nm) para
verificar o crescimento das bactérias em cultura. Após as 4 horas, o restante da
cultura foi centrifugado a 8000 xg, 20 min, 4ºC, sendo o sobrenadanate descartado.
Além da padronização da indução da expressão, foi feita a padronização da
lise bacteriana. O precipitado de bactérias foi ressuspenso em 500 µl de tampão de
lise (20 mM fosfato de sódio; 20 mM imidazol) com e sem NaCl (0,5 M) e transferido
para um tubo de 1,5 ml. Para rompimento das bactérias, foi feita a adição de
lisozima (0,5 mg/ml) com posterior incubação de 15 min a temperatura ambiente.
Logo após, foi feito choque térmico com congelamento a -80ºC e descongelamento a
37 ºC, sendo repetido por duas vezes. Em seguida, foi feita nova incubação com
lisozima (0,5 mg/ml), 15 min a temperatura ambiente, com posterior sonicação,
utilizando aparelho de ultrassom (Branson Sonc Power – Sonofer Cell Disruptor
450), sendo realizados três ciclos de 15 segundos, com intervalos de 15 segundos
em banho de gelo, com amplitude de 30%, com posterior centrifugação a 11000 xg,
58
4°C, por 15 minutos. O sobrenadante foi separado e o precipitado foi tratado com
sarcosil, para facilitar a solubilização, caso a proteína fosse insolúvel. Também foi
realizado protocolo sem o choque térimco -80ºC/37ºC, sendo que a sonicação por
ultrassom foi feita entre as duas incubações com lisozima.
O precipitado foi ressuspenso em 500 µl de tampão de lise com sarcosil
(1,5%) e incubado 5 min a temperatura ambiente. Após esta incubação, foi feita
nova sonicação com três ciclos de 15 segundos, com intervalos de 15 segundos em
banho de gelo, com posterior centrifugação a 14000xg, 4°C, por 5 minutos para
retirada do sobrenadante.
Foram retiradas alíquotas da cultura bacteriana antes da indução da
expressão (T0h), após 4 horas de crescimento da cultura (T4h) e do sobrenadante
antes do tratamento com sarcosil e após o tratameto com sarcosil, nos diferentes
protocolos utilizados. As alíquotas das culturas foram centrifugadas a 12000xg, 3
min e o sobrenadante descartado. O precipitado das culturas e as alíquotas de
sobrenadante antes e após o tratamento com sarcosil foram diluidos em tampão da
amostra SDS-PAGE (SDS 10%; Tris-HCl 0,5 mM pH 6,8; azul de Bromofenol 1%; 2-
β-mercaptoetanol 5%; glicerol 10%) e incubados a 95ºC, 5 min. Esses produtos
foram analisados em gel de poliacrilamida SDS 12% corrido em tampão tris-glicina
1X, e corado por coomassie blue (Coomassie Brilhant Blue G-250 0,25%; metanol
50%; ácido acético 10%).
Após os testes de expressão em pequena escala, foi feita expressão em larga
escala utilizando 0,5 mM do indutor IPTG, incubação de 4 h, sendo a lise bacteriana
feita com tampão de lise sem NaCl, ausência de choque térmico, não sendo
necessário o tratamento posterior com sarcosil, pois as proteínas expressas eram
solúveis. Para expressão em larga escala, foi utilizado um inóculo de 20 ml de
59
cultura para cada 1000 ml de meio circlegrow® (MP Biomedicals) contendo
ampicilina (100 µg/ml). Após as 4 horas de indução, a cultura foi centrifugada – 8000
xg, 20 min, 4ºC – para descarte do meio de cultura e as bactérias foram
ressuspensas em 20 ml de tampão de lise.
4.7.5. Purificação e confirmação da expressão de proteínas
O lisado protéico produzido após a indução da expressão das proteínas
(domínios KU) foi purificado por cromatografia de afinidade por níquel utilizando o
cromatógrafo FPLC (Fast Protein Liquid Chromatography) multidimensional ÄKTA
Prime® (GE Healthcare) e coluna HisTrap HP de 1 ml (GE Healthcare). Após
algumas padronizações, a purificação foi realizada com o tampão de corrida (20 mM
fosfato de sódio; 20 mM imidazol) e tampão de eluição (20 mM fosfato de sódio; 500
mM imidazol), com fluxo de um ml/min durante a corrida e 0,7 ml/min durante a
injeção, com injeção de 10 ml de lisado bacteriano a cada corrida.
Alíquotas das frações da eluição com picos de absorbância a 280 nm, além
de algumas frações do descarte, foram analisadas em gel de poliacrilamida SDS
12% corrido em tampão tris-glicina 1X, e corado por coomassie brillante blue R250,
para certificação da purificação dos domínios KU recombinantes.
Após a purificação, as frações contendo os domínios KU recombinantes foram
concentradas em tubos Vivaspin 20 5 kDa MWCO (GE Healthcare) e/ou Vivaspin
500 5 KDa MWCO (GE Healthcare) até redução de 90-95% do volume.
Os domínios KU recombinantes concentrados foram analisados em gel de
poliacrilamida SDS 12%, corado por coomassie brillante blue R250, e pela técnica
de Western blot para confirmação da identidade da proteína induzida.
As amostras foram submetidas à eletroforese em gel SDS-PAGE 12% com
tampão tris-glicina 1X. Posteriormente, as proteínas foram transferidas para uma
60
membrana de PVDF (Amersham Hybond™-P – GE Healthcare), previamente tratada
seguindo instruções do fabricante, em sistema semi-úmido (Semi-dry blot cell
transfer – Bio-Rad, EUA), a 20 V por 40 minutos, utilizando tampão contendo 20%
de metanol, 18,5 µM de tris-base e 0,14 M de glicina. A membrana foi incubada com
tampão PBST (PBS 1X + 0,05% Tween 20) contendo 5% de leite em pó desnatado
(Molico® – Nestlé) por aproximadamente 16 horas, para bloqueio de sítios
inespecíficos pela proteína caseína presente no leite. Em seguida, foi lavada três
vezes, com intervalos de 5 minutos, com PBST, para incubação, por 1 h, com o
anticorpo primário que reconhece a cauda de histidina (Anti-His(C-term) Antibody –
GE Healthcare), diluído 1:2000 em tampão PBST.
Após três lavagens com PBST, a membrana foi exposta ao anticorpo
secundário contra IgG de camundongo (Anti-mouse IgG Peroxidase – Sigma, EUA),
diluído na concentração de 1:2.000 em tampão PBST, por 1 h. A membrana foi
lavada três vezes com tampão PBST e revelada com solução contendo 0,5 mg/ml de
diaminobenzidina (DAB), 0,25 mg/ml de 4-cloronaftol (0,25 mg/ml), 8% de metanol e
0,042% de H2O2 30V, diluídos em PBS 1X.
4.7.6. Produção de anticorpo policlonal
As sequências de aminoácidos dos domínios KU expressos (AyD1, AbD2,
AcD5 e Na16D1) foram submetidas à predição de epitopos lineares de célula B,
utilizando o programa BepiPred (LARSEN et al., 2006), para verificar se a
imunização com estes domínios poderia induzir a produção de anticorpos contra os
mesmos. Nesta análise, foi utilizado um valor de corte de 0,35, que fornece 50% de
especificidade e sensibilidade.
Para a produção de anticorpos policlonais contra os quatro domínios KU
recombinantes produzidos, três camundongos da linhagem Balb/c foram usados
61
para cada ensaio de imunização. Antes da imunização, foram retirados
aproximadamente 200 µl de sangue de cada camundongo, pelo plexo orbital, para
ser o controle pré-imune.
A primeira imunização foi feita com injeção subcutânea de aproximadamente
25 µg de proteína recombinante diluída em adjuvante de Freund completo (Sigma,
EUA) em um volume final de 200 µl. Outras duas imunizações foram feitas utilizando
a mesma quantidade de proteína diluída em adjuvante de Freund incompleto
(Sigma, EUA), totalizando um volume final de 200 µl. O intervalo entre as
imunizações foi de duas semanas e, após 10 dias da última imunização, foi feita a
sangria de todos os animais, através do plexo orbital. O soro foi obtido através da
centrifugação do sangue coletado, a 3000xg por 5 min, e armazenado a -20ºC até o
momento do uso.
Os soros dos quatro grupos imunizados foram testados, por Western Blot,
como descrito anteriormente, contra os quatro domínios recombinantes, sendo
utilizado 0,5 µg de proteína recombinante e o soro dos camundongos imunizados
diluído na concentração de 1:250 em tampão PBS 1X 0,05% Tween 20.
4.7.7. Obtenção de proteínas excretadas/secretadas e extrato protéico total
Para a obtenção dos produtos excretados/secretados (ES) de machos e
fêmeas de A. caninum, A. ceylanicum e N. americanus, os parasitos foram lavados
com solução salina tamponada (PBS, pH 7,4), logo após sua retirada da mucosa
intestinal dos hospedeiros. Em seguida, os parasitos foram lavados por mais três
vezes com solução salina tamponada (PBS, pH 7,4) estéril e três vezes com meio de
cultura RPMI 1640 (desenvolvido pelo Instituto Roswell Park Memorial – Sigma,
EUA), suplementado com antibiótico/antimicótico 1X (Sigma, EUA) e 1,6% de l-
glutamina (Synth, BRASIL), em capela de fluxo laminar, para retirar possíveis
62
dendritos contaminando os vermes e evitar a contaminação da cultura, por bactérias
presentes nos parasitos.
Após a lavagem, os vermes foram transferidos para tubos de 50 ml contendo
meio de cultura RPMI 1640 (desenvolvido pelo Instituto Roswell Park Memorial –
Sigma, EUA), suplementado com antibiótico/antimicótico 1X (Sigma, EUA) e 1,6% de
l-glutamina (Synth, BRASIL), numa taxa de 10-15 vermes por mililitro, e incubados
em estufa a 37ºC e 5% de gás carbônico durante 3-6 dias, dependendo das
condições dos vermes em cultura. A cada 12 h, aproximadamente, o meio da cultura
era renovado, sendo que o sobrenadante contendo meio de cultura e os produtos
ES produzidos foram retirados e armazenados a -20ºC. Ao final da incubação, os
sobrenadantes coletados foram agrupados em tubos de 50 ml e os parasitos
armazenados a -20ºC para a produção do extrato protéico total. Todos os
procedimentos feitos durante a cultura ocorreram em capela de fluxo laminar para
evitar contaminação.
O meio de cultura coletado contendo os produtos ES produzidos pelos
parasitos foi centrifugado por 10 min, 1500xg, 4ºC, para retirada de ovos, restos
celulares ou outras partículas que pudessem estar em suspensão. Em seguida, o
sobrenadante foi transferido para um tubo Vivaspin 20 5kDa MWCO (GE Healthcare)
para concentração dos produtos ES, seguindo instruções do fabricante, até redução
para 1-5% do volume inicial. Os produtos ES concentrados foram aliquotados em
tubos de 1,5 ml e armazenados a -80ºC até sua utilização.
O extrato protéico total de vermes adultos machos e fêmeas foi obtido através
da maceração manual dos parasitos, com auxílio de pistilo de vidro, suspensos em
5-15 µl de PBS (pH 7,4) por verme, em tubos de microcentrífuga (1,5 ml). Em
seguida, o extrato bruto foi sonicado utilizando aparelho de ultrassom (Branson Sonc
63
Power – Sonofer Cell Disruptor 450), sendo realizados cinco ciclos de 30 segundos,
com intervalos de 30 segundos em banho de gelo, com amplitude de 40%, com
posterior centrifugação a 3000xg, 4°C, por 15 minutos. O sedimento foi descartado e
o extrato bruto solúvel foi aliquotado em tubos de 1,5 ml e armazenado a -80°C até o
seu uso.
Os antígenos produzidos (produtos ES e extrato protéico total) foram
submetidos à dosagem de proteínas utilizando o kit BCA® (Pierce, EUA), conforme
recomendações do fabricante. Foi feita também a estimativa da quantidade de
proteínas através da dosagem por espectrofotômetro (A260nm e A280nm) utilizando a
fórmula: (mg/ml) = 1,55. A280nm – 0,76 A260nm (HARRIS & BASHFORD, 1987).
Os produtos ES (2 µg) e o extrato protéico total (5 µg) foram submetidos à
eletroforese em gel de poliacrilamida SDS 12% corrido em tampão tris-glicina 1X,
posteriormente corados por nitrato de prata, para visualização dos perfis protéicos
de produtos ES e extratos totais de machos e fêmeas das quatro espécies de
ancilostomídeos. Para a coloração, o gel foi fixado à temperatura ambiente por 30
min em solução aquosa contendo 50% metanol e 12% ácido acético, seguindo-se
três lavagens de 10 min com solução aquosa 50% etanol, com posterior incubação
em solução aquosa de tiossulfato de sódio 0,02% por 1 min. O gel foi lavado três
vezes com água destilada e posteriormente imerso em solução aquosa de nitrato de
prata 0,2% por 20 min, sendo novamente lavado e revelado com solução aquosa
contendo 6% carbonato de sódio, 0,05% formaldeído e 0,0004% tiossulfato de sódio
. A reação foi interrompida com água destilada.
4.7.8. Caracterização do perfil protéico por “Western blot”
O perfil de proteínas que contenham os domínios conservados KU, do extrato
protéico total de vermes adultos machos e fêmeas de A. braziliense, A. caninum, A.
64
ceylanicum e N. americanus e de proteínas excretadas/secretadas de machos e
fêmeas de A. caninum, A. ceylanicum e N. americanus, foi analisado frente ao soro
obtido nos quatro ensaios de imunização, através da técnica de Western blot, como
já descrita anteriormente.
Para isso, foram realizadas algumas padronizações a fim de se estabelecer a
melhor quantidade de antígenos a ser utilizado (10, 15, 20, 25 ou 50 µg), bem como
as concentrações (1:100, 1:250 e 1:500) e tempos de incubação (1h, 1:30h, 2h a
temperatura ambiente ou 1h+16h temperatura ambiente + 4ºC) dos soros anti-
domínios KU. Sendo assim, 25 µg do extrato protéico total e 15 µg dos produtos ES
de vermes adultos machos e fêmeas, separadamente, das quatro espécies foram
submetidos à eletroforese em gel de poliacrilamida SDS-PAGE 12% e transferidos
para membrana de PVDF (Amersham Hybond™-P – GE Healthcare). Essa
membrana foi incubada com o soro anti-domínio KU por 1 h, para produtos ES, ou 2
h, para os extratos protéicos totais, na diluição de 1:250 ou 1:100, respectivamente,
conforme previamente padronizado.
Este procedimento foi feito para todos os soros provenientes das imunizações
com os domínios recombinantes KU e 0,5 µg destes recombinantes foram usados
como controle. O soro pré-imune foi usado como controle negativo do experimento,
sob as mesmas condições descritas anteriormente.
4.8. Ensaio de vacinação de hamsters
Para avaliar o potencial imunogênico protetor dos domínios KU
recombinantes contra a infecção por ancilostomídeos, bem como a possibilidade de
interferir no curso da infecção, como alterando a proporção de vermes adultos
65
machos e fêmeas, e a postura de ovos foi realizado ensaio de vacinação de
hamsters com estas proteínas.
4.8.1. Imunização e desafio
Para este ensaio, 28 hamsters (M. auratus) fêmeas, nascidos no Biotério de
Reprodução do Departamento de Parasitologia (ICB/UFMG), com cinco semanas de
idade, foram divididos em quatro grupos experimentais para vacinação com o
domínio recombinante de A. ceylanicum AyD1 e uma mistura (mix) dos quatro
domínios KU expressos (AyD1, AbD2, AcD5 e Na16D1), além dos grupos controles,
como descrito no QUADRO 3:
Grupo experimental
Quantidade de animais Imunizações
1 – controle (PBS) 7 200 µl PBS 1X
2 – Adjuvante 7 100 µl PBS 1X + 100 µl adjuvante de Freud
3 – Mix 7 mix 4 rKU em PBS 1X (100 µl) + 100 µl adjuvante de Freud
4 – AyD1 7 rAyD1 em PBS 1X (100 µl) + 100 µl adjuvante de Freud
Antes da imunização, foram retirados aproximadamente 500 µl de sangue, por
punção do plexo orbital, utilizando colírio anestésico (Cloridrato de proximetacaína
0,5%) e seringas de vidro contendo EDTA (0,5 M), de dois hamsters de cada grupo
que foram usados como controle de soro pré-imune.
Os hamsters dos grupos 3 e 4 receberam três inóculos, com intervalos de
duas semanas, de injeções subcutâneas de 25 µg de proteínas (XIAO et al., 2008)
diluídos em PBS 1X e adjuvante de Freund completo (Sigma, EUA) (1ª dose) e
QUADRO 3: Grupos experimentais de hamsters para imunização com domínios KU
recombinantes.
66
incompleto (2ª e 3ª doses). Além destes, outros hamsters foram imunizados com
PBS 1X (grupo 1) e adjuvante de Freund (grupo 2), para servirem como controles do
ensaio de vacinação, seguindo o mesmo esquema de vacinação dos grupos 3 e 4.
Os animais foram mantidos no biotério do Laboratório de Parasitologia
Molecular do Departamento de Parasitologia da UFMG, à temperatura ambiente, em
gaiolas plásticas, sendo oferecidas água e ração comercial para camundongos ad
libitum.
Após sete dias da última imunização, os hamsters foram pesados e foram
coletados aproximadamente 500 µl de sangue de todos os animais que foram
posteriormente desafiados com 100 larvas infectantes (L3) de A. ceylanicum, como
descrito anteriormente.
Uma semana após o desafio, foi iniciada pesagem semanal dos hamsters e a
coleta de fezes dos animais infectados para realização do exame de fezes,
contagem de ovos por grama de fezes (OPG), utilizando câmara de McMaster
(GORDON & WHITLOCK, 1939), a cada dois dias. As fezes foram coletadas durante
a noite (cerca de 12 horas) em gaiolas próprias, por grupo experimental. Após o
exame de OPG, as fezes da última coleta foram submetidas à coprocultura
(ROBERTS & O´SULLIVAN, 1950) e exame de Baermann Moraes modificado
(BARÇANTE et al., 2003), para recuperação de larvas infectantes (L3).
Todos os hamsters foram sacrificados após 22 dias de infecção, para
recuperação dos vermes adultos presentes no intestino delgado, como descrito
anteriormente. Antes do sacrifício, foram coletados 500-1000 µl de sangue de todos
os hamsters, como descrito anteriormente.
67
4.8.2. Avaliação da imunização
Para avaliar a eficiência da imunização, foi analisada a resposta por
anticorpos IgG total dos animais imunizados frente aos domínios recombinantes
AyD1 e mix (rAyD1, rAbD2, rAcD5 e rNa16D1), através da técnica ELISA (Enzyme
Lynked Immunossorbent Assay). Para isso, foi utilizado o plasma dos animais
coletado antes da primeira imunização, no dia do desafio e no dia do sacrifício. Para
obtenção do plasma, o sangue coletado foi centrifugado a 10000xg, por 10 min e
armazenado a -20ºC até o momento do uso.
Uma placa de 96 poços de poliestireno (BD Falcon) foi sensibilizada com 0,1
µg/poço de antígeno diluído em tampão carbonato (0,05M NaHCO3 pH 9,6) por
aproximadamente 18 h, a 4°C. Após este período, a placa foi lavada três vezes com
PBST (PBS 1X + 0,05% Tween 20) e incubada com 200 µl/poço de solução de
bloqueio (PBST; 2% leite em pó desnatado) por 2 h a temperatura ambiente.
A placa foi novamente lavada com PBST e incubada com os plasmas
testados, em duplicata, diluídos 1:100 em PBST, por aproximadamente 18 h, a 4°C.
Posteriormente, a placa foi lavada com PBST e incubada com o anticorpo
secundário conjugado com biotina (BD Biosciences), diluído 1:5000 em PBST, por 2
h, a 4ºC. Em seguida, após três lavagens com PBST, foi adicionada a estreptavidina
(R&D Systems – EUA) diluida 1:200 em PBST, conforme recomendações do
fabricante, com incubação de 20 min à temperatura ambiente.
Após três lavagems com PBST, foi feita revelação com 100 µl/poço de
solução contendo o cromógeno TMB (3,3’,5,5’-tetrametilbenzidina – BD
Biosciences), por 10 min, à temperatura ambiente, no escuro. A reação foi
interrompida com a adição de 100 µl/poço de H2SO4 2 M. A leitura da placa foi feita
em espectrofotômetro a 450nm.
68
Além disso, foram realizados testes com extrato protéico total e produtos ES
de A. ceylanicum para avaliar a produção de anticorpos contra as proteínas do
parasito e se a imunização interferiu nesta resposta, através da técnica de ELISA,
como descrito anteriormente. Neste caso, foram utilizados 0,5 µg/poço de antígeno.
4.8.3. Avaliação da vacinação
Para avaliar se houve alguma alteração na infecção dos hamsters por A.
ceylanicum nos grupos vacinados com os domínios recombinantes (3 e 4), quando
comparados com os grupos controles (1 e 2), foram avaliados os seguintes
parâmetros:
- OPG
- Viabilidade dos ovos
As fezes obtidas na última coleta foram submetidas à coprocultura
(ROBERTS & O´SULLIVAN, 1950) e exame de Baermann Moraes modificado
(BARÇANTE et al., 2003) para verificar se os ovos presentes nas fezes eram
viáveis.
- Ganho de peso
- Exame do volume globular e dosagem de hemoglobina
O sangue fresco dos animais coletado no dia da primeira imunização, no dia
do desafio e no dia do sacrifício foram submetidos ao método de microhematócrito,
para se obter a porcentagem de hemácias, através da centrifugação a 10000xg, por
cinco minutos, dentro de um tubo capilar. Além disso, foi feita a dosagem de
hemoglobina das mesmas amostras utilizando sistema colorimétrico e padrão de
hemoglobina (Doles, Brasil), conforme instruções do fabricante.
69
- Recuperação de vermes adultos e proporção entre machos e fêmeas
Os vermes recuperados da mucosa do intestino delgado, após o sacrifício dos
hamsters, foram separados por sexo e contados.
4.9. Teste de imunogenicidade
Os domínios recombinantes KU foram utilizados para avaliar o potencial
imunogênico das proteínas produzidas pelos ancilostomídeos que possuem tais
domínios, através da técnica ELISA, utlilizando soros de hamsters e cães infectados
ou não, por ancilostomídeos, como descrito anteriormente.
Os soros foram avaliados contra uma mix dos quatro domínios recombinantes
e o domínio recombinante de cada espécie infectante. Para os testes com soro de
cães, foi feita incubação com o anticorpo monoclonal anti-IgG conjugado com
peroxidase (Bethyl Laboratories Inc., USA), diluído 1:10000, por 2 h a temperatura
ambiente. Para os testes com soros de hamster, a incubação foi realizada com
anticorpo monoclonal anti-IgG (Invitrogen) conjugado com peroxidase, diluído
1:5000, por 2 h a 4ºC. Nestes testes, não houve a adição e incubação com
estreptavidina.
Para os testes de cães, foram utilizados soros de oito cães infectados com
100 larvas infectantes (L3) por quilo de animal de A. braziliense, A. caninum ou A.
ceylanicum, coletados antes da infecção (negativo) e após 54, 63, e 39 dias após a
infecção, respectivamente. Estes soros foram obtidos em estudo prévio
desenvolvido no Laboratório de Parasitologia Molecular (CUNHA, 2009).
Além destes, foram utilizados soros de hamsters infectados por N.
americanus. Os soros de sete hamsters infectados há 42 dias com 600 larvas
infectantes (L3) de N. americanus, provenientes de saguis (Callithrix penicillata),
70
foram cedidos pelo professor do Departamento de Parasitologia/UFMG Dr. Alan
Lane de Melo, do Laboratório de Taxonomia e Biologia de Invertebrados. Como soro
negativo, foram utilizados os soros pré-imune do experimento de imunização de
hamsters deste trabalho.
Os soros de hamsters infectados por N. americanus foram testados também,
através da técnica ELISA, contra o extrato protéico total e produtos
excretados/secretados (ES) deste ancilostomídeo.
4.10. Análise estatística
Para a análise estatística dos dados gerados nos itens 4.8 e 4.9, foi utilizado o
software Graph Pad Prism 5. Para verificar a distribuição dos dados, foi utilizado o
teste Kolmogorov-Smirnov.
As análises entre dois grupos foram feitas com os métodos estatíticos teste T
pareado ou não-pareado (dados paramétricos) e Wilcoxon Matched Pairs ou Mann e
Whitney (dados não-paramétricos). Para análise de três ou mais grupos, os dados
foram submetidos aos testes ANOVA ou Reapeated Measures ANOVA seguido do
de Tukey (dados paramétricos) e Kruskal-Wallis ou Friedman seguido do de Dunns
(dados não-paramétricos).
Todos os testes foram considerados significativos quando apresentaram um
valor de p ≤ 0,05.
Este projeto foi financiado pela Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de
Minas Gerais – FAPEMIG – (nº 13889) e está de acordo com os Princípios Éticos da
Experimentação Animal, adotados pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal
– CETEA/UFMG – (nº 57/2008).
71
RESULTADOS
72
5. RESULTADOS
5.1. Obtenção de sequências parciais para Ancylostoma ssp.
Todos os cDNAs codificadores de ASPs e inibidores de proteases tipo Kunitz
de A. braziliense (Ab), A. caninum (Ac) e A. ceylanicum (Ay) amplificados foram
sequenciados para confirmação de suas identidades. As sequências asps de A.
braziliense foram amplificadas com pares de iniciadores baseados nas asps de A.
caninum. Os tamanhos dos fragmentos obtidos foram 1610, 1293 e 1402 pares de
bases para Ab-asp-4, Ab-asp-5 e Ab-asp-6, respectivamente. Essas sequências
quase completas foram depositadas no GenBank sob os números de acesso
FJ593954 –FJ593956, respectivamente.
As três ASPs de A. braziliense inferidas das sequências obtidas têm dois
domínios SCP-like (FIGURA 3), assim como as de A. caninum, e apresentam
identidades e similaridades entre 96-99% com as respectivas ASPs de A. caninum.
As novas asps de A. braziliense foram nomeadas de acordo com as
sequências ortólogas/homólogas de A. caninum, uma vez que os cDNAs foram
amplificados com iniciadores para as sequências de A. caninum. Isto não se aplica
às asps de A. ceylanicum disponíveis no banco de dados do NCBI. As sequências
FIGURA 3: Estrutura esquemática dos domínios das ASPs inferidas a partir das sequências
obtidas asps 4, 5 e 6 de A. braziliense. SCP: domínio conservado Pfam PF00188; pb: Pares de
bases.
73
de aminoácidos preditas para Ay-asp-4 e Ay-asp-5 apresentam 50-54% de
similaridade às ortólogas de A. braziliense e A. caninum e a proteína deduzida Ay-
ASP-4 tem apenas um domínio SCP-like, enquanto Ac-ASP-4 possui dois.
Para obtenção das sequências parciais de genes de inibidores de proteases
tipo Kunitz das três espécies, iniciadores foram desenhados baseados nos genes
disponíveis no banco de dados do NCBI: gene tipo Kunitz (1D) de A. ceylanicum e
gene tipo Kunitz (12D) de A. caninum. As novas sequências parciais obtidas foram
denominadas Ab-Kunitz (1D) (FJ593957) e Ab-Kunitz (12D) (FJ593958) para A.
braziliense; Ac-Kunitz (1D) (FJ593959) para A. caninum; e Ay-Kunitz (12D)
(FJ593960) para A. ceylanicum, e foram depositadas no GenBank (FIGURA 4).
A sequência de aminoácidos predita para Ab-Kunitz (1D) é 68% idêntica e
80% similar a Ay-Kunitz (1D), enquanto a sequência Ac-Kunitz(1D) é 81% idêntica e
94% similar a Ay-Kunitz (1D). Essas novas sequências Kunitz (1D) possuem um
FIGURA 4: Estrutura esquemática dos domínios de inibidores de protease tipo Kunitz 12D (a) e
1D (b) inferidos a partir das sequências de A. caninum, A. ceylanicum e A. braziliense obtidas
com as respectivas identidade e similaridade com as sequências para as quais foram
desenhados os iniciadores. KU: domínio conservado cd00109; pb: Pares de bases.
(a)
(b)
74
domínio KU, assim como a sequência original de A. ceylanicum. As sequências
parciais Ay- e Ab-Kunitz (12D) apresentam dois domínios KU, mas as sequências
gênicas completas provavelmente devem apresentar doze domínios. Além disso,
essas sequências foram geradas baseadas na sequência de A. caninum e a
comparação da sequência de aminoácidos deduzida indica que Ab-Kunitz (12D) é
70% idêntica e 86% similar a Ac-Kunitz (12D), enquanto Ay-Kunitz (12D) é 76%
idêntica e 88% similar a Ac-Kunitz (12D).
5.2. Comparação do perfil de transcrição para inibidores de proteases tipo
Kunitz e asps entre vermes adultos machos e fêmeas de Ancylostoma ssp.
5.2.1. Perfil de transcrição de inibidores de proteases tipo Kunitz
Pares de oligonucleotídeos específicos foram desenhados para sequências
Ac-Kunitz (12D) e Ay-Kunitz (1D) e foram usados para comparar a transcrição entre
machos e fêmeas de A. braziliense, A. caninum e A. ceylanicum, por RT-PCR e RT-
PCR em tempo real. Para as três espécies, a transcrição foi significativamente maior
em machos, em relação às fêmeas, para o Kunitz (12D) (FIGURA 5).
FIGURA 5: Transcrição diferencial de genes codificadores de inibidores de proteases tipo
Kunitz em machos de A. braziliense, A. caninum e A. ceylanicum, por RT-PCR. O gene da
proteína ribossomal 60S foi usado como gene constitutivo. M: macho e F: fêmea
75
Os dados da RT-PCR quantitativa confirmaram os resultados da RT-PCR
convencional para o Kunitz (12D), mostrou que há diferença também para o Kunitz
(1D) nas três espécies de Ancylostoma e revelou um perfil semelhante entre as
espécies – maior transcrição diferencial entre os sexos para o gene tipo Kunitz (12D)
(QUADRO 4 e FIGURA 6).
Espécie cDNA/gene qRT-PCR
(log2)
A. braziliense Kunitz (1D) 2.61 ± 0.58 (M)
Kunitz (12D) 12.58 ± 0.19 (M)
A. caninum Kunitz (1D) 3.22 ± 1.30 (M)
Kunitz (12D) 13.14 ± 2.39 (M)
A. ceylanicum Kunitz (1D) 4.91 ± 0.26 (M)
Kunitz (12D) 13.65 ± 2.36 (M)
FIGURA 6: Comparação dos dados da RT-PCR quantitativa (log2) de genes codificadores de
inibidores de proteases tipo Kunitz. Quantificação relativa da transcrição em machos versus
fêmeas. As barras representam os valores logarítmicos (média ± desvio padrão) da
expressão diferencial dos machos, de três réplicas biológicas
QUADRO 4: Dados da RT-PCR quantitativa (2-∆∆Ct, média dos valores logarítmicos ± desvio
padrão) para genes codificadores de inibidores de proteases tipo Kunitz. Quantificação
relativa da transcrição gênica de machos (M) em relação às fêmeas
76
Ao contrário dos resultados obtidos para as espécies de Ancylostoma, não
houve amplificação de genes tipo Kunitz para N. americanus, utilizandos os mesmos
iniciadores (dados não mostrados). Isto sugere que há relativa preservação das
regiões codificadoras dos dois genes tipo Kunitz na subfamília Ancylostomatinae,
mas não entre Ancylostomatinae e Bunostominae, a qual pertence o N. americanus.
5.2.2. Perfil de transcrição de asps
Usando método semelhante ao utilizado para os genes de inibidores de
proteases tipo Kunitz, iniciadores específicos foram desenhados para três asps de A.
caninum, para amplificação do cDNA de A. caninum e A. braziliense, e para as asp-4
e asp-5 de A. ceylanicum. Os resultados da RT-PCR mostram a maior transcrição
em machos das três espécies para todos os transcritos (FIGURA 7).
Esses achados foram confirmados pela RT-PCR quantitativa, semelhante ao
que foi demonstrado para os genes tipo Kunitz (QUADRO 5).
FIGURA 7: Transcrição diferencial de asps em machos de A. braziliense, A. caninum e A.
ceylanicum, por RT-PCR. O gene da proteína ribossomal 60S foi usado como gene
constitutivo. M: macho e F: fêmea
77
Espécie cDNA/gene qRT-PCR
(log2)
A. braziliense
asp-4 8.50 ± 2.66 (M)
asp-5 8.32 ± 3.22 (M)
asp-6 7.39 ± 2.40 (M)
A. caninum
asp-4 0.98 ± 0.63 (M)
asp-5 4.77 ± 1.10 (M)
asp-6 2.26 ± 1.83 (M)
A. ceylanicum asp-4 4.34 ± 1.57 (M)
asp-5 1.51 ± 1.17 (M)
A transcrição diferencial entre ancilostomídeos machos e fêmeas variou entre
os transcritos e as espécies, entretanto, o A. braziliense demonstrou maior
transcrição diferencial em machos para todas as asps avaliadas (FIGURA 8).
QUADRO 5: Dados da RT-PCR quantitativa (2-∆∆Ct, média dos valores logarítmicos ± desvio
padrão) para asps. Quantificação relativa da transcrição gênica de machos (M) em relação
às fêmeas
FIGURA 8: Comparação dos dados da RT-PCR quantitativa (log2) de asps. Quantificação
relativa da transcrição em machos versus fêmeas. As barras representam os valores
logarítmicos (média ± desvio padrão) da expressão diferencial dos machos, de três réplicas
biológicas
78
Assim como para os genes de inibidores de proteases tipo Kunitz, não houve
amplificação de asps para N. americanus, utilizando os iniciadores desenhados para
as sequências de A. caninum e A. ceylanicum (dados não mostrados),
demonstrando que as regiões gênicas codificadoras de ASPs também não são
conservadas entre as subfamílias Ancylostomatinae e Bunostominae.
Portanto, a transcrição diferencial em machos de A. braziliense, A. caninum e
A. ceylanicum para genes de inibidores de proteases tipo Kunitz e asps
demonstrada neste trabalho confirmam dados anteriores feitos com A. brazliliense
(COSTA et al., 2008).
5.3. Análise das sequências gênicas de N. americanus
Os bancos de dados dbEST e SRA (SRA012052), disponíveis no NCBI,
continham 539822 ESTs de N. americanus, sendo que destas, 1699 apresentaram
similaridade com os genes de inibidores de proteases tipo Kunitz (711) e asps (988)
de A. caninum (Ac) e A. ceylanicum (Ay) já descritas (QUADRO 6).
Genes Número de ESTs similares
Ac-asp-4 191
988
Ac-asp-5 717
Ac-asp-6 409
Ay-asp-4 22
Ay-asp-5 278
Ac-Kunitz (12D) 693 711
Ay-Kunitz (1D) 495
TOTAL 1699
QUADRO 6: ESTs de N. americanus do banco de dados dbEST e SRA, disponíveis no NCBI,
similares aos genes de inibidores de protease tipo Kunitz e asps de A. caninum e A.
ceylanicum
79
Dessas 1699 ESTs, foram geradas 94 sequências consenso, 36 similares aos
genes de inibidores de proteases tipo Kunitz e 58 para as asps. As sequências
consenso similares aos genes de inibidores de protease tipo Kunitz têm tamanhos
que variam de 147 a 784 pares de bases, tendo uma média de 381 nucleotídeos,
enquanto as sequências consenso similares às asps têm tamanhos entre 208 e
1585 pares de bases, com média de 572 nucleotídeos. Todas as sequências contêm
pelo menos um domínio conservado específico, SCP-like (cd05380), para as asps, e
KU (cd00109), para os genes de inibidores de proteases tipo Kunitz.
A partir das sequências consenso geradas, foi feita nova busca por
similaridade, utilizando o BLASTX, com proteínas de ancilostomídeos depositadas
no banco de dados do NCBI, para verificar se as mesmas eram realmente similares
aos genes com os quais foram selecionadas. A similaridade das 36 sequências
consenso geradas a partir de inibidores de proteases tipo Kunitz e das 58
sequências consenso geradas a partir de asps foi confirmada.
Das 36 sequências consenso de N. americanus geradas, prováveis inibidores
de proteases tipo Kunitz, 21 são similares a proteína Ac-Kunitz (12D), seis são
similares a Ay-Kunitz (12D), cinco são similares a Ay-Kunitz (1D), três são similares
a Ab-Kunitz (12D) e uma a Ac-Kunitz (1D). Já para as 58 sequências consenso
similares a asps, 25 são similares a Ac-ASP-5, 15 são similares a Ac-ASP-6, seis
são similares a Ac-ASP-1 (AF132291), quatro se assemelham a Ay-ASP-4, três são
similares a Ay-ASP-1 (AY136548) e outras cinco similares a Na-ASP-2 (AY288089),
Ay-ASP-5, Ac-ASP-3, Ay-ASP-2 (AY288090) e Ad-ASP-1 (AF077402) cada.
Todas as sequências consenso geradas tiveram as respectivas proteínas
preditas pelo programa GeneMark™ (BESEMER & BORODOVSKY, 2005), sendo
80
que 16 similares a asps e 12 similares a inibidores de proteases tipo Kunitz
apresentam peptídeo sinal.
5.4. Comparação da expressão protéica de inibidores tipo Kunitz entre vermes
adultos machos e fêmeas de ancilostomídeos
A fim de comparar a expressão protéica de todos os inibidores de protease
tipo Kunitz de machos e fêmeas das quatro espécies, foi feita a amplificação e
expressão apenas do domínio conservado para cada espécie de ancilostomídeo.
5.4.1. Amplificação dos domínios KU
Os domínios KU foram amplificados a partir do cDNA de A. braziliense, A.
caninum, A. ceylanicum e N. americanus, utilizando iniciadores desenhados para as
sequências de inibidores de proteases tipo Kunitz das quatro espécies.
Apesar de representar um domínio conservado, as sequências nucleotídicas e
aminoacídicas dos domínios de inibidores de proteases tipo Kunitz, da mesma
proteína e de proteínas distintas, das três espécies de Ancylostoma e N. americanus
não são idênticas entre si, como demostrado na FIGURA 9 criada com programa
WebLogo 3 (http://weblogo.threeplusone.com/) (CROOKS et al., 2004), que
representa a presença e a frequência dos aminoácidos em cada posição.
FIGURA 9: Constituição de aminoácidos dos domínios KU das sequências de inibidores de
proteases tipo Kunitz de N. americanus (a) e A. braziliense, A. caninum e A. ceylanicum (b),
criada com WebLogo 3. A altura dos símbolos representa a probabilidade, a largura é
proporcional à quantidade de sequências com aminoácidos em cada posição e as cores
representam as propriedades químicas de cada aminoácido: verde – polar; azul – básico;
vermelho – ácido; preto – hidrofóbico
(b)
(a)
81
Na FIGURA 9, estão representados 39 domínios KU das 36 sequências
conseso geradas para N. americanus, similares a inibidores de proteases tipo
Kunitz, e 19 domínios KU das seis sequências de inibidores de proteases tipo Kunitz
de A. braziliense, A. caninum e A. ceylanicum.
Sendo assim, foram desenhados iniciadores para diferentes domínios das
sequências: Ab-Kunitz (12D), Ac-Kunitz (12D), Ay-Kunitz (1D), Na-KunitzContig1,
Na-KunitzContig8 e Na-KunitzContig16, que estão descritos no APÊNDICE B e têm
como objetivo amplificar domínios com sequências distintas.
Os cDNAs das três espécies de Ancylostoma foram submetidos a reações de
PCR utilizando os seis pares de iniciadores sitntetizados para o gênero, sendo que a
amplificação dos domínios KU variou de acordo com o oligonucleotídeo utilizado
(FIGURA 10).
FIGURA 10: Amplificação dos domínios KU, através de RT-PCR, para as espécies A.
braziliense (Ab), A. caninum (Ac) e A. ceylanicum (Ay) com os pares de iniciadores AyD1,
AbD2, AcD3, AcD5, AcD11 e AcD12, apresentada em gel de agarose 1% corado por brometo
de etídeo. M: cDNA de macho; F: cDNA de fêmea; B: Branco e PM: Padrão de peso molecular
em pares de base (pb)
82
Para cada domínio de interesse, houve amplificação em pelo menos uma das
espécies. Não houve amplificação dos domínios KU para N. americanus, utilizando
os mesmos iniciadores (dados não mostrados).
Para alguns pares de iniciadores – AcD3, AcD5 e AcD12 – foi observada
maior amplificação em cDNAs de fêmeas de A. caninum e, para A. braziliense, uma
maior amplificação em machos. Entretanto, esses resultados não são quantitativos
e, portanto, nenhuma inferência sobre valores de transcrição diferencial pode ser
feita. Além disso, os fragmentos amplificados podem corresponder a outros genes
diferentes dos que foram originalmente amplificados e quantificados.
Os domínios KU de N. americanus foram amplificados, através de RT-PCR,
utilizando três pares de iniciadores específicos (FIGURA 11).
Houve amplificação para o cDNA de machos e fêmeas de N. americanus,
com os três pares de iniciadores utilizados. Assim como descrito anteriormente, não
houve amplificação de domínios KU para as três espécies de Ancylostoma usando
os iniciadores específicos para N. americanus (dados não mostrados).
5.4.2. Clonagem e sequenciamento dos domínios KU
Os seguintes fragmentos obtidos anteriormente foram selecionados para
clonagem: AyD1 – AbM (cDNA macho), AcM e AyM; AbD2 – AbM; AcD3 – AbM e
FIGURA 11: Amplificação dos domínios KU, através de RT-PCR, para N. americanus utilizando
os pares de iniciadores Na1D2, Na16D1 e Na8D2, apresentada em gel de agarose 1% corado
por brometo de etídeo. M: cDNA de macho; F: cDNA de fêmea; B: Branco e PM: Padrão de
peso molecular em pares de base (pb)
83
AcF (cDNA fêmea); AcD5 – AbM, AcF e AyM; AcD11 – AbM e AcF; AcD12 – AbM e
AcF; Na1D2 – NaM; Na16D1 – NaM e NaF; Na8D2 – NaM.
Para a confirmação do sucesso da clonagem e seleção das colônias que
teriam os plasmídeos purificados e posteriormente sequenciados, foi realizada uma
PCR convencional, com as colônias crescidas a partir das bactérias transformadas.
Foram escolhidas colônias totalmente brancas, além de colônias azuis, que
continham apenas o plasmídeo sem inserto, para serem usadas como controle da
clonagem e PCR.
Os iniciadores usados na PCR de colônia foram o M13 direto e reverso que
se anelam em seqüências do plasmídeo utilizado na clonagem. Por esse motivo, os
tamanhos dos fragmentos gerados a partir dessa PCR de colônia são maiores que o
esperado (~250 pb a mais), pois além de haver a amplificação do fragmento
clonado, há também a amplificação de parte do plasmídeo. A FIGURA 12 ilustra o
resultado de uma PCR de colônia feita com colônias brancas e azuis.
Após análises dos resultados da PCR de colônia, foi realizada a extração e
sequenciamento do DNA plasmidial dos clones selecionados, sendo que foram
selecionadas no mínimo três colônias para cada domínio clonado. Com exceção dos
fragmentos obtidos com os pares de iniciadores AcD3, AcD5 e AcD12 para cDNA de
PM 1 2 3 4 5 6 7 8 9 B
AbD2 AcD3 pb
250-
500-
FIGURA 12: Resultado da PCR de colônias provenientes de transformações com plasmídeos
recombinantes contendo domínios KU amplificados, apresentado em gel de agarose 1%
corado por brometo de etídeo. 1-4: Abmacho amplificado com AbD2; 5-9: Abmacho
amplificado com AcD3; 1, 7 e 9: plasmídeos sem inserto; 2-6 e 8: plasmídeos com inserto; B:
Branco e PM: Padrão de peso molecular em pares de base (pb)
84
fêmeas de A. caninum, os fragmentos clonados foram sequenciados com sucesso e
as sequências obtidas são correspondentes aos domínios selecionados. As
sequências dos domínios obtidos com o mesmo par de iniciador para as espécies de
Ancylostoma são idênticas.
Os dados da amplificação, clonagem e sequenciamento dos domínios KU
estão sumarizados no QUADRO 7.
AyD1# AbD2# AcD3 AcD5# AcD11 AcD12 Na1D2 Na16D1# Na8D2 M F M F M F M F M F M F M F M F M F
A. braziliense + + ++ + + + + + A. caninum + + +* + +* +*
A. ceylanicum + + + N. americanus + + + + + +
5.4.3. Expressão e purificação dos domínios KU
Como a amplificação e confirmação das identidades dos diferentes domínios
KU selecionados foram bem sucedidas, uma sequência de cada espécie foi utilizada
para expressão: AyD1, AbD2, AcD5 e Na16D1. Estas sequências foram inseridas no
vetor de expressão pJexpress414, pela empresa DNA2.0, e expressas em bactérias
E. coli BL21 (DE3). Os quatro domínios KU recombinates foram expressos
satisfatoriamente, apresentando peso molecular de aproximadamente 13 kDa
(FIGURA 13), diferente do peso molecular teórico para esses domínios que seria de
7-7,8 kDa, considerando os resíduos adicionados para expressão.
Dentre as várias condições de expressão, lise bacteriana e purificação
utilizadas nas padronizações, a presença/ausência de NaCl (0,5 M) no tampão de
lise e nos tampões de corrida e eluição utilizados na purificação foi o fator
determinante para o sucesso da expressão/purificação. A lise bacteriana com
QUADRO 7: Domínios KU de A. braziliense, A. caninum, A. ceylanicum e N. americanus
selecionados para amplificação, clonagem, sequenciamento e expressão. M: Machos; F:
Fêmeas; +: Amplificação; realce cinza: Bandas sequenciadas com sucesso; *: Bandas cujo
sequenciamento não funcionou; #: Domínios selecionados para expressão.
85
tampão contendo NaCl (0,5 M) foi bem mais eficiente quando comparada à lise com
tampão sem NaCl (0,5 M), pois os domínios recombinantes se solubilizavam
totalmente no sobrenatante sem sarcosil. Entretanto, a purificação deste lisado era
bem menos eficiente: grande parte do domínio recombinante saía no descarte da
corrida e as frações purificadas (eluição) estavam contaminadas com proteínas
bacterianas (FIGURA 13).
FIGURA 13: Lise bacteriana e purificação dos domínios KU recombinantes com tampões com
e sem NaCl (0,5 M), apresentado em SDS-PAGE 12% corado com azul de coomasie R250. Lise
da expressão de rAbD2 com NaCl (0,5 M) (a) e de rAcD5 sem NaCl (0,5 M) (b): antes da
indução (T0h), depois da indução (T4h), sobrenadante sem sarcosil, sobrenadante com
sarcosil e pellet. Purificação de rAcD5 com NaCl (0,5 M) (c) e sem NaCl (0,5 M) (d): 2 – fração
do descarte; 9-16 e 14-21 – frações da eluição. Padrão molecular de proteínas em kilodaltons
(kDa)
(a) (b)
(c)
(d)
86
Deste modo, as culturas bacterianas dos quatro domínios recombinantes
foram lisadas e purificadas com tampões sem adição de NaCl (0,5 M). Após a
purifcação, as frações da eluição que continham os domínios recombinantes foram
reunidas e concentradas. Os quatro domínios KU recombinantes foram purificados e
concentrados com sucesso, além de serem satisfatoriamente reconhecidos pelo
anticorpo anti-histidina, através do ensaio de Western blot (FIGURA 14).
5.4.4. Predição de epitopos e produção de anticorpos policlonais
Após a análise de prováveis epitopos lineares de céluas B, foram preditos três
epitopos para os domínios AyD1, AbD2 e AcD5 e dois para Na16D1 (FIGURA 15),
demonstrando que estas proteínas possivelmente seriam capazes de induzir a
produção de anticorpos.
(a) (b)
FIGURA 14: Domínios KU recombinantes após purificação e concentração analisados por
SDS-PAGE 12% corado com azul de coomasie R250 (a) e western blot com anticorpo primário
anti-histidina (b). Padrão molecular de proteínas em kilodaltons (kDa)
FIGURA 15: Epitopos lineares de células B (aminoácidos sublinhados) dos domínios KU
AyD1, AbD2, AcD5 e Na16D1, preditos pelo programa Bepipred (corte 0,35).
87
Os domínios recombinantes purificados foram utilizados para produção de
anticorpos policlonais, através da imunização de camundongos. Após a obtenção
dos soros, através da sangria dos animais imunizados, estes foram testados contra
os quatro domínios recombinantes com os quais os animais haviam sido
imunizados, por Western blot. Houve reconhecimento dos quatro domínios KU
recombinantes (AyD1, AbD2, AcD5 e Na16D1) para os quatro pools de soros
obtidos, o que não aconteceu para o soro pré-imune (FIGURA 16).
Este resultado demonstra que, apesar de não terem sequências idênticas, os
domínios KU de ancilostomídeos são semelhantes entre si, promovendo um
reconhecimento cruzado dos soros obtidos através da imunização.
Após a obtenção dos soros anti-domínios KU e confirmação do
reconhecimento das proteínas recombinantes, as proteínas excretadas/secretadas e
o extrato protéico total dos vermes adultos machos e fêmeas dos quatro
ancilostomídeos foram obtidos para posterior comparação da expressão protéica de
inibidores de protease tipo Kunitz.
(a) (b)
(c) (d)
(e)
FIGURA 16: Western blot dos domínios KU recombinantes (0,5 µg) contra os soros de
camundongos anti-AyD1 (a), anti-AbD2 (b), anti-AcD5 (c), anti-Na16D1 (d) e pré-imune (e)
diluídos 1:250. Padrão molecular de proteínas em kilodaltons (kDa)
88
5.4.5. Análise dos perfis eletroforéticos de proteínas excretadas/secretadas e
extrato protéico total
Os produtos de excreção/secreção (ES) e o extrato protéico total dos
parasitos adultos machos e fêmeas de ancilostomídeos obtidos e dosados foram
submetidos à análise por SDS-PAGE 12% e corados por nitrato de prata, para
verificar a integridade das proteínas obtidas (FIGURA 17).
FIGURA 17: Perfis eletroforéticos dos produtos excretados/secretados (2 µg) de machos e
fêmeas de N. americanus, A. ceylanicum e A. caninum (a) e do extrato protéico total (5 µg) de
machos e fêmeas de N. americanus, A. ceylanicum, A. caninum e A. braziliense (b),
analisados por SDS-PAGE 12% corado com nitrato de prata. Seta preta: proteínas exclusivas
da espécie; Seta vermelha: proteína compartilhada por duas espécies. Padrão molecular de
proteínas em kilodaltons (kDa)
(a)
(b)
89
Os dois perfis eletroforéticos, produtos ES e extrato protéico total, demostram
a grande diversidade protéica dos ancilostomídeos. De maneira geral, os perfis
protéicos são semelhantes entre machos e fêmeas da mesma espécie, mas se
diferem entre as espécies, principalmente para proteínas excretadas e secretadas.
O perfil protéico dos produtos ES se mostrou bastante heterogêneo entre as
espécies, sendo possível observar algumas proteínas aparentemente exclusivas de
uma determinada espécie ou compartilhada por duas e ausente na terceira. Alguns
exemplos são proteínas de aproximadamente 20 e 36 kDa que parecem ser
exclusivas de A. ceylanicum e N. americanus, respectivamente. Observam-se
também três proteínas de 19, 22 e 47 kDa, aproximadamente, compartilhadas por N.
americanus e A. caninum, além de outra de quase 38 kDa compartilhada por N.
americanus e A. ceylanicum (FIGURA 17).
Já o perfil de proteínas do extrato total demonstrou-se mais conservado entre
as espécies, sendo observadas diferenças em A. caninum e A. braziliense,
destacando-se uma proteína de aproximadamente 20 kDa para A. caninum e duas
proteínas próximas a 17 kDa para A. braziliense (FIGURA 17).
5.4.6. Caracterização do perfil protéico de inibidores de protease tipo Kunitz
por “Western blot”
A caracterização do perfil de prováveis inibidores de protease tipo Kunitz das
espécies de ancilostomídeos foi feita por Western blot, utilizando os produtos ES e
extrato protéico total dos ancilostomídeos contra o pool de soros obtidos através da
imunização de camundongos com os domínios KU recombinantes: AyD1, AbD2,
AcD5 e Na16D1.
90
FIGURA 18: Western blot dos produtos excretados/secretados (15 µg) de machos e fêmeas
de N. americanus, A. ceylanicum e A. caninum e domínios KU recombinantes (0,5 µg) contra
os soros de camundongos anti-AyD1 (a), anti-AbD2 (b), anti-AcD5 (c), anti-Na16D1 (d) e pré-
imune (e) diluídos 1:250. Padrão molecular de proteínas em kilodaltons (kDa). Os números 1-
6 indicam as proteínas reconhecidas pelos soros e estão detalhados no texto.
(a) (b)
(c) (d)
(e)
1 1
3
4
5 5
1 1
2 3
5
1 1
4
5 6
2
1
2
1
3
4
5
3
6
91
O reconhecimento de proteínas com domínios KU nos produtos ES e extratos
protéicos totais pelos quatros soros contra os domínios recombinantes foi bem
distinto. O soro anti-AcD5 foi o que reconheceu o maior número de bandas nos
produtos ES e nos extratos protéicos totais, neste segundo juntamente com o soro
anti-AyD1. Em contrapartida, o soro anti-AyD1 reconheceu menos proteínas dos
produtos ES e o anti-AbD2 foi o que apresentou o menor número de proteínas
reconhecidas para os extratos protéicos totais (FIGURAS 18 e 19).
Os produtos ES de machos e fêmeas de N. americanus apresentou o melhor
perfil de reconhecimento pelos soros contra os quatro domínios recombinantes,
demostrando ter algumas proteínas que possuem domínio Kunitz. Já para A.
caninum e A. ceylanicum, poucas proteínas foram reconhecidas (FIGURA 18).
No perfil de produtos ES, destacam-se seis proteínas, que estão numeradas
na FIGURA 18 e serão analisadas de acordo com a numeração: 1) proteína de
aproximadamente 35 kDa reconhecida em machos e fêmeas de N. americanus e
fêmeas de A. caninum para os quatro soros anti-domínios KU recombinantes; 2)
proteína de aproximadamente 85 kDa em machos e fêmeas de N. americanus
reconhecida pelo soro anti-AcD5 e anti-AbD2, sendo que para este segundo ela se
apresenta aparentemente mais expressa em machos, além de ser reconhecida em
fêmeas de A. caninum com o soro contra o domínio recombinante da espécie; 3)
proteína de aproximadamente 60 kDa em machos e fêmeas de N. americanus
reconhecida pelos soros anti-AbD2, anti-AcD5 e anti-Na16D1, sendo aparentemente
mais expressa em fêmeas, além de aparecer também, bem fraca, no ES de machos
de A. ceylanicum quando incubado com soro anti-AcD5; 4) proteína de
aproximadamente 25 kDa em ambos os sexos de N. americanus reconhecida pelo
soro específico e reconhecida em fêmeas pelos soros anti-AyD1 e anti-AcD5; 5)
92
proteína de aproximadamente 15 kDa em machos e fêmeas de N. americanus para
os soros anti-Na16D1, anti-AyD1 e anti-AcD5, sendo que para os dois últimos esta é
aparentemente mais expressa em fêmeas, sendo também reconhecida, fracamente,
pelos soros anti-AbD2 e anti-Na16D1 no ES de A. caninum fêmea; 6) proteína de
aproximadamente 10 kDa de N. americanus reconhecida pelos soros anti-AyD1 e
anti-AcD5, que também é reconhecida pelo soro pré-imune, com menor intensidade
(FIGURA 18).
Nos produtos ES de fêmeas de A. caninum foi reconhecida uma proteína de
aproximadamente 85 kDa, utilizando o soro específico, que pode ser o inibidor de
protease tipo Kunitz já descrito para a espécie (83 kDa). Entretanto, o inibidor de
protease tipo Kunitz já descrito para A. ceylanicum (7,9 kDa) não foi reconhecido nos
produtos ES deste parasito. Além disso, foram reconhecidas bandas de
aproximadamente 10 e 85 kDa nos produtos ES de N. americanus que podem ser
proteínas homólogas a estes inibidores já descritos para A. caninum e A.
ceylanicum.
Apesar de algumas proteínas serem aparentemente mais expressas por
machos ou fêmeas, de uma maneira geral, não houve diferença aparente na
quantidade e intensidade de proteínas com domínios KU, inibidores de proteases
tipo Kunitz, entre os produtos ES de machos e fêmeas das três espécies, que
confirme a expressão diferencial destas proteínas baseado na transcrição diferencial
observada anteriormente. Para A. caninum, observa-se um reconhecimento de
proteínas em fêmeas, ausentes em machos, mas que provavelmente se deve ao
fato de os produtos ES de machos e fêmeas não terem quantidades de proteínas
semelhantes, apesar de terem sido dosados (FIGURA 17).
93
Em comparação com os produtos ES, foram obtidos, por western blot, perfis
mais fracos para os extratos protéicos totais. Ao contrário do observado para os
produtos ES, nenhuma proteína foi reconhecida no extrato protéico total de N.
americanus pelos quatro soros anti-domnínios KU recombinantes. Neste caso, a
maior parte de proteínas do extrato protéico total que possuem domínios KU é de A.
ceylanicum e A. caninum (FIGURA 19).
Para o perfil dos extratos protéicos totais, observam-se oito proteínas, que
estão numeradas na FIGURA 19 e serão analisadas de acordo com a numeração: 1)
proteína de aproximadamente 130 kDa reconhecida em machos e fêmeas de A.
ceylanicum e A. caninum e machos de A. braziliense para os quatro soros anti-
domínios KU recombinantes, apesar de ser reconhecida com menor intensidade
pelo soro pré-imune; 2) proteína de aproximadamente 35 kDa em machos de A.
ceylanicum, reconhecida pelos soros anti-AyD1 e anti-Na16D1, e em A. braziliense,
reconhecida pelos soros anti-AcD5 e anti-AyD1, sendo para o segundo soro o
reconhecimento foi só para machos; 3) proteína de aproximadamente 15 kDa de
machos de A. ceylanicum reconhecida pelos soros anti-AyD1 e anti-AcD5; 4)
proteína de aproximadamente 37 kDa em machos de A. caninum reconhecida pelos
quatro soros anti-domínios KU e pelo pré-imune, com menor intensidade; 5, 6 e 7)
três proteínas foram reconhecidas pelo soro anti-AcD5 em machos de A. canium,
com tamanho aproximado de 100, 70 e 20 kDa; 8) proteína de aproximadamente 45
kDa de fêmeas de A. caninum reconhecida pelo soro anti-AyD1 e de A. braziliense
reconhecida, com pouca intensidade, pelos soros anti-AcD5 e anti-AbD2, sendo que
o segundo só reconheceu a proteína em machos (FIGURA 19).
94
FIGURA 19: Western blot dos extratos protéicos totais (25 µg) de machos e fêmeas de N.
americanus, A. ceylanicum, A. caninum e A. braziliense e domínios KU recombinantes (0,5
µg) contra os soros de camundongos anti-AyD1 (a), anti-AbD2 (b), anti-AcD5 (c), anti-Na16D1
(d) e pré-imune (e) diluídos 1:100. Padrão molecular de proteínas em kilodaltons (kDa). Os
números 1-8 indicam as proteínas reconhecidas pelos soros e estão detalhados no texto.
(a) (b)
(c) (d)
(e)
1 1
2 4
1 1
2 2
3
4
8
1 1
4 8
1 1
2
3
4
5 6
7
8
95
Ao contrário do observado parao os produtos ES, a expressão diferencial de
inibidores de protease tipo Kunitz dos extratos protéicos totais foi parcialmente
confirmada. Observam-se cinco proteínas, quatro de A. caninum (4, 5, 6 e 7) e uma
de A. ceylanicum (3), aparentemente específicas de machos. Além destas, outras
três proteínas de A. ceylanicum (2) ou A. braziliense (1 e 8) são reconhecidas
apenas em machos por pelo menos um soro anti-domínio KU recombinante.
5.5. Ensaio de vacinação de hamsters
5.5.1. Avaliação da imunização
Após 57 dias da primeira dose da vacina com domínios KU – AyD1 e mix dos
quatro domínios – os hamsters vacinados e desafiados com larvas infectantes (L3)
de A. ceylanicum foram sacrificados. Durante o experimento, morreram dois animais:
um do grupo 4 (AyD1), aos 7 dias de experimento, e outro do grupo 3 (Mix), 10 dias
após o desfio. Para avaliar se a imunização estimulou a produção de anticorpos anti-
domínios KU pelos hamsters imunizados, os plasmas obtidos antes da primeira
imunização (pré-imune), no dia do desafio (dia D) e no dia do sacrfício (dia S) foram
avaliados quanto à produção de anticorpos IgG contra os domínios recombinantes,
através da técnica ELISA.
Os hamsters imunizados com apenas o domínio AyD1 ou mix dos quatro
domínios KU produziram resposta por anticorpos IgG significativa quando
comparados com o plasma pré-imune e com os grupos controle (PBS e Adjuvante),
como demonstrado na FIGURA 20.
96
A produção de anticorpos foi siginificativamente maior para os grupos
imunizados com AyD1 (antes do desafio) e com mix dos quatro domínios (antes do
desafio e no dia do sacrifício). Observa-se que houve uma resposta humoral maior
no grupo imunizado contra os quatro domínios recombinantes, mesmo quando
testado apenas contra o domínio AyD1, sendo que a diferença entre os grupos 3
(Mix) e 4 (AyD1) no dia do desafio foi estatisticamente significativa. Além disso, há
uma queda na produção de anticorpos entre o dia do desafio e o dia do sacrifício,
para os dois grupos imunizados com proteínas, mas esta não é estatisticamente
significativa (FIGURA 20).
Os plasmas dos hamsters imunizados também foram avaliados quanto à
produção de anticorpos IgG contra antígeno bruto total e produtos de excreção e
secreção de A. ceylanicum, através da técnica ELISA. Observa-se que os hamsters
dos quatro grupos experimentais produziram resposta significativa contra antígeno
FIGURA 20: Níveis de anticorpos IgG de hamsters do ensaio de vacinação frente ao domínio
KU recombinante AyD1 (a) e mix dos quatro domínios KU recombinantes – AyD1, AbD2, AcD5
e Na16D1 – (b). Diferença estatística para o pré-imune * = p<0,05; ** = p<0,01. Diferença
estatística entre Mix (D) e AyD1 (D) # = p<0,05. D: dia do desafio com 100 L3 de A.
ceylanicum; S: dia do sacrifício.
(a) (b) # #
97
bruto total e produtos ES, comparando-se o dia do sacrifico com o dia do desafio,
independentemente da imunização recebida (FIGURA 21).
5.5.2. Avaliação da vacinação
A imunização com domínios KU recombinantes – mix e AyD1 – não conferiu
proteção aos hamsters contra a infecção por A. ceylanicum, quando comparados
aos grupos controle (PBS e Adjuvante), baseado nos parâmetros avaliados. Não
houve diminuição de parâmetros clínicos decorrentes da infecção, carga parasitária
e do potencial de transmissão da doença, medido pelo número de ovos por grama
de fezes (OPG) e pela viabilidade dos ovos, através da eclosão de larvas.
- OPG
Não houve diferença aparente no número de ovos eliminados, juntamente
com as fezes, pelos hamsters dos quatro grupos experimentais ao longo da infecção
(FIGURA 22).
FIGURA 21: Níveis de anticorpos IgG de hamsters do ensaio de vacinação frente ao antígeno
bruto total (a) e produtos de excreção e secreção (b) de A. ceylanicum. Diferença estatística
entre os dias do desafio e sacrifício * = p<0,05; ** = p<0,01; *** = p<0,001. D: dia do desafio
com 100 L3 de A. ceylanicum; S: dia do sacrifício.
(a) (b)
98
- Viabilidade dos ovos
Os ovos presentes nas fezes dos quatro grupos coletadas no 22º dia após a
infecção por A. ceylanicum, dia do sacrifício, estavam viáveis. Foram recuperadas
larvas infectantes (L3) ativas das coproculturas feitas com estas fezes.
- Ganho de peso
A imunização com a mix dos quatro domínios KU recombinantes ou com o
domínio AyD1 não conferiu proteção contra a perda de peso causada pela infecção
por ancilostomídeos. Não houve diferença estatística da média dos pesos dos
hamsters entre os quatro grupos experimentais, em nenhum dos dias avaliados
durante a infecção por A. ceylanicum (FIGURA 23).
FIGURA 23: Peso, em gramas, dos hamsters do ensaio de vacinação ao longo da infecção
com 100 L3 de A. ceylanicum.
FIGURA 22: Eliminação de ovos por grama de fezes dos hamsters dos quatro grupos do
ensaio de vacinação ao longo da infecção com 100 L3 de A. ceylanicum. O.P.G. = ovos por
grama de fezes.
99
Os hamsters dos quatro grupos experimentais ganharam peso na primeira
semana após a infecção por A. ceylanicum, mas perderam peso nas duas semanas
seguintes, sendo que a média dos pesos dos hamsters, dos quatro grupos, no dia 21
era significativamente menor que nos dias 0 e 7 após a infecção. A semana com a
perda de peso mais significativa foi entre 7-14 dias após a infecção, com exceção do
grupo AyD1 cuja diferença da média dos pesos entre os dias 7 e 14 não foi
estatisticamente significativa.
- Exame do volume globular e dosagem de hemoglobina
A imunização também não conferiu proteção contra a anemia causada pela
infecção por ancilostomídeos, avaliadas aqui pela comparação do exame
volumétrico de hemácias e níveis de hemoglobina do sangue dos hamsters antes e
no final da infecção por A. ceylanicum.
Os níveis de hemoglobina e o volume globular diminuíram significativamente
com a infecção, chegando a atingir níveis abaixo da taxa de normalidade (FIGURA
24).
FIGURA 24: Volume de hemácias (a) e níveis de hemoglobina (gramas por decilitro de
sangue) (b) de hamsters do ensaio de vacinação antes e ao final da infecção por A.
ceylanicum. As linhas pontilhadas indicam os valores de referência normais obtidos de
Mitruka e Rawnsley apud Gad (2007). D: dia do desafio com 100 L3 de A. ceylanicum; S: dia
do sacrifício. Diferença estatística entre os dias D e S do mesmo grupo * = p<0,05.
(a) (b)
100
- Recuperação de vermes adultos e proporção entre machos e fêmeas
Foram recuperados vermes adultos da mucosa do intestino delgado de todos
os hamsters, dos quatro grupos imunizados. Não houve diferença estatística
significativa entre a quantidade de vermes recuperados nos grupos imunizados (mix
e AyD1) quando comparados com os grupos controle (PBS e Adjuvante), assim
como não houve diferença estatisticamente significativa na proporção entre vermes
machos e fêmeas nos quatro grupos experimentais (FIGURA 25).
5.6. Teste de imunogenicidade
Os soros/plasmas de hamsters e cães infectados com ancilostomídeos foram
testados, através da técnica ELISA, em comparação com soros/plasmas negativos,
contra uma mix dos quatro domínios KU recombinantes e o domínio recombinante
de cada espécie infectante, para saber se há produção de anticorpos IgG contra
proteínas que possuem este domínio: inibidores de protease tipo Kunitz.
Dentre os cães, infectados com A. braziliense, A. caninum ou A. ceylanicum,
a produção de anticorpos IgG foi significativamente maior apenas para os cães
FIGURA 25: Recuperação de vermes adultos, machos e fêmeas, de A. ceylanicum do
intestino delgado dos hamsters do ensaio de vacinação, infectados com 100 L3 de A.
ceylanicum.
101
infectados com A. caninum, tanto para o domínio recombinante específico do A.
caninum, quanto para a mix de domínios, comparando-se os soros coletados no dia
do sacrifício e antes da infecção (FIGURA 26).
Para hamsters infectados com A. ceylanicum, também não houve resposta
humoral significativa contra proteínas com domínios KU, como verificado para os
hamsters do grupo 1 (PBS) do ensaio de vacinação deste trabalho (FIGURA 27).
FIGURA 26: Níveis de anticorpos IgG de cães infectados por A. braziliense (1:1000) (a), A.
caninum (1:500) (b) e A. ceylanicum (1:500) (c) frente a mix dos quatro domínios KU
recombinantes – AyD1, AbD2, AcD5 e Na16D1 – e ao domínio KU recombinante AbD2 (a),
AcD5 (b) e AyD1 (c). Diferença estatística entre negativo e positivo *** = p<0,001. Negativo:
antes da infecção; Positivo: dia do sacrifício.
(a) (b)
(c)
FIGURA 27: Níveis de anticorpos IgG de hamsters infectados por A. ceylanicum frente a mix
dos quatro domínios KU recombinantes – AyD1, AbD2, AcD5 e Na16D1 – e ao domínio KU
recombinante AyD1. Negativo: dia do desafio com 100 L3 de A. ceylanicum; Positivo: dia do
sacrifício.
102
Os hamsters infectados com N. americanus foram avaliados quanto a
produção de anticorpos IgG contra proteínas com domínios KU, além de produtos de
excreção/secreção e antígeno bruto total do parasito. Para os antígenos do parasito,
foi observada uma resposta por anticorpos IgG estatisticamente significativa nos
hamsters infectados por N. americanus, quando comparados com hamsters não
infectados (FIGURA 28). Houve maior reconhecimento dos domínios KU
recombinantes – mix e Na16D1 – pelos hamsters infectados, em relação aos não
infectados, mas esta não foi estatisticamente significativa (FIGURA 28).
Como os hamsters foram infectados com larvas infectantes (L3) de N.
americanus não adaptadas para esta espécie, apenas em dois hamsters foram
encontrados vermes adultos na mucosa intestinal.
FIGURA 28: Níveis de anticorpos IgG de hamsters infectados por N. americanus frente ao
antígeno bruto total e produtos de excreção e secreção de N. americanus (a) e frente a mix
dos quatro domínios KU recombinantes – AyD1, AbD2, AcD5 e Na16D1 – e ao domínio KU
recombinante Na16D1 (b). Diferença estatística entre negativo e positivo *** = p<0,001.
Negativo: pré-imune ensaio de vacinação; Positivo: 42 dias de infecção.
(a) (b)
103
DISCUSSÃO
104
6. DISCUSSÃO
Após a identificação de um número considerável de sequências gênicas
expressas e de algumas sequências genômicas, para membros da família
Ancylostomatidae, grupos de pesquisadores vem se voltando para o
aprofundamento na caracterização de genes selecionados e no envolvimento
desses genes nos processos biológicos da relação parasito/hospedeiro. Dessa
forma, genes codificando proteínas consideradas importantes para o
estabelecimento da infecção e da sobrevivência do parasito no hospedeiro, vêm
sendo selecionadas para serem mais bem caracterizados. Dentre essas possíveis
moléculas, temos proteínas candidatas ao desenvolvimento de vacinas ou mesmo
ao desenvolvimento de novos alvos para drogas.
O controle de ancilostomídeos nas regiões endêmicas é feito através do uso
de benzimidazóis anti-helmínticos (WHO, 2005). Entretanto, as altas taxas de
reinfecção após o tratamento, a diminuição da eficácia dos anti-helmínticos
utilizados devido ao seu uso frequente e o surgimento de uma possível resistência
dos ancilostomídeos a essas drogas, tem estimulado o interesse em desenvolver
vacinas recombinantes (HOTEZ et al., 2006). O desenvolvimento de vacinas
recombinantes envolve o conhecimento da função de várias proteínas do parasito e
sua possível capacidade imunogênica. Apesar do grande impacto da ancilostomose
nos países em desenvolvimento, os estudos moleculares de caracterização e função
de proteínas, para membros da família Ancylostomatidae, ainda são escassos.
A maior parte das proteínas já estudadas, em ancilostomídeos, está envolvida
no processo de invasão do parasito no hospedeiro, na digestão da hemoglobina
ingerida pelo ancilostomídeo e na proteção do ancilostomídeo contra o sistema
imune, além da ação das enzimas digestivas do hospedeiro (HAWDON et al., 2003;
105
WILLIAMSON et al., 2003; ZHAN et al., 2003), dentre as quais se destacam as ASPs
e os inibidores de proteases tipo Kunitz.
As ASPs (Ancylostoma Secreted Protein) são uma família de proteínas
secretadas, ricas em cisteína e específicas de nematódeos, que já foram descritas
em nove espécies do Filo (VISSER et al., 2008), sendo que já foram descritas 15
ASPs para ancilostomídeos (ASOJO et al., 2005; GOUD et al., 2004; ZHAN et al.,
1999; ZHAN et al., 2003) , além de identificadas 25 novas proteínas homólogas a
ASPs nos produtos ES de A. caninum (MULVENNA et al., 2009). Neste trabalho,
foram descritas três novas asps para A. braziliense e estas foram nomeadas de
acordo com as sequências ortólogas/homólogas de A. caninum, asp-4, asp-5 e asp-
6, uma vez que o cDNA foi amplificado utilizando iniciadores desenhados para as
sequências já descritas para A. caninum (ZHAN et al., 2003).
Este não é o caso das asps de A. ceylanicum disponíveis no banco de dados
do NCBI. As sequências de aminoácidos deduzidas de Ay-asp-4 e Ay-asp-5 são 50-
54% similar às ortólogas de A. braziliense e A. caninum e a proteína inferida Ay-
ASP-4 possui apenas um domínio SCP-like, enquanto a Ac-ASP-4 possui dois.
Como as asps de A. ceylanicum não têm alta similaridade com as asp-4 e asp-5
originalmente descritas para A. caninum (ZHAN et al., 2003), uma nomenclatura
diferente deveria ser usada para tais sequências. Assim como para ancilostomídeos,
a nomenclatura da maioria das ASPs descritas para nematódeos, incluindo Cooperia
punctata (YATSUDA et al., 2002), Ostertagia ostertagi (GELDHOF et al., 2003;
VISSER et al., 2008) e Onchocerca volvulus (TAWE et al., 2000), é bastante confusa
e requer revisão.
Além das asps de A. braziliense, foram descritas novas sequências parciais
de inibidores de proteases tipo Kunitz para ancilostomídeos. Proteínas tipo Kunitz
106
são uma classe de inibidores de proteases que podem ter um ou mais domínios
conservados (KU) e existem 44 proteínas de nematódeos no banco de dados
contendo esse(s) domínio(s) (HAWDON, et al., 2003). Até este presente trabalho, já
havia sido descrito dois genes tipo Kunitz para ancilostomídeos: um contendo um
domínio KU, de A. ceylanicum (MILSTONE et al., 2000), e outro com doze domínios
KU, de A. caninum (HAWDON, et al., 2003). Neste trabalho, foram obtidas novas
sequências parciais de genes tipo Kunitz para A. braziliense, A. caninum e A.
ceylanicum, utilizando iniciadores desenhados para os dois genes já disponíveis
para ancilostomídeos.
A transcrição diferencial em machos de asps e inibidores de proteases tipo
Kunitz observado em estudos anteriores (COSTA et al., 2008) foi confirmada para as
asps 4, 5 e 6 de A. braziliense e A. caninum, as asps 4 e 5 de A. ceylanicum, e para
dois genes de inibidores tipo Kunitz para as três espécies de ancilostomídeos neste
trabalho. Algumas moléculas semelhantes a estas já foram descritas em machos e
estariam relacionadas à reprodução.
O perfil macho-específico de um provável inibidor de serino-proteases de
Oesophagostomum dentatum, que pode estar envolvido na interação com proteases
endógenas associados a processos biológicos nos vermes adultos machos (BOAG
et al., 2002), e a expressão de proteínas com domínios semelhantes aos das ASPs
(KRÄTZSCHMAR et al., 1996) e tipo Kunitz (CLAUSS et al., 2011) em órgão
reprodutores masculinos de mamíferos, poderiam estar ligados à reprodução,
justificando assim o caráter macho-específico destas proteínas.
Entretanto, isto não se aplicaria às proteínas de ancilostomídeos. A
localização sub-cuticular da proteína Ay-Kunitz (1D) (CHU et al., 2004) e Ac-ASP-4,
nas glândulas cefálica e excretora da Ac-ASP5 e no trato intestinal Ac-ASP6 (ZHAN
107
et al., 2003), além destas proteínas serem excretadas/secretadas, incluindo as 25
novas proteínas similares a ASPs encontradas nos produtos ES de A. caninum
(MULVENNA et al., 2009), sugerem uma função não relacionada à reprodução e sim
na interação parasito-hospedeiro.
Observações similares, de genes de ASPs mais transcritos em machos
também foram feitas em outros nematódeos como O. ostertagi (VISSER et al.,
2008), C. elegans (REINKE et al., 2004), Trichostrongylus vitrinus (NISBET &
GASSER, 2004), O. dentatum (COTTEE et al., 2006) e Brugia malayi (LI et al.,
2005). A ASP-3 de O. ostertagi é mais transcrita em machos e se localiza no
esôfago, o que também torna improvável que esta proteína desempenhe um papel
na reprodução do parasito.
Em comparação com outros ancilostomídeos, a descrição de ASPs e
inibidores de proteases tipo Kunitz para o principal causador da ancilostomose
humana, o parasito N. americanus, ainda é escassa. Recentemente, foram
disponibilizadas um grande número de sequências para N. americanus (RABELO et
al., 2009; CANTACESSI et al., 2010), totalizando mais de 530 mil sequências
disponíveis no banco de dados do NCBI, que ainda foram pouco exploradas.
Neste trabalho, foram geradas, in silico, 94 sequências consenso, 36 similares
aos inibidores de proteases tipo Kunitz, Ay-Kunitz (1D) e Ac-Kunitz (12D), e 58
similares às ASPs 4, 5 e 6 de A. caninum e 4 e 5 de A. ceylanicum. Estas
sequências poderão ser utilizadas em estudos futuros para melhor caracterização
destas proteínas em N. americanus.
O grande número de ESTs de ancilostomídeos depositadas nos bancos de
dados de DNA que possuem homologia com inibidores de proteases tipo Kunitz,
além do perfil macho-enriquecido observado para os genes já descritos neste
108
trabalho e em estudos anteriores (COSTA et al., 2008), tornou evidente a
necessidade do aprofundamento de estudos com tais proteínas.
A comparação da expressão de genes de inibidores tipo Kunitz entre machos
e fêmeas de ancilostomídeos foi feita utilizando soro de camundongos imunizados
apenas com os domínios KU recombinantes para que, além da comparação da
expressão, fosse possível conhecer a quantidade e o perfil de proteínas que contêm
este domínio conservado, ou seja, prováveis inibidores tipo Kunitz, nos produtos ES
e extratos protéicos totais dos parasitos. Curiosamente, a maioria das proteínas
reconhecidas nos produtos ES era de N. americanus e, em contraparitda, para os
extratos protéicos totais, foram reconhecidas proteínas apenas nos extratos das
espécies de Ancylostoma, demonstrando assim uma diferença na expressão
protéica deste inibidor entre as duas subfamílias de ancilostomídeos.
Sendo assim, foram identificadas 14 proteínas que provavelmente possuem
este domínio conservado, sendo seis de produtos ES de A. caninum, A. ceylanicum
e N. americanus e oito dos extratos protéicos totais de A. braziliense, A. caninum e
A. ceylanicum. Estudos futuros serão necessários para confirmar se tais proteínas
seriam realmente inibidores de proteases tipo Kunitz.
A transcrição diferencial de inibidores de proteases tipo Kunitz foi
parcialmente confirmada, quando avaliada a expressão das proteínas, uma vez que
a maioria das proteínas reconhecidas nos extratos protéicos totais das espécies de
Ancylostoma é de machos. Já para os produtos ES, não houve reconhecimento
diferencial significativo para estes inibidores.
Embora os domínios KU utilizados para produção do soro apresentassem
sequências diferentes, eles ainda apresentam um alto grau de conservação, por se
tratarem de um domínio conservado, não sendo possível observar um
109
reconhecimento específico entre o soro produzido com o domínio recombinante de
cada espécie, como já era esperado. Da mesma forma, o fato de existirem vários
genes contendo diferentes combinações desses domínios pode ter mascarado o
caráter macho-específico significativo que foi observado para o RNA. Ou seja, as
diferenças podem ter sido observadas para o RNA com iniciadores específicos para
cada domínio, que devido à degeneração do código genético foram mascaradas nas
proteínas.
Embora a vacinação não estivesse inicialmente contemplada nos objetivos
deste trabalho, uma vez expressos os domínios KU, foi decidido testar a
possibilidade de esses domínios serem usados em ensaios de vacinação, além de
verificar se haveria interferência na proporção de vermes adultos machos e fêmeas
que viessem a ser recuperados da mucosa intestinal.
Atualmente, os modelos usados para o estudo da infecção por
ancilostomídeos são modelos naturais ou permissíveis, tais como o cão e hamsters,
respectivamente. Apesar de estes modelos apresentarem limitações quanto ao
desenvolvimento de resistência às infecções, cães podem ser utilizados na infecção
por A. ceylanicum e A. caninum, enquanto hamsters albergam A. ceylanicum e N.
americanus (GARSIDE et al., 1990; LOUKAS & PROCIV, 2001; FUJIWARA et al.,
2006).
A infecção de hamsters (Mesocricetus auratus) por A. ceylanicum tem sido
usada como modelo da infecção experimental por ancilostomídeos em estudos de
patologia, imunologia e vacinação (DONDJI et al., 2008; ALKAZMI et al., 2006, 2008;
GHOSH et al., 2006; BUNGIRO et al., 2001; MENON & BOPHALE, 1985). Ao
contrário de camundongos, que não permitem o desenvolvimento de parasitos
110
adultos de Ancylostoma, hamsters imunocompetentes são permissíveis ao
desenvolvimento de ancilostomídeos parasitos do homem, inclusive A. ceylanicum.
Assim, larvas infectantes (L3) administradas por via oral em hamster se
desenvolvem no intestino delgado em vermes adultos (BUNGIRO et al., 2003). O
modelo é útil porque reproduz a perda de peso, diminuição no ritmo de crescimento
e anemia encontrados em infecções maciças por ancilostomídeos em humanos
(MENON & BOPHALE, 1985; GARSIDE & BEHNKE, 1989; BUNGIRO et al., 2001, 2003;
GHOSH et al., 2006). Entretanto, hamsters desenvolvem uma resistência parcial a
infecções secundárias por A. ceylanicum (GARSIDE et al., 1990).
Ainda que a imunização dos hamsters com uma mix dos quatro domínios
recombinantes ou com o domínio específico de A. ceylanicum, a espécie utilizada
como modelo em hamsters, tenha sido eficaz, não foi produzida uma resposta
protetora em nenhum dos aspectos analisados no curso da infecção.
Neste trabalho, foram feitas três imunizações com 25 µg de proteínas cada,
assim como utilizado por Xiao e colaboradores (2008), que verificaram uma redução
de 29,3-50,6% de vermes adultos recuperados do intestino de hamsters infectados
com 150 larvas infectantes (L3) de N. americanus, utilizando proteínas
recombinantes de A. caninum e N. americanus, Ac-aspartic protease 1, Ac-
glutathione-S transferase 1, Na-Ancylostoma secreted protein 2 e Na-cysteine
proteases 2.
Em outro estudo, Chu e colaboradores (2004) constataram que hamsters
vacinados com Kunitz (1D) de A. ceylanicum apresentaram maior ganho de peso do
que os não vacinados e, ao contrário do que se imaginava, esse inibidor não tem
relação alguma com a anemia provocada em infecções por ancilostomídeos,
demonstrando que a inibição da ação de serino-proteases, como tripsina,
111
quimiotripsina, elastase pancreática e elastase de neutrófilos, é um dos fatores
envolvidos no atraso de crescimento do hospedeiro.
Neste caso, os hamsters foram imunizados com três doses de 100 µg (1ª) e
50 µg (2ª e 3ª) de proteína cada, desafiados com 100 larvas infectantes (L3) de A.
ceylanicum, sendo avaliados apenas o ganho de peso e a concentração de
hemoglobina durante 60 dias de infecção. Como o objetivo do ensaio de vacinação
do nosso trabalho era avaliar, dentre outros parâmetros, a quantidade de vermes
adultos recuperados da mucosa intestinal dos hamsters, estes foram sacrificados na
fase aguda da doença, com 22 dias de infecção.
As vacinas contra helmintos que estão atualmente em desenvolvimento têm
como alvo proteínas envolvidas nos processos metabólicos e de aquisição de
nutrientes pelos parasitos (HOTEZ et al., 2010) e assume-se que vacinas anti-
helmínticas devem ser multivalentes, uma vez que as várias fases do parasito tem
transcripitomas e proteomas muito distintos (LOUKAS et al., 2011). Acredita-se
também que para essa associação deve-se usar antígenos distintos, que tenham
demonstrado proteção parcial anteriormente (PINHEIRO et al., 2011), sendo
também necessária a avaliação de excipientes que tornem a vacina estável contra a
degradação do antígeno, o que poderia resultar em perda da atividade e
imunogenicidade (PLIESKATT et al., 2012).
Além disso, estudos têm avaliado a possibilidade de desenvolvimento de
vacinas multivalentes para mais de uma doença, como ancilostomose e
esquistossomose mansoni, o que poderia aumentar a eficiência da vacina e a
abrangência da distribuição da mesma, uma vez que a maior parte das áreas de
ocorrência das duas doenças se sobrepõe (HOTEZ et al., 2010).
112
Apesar dos esforços para desenvolvimento de vacinas anti-helmínticas
humanas, esta ainda é uma realidade um pouco distante. Para ancilostomídeos, a
proteína promissora ASP-2, que havia demonstrado proteger parcialmente cães e/ou
hamsters contra infecções por A. caninum (BETHONY et al., 2005), A. ceylanicum
(GOUD et al., 2004; MENDEZ et al., 2005) e N. americanus (XIAO et al., 2008) e ser
bem tolerada imunogenicamente em humanos vacinados na fase 1 nos EUA
(BETHONY et al., 2008), foi descartada pois se mostrou extremamente alergênica
quando testada em indivíduos de áreas endêmicas no Brasil (BETHONY et al.,
2011).
Para esquistossomose mansoni, os antígenos candidatos para vacina têm
demonstrado não ser muito eficazes e a estratégia de usar vacinas multivalentes
com peptídeos sintéticos ou de DNA não geraram níveis mais elevados de proteção
quando comparados ao uso de um único antígeno (revisado por PINHEIRO et al.,
2011).
O fato dos domínios KU testados nesse trabalho terem desencadeado uma
resposta imune aos mesmos, demonstra a potencialidade de serem testados
futuramente em combinações com outros peptídeos ou proteínas recombinantes.
Os domínios KU recombinantes produzidos neste trabalho foram utilizados
para saber se há produção de anticorpos IgG contra proteínas que possuem este
domínio conservado, inibidores de protease tipo Kunitz, em animais infectados por
ancilostomídeos. Dos soros de cães infectados com A. braziliense, A. canium ou A.
ceylanicum avaliados, apenas os cães infectados com A. caninum produziram
resposta humoral significativa contra proteínas com domínios KU.
Os soros utilizados neste trabalho foram obtidos em estudo prévio do nosso
grupo, por Cunha (2009). Neste estudo, três grupos distintos de animais foram
113
infectados com larvas de A. ceylanicum, A. caninum e A. braziliense, para
comparação de parâmetros imunológicos e parasitológicos da infecção. Foi
observado que o grupo de cães infectados com A. caninum apresentou uma
elevação da produção de IgG reativa, em títulos de IgG total, mais precoce e mais
intensa que os outros dois grupos, tanto contra os antígenos totais quanto para os
antígenos secretados e excretados do parasito. Esse fato poderia explicar o
resultado encontrado no presente trabalho no qual ocorreu o reconhecimento, por
IgG, dos domínios KU recombinantes apenas para o grupo de A. caninum que,
provavelmente por ser o parasito mais adaptado ao hospedeiro em questão,
produziu uma resposta mais efetiva.
Além do soro de cães, foram avaliados plasmas/soros de hamsters infectados
com A. ceylanicum ou N. americanus. Os dois grupos apresentaram elevação da
produção de IgG reativa contra extratos protéicos totais e produtos ES dos parasitos
com os quais estavam infectados, mas não tiveram reconhecimento significativo dos
domínios KU recombinantes testados. Para N. americanus, como os hamsters foram
infectados com larvas infectantes (L3) de N. americanus não adaptadas para esta
espécie, apenas em dois hamsters foram encontrados vermes adultos na mucosa
intestinal. Isso pode explicar o reconhecimento não-significativo dos domínios
recombinantes KU por anticorpos dos animais infectados.
Humanos, cães, camundongos e hamsters possuem inibidores tipo Kunitz que
possuem domínios conservados KU assim como os dois inibidores de proteases tipo
Kunitz dos ancilostomídeos, como aprotininas e TFPI (Tissue Factor Pathway
Inhibitor) (CRAWLEY et al., 2008; GIRARD et al., 1994; MARONEY et al., 2011;
número de acesso DE31814). A proteína TFPI é um fator que inibe a produção de
trombina através da via extrínseca da coagulação sanguínea e, em condições
114
normais, é expressa principalmente por células endoteliais vasculares, sendo que
cerca de 20% encontra-se no plasma, principalmente ligados a lipoproteína de baixa
densidade (LDL) (CRAWLEY et al., 2008; OSTERUD, 2012).
Apesar da similaridade das sequências de aminoácidos dos domínios KU de
humanos, cães, camundongos e hamsters com as sequências dos domínios KU
recombinantes expressos neste trabalho (40-60%), não acreditamos que isso
pudesse interferir na produção de anticorpos por hospedeiros, quando infectados por
ancilostomídeos, ou por humanos imunizados com tais domínios, uma vez que neste
trabalho foi alcançada imunização satisfatória e específica de camundongos e
hamsters pelos domínios KU recombinantes.
O reconhecimento de 14 proteínas que possuem domínios KU neste trabalho,
especialmente as proteínas específicas de N. americanus nos produtos de excreção
e secreção, abre novas perspectivas para o estudo de tais proteínas nos
ancilostomídeos. Uma próxima etapa seria a identificação destas, por espectrometria
de massa, para verificar se tais proteínas seriam realmente inibidores de proteases
tipo Kunitz. As proteínas poderiam ser extraídas do gel de poliacrilamida, após
corrida eletroforética dos antígenos, tratadas com tripsina para posterior análise em
espectrômetro de massa e comparação com banco de proteínas, como já realizado
para ancilostomídeos (MULVENNA et al., 2009).
Além disso, poderiam ser realizadas a expressão e caracterização de
algumas destas proteínas, principalmente Ac-Kunitz (12D) e das sequências
consenso geradas para N. americanus, submetendo-as a ensaios funcionais
biológicos, incluindo inibição de proteases, atividade anticoagulante e inibição de
complemento, para determinar sua possível função.
115
Outra estratégia bastante útil e que vem se tornando cada vez mais comum, é
o estudo da função das proteínas através do silenciamento pós-transcrição por RNAi
(FIRE et al., 1998). Essa estratégia poderia ser usada em estudos futuros na
tentativa de aprofundar a caracterização e função do gene Kunitz (12D). A
interferência por RNA (RNAi) é uma técnica que suprime a expressão de um gene,
pela degradação do seu RNA mensageiro, utilizando um RNA fita dupla (doubled-
stranded RNA – dsRNA) gene-específico. A técnica foi originalmente caracterizada
em Caenorhabditis elegans (Fire et al., 1998) e desde então vem sendo utilizada
para estudar a função gênica em uma ampla variedade de organismos, incluindo
helmintos (GELDHOF et al., 2007).
O silenciamento pós-transcrição por RNAi também já foi feito em
ancilostomídeos. Marques (2008) demonstrou diminuição de 80% nos níveis de
mRNA e significativa redução na expressão da proteína APR-1 (cathepsin D-like
aspartic protease) em A. ceylanicum. Portanto, a supressão gênica por RNAi
consiste em uma estratégia factível e bastante útil para o estudo de proteínas de
ancilostomídeos envolvidas no parasitismo, apesar da eficiência do silenciamento
gênico poder ser extremamente variável (ISSA et al., 2005; GELDHOF et al., 2006;
VISSER et al., 2006).
116
CONCLUSÕES
117
7. CONCLUSÕES
• Foram obtidas sete novas sequências parciais para ancilostomídeos: três
asps para A. braziliense e quatro inibidores de protease tipo Kunitz, dois para
A. braziliense, um para A. caninum e um para A. ceylanicum;
• Foi verificada a transcrição diferencial em machos, em relação às fêmeas,
das asps 4, 5 e 6 de A. braziliense e A. caninum, das asps 4 e 5 de A.
ceylanicum e de dois genes de inibidores de proteases tipo Kunitz (1D e 12D)
para as três espécies, através de RT-PCR convencional e RT-PCR em tempo
real;
• Foram geradas, in silico, 36 sequências consenso similares aos inibidores de
proteases tipo Kunitz e 58 às asps para N. americanus, a partir do banco de
ESTs do parasito;
• Quatro domínios Kunitz distintos para as espécies A. braziliense, A. caninum,
A. ceylanicum e N. americanus foram expressos e utilizados para a produção
de anticorpos;
• A expressão diferencial em machos, em relação às fêmeas, de inibidores de
proteases tipo Kunitz dos extratos protéicos totais de A. braziliense, A.
caninum e A. ceylanicum foi parcialmente confirmada, através de western
blot, utilizando soros obtidos através da imunização de camundongos com um
domínio KU recombinante de cada espécie;
• Não foi confirmada a expressão diferencial de inibidores de proteases tipo
Kunitz presentes nos produtos de excreção e secreção de A. caninum, A.
ceylanicum e N. americanus e extrato protéico total de N. americanus, através
de western blot, utilizando soros obtidos através da imunização de
camundongos com um domínio KU recombinante de cada espécie;
118
• Foram reconhecidas 14 proteínas distintas, sendo seis de produtos ES e oito
de extratos protéicos totais das quatro espécies, que provavelmente contêm o
domínio conservado KU;
• Dentre estas proteínas, foram reconhecidas proteínas específicas de N.
americanus para os produtos ES de machos e fêmeas usando soro dos
camundongos imunizados com os domínios KU recombinantes. A identidade
de tais proteínas deverá ser confirmada em estudos futuros.
• A vacinação de hamsters com os domínios KU recombinantes não conferiu
proteção contra a infecção por A. ceylanicum;
• O soro de cães infectados com A. braziliense ou A. ceylanicum e de hamsters
infectados com A. ceylanicum ou N. americanus não reconheceu de maneira
significativa os quatro domínios KU recombinantes e o domínio recombinante
de cada espécie infectante;
• O soro de cães infectados com A. caninum foi capaz de reconhecer os quatro
domínios KU recombinantes e o domínio KU recombinante específico.
119
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131
APÊNDICES
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APÊNDICE A – Iniciadores utilizados para amplificação do cDNA, sequenciamento, RT-PCR convencional e quantitativo
cDNA/gene Espéciesa Iniciador direto Iniciador reverso Produto (pb)
amplificação e sequenciamento do cDNAb
asp-4 Ab ASP4/1AcF: 5’ CGC TTG CCA TAA CCT CTC TT 3’ ASP4/2AcR: 5’ CCC AAT CCA ATC TAA CCA CC 3’ 1625 Ab e Ac ASP4/1AcF: 5’ CGC TTG CCA TAA CCT CTC TT 3’ ASP4/1AcR: 5’ GCT TTT GTT GTT GTT GCC CC 3’ 853 Ab ASP4/2AcF: 5’ CAT CTA CAT CGG CAA GCA CA 3’ ASP4/2AcR: 5’ CCC AAT CCA ATC TAA CCA CC 3’ 881 Ay ASP4/1AyF: 5’ CGA AAA CAA TAG CAG ATG ACT 3’ ASP4/1AyR: 5’ CGA GCA TTT CTA CAG GAG GA 3’ 110 asp-5 Ab ASP5/1AcF: 5’ AGG AGA ACT CTC ACT GCA TC 3’ ASP5/2AcR: 5’ TCG TGA AAC AGT CCA GTG AA 3’ 1321 Ab e Ac ASP5/1AcF: 5’ AGG AGA ACT CTC ACT GCA TC 3’ ASP5/1AcR: 5’ GCA TCA GTC ATT TCA GCG TTT 3’ 740 Ab ASP5/2AcF: 5’ ATT ATT CCT ACG CCA CAT CCA 3’ ASP5/2AcR: 5’ TCG TGA AAC AGT CCA GTG AA 3’ 658 Ay ASP5/1AyF: 5’ AGA CGC AGA CAA CAG ATA CC 3’ ASP5/1AyR: 5’ CCA TTC TAT TGC CAC ACA CAT 3’ 113 asp-6 Ab ASP6/1AcF: 5’ GCT CTT CAT TCT GGT TTT GGT 3’ ASP6/2AcR: 5’ CAC GCT TGG TTT ATT GCT CG 3’ 1407 Ab e Ac ASP6/1AcF: 5’ GCT CTT CAT TCT GGT TTT GGT 3’ ASP6/1AcR: 5’ CTG AGT CCG TTG TGC GTA TT 3’ 846 Ab ASP6/2AcF: 5’ GCT CCA CCA CCA ACA ACT G 3’ ASP6/2AcR: 5’ CAC GCT TGG TTT ATT GCT CG 3’ 695 Kunitz (1D) Ab, Ac e Ay KU/1AyF: 5’ TCT TCT GGT GGT GCT GCT TT 3’ KU/1AyR: 5’ CGG CAT CCT CCA TAA ACG AA 3’ 189 Kunitz (12D) Ab, Ac e Ay KU/1AcF: 5’ AAG TGG GGC CAT GTA AAG GA 3’ KU/1AcR: 5’ CTC TGG TAC TGC TTT CTT ACA 3’ 344
RT-PCR
asp-4 Ab e Ac ASP4/2AcF: 5’ CAT CTA CAT CGG CAA GCA CA 3’ ASP4/3AcR: 5’ CGT GTT CTA TGG CTC CTT GT 3’ 348 Ay ASP4/1AyF: 5’ CGA AAA CAA TAG CAG ATG ACT 3’ ASP4/1AyR: 5’ CGA GCA TTT CTA CAG GAG GA 3’ 110 asp-5 Ab e Ac ASP5/3AcF: 5’ GGC TGT CAC TAT GCG AAA TG 3’ ASP5/3AcR: 5’ TGG GGC AGT TGT AAG CAT TTT 3’ 337 Ay ASP5/1AyF: 5’ AGA CGC AGA CAA CAG ATA CC 3’ ASP5/1AyR: 5’ CCA TTC TAT TGC CAC ACA CAT 3’ 113 asp-6 Ab e Ac ASP6/3AcF: 5’ GGG TAT GCC AAT CTA TGA GG 3’ ASP6/1AcR: 5’ CTG AGT CCG TTG TGC GTA TT 3’ 324 Kunitz (1D) Ab, Ac e Ay KU/1AyF: 5’ TCT TCT GGT GGT GCT GCT TT 3’ KU/1AyR : 5’ CGG CAT CCT CCA TAA ACG AA 3’ 189 Kunitz (12D) Ab, Ac e Ay KU/1AcF: 5’ AAG TGG GGC CAT GTA AAG GA 3’ KU/1AcR: 5’ CTC TGG TAC TGC TTT CTT ACA 3’ 344
RT-PCR em tempo real
asp-4 Ab e Ac ASP4/2AcF: 5’ CAT CTA CAT CGG CAA GCA CA 3’ ASP4/1AcR: 5’ GCT TTT GTT GTT GTT GCC CC 3’ 109 Ay ASP4/1AyF: 5’ CGA AAA CAA TAG CAG ATG ACT 3’ ASP4/1AyR: 5’ CGA GCA TTT CTA CAG GAG GA 3’ 110 asp-5 Ab e Ac ASP5/2AcF: 5’ ATT ATT CCT ACG CCA CAT CCA 3’ ASP5/1AcR: 5’ GCA TCA GTC ATT TCA GCG TTT 3’ 77 Ay ASP5/1AyF: 5’ AGA CGC AGA CAA CAG ATA CC 3’ ASP5/1AyR: 5’ CCA TTC TAT TGC CAC ACA CAT 3’ 113 asp-6 Ab e Ac ASP6/2AcF: 5’ GCT CCA CCA CCA ACA ACT G 3’ ASP6/1AcR: 5’ CTG AGT CCG TTG TGC GTA TT 3’ 134 Kunitz (1D) Ab, Ac e Ay KU/2AyF: 5’ AGC TGA CAG ACG AGG AGA GAT GT 3’ KU/2AyR: 5’ CTC TTG AAG AAC GCC ATG CA 3’ 73 Kunitz (12D) Ab, Ac e Ay KU/2AcF: 5’CAA AGA AGC CTG CCT CAA GTA AC 3’ KU/2AcR: 5’ GGC AGA GAC AAC CGA ATG ATC 3’ 71
a Espécies A. braziliense (Ab), A. caninum (Ac) e A. ceylanicum (Ay). b Para asps de A. braziliense, o cDNA completo foi obtido e depois sequenciado por dois diferentes pares de iniciadores, gerando fragmentos sobrepostos.
133
APÊNDICE B – Iniciadores utilizados para amplificação dos domínios KU
Origem Nome Sequênciaa Produto (pb)
Ab-Kunitz (12D) AbD2
Direto 5’ CCCAAGCTTGGGGAGAGCTGTTCACAGCCCA 3’
185 Reverso 5’ CCGCTCGAGCGCTTACACGTCTCCATGCACT 3’
Ac-Kunitz (12D)
AcD3
Direto 5’ CCCAAGCTTGGGGATGCATGCCTATTGCCATC 3’
182 Reverso 5’ CCGCTCGAGCGGCAGGTTTCCATGCATTTGG 3’
AcD5
Direto 5’ CCCAAGCTTGGGGACACCTGCTCACAGCCC 3’
185 Reverso 5’ CCGCTCGAGCGCTTACATGTCCGGGTGCAC 3’
AcD11
Direto 5’ CCCAAGCTTGGGGATAAATGCTTGCTGCCAATT 3’
182 Reverso 5’ CCGCTCGAGCGGCACGCATCCTGGCAGTC 3’
AcD12
Direto 5’ CCCAAGCTTGGGAGTCCATGCACCCTTCCTAT 3’
176 Reverso 5’ CCGCTCGAGCGGCAGGCTTCTTTGCAATCG 3’
Ay-Kunitz (1D) AyD1
Direto 5’ CCCAAGCTTGGGGAGAGATGTAATGCTCCGAC 3’
191 Reverso 5’ CCGCTCGAGCGTACACAAGTCTTCTTGCACTC 3’
Na-KContig1 Na1D2
Direto 5’ CCCAAGCTTGGGACAGCATGCAGTCTTCCAAT 3’
185 Reverso 5’ CCGCTCGAGCGAAGACATGTATTTTCGCACTC 3’
Na-KContig8 Na8D2
Direto 5’ CCCAAGCTTGGGAACATTTGTACGCTGCCAATA 3’
182 Reverso 5’ CCGCTCGAGCGACATGCAACCTCACAAGAAAG 3’
Na-KContig16 Na16D1
Direto 5’ CCCAAGCTTGGGAGATGCACGCTTCCAATAAAA 3’
182 Reverso 5’ CCGCTCGAGCGGAGGCATGTTTTCTGGCATT 3’
a Sítios para enzimas de restrição (negrito): direto – Hind III; reverso – Xho I
134
APÊNDICE C – Sequências nucleotídicas e aminoacídicas dos domínios KU
inseridas no vetor pJexpress 414 (DNA2.0)
> AyD1
AGGAGGTAAAACATATGGAACGCTGCAACGCCCCAACCCACCTGGACGGCCCACAATGCATGGCGTTC
TTTAAGCGTTACACGTATAACAAAGAGAAAAAGCAGTGCGAGGAGTTTGTGTACGGTGGTTGTCGTCC
GAGCCCGAACAATTTCGAAACTATGGAGGAATGTAAAAAGACCTGTGTTCTCGAGCACCATCACCACC
ATCATTAA
> AyD1 (proteína)
MERCNAPTHLDGPQCMAFFKRYTYNKEKKQCEEFVYGGCRPSPNNFETMEECKKTCVLEHHHHHH
> AbD2
AGGAGGTAAAACATATGGAGAGCTGCAGCCAACCGATCGAAGTAGGCCCGTGCAAAGCAATGCTGGAG
CGTTTTGCGTACGATGACAAGAAAAAGAAGTGTGTTGAATTCTTTTATGGTGGTTGTCGCGGCAATCA
GAACAACTTCAAATCCATGGAGAAGTGCATGGAAACCTGTAAACTCGAGCACCACCACCATCATCACT
AA
>AbD2 (proteína)
MESCSQPIEVGPCKAMLERFAYDDKKKKCVEFFYGGCRGNQNNFKSMEKCMETCKLEHHHHHH
> AcD5
AGGAGGTAAAACATATGGACACCTGCAGCCAACCAATCGAAGTCGGCCCGTGCAAAGCAATGCTGAAG
CGTTACGCGTATGATAACAAAAAGAATAAGTGTGTTCGCTTCATTTACGGTGGTTGTAAAGGCAACAA
GAACAATTTTGAGAGCATGGAGGAGTGCACGCGTACCTGTAAACTCGAGCACCATCACCACCACCATT
AA
>AcD5 (proteína)
MDTCSQPIEVGPCKAMLKRYAYDNKKNKCVRFIYGGCKGNKNNFESMEECTRTCKLEHHHHHH
> Na16D1
AGGAGGTAAAACATATGCGCTGCACCCTGCCTATCAAACGCGGCCGCTGCCTGGCACTGAACCCGCGT
TATGGTTTCGACGGTAAAACGGGTCGTTGTGTTAAGTTCATTTACGGTGGCTGTGGCGGTAATGCGAA
TAACTTTGAAACCCTGAAGGAGTGTCAGAAAACTTGCTTGCTCGAGCACCACCATCACCACCATTAA
> Na16D1 (proteína)
MRCTLPIKRGRCLALNPRYGFDGKTGRCVKFIYGGCGGNANNFETLKECQKTCLLEHHHHHH
Legenda:
- RBS consenso para E. coli
- Sítios para enzima de restrição
- Cauda de histidina
- Códon de terminação
- Domínio KU
135
APÊNDICE D – Artigo publicado
136
137
138
139
140
141
APÊNDICE E – Publicações decorrentes de colaborações realizadas durante o
Doutorado
- Artigo Publicado
- Artigos Aceitos para Publicação
CAMPOS, L.C.; LAVALLE, G.E.; ESTRELA-LIMA, A.; FARIA, J.C.M.; GUIMARÃES, J.E.; DUTRA, A.P.; FERREIRA, E.; SOUSA, L. P.; RABELO, E.M.L.; COSTA, A.F.; CASSALI, G.D. CA15.3, CEA and LDH in dogs with malignant mammary tumors. Journal of Veterinary Internal Medicine, 2012. DIAS, S.R.; COSTA, A.F.; GAZZINELLI-GUIMARÃES, P.H.; ROATTB, B.M.; FONSECA, K.S.; PAIVA, N.C.; GIUNCHETTIB, R.C.; FUJIWARA, R.T.; RABELO, E.M. Prednisolone and cyclosporine a: effects on an experimental model of ancylostomiasis. Experimental Parasitology, 2012.