. .... B I B LI O T E C A Faculdade de Ciências Farmacêuticas

Universidade de São Paulo

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

Programa de Pós-Graduação em Análises Clínicas Área de Análises Clínicas

Caracterização das funções dos linfócitos T CD4+ e T coa+ na cromoblastomicose experimental

Maria da Glória Teixeira de Sousa

Dissertação para obtenção do grau de MESTRE

Orientador: Prof. Dr. Sandro Rogério de Almeida

São Paulo 2005

J~.1.JJ

DEDALUS - Acervo - CQ

1111111111111111I IIII IIIII IIIII IIIII IIIII IIIII IIIII IIIII 11111111

30100011342

Ficha Catalográfica Elaborada pela Divisão de Biblioteca e

Documentação do Conjunto das Químicas da USP.

Sousa, Maria da Glória Teixeira de S725c Caracterização das funções dos linfócitos T CD4+ e T CDS+

na cromoblastomicose experimental / Maria da Glória Teixeira de Sousa. -- São Paulo, 2005. -~

,., --

Dissertação (mestrado) - Faculdade de Ciências Farmacêuticas da Universidade de São Paulo. Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas.

Orientador: Almeida, Sandro Rogério de

1. Cromoblastomicose : Medicina I. T. II. Almeida, Sandro Rogério de, orientador.

616.969 CDD

Maria da Glória Teixeira de Sousa

Caracterização das funções dos linfócitos T CD4+ e T CD8+ na cromoblastomicose experimental

Comissão Julgadora da

Dissertação para obtenção do grau de Mestre

Profa. Ora. Sandro Rogério de Almeida orientador/presidente

-?!21r _t),K'~ ç:fR/4$ flç~~Er-5d'/// 7/f'/?é7Rt:M1-2º. examinador

São Paulo, ,/y' de ~{l~

Este trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Micologia da Faculdade de Ciências Farmacêuticas da Universidade de São Paulo no Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas com o auxilio financeiro do Conselho Nacional

de Desenvolvimento Científico e Tecnológico.

A minha mãe, Maria Gomes de Sousa Corrêa, exemplo de vida. Para ela com amor, admiração e gratidão pelo carinho, paciência e incansável apoio

ao longo do período de realização deste trabalho.

' A doce lembrança de papai, Severo José Correa Neto.

Agradeço, com todo meu amor, a Francisco Erivaldo Vidal Barros, presente em grandes momentos da minha vida, que me apoiou e me deu todo o seu

amor e carinho ao longo desta minha jornada.

A minha irmã Nádia pacheco e ao meu cunhado Luís Antônio Pacheco pela amizade, apoio, solidariedade e gentileza, essenciais na minha vinda e

estada em São Paulo.

Ao orientador Profº Dr. Sandro Rogério de Almeida, por sua disponibilidade imensurável, amizade, ensinamentos e confiança, deixando­

me à vontade no Laboratório, certo do meu desejo em aprender.

A Deus por sua infinita bondade e misericórdia.

A minha famíl ia, o motivo pelo qual cheguei até aqui.

Aos meus irmãos Tereza, Nádia, Nilza, Neuraci, Silvan, Sérgio, Severo Filho e Flávio, pelo amor, carinho e incentivo que sempre me deram.

A minha irmã Nilza que foi muito importante na minha escolha profissional.

A minha irmã Tereza pelo seu amor e uma amiga que sei que posso sempre contar.

Ao meu sobrinho Gú por permitir que eu sempre aprenda mais com as nossas "brincadeiras".

A minha amiga Fabiana Érica Vilanova da Silva pela amizade, compreensão, carinho e pelo ombro amigo que muitas vezes me consolou e ajudou na superação de momentos difíceis.

À Josilene Mariz e Saulo Mariz, casal admirável , pelo apoio, carinho, amizade e pelos momentos descontraídos que compartilhamos durante essa jornada em São Paulo.

À Cláudia Maria de Castro Gomes que foi uma das primeiras pessoas que tive contato ao chegar em São Paulo e não mediu esforços para me ajudar. Muito obrigada pela a sua acolhida e seu espírito cooperativo e solidário!!!

Obrigada a todos do Laboratório de Investigação Médica (LIM-50) da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo, em especial a Prof' Ora.Márcia Dalastra, Prof. Dr.Carlos Corbett, Lia Negrão, Thaíse Tomokane.

Obrigada a Thaíse Tomokane pela amizade e pelos momentos descontraídos quando passei pelo LIM-50.

Aos meus amigos da Universidade Federal do Maranhão (UFMA) Carlos Augusto, Cybelle Lindoso e Fabiana Vilanova pelo incentivo e momentos felizes que compartilhamos juntos.

À Andréa Arruda, sempre disposta a colaborar.

Ao Eliver Eid Bou Ghosn, pessoa que me acolheu em momentos difíceis e sempre tinha uma palavra ou um gesto amigo. Com ele aprendi a fazer ciência de uma forma "apaixonante", ao longo desses dois anos me deu conhecimento e me ensinou a vê a Imunologia como uma ciência fascinante. É sempre um imenso prazer prazer rir, trabalhar e aprender contigo.

À Karen Spadari Ferreira pela alegria e ajuda no início da realização desse trabalho.

À Márcia Hayakawa pelos momentos divertidos durante todo este período.

Á Marina Reis de Moura Campos pela sua alegria contagiante.

Á Rosana Cícera do Nascimento pelo apoio e palavra amiga nos momento finais desse trabalho.

À Sônia Regina Caramico Burrato pela simpatia e auxílio técnico na realização desse trabalho.

Á Tânia Sueli de Andrade pelos ensinamentos essenciais na micologia.

À Viviane Gimenes pela sua disponibilidade em sempre me ajudar.

À Alziana Moreno pelos momentos agradáveis quando dividimos o nosso ex­"muquifinho".

À Profª Ora. Irene Soares pela amizade e incentivo

Ao Valdir Azevedo dos Santos e Família, pela amizade, ensinamentos, e por nunca hesitar em me ajudar.

À Dorlei pelo carinho e famoso cafezinho.

À Daniela Matto Gosso pela sua disponibilidade em sempre ajudar.

Aos professores Carlos Taborda e Lígia Gomes pelas valiosas sugestões no exame de qualificação.

A professora Vera Calich pelos camundongos CS?BL/6 nocautes para CD4 ou coa.

Aos funcionários da secretaria de pós-graduação pela dedicação e respeito.

À Universidade de São Paulo, especialmente à Faculdade de Ciências Farmacêuticas e ao Departamento de Análises Clínicas e toxicológicas por contribuir com a formação de novo pesquisadores.

A todos muito obrigada!

ÍNDICE

ÍNDICE ..................................................................................................................... . i

LISTA DE ABREVIATURAS ................................................................................... iii

RESUMO .................................................................................................................. V

I. INTRODUÇÃO ..................................................................................................... 3

1. Revisão da literatura ...................................................................................... 5 1.1 Histórico ............................................................................... ........................ 5 1.2 Epidemiologia e Manifestações Clínicas .................................... ................. 6 1.3 Diagnóstico e Tratamento ............................................................................ 8 1.4 lmunopatogenia ......................................................................................... 1 O

li. OBJETIVOS ...................................................................................................... 13

Ili. MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................. 14

1. Fungo ............................................................................................................. 14

2. Caldo Batata .................................................................................................. 14

3. Obtenção dos conídios ................................................................................ 14

4. Preparo dos Antígenos Fúngicos ............................................................... 15 4.1 Exoantígeno (Exo) ..................................................................... ........... ..... 15 4.2 Fungo morto por calor (F.M.C.) ................................................................. 15 4.3 Antígeno Total (A.T.) ................................................................................. 15 4.4 Dosagem de proteínas ............................................................................... 16 4.5 SOS - PAGE das proteínas liberadas pela F. pedrosoi ............................. 16

5 Infecção experimental com F. pedrosoi ....................................................... 16 5.1 Infecção intraperitoneal. ............................................................................. 16 5.2 Infecção subcutânea (s.c.) ......................................................................... 18 5.2.1 Subtipagem de linfócitos T. ..................................................................... 19 5.2.2 Ensaio de proliferação celular. ................. .... ......... .................. ................ 20 5.2.3 Determinação das citocinas: ELISA para quantificação de IL- 4, IL- 1 O e IFN-y . ....... ........................................................................................................ 21

IV. RESULTADOS ................................................................................................. 24

2. Infecção experimental pela via s.c . ............................................................. 25 2.1 Cinética da evolução da doença pela via s.c .... .............. ........................... 25 2.3 Subtipagem de linfócitos T nos linfonodos regionais de camundongos BALB/c após a infecção s.c .. ........................................................................... 27 2.4 Ensaio de proliferação celular. ................................................................... 28 2.5 Análise do padrão de citocinas presentes no sobrenadante de cultura de células totais dos linfonodos dos camundongos BALB/c infectados com F. pedrosoi pela via s.c ....................... ................................................................. 29

3. Infecção experimental via i.p . ...................................................................... 30

i

u

3.1 Grau de infecção nos órgãos baço e fígado de animais infectados com conídios de F. pedrosoi .. .. .. .................... .... .................... .... ............................. 30 3.2 Resposta de Hipersensibilidade do Tipo Tardio (HTT) ............ ...... ............ 31 3.3 Grau de infecção nos órgãos baço e fígado dos animais C57BU6 "WT", C57BL/6 CD4 "KO" e C57BL/6 "KO" .. .............. ......... .......... ...... ............ ...... .... . 32 3.4 Resposta de HTT em camundongos C57BU6 WT, C57BL/6 T CD4 "KO" ou C57BL/6 T CDS "KO" ....................................................................................... 34

V. DISCUSSÃO ..................................................................................................... 37

VII. REFERÊNCIAS ............................................................................................... 47

0f.CE"4 nº 1512004

UNIVt::.t<.~IUAUt::. Ut::. ~AU t'AULU Faculdade de Ciências Farmacêuticas

Comissão de Ética em Experimentação Animal

CERTIFICADO

Certificamos que o Projeto "Estudo da resposta imune celular na

cromoblastomicose experimental" (Protocolo nº37), sob a

responsabilidade do(a) Sr(a). Maria da Glória Teixeira de Sousa e

do orientador(a) Sandro Rogério de Almeida, está de acordo com os

Princípios Éticos na Experimentação Animal adotado pelo Colégio

Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA) e foi aprovado pela

Comissão de Ética em Experimentação Animal (CEEA) desta

Faculdade, em 05/04/2004.

São Paulo, 06 de abril de 2004.

Prof Assoe. Elfriede Marianne Bacchi Coordenadora da CEEA

Av. Prof. Lineu Prestes, 580 - Bloco 13 A - Cidade Universitária - CEP 05508-900 - São Paulo - SP Fone: (11) 309136TT J Fax: (11) 3031-8986 - e-mail: rtrigo@usp.br

LISTA DE ABREVIATURAS

BALB/c - Camundongo selvagem (controle) da linhagem BALB

C57BU6 - Camundongo selvagem da linhagem C57BL

BSA - "Sovine Serum Albumine"

ºC - Graus Celsius

C02 - Dióxido de carbono (gás carbônico)

CD - "Cluster of Differentiation"

DO - Densidade Óptica

ELISA- "Enzyme-Linked lmmunosorbent Assay"

H2S04 - Ácido sulfúrico

IFN-y - lnterferon-gamma

IL - lnterleucina

i.p. - lntraperitoneal

lg - lmunoglobulina

"KO" - Knockout

ml - mililitro

mg - miligrama

nm -nanograma

PBS - "Phosphate Buffered Saline"

pg - picograma

rpm - Rotações por minuto

RPMI - Meio de cultura "Roswell Park Memorial lnstitute - 1640"

s.c. - subcutânea

Th1 - T "helper" 1

Th2- T "helper" 2

TNF-a. - "Tumor Necrose Factor- alfa"

TCD4+ - Linfócito T "helper" (CD4+)

Tcoa+ - Linfócito T "helper" (CD8+)

µL - microlitro

"WT" - wild type

ii

RESUMO

A cromoblastomicose é uma infecção fúngica subcutânea causada por

fungos da família Dematiceae sendo o principal agente etiológico o fungo

Fonsecaea pedrosoi (F. pedroso!). Estes fungos induzem uma lesão crônica na

pele de freqüente recidivas. O objetivo do trabalho foi avaliar alguns aspectos

imunológicos na cromoblastomicose experimental através de dois modelos de

infecção pelas vias: intraperitoneal (i.p.) e subcutânea (s.c.). No primeiro modelo

de infecção pela via s.c. em camundongos BALB/c infectados com 106 conídios

de F. pedrosoi, ocorreu a cura espontânea da infecção em aproximadamente 4

semanas. Na subtipagem de linfócitos T em linfonodos regionais ocorreu um

predomínio de células T co4+ que foi constante até a 4ª semana de infecção, no

entanto, observamos aumento significativo de linfócitos T coa+ ao longo da

infecção sugerindo que essa população tenha também uma importante

participação no controle da doença. Os ensaios de linfoproliferação

demonstraram, na 1 ª semana de infecção, elevado índice de proliferação celular

quando as células de linfonodos foram estimuladas in vitro com antígenos de F.

pedrosoi, além da liberação principalmente da citocina IFN-y, já na 4ª semana de

infecção não foi detectado proliferação celular. Esses resultados sugerem que

no início da infecção a resposta celular seja mediada principalmente por

linfócitos T CD4+ produtores de IFN-y, o que nos sugere, que neste modelo

experimental, polarize uma resposta de células T do tipo Th1.

No segundo modelo de infecção, via intraperitoneal (i.p.), camundongos

BALB/c infectados com 106 conídios de F. pedrosoi mostraram desenvolvimento

de infecção crônica com preservação da imunidade celular mesmo após a 8ª

semana. Ainda pela via i.p., os camundongos C57BU6 nocautes de T CD4+

apresentaram uma maior carga fúngica no início da infecção e em tempos mais

tardios a carga fúngica foi semelhante aos camundongos controles (C57BU6);

esses mesmos animais nocautes não apresentaram uma ativação da resposta

celular medida pelo teste de HTT (Hipersensibilidade do Tipo Tardio). Quando

avaliamos o padrão de citocinas, a citocina IFN-y produzida pelos órgãos baço e

iii

fígado apresentou menores níveis no início da infecção quando comparado ao

camundongos controle. Já os níveis de IL-10 aumentaram gradativamente ao

longo da infecção e IL-4 não apresentou diferenças em relação ao controle. Nos

camundongos nocautes para CDS (C578L/6 CD8 "KO"), a carga fúngica, os

níveis de citocinas e o teste de HTT foram semelhantes aos animais controle.

Esses resultados mostraram que pela via i.p. os linfócitos T, principalmente

células T CD4+ são importantes no controle inicial da infecção. Em tempos mais

tardios a infecção foi controlada mesmo em camundongos deficientes de

linfócitos TCD 4+ ou T coa+, sugerido que outras células como macrófagos ou

NK, estariam atuando de forma mais efetiva no controle da infecção.

1. INTRODUÇÃO

Nas últimas décadas, os principais avanços observados na micologia

médica foram motivados pelo impacto das infecções fúngicas oportunistas que

causam alto índice de morbidade e mortalidade. Entretanto, esse progresso não

se refletiu na mesma proporção em infecções fúngicas de caráter endêmico como

cromoblastomicose, esporotricose, micetomas, lobomicose, rinosporidiose e

entomoftoromicose, classificadas como micoses subcutâneas. Essas micoses,

prevalentes em populações rurais das zonas tropicais e subtropicais dos países

em desenvolvimento, têm seu tratamento dificultado pela co-existência de

problemas sócio-econômicos, ausência de diagnóstico precoce, além do

desconhecimento da relação parasito -hospedeiro.

Dentre as doenças infecciosas que foram citadas acima, a

cromoblastomicose destaca-se por sua morbidade. Embora possua evolução

clínica lenta e pouco comprometimento do estado geral do paciente, a doença ao

longo dos anos pode causar mutilações de importância estética e funcional, já que

se trata de uma micose refratária aos mais variados tratamentos, levando em

alguns casos à incapacitação para atividades laborativas. A cromoblastomicose é

uma micose de tecidos cutâneos e subcutâneos adquirida por via traumática,

através da penetração do agente etiológico pela solução de continuidade da pele.

As espécies de fungos causadoras dessa micose pertencem à família

Dematiceae que compreende um grande número de espécies, agrupadas por

apresentarem pigmentos em sua parede celular, conferindo-lhes uma coloração

variável desde marrom claro até o negro47. O pigmento, na maioria das vezes, é

composto de melanina (dihidroxinaftaleno - melanina), antioxidante natural que

oferece maior resistência ao fungo frente à lise fagocitária73.

São cinco os agentes mais freqüentes da cromoblastomicose: Fonsecaea

pedrosoi, Fonsecaea compacta, Cladophialophora (Cladosporium) caríonii,

Rhinocladiella aquaspersa e Phialophora verrucosa. Todos são dimórficos, pois se

apresentam sob a forma micelial em vida saprobiótica e como elementos

muriformes, em vida parasitária47.

1

Um dos últimos relatos sobre a epidemiologia da cromoblastomicose no

Brasil, a cidade de Monte Negro, no estado de Rondônia, foi notificada como

principal foco endêmico dessa doença. Nessa cidade foi descrita uma taxa anual

de 1,6 casos por 1 O mil habitantes, a maior do mundo, sugerindo que a

cromoblastomicose deve ser de grande prevalência também nos municípios

vizinhos 63.

O diagnóstico é realizado através do exame direto, cultura e

histopatológico, mediante a presença de células fúngicas globosas, de parede

espessa e de coloração castanha, denominadas de células muriformes. No

histopatológico, observa-se hiperceratose, hiperplasia da epiderme, geralmente do

tipo pseudoepiteliomatosa e dermatite granulomatosa supurativa. Na

cromoblastomicose, o desenvolvimento de reação inflamatória crônica

granulomatosa ocorre concomitantemente com extensa e progressiva fibrose

dérmica. Ambos os fatores estão associados a estímulo antigênico persistente e,

juntamente com a hiperplasia pseudoepiteliomatosa, que conferem o aspecto

verrucoso às lesões51· 52

.

Apesar de a cromoblastomicose ser uma micose endêmica em nosso país,

com alta morbidade e refratária aos mais variados tratamentos, até hoje pouco se

conhece sobre a relação parasito - hospedeiro. Sendo assim, propomos avaliar

alguns aspectos da resposta imune adaptativa na cromoblastomicose

experimental, visando a contribuir para o esclarecimento dos mecanismos

imunológicos envolvidos na progressão e cura dessa patologia.

2

1. Revisão da literatura

1.1 Histórico

Em 1914, o alemão Max Rudolph, radicado em Minas Gerais, publicou os

primeiros seis casos de cromoblastomicose em pacientes de Minas Gerais e

Goiás. Além de descrever a doença, então popularmente denominada de figueira,

obteve o isolamento de um fungo de hifas negras em cultivo de material de lesões

de quatro pacientes. Entretanto, Rudolph não mencionou em seu trabalho o

aspecto dos parasitos nas lesões cutânaes22. No ano seguinte, Lane e Mediar, em

publicações separadas em 1915, descreveram o primeiro caso da

cromoblastomicose na América do Norte, cuja etiologia foi atribuída à espécie

Phialophora venucosa48• 53

. No entanto, dois pesquisadores, Pedroso e Gomes em

1911 , já haviam estudado quatro casos de dermatite verrucosa também causadas

por Phialophora verrucosa, mas, acontecimentos ligados à Primeira Guerra

Mundial retardaram a publicação que só aconteceu no ano de 1920.

Desde a descoberta da cromoblastomicose, várias terminologias foram

utilizadas para definir a doença e seus agentes, entre elas podemos citar: figueira,

formigueiro, dermatite verrucosa cromomicótica, verruga blastomicótica, doença

de Pedroso, doença de Fonseca, doença de Gomes, doença de Carrion, dentre

outras47•

2. O termo cromoblastomicose foi proposto por Terra et ai., em 1922. Em

1935, Moore e Almeida propuseram o termo cromomicose, muito utilizado nas

décadas de 60 e 70, porém, essa nova denominação mostrou-se inadequada ao

longo do tempo por ser empregada para definir outras infecções fúngicas também

causadas por fungos demáceos, mas não relacionados à cromoblastomicose. Em

1974, Ajello et ai., criaram o termo feohifomicose para designar infecções

causadas por fungos demáceos, que diferem da cromoblastomicose em aspectos

clínicos, patológicos e micológicos. Atualmente, cromoblastomicose é a

terminologia indicada pela "lnternational Society of Human and Animal Mycology"

(ISHAM)6º.

3

1.2 Epidemiologia e Manifestações Clínicas

A cromoblastomicose ocorre em todos os continentes, porém, com maior

incidência nas regiões tropicais e subtropicais. Os agentes etiológicos são ubíquos

na natureza, integrando a microbiota do solo, da água e da matéria orgânica em

decomposição. Tais agentes vivem saprofiticamente na matéria orgânica, sem

exigências pedológicas específicas, do tipo, composição orgânica ou pH47.

Sabe-se que esses fungos não têm habitat específico, encontram-se

dispersos na natureza. Algumas espécies como P. verrucosa e F. pedrosoi já

foram isoladas de polpa de madeira, restos de plantas, cascas de árvores e

espinhos de plantas66·

72. A maioria dos casos relatados de cromoblastomicose

tem como agente etiológico a Fonsecaea pedrosoi e ocorre principalmente em

habitantes de regiões tropicais e subtropicais, seguido por Cladophialophora

(Cladosporium) carionii que prevalece em regiões de clima árido ou semi-árido de

Madagascar31, Austrália 4, Venezuela 13

, Equador e Peru6. Outras espécies, em

alguns casos, podem causar cromoblastomicose: Wangliella (Exopphiala)

dermatitides, Exophiala spinifera, Exophiala jeanselmei e Exophiala castelanii47.

A doença atinge todas as idades, porém, acomete mais homens de 30 a 50

anos, envolvidos em atividades rurais que mantêm contato direto com o solo e a

vegetação. Alguns autores acreditam que fatores hormonais possam conferir

proteção imunológica à mulher contra à infecção, mas até o momento nenhuma

pesquisa confirma tal fato22• 52

• 76

• 78

.

No Brasil, a cromoblastomicose já foi descrita em quase todos os Estados

sendo os principais focos na Região Amazônica, São Paulo, Rio de Janeiro, Minas

Gerais e Rio Grande do Sul41• 47

• 50

• 79

.

Embora a doença seja causada por várias espécies de fungos demáceos,

as manifestações clínicas são semelhantes. A localização das lesões se dá

principalmente na região podal, pernas, nádegas e com menos freqüência nas

mãos e braços. No entanto, já foram observados casos de infecção na região

auricular, nasal e em outras partes do corpo11• 83

• 89

.

4

Inicialmente, observa-se no local da penetração do inóculo a presença de

lesão papular de superfície lisa e eritematosa, que gradualmente aumenta em

tamanho, apresentando superfície descamativa. A lesão inicial pode ser única ou

múltipla e, evolutivamente, tende a se transformar em nódulos superficiais que,

por sua vez, podem expandir-se lateralmente, formando extensas placas. Nódulos

e placas podem coalescer, originando lesão tumoral ou papilomatosa, de aspecto

semelhante à couve-flor22• 47

• 83

. Freqüentemente, essas lesões estão associadas a

infecções bacterianas secundárias2· 67

.

Segundo Carrion (1950), as lesões iniciais de cromoblastomicose podem

evoluir para três tipos distintos de lesão clínica: nodular ou tumoral, em placa e

verruciforme. Boop (1959) classifica as manifestações cutâneas da doença em

duas formas: em placa e nodular (ou tumoral) acrescentando vários subtipos à

forma em placa (tuberculóide, maduromicosiforme, psoriasiforme) e o subtipo

sarcoídico a de forma nodular. Lavalle, 1975 sugeriu uma classificação

semelhante a de Boop (1959), reconhecendo apenas dois grupos de lesões: as

variedades em placa e nodular ou tumoral.

É importante salientar que, freqüentemente, mais de um tipo clínico de

lesão pode ser observado concomitantemente em um mesmo paciente e que a

presença de fatores complicadores, como edema ou infecção secundária, pode

modificar a manifestação clínica primária23.

Em sua fase inicial, a lesão de cromoblastomicose é oligossintomática,

não interferindo com o estado geral do paciente e, via de regra, não exige a

procura de assistência médica. Na fase de cronicidade, os sintomas são: pruridos

localizados que podem ser discreto ou intenso e em alguns casos, dor local,

principalmente, quando associados à infecção bacteriana secundária. Em lesões

extensas e de longa duração há fibrose do tecido celular subcutâneo,

determinando bloqueio dos vasos linfáticos regionais e linfandema crônico com

aspecto elefantiásico do membro acometido, que pode gerar incapacidade

permanente ao trabalho físico22• 77

• 83

.

5

As complicações mais freqüentes são as infecções secundárias e

linfadema, não sendo raros os casos que evoluem para amputação do membro

afetado. Já foram relatados na literatura casos de malignização das lesões

crônicas, com desenvolvimento de carcinoma espinocelular18·

35.

Clinicamente, algumas formas de cromoblastomicose podem ser

confundidas com várias doenças como blastomicose, sífilis terciária, micetoma,

leishmaniose e esporotricose. Entretanto, a demonstração do fungo no exame

direto e em cultura define o diagnóstico47· 52

.

O principal meio de disseminação dos agentes da cromoblastomicose no

organismo é o acometimento de áreas cutâneas adjacentes, por contigüidade.

Também pode ocorrer auto inoculação. Em menor freqüência ocorre disseminção

por via linfática e, raramente por via hematogênica, dando origem a novas lesões

em áreas cutâneas distantes do foco inicial 8· 81

.

1.3 Diagnóstico e Tratamento

O diagnóstico pode ser feito pelo exame direto com material retirado das

lesões, principalmente dos pontos negros e clarificado com KOH 10% onde se

observam células ou corpos muriformes que são patognomônicos da

cromoblastomicose. Essas células parasitárias são arredondadas ou elípticas,

medindo de 4µm a 12µm de diâmetro, de coloração marrom, membrana bem

nítida e de duplo contorno, reproduzindo-se por cissiparidade, outras vezes

observa-se nítida filamentação no material colhido das lesões47.

O diagnóstico micológico completa-se pelo isolamento do fungo em meio de

cultura ágar-Sabouraud, mantido em temperatura ambiente. As colônias suspeitas

aparecem depois de 7 a 15 dias de cultivo sob a forma de pequenos pontos

negros47. As colônias são escuras, aveludadas, com centros elevados, porém,

apenas a análise macroscópica não identifica a espécie, já que os agentes da

cromoblastomicose desenvolvem colônias semelhantes. A identificação do gênero

e espécie é feita principalmente pelos aspectos micromorfológicos do conidióforo e

conidiogênese. São descritos três tipos de conidióforo considerados clássicos da

6

cromoblastomicose: tipo Phialophora, tipo Cladophialophora (cladosporium) e tipo

Rhinocladiella. O predomínio da morfologia identifica a espécie isolada. A espécie

mais isolada no Brasil é a F. pedrosoi que é um fungo pleomórfico, isto é, pode

apresentar mais de um tipo de conidióforo47• 52

.

Recomenda-se o exame histopatológico para elucidar casos de resultados

falso-negativos. Nos tecidos parasitados observa-se que os agentes da

cromoblastomicose provocam resposta inflamatória de padrão misto, de natureza

supurativa e granulomatosa71. Na epiderme, as principais características

histológicas observadas são hiperplasias pseudo-epiteliomatosas ou acantose,

podendo às vezes, ocorrer hiperceratose ou abscessos. Na derme, o infiltrado

inflamatório contém nódulos granulomatosos confluentes, compostos por células

epitelióides, células gigantes de Langerhans ou de corpo estranho. Os granulomas

por vezes podem conter microabscessos com neutrófilos e restos celulares. Os

elementos muriformes e outras formas parasitárias podem ser encontrados no

interior das células gigantes24·

65· 85

· 88

.

Os testes imunológicos não são empregados rotineiramente como método

diagnóstico ou acompanhamento terapêutico dos pacientes com

cromoblastomicose, pois a detecção do fungo por exame micológico direto,

histopatalógico e isolamento em cultivo são mais vantajosos47.

A cromoblastomicose sempre constituiu desafio terapêutico a ser

enfrentado pela equipe de profissionais da saúde e pelos pacientes. Diversos

métodos e substâncias foram tentados, mas os resultados, aparentemente

promissores, raras vezes apresentavam consistência suficiente para justificar sua

utilização em larga escala ou serem considerados como método de eleição para o

tratamento da cromoblastomicose83·

22. Segundo Castro (1992) a existência de

tantas modalidades terapêuticas é a maior prova que nenhuma apresenta eficácia

satisfatória suficiente para que seja considerada como método de escolha.

As modalidades de tratamento conhecidas podem ser divididas em três

grupos: cirúrgicas, quimioterápicas e físicas. Tendo em vista a resistência da

doença aos mais variados tipos de tratamento, os médicos associam dois ou mais

7

métodos, de modo alternado ou simultâneo. Nos primeiros estágios da doença,

alguns autores indicam a excisão cirúrgica, eletrodissecação, uso da criocirurgia47•

22. Em estágios mais avançados, a conduta preferencial é a administração de

medicamentos isolados ou associados83. Vários medicamentos já foram utilizados

no tratamento da cromoblastomicose, sendo o itraconazol e a terbinafina os

medicamentos mais utilizados isoladamente ou em associação.

1.4 lmunopatogenia

O mecanismo de defesa do hospedeiro nas lesões fúngicas ainda é pouco

conhecido. Na maioria das vezes, os fungos são saprófitas e o parasitismo é uma

ocorrência acidental. De maneira geral, nosso sistema imunológico é capaz de

eliminar ou pelo menos de controlar a maioria das infecções fúngicas.

Os mecanismos imunológicos envolvidos na prevenção e controle da

infecção por F. pedrosoí ainda são desconhecidos. Sabe-se que a espécie F.

pedrosoí é capaz de ativar o sistema complemento podendo mediar à

quimiotaxia86. Alguns estudos têm focado na interação parasito-hospedeiro,

mostrando predominantemente a resposta imune celular, com ativação de

macrófagos envolvendo a fagocitose, entretanto, raramente observa-se a morte

das células fúngicas46. Rozental et ai., (1994) demonstraram que F. pedrosoí foi

capaz de sobreviver e proliferar em macrófagos peritoneais murinos e quando

ativados, essas células possuem ação fungistática e não fungicida. Entretanto, os

mesmos autores em 1996, revelaram que neutrófilos foram capazes de destruir

células fúngicas em períodos inferiores a 20 minutos.

Sabe-se que a imunidade mediada por células pode ser o principal

mecanismo de defesa nas micoses, determinando a evolução da infecção. Na

paracoccidioidomicose, Franco et ai., (1997) observaram que o desenvolvimento

da resposta de hipersensibilidade do tipo tardio, parece ser o mecanismo ideal

para circunscrever e limitar a disseminação fúngica a partir do foco primário.

8

" '

Na cromoblastomicose, sabe-se que os fungos chegam a derme por

solução de continuidade da epiderme, provocando uma reação inflamatória com

acúmulos de fagócitos no local da infecção. Os fungos não destruídos pelos

neutrófilos são fagocitados por macrófagos e por células de Langerhans,

desencadeando uma reação de hipersensibilidade do tipo IV, ou seja, uma reação

do tipo granulomatosa90•

88. O tipo de granuloma formado será responsável pelos

aspectos clínicos da lesão. As lesões atróficas tendem a formar um granuloma do

tipo tuberculóide, compacto, com presença principalmente de macrófagos e

linfócitos. Já as lesões mais severas com aspecto verrucoso desenvolvem um

granuloma frouxo com influxo principalmente de neutrófilos e eosinófilos, de

aspecto supurativo, sugerindo que os fatores determinantes dessa polarização

devem estar relacionados à imunidade inata, na qual têm papel determinante os

fenômenos que estão ocorrendo no microambiente no qual se dá a infecção26. A

resposta inflamatória granulomatosa é uma reação de hipersensibilidade do tipo

tardio. lawtsu et a/.,(1982) avaliaram essa reação em pacientes com

cromoblastomicose e cerca de 80% desses foram positivos para antígeno

específico de F. pedrosoi.

Estudos em humanos demonstraram que os padrões de citocinas

encontrados em pacientes indicam que a forma severa da doença é caracterizada

pela produção de IL-10 e TNF-a, associado a baixos níveis de IFN-y e

proliferação de linfócitos, entretanto, pacientes com a forma leve da doença

apresentaram altos níveis de IFN-y e proliferação de linfócitos e baixos níveis de

IL-10, sugerindo que a atividade anti-inflamatória da IL-10 esteja contribuindo para

a evolução da doença já que essa citocina é capaz de regular negativamente as

atividades dos macrófagos. Esses dados confirmam o melhor quadro clínico dos

pacientes que apresentaram aumento na produção de IFN-y, principal citocina

ativadora de macrófagos39. D'Avila et ai. , (2002) avaliaram a reação imune

mediada por células nas lesões cutâneas de cromoblastomicose em diferentes

formas clínicas e os dados sugeriram que pacientes com placa verrucosa têm uma

resposta imunológica Th2, enquanto os pacientes com placa atrófica eritematosa

possuem resposta Th 1.

9

O fungo F. pedrosoi secreta da parede celular estruturas semelhantes à

melanina, antioxidante natural, que protegem o fungo contra à lise fagocitária.

Ensaios in vitro, demonstraram que são as partículas de melanina liberada pela F.

pedrosoi que protegem o fungo da lise fagocitária33. Entretanto, essa mesma

melanina pode induzir a produção de anticorpos antifúngicos e aumentar a

eficiência da fagocitose, sugerindo que a melanina é uma estrutura

imunologicamente ativa que pode ativar tanto a resposta celular quanto a

humoral3. Outra estrutura da parede celular de F. pedrosoi é a substância

glicosilceramida que inibe o crescimento fúngico e aumenta a ação antifúngica de

macrófagos de camundongos.

Estudos avaliando a resposta imune humoral na cromoblastomicose

durante a terapia com terbinafina, demonstraram que altos níveis de anticorpos

específicos são identificados no soro de pacientes com a forma severa da doença

e que lgG foi o principal responsável pela positividade de anticorpos observados

nestes pacientes32.

Sabe-se que após a implantação do agente fúngico no hospedeiro, a

evolução da infecção depende de fatores inerentes ao parasito, a saber:

virulência, viabilidade, quantidade do inóculo e de fatores relacionados ao

hospedeiro como idade, sexo, ocupação profissional, susceptibilidade genética e

efetividade dos mecanismos de defesa inata e adaptativa. De acordo com os

estudos acima relatados, torna-se evidente a importância da imunidade celular na

defesa do hospedeiro. Todavia, ainda não se sabe quais seriam as populações

celulares responsáveis e quais os mecanismos envolvidos nessa doença, assim

avaliamos alguns aspectos imunológicos na cromobalstomicose experimental na

tentativa de mimetizar a relação homem-fungo.

10

li. OBJETIVOS

Investigar alguns aspectos imunológicos da imunidade adaptativa na

cromoblastomicose experimental. Para isso avaliamos dois modelos de infecção

experimental:

Infecção subcutânea

1- Estabelecimento do modelo de infecção na cromoblastomicose em

camundongos BALB/c;

2-Avaliação da resposta imune mediada por células pela verificação da reação de

hipersensibilidade do tipo tardio (HTT) e linfoproliferação desenvolvidas em

camundongos BALB/c;

3- Subtipagem de linfócitos T em linfonodos regionais de camundongos BALB/c

infectados com F. pedrosoi;

4- Dosagem de citocinas IL-4, IL-10 e IFN-y liberadas na cultura de células totais

dos linfonodos poplíteos e inguinais de camundongos BALB/c.

Infecção intraperitoneal

1- Grau de infecção em camundongos BALB/c, C57BU6 selvagem (C57BU6

"WT"), C57BU6 nocautes para a molécula CD4 (C57BU6 CD4 "KO") ou C57BU6

nocautes para a molécula CD8 (C57BU6 CD8 "KO") após a infecção com conídios

de F. pedroosi;

2- Avaliação da resposta imune mediada por células pela verificação da reação de

hipersensibilidade do tipo tardio (HTT) desenvolvidas em camundongos BALB/c e

C57BU6 "WT", C57BU6 CD4 "KO" ou C57BU6 CD8 "KO";

3- Dosagem de citocinas IL-4, IL-10 e IFN-y contidas no sobrenadante dos órgãos

baço e fígado dos camundongos C57BL/6 "WT", C57BU6 CD4 "KO" ou C57BU6

coa "KO".

11

Ili. MATERIAL E MÉTODOS

1.Fungo

Foi utilizada a cepa do fungo Fonsecaea pedrosoi número 46428 da

American Type Culture Collection - ATCC. A cepa foi inoculada duas vezes em

camundongos BALB/c pela via i.p. para aumentar a sua virulência. O micélio foi

utilizado após 15 dias de crescimento em meio ágar Sabouraud dextrose (Merck -

Alemanha) a 30ºC. Em seguida fragmentos do micélio foram colocados em caldo

batata para liberação dos conídios, sob agitação de 200 rpm a temperatura de

28ºC.

2. Caldo Batata

O meio líquido caldo-Batata foi preparado utilizando 20g de batata, 5g de

glicose (Merck - Alemanha) e 500 ml de água destilada. A batata foi descascada,

cortada em pedaços pequenos e misturada a 50 ml de água. Essa mistura foi

fervida até cozimento total da batata, por aproximadamente 30 minutos. Foram

acrescentados 450ml de água e filtrado em papel de filtro. Em seguida,

acrescentou-se a glicose, o meio foi autoclavado por 15 minutos à 121ºC e

conservado a 4ºC17.

3. Obtenção dos conídios

Por analogia à técnica de microcultivo, que utiliza o ágar Batata, pobre em

nutrientes, para se obter um número maior de conídios do fungo, foi utilizado o

mesmo meio sem o ágar, com a mesma finalidade, obtendo-se desta forma,

grande número de conídios viáveis de F. pedrosoi.

Após crescimento do fungo, a colônia foi raspada com alça de platina em

"L" e colocada em 50ml de caldo-batata em erlenmeyer de 250ml. Este inóculo

foi cultivado sob agitação constante de 200 rpm a 28ºC por 3 dias. Posteriormente,

o meio foi deixado em repouso por aproximadamente 30 minutos para que as hifas

sedimentassem por espontaneidade e o sobrenadante contendo os conídios foram

12

recolhidos com pipeta de bulbo, em seguida centrifugados 2 vezes com PBS

estéril, a 2500 rpm por 5 minutos, para retirar os resíduos do caldo batata. O

número de conídios foi contado em câmara de Neubauer e ajustado de acordo

com cada ensaio.

4. Preparo dos Antígenos Fúngicos

4.1 Exoantígeno (Exo)

O fungo foi cultivado em ágar Sabouraud dextrose (Merck - Alemanha) por

15 dias a 30ºC. Posteriormente, o fungo foi transferido para um balão volumétrico

contendo 250 ml de caldo Sabouraud (Merck- Alemanha) e cultivado por 21 dias,

sob agitação constante, a 200 rpm, a 30ºC em incubadora (C25 INCUBATOR

SHAKER, New Brunswick Scientific, Estados Unidos). Após esse período, as

células foram separadas do fluido por filtração em papel de filtro. O sobrenadante

(exoantígeno) foi concentrado 10 vezes pelo sistema Amicon (MILLIPORE,

Estados Unidos) com membrana de celulose YM10 (MILLIPORE, Estados

Unidos), em seguida filtrado em filtro 0,22µm (CORNING - Alemanha).

4.2 Fungo morto por calor (F.M.C.)

Fragmentos de colônias de F. pedrosoi foram colocados em uma solução

de PBS estéril e levados para agitação no vortex por aproximadamente 5 minutos

para a liberação de conídios, em seguida autoclavado por 20 minutos a 121° C.

4.3 Antígeno Total (A.T.)

Fragmentos de colônias de F. pedrosoi foram colocados em um tubo cônico

(15ml) contendo solução de PBS estéril, em seguida agitados no vortex, por

aproximadamente 5 minutos, essa suspensão foi colocada em recipiente estéril

com nitrogênio líquido e macerada até o completo derretimento do gelo. Após

13

esses procedimentos, essa solução foi centrifugada a 2500 rpm a 5 minutos e o

sobrenadante utilizado com antígeno total.

4.4 Dosagem de proteínas

As dosagens protéicas do Exo, A.T. e F.M.C. foram realizadas segundo

Bradford (1976), utilizando CBB G-250 (Sigma, Alemanha) e como padrão

albumina bovina (Sigma, Alemanha).

4.5 SDS - PAGE das proteínas liberadas pela F. pedrosoi

O gel para eletroforese vertical foi preparado em uma cuba de eletroforese

vertical para mini gel (BIO-RAD Mini PROTEAN® 3 CELL), constando de um gel de

separação linear a 12% de acrilamida e 0.75% de espessura.

Uma alíquota do Exo, A.T. e do F.M.C. de F. pedrosoi contendo 70 µg/ml,

28 µg/ml e 33 µg/ml, respectivamente de proteína foram diluídos em tampão de

amostra. A amostra foi fervida por 5 minutos, em seguida aplicada no gel. Em

cada corrida foi utilizado um padrão de baixo peso molecular (PM), composto de

fosforilase b (97 kDa), albumina bovina (66 kDa), ovoalbumina (45 kDa), anidrase

carbônica (30 kDa), inibidor de tripsina (20, 1 kDa), a-lactoalbumina (14,4 kDa)

(Amersham Pharmacia, Inglaterra).

Os géis contendo as amostras e o padrão de baixo peso molecular foram

submetidos à corrida eletroforética por 90 minutos a 120v. Após a corrida

eletroforética, o gel foi corado pela prata para a visualização das bandas protéicas.

5 Infecção experimental com F. pedrosoi

5.1 Infecção intraperitoneal

5.1.1 Animais

Camundongos machos da linhagem BALB/c com 6 a 8 semanas de vida

foram obtidos do Biotério do Instituto de Química e da Faculdade de Ciências

Farmacêuticas - Universidade de São Paulo. Os camundongos da linhagem

14

C57BL/6 selvagem (C57BL/6 "WT"), C57BL/6 nocautes de CD4 (C57BL/6 T CD4+

"KO") ou C57BL/6 nocautes de CD8 (C57BL/6 T CD8+ "KO") com 6 a 8 semanas

de vida foram obtidos do Biotério de camundongos isogênicos do Instituto de

Ciências Biomédicas li - Universidade de São Paulo. Todos os animais foram

mantidos em padrão sanitário livre de patógenos específicos (SPF) e alimentados

com ração comercial irradiada. Os camundongos foram sacrificados de acordo

com critérios aprovados pela Comissão de Ética em Experimentação Animal da

Faculdade de Ciências Farmacêuticas - CEENFCF.

5.1.2 Preparação do inóculo

Os conídios liberados no caldo batata, como descrito no item 2 foram

centrifugados 2 vezes com PBS estéril (pH 7,2), a 2500 rpm por 5 minutos. Após a

última lavagem os conídios foram contados e ajustados para 106 conídios por ml.

A contagem do número de células foi realizada utilizando-se câmara de Neubauer

(Optik Labor Eberstadt, Alemanha).

5.1.3 Infecção intraperitoneal (i.p.)

Vinte e quatro camundongos BALB/c, C57BL/6 selvagem, TCD4+ ko ou

TCD8+ ko foram infectados via i.p. com 1 O 6 conídios de F. pedrosoi suspensas em

1 ml de PBS estéril. Após a infecção, os camundongos de ambas as linhagens

foram sacrificados após a 1ª, 2ª, 4ª e 8ª semanas de infecção para a contagem

das unidades formadoras de colônias (UFCs)19.

5.1.4 Unidades Formadoras de Colônias (UFC)

Os órgãos baço e fígado de camundongos BALB/c foram retirados após 1ª,

2ª, 4ª e 8ª semanas de infecção e macerados em 2 ml de PBS estéril. Trezentos

microlitros do macerado foram distribuídos em placas de petri contendo meio ágar

Sabouraud dextrose (Merck - Alemanha). As placas foram incubadas a 30ºC. Os

números de UFCs foram determinados em aproximadamente sete dias após o

15

plaqueamento e os resultados quantificados em unidades formadoras de colônia

por grama de órgão (UFC/g). Esses mesmos procedimentos foram realizados com

os camundongos da linhagem C57BL/6.

5.1.5 Avaliação da resposta de hipersensibilidade do tipo tardio (HTT)

Grupos de animais BALB/c, C57BL/6 "WT", C57BL/6 CD4 "KO" ou

C57BL/6 CDS "KO", infectados pela via i.p foram avaliados quanto à resposta de

hipersensibilidade do tipo tardio específica para o fungo, realizando-se o teste de

coxim plantar de acordo com as condições descritas por FAIZOLI et ai (1994). O

estudo foi realizado após a 1ª, 2ª, 4ª e 8ª semanas de infecção nos camundongos

da linhagem BALB/c e C57BL/6.

Assim, 24 horas antes do teste, as patas esquerda e direita do animal

foram medidas com o auxílio de um paquímetro (Mitutoyo, Japão) e em seguida foi

injetado pela via s.c. no coxim plantar esquerdo 50 µL de Exo na concentração de

70 µg/ml. As medidas do inchaço das patas foram feitas após 24 horas com o

mesmo paquímetro. Controle negativo: 50 µL de PBS estéril no coxim plantar

direito. Os resultados obtidos foram expressos como a diferença, em mm, entre as

medidas feitas imediatamente antes e 24 horas após a inoculação do antígeno.

5.2 Infecção subcutânea (s.c.)

Quinze camundongos BALB/c foram infectados pela via s.c. no coxim

plantar direito com 106 conídios de F. pedrosoi suspensos em 50 µL de PBS

estéril. Foi realizada a cinética de evolução da lesão nesses animais. Como

controle negativo inoculou-se PBS estéril na pata direita. Assim, no tempo O, antes

da inoculação, as patas infectadas e controle foram medidas com auxilio de um

paquímetro (Mitutoyo, Japão). As medidas da lesão foram realizadas até 42 dias

de infecção com o mesmo paquímetro.

16

5.2.1 Subtipagem de linfócitos T

Os linfonodos regionais: inguinais e poplíteos dos camundongos BALB/c

foram retirados após a 1ª, 2ª, 4ª e 8ª semanas de infecção. As condições

adotadas no ensaio foram as seguintes:

a. os linfonodos de cada camundongo, foram macerados manualmente em

placa de petri estéril contendo 5 ml de RPMI 1640 (SIGMA - ALDRICH,

Alemanha) em seguida foram centrifugados a 1500 rpm por 5 minutos;

b. o sobrenadante desprezado e o sedimento celular ressuspendido em 5

ml de tampão hemolítico, seguida de uma nova centrifugação a 1500 rpm por 5

minutos;

c. depois o sobrenadante foi desprezado e o sedimento de células foi

ressuspendido em 5 ml de meio RPMI (RPMI 1640 (SIGMA - ALDRICH,

Alemanha);

d. as células foram contadas em câmaras de Neubauer (Optik Labor

Eberstadt, Alemanha), com corante azul de trypan para verificação da viabilidade

celular e as suspensões de células viáveis foram ajustadas a concentração final

de 106 células/ml;

e. Essas células foram duplamente marcadas com anticorpos: anti­

camundongos CD4 (L3T4) marcados com FITC (0,5µg/ml), anti- camundongos

CD8a (Ly-2) (53-6. 7) marcados com FITC (0,5 µg/ml) e anti- camundongo CD3

(cadeia E CD3) marcados com PE (0,2 µg/ml). Todos os anticorpos são da BD

Pharmigen (USA). As células nessa etapa permaneceram no gelo por 40 minutos;

d. Após esse tempo, foram centrifugadas a 1200 rpm por 3 minutos e

ressuspendidas numa solução fixadora.

No dia em que foi realizada a análise por citometria de fluxo, as amostras

foram centrifugadas a 1200 rpm por 3 minutos e ressuspendidas em PBS

acrescido de 2,5% de soro fetal bovino. A leitura foi realizada no equipamento

FacScalibur (Becton & Dickison, CA) do Instituto Butantã calibrado para leitura de

10.000 eventos e os dados foram analisados no programa Cell Quest.

17

5.2.2 Ensaio de proliferação celular

Os animais BALB/c infectados com 106 conídios de F. pedrosoi pela via s.c.,

após a 1ª, 2ª, 4ª e 8ª semanas de infecção tiveram os linfonodos inguinais e

poplíteos retirados para o ensaio de proliferação celular. As condições adotadas

no ensaio foram as seguintes:

a. os linfonodos poplíteos e inguinais dos camundongos BALB/c foram

retirados.

b. os linfonodos de cada camundongo, foram macerados manualmente em

placa de petri estéril contendo 5 ml de RPMI 1640 (SIGMA - ALDRICH,

Alemanha) em seguida foram centrifugados a 1500 rpm por 5 minutos;

c. o sobrenadante desprezado e o sedimento celular ressuspendido em 5

ml de tampão hemolítico, seguida de uma nova centrifugação a 1500 rpm por 5

minutos;

d. depois o sobrenadante foi desprezado e o sedimento de células foi

ressuspendido em 5 ml de meio RPMI (RPMI 1640 (SIGMA - ALDRICH,

Alemanha) suplementado com 2,5% de soro fetal bovino (Cultilab, Brasil);

e. as células foram contadas em câmaras de Neubauer, com corante azul

de trypan para verificação da viabilidade celular e as suspensões de células

viáveis foram ajustadas a concentração final de 2x106 células/ml;

f. 1 00µL dessas suspensões foram depositadas em cada orifício da placa

para cultura celular com 96 orifícios (Corning-COSTAR, Estados Unidos).

Essas suspensões celulares foram reestimuladas com os antígenos Exo,

A.T. e F.M.C. nas concentrações de 70 µg/ml, 28 µg/ml e 33 µg/ml,

respectivamente.

Como controle positivo as células foram estimuladas com o mitógeno Con A

(SIGMA-ALDRICH, Alemanha) na concentração de 2 µg/ml e como controles

negativos células sem nenhum estímulo. As células foram incubadas por 72 horas

em estufa de CO2 a 37°C e nas últimas 16 horas foi acrescentado 1 µCi de

Timidina triciada [metil- 3H] (Amershan Biosciences, Inglaterra) à cultura. Após a

incubação, as células foram coletadas em um coletor automático de células (cell

18

harvester, LKB Wallac 1295-001, Turku, Finlândia) e a radioatividade incorporada

foi medida em contador de emissões í3 (Liquid Scintillation Counter 1205

Betaplate, Wallac, Turku, Finlândia); a proliferação foi determinada pela

incorporação da radioatividade pelas células e os resultados expressos em

cintilações por minutos (cpm).

5.2.3 Determinação das citocinas: ELISA para quantificação de IL-4, IL- 10 e IFN-y.

Um grupo de camundongos BALB/c infectados pela via s.c. foram

sacrificados após a 1ª, 2ª, 4ª e 8ª semanas de infecção, e deles foram retirados os

linfonodos poplíteos e inguinais para a dosagem de citocinas.

As condições adotadas no ensaio foram as seguintes:

a. os linfonodos de cada camundongo, foram macerados manualmente em

placa de petri estéril contendo 5 ml de RPMI 1640 (SIGMA - ALDRICH,

Alemanha);

b. os homogenatos foram centrifugados a 1500 rpm por 5 minutos;

c. o sobrenadante desprezado e o sedimento celular ressuspendido em 5

ml de tampão hemolítico;

d. seguiu-se nova centrifugação a 1500 rpm por 5 minutos;

e. depois o sobrenadante foi desprezado, e o sedimento de células foi

ressuspendido em 5 ml de meio R5% (RPMI 1640 (SIGMA - ALDRICH,

Alemanha) suplementado com 5% de soro fetal bovino (Cultilab, Brasil);

f. as células foram contadas em câmaras de Neubauer, diluídas na

proporção de 1: 1 com corante azul de trypan para verificação da viabilidade

celular;

g. suspensões de células viáveis foram ajustadas a concentração final de

4x106 células/ml;

h. 1 000µL dessas suspensões foram depositadas em cada orifício da placa

para cultura celular com 24 orifícios (Corning-COSTAR, Estados Unidos).

19

Essas suspensões celulares foram reestimuladas com os antígenos Exo,

A.T. e F.M.C. nas concentrações de proteína de 70 µg/ml, 28 µg/ml e 33 µg/ml,

respectivamente; e as células foram incubadas por 48 horas e 72 horas em estufa

de CO2 a 37°C. O teste foi realizado em triplicata. Essas amostras foram

recolhidas e estocadas a -70ºC até o momento da dosagem.

A técnica utilizada foi ELISA de captura, utilizando anticorpos monoclonais,

para detecção das citocinas, nas concentrações recomendadas pelo fabricante

(R&D System, Minneapolis, USA). Para realizar o procedimento, placas de

microtitulação de 96 poços foram sensibilizadas com anticorpo primário diluído em

PBS e mantidas em temperatura ambiente de um dia para o outro. Foi adicionado

às placas, PBS contento 1 % de albumina de soro bovino (BSA) para promover o

bloqueio de sítios livres do plástico e mantido por 1 hora em temperatura

ambiente. As citocinas recombinantes utilizadas para realizar a curva padrão,

foram diluídas em PBS contendo 1 % de BSA e incubadas por 2 horas em

temperatura ambiente. As amostras também foram incubadas em poços por esse

mesmo período. Todos os poços foram lavados com PBS acrescido de tween 20 a

0,05%. Foram adicionados os anticorpos secundários conjugados a biatina,

diluídos em PBS e incubados por 2 horas em temperatura ambiente. Os poços

foram lavados. As placas foram incubadas com conjugado estreptovidina­

peroxidase por 30 minutos em temperatura ambiente e os poços lavados. A

revelação foi realizada com o-fenilenodiamina 1 mg/ml, diluído em tampão citrato

de sódio O, 1 M pH 4,5 por 15 a 30 minutos. Para o bloqueio da reação foi utilizado

ácido sulfúrico (H2 SO4 ) 4N e a leitura das densidades ópticas (DO) foi realizada

em leitor automático, em comprimento de onda de 450 nm. As concentrações de

cada citocina foram calculadas com base na equação da reta de regressão linear,

da curva padrão obtida com citocinas recombinantes murinas.

6. Análise Estatística

Os resultados obtidos foram analisados pelo método One- Way ANOVA, e

múltiplas comparações pelo teste de Tukey, com auxílio do software Graphpad

20

_ _,,A- n 1 s :_ , o -~ ~-e .11.

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u0;vers,dadr. cfe S:io ~- ;H ,I ?

lnstat TM. O nível de significância admitido foi de p<0,05 para todas as

comparações 93.

21

2. Infecção experimental pela via s.c.

2.1 Cinética da evolução da doença pela via s.c

Camundongos foram infectados no coxim plantar direito com 106 conídios

de F. pedrosoi e as patas dos animais foram medidas no tempo O e até 42 dias

após a infecção. Conforme a figura 2, as patas apresentaram aumento até o 9º dia

com picos entre o 7° e 9° dias de infecção. Entretanto, entre o 1 Oº e 18º dia, os

tamanhos das patas mantiveram-se constante. A partir do 20° dia ocorreu uma

diminuição acentuada do tamanho das patas, mostrando que pela via s.c. ocorre

um controle da infecção fúngica.

2.0 ,n

"' -a 1.5

=--e E o E 1.0 .e-e: ~ 0.5 "' -·

O.O 1h 4h 7h 24h 48h 7d ~ 10d 13d 14d 15d 18d 2>d 22d 28d 30d 35d 38d 4<Xf 42d

Tempo (horas e dias)

Figura 2. Cinética da evolução da doença em camundongos infectados pela via subcutânea. Camundongos BALB/c foram infectados no coxim plantar pela via s.c. com 106 conídios de F. pedrosoi, as patas foram medidas no tempo O até 42 dias após a infecção. Controle negativo: PBS estéril inoculado no coxim plantar direito. A diferença entre as patas direita e esquerda de cada animal foi medida em mm. Os resultados representam as médias ± desvio padrão das diferenças entre as patas direita e esquerda. O experimento foi realizado em triplicata.

23

2.2 Resposta de Hipersensibilidade do Tipo Tardio (HTT) na cromoblastomicose experimental pela via s.c.

Avaliamos a resposta de HTT em camundongos BALB/c infectados com 106

conídios de F. pedrosoi pela via s.c. Após a 1ª, 2ª e 4ª semanas de infecção, os

animais foram desafiados no coxim plantar com 70 µg/ml de Exo para estudo da

hipersensibilidade ao antígeno. Vinte e quatro horas antes do sacrifício dos

animais, foi realizado o teste de HTT, no coxim plantar desses camundongos.

Podemos observar na figura 3, que na 2ª semana de infecção os camundongos

apresentaram uma maior positividade ao teste de HTT. Na 4ª semana, os animais

apresentaram uma diminuição da ativação da resposta celular.

tn ca -ca e. tn ca CD E ... E -e: E CD ca CD (,), e: CD ... ~ "C

1.00

0.75

0.50

0.25

0.00 1 2

semanas

4

Figura 3. Hipersensibilidade do tipo tardio (HTT). Os camundongos BALB/c infectados no coxim plantar direito pela via s.c. com 106 conídios de Fonsecaea pedrosoi, foram desafiados no coxim plantar esquerdo com exoantígeno após a 13, 2ª e 4ª semana de infecção. Vinte e quatro horas antes do sacrificio dos camundongos, foi realizado o teste de HTT. As diferenças entre a pata esquerda antes e depois de inocular o antígeno de cada animal foi medida em mm. Os resultados representam as médias ± desvio padrão da diferença entre a pata esquerda. O exoerimento foi realizado em triolicata.

24

2.3 Subtipagem de linfócitos T nos linfonodos regionais decamundongos BALBlc após a infecção s.c.

Para avaliarmos a influência de céiulas TCD4+ e TCD8+ durante a

cromoblastomicose experimental realizamos a quantificação dessas células nos

linfonodos regionais dos animais BALB/c após a 1a, 2a e 4a semanas de infecção

com 106 conídios de F. pedrosoi pela via s.c. A presença de linfócitos T CD4+ ou T

CD8+ foram caracterizadas pela presença de células duplamente marcadas com

anticorpos anti-CD3 (PE) e anti- CD4 (FITC) ou anti-CD3 (PE) e anti- CD8 (FITC),

por citometria de fluxo. Na figura 4, observamos que após a 1a semana de

infecção houve um predomínio de células TCD4+ nos linfonodos regionais que se

mantiveram em níveis elevados pelo menos até a 4a semana de infecção.

Também foi observado que, apesar de em menor número, os linfócitos TCD8+

apresentaram um aumento significativo ao longo da infecção.

40

ti) 30.!!!.3.~ 20

cf!.

10

oo 5 10 15

dias

20 25 30

---TCD4+

-- TCD4+controle-TCD8+

- TCD8+controle

35

Figura 4. Subtipagem de linfócitos T. Análise por citometria de fluxo da porcentagem de célulasTCD4+ e TCD8+ nos linfonodos poplíteos e inguinais de camundongos BALB/c infectados no coximplantar via s.c. com 106 conídios de F. pedrosoi após a 1a, 2a e 4a semanas de infecção. Nos animaiscontroles foram injetados PBS estéril. Os resultados representam as médias ± desvio padrão. Oexperimento foi realizado em triplicata.

25

2.4 Ensaio de proliferação celular

o ensaio de linfoproHferação foi realizado para avaliar a capacidade dos

antígenos de F. pedrosoi (Exo, F.M.C. e AT.) de estimular a proliferação de

células totais dos linfonodos popHteos e inguinais de camundongos BALB/c

infectados com 106 conídios de F. pedrosoi no coxim plantar pela via s.c. Sendo

assim, após a 13, 23 e 43 semanas de infecção avaliamos a capacidade

proliferativa dessas células frente aos diferentes antígenos de F. pedrosoi.

Observamos na figura 5, que após a 13 semana de infecção as células dos

linfonodos regionais foram capazes de proliferar quando estimuladas com os três

preparados antigênicos de F. pedrosoi. Após a 23 semana de infecção essas

células foram capazes de proliferar com o AT., já com o Exo e o F.M.C.

proliferaram, porém em menor intensidade quando comparados com a proliferação

da 13 semana após a infecção. Após a 43 semana de infecção as células dos

Hnfonodos não foram capazes de proliferar quando estimuladas com os três

antígenos.

100000

l~

75000 *

E IIIN*

fr 50000

25000

o III~II~

*

*

I..,2

semana

*..,IL

4

c:::::J EXO

~A.T.

RlDF.M.C._ Controle positivo

c::::::J Controle negativo

Fi§ura 5. Capacidade proliferativa de células totais de linfonodos de animais infectados com10 conídios de F.pedroyoi pela via s.c.. Após alI\., 23 e 41\. semana de· infecção os animais foramsacrificados e as células dos linfonodos poplíteos e inguinais foram estimuladas in vitro com oexonatfgeno (Exo), fungo morto por calor (F.M.C.) e antígeno total (AT.). A proliferação foideterminada pela incorporação de timidina [metil-3H] pelas células e os resultados expressos comomédia ± desvio padrão de cpm (cintilações por minuto). Controle positivo~ células estimuladas com211g/mL de CanA. Controle negativo: células cultivadas sem estímulos. O experimento foi realizadoem triplicata. * Valores significativos comparados com o controle negativo para p<O,05.

26

2.5 Análise do padrão de citocinas presentes no sobrenadante decultura de células totais dos linfonodos dos camundongosBALB/c infectados com F. pedrosoi pela via s.c.

Avaliamos o padrão de citocinas (IL-4, IL-10, e IFN-y) liberados no

sobrenadante de cultura de células totais dos linfonodos inguinais e poplíteos de

camundongos infectados com 106 conídios de F. pedrosoi pela via s.c. Essas

células foram estimuladas in vitro durante 72 horas com os antígenos (Exo, F.M.C.

e AT.), após a 1a , 2a e 4a semanas de infecção. Na figura 6, mostramos que a

citocina WN- y foi produzida em maiores niveis após a 1a semana de infecção e

teve uma diminuição significativa ao longo da infecção. A citocina IL-4 não foi

detectada após a 1a semana de infecção, já na 2a e 4a semana de- infecção foi

detectada, porém em baixas concentrações. Observamos também que a citocina

IL- 10 apresentou os maiores níveis após a 2a semana de infecção e ao fim da 4a

semana de infecção, a concentração dessa citocina estava em níveis basais,

assim como as citocinas ~FN-y e IL-4.

7000

11*

600050004000

-I

.§ 2000C)Co

1000

oIFN-y IL-10 IL-4

18

* *

IFN-yIL-10 IL-4

:zasemana

_Exo

_F.M.C._A.T.

c=:J Controle

IFN-y IL-10 IL-4

48

Figura 6. Dosagem de citocinas do sobrenadante de cultura de células dos Iinfonodos. Oscamundongos foram infectados com 106 conídios de F. pedrosoi pela via s.c. Após a 13

, 23 e 43

semana de infecção os animais foram sacrificados e os linfonodos foram retirados e macerados comRPMI, suas células foram estimuladas com os antígenos (Exo, F.M.C.e A.T.) e mantidas na estufa37° C - 5% de C02 por 72 horas. Como controle foi utilizado células dos linfonodos doscamundongos infectados e cultivadas sem estímulo. As citocinas foram dosadas do sobrenadante. Osresultados representam as médias ± desvio padrão. O experimento foi realizado em triplicata. * Osvalores são significativos comparados com o controle para p<0,05.

27

3. Infecção experimental via i.p.

3.1 Grau de infecção nos órgãos baço e fígado de animais infectados com conídios de F. pedrosoi

Avaliamos a evolução da infecção fúngica nos camundongos BALB/c

através da carga fúngica medida pelas unidades formadoras de colônia (UFC) nos

órgãos baço e fígado. Os animais foram infectados, via i.p. com 106 conídios de

F.pedrosoi. Após a 1ª, 2ª, 4ª e 8ª semanas de infecção, os animais foram

sacrificados e os órgãos foram retirados, macerados e uma pequena alíquota

plaqueada em ágar Sabouraud para observamos a carga fúngica de cada órgão.

Como observado na figura 7, houve um decréscimo na carga fúngica em ambos

os órgãos, ao longo da infecção. Na 1ª semana de infecção, os animais

apresentaram a maior carga fúngica tanto no fígado quanto no baço, entretanto

após a 8ª semana de infecção, essa colonização diminuiu, tanto no baço como no

fígado. Esses resultados demonstraram uma diminuição na quantidade de fungos

nos órgãos no decorrer da infecção. Porém, mesmo após a 8ª semana de infecção

foi possível detectar fungos nos órgãos mostrando uma tendência a cronicidade

da infecção.

-o ... e, .2 -e, e) u. ::J

6

5

4

3

2

1

o Fígado Baço

c=::::J 1ªsemana EEITI ~ semana ~4ªsemana -aasemana

Figura 7. Carga fúngica nos órgãos dos animais infectados com a cepa F. pedrosoi. Camundongos BALB/c foram infectados com 106 conídios de Fonsecaea pedrosoi e após a 1ª, 23, 4ª e 8ª semanas de infecção os órgãos baço e figado foram retirados, macerados e a carga fúngica foi analisada através da contagem das UFCs. Os resultados foram expressos em UFC por grama de órgão (UFC/g). Os resultados representam as médias ± desvio padrão da contagem das UFCs nos tempos de infecção. O experimento foi realizado em triplicata.

28

3.2 Resposta de Hipersensibilidade do Tipo Tardio (HTT)

Avaliamos a resposta de HTT em camundongos BALB/c infectados com 106

conídios de F. pedrosoi pela via i.p. Após a 1ª, 2ª, 4ª e 8ª semanas de infecção, os

animais foram desafiados no coxim plantar com 70µg/ml de Exo para estudo da

hipersensibilidade ao antígeno. Vinte e quatro horas antes do sacrifício dos

animais, foi realizado o teste de HTT, no coxim plantar desses camundongos.

Podemos observar na figura 8, que ao longo da infecção teve um aumento na

positividade do teste de HTT, demonstrando que a imunidade celular estava

preservada, mesmo após a 8ª semana de evolução da doença. Outro resultado

observado foi a possibilidade da utilização do Exo produzido por F. pedrosoi na

avaliação da resposta celular na cromoblastomicose experimental.

i 1.0

!Q 0.8 l

~ E 0 .6

e Q) 0.4 B, ~ 0.2 i "0

O.O 1ª 2ª 4ª 8ª

semanas

Figura 8. Hipersensibilidade do tipo tardio (HTT). Os camundongos BALB/c infectados pela via i.p. com 106 conídios de Fonsecaea pedrosoi foram desafiados no coxim plantar esquerdo com o exoantigeno após a 1 ª, 23, 4ª e 8ª semanas de infecção. Vinte e quatro horas antes do sacrificio dos animais, foi realizado o teste de HIT. Controle negativo: PBS estéril inoculado no coxim plantar direito. A diferença entre as patas direita e esquerda de cada animal foi medida em mm. Os resultados representam as médias ± desvio padrão da diferença entre as patas direita e esquerda de cada animal. O experimento foi realizado em triplicata.

29

3.3 Grau de infecção nos órgãos baço e fígado dos animais C57BU6 "WT", C57BU6 CD4 uKO" e C57BU6 "KO".

Avaliamos a evolução da infecção fúngica nos camundongos C57BU6

"WT", C57BU6 C04 "KO" ou C57BU6 coa "KO" através da carga fúngica medida

pelas unidades formadoras de colônia (UFCs) nos órgãos baço e fígado. Os

animais foram infectados, via Lp. com 106 conídios de F.pedrosoi. Após a 1ª, 2ª, 4ª

e 8ª semana após a infecção, os animais foram sacrificados e os órgãos foram

retirados, macerados e uma pequena alíquota (200µL) plaqueada em ágar

Sabouraud para observamos a carga fúngica de cada órgão.

Como observado na figura 9A e 9B, os camundongos C57BU6 C04 "KO"

apresentaram uma grande quantidade de UFCs no baço e fígado após a 1ª

semana de infecção, sendo que após a 2ª semana de infecção ocorreu uma

diminuição acentuada de carga fúngica nos dois órgãos. Na 4ª e 8ª semana de

infecção, os animais apresentaram uma redução da carga fúngica, sendo que

somente no baço houve diferença em relação ao grupo controle (C57BU6 "WT").

Nos animais C57BU6 coa "KO" apresentaram uma carga fúngica maior na

1ª semana de infecção, nos demais tempos não houve diferença em relação ao

grupo controle. (figura 9A e 98).

3ó

A

-o .... C> ..2 -C> -o LL =>

B

5 * *

4

3

2

1

o 1ª semana

-o

6

5

m4 ..2 C> 3 o LL => 2

*

Fígado

*

2ª semana 4ª semana

Baço

* *

Q..J......L-----L...L..:..;:.J....J!Q!;ll.. _ ____J_____J_...l.:....:...:L..Jl;l!ll!l..._-----1..-----1....t....:...:..L

1ª semana 2ª semana 4ª semana

c=J C57BU6 "WT' ~ C57BU6 CD4 "KO" ~ C57BU6 CD8 "KO"

8ªsemana

c=J C57BU6 "WT' EJ C57BU6 CD4 "KO" ~ C57BU6 coa "KO"

*

8ª semana

Figura 9. Carga fúngica nos órgãos dos animais infectados com a cepa F. pedrosoi. Camundongos C57BL/6 ''WT", C57BL/6 CD4 "KO" e C57BL/6 CDS "KO'' foram infectados com 106 conídios de Fonsecaea pedrosoi e após a 1 a, 2\ 4ª e 8ª semanas de infecção os órgãos baço e fígado foram retirados, macerados e a carga fúngica foi analisada através da contagem das UFCs. Os resultados foram expressos em UFC por grama de órgão (UFC/g). Os resultados representam as médias ± desvio padrão da contagem das UFCs nos tempos de infecção. O experimento foi realizado em triplicata. * Valores significativos comparados com o controle (C57BL/6 "WT") para p<0,05.

31

3.4 Resposta de HTT em camundongos C57BL/6 WT, C57BL/6 T CD4 "KO" ou C57BL/6 T CDS "KO".

Avaliamos a resposta de HTT em camundongos C57BU6 "WT", C57BU6·

CD4 "KO" ou C57BL/6 coa "KO" infectados com 106 conídios de F. pedrosoi pela

via i.p. Após a 1ª, 2ª, 4ª, e 8ª semana de infecção, os animais foram desafiados no

coxim plantar com 70µg/ml de Exo para estudo da hipersensibilidade ao antígeno.

Vinte e quatro horas antes do sacrifício dos animais, foi realizado o teste de HTT,

no coxim plantar desses camundongos. Na figura 1 O, observamos que os

camundongos C57BU6 CD4 "KO" apresentaram uma baixa reação ao teste de

HTT ao longo da infecção quando comparados aos animais controle (C57BL/6

"WT"). Os animais C57BU6 CDS "KO" foram capazes de induzir uma ativação da

resposta imune celular e ocorreu um aumento na positividade do teste de HTT ao

longo da infecção, resultado semelhante aos animais controle (C57BU6 ''WT").

:a .... (li e. 1/1 (li

0.75

~ ê 0.50

; E (li CI) (.),

ai 0.25 ... ~ "O

*

semanas

= C57BU6 "WT'

~ C57BU6 CD4 "KO"

- C57BU6 CDS "KO"

Figura 10. Hipersensibilidade do tipo tardio (HTT). Os camundongos C57BL/6 selvagens, TCD4 - ou TCD8- infectados pela via i.p. com 106 conídios de Fonsecaea pedtosoi foram desafiados no coxim plantar esquerdo com o Exo após a ia, 23, 4ª e 8ª semana de infecção. Vinte e quatro horas antes do sacrificio dos animais foi realizado o teste de HTT. Controle negativo: PBS estéril inoculado no coxim plantar direito. A diferença entre as patas direita e esquerda de cada animal foi medida em mm. Os resultados representam as médias ± desvio padrão da diferença entre as patas direita e esquerda de cada animal. O experimento foi realizado em triplicata. * Valores significativos comparados com o controle (C57BL/6 "WT") para p<0,05.

32

3.5 Análise do padrão de citocinas presentes no macerado dos órgãos após infecção

Avaliamos o padrão de citocinas (IL-4, •L-10 e IFN-y) encontrado no

sobrenadante do macerado dos órgãos baço e fígado dos camundongos C57BL/6

"WT", C57BL/6 CD4 "KO" e C57BL/6 CDS "KO" infectados com 106 conídios de F.

pedrosoi.

Na 1ª semana de infecção os camundongos C57BL/6 CD4 "KO"

apresentaram níveis baixos da citocina IFN-y nos órgãos baço (figura 11A) e

fígado (figura 11 B). Na 4ª e 8ª semana após a infecção apresentaram os níveis

mais baixos com diferença significativa em relação ao controle (C57BL/6 "WT"). A

citodna IL-1 O do fígado (figura 11 E) apresentou os maiores níveis na 8ª semana

após a infecção com diferenças significativas em relação ao controle (C57B1/6

"WT"). Os níveis de IL-4 (11C e 11D) foram semelhantes ao grupo controle

(C57BL/6 "WT") ao longo da infecção.

Os animais C57BL/6 CD8 "KO" apresentaram maiores níveis de IFN-y no

início da infecção (figura 11A e 11 B), resultados semelhantes aos animais

controles. A citocina •L-4 (figura 11C e 11D) também não apresentou diferenças

em relação ao controle. A citocina IL-10 (figura 11E e 11F) produzida pelo baço

apresentou maiores níveis na 4ª e 8ª semana após a infecção com diferenças

significativas em relação ao controle.

33

c::J '" semanaE:E:I 2" semana~4"semana

_a" semana

IFN-yBaço

o I I I t;':,1 ....~:?..,!" l~~I~~.õ,~i NS? ,.~.. I _I ~;~~J .5'''' _

5000

2500

15000

12500

..J 10000E~ 7500

B

c::J '" semanaEEJ 2" semana

~4"semana

_a" semana

1FN-rFígado

5000

15000

..J 10000E~

A

c 1500

...J 1000

.ê'"Co

500

IL4Fígado ~1"semana

~2·semana

~4asemana

_a-semana

D 1500

..J 1000E

~500

IL4Baço

c:::J 1a semanaE:::3 23 semana~48semana

_Ssemana

E 4000

3000

..JE~2000

1000

IL-10Figado c=J 1a semana

E32"semana~4"semana

_B"semana

F 2000

1500

..JEen1000Q.

500

O

IL-10Baço

c=J 1" semanaE32"semana~4"semana

_a" semana

Figura 11. Padrão de citocinas nos órgãos baço e fígado dos camundongos C57BL/6 "WT", C57BL/6 CD4"KO" e C57BI/6 CD8 "KO". Os camundongos foram infectados com 106 conídios de Fonsecaea pedrosoi pela viai.p. Após a 13,23,43 e 83 semana de infecção foram sacrificados e os órgãos foram retirados e macerados com PBSestéril e centrifugados a 2500 rpm a 5 minutos. As citocinas foram dosadas do sobrenadante. Os resultadosrepresentam as médias ± desvio padrão. O experimento foi realizado em triplicata. * Valores significativoscomparados com O controle (CS7BL/6 "WT") para p<O,OS.

34

V. DISCUSSÃO

O mecanismo de defesa do hospedeiro nas lesões fúngicas ainda é pouco

conhecido, embora nas últimas décadas tenham sido realizados alguns estudos

relativos à interação fungo-hospedeiro. Na maioria das vezes, os fungos são

saprófitas e o parasitismo é uma ocorrência acidental e não necessária para a

continuidade do ciclo de vida dos mesmos. De maneira geral, nosso sistema

imunológico é capaz de eliminar ou pelo menos controlar a maioria das infecções

fúngicas. As formas graves da doença quase sempre estão associadas a algum

tipo de deficiência imunológica. A maioria das micoses sistêmicas (candidíase,

histoplasmose, coccidioidomicose, blastomicose e paracoccidioidomicose) são

controladas principalmente por mecanismos imunológicos mediados por células

T42•

25•

37. A resposta inflamatória pode ser modificada por uma variedade de

citocinas produzidas por linfócitos, macrófagos e vários outros tipos de células 1º· 91

• 56

. Contudo, os efeitos das citocinas são complexos e muitas dessas

substâncias tais como IFN-y, TNF-a, IL-1 e IL-10 têm efeito interreguladores 29· ªº·

40

A cromoblastomicose é uma micose subcutânea, com alto índice de

morbidade e raramente os indivíduos tem cura da micose e até o momento são

poucos os trabalhos que relatam sobre a relação parasito-hospedeiro nessa

micose. Alguns têm focado a interação fungo-hospedeiro e os achados apontam

para uma resposta imune predominantemente celular, com ativação de

macrófagos envolvidos na fagocitose do fungo. Nessa micose, a fagocitose, in

vitro, parece prejudicada e a morte das células fúngicas raramente ocorre.

Acredita-se que a persistência in situ do fungo seja o principal fator responsável

pela morbidade da doença90• 69

.

Até o momento, não existem trabalhos na literatura com modelos

experimentais explorando aspectos da resposta imune adaptativa na

cromoblastomicose. Sabe-se que o desenvolvimento de um modelo experimental

de infecção é fundamental para o estudo da construção da resposta imune. Esse

35

modelo é amplamente utilizado para definir populações celulares, citocinas e

moléculas envolvidas na resistência ou susceptibilidade do hospedeiro frente a um

patógeno. Na cromoblastomicose, vários modelos foram estudados utilizando

diferentes rotas de infecção como intravenosa, intraperitoneal e subcutânea,

porém nenhum desses modelos foram capazes de levar a cronicidade em animais

imunocompetentes 1• 14

· 46

· 58

· 64

. Porém, Cardona- Castro e Agudelo- Flores, (1999)

estabeleceram um modelo de cromoblastomicose crônica em animais

imunocompetentes pela via i.p. abrindo caminhos para estudos da resposta imune

inata e adquirida em animais.

O enfoque do nosso trabalho foi estudar alguns aspectos da resposta imune

adaptativa em dois modelos de infecção experimental, um pela via s.c. (entrada

natural do fungo no homem) e outro pela via i.p. Observamos que na infecção pela

via s.c. os animais curam aproximadamente em 30 dias e que por essa via as

células T CD4+ parecem ser importantes no controle da cromoblastomicose e que

na via i.p. essas mesmas células são importantes no período inicial da infecção,

portanto outras células principalmente da imunidade inata estariam envolvidas no

controle da doença.

Primeiramente, tentamos estabelecer o modelo pela via s.c. que é a via de

entrada natural do fungo no homem e verificamos que em aproximadamente 4

semanas ocorre a cura espontânea dos camundongos BALB/c. Esse resultado vai

de acordo com a literatura de que a maioria dos modelos experimentais de

infecções fúngicas pela via s.c. leva a cura em aproximadamente em 30 dias38·

55.

Os camundongos BALB/c, após a 1ª semana de infecção apresentaram

uma resposta de HTT aumentada. Por outro lado, na 2ª e 4ª semana de infecção

os camundongos no teste de HTT apresentaram baixas reações cutâneas, quando

os animais já estavam superando o processo infeccioso. Contrariando dados da

literatura que foram verificados por Oliveira et ai. , (2002) ao relatar que pacientes

com a forma grave da paracoccidioidomicose (PCM) apresentavam baixa

reatividade aos antígenos fúngicos; já os com a forma branda da patologia

apresentam teste cutâneo positivos.

36

No modelo pela via s.c. ocorreu à cura dos animais, todavia realizamos a

subtipagem de linfócitos T na tentativa de saber quais células estariam

participando mais ativamente no controle da cromoblastomicose. Ocorreu um

predomínio de linfócitos T C04+ nas células totais dos linfonodos regionais dos

camundongos BALB/c pelo menos até 30 dias de infecção. Já a população de

células T coa+, apesar de em menor número no início da infecção, apresentou um

aumento até o 30° dia de infecção, sugerindo que essa população também

poderia estar contribuindo para o controle da doença. Podemos sugerir que pela

via s.c. na cromoblastomicose tanto os linfócitos T C04+ e T coa+ são cruciais

para o controle da infecção. ASHMAN et ai., (1999) demonstraram na candidíase

murina que ambos os linfócitos T C04+ T coa+ são essenciais para reduzir a

severidade da doença.

Posteriormente, avaliamos a capacidade das células totais dos linfonodos

proliferarem in vitro frente a estímulos antigênicos do fungo. Após a 1 ª semana de

infecção, as células totais dos linfonodos apresentaram um elevado índice de

proliferação celular com secreção predominante de IFN-y, quando estimuladas in

vitro com os diferentes antígenos de F. pedrosoi. Após a 2ª semana de infecção,

as células apresentaram uma menor capacidade proliferativa frente aos antígenos

de F. pedrosoi, enquanto na 4ª semana não houve proliferação e, nesse mesmo

tempo, as citocinas analisadas estavam em níveis basais.

Pela via s.c., demonstramos que as células T C04+ poderiam ser uma das

células que estariam participando ativamente no controle da doença, produzindo

principalmente IFN -y nos momentos iniciais da infecção. As células T coa+

também podem ter um papel protetor, já que a porcentagem dessas células

aumentaram no decorrer da infecção. Quando os animais já se encontravam

curados, as células não proliferaram in vitro a nenhum dos antígenos testados,

levando à crer que em tempos mais tardios da infecção subcutânea os linfócitos

estariam em estado anérgico. Esses dados corroboram com o teste de HTT em

que os camundongos apresentaram, baixas reações cutâneas em tempos mais

tardios da infecção.

37

A possível migração de linfócitos T CD4+/CD25+ antígeno- específica

poderiam justificar a ausência da proliferação. Dentro dessa hipótese o que

poderia estar controlando a infecção em tempos mais tardios seriam outras células

como macrófagos, neutrófilos ou células NK; o fungo também poderia estar em

granulomas compactos dificultando a ativação de linfócitos T para controlar a

infecção.

Como pela via s.c. não ocorreu a cronicidade, utilizamos um modelo que já

havia sido estabelecido por Cardona e Castro, 1999 pela via i.p. Os camundongos

apresentaram após a 8ª semana de infecção, colonização nos órgãos,

demonstrando uma tendência a cronicidade. Nesse aspecto, o modelo

experimental pode estar mimetizando a infecção em humanos, que na maioria dos

casos é observada uma infecção com caráter granulomatoso crônico.

Ainda nessa via de inoculação, avaliamos a ativação da resposta imune in

vivo e observamos que o antígeno utilizado foi capaz de induzir uma ativação da

resposta celular observada no teste de HTT. Essa resposta indicou que a

imunidade celular nos animais estava preservada, mesmo após 60 dias de

infecção. A diminuição da carga fúngica coincidiu com um aumento de HTT

nesses animais, sugerindo que a baixa colonização nos órgãos infectados pode

ter favorecido a migração dessas células para outro foco inflamatório, o coxim

plantar. Já foi observado em PCM experimental que a relação existente entre a

reação de hipersensibilidade e o número de UFC/g nos órgãos é inversamente

proporcional entre esses dois parâmetros, ou seja, quanto maior o número de

UFC/g recuperados dos órgãos examinados, menor a reação de

hipersensibilidade tardia. Este fato, também, é usual na doença humana uma vez

que o tratamento com a melhora clínica dos pacientes associa-se, em muitas

ocasiões, a reversão da anergia nos testes cutâneos36.

Experimentos com camundongos BALB/c atímicos e eutímicos 16

confirmaram a importância dos linfócitos T na PCM experimental. A doença é mais

grave nos animais deficientes de linfócitos T do que naqueles suficientes para

essa população celular.

38

Com a intenção de determinar se os linfócitos T CD4+ estariam envolvidos

na proteção da cromoblastomicose, infectamos com conídios de F. pedrosoi,

camundongos nocautes para essa população celular, e o grau de infecção foi

analisado.

O grau de infecção foi avaliado pela cultura dos órgãos (fígado e baço) pela

técnica de UFC. Após a 1ª semana de infecção os camundongos C57BL/6 CD4+

"KO" apresentaram maior disseminação fúngica quando comparado aos animais

controle (C57BL/6 "VVT"). A partir da 2ª semana de infecção esses camundongos

apresentaram uma redução drástica da carga fúngica nos órgãos analisados,

porém a carga fúngica ainda era maior que a do grupo controle (C57BL/6 "VVT")

com diferença significativa. Já, no teste de HTT esses mesmos camundongos

nocautes para CD4 apresentaram uma baixa resposta de HTT frente ao

exoantígeno.

Os linfócitos T, principalmente células T CD4+ são importantes no controle

inicial da infecção por F. pedrosoi. Em tempos mais tardios a infecção foi

controlada mesmo em camundongos deficientes de linfócitos T CD4\ sugerindo

que outras células, como macrófagos ou NK, estariam atuando de forma mais

efetiva no controle da infecção. Outra hipótese seria que após a 2ª semana de

infecção os fungos já estariam contidos em granulomas compactos o que faria que

os linfócitos T não tivessem um papel decisivo no controle da infecção. Outro fato

pode ser que as células T coa+ estariam em maior número nesse animais

nocautes para células T CD4+ , e atuando de forma efetiva no controle da

infecção.

Animais deficientes de células T CD4+ apresentaram uma fraca resposta ao

teste de HTT ao longo da infecção, mesmo quando em tempos mais tardios a

carga fúngica estava menor. Este fato não corrobora com o caso na doença

humana, que foi explicado anteriormente, uma vez que a melhora clínica dos

pacientes associa-se, em muitas ocasiões, a reversão da anergia nos testes

cutâneos36.

Pela técnica de UFC, camundongos C57BL/6 T coa+ "KO" apresentaram

uma carga fúngica semelhante aos animais controle. Nossos resultados sugerem

39

que os linfócitos T crnt não exercem função protetora nos animais por essa via

de infecção. Este fato não é usual em outras patologias, visto que trabalhos de

diferentes grupos têm demonstrado que as células T coa+ contribuem na defesa

do hospedeiro contra a ·infecção pelo Trypanossoma cruzi 82, Toxoplasma gondii

15, Leishmania ssp34

, Histoplasma capsulatum28 e Cryptococcus neoformans 43

entre outros.

A resposta do teste de HTT foi positiva em todos os tempos de infecção,

não apresentado diferença em relação ao controle. Com base nesses dados,

pode-se aventar a hipótese de que os linfócitos T coa+ não são responsáveis pela

formação do edema de HTT na cromoblastomicose experimental.

As citocinas induzidas por um organismo ou antígeno logo após a entrada

no organismo influencia se as células T "helper" O (Th0) vão desenvolver-se em

células Th1 que produzem interleucina-2 (IL-2), IFN-y e TNF-p, ou células Th2 que

auxiliam na maturação de células B e produzem IL-4, 11-5, IL-10 e IL-1345. As

células Th1 e as linfocinas que elas produzem são associadas com a resposta

imune celular, enquanto as que as células Th2 e suas linfocinas são associadas

com a imunidade humoral. Se um imunógeno ou organismo estimula macrófago a

produzir IL-12, então as células NK são estimuladas a produzir IFN-y resultando

em uma resposta Th187

.

Em geral em hospedeiros imunocompetentes, os fungos patogênicos

induzem preferencialmente células Th1 ou resposta imune celular, a qual fornece

ao hospedeiro alguma proteção. A extensão e eficácia da resposta imune celular

na proteção contra os diferentes fungos podem variar dependendo da rota de

infecção, do tecido infectado e a resposta imune local, o padrão genético do

hospedeiro, e o isolado que está causando a infecção.

Em nosso modelo estudado, camundongos nocautes de T CO4\ durante o

período de infecção analisados, apresentaram menores níveis de IFN-y, quando

comparadas ao controle, e no decorrer da infecção esses níveis diminuíram

significamente. Enquanto, os níveis de IL-10 aumentaram no decorrer da infecção.

Esses dados levam a crer que a cronicidade observada nesses animais pode ser

pelo aumento de IL-10 e a conseqüente diminuição de IFN-y. Esse fato foi

40

-···_/ BIBLIOTECA F9culdade de Ciências Farmacêuticas

Universidade de São Paulo

observado em humanos com cromoblastomicose, em que indivíduos com a forma

grave da doença apresentam altos níveis de IL-10 e com a forma leve, altos níveis

de IFN-y. Portanto, torna-:se evidente que a resposta imune protetora na

cromoblastomicose deve ser sustentada por células do tipo 1, ou por outra fonte

secretora de IFN-y.39

Em outro trabalho que avaliaram a expressão de citocinas em cortes

histológicos por imunohistoquímica em pacientes com cromoblastomicose,

observaram que pacientes com a forma grave da doença possuíam células que

expressavam IL-1 O, IL-4 e TNF-a, não sendo detectada expressão local de IFN-y.

Na forma leve foi encontrada células expressando IFN-y, TNF-a e IL-4 e não foi

encontrado expressão de IL-1026.

A produção de IFN-y em camundongos nocautes de T CD4+ pode ser por

outras células como células NK ou células T coa+ devido aos próprios

mecanismos compensatórios de camundongos nocautes. Como foi demonstrado

ocorreu uma diminuição das UFCs em camundongos nocautes de T CO4+

podemos sugerir que outras células estariam envolvidas no controle da infecção

em tempos mais tardios da infecção. Os níveis de IL-4, nos animais nocautes de T

CD4+ apresentaram níveis semelhantes ao controle.

No animais nocautes de linfócitos T coa+ não foi observada alteração na

carga fúngica em relação ao controle. Este perfil foi acompanhado de maiores

níveis de IFN-y na 1ª semana de infecção, resultado semelhante ao controle.

Estes resultados são compatíveis com o UFC, onde os animais que apresentam

maior carga fúngica apresentaram maiores níveis de IFN-y. Este fato explicaria ou

estaria em concordância com o achado de resposta de HTT positivas nos animais

nocautes de T coa+ com a diminuição da carga fúngica.

Esterre et ai., (1993) avaliaram a reação imune mediada por células através

da expressão de citocinas TGF-13, TNF-a e IFN-y e de linfócitos T CO4+ e T coa+

em biópsias de lesões cutâneas pacientes com cromoblastomicose, sem

discriminação do tipo de lesão. Os autores, através de estudo semi-quantitativo

dos diferentes tipos celulares, encontraram pequena participação de linfócitos T

41

C04+ e T coa+, alguns macrófagos expressando TNF-a e ausência de células

expressando IFN-y.

Na resposta imune natural e adquirida participam várias células produtoras

de citocinas T C04+, T coa+, NK, leucócitos PMN, macrófagos, células epiteliais

do baço e fígado, etc. Assim, as citocinas são o refluxo da atividade secretora das

diferentes subpopulações celulares e de seus efeitos inibitórios umas sobre as

outras. Além disso, o influxo de células inflamatórias (linfócitos T e B, macrófagos,

leucócitos PMN) que expressam receptores para citocinas, leva ao consumo dos

mediadores produzidos localmente o que resta no sobrenadante é o que sobrou

da complexa interação entre síntese e consumo.

Entretanto, a análise conjunta de nossos resultados demonstrou que na

cromoblastomicose pela via s.c. podemos sugerir que nesse modelo há uma

polarização para uma resposta do tipo Th1. Já na via i.p. , as células T C04+ são

reguladoras da carga fúngica no início da infecção e que os linfócitos T coa+ parecem ter uma função secundária no controle da cromoblastomicose

experimental. Além disso, o nível de citocina IFN-y é inversamente proporcional à

carga fúngica.

No entanto, para um melhor entendimento, faz se necessário à realização

de experimentos adicionais, como o uso de camundongos atímicos para avaliar a

importância de linfócitos na cromoblastomicose experimental.

42

VI. CONCLUSÕES

A análise dos resultados descritos anteriormente permite algumas conclusões tais

como:

- Pela via de entrada natural do fungo ocorreu a cura dos camundongos BALB/c

em aproximadamente 30 dias. Durante esse tempo de infecção ocorreu um

predomínio de células T CD4\

- Ainda na via s.c., nos primeiros dias de infecção a resposta celular foi mediada

predominantemente por linfócitos T CD4+ produtores de IFN-y, podendo nesse

modelo estar ocorrendo uma polarização de resposta para Th1 .

- Através do ensaio de HTT em camundongos BALB/c infectados pela via i.p. , o

antígeno utilizado foi capaz de ativar uma resposta de HTT, e a imunidade celular

estava preservada, mesmo após 60 dias de infecção;

- Nos camundongos nocautes de células T CD4+ ou T CDS+, demostramos que os

linfócitos T, principalmente as células T CD4+ são importantes no controle inicial

da infecção e que os linfócitos T CDS+ parecem não ter função importante no

controle da carga fúngica;

- Em relação ao teste de HTT, as células T CD4+ mostraram-se importantes

mediadoras da resposta celular;

- Os linfócitos T CD4+ parecem ter pequena participação na regulação da

produção de citocinas nos órgãos baço e fígado, pois os animais nocautes para

essa população de linfócitos apresentaram poucas alterações na produção de

citocinas (IFN - y, IL-4 e IL-10).

43

- Os linfócitos T coa+ parecem não ter participação na regulação da produção de

citocinas nos órgãos baço e fígado, pois os animais nocautes para essa população

de linfócitos não apresentaram diferenças em relação ao controle.

44

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