caracterizaÇÃo quÍmica e efeito do Óleo essencial de ... · iii ficha catalogrÁfica elaborada...
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MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE
PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AGRICULTURA E BIODIVERSIDADE
CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA E EFEITO DO ÓLEO
ESSENCIAL DE Lippia gracilis E SEUS CONSTITUINTES
MAJORITÁRIOS SOBRE Aceria guerreronis (Acari:
Eriophyidae)
MARIANA SANTOS MENEZES
2016
ii
MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE
PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AGRICULTURA E BIODIVERSIDADE
MARIANA SANTOS MENEZES
CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA E EFEITO DO ÓLEO ESSENCIAL DE Lippia
gracilis E SEUS CONSTITUINTES MAJORITÁRIOS SOBRE Aceria guerreronis
(Acari: Eriophyidae)
Dissertação apresentada à Universidade
Federal de Sergipe, como parte das exigências
do Curso de Mestrado em Agricultura e
Biodiversidade, área de concentração em
Agricultura e Biodiversidade, para obtenção
do título de “Mestre em Ciências”.
Orientador
Prof. Dr. Arie Fitzgerald Blank
SÃO CRISTÓVÃO
SERGIPE – BRASIL
2016
iii
FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA CENTRAL
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE
M543c
Menezes, Mariana Santos.
Caracterização química e efeito do óleo essencial de Lippia gracilis e seus
constituintes majoritários sobre Aceria guerreronis (Acari: Eriophyidae) / Mariana
Santos Menezes; orientador Arie Fitzgerald Blank. – São Cristóvão, 2016.
26 f.: il.
Dissertação (mestrado em Agricultura e Biodiversidade)– Universidade
Federal de Sergipe, 2016.
1. Essências e óleos essenciais. 2. Pragas – Controle biológico. 3.
Toxicidade - Testes. I. Blank, Arie Fitzgerald, orient. II. Título.
CDU 665.52/.54
iv
MARIANA SANTOS MENEZES
CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA E EFEITO DO ÓLEO ESSENCIAL DE Lippia
gracilis E SEUS CONSTITUINTES MAJORITÁRIOS SOBRE Aceria guerreronis
(Acari: Eriophyidae)
Dissertação apresentada à Universidade
Federal de Sergipe, como parte das exigências
do Curso de Mestrado em Agricultura e
Biodiversidade, área de concentração em
Agricultura e Biodiversidade, para obtenção
do título de “Mestre em Ciências”.
APROVADA em 22 de julho de 2016.
Prof. Dr. Adenir Vieira Teodoro
Embrapa Tabuleiros Costeiros
Prof. Dr. Marcelo da Costa Mendonça
Programa de Pós-Graduação em
Biotecnologia Industrial (PBI)/UNIT
Prof. Dr. Arie Fitzgerald Blank
PPGAGRI/UFS
(Orientador)
SÃO CRISTÓVÃO
SERGIPE – BRASIL
v
A meus pais, Antonio Carlos e Maria Angélica
Dedico
vi
AGRADECIMENTOS
A Deus pelo dom da vida.
Aos meus pais que não mediram esforços para me proporcionar o melhor em tudo.
À minha irmã Ique pelo amor, carinho, paciência e pelos amores da minha vida Arthur e Davi.
Aos amigos do GPMACO, em especial a Elizangela, Larissa, Thaís, Faby, Vanderson e
Carlos.
Aos amigos do laboratório de entomologia da UFS, em especial a Abraão, Alexandre, Angela,
Morg, Anne, Bruna e Carlisson.
Aos amigos do Laboratório de Entomologia da Embrapa, Jessica, Samuel, Shenia, Clesia,
Adriano, Priscila, Luan, Mari, Rafaela, Carol, Danúbia Eliana e Flaviana pelo apoio nos
experimentos e momentos compartilhados.
Aos funcionários da Embrapa, em especial a Chico, Lourdes, Ricardo e Guedes pela ajuda na
realização e condução dos experimentos.
À Universidade Federal de Sergipe.
À Embrapa Tabuleiros Costeiros.
À Capes, pela concessão da bolsa.
Ao meu orientador, Arie Fitzgerald Blank pelos ensinamentos, dedicação e paciência; sem sua
orientação esse trabalho não seria possível.
À Adenir Viera Teodoro, pela corientação e dedicação.
À Marcelo Mendonça, que sempre está presente na minha caminhada acadêmica e
profissional.
A todos os professores do PPGAGRI, em especial a Leandro Bacci e Genésio Tamara.
A todos que direta ou indiretamente me ajudaram na conquista desse título.
Muito obrigada.
vii
BIOGRAFIA
Mariana Santos Menezes, filha de Antonio Carlos de Almeida Menezes e Maria Angelica
Santos Menezes, nasceu na cidade de Aracaju, no estado de Sergipe, em 15 de agosto de
1986.
Em Janeiro de 2011, graduou-se em Engenharia Agronômica pela Universidade Federal de
Sergipe, em São Cristovão, Sergipe. Durante o período de graduação foi estagiaria da
Empresa Brasileira de Pesquisa e Pesquisa Agropecuária, EMBRAPA.
Em 2014, iniciou o Mestrado em Agricultura e Biodiversidade na Universidade Federal de
Sergipe defendendo a dissertação em Julho de 2016.
viii
SUMÁRIO
Página
LISTA DE FIGURAS ..................................................................................................... i
LISTA DE TABELAS .................................................................................................... ii
LISTA DE ABREVIATURAS, SÍMBOLOS E SIGLAS ............................................... iii
RESUMO ........................................................................................................................ iv
ABSTRACT .................................................................................................................... v
1. INTRODUÇÃO .......................................................................................................... 1
2. REFERENCIAL TEÓRICO ....................................................................................... 2
2.1 Origem e botânica de Lippia gracilis ................................................................... 2
2.2 Atividades inseticida, acaricida e repelente de óleos essenciais ........................... 2
2.3 Atividades inseticida, acaricida e repelente de timol e carvacrol .........................
2.4 Sinergismo ............................................................................................................
2.5 Ácaro-da-necrose Aceria guerreronis ..................................................................
4
5
5
3. MATERIAL E MÉTODOS ........................................................................................ 8
3.1 Obtenção do material vegetal, dos ácaros e dos monoterpenos timol e carvacrol 8
3.2 Extração dos óleos essenciais de L. gracilis ......................................................... 8
3.3 Análise química do óleo essencial de L. gracilis .................................................. 8
3.4 Toxicidade ............................................................................................................ 8
3.5 Repelência ............................................................................................................. 9
3.6 Análise estatística ................................................................................................. 9
4. RESULTADO ............................................................................................................. 10
4.1 Composição química ............................................................................................. 10
4.2 Toxicidade ............................................................................................................ 11
4.3 Repelência ............................................................................................................. 11
5. DISCUSSÃO .............................................................................................................. 14
6. CONCLUSÕES .......................................................................................................... 16
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................................ 17
i
LISTA DE FIGURAS
Figura Página
1 Lippia gracilis no Banco Ativo de Germoplasma de plantas medicinais e
aromáticas da UFS, São Cristovão - 2016. ..................................................... 17
2 Estrutura molecular do timol (a) e carvacrol (b)............................................. 20
3 Imagem apresentando o ácaro-da-necrose (Aceria guerreronis) .................... 23
ii
LISTA DE TABELAS
Tabela Página
1 Composição química dos óleos essenciais dos genótipos LGRA-106 e
LGRA-109 de Lippia gracilis. ........................................................................ 27
2 Estimativas das concentrações letais (CL50 e CL 90) de óleos essenciais de
dois genótipos de Lippia gracilis (LGRA-106 e LGRA-109) e seus
compostos majoritários timol e carvacrol sobre Aceria guerreronis após 24h
de exposição. ................................................................................................... 29
3 Repelência dos óleos essenciais dos genótipos de Lippia gracilis e seus
compostos majoritários ao ácaro-da-necrose após 1 e 24 h de exposição. .... 30
iii
LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS
CL Concentração letal
LGRA Lippia gracilis
AChE Acetilcolinesterase
MAPA Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento
CG/EM/DIC Cromatografia gasosa aplicada no espectômetro de massa e detector de
iniozação por chama
BOD Biochemical oxygen demand (Demanda Bioquimica de oxigênio)
IR Índice de retenção
IC Intervalo de confiança
GL Grau de liberdade
X2 Qui-quadrado
P Probabilidade
iv
RESUMO
MENEZES, Mariana Santos. Caracterização química e efeito do óleo essencial de Lippia
gracilis e seus constituintes majoritários sobre Aceria guerreronis (Acari: Eriophyidae). São Cristóvão: UFS, 2016. 26p. (Dissertação – Mestrado em Agricultura e Biodiversidade).*
Lippia gracilis Schauer é uma planta pertencente à família Verbenaceae popularmente
conhecida como “alecrim-da-chapada” ou “alecrim-de-tabuleiro” e própria do bioma caatinga.
Devido ao potencial bioativo, o óleo essencial de L. gracilis vem sendo testado para o
controle de diferentes pragas e doenças na agricultura e pecuária. Uma destas pragas é o
ácaro-da-necrose Aceria guerreronis (Acari: Eriophyidae), importante praga da cultura do
coqueiro no Brasil. O objetivo deste trabalho foi avaliar a toxicidade e repelência do óleo
essencial de dois genótipos de L. gracilis e seus compostos majoritários timol e carvacrol ao
ácaro-da-necrose (A. guerreronis). Adultos do ácaro-da-necrose foram submetidos a
concentrações crescentes dos óleos essenciais dos genótipos LGRA-106 e LGRA-109 de L.
gracilis, de timol e carvacrol, possibilitando a estimativa das concentrações letais (CL).
Adicionalmente à toxicidade, foi avaliada a repelência dos óleos essenciais de L. gracilis,
timol e carvacrol por meio da liberação de ácaros no centro de uma arena com metade
pulverizada e metade não pulverizada. A análise da composição química dos óleos essenciais
de L. gracilis identificou o timol (52,41%) e o carvacrol (49,36%) como compostos
majoritários dos genótipos LGRA-106 e LGRA-109, respectivamente. O genótipo LGRA-106
apresentou maior toxicidade (CL50 = 4,73 µL/mL) ao ácaro-da-necrose em comparação com
LGRA-109 (CL50 = 30,99 µL/mL). A toxicidade do LGRA-106 não diferiu do seu composto
majoritário timol (CL50 = 5,34 µL/mL). O óleo essencial do LGRA-106 foi 2,3 vezes mais
tóxico que do seu composto majoritário timol para CL90. A CL50 e a CL99 dos genótipos
LGRA-106 (4,73 e 13,18 µL/mL-1
), LGRA-109 (30,99 e 54,33 µL/mL-1
) e de carvacrol (6,84
e 45,97 µL/mL-1
), repeliram o ácaro-da-necrose após 24 h de exposição. A CL50 e CL99 de
timol (5,34 e 56,35 µL/mL) apresentaram efeito neutro sobre o ácaro-da-necrose após 24 h de
exposição. Conclui-se que o óleo essencial do genótipo LGRA-106 apresenta potencial para
desenvolvimento de um produto para o controle do ácaro-da-necrose.
Palavra-chave: Lippia gracilis; óleo volátil; timol; carvacrol; atividade acaricida; Aceria
guerreronis
___________________
* Comitê Orientador: Arie Fitzgerald Blank – UFS (Orientador), Adenir Vieira Teodoro – EMBRAPA.
v
ABSTRACT
MENEZES, Mariana Santos. Chemical characterization and effect of the essential oil of
Lippia gracilis and its major constituents on Aceria guerreronis (Acari: Eriophyidae).
São Cristóvão: UFS, 2016. 26p. (Thesis - Master of Science in Agriculture and
Biodiversity).*
Lippia gracilis Schauer is a plant that belongs to the Verbenaceae family, is known as
“alecrim-da-chapada” or “alecrim-de-tabuleiro”, and occure in the caatinga biome. Because of
its bioactive potential, the essential oil of L. gracilis is been tested for control of different
agriculture and livestock pests and diseases. One of these pests is the coconut mite, Aceria
guerreronis (Acari: Eriophyidae), an important pest of the coconut crop in Brazil. The
objective of this study was to evaluate the toxicity and repellency of the essential oil of two
genotypes of L. gracilis and their major compounds thymol and carvacrol against the coconut
mite (A. guerreronis). Adults of the coconut mite were subjected to increasing concentrations
of the essential oils of the genotypes LGRA-106 and LGRA-109, of thymol and carvacrol,
allowing the estimation of the lethal concentrations (LC). In addition to toxicity, the
repellency of essential oils of L. gracilis, thymol and carvacrol was evaluated by releasing
mites in the center of an arena with half area sprayed and the other half unsprayed. The
analysis of the chemical composition of the essential oils of L. gracilis identified thymol
(52.41%) and carvacrol (49.36%) as the major compounds for genotypes LGRA-106 and
LGRA-109, respectively. The genotype LGRA-106 showed higher toxicity (LC50 = 4.73
µL/mL) to the coconut mite compared to the genotype LGRA-109 (LC50 = 30.99 µL/mL).
The toxicity of LGRA-106 did not differ from its major compound thymol (LC50 = 5.34
µL/mL). The essential oil of LGRA-106 was 2.3 times more toxic than its major compound
thymol at LC90. The LC50 and LC99 of genotypes LGRA-106 (4.73 and 13.18 µL/mL),
LGRA-109 (30.99 and 54.33 µL/mL) and carvacrol (6.84 and 45.97 µL/mL) repelled the
coconut mite after 24 h of exposure. The LC50 and LC99 of thymol (5.34 and 56.35 µL/mL)
presented a neutral effect on the coconut mite after 24 h of exposure. We can conclude that
the essential oil of genotype LGRA-106 has potential for development of a product to control
the coconut mite.
Key-words: Lippia gracilis; volatile oil; thymol; carvacrol; acaricide activity; Aceria
guerreronis.
___________________
* Supervising Committee: Arie Fitzgerald Blank – UFS (Supervisor), Adenir Vieira Teodoro – EMBRAPA.
1
1. INTRODUÇÃO
O uso de agrotóxicos consome mundialmente bilhões de dólares na tentativa de
controlar pragas. Até a década de 40, os agrotóxicos naturais foram muito utilizados, no
entanto a partir da segunda guerra mundial, os produtos sintéticos passaram a ganhar espaço,
revelando-se mais potentes e menos específicos que os naturais no controle de pragas
agrícolas (VIEGAS JUNIOR, 2003). Porém, o uso intensivo e indiscriminado desses
produtos, favoreceu o surgimento de pragas mais resistentes devido ao processo de seleção de
indivíduos, surgimento de pragas secundárias e efeitos negativos em insetos não alvos. Além
disso, observou-se também prejuízos causados ao ambiente, como a contaminação do solo, de
lençóis freáticos, de rios e lagos, empobrecimento do solo e à saúde humana. (RIBAS &
MATSUMURA, 2009; CHANDLER et al., 2011)
Um grande número de fatores ecológicos, sociais, políticos e econômicos, tem
aumentado a motivação para o desenvolvimento de outros métodos de controle de pragas,
como o uso de novas substâncias praguicidas. Em função disto, estudos recentes demostraram
que dentre as substâncias biologicamente ativas utilizadas no controle de pragas destaca-se o
uso de óleos essenciais extraídos de diversas espécies vegetais.
Lippia gracilis Schauer é uma espécie aromática pertencente à família Verbenaceae,
endêmica do nordeste brasileiro e popularmente conhecida como alecrim-de-chapada ou
alecrim-de-tabuleiro. O óleo essencial desta espécie possui forte atividade bactericida,
fungicida, leishmanicida, carrapaticida e inseticida devido à presença majoritária dos
monoterpenos carvacrol ou timol (ALBUQUERQUE et al., 2006; SILVA et al., 2008; CRUZ
et al., 2013; MELO et al., 2013). No entanto, não se conhece a biotividade do óleo essencial
de L. gracilis sobre ácaros-praga de cultivos agrícolas.
O ácaro-da-necrose Aceria guerreronis (Acari: Eriophyidae) é considerado uma das
pragas mais notórias e importantes de frutos de coqueiros em muitos países (NAVIA et al.,
2013). Dentre as medidas de controle mais utilizadas para o ácaro-da-necrose está o uso de
acaricidas (ALENCAR, 2001). No entanto, como é necessária uma frequência contínua de
aplicação, o controle químico pode resultar em desenvolvimento de resistência pela praga
além de aumentar o custo da produção e causar problemas, como acúmulo de resíduos nos
produtos do coco (MOORE & HOWARD, 1996).
Diante do potencial de utilização desta planta, o presente trabalho teve como objetivo
avaliar a toxicidade e a repelência do óleo essencial de dois genótipos de L. gracilis e seus
compostos majoritários, timol e carvacrol ao ácaro-da-necrose Aceria guerreronis.
2
2. REFERENCIAL TEÓRICO
2.1 Origem e botânica de Lippia gracilis
O gênero Lippia, o segundo maior da família Verbenaceae, inclui aproximadamente
200 espécies de ervas, arbustos e árvores de pequeno porte, distribuídas principalmente na
América Central, regiões tropicais da África, América do Norte, América do Sul e Austrália
(MUNIR, 1993; PASCUAL et al., 2001; SILVA et al., 2006; GOMES et al., 2011).
No Brasil, as plantas do gênero Lippia são espécies próprias do bioma caatinga, que é
o principal bioma da região Nordeste, estendendo-se pelo domínio do clima semiárido, sendo
comum sua presença nos estados do Piauí, Bahia, Ceará, Paraíba, Pernambuco
(CAVALCANTI, 2006) e Sergipe (LORENZI & MATOS, 2002).
Dentro do gênero, L. gracilis (Figura 1) é um arbusto de folha caduca ramificada que
pode atingir cerca de 2 m, conhecida como “alecrim-da-chapada” ou “alecrim-de-tabuleiro”
no Agreste, e no sertão nordestino conhecida como “cidreira-da-serra” (PRADO et al., 2012).
A planta possui caule quebradiço, com folhas pequenas e aromáticas de pouco mais de um
centímetro de comprimento. As flores são miúdas e amarelo-esbranquiçadas, reunidas em
espigas de eixo curto. Os frutos são do tipo aquênio extremamente pequeno, cujas sementes
raramente germinam (LORENZI & MATOS, 2002).
L. gracilis é principalmente propagada por estaquia, devido à dificuldade de
germinação das sementes. A planta possui grande resistência à seca e a altas temperaturas,
perdendo suas folhas somente após um longo período de estiagem (OLIVEIRA et al., 2008).
Figura 1. Lippia gracilis no Banco Ativo de Germoplasma de Plantas Medicinais e Aromáticas da
Universidade Federal de Sergipe (UFS). São Cristovão, UFS, 2016.
2.2 Atividades inseticida, acaricida e repelente de óleos essenciais
Dentre as substâncias que as plantas produzem por meio do metabolismo secundário
destacamos os óleos essenciais (OLIVEIRA, 2012) ou substâncias bioativas (SILVA et al.,
2011). O óleo essencial é uma mistura complexa de substâncias voláteis lipofilícas,
geralmente odoríferas e líquidas e de baixo peso molecular (LUBBE & VERPOORTE, 2011).
3
Podem ser chamados de óleos voláteis, óleos estéreos ou essenciais devido a algumas de suas
características físico-químicas como volatilidade, solubilidade em solventes orgânicos (como
o éter) e aroma intenso, muitas vezes agradável (MATTOS et al., 2007).
A ação dos óleos essenciais está relacionada com a sua volatilidade, pois, por meio
dessa característica, age como sinais de comunicação química com o reino vegetal e como
arma de defesa contra o reino animal. Eles são considerados como repelentes de insetos que
se alimentam de suas folhas, inibidores da germinação e de crescimento de outras plantas,
controladores da atividade microbiológica de alguns fungos e bactérias e atrativos de
polinizadores (BOLAND et al., 1991; CHAIBI et al., 1997; OYEDEJI et al., 1999; SAITO &
SCRAMIN, 2000).
O modo de ação da atividade dos óleos essenciais está diretamente ligado aos
compostos terpenoides, que ocorre por meio da interação com o tegumento do inseto e/ou
com enzimas digestivas e neurológicas inibindo a acetilcolinesterase e/ou serem antagonista
dos receptores de octopamina (ENAN, 2001; ISMAN, 2006). Nas interações neurológicas, a
toxicidade dos óleos essenciais é devida à sua ação sobre o sítio octopaminérgico, inibindo ou
estimulando a octopamina, um neurotransmissor presente apenas em invertebrados, quando
seu funcionamento é interrompido resulta na ruptura do funcionamento do sistema nervoso do
inseto (ENAN, 2001; TRIPATHI et al., 2009).
Quanto ao mecanismo de ação do óleo sobre os ácaros, acredita-se que, embora seja
pouco conhecido (KIM et al., 2004), o seu efeito rápido seria indicativo de uma ação
neurotóxica (ISMAN, 2006). Por outro lado, Moraes & Flechtmann (2008) asseguraram que
os óleos essenciais apresentam efeito tóxico aos ácaros, pois penetram no corpo destes
artrópodos por meio da cutícula, que corresponde à sua única superfície respiratória.
A atividade inseticida de óleos essenciais vem sendo pesquisada há algum tempo
(CORRÊA & SALGADO, 2011). Kim et al., (2003) relatam atividade inseticida de cinco
óleos essenciais de plantas aromáticas sobre os carunchos de feijão Callosobruchus chinensis
(Coleoptera: Bruchidae) e de arroz Sitophilus oryzae (Coleoptera: Curculionidae). O óleo
essencial de Litsea pungens e Litses cubeba causam toxicidade a larvas de terceiro instar da
falsa medideira Trichoplusia ni (Lepidoptera: Noctuidae) através de aplicação tópica. Óleos
essenciais extraídos das folhas de Aloysia polystachya e A. citriodora apresentaram atividades
repelentes e tóxicas contra adultos do besourinho dos cereais Rhyzopertha dominica
(Coleoptera: Bostrichidae) por apliacação tópica e fumigante. Óleos essenciais de Baccharis
spartioides, Rosmarinus officinalis e Aloysia citriodora mostraram repelência a Aedes aegypti
(Diptera: Culicidae) por longo período (JIANG et al., 2009; BENZI et al., 2009).
Entre os gêneros de plantas com óleos essenciais promissores, destaca-se o gênero
Lippia que apresenta atividade tóxica ou repelente a diversos insetos e carrapatos (COSTA et
al., 2005; NERIO et al., 2009; PEIXOTO et al., 2015).
Os óleos essenciais são misturas complexas que podem conter 100 ou mais compostos
orgânicos. Seus constituintes podem pertencer às mais diversas classes de compostos, sendo
classificados em terpenos, compostos terpenóides oxigenados, compostos benzenóides e
compostos contendo nitrogênio e/ou enxofre (CASTRO et. al., 2004; DONELIAN, 2004;
SONWA, 2000).
O óleo essencial de L. gracilis apresenta como componentes que aparecem com maior
frequência o limoneno, β-cariofileno, p-cimeno, cânfora, linalool, α-pineno, 1-8 cineol,
humuleno, γ-terpineno, timol e carvacrol (PASCUAL et al., 2001; CAVALCANTI et al.,
2010). Alguns deles foram isolados e avaliados quanto à toxicidade a diferentes insetos,
ácaros e carrapatos como, por exemplo, o limoneno (NAKATANI, 1999), p-cimeno
(OLIVEIRA, 2015), linalool (NICULAU et al, 2013), α-pineno (HARBORNE, 1993), 1-8
cineol (PRATES et al., 1998a,b), timol (ARAUJO, 2015) e carvacrol (MELO, 2014).
4
2.3 Atividades inseticida, acaricida e repelente de timol e carvacrol
O timol e o carvacrol (Fig. 2) são fenóis monoterpenoides biosintetizados em plantas a
partir do γ-terpineno e ρ-cimeno, por isso é verificada a presença desses compostos em óleos
essenciais que contém timol e carvacrol (BASER & DEMIRCI, 2007).
Figura 2. Estrutura molecular do timol (a) e carvacrol (b)
O timol e o carvacrol são encontrados no óleo essencial de L. gracilis. O óleo
essencial de algumas espécies nativas do Nordeste brasileiro possui timol e carvacrol em sua
composição como componente majoritário (COSTA et al., 2005; CRUZ et al., 2013).
O timol, cuja nomenclatura química é 5-metil-2-(1-metiletil)-fenol possui fórmula
molecular C10H14O e peso molecular de 150,22 g/mol, apresenta-se em forma de cristais
grandes translúcidos incolores ou brancos. Esse composto é uma substância pouco solúvel em
água, com coeficiente de partição n-octonol/água 3,30 com ponto de fusão de 52° C,
permanecendo líquido em temperaturas consideravelmente mais baixas, enquanto que seu
ponto de ebulição é 233° C (RODRIGUES, 2002)
O carvacrol é um fenol monoterpenóide quimicamente denominado 2-metil-5-(1-
metiletil)-fenol ou isopropyl-0-cresol, possui fórmula molecular C6H12O6,
C6H3(OH)(C3H7) e peso de 150,22 g/mol. Em temperatura ambiente, apresenta-se na forma
líquida de coloração amarelo claro com densidade igual a 0,975 g/ml. Esse composto é uma
substância lipofílica com pouca solubilidade em água (coeficiente de solubilidade igual a
0,04%) e seu ponto de fusão é de 2° C e seu ponto de ebulição é de 234° C (CARVALHO et
al., 2003).
A atividade do timol e carvacrol é conhecida por apresentar efeitos tóxicos a diversos
organismos. Hummelbrunner & Isman (2001), apontaram efeito tóxico do timol e do
carvacrol contra lagartas de quarto ínstar da lagarta militar do tabaco Spodoptera litura e do
timol ao gorgulho do arroz Sitophilus oryzae, sendo altamente eficaz quando aplicado após 24
horas na dose mais baixa (0,1 µL /720 mL de volume). Resultados semelhantes foram obtidos
por Szczepanik et al. (2012) a larvas de cascudinho Alphitobius diaperinus (Coleoptera:
Tenebrionidae) sendo os compostos puros timol e carvacrol mais ativos que o óleo essencial
de Thymus vulgaris.
É necessário saber o modo de ação destes compostos, que estão sendo estudados
quanto a inibição da enzima acetilcolinesterase (AchE), que é uma das enzimas mais
importantes e necessárias ao pleno funcionamento do sistema nervoso dos insetos. Dessa
forma, a inibição da AChE foi avaliada como possível mecanismo de ação do timol e
carvacrol (JUKIC et al., 2007), sendo o carvacrol mais eficaz do que timol sugerindo que a
posição do grupo hidroxila na estrutura molecular do composto desempenha papel importamte
para o efeito inibidor da AChE (AAZZA et al., 2011). Resultados semelhantes foram
encontrados por Dandlen et al. (2011) mostrando que o carvacrol apresenta potencial inibidor
de acetilcolinesterase.
5
2.4 Sinergismo
As defesas químicas das plantas apresentam-se não como substâncias individualizadas
e sim como misturas complexas de compostos. Os óleos essenciais apresentam na sua
composição compostos em diferentes concentrações (majoritárias e minoritárias). Assim, os
efeitos biológicos dos óleos essenciais podem ser devido as interação entre tais compostos,
como resultado de efeitos sinérgicos, aditismos, antagonimos e potenciações. Estes efeitos
podem ocorrer via interação entre todas as moléculas presentes nos óleos essenciais ou através
da interação entre determinados componentes, principalmente os majoritários (BAKKALI et
al., 2008). Contudo, componentes minoritários também podem atuar como agentes sinérgicos,
aumentando o efeito dos principais (NERIO et al., 2010; HUMMELBRUNNER e ISMAN,
2001) ou como agentes antagônicos, provocando a redução do efeito (IZZO & ERNST,
2001). Estes componentes desempenham importantes papéis em diversas características do
óleo, tais como: atração hipo ou hidrofílica, fixação (BAKKALI et al., 2008) e penetração em
células (CAL, 2006).
A importância do efeito sinérgico consiste no aumento dos efeitos biológicos dos óleos
essenciais (KOSTIC et al., 2013). Assim, tal efeito permite a utilização de dosagens menores
da mistura, possibilitando a redução de custos com o manejo de pragas e os riscos ao meio
ambiente (RIBEIRO et al., 2003). Além disso, as misturas complexas também são menos
susceptíveis à resistência e adaptação comportamental pelos insetos (FENG & ISMAN, 1995;
BOMFORD & ISMAN, 1996).
O sinergismo que ocorre entre os compostos presentes nos óleos essenciais de plantas
pode resultar numa maior bioatividade do que a observada para os compostos isolados. Tais
efeitos são comuns em terpenos, compostos hidrofóbicos que apresentam efeitos sinérgicos
sobre outros compostos solubilizando-os e facilitando sua passagem através das membranas
(RATTAN, 2010).
2.5 Ácaro-da-necrose Aceria guerreronis
O ácaro-da-necrose A. guerreronis (Acari: Eriophyidae) (Figura 3) foi descrito por
Keifer em 1965 a partir de amostras coletadas no estado de Guerrero, no México, sendo
depois encontrado em vários outros países do continente americano, africano e asiático
(KEIFER, 1965; MARIAU, 1977; FERNANDO et al., 2002; MORAES & FLECHTMANN,
2008). No Brasil, o primeiro relato desse ácaro foi feito no estado do Rio de Janeiro em 1964
(ROBBS & PERACCHI, 1965). Posteriormente o ácaro foi relatado em Pernambuco, causando
necrose no meristema e morte das mudas (AQUINO & ARRUDA, 1967). Atualmente, o ácaro-
da-necrose é considerado praga-chave em todas as regiões brasileiras (FERREIRA et al., 2002)
Esse ácaro, quando adulto, mede aproximadamente 255 μm de comprimento, possui corpo
vermiforme, coloração branco-leitosa ou levemente amarelada e brilhante, possuindo apenas dois
pares de pernas (MOORE & HOWARD, 1996). As fêmeas ovipositam por até 15 dias,
colocando em média, 66 ovos, os quais são pequenos, hialinos e de formato oval. Antes de
atingir a fase adulta, os indivíduos passam pelos estádios de ovo, larva e ninfa com durações
de 2,5 a 3,5 dias, 1,5 a 2,5 dias, e 2,0 dias, respectivamente (a 28 ± 2˚C de temperatura e 80%
de umidade relativa). Os ácaros apresentam um período de imobilidade de 1,0 a 1,5 dias entre
as fases de ninfa a adulto. No total, o período de ovo a adulto dura em torno de 10 dias
(SOBHA & HAQ, 2011).
A população do ácaro-da-necrose diminui em períodos chuvosos e é mais abundante
nos períodos quentes e secos (SOUZA et al., 2012). A temperatura ideal para o
desenvolvimento do ácaro é de 33,6ºC a 40ºC (ANSALONI & PERRING, 2004). O vento é o
principal meio de dispersão entre plantas, enquanto que o caminhamento é a preponderante
forma de migração na mesma planta (GALVÃO et al., 2012).
6
Figura 3. Imagem apresentando o ácaro-da-necrose (Aceria guerreronis).
As colônias do ácaro-da-necrose estão localizadas na região meristemática do fruto
coberta pelas brácteas (ALENCAR et al., 1999) e podem estar presentes em frutos de
diferentes idades (MOORE & ALEXANDER, 1987; FERNANDO et al, 2003; LAWSON-
BALAGBO et al., 2008; GALVÃO et al., 2011). As maiores densidades populacionais
ocorrem aos 4 meses de idade do cacho (FERNANDO et al., 2003; GALVÃO et al., 2011)
com 16% da superfície da fruta danificada e aproxidamente 3000 ácaros por fruto (GALVÃO
et al., 2008). Inicialmente, os danos provocados pelo ácaro são manchas branco-amareladas
de formato triangular na epiderme dos frutos, que posteriormente se expandem e tornam-se
necrosadas (HAQ et al., 2002). Com o crescimento do fruto, a área necrosada apresenta
rachaduras longitudinais, exsudações de resinas e pode ocorrer sua deformação (CARDONA
& POTES, 1971). A queda precoce e intensa dos frutos também é observada (NAIR, 2002).
Eventualmente, esse eriofídeo pode atacar mudas, provocando lesões que se expandem por
toda a folha e, consequentemente, causam a morte da planta (AQUINO & ARRUDA, 1967).
O ataque do ácaro ocasiona perdas significativas em todas as regiões que produzem
coco no mundo, causando diminuição no tamanho, redução de peso, volume de água, albúmen
e no valor comercial dos frutos (MOORE et al., 1989; HAQ et al., 2002; NEGLOH et al,
2011). As perdas ocasionadas pelo ataque do ácaro-da-necrose são variáveis de acordo com o
nível de infestação apresentado no coqueiral. Em Benin, constatou-se 68 a 85% de frutos
danificados com 30-40% da superfície do fruto danificado e na Tanzania 43-81% de frutos
danificados com 30-40% da superfície do fruto danificado (NEGLOH et al., 2011). Segundo
Mariau et al. (1981), altas infestações podem diminuir em 50% o tamanho do fruto. Enquanto
Olivera (1986) constatou redução da copra em 30 a 80%. No Caribe, por ocasião do ataque da
praga a queda prematura dos frutos foi constatada uma variação de perdas entre 10 e 100% no
litoral da Tanzânia e nas ilhas Máfia, em Zanzibar e Pempa foi relatada uma média de 21% de
perdas (SEGUNI, 2002). O controle químico do ácaro-da-necrose é frequentemente utilizado pelos
cocoicultores, no entanto apenas sete produtos sintéticos são registrados no MAPA
(Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento) à base dos seguintes principios ativos:
abamectina, espirodiclofeno, fenpiroximato, hexitiazoxi e azadiractina (AGROFIT, 2016). O
controle químico é geralmente uma prática dispendiosa, especialmente por serem necessárias
aplicações sucessivas. O alto custo transforma essa prática economicamente proibitiva para os
pequenos agricultores (PERSLEY, 1992; MOORE & HOWARD, 1996; RAMARAJU et al.,
2002), que na maioria dos países são os principais produtores de coco. Além disso, o uso
frequente de produtos químicos pode causar sérios problemas para o ambiente e para a
7
utilização de frutos in natura ou de outros produtos do coco para a alimentação (MOORE &
HOWARD, 1996). Sob estas circunstâncias, medidas de controle alternativo são altamente
desejáveis.
8
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Obtenção do material vegetal, dos ácaros e dos monoterpenos timol e carvacrol
Folhas de L. gracilis dos genótipos LGRA-106 e LGRA-109 foram colhidas de plantas
cultivadas na Fazenda Experimental “Campus Rural da UFS”, localizado no município de São
Cristóvão – SE, latitude 11° 00‟ S e longitude 37° 12‟ O.
Os adultos do ácaro-da-necrose A. guerreronis utilizados no trabalho foram coletados
em frutos de coqueiro localizado na Embrapa Tabuleiros Costeiros, latitude 10°57‟ S e
longitude 37°03‟ O. Em laboratório, os ácaros foram mantidos a uma condição de 25 ± 2°C,
60 ± 10% UR e imediatamente utilizados para os bioensaios.
Os compostos timol e carvacrol foram adquiridos da Merck (99% de pureza) e Sigma-
Aldrich (98% de pureza), respectivamente.
3.2 Extração dos óleos essenciais de L. gracilis
A extração dos óleos essenciais de L. gracilis foi realizada por hidrodestilação em
aparelho Clevenger. Cada amostra foi constituída por 75g de folhas secas em estufa de
circulação de ar a 40°C por cinco dias para dois litros de água destilada por 140 min. após o
início da ebulição (EHLERT et al., 2006).
3.3 Análise química do óleo essencial de L. gracilis
As análises dos óleos essenciais dos genótipos LGRA-106 e LGRA-109 de L. gracilis
foram realizadas utilizando um CG/EM/DIC (GCMSQP2010 Ultra, Shimadzu Corporation,
Kyoto, Japão) equipado com um amostrador com injeção automática AOC-20i (Shimadzu).
As separações foram realizadas em uma coluna capilar de sílica fundida Rtx®-5MS Restek
(5%- difenil-95%-dimetilpolisiloxano) 30 m x 0,25 mm de diâmetro interno, 0,25 mm de
espessura de filme, em um fluxo constante de Hélio 5.0 com taxa de 1,0 mL min-1
. A
temperatura de injeção foi de 280 °C, 1,0 μL (10 mg mL-1
) de amostra foi injetado, com uma
razão de split de 1:30. A programação de temperatura do forno iniciou-se a partir de 50 °C
(isoterma durante 1,5 min), com um aumento de 4 °C min-1
, até 200 °C, em seguida, a 10 °C
min-1
até 300 °C, permanecendo por 5 min. Para o CG/EM as moléculas foram ionizadas por
ionização por elétrons com energia de 70 eV. Os fragmentos analisados por um sistema
quadrupolar programado para filtrar fragmentos/íons com m/z na ordem de 40 a 500 Da e
detectados por um multiplicador de elétrons. O processamento de dados foi realizado com
software CGMS Postrun Analysis (Labsolutions- Shimadzu). O processo de ionização para o
CG/DIC foi realizado pela chama proveniente dos gases hidrogênio 5.0 (30 mL min-1
) e ar
sintético (300 mL min-1
). O processamento de dados foi realizado utilizando o software CG
Postrun Analysis (Labsolutions- Shimadzu).
A identificação dos constituintes foi realizada com base na comparação dos índices de
retenção da literatura (ADAMS, 2007). Para o índice de retenção foi utilizando a equação de
Van den Dool e Kratz 1963 em relação a uma série homóloga de n-alcanos (nC9- nC18).
Também foram utilizadas três bibliotecas do equipamento WILEY8, NIST107 e NIST21 que
permitiu a comparação dos dados dos espectros com aqueles constantes das bibliotecas
utilizando um índice de similaridade de 80%.
3.4 Toxicidade
O experimento foi realizado no laboratório de entomologia da Embrapa Tabuleiros
Costeiros, Aracaju - SE. Para estimar as concentrações letais dos óleos, foram preparadas
arenas com pedaços do perianto de frutos de coqueiro jovem imersos em ágar (5%) e 0,3% de
9
metil parabeno como fungicida (Nipagim®) e água destilada depositados em placa de Petri
(10 cm de diâmetro). Após a solidificação do meio, oito discos de 1 cm de diâmetro foram
perfurados até o contato com a epiderme do fruto. Posteriormente, as placas foram
pulverizadas com concentrações crescentes dos óleos essenciais de L. gracilis genótipo
LGRA-106 (0,1%, 0,3%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 1% e 1,2%) e genótipo LGRA-109 (0,1%, 0,5%,
1%, 2%, 2,5%, 3%, 3,5%, 4,5% e 5%) dissolvidos em Tween 20 (0,5% v/v). Foram
pulverizados também os compostos majoritários timol, adquirido da Merck, (0,05%, 0,2%,
0,6%, 1%, 1,5% e 1,7%) e carvacrol, adquirido da Sigma-Aldrich, (0,1%, 0,3%, 0,5%, 0,7%,
1%, 1,5% e 2%) diluídos em acetona (Vetec Quimica Fina).
Para as pulverizações utilizou-se uma torre de Potter (Burkard, Rickmansworth, Reino
Unido) a uma pressão de 5 psi/pol2 e um volume de calda de 1,7 mL para os óleos essenciais
de L. gracilis e 9,3 mL para os compostos majoritários, timol e carvacrol, o que corresponde a
um depósito de 1,8 ± 0,1 mL/cm2. Na sequencia, as placas foram mantidas em local escuro
por 1 hora e em seguida foram colocados 30 adultos do ácaro-da-necrose por arena,
totalizando 240 ácaros por tratamento. As placas foram mantidas em uma BOD a 28°C ±2°C,
umidade relativa do ar de 80% ± 2°C e fotofase de 12 h.
O número de ácaros vivos e mortos foi registrado após 24 h da pulverização. Os
ácaros foram considerados mortos quando em contato com o pincel não responderam ao
estímulo. Para o controle, arenas foram pulverizadas com Tween 20 (0,5% v/v) para os
experimentos com os óleos essenciais e com acetona para os experimentos com os compostos
majoritários.
3.5 Repelência
O experimento foi realizado no laboratório de entomologia da Embrapa Tabuleiros
Costeiros, Aracaju - SE. Arenas foram preparadas conforme descrição anterior com a
diferença de que cada uma foi constituída de uma área tratada e uma área não tratada, a qual
foi coberta com duas camadas de fita adesiva durante a pulverização (adaptada de TEODORO
et al., 2009). As arenas foram pulverizadas com as soluções da CL50 e CL99 dos óleos
essenciais dos dois genótipos de L. gracilis e dos compostos majoritários timol e carvacrol,
definidas nos bioensaios anteriores. Após a secagem da solução, um ponto de cola branca foi
disposto no centro do disco (1,0 x 1,0 x 0,5cm3). Adultos do ácaro-da-necrose foram
individualmente posicionados sob o ponto da cola branca e avaliações de seu posicionamento
foram realizadas após 1 e 24h. Foram realizadas três repetições para cada tratamento, sendo
que cada repetição foi constituída por um conjunto de 20 ácaros, totalizando 60 ácaros por
tratamento.
3.6 Análise estatística
A Fórmula de Abbott (1925) foi utilizada para correção da mortalidade dos ácaros
nos bioensaios de concentração letal em relação ao controle. Análises de Probit (Finney,
1971) foram realizadas para determinar as concentrações letais dos genótipos ao ácaro. As
concentrações letais dos bioensaios de toxicidade (CL50 e CL90) e os seus respectivos
intervalos de confiança a 95% de probabilidade, foram obtidos utilizando o software SAEG,
versão 9.1 (2007).
O Índice de Repelência (IR) foi calculado pela fórmula: IR =2G/G+P, adaptado do
Índice de Preferência (PI) de Kogan and Goeden (1970), onde G é o número de ácaros no
tratamento e P é o número de ácaros no controle. O intervalo de segurança utilizado para
considerar se o óleo ou o composto foi ou não repelente foi obtido a partir da média dos IR
calculado e seu respectivo desvio padrão (DP), de acordo com os seguintes critérios: média do
IR<1 – DP, o óleo essencial ou o composto é repelente; média>1 + DP, o óleo ou o composto
é atraente e se a 1 – DP<média<1 + DP, o óleo ou o composto é considerado neutro.
10
4. RESULTADO
4.1. Composição química
Trinta compostos foram identificados para o genótipo LGRA-106 e 31 compostos para
o acesso LGRA-109, representando 100% do total dos componentes. Para o genótipo LGRA-
106 verificou-se a presença do timol como composto majoritário (52,43%) seguido do metil-
timol (10,82%) e do E-cariofileno (8,35%). O genótipo LGRA-109 apresentou o composto
carvacrol como majoritário (49,36%) seguido do ρ-cimeno (11,29%) e do γ-terpineno
(10,11%) (Tabela 1).
Tabela 1. Composição química dos óleos essenciais dos genótipos LGRA-106 e LGRA-109
de Lippia gracilis.
Genótipos
Compostos IRRl IRRo LGRA-106 (%DIC) LGRA-109 (%DIC)
α-Tujeno 924 915 1,18 1,20
α-Pineno 932 923 0,49 0,29
Cânfeno 946 938 - 0,14
Sabineno 969 962 0,21 0,10
β-Pineno 974 974 0,21 0,10
Mirceno 988 977 3,20 1,58
α-Felandreno 1002 993 0,11 0,14
3-δ-Careno 1008 999 0,13 0,10
α-Terpineno 1014 1005 1,26 1,79
ρ-Cimeno 1020 1013 7,16 11,29
Limoneno 1024 1017 0,53 0,48
1,8-Cineol 1026 1021 2,91 0,36
(Z)-β-Ocimeno 1032 1034 0,14 -
γ-Terpineno 1054 1047 5,56 10,09
Hidrato de(Z)-Sabineno 1065 1055 - 0,47
(E)-4-Tujanol 1065 1056 0,33 -
Linalol 1095 1086 0,52 0,65
Cânfora 1141 1136 - 0,45
Terpinen-4-ol 1174 1167 0,67 0,48
α-Terpineol 1186 1181 0,22 -
Metil timol 1232 1221 10,81 4,40
Metil carvacrol 1241 1230 - 0,19
Timol 1289 1281 52,41 3,05
Carvacrol 1298 1288 0,87 49,35
δ-Elemeno 1335 1327 0,11 0,46
Acetato de timol 1349 1339 0,10 -
Acetato de carvacrol 1349 1358 - 0,54
(E)-Cariofileno 1417 1415 8,36 6,79
α-E-Bergamoteno 1432 1424 0,12 0,46
Aromadendreno 1439 1434 0,17 0,24
α-Humuleno 1452 1449 0,43 0,40
Biciclogermacreno 1500 1491 0,61 2,46
Espatulenol 1577 1575 0,15 0,58
Óxido de cariofileno 1582 1582 0,52 0,75
Viridiflorol 1592 1591 0,52 0,64 IRRl - índice de retenção da literatura; IRRo - índice de retenção observado.
11
4.2. Toxicidade
O óleo essencial do genótipo LGRA-106 apresentou toxicidade maior (4,736 – 8,31
µL/mL) que o óleo essencial do genótipo LGRA-109 em ambas estimativas de concentrações
(30,99 – 42,18 µL/mL). O monoterpeno carvacrol (6,84 – 19,49 µL/mL) foi mais tóxico que o
óleo essencial do genótipo LGRA-109 (30,99 – 42,18 µL/mL) nas duas concentrações
estimadas, que o tem como composto majoritário. No entanto o óleo essencial do genótipo
LGRA-106 e o monoterpeno timol apresentaram o mesmo padrão de toxicidadena
estimativada CL50 e na estimativa da CL90 o óleo essencial do genótipo LGRA-106 foi duas
vezes mais tóxico que o timol. Entre os monoterpenos o timol (5,34 µL/mL) foi mais tóxico
que o carvacrol (6,84 µL/mL) na estimativa da CL50, mas nas estimativas da CL90 os
monoterpenos apresentaram o mesmo padrão de toxicidade (Tabela 2).
4.3. Repelência
Adultos do ácaro-da-necrose foram repelidos nas CL50 e CL90 após 1 e 24 horas de
exposição nos tratamentos com o óleo essencial do genótipo LGRA-106 e com o
monoterpeno carvacrol. O óleo essencial do genótipo LGRA-109 apesentou efeito neutro
apenas na avaliação após 1h da CL50 (30,99 µL/mL), sendo repelente na outras concentrações
e avaliações e no tratamento com o monoterpeno timol o efeito de repelência foi considerado
repelente após 1 hora de avaliação e neutro após 24 horas de avaliação nas concentrações
testadas, tendo a média do índice de repelência se situado entre 1-DP e 1+DP (Tabela 3).
12
Tabela 2. Estimativas das concentrações letais (CL50 e CL 90) de óleos essenciais de dois genótipos de Lippia gracilis (LGRA-106 e LGRA-109) e seus
compostos majoritários timol e carvacrol sobre Aceria guerreronis após 24h de exposição.
Tratamento β CL50 (95% IC)
(µL/mL)
CL90(95% IC)
(µL/mL)
CL99(95% IC)
(µL/mL) X
2 GL P
LGRA 106 5,24 4,73 (4,37-5,07) 8,31 (7,63-9,25) 13,18 (11,48-15,90) 1.58 2 0,544
LGRA 109 9,55 30,99 (29,91-32,03) 42,18 (40,27-44,76) 54,33 (50,39-60,08) 1,09 3 0,781
Timol 2,27 5,34 (4,51-6,28) 19,50 (15,59-25,99) 56,35 (39,82-90,09) 1,84 2 0,600
Carvacrol 2,81 6,84 (5,99-7,79) 19,49 (16,17-24,89) 45,97 (34,33-68,57) 0,42 2 0,810
Valores médios obtidos (n=8 repetições com 30 ácaros adultos por repetição). As concentrações letais estimadas (LC50 e CL90) e os valores (µL/mL) para cada óleo essencial foram
estimadas usando análise probit. IC= Intervalo de confiança a 95% de probabilidade, X2= Qui-quadrado, GL= Grau de liberdade, P= Probabilidade (p≤0.05).
13
Tabela 3. Repelência dos óleos essenciais dos genótipos de Lippia gracilis e seus compostos
majoritários ao ácaro-da-necrose após 1 e 24 h de exposição.
Tratamento Tempo Concentração
Letal (µL/mL) IR SE 1+DP 1-DP Classificação
LGRA-106
1h CL50=4,73 0,367 0,111 1,153 0,847 Repelente
CL99=13,81 0,300 0,000 1,000 1,000 Repelente
24h CL50=4,73 0,533 0,044 1,058 0,942 Repelente
CL99=13,81 0,367 0,178 1,252 0,748 Repelente
LGRA-109
1h CL50=30,99 0,667 0,289 1,379 0,621 Neutro
CL99=54,33 0,800 0,067 1,100 0,900 Repelente
24h CL50=30,99 0,867 0,089 1,115 0,885 Repelente
CL99=54,33 0,900 0,067 1,100 0,900 Repelente
Timol
1h CL50=5,34 0,633 0,111 1,153 0,847 Repelente
CL99=56,35 0,500 0,133 1,173 0,827 Repelente
24h CL50=5,34 0,733 0,289 1,404 0,596 Neutro
CL99=56,35 0,933 0,156 1,208 0,792 Neutro
Carvacrol
1h CL50=6,84 0,400 0,067 1,100 0,900 Repelente
CL99=45,97 0,367 0,044 1,058 0,942 Repelente
24h CL50=6,84 0,467 0,044 1,058 0,942 Repelente
CL99=45,97 0,600 0,067 1,100 0,900 Repelente
IR= Índice de repelência; DP= Desvio padrão; SE= Erro padrão da média
14
5. DISCUSSÃO
Estudos demonstram variações quantitativas na composição química do óleo de L.
gracilis. É provável que esta variação esteja associada à diferença genética entre populações
de Lippia, ao estádio de desenvolvimento, e a idade da planta, a parte da planta a qual o óleo
foi extraído e também a fatores ambientais, como características de solo e localização
geográfica (BLANK, 2013). Estudos realizados com Lippia sob diferentes condições
edafoclimáticas relatam alterações na composição dos compostos majoritários. Lemos et al.
(1992) verificaram que o óleo essencial de folhas de L. gracilis coletadas no estado do Ceará
apresentou o timol (30,6%), carvacrol (11,8%) e ρ-cimeno (10,7%) como compostos
majoritários. No estado do Piauí, Matos et al. (1999) relataram que o óleo obtido de folhas de
L. gracilis apresentou o carvacrol (47,7%), ρ-cimeno (19,2%) e metil-timol (6,2%) como
componentes majoritários. Em Sergipe, na cidade de Tomar do Geru, o óleo analisado de
folhas de L. gracilis por Teles et al. (2010) apresentou como composto majoritário o timol
(24%), seguido do ρ-cimeno (15,9%) e do metil timol (11,7%).
Os óleos essenciais dos genótipos LGRA-106 e LGRA-109 foram tóxicos ao ácaro-da-
necrose, assim como os monoterpenos isolados timol e carvacrol. Plantas do gênero Lippia
apresentam atividade tóxica a diversos insetos (GLEISER & ZYGADLO, 2007; NGAMO et
al., 2007), atividade acaricida (CAVALCANTI et al., 2010; MOREIRA et al., 2016) e
atividade carrapaticida (LAGE et al., 2013; GOMES et al., 2014). A atividade isolada do
timol e carvacrol também é conhecida por apresentar efeitos tóxicos a diversos insetos, ácaros
e carrapatos (LINDBERG et al., 2000; HUMMELBRUNNER & ISMAN, 2001; SCORALIK
et al., 2012; SZCZEPANIK et al., 2012).
O monoterpeno timol (Merck® 99% de pureza - CL50= 5,34 µL/mL-1
), composto
majoritário do genótipo LGRA-106, foi mais tóxico ao ácaro-da-necrose que o monoterpeno
carvacrol (Sigma-Aldrich® 98% de pureza - CL50=30,99 µL/mL), presente no genótipo
LGRA-109, porém na avaliação da estimativa da CL90 apresentaram o mesmo padrão de
toxicidade. Quando avaliado isoladamente, o timol (CL50= 5,34 µL/mL) (Merck® 99% de
pureza) não apresentou diferença significativa em relação ao genótipo LGRA-106 (CL50=
4,73 µL/mL), porém quando avaliado as estimativas da CL90 do óleo essencial do genótipo
LGRA-106 (CL90= 8,31 µL/mL) e do timol (CL90= 19,50 µL/mL) observamos que o óleo
essencial foi duas vezes mais tóxico que o monoterpeno timol, portanto podemos atribuir à
toxicidade do genótipo LGRA-106 à interação entre o composto majoritário timol associado
aos outros componentes químicos presentes no óleo essencial, caracterizando o efeito de
sinergismo. Efeitos sinérgicos de misturas complexas são considerados importantes na defesa
das plantas contra herbivoria (HUMMELBRUNNER & ISMAN, 2001). Embora a
bioatividade de óleos essenciais seja geralmente atribuída a alguns compostos particulares,
um fenômeno sinérgico entre estes metabolitos podem resultar em uma maior bioatividade em
comparação com os componentes isolados (HUMMELBRUNNER & ISMAN, 2001; GILLIJ
et al., 2008). Estudos demonstram que misturas binárias de compostos de óleos essenciais
apresentam maior potencial inseticida quando comparado com os compostos puros (LAURIN
& MURRAY 2001; LIU et al., 2006; SINGH et al., 2009). Ao contrário do timol, o composto
carvacrol (Sigma-Aldrich® 98% de pureza - CL50=6,84 µL/mL-1
), quando aplicado
isoladamente, apresentou toxicidade superior ao óleo essencial LGRA-109 (CL50=30,99
µL/mL-1
), demonstrando ação antagonista entre o carvacrol e os demais componentes
químicos presentes no óleo essencial. Antagonismo ocorre quando duas ou mais substancias
interagem em solução reduzindo o efeito de uma delas. Exemplo de antagonismo foi
observado em folhas de D. angustifolia que possuem algum constituinte, ou mistura de
constituintes, em seu óleo essencial que provoca antagonismo a formigas do gênero
Acromyrmex spp. (MENEGHETTI et al., 2015).
Para um controle eficaz de pragas deve-se avaliar além dos efeitos letais os efeitos
sub-letais sobre as pragas. Efeitos subletais são definidos como efeitos (tanto fisiológicas ou
15
comportamentais) sobre os indivíduos que sobrevivem à exposição a um pesticida (a
dose/concentração de um pesticida pode ser subletal ou letal) (DESNEUX et al., 2007).
Um efeito subletal é a repelência causada por inseticidas/acaricidas botânicos (Isman,
2011). Os óleos essenciais dos genótipos de L. gracilis e o monoterpeno carvacrol foram
considerados repelentes, apresentando índices de repelência menores que o limite 1-DP,
sugerindo que ácaros detectaram a presença das substâncias tóxicas afastando-se da área
tratada com o óleo ou o efeito destes produtos pode causar irritabilidade aos ácaros quando
entram em contato com a área tratada, levando-os a se afastarem (LOCKWOOD et al., 1984;
CORDEIRO et al., 2010), porém o óleo essencial do genótipo LGRA-109 apresentou efeito
neutro quando aplicado a concentração menor na avaliação com 1 hora. Outros estudos com
plantas do gênero Lippia demostraram o efeito repelente do óleo essencial sobre Anopheles
gambiae (Diptera: Culicidae) (OMOLO et al., 2004) e Tribolium castaneum (Coleoptera:
Tenebrionidae) (CABALLERO-GALLARDO et al., 2011) e efeito repelente do monoterpeno
carvacrol sobre o carrapato Ixodes scapularis (DIETRICH et al., 2006). O monoterpeno timol
apresentou efeito neutro ao ácaro-da-necrose na avaliação com 24 h, porém na avaliação com
1 hora e quando está associado aos outros compostos presentes no óleo essencial do genótipo
LGRA-106 o efeito foi classificado como repelente, reforçando a hipótese de que houve
sinergismo entre os componentes do óleo essencial de L. gracilis, genótipo LGRA-106. Uma
possível justificativa para a diminuição da atividade repelente com o aumento do tempo de
exposição do ácaro ao timol é a alta volatilização desse monoterpeno que causa uma ação
repelente relativamente rápida, agindo por curto período de tempo (TRONGTOKIT et al.,
2005; SEO et al., 2008). O efeito repelente é de importância fundamental para o ácaro-da-
necrose, considerando que suas colônias apresentam localizadas sob o perianto, uma vez que
resíduos de acaricidas podem agir sobre adultos do ácaro-da-necrose, quando estes deixam a
proteção do perianto para dispersão (MONTEIRO et al., 2012; MELO et al., 2012). A
repelência combinada com a mortalidade é uma propriedade importante a ser considerada na
escolha de um produto para o controle de pragas. De modo geral, quanto maior a repelência
menor será a infestação, diminuindo, assim, as perdas causadas pelo ácaro-da-necrose.
16
6. CONCLUSÕES
O óleo essencial do genótipo LGRA-106 foi mais tóxico que o óleo essencial do
genótipo LGRA-109.
Efeito de sinergismo entre os compostos químicos do óleo essencial de LGRA-106 foi
detectado por ser 2,3 vezes mais tóxico ao ácaro-da-necrose do que seu composto majoritário
timol na CL90.
Os óleos essenciais dos genótipos LGRA-106 e LGRA-109 apresentam atividade
repelente ao ácaro-da-necrose.
Efeito de sinergismo foi identificado entre os compostos químicos do óleo essencial do
genótipo LGRA-106, potencializando a ação acaricida sobre o ácaro-da-necrose.
17
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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