caracterização das propriedades de microestruturas porosas … · impressão de scaffolds...

Caracterização das propriedades de microestruturas

porosas produzidas por impressão 3D para utilização como

substitutos ósseos

Ana Teresa Pina Barrigoto Laranjeira

Dissertação para a obtenção do grau de Mestre em

Bioengenharia e Nanosistemas

Orientadores: Prof. Paulo Fernandes

Prof. André Castro

Júri

Presidente: Prof. Gabriel Monteiro

Orientador: Prof. André Castro

Vogais: Prof. Rui Ruben

Janeiro, 2019

https://fenix.tecnico.ulisboa.pt/cursos/mbionano/dissertacao/846778572212042



Aos meus pais

Ao meu namorado

Aos meus amigos

i

Agradecimentos

Para a realização da minha tese e principalmente para a sua finalização, tenho vários agradecimentos

sinceros a fazer:

Em primeiro lugar tenho que agradecer ao meu orientador, o Professor Paulo Fernandes, começando

pelo facto de ter aceite ser o meu orientador, o único que eu idealizei ter e finalizando com toda a ajuda,

amizade e disponibilidade que me facultou, desde o início até ao fim deste trabalho.

De seguida, tenho que agradecer ao meu coorientador, Professor André Castro, pelo seu contributo

critico e científico durante a realização deste trabalho.

Ao Engenheiro Sérgio Gonçalves, apresento os meus mais sinceros agradecimentos, por toda a

paciência, amizade e disponibilidade e principalmente por todo o apoio que me deu na realização deste

trabalho, tanto no contexto teórico, como no contexto prático.

Aos meus pais, visto que me possibilitaram a frequência do meu curso, mas acima de tudo à minha

mãe, pelo seu amor, carinho e amizade, até nas alturas em que foi difícil continuar, mas com ela, tudo

se tornou mais fácil.

Um especial agradecimento ao meu namorado, que sempre me apoiou, quer nos bons, quer nos maus

momentos, por toda a força incondicional que me deu. Pelas variadas vezes que o fiz “ler na diagonal”

o meu trabalho, mas acima de tudo pelo amor e orientação, constantes neste percurso.

E por último, tenho que agradecer aos meus amigos, pela forma como me apoiaram e me fizeram

perceber, que às vezes sair de casa é um excelente remédio, para se regressar com muito mais

produtividade. Por toda a sua amizade e sem dúvida, por toda a paciência, que sempre tiveram.

iii

Resumo

A Engenharia de Tecidos é uma disciplina que combina diferentes áreas, nomeadamente a Engenharia,

a Biologia e a Medicina. O desenvolvimento de tecidos e órgãos que possam atuar no tratamento de

doenças graves, cada vez mais frequentes devido ao prolongamento da esperança média de vida é um

desafio para a Bioengenharia e Engenharia Biomédica. No caso da Engenharia do Tecido Ósseo, o

desenvolvimento de substitutos ósseos artificiais pode ajudar a resolver os problemas dos auto e

aloenxertos, tais como a incompatibilidade e a escassez de recursos devido aos limites dos bancos de

ossos. Estes substitutos ósseos exigem certas características na sua geometria e material para que o

osso que vão reparar ou substituir possa continuar a cumprir a sua função estrutural e promovam a

regeneração do tecido, proporcionando um ambiente favorável à proliferação e difusão celular.

O desenvolvimento de scaffolds (suportes para a regeneração do tecido) para a Engenharia do Tecido

ósseo, tem tirado partido de técnicas de fabrico inovadoras, como a impressão 3D, uma vez que esta

permite um controlo rigoroso da arquitetura do objeto a produzir e por consequência, o controlo das

propriedades requeridas, em particular do seu comportamento mecânico. No entanto, é preciso

assegurar que o processo de impressão escolhido conduz a scaffolds com as características definidas

na sua fase de projeto.

Neste âmbito, a presente dissertação tem como objetivo contribuir para a verificação do processo de

impressão de scaffolds utilizando uma tecnologia Multijet, em particular a impressora ProJet 3600 da

3D Systems. Uma vez que este processo utiliza um material de suporte que ocupa os poros do scaffold,

e que uma deficiente remoção pode comprometer as suas propriedades, o trabalho teve como objetivo

específico a análise e otimização do tratamento de limpeza dos scaffolds, após impressão.

Assim, monitorizou-se o processo de tratamento e limpeza de scaffolds com estruturas porosas

periódicas obtidos com base em TPMS (Triply Periodic Minimal Surfaces) para diferentes frações

volúmicas. Esta monitorização consistiu no controlo de peso e respetiva densidade ao longo do

processo, finalizando com um conjunto de ensaios mecânicos de compressão para aferir as

propriedades mecânicas finais.

Concluiu-se que o processo de limpeza recomendado pelo fabricante se mostrou eficaz para os

scaffolds testados, sendo que o módulo de rigidez obtido nos ensaios mecânicos se encontrava dentro

dos valores esperados.

Palavras-chave

Scaffolds, Impressão 3D, Tratamentos de limpeza dos scaffolds, Ensaios mecânicos, Engenharia de

Tecidos, Porosidade

v

Abstract:

Tissue Engineering is a discipline that combines different areas, namely Engineering, Biology and

Medicine. The development of tissues and organs that can act in the treatment of serious diseases,

increasingly frequent due to the prolongation of the average life expectancy is a challenge for

Bioengineering and Biomedical Engineering. In the case of Bone Tissue Engineering, the development

of artificial bone substitutes can help to resolve auto and allograft problems, such as the incompatibility

and resource scarcity due to bone bank boundaries. Bone substitutes require certain characteristics in

their geometry and material so that the bone they are going to repair or replace can continue to fulfill its

structural function and promote tissue regeneration, providing an environment to cell proliferation and

diffusion.

The development of scaffolds for bone tissue engineering has taken advantage of innovative

manufacturing techniques, such as 3D printing, since it allows a rigorous control of the architecture of

the object to be produced and consequently, the control of the required properties, their mechanical

behavior. However, it is necessary to ensure that the printing process chosen, leads to scaffolds with

the characteristics defined in their design phase.

In this context, the present dissertation aims to contribute to the verification of the printing process of

scaffolds using a Multijet technology, in particular the ProJet 3600 printer from 3D Systems. Since this

process use a carrier material that occupies the pores of the scaffold, a poor removal can compromise

its properties, the specific objective of the work was to analyze and optimize the scaffold cleaning

treatment after printing.

The process of treatment and cleaning of scaffolds with periodic porous structures obtained based on

TPMS (Triply Periodic Minimal Surfaces) for different volume fractions was monitored. This monitoring

consisted of weight control and respective density throughout the process, ending with a set of

mechanical compression tests to verify the final mechanical properties.

It was concluded that the cleaning process recommended by the manufacturer proved effective for the

scaffolds tested, and the stiffness modulus obtained in the mechanical tests was within the expected

values.

Keywords

Scaffolds, 3D printing, Scaffold Cleaning Treatments, Mechanical tests, Tissue Engineering, Porosity

vii

Índice:

Agradecimentos........................................................................................................................................i

Resumo...................................................................................................................................................iii

Abstract....................................................................................................................................................v

Lista de Figuras.......................................................................................................................................ix

Lista de Tabelas.......................................................................................................................................x

Nomenclatura.........................................................................................................................................xii

Capítulo I

Introdução................................................................................................................................................1

1.1. Motivação..........................................................................................................................................1

1.2. Objetivos...........................................................................................................................................2

1.3. Estrutura da dissertação...................................................................................................................2

Capítulo II

Revisão de Literatura...............................................................................................................................5

2.1. Osso..................................................................................................................................................5

2.1.1. Tecidos formadores de osso..........................................................................................................7

2.1.2. Função dos ossos..........................................................................................................................9

2.1.3. Doenças exemplo..........................................................................................................................9

2.2. Engenharia de Tecidos...................................................................................................................10

2.2.1. Scaffolds......................................................................................................................................12

2.2.2. Células usadas na Engenharia de Tecidos………………………………......................................14

2.2.3. Influência no design dos scaffolds………………………………....................................................15

2.2.4. Estímulo Bioquímico……………………………….........................................................................15

2.2.5. Estímulo Mecânico……………………………...............................................................................16

2.2.6. Estímulo Eletromagnético……………………………….................................................................17

2.3. Biomateriais……………………………….........................................................................................18

2.3.1. Materiais Osteógenicos………………………………....................................................................20

2.3.1.1. Osso esponjoso autólogo………………………………..............................................................20

viii

2.3.1.2. Osso cortical autólogo………………………………...................................................................21

2.3.2. Propriedades mecânicas………………………………..................................................................21

2.3.3. Classes USP……………………………........................................................................................22

2.4. Impressão 3D……………………………..........................................................................................23

Capítulo III

Metodologia………………………………................................................................................................27

3.1. Produção e impressão……………………………….........................................................................27

3.2. Tratamento………………………………..........................................................................................30

3.3. Testes mecânicos………………………...........................................................................................33

Capítulo IV

Resultados e Discussão………………………........................................................................................35

4.1. Tratamentos/Pesagens………………………..................................................................................35

4.2. Ensaios mecânicos……………………….........................................................................................39

4.3. Sumário………………………..........................................................................................................45

Capítulo V

5. Conclusões……………………...........................................................................................................47

5.1. Perspetivas de trabalhos futuros…………………...........................................................................48

6. Referências……………………...........................................................................................................49

ix

Lista de figuras:

Capítulo II- Revisão de literatura

Figura 1. Esqueleto humano e os diferentes ossos…………………………………………………………...6

Figura 2. Imagem representativa dos três tipos de ossos existentes………………………………………..7

Figura 3. Imagens referentes à trabécula representando as diferentes células constituintes do tecido

ósseo………………………………………………………………………………………………………………8

Figura 4: Scaffolds TPMS. As três imagens de cima, correspondem a células unitárias, com superfícies

P, G e D, da esquerda para a direita respetivamente, sendo p, o tamanho dos poros e a, o tamanho

das células. As 3 últimas figuras correspondem às células unitárias repetidas 3x3x3………………….14

Figura 5: Diversas aplicações e respetivas Classes USP (I-VI)…………………………………………….23

Figura 6: Figura representativa do funcionamento do formato STL………………………………………..24

Capítulo III- Metodologia

Figura 7: Ficheiro STL. Respetivamente da esquerda para a direita, tem-se as estruturas SD70, SG70

e SP70………………………………………………………………………………………………………..….27

Figura 8: Impressora MJP600, utilizada para a impressão dos scaffolds…………………………………28

Figura 9: Padrão dimensional impresso à esquerda e TPMS Gyroid, à direita………………..………….29

Figura 10: Figura representativa dos diferentes scaffolds impressos. Respetivamente da esquerda para

a direita temos na prima fila, SP50, SP70, SG70 e na segunda fila, SG50, SD70, SD50.....................29

Figura 11: Imagens representativas do forno usado nos tratamentos de limpeza dos scaffolds...........30

Figura 12: Aplicação da pistola de ar quente nos scaffols, após retirar do forno...................................31

Figura 13: Ensaio de compressão, à esquerda e vídeo-extensómetro, à direita...................................33

Capítulo IV- Resultados e discussão

Figura 14: Gráficos representativos da pesagem dos scaffolds em função do número de pesagens,

durante os vários processos de limpeza, mantendo a mesma porosidade e variando a estrutura..........37

Figura 15: Gráficos representativos da pesagem dos scaffolds em função do número de pesagens,

durante os vários processos de limpeza, comparando as diferentes estruturas, mas mantendo a

porosidade.............................................................................................................................................38

Figura 16: Gráfico Tensão vs. Extensão (Arm) referente ao padrão dimensional impresso……………42

xi

Lista de tabelas:

Capítulo II- Revisão de literatura

Tabela 1- Tabela representativa das diferentes camadas relativas à estrutura interna de um osso

longo……………………………………………………………………………………………………………....7

Tabela 2- Propriedades mecânicas relativas ao osso compacto (cortical) e ao osso esponjoso

(trabecular)………………………………………………………………………………………………………..8

Tabela 3- Tabela ilustrativa das diversas funções dos ossos……………………………………………....9

Capítulo III- Metodologias

Tabela 4: Descrição dos tratamentos de limpeza em função das pesagens………………………………32

Capítulo V- Resultados e discussão

Tabela 5: Pesagem referente aos scaffolds de padrão dimensional impresso……………………………35

Tabela 6: Pesagem referente aos diferentes scaffolds após finalização dos tratamentos de

limpeza………..…………………………………………………………………………………………………36

Tabela 7: Valores obtidos de massa volúmica dos scaffolds vs. Valores esperados…………..……....36

Tabela 8: Valores obtidos do Módulo de Young (E) depois da realização dos ensaios de compressão

nos scaffolds P50 que foram testados no Micro CT e nos P50 que não foram testados Micro

C………………………………………………………………………………………………………………….39


nos scaffolds D50 que foram testados no Micro CT e nos D50 que não foram testados Micro

CT………………………………………………………………………………………………………………...39


nos scaffolds G50 que foram testados no Micro CT e nos G50 que não foram testados Micro

CT………………………………………………………………………………………………………………...40


nos scaffolds P70 que foram testados no Micro CT e nos P70 que não foram testados Micro

CT………………………………………………………………………………………………………………...40


nos scaffolds D70 que foram testados no Micro CT e nos D70 que não foram testados Micro

CT………………………………………………………………………………………………………………...40

xii


nos scaffolds G70 que foram testados no Micro CT e nos G70 que não foram testados Micro

CT………………………………………………………………………………………………………………...40

Tabela 14: Valores obtidos do Módulo de Young (E) para o padrão dimensional impresso……………41

Tabela 15: Valores obtidos do Módulo de Young (E) para o padrão dimensional impresso, medidos

através da utilização do Video-extensómetro (SVE) Vs. Braço mecânico (Arm)………………………..42

Tabela 16: Valores obtidos do Módulo de Young (E) para o P50, medidos através da utilização do

Video-extensómetro (SVE) Vs. Braço mecânico (Arm)……………………………………………………..43

Tabela 17: Valores obtidos do Módulo de Young (E) para o D50, medidos através da utilização do


Tabela 18: Valores obtidos do Módulo de Young (E) para o G50, medidos através da utilização do


Tabela 19: Valores obtidos do Módulo de Young (E) para o P70, medidos através da utilização do


Tabela 20: Valores obtidos do Módulo de Young (E) para o D70, medidos através da utilização do


Tabela 21: Valores obtidos do Módulo de Young (E) para o G70, medidos através da utilização do


xiii

Nomenclatura

Lista de siglas e abreviaturas:

3D- Tridimensional

Arm- Braço mecânico

BMP- Bone Morphogenic Proteins

CAD- Desenho assistido por computador

CMs- Materiais celulares

DC- Corrente contínua

E- Módulo de Young

ECM- Matriz extracelular

FDM- Moldagem através da deposição de fundidos

FGFs- Fibroblast Growth Factor

IGFs- Insulin-like Growth Factor

IPC´s- Interpenetrating Phase Composites

Micro CT ou 𝜇 𝐶𝑇- Microtomografia Computadorizada

MJP- Multijet printing

PDGF- Platelet-derived Growth Factor

SL- Estereolitografia

STL- Formato de arquivo de dados

SVE- Vídeo- extensómetro

TGFβ- Transforming Growth Factor Beta

TPMS- Triply Periodic Minimal Surfaces

USP- Farmacopeia dos Estados Unidos

Wnt- Via de sinalização

xiv

Lista de símbolos:

A – Área

Ab- Área da base

F- Força aplicada

h- Altura

m- Massa

V- Volume

ρ- Densidade

𝜀- Extensão

𝜃= Tensão

1

Capítulo I

Introdução

Scaffolds para regeneração óssea, podem ser definidos como sendo biomateriais que

apresentam uma estrutura tridimensional porosa, propriedades bioativas e biodegradáveis,

possibilitando desta forma a formação de novo tecido, servindo assim, como um molde. O objetivo

fulcral é que os scaffolds consigam mimetizar tanto o meio físico como o meio químico do tecido, de

forma a permitir o crescimento, diferenciação e proliferação celular [1].

1.1. Motivação

Os scaffolds são um tema de elevada importância nos dias que correm, uma vez que existe a

necessidade de ultrapassar de alguma forma as limitações existentes, tal como a inevitabilidade de se

recorrer a bancos de ossos ou à colheita de enxertos. Assim é possível o preenchimento dos defeitos

ósseos existentes, além do que, a utilização de elementos com capacidade osteogénica abre novas

portas ao tratamento de fraturas e doenças [2].

Anualmente, a nível mundial, são realizadas mais de 2 milhões de cirurgias ortopédicas, das

quais se recorre a enxertos [2]. Devido a este elevado número, somos obrigados a procurar novas

estratégias para evitar os métodos tradicionais de recolha de ossos. Mesmo sendo difícil concentrar as

diferentes propriedades requeridas, num material, é possível adicionar a uma matriz osteocondutora

(cerâmicos como a hidroxiapatite ou o fosfato tricálcico), agentes bioativos (como o BMP‘s) fornecendo

deste modo, as características necessárias à substituição dos auto e aloenxertos.

Como tal, a Engenharia de Tecidos é uma área multidisciplinar que permite fazer a ponte entre

duas áreas de grande peso, a Engenharia e a Medicina, sendo uma alternativa relativamente à

utilização dos métodos tradicionais que acarretam variadas limitações, tais como a falta de dadores, a

rejeição imunológica do enxerto, os riscos de transmissão de doenças, entre outras.

2

1.2. Objetivos

Os scaffolds podem ser considerados como uma das estruturas do futuro, uma vez que podem

ser impressos à medida de cada defeito ósseo, respetivo a cada paciente, e como foi referido

anteriormente, servem de suporte para o crescimento, diferenciação e proliferação celular.

Neste contexto, a presente dissertação tem como objetivo contribuir para a verificação do

processo de impressão de scaffolds utilizando uma tecnologia Multijet e a monitorização do processo

de tratamento e limpeza posterior à impressão dos scaffolds e consequente otimização do processo,

bem como a realização de ensaios mecânicos de compressão, de forma a serem estudadas as suas

propriedades mecânicas, nomeadamente módulo de Young e respetivas densidades.

É muito importante otimizar o processo de tratamento dos scaffolds, uma vez que o material de

suporte presente nos poros do scaffold, pode influenciar as caraterísticas do material aquando dos

ensaios mecânicos e não menos importante, a obstrução destes, comprometendo a permeabilidade

desejada.

Relativamente aos ensaios de compressão, é necessário compreender primeiro se os ensaios

de MicroCT, para análise das estruturas afetam ou não as propriedades do material, e, mais importante,

determinar o módulo de Young relativo a cada estrutura e nível de porosidade, para avaliar o potencial

de utilização destes scaffolds em Engenharia de Tecidos e perceber a influência da porosidade.

1.3. Estrutura da dissertação

Esta dissertação encontra-se dividida em 5 capítulos.

Capítulo I: Introdução

Este capítulo tem como propósito principal a realização do enquadramento geral do trabalho proposto,

sendo definidos os objetivos traçados e a forma como a dissertação se encontra estruturada.

Capítulo II: Revisão de Literatura

Neste capítulo é realizado um enquadramento do osso e da sua biologia, assim como da importância

da Engenharia de Tecidos na medicina regenerativa, enfatizando o benefício do uso de scaffolds. Neste

capítulo foi referido também, tanto os materiais que são usados, tais como algumas das suas

propriedades características. São apresentadas as Classes USP (Farmacopeia dos Estados Unidos)

próprias para as diferentes utilizações dos scaffolds e por fim, é realizada uma contextualização da

impressão 3D e consequentemente as vantagens que esta tecnologia apresenta. Este capítulo resulta

também, da minha aprendizagem sobre Bioengenharia (Engenharia de Tecidos e Medicina

Regenerativa).

3

Capítulo III: Metodologia

Aqui, é realizada a descrição pormenorizada de toda a metodologia usada, nomeadamente dos

processos de tratamento e posteriormente dos ensaios mecânicos realizados, sendo estes, ensaios de

compressão.

Capítulo IV: Resultados e Discussão

No capítulo de Resultados e Discussão é feita a análise do processo de tratamento, de forma a ser

possível a otimização deste processo. São também estudadas as propriedades do material,

nomeadamente a sua densidade e o seu Módulo de Young. Neste capítulo é também comparado qual

é o método mais preciso de medição dos parâmetros mecânicos do material.

Capítulo V: Conclusões

Neste capítulo é realizada uma constatação dos aspetos mais importantes relativos a este trabalho e

perspetivas futuras.

5

Capítulo II

Revisão de Literatura

O nosso sistema esquelético não é uma constante no tempo, ou seja, um recém-nascido possui

cerca de trezentos ossos, no entanto, na idade adulta apenas terá duzentos e seis, devido à fusão de

alguns destes. Os ossos acarretam variadas funções, mas a mais evidente é a sustentação do nosso

corpo, sendo os grandes responsáveis por assegurar a locomoção e proteger os órgãos. Os ossos

apresentam outra característica de grande relevância, tem o papel de órgãos formadores de sangue

(hematopoiese) e fazem parte do depósito de material mineral do corpo. Os ossos apresentam várias

funções, sendo estas, de apoio, proteção e função metabólica, como vamos ver posteriormente.

Conjuntamente, determinam cada pormenor ósseo e, como tal, formam toda a arquitetura corpórea [3].

Cada osso submete-se, continuadamente, a métodos adaptativos de remodelação. Mudanças

relativas às forças de tração, compressão e de pressão, a nível fisiológico, conduzem em curto espaço

de tempo à reconstrução do tecido ósseo. Certos ossos encontram-se sujeitos a estímulos mais

intensos que outros, como por exemplo as vértebras ou os fémures, que são permanentemente

submetidos a cargas. É preciso, de qualquer forma, que as forças mecânicas operam continuamente a

nível fisiológico, contribuindo para a remodelação óssea [4].

Neste capítulo, irei abordar tanto a sua composição como detalhar a sua função e algumas

doenças mais comuns que afetam o sistema esquelético.

2.1. Osso

O nosso sistema esquelético pode ser divido em três grandes grupos: cabeça, tronco e

membros. O crânio e a face são os constituintes do primeiro grupo - cabeça. O crânio é formado por

ossos achatados e curvos, encaixados uns nos outros, de modo a formar uma caixa, com o intuito de

proteger o encéfalo e a maior parte dos órgãos sensoriais. Relativamente aos ossos da face, estes são

6

todos irregulares. À semelhança do que acontece no crânio, também se encontram fortemente

encaixados, à exceção da mandíbula (único osso móvel da cabeça). O tronco é constituído pela coluna

vertebral e pela caixa torácica. O conjunto, tronco e cabeça compõem o esqueleto axial. Os membros

são divididos em superiores e inferiores, sendo os primeiros compostos pelos ossos do ombro, braço,

antebraço e mão. Os membros inferiores são compostos pelo quadril, coxa, pernas e pés (Figura 1).

Podemos também categorizar os diferentes tipos de ossos em três tipos, sendo estes, os ossos

longos, os curtos e os planos (vulgarmente conhecidos como chatos ou laminares) (Figura 2). Os ossos

longos funcionam como alavancas, estando encarregues de levantar/baixar as diferentes partes do

nosso corpo e temos como exemplo, os ossos dos nossos braços e pernas. Os ossos planos possuem

uma espessura pequena, quando comparados à largura e comprimento, servindo de estrutura

de proteção, como é o caso dos ossos do crânio. Os ossos curtos, apresentam largura, comprimento e

altura semelhantes, como se pode constatar pelos ossos das mãos e dos pés [5].

Podemos observar externamente dois locais diferentes, num osso longo, sendo estes,

as epífises (extremidades dilatadas) e a diáfise (“corpo” do osso, localizada entre as epífises). No que

diz respeito à estrutura interna de um osso longo, também conseguimos identificar diferentes camadas,

tais como a medula óssea, o periósteo, o tecido ósseo compacto e o tecido ósseo esponjoso, como

vamos ver à frente [5].

Figura 1. Esqueleto humano e os diferentes ossos.1

1 Figura 1 adaptada de http://www.anatomiadocorpo.com/esqueleto-humano-sistema-esqueletico-ossos/

http://www.anatomiadocorpo.com/esqueleto-humano-sistema-esqueletico-ossos/

7

Figura 2. Imagem representativa dos três tipos de ossos existentes.2

2.1.1. Tecidos formadores de ossos

Os ossos são formados por diferentes tecidos, tais como o tecido ósseo, sanguíneo, adiposo e

cartilaginoso, dos quais, logicamente, o de maior importância é o tecido ósseo. Este pode ser dividido

em duas classes: o tecido ósseo esponjoso, que se encontra nas extremidades dos ossos longos e o

tecido ósseo compacto. Relativamente ao tecido ósseo esponjoso, a camada intercelular apresenta

cavidades e no seu interior encontramos a medula óssea vermelha, estando esta encarregue da

produção de glóbulos vermelhos, alguns glóbulos brancos e plaquetas. Relativamente ao tecido ósseo

compacto, este é responsável pela parte alongada e tubular dos ossos longos, devido à sua

constituição, uma vez que possui uma camada compacta (Tabela 1), sendo que, aqui encontramos os

pequenos canais centrais onde passam os vasos sanguíneos. Cerca de 70% do nosso tecido ósseo é

do tipo compacto [5]. Na Tabela 2, encontram-se apresentadas as propriedades mecânicas destes

tecidos.

Tabela 1- Tabela representativa das diferentes camadas relativas à estrutura interna de um osso longo.

2 Figura 2 adaptada de http://cienciadotreinamento.com.br/2016/08/sistema-esqueletico-e-seus-detalhes-

parte-ii-tipos-de-ossos/

Medula Óssea Periósteo Tecido Ósseo

Compacto Tecido Ósseo Esponjoso

Possui uma componente vermelha e

outra amarela: A medula óssea

vermelha, localiza-se nas

extremidades dos ossos longos e é

responsável pelo fabrico de glóbulos

vermelhos, brancos e plaquetas. A

medula óssea amarela (tutano)

equivale a um depósito de gordura

localizado dentro da diáfise, com

uma forma gelatinosa.

Membrana fina e

resistente que envolve

o osso, com exceção

das junções. Contém

diversos nervos e vasos

sanguíneos, que

ingressam nas outras

camadas, ramificando-

se.

Forma um tipo de

cobertura rígida.

Os nervos e os

vasos sanguíneos

entram por

pequenos orifícios

na superfície.

Tecido que é encontrado

nas epífises (extremidades dos

ossos longos, que engloba tecido

ósseo esponjoso rodeado por uma

camada fina de tecido ósseo

compacto), no entanto nos ossos

curtos e nos planos, encontra-se

na zona central. No caso dos

ossos longos possui numerosas

cavidades.

8

Tabela 2- Propriedades mecânicas relativas ao osso compacto (cortical) e ao osso esponjoso (trabecular).3

Propriedades Osso Compacto Osso Esponjoso

Resistência à compressão (MPa) 170-193 7-10

Resistência à tração e flexão (MPa) 50-150 10-20

Módulo de Young (GPa) 14-20 0,05-0,5

O tecido ósseo é composto por três diferentes tipos de células: os osteoblastos, os osteoclastos

e os osteócitos (Figura 3). Podemos considerar também mais dois tipos de células: as células

osteoprogenitoras, sendo estas, células mesenquimais (mantêm a multipotencialidade das células

mesenquimais embrionárias e são semelhantes aos fibroblastos, mas com a particularidade do seu

núcleo ser mais alongado), que dão origem aos osteócitos e aos osteoblastos e as células de

revestimento ósseo, tratando-se dos osteoblastos que não se diferenciaram em osteócitos [5]. Podem

ser consideradas como células de reserva, uma vez que, caso um estímulo ocorra, estas poderão

transformar-se em osteoblastos [6].

Os osteoblastos são células que promovem a construção do tecido, sendo responsáveis pela

produção de componentes orgânicos da matriz óssea e encontram-se localizados na superfície do

osso, enquanto que os osteoclastos são responsáveis pela degradação do osso, visto que promovem

a sua descalcificação, pela entrada de iões H+, através do contacto da membrana celular dos

osteoclastos e a matriz óssea, produzindo-se um meio ácido. Relativamente aos osteócitos, estes são

osteoblastos com uma particularidade diferente, o facto destes se encontrarem fixos na matriz óssea.

Mais especificamente, encontram-se alocados dentro de pequenas cavidades, os osteoplastos,

integradas na matriz óssea. Esta é constituída por uma componente orgânica proteica, rica em

colagénio e por outra intercelular, rica em cálcio e fósforo. A comunicação realizada pelos osteoplastos

é feita através de canais com um diâmetro muito pequeno. Estes estão diretamente ligados a canais

de maiores dimensões, os canais centrais, onde passam os capilares, sendo assim possível o

transporte de água, nutrientes e oxigénio, para os osteócitos, e a libertação de CO2, através do sangue

[5].

Figura 3. Imagens referentes à trabécula representando as diferentes células constituintes do tecido ósseo.4

3 Tabela 2 adaptada de Batista, 2013

4 Figura 3 adaptada de http://dicionariosaude.com/osteocito/

http://dicionariosaude.com/osteocito/

9

2.1.2. Função dos ossos

Os ossos apresentam cinco funções fundamentais, sendo elas, proteção, apoio, formação das

células sanguíneas, mantém o equilibro ácido-base e são um depósito de minerais (Tabela 3). A função

do osso também é influenciada pelo periósteo (cobertura conjuntiva), devido às suas duas camadas, a

externa fibrosa e a interna, mais rica em células osteogénicas. O periósteo envolve completamente os

ossos, com ressalva dos locais de inserção muscular e da cartilagem. De forma a aumentar a atividade

metabólica dos ossos, a camada osteogénica possui uma densa rede de vasos linfáticos e sanguíneos

e um enorme número de feixes de fibras nervosas. Esta camada encontra-se constantemente em

condições de formar novos tecidos ósseos. Deste modo, ela favorece o crescimento ósseo e todas as

práticas referentes a remodelação e reconstrução óssea no caso de fraturas (regeneração).

Os ossos apresentam uma função de destaque que é o depósito de fósforo e cálcio. Assim na

camada esponjosa dos ossos, existe um depósito “móvel” de cálcio, sendo este libertado no sangue,

em caso de necessidade, assegurando a manutenção das funções vitais do organismo [5].

Tabela 3- Tabela ilustrativa das diversas funções dos ossos.

Proteção Apoio Formação das células

sanguíneas

Mantém o equilíbrio

ácido-base

Reserva de

minerais

Protege órgãos internos,

tais como o cérebro,

órgãos torácicos, entre

outros.

Apoio para

os músculos.

Heritrócitos- glóbulos vermelhos-

através da medula óssea

vermelha, pelo processo de

hematopoiese.

Absorve sais

alcalinas,

funcionando como

tampões.

Basicamente

cálcio e fósforo.

2.1.3. Doenças exemplo

Os ossos são parte integrante da anatomia do sistema esquelético do corpo humano. Minerais,

tais como o cálcio e o fósforo e uma proteína denominada de colagénio são essenciais para manter os

ossos numa condição saudável. A deficiência destes minerais ou desta proteína, pode dar origem a

doenças ósseas. Existe uma larga variedade de doenças ósseas, com diferentes graus de seriedade,

diferentes tipos de tratamento e diferentes taxas de mortalidades. Uma fratura óssea (ou um defeito

ósseo), causada quer por acidente ou como consequência de alguma destas doenças ósseas, pode

também ser resolvida através da implantação de um scaffold que promova a remodelação óssea. As

doenças mais comuns nos dias de hoje que afetam os ossos são o cancro ósseo, a osteoporose,

escoliose, lesão do menisco, hérnia discal, artroses e raquitismo [7]. No entanto existem algumas

destas que iriam beneficiar da utilização da regeneração de tecidos.

A osteoporose é uma doença que afeta o sistema esquelético, manifestando-se de uma forma

silenciosa e lenta. Esta tem inicio com sintomas de desconforto e dor, referentes a microfraturas

trabeculares, que normalmente terminam em fraturas ósseas levando a elevados índices de

incapacidade, tornando a qualidade de vida muito reduzida [7]. Esta doença é caracterizada por uma

10

pequena atividade osteoclástica e reduzido índice de deposição óssea. Os ossos trabeculares, devido

à sua porosidade, são os mais vulneráveis, no que toca a osteoporose.

Relativamente ao cancro, este é uma doença que cada vez mais afeta a população nos dias

que correm e deve-se ao facto de que as células perdem a capacidade de morrer naturalmente. De

forma geral, as células crescem e dividem-se em novas células (diferenciação), sendo formadas à

medida que vão sendo necessárias (regeneração celular). Quando as células normais envelhecem ou

são danificadas, morrem naturalmente. Quando as células perdem este mecanismo de controlo e

sofrem alterações no seu genoma (DNA), tornam-se células cancerígenas, que não morrem quando

envelhecem nem se danificam, e produzem novas células, que não são necessárias, de forma

descontrolada, resultando na formação do cancro [8].

É expectável que, tanto a osteoporose, como o cancro, como as lesões/fraturas ósseas, após

tratamento médico apropriado a cada uma delas, iriam lucrar através da utilização de terapias de

engenharia de tecidos, aquando de perda óssea, uma vez que iria permitir aumentar a qualidade de

vida do paciente, em detrimento da utilização de enxertos.

2.2. Engenharia de Tecidos

Doenças, ferimentos e malformações dos mais variados tipos sempre se encontraram

presentes em toda a existência humana. Com a introdução do método científico, surgiu uma nova

capacidade de compreensão do mundo. Por consequência, conseguiu-se obter a interligação entre o

conhecimento metódico dos segredos referentes à Biologia, em conjunto com o conhecimento científico

referente a traumas, doenças e malformações. Materiais prostéticos ou artificiais para substituir

membros, como por exemplo, dentes e tecidos, resultou na possibilidade de restauro de funções

corpóreas perdidas. Neste seguimento, foi também introduzido o conceito de substituição de um tecido

por outro diferente [9].

Com o conhecimento adquirido no século XIX relativamente a temas relacionados com a

teoria microbiana das doenças e a introdução das técnicas de esterilização, a cirurgia moderna

começou a crescer. O início das práticas de anestesia, foi o principal responsável pela evolução de

inúmeras técnicas cirúrgicas. O uso da anestesia permitiu o tratamento de muitas doenças, através da

examinação de áreas internas do corpo, conseguindo assim salvar diversas vidas. Inicialmente as

técnicas cirúrgicas eram bastantes invasivas, como por exemplo, na remoção de tumores. As

consequências relativas à perda de tecido ou ao impacto psicológico da desfiguração, não foi uma

conclusão final aceitável, e como tal, as técnicas que resultaram no restabelecimento das funções

perdidas, tornaram-se parte integrante do avanço da terapia humana. Hoje em dia, todos os campos

associados à cirurgia reconstrutiva, manifestam-se de forma a ser viável o aperfeiçoamento da

qualidade de vida, através da recuperação de funções corpóreas perdidas por meio da reconstrução

destas. De certa forma, o transplante pode ser visto como a forma mais extrema de cirurgia

reconstrutiva, sendo necessária a transferência de tecido de um indivíduo para outro [9].

11

No entanto, novos problemas surgiram. As técnicas que utilizam materiais implantáveis

produziram infeções na interface corpo/tecido, fratura e migração ao longo do tempo. Ocorreram

também, interações anormais de tecidos, devido à deslocação de uma posição para outra. Como

exemplo temos, o desvio da urina diretamente para o cólon, podendo assim produzir cancros fatais do

cólon, 20-30 anos depois. O transplante de um indivíduo para outro, embora por muito bem-sucedido

que seja, tem severas restrições. O principal problema é aceder a tecidos e órgãos suficientes para

todos os pacientes que necessitem deles. Além disso, é importante frisar todos os possíveis problemas

relacionados com o sistema imunológico, devido à rejeição. Estas restrições conduziram à necessidade

de novas soluções para prover o tecido necessário [9].

Foi nesta linha de ideias que surgiu a Engenharia de Tecidos, sendo referida pela primeira

vez como uma disciplina peculiar na área das ciências biomédicas por Vacanti e Langer´s, em 1993

[10]. O método de Engenharia de Tecidos inicia-se pela escolha dos biomateriais seguido da fabricação

de scaffolds, sendo estes, química ou fisicamente modificados no processo de fabricação, como

resposta às necessidades existentes, tais como, a porosidade, forma, dimensões e bioatividade.

Claramente cada caso é um caso e como tal, os requisitos vão variando, consoante o processo de

fabricação, tecido alvo e natureza dos biomateriais. Após a fabricação do scaffold, com todas as

propriedades requeridas é possível o cultivo de células in vitro, de forma a ser criado o tecido desejado,

ou então, a colocação deste no corpo, proporcionando a infiltração e preenchimento de células

hospedeiras na estrutura do scaffold. No entanto, quer para uma abordagem, quer para a outra é

necessário o uso de fatores de crescimento, hormonas e sinais químicos, para garantirem a

diferenciação celular e a funcionalidade do novo tecido. No fundo, o objetivo principal dos scaffolds e

dos biomateriais é sustentar a proliferação celular e a sua função [11].

O novo tecido vivo e funcional é fabricado através da utilização de células vivas, sendo estas

associadas ao scaffold, como forma de orientar o desenvolvimento dos tecidos. Novos métodos de

partida para a obtenção de células, incluindo muitos tipos de células estaminais, foram identificadas

nos últimos anos. De facto, o despontar da biologia de células estaminais levou a um novo caminho, a

medicina regenerativa. Os scaffolds podem ser naturais, feitos pelo homem ou uma combinação de

ambos e as células vivas podem migrar para o implante, após a implantação. Estas, posteriormente

poderão ser isoladas, como células totalmente diferenciadas do tecido que queremos recriar, ou podem

ser manipuladas de forma a produzirem uma função/ação desejada [9].

A aplicação desta nova disciplina pode ser considerada como um aperfeiçoamento,

relativamente aos cuidados de saúde e aos princípios médicos previamente tratados. Historicamente,

um médico conseguiu tratar variados processos referentes a doenças, minimizando fatores hostis e

otimizando o meio ambiente para que o corpo conseguisse curar-se. No campo da engenharia de

tecidos, o mesmo é realizado a nível celular. O tecido lesivo é eliminado, as células necessárias para

o reparo são então introduzidas numa configuração que otimiza a sobrevivência das células, em

ambiente que permite que o corpo se restaure. Existem inúmeros desafios que necessitam ainda de

ser ultrapassados, mas em termos gerais, são de carácter científico e social [9]. Hoje em dia a

Engenharia de tecidos é empregue em diversas áreas com sucesso, em particular em vítimas de

12

queimaduras graves, das quais é retirada e cultivada amostras de pele, de forma a posteriormente,

serem transplantadas para o doente recuperando as zonas que se encontravam lesadas [10].

2.2.1. Scaffolds

O desenvolvimento e constante aperfeiçoamento dos scaffolds, permite não só, ser uma

alternativa à recorrência ao banco de ossos, como por outro lado, ser uma via inovadora de reparação

de lesões/fraturas ósseas, como já foi referido anteriormente [12].

No fundo, os scaffolds funcionam como uma estrutura tridimensional, permitindo a agregação,

proliferação e diferenciação das células, servindo de suporte temporário até às células construírem

novo osso, mas também como uma forma de preencher o espaço em falta e um aparelho local

controlado de libertação de moléculas de sinalização [13]. Mas para tal acontecer, os scaffolds

necessitam de possuir certo tipo de características fundamentais, tais como a taxa de biodegradação

ser compatível com a taxa de formação de tecido, serem biocompatíveis, de forma a não ocorrer

rejeição, serem porosos e permeáveis e possuírem propriedades mecânicas apropriadas [14].

É importante referir que os ossos são vascularizados e como tal, o scaffold também tem que

permitir a vascularização. A propriedade que determina a vascularização é a porosidade. Os scaffolds

necessitam da existência de poros interconectados, de forma a ser possível a promoção do crescimento

celular e posterior distribuição celular pela matriz. Como tal, temos um tamanho mínimo de poro, devido

a fatores como o transporte de fluidos, migração e tamanho celular. O tamanho mínimo que o poro

deve apresentar é entre o seguinte intervalo de valores, 100-150 𝜇𝑚. No entanto, o tamanho dos poros

afeta a osteogénese, devido à vascularização, sendo que, se o tamanho dos poros for muito grande,

significa muito boa vascularização e a osteogénese direta ocorre. Caso contrário, se estes forem muito

pequenos, condições hipóxicas acontecem. A porosidade tem um papel muito importante nas

propriedades mecânicas do scaffold. Scaffolds com alta porosidade permitem um bom crescimento do

tecido. Porventura há uma redução forte nas propriedades mecânicas, podendo comprometer a

estrutura. É importante que as propriedades mecânicas do scaffold sejam semelhantes às do osso, tais

como, Módulo de Young, tensão de cedência e tensão de fratura, de forma a não comprometer a

estrutura depois da implementação [14].

Hoje em dia, vários tipos de scaffolds são usados nas clínicas, particularmente aqueles que

são relacionados com a regeneração da pele. Temos como exemplo, o Dermagraft®, sendo este

composto por scaffolds de poliglactina, com fibroblastos neonatais semeados, de forma a regenerar a

pele, sendo muito empregue em pacientes com úlceras [13]. Por outro lado, temos também o Integra®,

sendo este um scaffold à base de colagénio e condroitina, usado para deter células endógenas e assim

produzir tecido funcional [15]. BioDesign® é também um scaffold em que o seu propósito é suspender

a perda de água de feridas fechadas, posteriormente a uma cirurgia cerebral, cicatrização de feridas

ou cirurgia cardíaca.

Devido às características e diversas aplicações dos scaffolds referidas anteriormente, é fácil

perceber que a estrutura do scaffold é um fator decisivo da sua funcionalidade, visto que o objetivo

13

fulcral é mimetizar o microambiente do tecido nativo, quer em termos químicos e biológicos, quer nas

suas propriedades mecânicas [16].

É conhecido que, tanto o tamanho dos poros, tal como a interconectividade da estrutura porosa

intervêm na regeneração óssea [17], [18]. As TPMS, ou seja, “Triply Periodic Minimal Surfaces”,

começaram a ser usadas recentemente, uma vez que a razão entre área superficial e o volume dos

scaffolds é muito grande, quando comparada com os scaffolds convencionais, sendo que este aumento

de área superficial, favorece tanto a migração e proliferação como a adesão celular. Como grande parte

das funcionalidades biológicas ocorrem na superfície, nomeadamente trocas iónicas, difusão de

oxigénio e transporte de nutrientes, faz com que uma maior razão de área superficial por volume seja

favorável a estas condições. Fora estes detalhes biológicos, as TPMS também favorecem o

comportamento mecânico, uma vez que garante uma menor concentração de tensões, permitindo

assim uma facilidade de crescimento celular nas zonas de curvatura [17]. Por último, garantem também

um aumento da permeabilidade, o que faz com que a penetração celular, transporte de nutrientes e

fatores de crescimento, sejam favorecidos [16], [19].

Existem diversos tipos de arquiteturas TPMS, tais como Gyroid, Schwarz P e D, Schoen I-WP e

Neovius [20]. Nesta dissertação, foram usadas três superfícies TPMS, sendo elas a P, “Primitive”, a G,

“Gyroid” e a D “Diamond”. O módulo de Young, a porosidade e tamanho do poro nas TPMS, pode ser

controlado através do tamanho da célula e da espessura. No fundo, a TPMS é um grupo de superfícies

que divide o espaço em dois ou mais subespaços. A Figura 4 mostra a célula unitária e a matriz 3x3x3

dos scaffolds TPMS. De seguida, a TPMS seria convertida para o ficheiro STL e posteriormente

enviados para a impressora 3D [16].

Em suma, as TPMS minimizam a energia de superfície, o que é equivalente a ter uma curvatura

média igual a zero, uma vez que Bidan et al. comprovou que a média das curvaturas médias dos ossos

trabeculares são próximas de zero [17], [21].

Recentemente, foram estudadas diversas propriedades de estruturas inspiradas nas TPMS, tais

como propriedades elásticas, condutividade térmica e elétrica, coeficiente de expansão térmica, entre

outras [20]. Abueidda et al. estudou tanto as propriedades elásticas como a dissipação de energia de

compósitos baseados em três TPMS. Estas TPMS foram usadas de forma a criar IPC´s, ou seja,

“Interpenetrating Phase Composites”. Para além disto, a formação de novos materiais celulares (CMs)

com densidades relativas diferentes foi possível através da utilização de TPMS. Abueidda et al. referiu

também que foi utilizada a estrutura Primitiva, como forma de fabricar novos materiais celulares com

propriedades melhoradas [20].

14

Figura 4: Scaffolds TPMS. As três imagens de cima, correspondem a células unitárias, com superfícies P, G e D, da esquerda

para a direita respetivamente, sendo p, o tamanho dos poros e a, o tamanho das células. As 3 últimas figuras correspondem às

células unitárias repetidas 3x3x3.5

2.2.2. Células usadas na Engenharia de Tecidos

As células usadas na Engenharia de Tecidos podem ter três origens diferentes: células

autólogas, alogénicas e xenogenicas. Sendo então, células recolhidas do próprio paciente, células

provenientes de outro paciente, ou de uma espécie diferente, como por exemplo um animal,

respetivamente. É importante referir as consequências da sua utilização a nível imunológico, visto que,

as células referentes ao próprio paciente têm aceitação garantida a nível imunológico. Relativamente

às células alogénicas há que ter me atenção a sua implantação, para evitar riscos de rejeição. Por fim,

as células xenogenicas, necessitam de mais cuidado. É necessário ter em conta, quer a aceitação a

nível imunitário, visto que é estritamente necessário que qualquer doença capaz de ser transmitida seja

por completo eliminada, quer a nível microbiano ou de outro tipo. Células autológas e alogénicas podem

ser extraídas de duas formas, ou através de uma biopsia ao paciente ou pelas células estaminais

provenientes do cordão umbilical, guardadas através de criopreservação, ao contrário do que acontece

com as células xenogenicas, sendo estas retiradas do animal vivo. Existem inúmeros parâmetros

importantes a ser considerados, tais como a questão imunitária, impedimentos relacionados com a

5 Figura 4 adaptada de https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/acsabm.8b00052

15

biopsia, células guardadas através de criopreservação e os custos que associados. Importante frisar

que, no caso das células autólogas, apenas um paciente é envolvido.

Para além da origem das células, é preciso considerar também, a sua capacidade de

diferenciação, uma vez que o objetivo é a criação de diversos tecidos. As células estaminais são células

imaturas com capacidade de se diferenciarem e com a ajuda de sinalizadores biológicos apropriados,

são capazes de prosperar diferentes tipos de linhagens celulares. As células estaminais nos adultos

podem ser encontradas quer na medula óssea como no cordão umbilical, sendo estas últimas de

elevada importância, visto que são de origem embrionária (mesenquinosas), sendo pluripotentes, ou

seja, capacidade de se diferenciarem em qualquer outro tipo de célula [9].

2.2.3. Influência no design dos scaffolds

Sabe-se que a elaboração dos scaffolds a partir de uma vasta gama de materiais, na

engenharia de tecido ósseo é o tema mais investigado [19], [22]. No entanto o estudo dos materiais

não é suficiente, quando o objetivo é mimetizar o processo de cicatrização óssea, ou melhor, propiciar

a formação de osteoblastos e estimular a vascularização. Por norma, os estudos focam-se apenas no

uso de apenas um tipo de célula específico (nomeadamente células estaminais ou células equivalentes

aos osteoblastos). Foram sendo realizados vários estudos com sistemas de co-cultura em que a

finalidade seria o aperfeiçoamento das propriedades dos scaffolds 3D, e desta forma, compreender os

processos que ocorrem in vivo no seguimento do restauro ósseo [12], [23].

A reprodução do microambiente que existe no tecido ósseo, é um dos principais objetivos

para a elaboração de substitutos do enxerto ósseo, de forma a ser possível a cicatrização. Este

microambiente é responsável pela regulação da função das células osteoprogenitoras, de modo a

perpetuar a homeostase. Fatores estimulantes, responsáveis pela promoção da capacidade

osteoindutora dos substitutos, são fundamentais ao microambiente. Estes fatores são constituídos quer

por estímulos bioquímicos, quer por mecânicos, quer por eletromagnéticos [24].

2.2.4. Estímulo Bioquímico

A osteogénese é conduzida pela expressão de diversas moléculas de forma coordenada,

englobando fatores de crescimento e fatores de transcrição, que instigam estímulos celulares e

moleculares de forma a guiar a diferenciação celular. Uma estratégia na engenharia de tecidos,

nomeadamente nos tecidos ósseos, como forma de refinar a função das células osteogénicas, foi a

incorporação dos fatores de crescimento e transcrição nos scaffolds, sendo estes libertados durante o

processo de restauro. Os fatores de crescimento são moléculas proteicas, que através da ligação a

recetores específicos da superfície celular, iniciam uma cascata de sinalização, levando assim, à

transdução de sinal (que ocorre no núcleo, sendo os fatores de transcrição ativados). Por

consequência, a expressão genica é afetada, influenciando a divisão celular, diferenciação dos tecidos

e síntese de matriz. TGFβ (Transforming Growth Factor Beta), BMPs (Bone Morphogenic Proteins),

16

FGFs (Fibroblast Growth Factor), IGFs (Insulin-like Growth Factor), PDGF (Platelet-derived Growth

Factor), Wnt (signaling pathway) e a sinalização sonora hedgehog (Shh), são exemplos de fatores de

crescimento na formação e restauro ósseo. Relativamente aos fatores de transcrição, destacam-se os

TAZ, Runx-2 e osterix, sendo estes os mais importantes, uma vez que controlam a diferenciação e

inibem a adipogenese, ao mesmo tempo. Através dos padrões de expressão génica de fatores de

crescimento e transcrição pode-se propor que estes sejam co-regulados, visto que é conjeturável que

os fatores de transcrição ativam a expressão de fatores de crescimento como meio de resposta à

sinalização de fatores de crescimento, sendo estes produzidos através do tecido adjacente, e desta

forma há regulação do crescimento dos tecidos [24].

Para se iniciar a formação ou cicatrização óssea, o TGF-β alicia e estimula a proliferação de

células osteoprogenitoras, tendo assim uma quantidade de pré-osteoblastos. No decurso da

diferenciação dos osteoblastos, o TGF-β acaba por inibir a mineralização e a diferenciação, devido à

inibição da expressão dos genes Runx-2 e OCN. As BMP, nomeadamente as BMP-2, -4, -6 e -7 são

conhecidas pelo seu importante papel na diferenciação de osteoblastos, e a sua maioria pertence à

superfamília dos TGF-β. É importante também frisar que estes regulam os fatores de transcrição TAZ,

Runx-2 e osterix.

Um grande problema relativo à implementação de scaffolds biodegradáveis com libertação

controlada de BMPs é o facto destes exigirem concentrações de cerca de seis ordens de grandeza

superiores às concentrações fisiológicas, para se conseguir um efeito equivalente. A família de IGF,

pode ser dividida em IGF-1 e IGF-2, em que o primeiro, respetivamente, tem uma maior capacidade

osteogénica, enquanto que o segundo é o mais abundante no tecido ósseo. Sabe-se que o IGF-1

estimula tanto a mobilidade como a atividade dos osteoblastos in vitro, aumentando a formação óssea

in vivo.

Através do conhecimento da regulação das células osteoprogenitoras por meio de fatores de

crescimento podemos depreender que existe uma larga “conversa cruzada” entre as vias de sinalização

por eles ativadas. Relativamente ao uso de scaffolds biodegradáveis de forma a ser controlada a

libertação dos fatores de crescimento em substitutos de enxerto ósseo de terceira geração é uma forma

de entrega eficaz. Para ser possível refinar o controlo do microambiente, temos o desenvolvimento de

bioreatores que conseguem produzir gradientes constantes ou dinâmicos de fatores de crescimento

ligados ao substrato da matriz. Pesquisas continuam a ser necessárias nesta área, de forma a ser

possível a superação de desafios que são encontrados pela engenharia de tecidos[24].

2.2.5. Estímulo Mecânico

De forma idêntica, em termos de importância, temos o estímulo mecânico exógeno que afeta

o microambiente do tecido ósseo, sendo este um elemento fundamental para perdurar a vida e a

homeostase dos ossos. Este irá ser transformado em sinais bioquímicos, sendo estes últimos

responsáveis pelas respostas celulares através da mecanotransdução. Os osteoblastos e os

osteoclastos são células efetoras. Quanto ao tecido ósseo, podemos considerar que este é uma rede

17

celular, onde os osteócitos funcionam como células sensoriais, responsáveis pela mecanotransdução.

O paradigma mais recente referente à mecanotransdução comprova que cargas aplicadas num osso

inteiro são responsáveis por um fluxo pulsátil pelos canalículos de osteócitos. Estes podem sentir a

tensão de corte formada pelo fluxo na superfície e produzir assim moléculas de sinalização,

responsáveis pela regulação da remodelação óssea pelos osteoclastos e osteoblastos. Sabe-se que a

tensão mecânica e o fluxo de fluido pulsátil instigam a síntese de moléculas sinalizadoras pelos

osteócitos. Os efeitos da carga mecânica na força e no fluxo do fluido pulsátil pelas células ósseas está

relacionado com o efeito da tensão de tração devido à pressão hidrostática e compressão/relaxamento

da ECM (Matriz Extracelular), e a tensão de corte, devido ao fluxo do fluido. As tensões mecânicas

ósseas in vivo geram todas estas forças ao mesmo tempo. A engenharia de tecidos, neste caso ósseos,

tem interesse em usar estes mecanismos de compressão/tração de forma a estimular mecanicamente

scaffolds, carregados com células osteoprogenitoras, de forma a produzir a matriz óssea. O objetivo

será mimetizar os estímulos mecânicos que ocorrem in vivo e para tal temos que usar as diferentes

forças mecânicas. Vários estudos efetuados mostram que o efeito da pressão hidrostática cíclica nas

células osteoprogenitoras conduz a um aumento da formação de novo osso. Por outro lado, a

estimulação via tensão de corte por fluido impulsiona a diferenciação e mineralização osteogénica [18].

É necessário continuar a investigação relativa ao efeito da duração e intensidade destes

estímulos para permitir o desenvolvimento de métodos que possam ser futuramente aplicados.

Claramente o efeito da estimulação bioquímica necessita ser explorado para conseguir que o sistema

se torne o mais idêntico quando comparado à condição fisiológica [18].

2.2.6. Estímulo Eletromagnético

Os estudos realizados para esclarecer o efeito osteogénico consequente da estimulação

mecânica nos ossos, estudaram também as suas propriedades bioelétricas, concluindo que as vias

elétricas eram os principais responsáveis por esta resposta. De seguida desenvolveram-se três formas

de administrar eletricidade ao osso, incluindo corrente DC, acoplamento capacitivo e indutivo. Este

último, respetivamente, favorece a cicatrização óssea através de estimulação elétrica/ eletromagnética.

O seu mecanismo de funcionamento baseia-se na colocação de bobines na pele, no local onde se

encontra a fratura, ocorrendo a passagem de corrente através das bobines, e por consequência um

campo magnético é criado dentro do local da fratura. O campo formado não é constante, dependendo

por exemplo do tipo de fratura. Verificou-se que campos eletromagnéticos de baixa frequência induzem

o crescimento ósseo e vascular, aumentando também a expressão do fator osteogénico referido

anteriormente, Runx-2 e diminuindo a expressão do PPARγ (fator adipogénico). Apesar destas

verificações, a resposta das células relativamente a estímulos eletromagnéticos estão longe de serem

totalmente compreendidas, devido à incoerência existente de resultados obtidos em diversos estudos.

Uns comprovaram o aumento na proliferação, depois da exposição das células aos campos, no entanto

outros não verificaram diferenças relevantes. Do mesmo modo que os resultados referentes às

diferenciações osteogénicas também são variáveis. Isto pode resultar de diferentes fatores tais como

18

a diferença nos tipos de células, o estado de maturação destas e claramente das características do

campo elétrico. Analogamente ao que acontece devido à estimulação mecânica, os mecanismos

referentes à estimulação eletromagnética são substanciais, e necessitam ser otimizados de forma a

que o nosso sistema se assemelhe o mais possível às condições fisiológicas[24].

2.3. Biomateriais

Os suportes ou scaffolds, que são usados para guiarem e estruturarem o crescimento do

tecido, necessitam de usar materiais que sejam compatíveis, quer com os sistemas vivos, quer com as

células vivas, in vivo ou in vitro, uma vez que estes materiais interagem diretamente com as células

vivas. Esta interação deve ser otimizada para que a produção seja valorizada e para que as células se

expandam, diferenciem e organizem. Os scaffolds devem ser pensados de forma a que consigam

mimetizar a forma dos recetores e dos locais onde se vão localizar e a tridimensionalidade das células

a utilizar e dos tecidos a criar. Desta forma, existem então dois fatores críticos, para a utilização dos

scaffolds, sendo eles a escolha do biomaterial que se irá utilizar na criação do scaffold e o seu método

de fabricação. “Biomateriais são definidos como quaisquer materiais que interfiram com sistemas

biológicos” [11]. Para se realizar a escolha do biomaterial a usar, tendo em conta a grande diversidade

de materiais existentes, variando na sua composição química e física, tem que se ter em atenção qual

é o tecido alvo e posteriormente fazer a escolha em concordância. Os scaffolds tanto podem ser

naturais, como sintéticos ou até semissintéticos, permanentes ou biodegradáveis. Antes da sua

utilização é necessário estudar, quer a toxicidade, quer a citoxicidade do material, sendo estes, dois

parâmetros em que é necessário um controlo exigente, como forma de evitar futuras rejeições e

inflamações. Por outro lado, é também fundamental o mantimento das suas respetivas propriedades

mecânicas após implante, assim como do seu perfil de degradação. Esta última, respetivamente, é

crucial para a regeneração ser um sucesso, uma vez que, como já foi referido anteriormente, as células

detêm a necessidade de migrar para a formação de tecidos remodelados ser possível, e como

consequência, existe um timing certo, para que este procedimento seja bem sucedido. “A composição

e o design do suporte devem ser igualmente controlados e a reprodutibilidade deve ser garantida” [11].

Quanto ao produto final, este tem que ser necessariamente o melhor, quer em design, quer em

manuseamento, quer em aceitação biológica.

Uma das classes de materiais usados comumente como matéria prima dos scaffolds são os

polímeros devido à sua grande semelhança com os tecidos conjuntivos. Temos também os materiais

compósitos, sendo muito usados em engenharia de tecidos para dentária e ortopedia. Relativamente

aos polímeros, estes podem ter origem natural ou sintética. Os que são de origem natural, tal como o

colagénio, tem uma grande taxa de empregabilidade, devido às suas características, sendo elas, a

biocompatibilidade, biodegrabilidade e a sua grande abundância. Este grupo de polímeros encontra-se

presente na ECM, logo faz com que as células apresentem uma boa resposta de crescimento e

consequentemente boa biocompatibilidade. “A matriz extracelular é um espaço ocupado por várias

moléculas, que pode contribuir para a integridade mecânica, ocupando assim, um lugar importante na

sinalização e função reguladora para o desenvolvimento, manutenção e regeneração dos tecidos”[2].

19

Quanto aos biomateriais sintéticos, existem os naturais que sofreram uma modificação ou aqueles que

são completamente sintéticos, podendo ser degradáveis ou não. As vantagens associadas aos

biomateriais sintéticos não degradáveis são a sua qualidade não- imunológica, são reprodutíveis e

apresentam tanto formas, como propriedades mecânicas personificadas. Existem inúmeras aplicações

para este tipo de biomateriais, tais como, implantes ortopédicos, aparelhos de fixação de fraturas e

cateteres. Quanto aos biomateriais degradáveis, eles, são usados tanto em scaffolds como em

mecanismos de entrega de drogas [11].

Por outro lado, temos também outro tipo de materiais usados para a elaboração de scaffolds,

obtendo assim suportes que são constituídos normalmente por uma mistura de hidroxipatite e vidro ou

por cerâmicos bioativos, que devido às suas características, nomeadamente à sua porosidade na

criação ou renovação de tecidos duros, também são usados. É necessário ter em atenção que existem

inúmeros fatores que podem afetar a degradação destes, tais como solicitações mecânicas, mais

concretamente fatores de compressão e tração, localização do implante, composição química,

comparecimento de aditivos e morfologia.

De uma forma generalizada, podemos classificar os Biomateriais, segundo duas direções: a

sua composição química e o seu comportamento biológico. Relativamente à composição química,

podemos subdividir os biomateriais como:

✓ Metais e ligas metálicas.

✓ Cerâmicos.

✓ Polímeros;

✓ Compósitos

No que diz respeito ao comportamento biológico este é fundamentado pela resposta do tecido

hospedeiro, e como tal temos:

✓ Bioinertes – Materiais que não provocam nenhuma reação do corpo estranho, no organismo.

Estão diretamente ligados com o tecido recetor. Como exemplo destes, temos o titânio, a

zircónia e a alumina.

✓ Biotolerados – Não são totalmente aceites pelo tecido recetor, e por norma encontram-se

envolvidos numa cápsula fibrosa. Como exemplo temos o aço inox, as ligas de crómio-cobalto

e o PMMA (polimetilmetacrilato).

✓ Bioativos – Estes possuem na sua composição iões de cálcio e/ou fósforo, criando assim uma

ligação direta com tecidos vivos, devido ao facto de conseguirem criar uma ponte química com

o osso. Temos então a hidroxiapatite e os vidros ativos.

✓ Reabsorvíveis – Caracterizam-se pela capacidade que possuem de serem degradados

lentamente e progressivamente substituídos pelos tecidos onde vão ser implantados. Fosfato

tricálcico e vidros bioativos.

20

Uma boa osteointegração é estritamente necessária para ocorrer sucesso clínico, uma vez que

esta está diretamente associada à resistência mecânica, sendo fundamental para a performance das

funções do scaffold. É possível combinarmos vários materiais complementares entre si, de forma a

otimizar as suas propriedades mecânicas, físicas e químicas. Isto explica o facto de variados

ortopedistas utilizarem materiais compósitos na reconstrução óssea, porque as suas

propriedades/características são superiores quando comparadas às que resultariam apenas da adição

dos seus componentes. Há que ter em atenção que alguns princípios essenciais da Engenharia de

Tecidos devem ser respeitados, como por exemplo, para suceder a regeneração tecidular é

indispensável a presença de células que sejam capazes de formar novo tecido ósseo, ou seja, a

osteogénese. E para que tal aconteça, as células precisam de aderir ao material, crescer e atravessá-

lo (ou seja, que ocorra osteocondução) e que existam fatores de estimulação fenotípica em

osteoblastos (osteoindução) [2]. Os scaffolds usados, concretamente para a Engenharia de Tecidos

Ósseos, necessitam também que os biomateriais que os compõem possuam propriedades mecânicas

que se assemelhem ao osso humano, dependendo assim da localização do osso. Como exemplo, tem-

se que, no caso dos ossos corticais, estes apresentam uma elevada resistência à compressão, de

cerca de 100MPa, ao passo que os ossos esponjosos apresentam resistência à compressão de

3,9MPa, em média [10].

2.3.1. Materiais Osteogénicos

No grupo dos materiais osteogénicos incluímos os biomateriais que apresentam células vivas.

Estas células necessitam de ter tendência para se diferenciarem em tecido ósseo e como tal, para

apresentarem estas características utilizamos as células da medula óssea, do periósteo e dos tecidos

moles peritrabelculares, uma vez que estas últimas provem das células estaminais indiferenciadas do

tecido conetivo.

2.3.1.1. Osso esponjoso autólogo

Não retrata riscos de rejeição, visto que é retirado do próprio individuo, nomeadamente do

ilíaco ou da tíbia. “Além de uma matriz osteocondutora de minerais, cartilagem e proteínas, inclui

também proteínas osteoindutoras e células osteogénicas”.[2] Através destas características

apresentadas obtemos o sucesso da sua implantação, especialmente no que toca a fusões ao nível da

coluna vertebral. É importante frisar que, apesar de não existirem problemas a nível de rejeição ou

transmissão de doenças, cerca de 10% de morbilidade está associada à sua colheita. Problemas como

hematomas, hérnias, lesões nervosas, etc., são frequentes nos pacientes sujeitos a este tipo de

procedimento, tal como a possível dor crónica no local onde foi realizada a colheita.

21

2.3.1.2. Osso cortical autólogo

Este grupo é caracterizado pela sua boa resistência mecânica, nomeadamente no suporte de

carga imediata, sendo conveniente para aplicações particulares, como na coluna vertebral. O

inconveniente que este grupo apresenta é que a nível biológico os seus atributos são inferiores aos do

osso esponjoso, por diversas razões, tais como a sua reduzida porosidade, que por consequência

provoca uma revascularização lenta, menos quantidade de osteoclastos, ou seja, células

hematopoiéticas e progenitores osteoblásticos, a osteogénese do osso novo é lenta, provocando uma

remodelação lenta, uma vez que a reabsorção também o é. Devido às desvantagens referidas

anteriormente, por norma não fundamentam a sua aplicação em detrimento do aloenxerto de osso

cortical.

2.3.2. Propriedades Mecânicas

As propriedades mecânicas de um biomaterial, são essenciais para a regeneração óssea e são

responsáveis pelo sucesso ou insucesso do implante, dependendo dos tecidos nos quais eles vão ser

implantados. Como tal é necessário estudar as exigências mecânicas que é necessário cumprir nos

scaffolds a fabricar, como meio de reparação de defeitos ósseos onde carga é aplicada. Uma

caraterística muito importante e que é necessário ter em conta é a porosidade e a arquitetura dos poros

nos scaffolds. Se aumentarmos a porosidade, iremos proporcionar um aumento do crescimento ósseo,

no entanto, compromete a sua resistência mecânica, e como tal a integridade da estrutura. Para se

elaborar o design do scaffold é indispensável tomar em conta fatores como elasticidade, força e tensão.

Os critérios reológicos relativos aos fatores referidos anteriormente são:

• Regime elástico e plástico;

• Tensão de cedência;

• Resistência à compressão (tensão máxima que um material consegue suportar em

compressão, antes de atingir a fratura);

• Tensão de fratura;

Algumas das propriedades decorrentes destes critérios são as seguintes:

• Módulo de Young (é possível retirá-lo do gráfico de tensão-extensão correspondente, uma vez

que este é o declive da reta no regime elástico), indica a rigidez do scaffold;

• Módulo da resiliência (área sobre a curva de tensão-extensão), reflete a energia empregue na

deformação do scaffold, devido a uma determinada tensão, representando a tenacidade do

material relativo à deformação elástica;

• Módulo de Weibull (parâmetro sem dimensão comumente conhecido como “parâmetro de

forma”, estando este relacionado à volubilidade de resistência do material;

22

• Trabalho de fratura (energia relativa à fratura), sendo este diretamente proporcional à relação

entre o módulo de Young e a tensão);

Através do método de fabricação usado é possível controlar algumas destas propriedades

mecânicas. Como exemplo temos, o tratamento térmico de scaffolds compostos por BG20 (vidro

bioativo) altera a percentagem de cristalização e consequentemente modifica a resistência mecânica,

biodegradabilidade e bioatividade, e a resistência à compressão dos scaffolds de TiO2 é possível ser

melhorada através da utilização de diversos processos de recobrimento [24].

2.3.3. Classes USP

A matéria prima dos scaffolds nesta dissertação é um polímero, com a designação comercial de

Crystal, proveniente da empresa 3D Systems e segundo o fabricante cumpre os requisitos USP Classe

VI. USP, ou seja, Farmacopeia dos Estados Unidos, é uma organização independente, que introduziu

um conjunto de padrões necessários, de forma a garantir a qualidade dos medicamentos e tecnologias

usadas para assistência médica. Estes protocolos são utilizados de forma a classificar os polímeros

usados em classes, de I a VI (Figura 5), dependendo do seu uso final, e tipos/tempos de exposição dos

polímeros aos tecidos [25]. Logicamente o teste Classe I, será o menos rigoroso, enquanto que o

Classe VI será o mais severo. Regra geral, três tipos de testes são realizados, sendo eles:

• Testes de toxicidade sistémica, como forma de precisar quais os efeitos irritantes relativos

aos lixiviáveis tóxicos que existem no material teste;

• Testes intracutâneos, são realizados para determinar a qual é a reação a nível local, do

tecido, a substâncias lixiviáveis;

• Testes de implantação, para classificar qual é a reação do tecido vivo relativamente ao

plástico;

Aparelhos de superfície

Pele

Limitado

USP Classe

I

Prologando

USP Classe I

Permanente

USP Classe

I

Superfícies Mucosas

Limitado

USP Classe

I

Prolongado

USP Classe

III

Permanente

USP Classe

V

Superfícies partidas ou

corrompidas

Limitado

USP Classe

III

Prolongado

USP Classe

V

Permanente

USP Classe

VI

23

Figura 5: Diversas aplicações e respetivas Classes USP (I-VI).6

2.4. Impressão a 3D

O pioneiro dos novos métodos tecnológicos baseados no conceito de produção assistida foi Chuck

Hull em 1986, que apresentou o método de Esteriolitografia [13]. Desde essa altura, com o avanço

tecnológico vários métodos foram descobertos e utilizados, até se chegar à impressão 3D, como a

conhecemos hoje em dia. A impressão 3D é um método de fabricação em que materiais, tais como

polímeros ou metais, são depositados em camadas de forma a produzir um objeto tridimensional, como

por exemplo, um copo ou outros objetos muito mais complexos a três dimensões [26].

É fácil perceber as inúmeras vantagens que esta técnica oferece, nas mais diferentes áreas, no

entanto, existe uma peculiaridade a ter em atenção, que é o caso das economias de escala. Embora

os métodos de fabricação tradicionais sejam muito mais vantajosos a nível económico para a produção

em larga escala, o custo da impressão 3D está cada vez mais competitivo. É preciso ter em conta que

esta técnica permite ter uma arquitetura controlada da matriz, ou seja, em termos de tamanho, forma,

poros, interconexões, a possibilidade de ter controlo sob o tamanho dos poros e consequentemente

uma mecânica controlada. Como desvantagem principal tem-se que é restrita a certo tipo de polímeros,

sendo válido para fabrico de estruturas porosas como é o caso dos ossos [13].

6 Figura 5 adaptada de https://www.distrupol.com/5549_Distrupol-US_Pharma_Plastics_Designations-Final.pdf;

Aparelhos de comunicação

externa

Caminhos indiretos do

sangue

Limitado

USP Classe IV

Prolongado

USP Classe V

Permanente

USP Classe

VI

Tecido / Osso

Limitado

USP Classe

IV

Prolongado

USP Classe VI

Permanente

USP Classe

VI

Sangue Circulante

Limitado

USP Classe

IV

Prolongado

USP Classe

VI

Permanente

USP Classe VI

24

Existem inúmeros potenciais usos para a impressão 3D em medicina, muitos deles no ramo da

oftalmologia, dentária e ortopedia, que irão ter um impacto significativo na forma como os pacientes

são tratados no futuro [26].

Uma das formas da qual a impressão a 3D está a ser investigada e estudada é com o objetivo de

produzir órgãos ou ossos, para reparar ou substituir antigos lesados ou não funcionais. Por acréscimo,

esta forma de impressão tem também o potencial de criar por completo novos órgãos, que consigam

mimetizar as funções biológicas, como por exemplo o pâncreas, em caso de diabetes. E como tal,

resulta num avanço significativo no tratamento de doenças, e consequentemente, cria um alívio

considerável na procura de bancos de ossos ou transplantes de órgãos, sendo estes escassos. Para

além disto, no tratamento com órgãos transplantados é ainda necessário encontrar um tecido

compatível. Estes problemas desapareceriam por completo se os órgãos fossem fabricados por este

método e que assim garantíssemos o crescimento e proliferação de células, no corpo do paciente[27].

A impressão 3D empregue no desenvolvimento de scaffolds para engenharia de tecidos possui de

grosso modo, três fases distintas:

• A formação de um protótipo virtual do scaffold utilizando softwares de desenho técnico, de

forma a criar a geometria com as características pretendidas (estrutura e porosidade);

• O passo seguinte será converter este ficheiro, noutro adequado à impressão, nomeadamente

o ficheiro STL, usando assim um software de execução assistida por computador;

Relativamente ao STL, este é um formato de ficheiro criado pela empresa 3D Systems, que

rapidamente se tornou o formato padrão de transmissão de dados no setor da Prototipagem Rápida. O

seu funcionamento baseia-se na aproximação de superfícies de um modelo através do uso de

triângulos, ou seja, na Figura 6, podemos observar que a caixa inicial, pode ser aproximada através do

uso de 12 triângulos. Quando mais complexa for a nossa estrutura, mais triângulos são produzidos no

sentido de a conseguir replicar na totalidade.[28]

Os sistemas CAD atuais, praticamente todos, são capazes de produzir um arquivo STL.

Figura 6: Figura representativa do funcionamento do formato STL.7

• O passo final será a de impressão, e como tal teremos o nosso scaffold a ser impresso camada

por camada, através da adição de porções do material pretendido;

7 Figura 6 adaptada de https://www.3dsystems.com/quickparts/learning-center/what-is-stl-file

25

No entanto existem inúmeros processos de fabrico, para além da impressão a 3D, possíveis de

ser usados na fabricação de scaffolds, cada um com as suas especificidades, e por consequência,

influencia as características que este vai apresentar, quer em termos de materiais usados, quer a nível

de geometria, influenciando assim, as propriedades mecânicas respetivas, sistema de permeabilidade

e condições necessárias para a adesão, crescimento e proliferação celular [29]. É possível dividir-se

os processos de fabrico em dois segmentos diferentes: técnicas convencionais e técnicas aditivas.

Atualmente as técnicas aditivas são as mais usadas, uma vez, que as técnicas convencionais possuem

uma grande quantidade de limitações, tais como a morosidade dos processos, a utilização de solventes

que apresentam toxicidade e a falta de controlo dimensional [30].

A impressão a 3D é considerada uma técnica aditiva, mas existem outras técnicas, pertencentes a este

grupo [30]. Estas técnicas, em comum, têm o facto de fazerem uso de métodos computacionais para

assistirem o fabrico dos scaffolds, produzindo-os assim, muito mais rapidamente, e também o facto de

usarem o princípio de fabricação por camadas. Temos como técnicas aditivas a Sinterização a laser

(SLS), a Estereolitografia (SL), como foi referida anteriormente, pioneira da impressão a 3D e

Moldagem através da deposição de fundidos (FDM) [31]. A primeira respetivamente, sinteriza as

partículas de pó do material em questão, através da metodologia camada a camada, idêntica à

impressão 3D, onde a maior diferença está no facto de esta usar ligante como forma de união das

partículas [32]. Relativamente à Estereolitografia (SL) o seu princípio de funcionamento baseia-se na

solidificação da resina, com a particularidade desta ser fotossensível, de forma à estrutura ser criada

[33]. Por fim temos a moldagem através da deposição de fundido (FDM) que é uma técnica que utiliza

a deposição de um fio continuo, à escala dos micrómetros, de um termoplástico e através deste

processo constrói-se uma estrutura, por extrusão [32].

27

Capítulo III

Metodologia

Neste capítulo será elaborada uma descrição do processo usado para a realização dos scaffolds,

visto que, até chegar ao produto final, diversos passos foram executados e alguns deles variadas vezes,

para obtermos o scaffold com a qualidade desejada e com as normas de biocompatibilidade

alcançadas. O processo realizado, pode ser dividido em três etapas:

• Produção do ficheiro STL;

• Impressão a 3D;

• Tratamento e limpeza dos scaffolds;

3.1. Produção e impressão

Após a produção do ficheiro, ele é enviado para a impressora 3D (Figura 7).

Figura 7: Ficheiro STL. Respetivamente da esquerda para a direita, tem-se as estruturas SD70, SG70 e SP70.

28

Para a realização deste projeto usou-se a Impressora MJP3600, como se pode ver na Figura

8, sendo esta uma impressora Multijet, ideal para a impressão de plásticos. MJP ou Multijet Printing

é um método de impressão a jato de tinta, que leva a cabo o uso da tecnologia de impressão piezo,

de forma a que a resina plástica fotocurável seja depositada ou a moldagem de materiais camada a

camada seja feita. Esta tecnologia é usada como forma de construir peças ou moldes, com diversos

detalhes para as diferentes aplicações possíveis, oferecendo uma grande resolução. O material usado

para a impressão dos scaffolds foi o polímero, com a designação comercial de Crystal, proveniente

da mesma empresa, 3D Systems, devido à sua especificação de biocompatibilidade. É necessário

um material de suporte, de forma a ser possível a construção de camada por camada, com geometrias

internas. [28]

Figura 8: Impressora MJP600, utilizada para a impressão dos scaffolds.

Foram produzidos quatro tipos de scaffolds, divergindo na estrutura e porosidade. Destes

quatro, temos um deles com 0% de porosidade, como de pode ver na Figura 9, sendo apenas um

paralelepípedo, servindo de padrão dimensional impresso, de forma a ser possível, posteriormente a

comparação dos seus pesos e perceber se o processo de limpeza, ou seja, a remoção da cera foi bem

realizada. Relativamente aos outros três, estes apresentam porosidades de 50% e 70%, com as

estruturas Gyroid e Schwartz D e P, doravante referidas como G, D e P (Figura 10), sendo a grande

diferença entre as estruturas a variação nas células base, ou seja, cada unidade base tem 3x3x3mm,

construindo estruturas paralelepípedas com 5x5x10 unidades base, resultando em dimensões finais de

15x15x30mm.

29

Figura 9: Padrão dimensional impresso à esquerda e TPMS Gyroid, à direita.

Figura 10: Figura representativa dos diferentes scaffolds impressos. Respetivamente da esquerda para a direita temos na

prima fila, SP50, SP70, SG70 e na segunda fila, SG50, SD70, SD50.

30

3.2. Tratamento

Relativamente ao procedimento de limpeza, referente ao material Crystal é necessário seguir o

protocolo de tratamento definido para o material cumprir as normas USP Classe VI, aprovadas para

este material, uma vez que estes scaffolds são destinados à implementação no organismo e para isso,

necessitam de ser biocompatíveis, sendo necessário o cumprimento destas normas apropriadas ao

efeito. Como tal, após os scaffolds terem saído da impressora, estes foram pesados e de seguida foram

depositados no forno (como se pode ver na Figura 11), a 65ºC, durante 1 hora.

Figura 11: Imagens representativas do forno usado nos tratamentos de limpeza dos scaffolds.

Por conseguinte, foi necessário retirá-los e limpá-los com papel absorvente de forma a que a

cera derretida possa começar a sair. Posteriormente foram colocados outra vez no forno. Este processo

foi retido várias vezes, para garantir que a maior parte da cera/material de suporte, contida nos poros

do scaffold fosse retirada. Foi realizada uma pesagem constante (ADAM PQW 4502), por cada hora

que os scaffolds passavam no forno, de forma a ser possível no final, o cálculo da massa volúmica

referente a cada estrutura, em comparação com a massa volúmica do scaffold de padrão dimensional

impresso, e assim perceber, se o processo de limpeza foi feito corretamente. No entanto, como se

queria uma pesagem uniforme e durante este processo a cera acabava por secar, foi aumentado o

tempo de permanência no forno para cerca de 2 horas, para conseguir otimizar o processo de remoção

de cera. Quando os pesos começaram a estabilizar, voltou-se a aumentar o tempo de forno para cerca

de 10/15h, uma vez que a variação já era pequena, maioritariamente na casa das centésimas. Foi

também utilizado, papel aderente, por baixo dos scaffolds, uma vez que este ajuda o processo de

remoção de cera. Há que ter em atenção que o papel necessita ser trocado, sempre que este se

31

encontra com cera, pois caso contrário, a sua utilidade é perdida e uma camada de cera fica “presa”

na superfície do scaffold em contacto com o papel. Quando o peso começou a variar muito pouco,

passadas muitas horas seguidas de permanência no forno e praticamente já não se encontrava cera

no papel absorvente, foi utilizada a pistola de ar quente J. Wagner GmbH, cerca de 10 minutos em cada

scaffold, como se pode ver na Figura 12, e colocou-se no forno, por mais 1 hora. Após esta hora no

forno, os scaffolds foram pesados novamente.

Figura 12: Aplicação da pistola de ar quente nos scaffols, após retirar do forno.

O próximo passo foi encher recipientes de plástico com isopropanol e deixar os scaffolds nesta

solução, sendo necessário esfregá-los periodicamente para ajudar a remover o material de suporte. O

primeiro de 5 banhos é feito durante 20 minutos. O processo é repetido mais quatro vezes, mas o tempo

de imersão é reduzido para 5 minutos. É necessário trocar as luvas, por cada banho realizado para

prevenir a potencial contaminação das nossas amostras. Após a finalização dos banhos, os scaffolds

foram retirados e deixados a secar ao ar. Por fim, foi feita uma inspeção visual à superfície das

amostras, para perceber se o material de suporte, ou algum tipo de contaminante foi, ou não, removido

totalmente. Caso ainda existissem contaminantes o processo de limpeza poderia ser realizado de novo

[34]. Quando os scaffolds se encontravam totalmente secos, foi realizada a pesagem final. Na tabela 4

são apresentadas as diferentes horas que os scaffolds permaneceram no forno, posterior tratamento

com pistola de ar quente e álcool com a descrição dos tratamentos realizados.

32

Tabela 4: Descrição dos tratamentos de limpeza em função das pesagens.

# Pesagem Descrição # Pesagem Descrição

1 Primeira pesagem após saída da

impressora 3D 13

Pesagem realizada após a 12ª hora de permanência no forno

2 Pesagem realizada após a 1ª hora

de permanência no forno 14

Pesagem realizada após a 2 horas de permanência no forno, ou seja,

num total de 14 horas



































Pesagem realizada após aplicação de pistola de ar quente, sendo que

posteriormente a amostra foi submetida a 1 hora de permanência no forno, ou seja, num total de 54

horas



Pesagem realizada após os tratamentos com isopropanol

Por fim, a massa volúmica de cada scaffold foi calculada, utilizando o resultado obtido na última

pesagem e tendo como comparação a massa volúmica calculada dos scaffolds de padrão dimensional

impresso. É possível calcular a massa volúmica, através da seguinte fórmula:

𝜌 =𝑚

𝑣

Em que m é a massa e v, o volume. Como os nossos scaffolds de padrão dimensional impresso são

paralelepípedos maciços, calculou-se o volume através de:

𝑣 = 𝐴𝑏. ℎ

33

Em que Ab, é a área correspondente à base e h, a altura. Os pesos foram obtidos através da

média de 3 pesagens efetuadas a cada scaffold, como forma de reduzir a taxa de erro da balança

usada. Consoante a porosidade de cada estrutura, obter-se-á um peso pré-estabelecido, ou seja,

scaffolds com 70% de porosidade pesarão cerca de 30% da massa do sólido, e, por analogia, no caso

dos que têm 50% de porosidade, o seu peso será cerca de 50% da massa do sólido.

3.3. Testes mecânicos

O objetivo central deste trabalho foi a análise do comportamento mecânico dos scaffolds

aquando da realização de ensaios de compressão. Como tal, foi feito para cada scaffold, o ensaio de

compressão respetivo. Utilizou-se a máquina de ensaios mecânicos (INSTRON 2663-821), como se

pode ver na Figura 13, para a realização dos testes. Para a realização dos ensaios foi usado o modelo

de compressão de 1,3 mm/min. O objetivo foi levar todos os provetes até à fratura, no entanto, nem

todos fraturaram devido a erros relativos ao vídeo-extensómetro. É importante frisar que, optou-se por

utilizar o vídeo-extensómetro ao invés do braço mecânico, de forma a reduzir folgas e erros associados,

visto que o braço não é tão preciso. No capítulo seguinte é feita uma análise de ambos os métodos.

Através destes ensaios é possível obter o módulo de Young equivalente, tensão de cedência,

fratura e respetivas deformações, elástica e plástica. Por conseguinte, com a ajuda do Matlab e através

da exportação dos ficheiros produzidos pelo software BlueHill 3, fez-se o tratamento dos dados, em

particular, a interpolação das curvas de tensão- deformação, e análise estatística referente aos ensaios

feitos, e assim, produziram-se os gráficos comparativos das diferentes estruturas. É importante retirar

e comparar estes parâmetros, para ser possível o estudo do comportamento biomecânico dos scaffolds,

em regime de compressão.

.

Figura 13: Ensaio de compressão, à esquerda e vídeo-extensómetro, à direita.

35

Capítulo IV

Resultados e Discussão

Este capítulo tem como objetivo estudar e discutir tanto a capacidade de remoção do material

de suporte dos scaffolds, como as propriedades mecânicas medidas após a realização dos ensaios de

compressão.

4.1. Tratamento/ Pesagens

Foi realizada uma pesagem dos scaffolds de padrão dimensional impresso, como se pode ver na

Tabela 5, de forma a ser possível o cálculo da densidade. A média de cada três pesagens dos scaffolds

foi calculada, para reduzir a taxa de erro da balança usada na medição e o esse valor foi utilizado

posteriormente para a realização dos cálculos necessários.

Tabela 5: Pesagem referente aos scaffolds de padrão dimensional impresso.

De seguida, calculou-se para cada um dos scaffolds padrão a massa volúmica respetiva e foi

feita a média, obtendo o valor de 1,18 × 10−3𝑔/𝑚𝑚3. Nas especificações do material Crystal, fornecidas

pela 3D Systems, não temos o valor da massa volúmica à temperatura ambiente (estado sólido), mas

temos o valor de 1,02 × 10−3𝑔/𝑚𝑚3 a 80ºC, em estado líquido. Considera-se que, em estado sólido, a

massa volúmica aumenta (salvo poucas exceções), o que faz crer que o valor que foi obtido de massa

Padrão Dimensional Impresso

Pesagens Massa (g)

1ª 7,93 7,93 7,96 7,93 7,93 7,96 7,94 7,98

2º 7,99 7,93 7,97 7,95 7,96 7,91 7,90 7,91

3ª 7,94 7,91 7,96 7,93 7,89 7,94 7,96 7,96

Média 7,95 7,92 7,96 7,94 7,93 7,94 7,93 7,95

Média Total

7,94

Percentagem relativa à diferença entre a Média e a Média Total

1,29% -1,70% 2,30% -0,40% -1,40% -0,30% -0,70% 1,00%

36

volúmica é concordante com o tabelado. Assim é possível verificar, através dos pesos obtidos no final

dos tratamentos, tempo de exposição no forno, aplicação da pistola e álcool, se os pesos obtidos são

os esperados, ou seja, como foi referido anteriormente, 50% de porosidade, implica 50% de material

sólido e analogamente, 70% de porosidade implica 30% de material sólido. A Tabela 6 indica os

resultados obtidos da massa, referente a cada scaffold, após tratamentos.

Tabela 6: Pesagem referente aos diferentes scaffolds após finalização dos tratamentos de limpeza.

24ª Pesagem

Média (g) SP50 SP70 SD50 SD70 SG50 SG70

1 3,77 1,98 3,91 2,18 3,79 2,18

2 3,80 2,06 3,92 2,23 3,80 2,19

3 3,82 2,07 3,91 2,20 3,82 2,15

Média dos 3 Scaffolds (g) 3,80 2,04 3,91 2,20 3,80 2,17

Com estes dados é possível calcular a massa volúmica de cada scaffold, sendo os respetivos

resultados apresentados na tabela 7.

Tabela 7: Valores obtidos de massa volúmica dos scaffolds vs. Valores esperados.

Como se pode observar através dos resultados, o valor obtido não é igual ao valor esperado,

no entanto é muito próximo dele. O que significa que o processo de limpeza foi bem realizado e ainda

mais importante, significa que é eficaz. Como já foi referido anteriormente, os scaffolds foram sempre

pesados, após aplicação dos tratamentos de limpeza, permitindo assim a análise das diminuições de

pesos, como se pode ver na Figura 14.

Valor Obtido Valor Esperado

SP70 3,02 × 10−4𝑔/𝑚𝑚2 ≈ 26%

30% SD70 3,26 × 10−4𝑔/𝑚𝑚2 ≈ 28%

SG70 3,21 × 10−4𝑔/𝑚𝑚2 ≈ 27%

SP50 5,63 × 10−4𝑔/𝑚𝑚2 ≈ 48%

50% SD50 5,79 × 10−4𝑔/𝑚𝑚2 ≈ 49%

SG50 5,63 × 10−4𝑔/𝑚𝑚2 ≈ 48%

37

Figura 14: Gráficos representativos da pesagem dos scaffolds em função do número de pesagens, durante os vários

processos de limpeza, mantendo a mesma porosidade e variando a estrutura.

0

1

2

3

4

5

6

7

8

1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23

Mas

sa (

g)

# Pesagens

SP70

SP50

0

2

4

6

8

1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23

Mas

sa (

g)

# Pesagens

SD70

SD50

0

1

2

3

4

5

6

7

8

1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23

Mas

sa (

g)

# Pesagens

SG70

SG50

38

Através da análise dos gráficos é notório que o processo mais eficaz, comparando tempo

despendido e perda do material de suporte é o banho em isopropanol, uma vez que neste processo

cerca de 13% de massa é perdida. No entanto, além de ser mais dispendioso, devido ao preço do

álcool, não se sabe se o facto de se aumentar o tempo de permanência ou a quantidade de vezes que

os banhos são realizados, se não danifica a estrutura do material. Esta análise foi realizada com o

intuito de compreender se os tratamentos de limpeza são eficazes na remoção de cera e também,

perceber se existem formas de otimizar o processo. É importante fazer também uma análise dos

gráficos, comparando apenas a estrutura, mantendo a porosidade, como podemos ver na Figura 15.

Figura 15: Gráficos representativos da pesagem dos scaffolds em função do número de pesagens, durante os vários

processos de limpeza, comparando as diferentes estruturas, mas mantendo a porosidade.

0

1

2

3

4

5

6

7

8

1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23

Mas

sa (

g)

# Pesagens

SG70

SP70

SD70

0

1

2

3

4

5

6

7

8

1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23

Mas

sa (

g)

# Pesagens

SG50

SP50

SD50

39

De uma forma geral, inicialmente os scaffolds apresentam uma massa semelhante e ambos

decrescem uma percentagem similar, após tratamento com o álcool. Os resultados sugerem, em regra,

que os scaffolds, após tratamentos pesam valores muito aproximados uns dos outros.

4.2. Ensaios mecânicos

De seguida foram realizados os ensaios mecânicos, nomeadamente, ensaios de compressão,

onde é possível analisar as propriedades mecânicas dos nossos provetes. Dos 8 scaffolds produzidos

de cada estrutura e porosidade, 4 deles foram testados através do Micro CT, como forma de analisar a

eficiência do tratamento de limpeza. A Microtomografia Computadorizada é análoga a uma radiografia,

no entanto tem a grande diferença de ser realizada em pequena escala e da sua resolução ir

aumentando exponencialmente, tendo como objetivo a visualização das estruturas dos scaffolds [35].

Não sendo um ensaio destrutivo foi possível posteriormente realizar os ensaios mecânicos nestes

scaffolds e desta forma perceber se este exame afeta as propriedades do material, nomeadamente o

Módulo de Young (E), como se pode ver nas seguintes tabelas.

Tabela 8: Valores obtidos do Módulo de Young (E) depois da realização dos ensaios de compressão nos scaffolds

P50 que foram testados no Micro CT e nos P50 que não foram testados Micro CT.

Tabela 9: Valores obtidos do Módulo de Young (E) depois da realização dos ensaios de compressão nos scaffolds D50 que

foram testados no Micro CT e nos D50 que não foram testados Micro CT.

SVE

E (GPa) Sem 𝝁CT Com 𝝁CT Erro

1 0,402 0,429 -0,629%

2 0,371 0,381 -2,625%

3 0,373 0,339 10,029%

4 0,384 0,377 1,857%

Erro Médio 2,158%

SVE


1 0,423 0,275 53,818%

2 0,358 0,355 0,845%

3 0,392 0,333 17,718%

4 0,369 0,345 6,957%

Erro Médio 19,835%

40

Tabela 10: Valores obtidos do Módulo de Young (E) depois da realização dos ensaios de compressão nos scaffolds G50 que

foram testados no Micro CT e nos G50 que não foram testados Micro CT.

Tabela 11: Valores obtidos do Módulo de Young (E) depois da realização dos ensaios de compressão nos scaffolds P70 que

foram testados no Micro CT e nos P70 que não foram testados Micro CT.

Tabela 12: Valores obtidos do Módulo de Young (E) depois da realização dos ensaios de compressão nos scaffolds D70 que

foram testados no Micro CT e nos D70 que não foram testados Micro CT.

Tabela 13: Valores obtidos do Módulo de Young (E) depois da realização dos ensaios de compressão nos scaffolds G70 que

foram testados no Micro CT e nos G70 que não foram testados Micro CT.

Os resultados obtidos para os scaffolds que foram submetidos ao Micro CT, não apresentam

diferenças significativas de valores, quando comparados com os restantes scaffolds. Apresentam

SVE


1 0,314 0,303 3,630%

2 0,327 0,284 15,141%

3 0,312 0,304 2,632%

4 0,324 0,309 4,854%

Erro Médio 6,564%

SVE


1 0,111 0,109 1,835%

2 0,110 0,112 -1,786%

3 0,108 0,106 1,887%

4 0,110 0,109 0,917%

Erro Médio 0,713%

SVE


1 0,158 0,156 1,282%

2 0,134 0,145 -7,586%

3 0,153 0,142 7,746%

4 0,167 0,143 16,783%

Erro Médio 4,556%

SVE


1 0,143 0,134 6,716%

2 0,154 0,127 21,259%

3 0,139 0,138 0,725%

4 0,137 0,129 6,202%

Erro Médio 8,726%

41

valores num intervalo de erros entre 0,7% a 9%, com exceção do D50 que apresenta um erro de 20%,

devido a um valor que apresenta uma grande discrepância, em consequência de um erro que ocorreu

no vídeo-extensómetro. Os erros foram calculados relativamente aos scaffolds que sofreram o Micro

CT. Como tal, é possível verificar pela análise da tabela que o Micro CT, não compromete as

características do material.

O Módulo de Young (E) é uma característica de cada tipo de material, sendo que o Crystal

pertence à categoria dos polímeros e tem obrigatoriamente que apresentar valores num intervalo entre

0,002 e 4,8 GPa, o que é concordante com os dados obtidos. Porosidades diferentes, levam a

resultados de E diferentes, uma vez que este é calculado através da equação:

𝜃 =𝐸

𝜀

Sendo que 𝜃 é a tensão aplicada, E, o módulo de Young e 𝜀, a extensão. E 𝜃, é calculado por:

𝜃 =𝐹

𝐴

Em que F é a força aplicada e A, a área transversal respetiva. Uma vez que, os nossos scaffolds são

porosos, excetuando o padrão dimensional impresso, sendo esse o único que o E, tem que se

aproximar do valor tabelado pela 3D Systems, que é 1,463 GPa, que de facto se verifica, sendo em

média de 1,293 GPa, 12% abaixo do valor esperado, como se pode ver pela Tabela 14. De seguida é

também apresentado o gráfico Tensão vs. Extensão, respetivo ao padrão dimensional impresso (Figura

16).

Tabela 14: Valores obtidos do Módulo de Young (E) para o padrão dimensional impresso.

SVE

Padrão dimensional impresso/ Módulo de Young (GPa)

1 1,326

2 1,334

3 1,333

4 1,298

5 1,257

6 1,235

7 1,261

8 1,298

Média do Módulo de Young 1,293

42

Figura 16: Gráfico Tensão vs. Extensão (Arm) referente ao padrão dimensional impresso.

É importante referir que nem todos os provetes fraturaram e noutros ocorreu erro no vídeo-

extensómetro, nomeadamente:

• SG50 1 e 2 (sem Micro CT) não fraturou;

• SP50 1 e 3 (sem Micro CT) não fraturou;

• SG70 2 e 4 (sem Micro CT) ocorreu erro no vídeo-extensómetro;

• SG70 5 e 6 (Micro CT) ocorreu erro no vídeo-extensómetro;

• SD50 1 (sem Micro CT) ocorreu erro no vídeo-extensómetro;

Os dados foram obtidos de 2 formas diferentes, através da utilização do vídeo-extensómetro e

através do braço mecânico, para ser possível compreender qual destes dois métodos de obtenção de

resultados é mais preciso. Os valores obtidos do Módulo de Young (E), referentes a estes métodos

encontram-se representados nas tabelas seguintes. No entanto, para ser possível realizar a

comparação de valores, apenas se pode usar os scaffolds padrão dimensional impresso, porque

apenas com esses se tem um valor de comparação, sendo este o valor do E fornecido pela 3D Systems

Tabela 15: Valores obtidos do Módulo de Young (E) para o padrão dimensional impresso, medidos através da utilização do

Vídeo-extensómetro (SVE) Vs. Braço mecânico (Arm).

E (GPa) SVE Arm Erro

1 1,326 0,807 -39,140%

2 1,334 0,829 -37,856%

3 1,333 0,833 -37,509%

4 1,298 0,844 -34,977%

5 1,257 0,812 -35,402%

43

6 1,235 0,819 -33,684%

7 1,261 0,814 -35,448%

8 1,298 0,830 -36,055%

Média 1,293 0,824 -36,259%

Tabela 16: Valores obtidos do Módulo de Young (E) para o P50, medidos através da utilização do Vídeo-extensómetro (SVE)

Vs. Braço mecânico (Arm).

Tabela 17: Valores obtidos do Módulo de Young (E) para o D50, medidos através da utilização do Vídeo-extensómetro (SVE)


E(GPa) SVE Arm Erro

1 0,423 0,327 -22,695%

2 0,358 0,318 -11,173%

3 0,392 0,330 -15,816%

4 0,369 0,288 -21,951%

5 0,275 0,288 4,727%

6 0,355 0,296 -16,619%

7 0,333 0,278 -16,517%

8 0,345 0,298 -13,623%

Média 0,356 0,267 -14,208%

Tabela 18: Valores obtidos do Módulo de Young (E) para o G50, medidos através da utilização do Vídeo-extensómetro (SVE)



1 0,314 0,273 -13,057%

2 0,327 0,279 -14,679%

3 0,312 0,280 -10,256%

4 0,324 0,272 -16,049%

5 0,303 0,262 -13,531%

6 0,284 0,252 -11,268%

7 0,304 0,259 -14,803%

8 0,309 0,283 -8,414%

Média 0,309 0,270 -12,757%

E(GPa) SVE Arm Erro

1 0,402 0,304 -24,378%

2 0,370 0,308 -16,757%

3 0,373 0,301 -19,303%

4 0,384 0,289 -24,739%

5 0,429 0,295 -31,235%

6 0,381 0,298 -21,785%

7 0,339 0,288 -15,044%

8 0,377 0,303 -19,629%

Média 0,382 0,298 21,609%

44

Tabela 19: Valores obtidos do Módulo de Young (E) para o P70, medidos através da utilização do Vídeo-extensómetro (SVE)



1 0,111 0,099 -10,811%

2 0,110 0,104 -5,455%

3 0,108 0,095 -12,037%

4 0,110 0,097 -11,818%

5 0,109 0,098 -10,092%

6 0,112 0,102 -8,929%

7 0,106 0,094 -7,500%

8 0,109 0,095 -12,844%

Média 0,109 0,098 -9,936%

Tabela 20: Valores obtidos do Módulo de Young (E) para o D70, medidos através da utilização do Vídeo-extensómetro (SVE)



1 0,158 0,143 -9,494%

2 0,134 0,127 -5,224%

3 0,153 0,132 -13,725%

4 0,167 0,151 -9,581%

5 0,156 0,147 -5,769%

6 0,145 0,128 -11,724%

7 0,142 0,132 -7,042%

8 0,143 0,138 -3,497%

Média 0,149 0,137 -8,257%

Tabela 21: Valores obtidos do Módulo de Young (E) para o G70, medidos através da utilização do Vídeo-extensómetro (SVE)



1 0,143 0,129 -9,790%

2 0,154 0,124 -19,481%

3 0,139 0,123 -11,511%

4 0,137 0,113 -17,518%

5 0,134 0,122 -8,955%

6 0,127 0,116 -8,661%

7 0,138 0,119 -13,768%

8 0,129 0,117 -9,302%

Média 0,138 0,120 -12,373%

Através destes dados é possível perceber que os valores obtidos pelo SVE, variam em média

12% do valor tabelado para o E deste material, enquanto que os valores obtidos para o braço mecânico

variam em média 47%, dos valores tabelados. O erro calculado quando foi comparado o SVE, com o

braço mecânico, em média é de 36%. As tabelas que se seguem ao padrão dimensional impresso são

45

relativas aos valores obtidos das diferentes estruturas, com porosidades diferentes. E de forma análoga

é possível verificar que por norma apresentam um valor mais fidedigno pelo método SVE, como o erro

obtido afirma. Como tal, pode-se dizer que o vídeo- extensómetro é o método mais preciso, quando

comparado ao braço mecânico, uma vez que este último possui folgas e por consequência muitos erros

associados.

Considerando então os dados fornecidos pelo SVE é possível realizar uma análise de qual destas

estruturas e porosidades diferentes, apresentam um maior E, permitindo assim perceber qual destes

scaffolds apresenta um maior regime elástico, permitindo assim, que uma maior carga seja aplicada,

sem que a deformação seja irreversível. É importante frisar, que este E obtido é um Eeq, como foi

referido anteriormente. Através dos dados é possível verificar que o scaffold com TPMS P50 é o que

em média apresenta maior valor de E, nomeadamente de 0,382 GPa. Analisando apenas em termos

de propriedades mecânicas, os dados sugerem que o P50, seria a melhor estrutura e porosidade a ser

usada como scaffold ósseo, nomeadamente para substituir um osso que se seja muito submetido a

tensões de compressão.

4.3. Sumário

Na parte experimental desta dissertação, foi analisada a eficiência dos processos de limpeza

sugeridos pela empresa fabricante do material que compõe os scaffolds e foi também realizado ensaios

de compressão a cada scaffold existente, de forma a ser possível verificar algumas propriedades do

material, bem como, a compreensão de qual método de medida seria o mais eficiente para a obtenção

dos resultados, com isto quero dizer, qual deles apresentava uma menor taxa de erro.

Relativamente aos processos de tratamento utilizados, os resultados sugerem que o método mais

eficaz é a utilização do álcool, nomeadamente do isopropanol, como forma de retirar o material de

suporte existente na estrutura dos scaffolds. No entanto um estudo pormenorizado terá que ser

realizado, visto que não se sabe se um maior tempo de permanência dos scaffolds, ou o aumento da

efetuação dos banhos, não danifica ou corrompe a estrutura do material e por consequência, as

propriedades mecânicas associadas ao material em questão. É importante referir que o sucesso e

otimização dos tratamentos de limpeza têm influência nos resultados obtidos após realização dos

ensaios mecânicos, uma vez que, caso o tratamento não seja efetuado com êxito, pode possibilitar a

ocorrência de erros nos resultados obtidos para os provetes, uma vez que a cera ainda se encontrará

acumulada nos poros. Com este estudo, também foi possível saber quanto tempo é preciso despender

no primeiro tratamento efetuado, sendo este, o forno, e a partir de que altura era possível seguir para

o próximo processo.

Em relação aos ensaios mecânicos, mais concretamente ao ensaio de tração, os resultados

sugerem que os valores do Módulo de Young obtidos, se encontram em concordância com os dados

46

fornecidos pela empresa para o material em questão, ou seja, o Crystal. Cálculos foram efetuados

também, de forma a compreender qual dos métodos de medida, vídeo-extensómetro ou braço

mecânico, seria o mais preciso. E como é possível verificar pelos dados obtidos, o vídeo-extensómetro

é sem dúvida o mais eficiente.

47

Capítulo V

5. Conclusões

A presente dissertação tinha como objetivo, por um lado, compreender se o tratamento de

limpeza utilizado nos scaffolds, após saírem do forno seria eficaz e posteriormente otimizar o processo.

Este objetivo foi cumprido. Pesou-se as amostras após cada tratamento e foi possível quantificar o

número de horas de permanência no forno necessárias aos scaffolds, de forma a perderem o material

de suporte que se encontra na sua estrutura. Foi também possível concluir que o método mais eficaz

de remoção de cera (após os scaffolds saírem do forno) são os banhos de isopropanol. Com isto, foi

possível também, conferir que o tempo/número de banhos de isopropanol indicado pelo fabricante do

material se encontra correto. No entanto, os dados sugerem que seria interessante estudar a

permanência dos scaffolds em isopropanol, uma vez que este processo se tornaria muito mais rápido.

Por outro lado, esta dissertação tinha também como objetivo verificar se o Módulo de Young

era afetado após utilização do método Micro CT. Este objetivo também foi cumprido e os dados

sugerem que o Micro CT não afeta as propriedades mecânicas dos materiais, visto que o Módulo de

Young equivalente medido experimentalmente é concordante, quer nos scaffolds que sofreram Micro

CT, quer nos scaffolds que não sofreram.

Por fim, com a realização dos ensaios de compressão foi possível verificar qual das diferentes

estruturas dos scaffolds, possui um menor/maior módulo de Young e por consequência qual deles

apresenta um menor comportamento elástico/ maior comportamento elástico, vez que os ossos,

encontram-se muitas vezes sujeitos a tensões de compressão. Desta forma foi possível perceber que

a estrutura TPMS P50 seria a mais adequada para substituir um osso que se seja muito submetido a

forças de compressão, uma que que este scaffold é o que apresenta um maior Módulo de Young.

48

5.1. Perspetivas de trabalhos futuros

• Estudo da biocompatibilidade e citoxicidade do material;

• Reduzir o tempo de permanência dos scaffolds no forno e aumentar o número de banhos em

isopropanol;

• Estudar o efeito de uma maior permanência dos scaffolds no isopropanol, no processo de

limpeza dos scaffolds, a nível estrutural;

• Realização dos ensaios de tração nos scaffolds;

• Realizar ensaios de permeabilidade nas diversas estruturas sugeridas;

• Testar estas estruturas in vivo.

49

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