Caracterização de genes de resistência a insetos

Marcelo MenossiLaboratório de Genoma Funcional

Centro de Biologia Mol. Engenharia Genéticahttp://cafe.cbmeg.unicamp.br

Coffea arabica (75%) e Coffea canephora (25%)

13 estados produtores

9 milhões de empregos diretos e indiretos

2 bilhões de dólares em receita

2 milhões de hectares

150 cooperativas e empresas exportadoras registradas

1.500 indústrias de torrefação e moagem

Segundo país maior consumidor do produto

Café no Brasil

Nematódeos

Meloidogyne sp.

Fungos

Ferrugem do café (Hemileia vastatrix)

Insetos

Broca do Café (Hypothenemus hampei)

Bicho mineiro (Leucoptera coffeella)

Estresse Biótico e o Café

Ciclo de vida do bicho mineiro

Incubação dos ovos à eclosãoDas lagartas - 4 a 6 dias

Desenvolvimento da lagarta - 7 a 11 dias (dano)

Mariposa

Oviposição

 Formação da crisálida

Eclosão da lagarta

Duração da fase pupal – 5 a 8 dias

Duração da fase adulta - 5 a 20 dias (fêmeas)

Instituto Agronômico de Campinas

- Hibridações entre C. arabica e C. racemosa (resistente)

- Avaliação da quinta geração de retrocruzamentos

Indivíduos resistentes e suscetíveis

Cultivares resistentes

Defesa Constitutiva- Barreiras Físico-químicas

Defesa Induzida - Expressão gênica

Transdução de sinal

Reparação do tecido

Ajuste metabólico

Inibição do crescimento do predador

Defesas contra herbivoria

Identificar e caracterizar a expressão de genes que possam estar relacionados com a expressão da resistência do cafeeiro ao bicho-mineiro

Avaliar esses genes como possíveis marcadores moleculares de resistência ao bicho-mineiro

Objetivos

Arranjos de DNAArranjos em lâmina - MicroarraysArranjos em membrana - Macroarrays

Arranjos de DNA

**

*

**

***

****

******** ****

********

****

Sonda células controle Sonda células tratadas

**

**

**

****

Hibridação

Macroarray A1 Macroarray A2

Detecção do sinale análises

**

768 ESTs duplicata12 x 8,5 cm

Bibliotecas de subtração

Enriquecidas em cDNAs diferencialmente expressos

Driver Tester

Sem amplificação

Amplificação Exponencial

Amplificação Linear

EliminadoEliminado

Driver Driver e Tester

Tester

Tester Enriquecido

genes seminteresse

genes deinteresse

Resultados

Avaliação do nível de resistências das plantas

11 22

3344

Resistentes

Suscetíveis

Experimento de infestação

R S

Resistentes e Suscetíveis

3 dias pós infestação (oviposição)

7 dias pós infestação (eclosão)Ro e So

Re e Se

Rc e ScControle (sem infestação)

C O E C O E

Estratégia - Biblioteca de Subtração

Tester(genes de interesse)

Driver(genes descartáveis)

Genes induzidos preferencialmente nas resistentes pós infestação

Resistente após oviposição +

Resistente após eclosão

Resistente controle

Suscetível controle

Suscetível após oviposição

Suscetível após eclosão

Resultados subtração

DP1 DP2 DP3

•Vários ciclos de subtração

•Não normalizada

•Único ciclo de subtração

•Efeito de normalização

Representational Diference Analysis (RDA)

Supressive Subtraction Hybridization(SSH)

Hibridação com sondas de cDNA

Membranas de náilon contendo 768 clones da biblioteca de

subtração, hibridadas com sondas de cDNA

Resistente - controle Resistente - pós eclosão

SOM- Self Organizing Maps

260 ESTs selecionados.

C O E C O E

Res Sus

Clones Funções hipotéticas e-value Ro/Rc Re/Rc Sc/Rc So/Rc Se/Rc So/Sc Se/ScSSH203F09 O-sialoglicoprotease Arabidopsis thaliana 1,00E-12 4,3 0,6 0,8 1,1 0,1 1,4 0,2SSH103H03 Proteína hipotética domínio metaloprotease Arabidopsis thaliana 5,00E-31 3,1 0,4 0,7 0,8 0,1 1,1 0,1SSH103F12 Proteína RD22 Domínio BURP Prunus persica 3,00E-13 2,7 0,4 0,6 0,9 0,2 1,4 0,2SSH203E09 GST T3 Lycopersicon esculentum 2,00E-57 3,6 0,9 0,6 1,4 0,7 2,2 1,1SSH104C02 Albumina Domínio Kunitz STI Theobroma cacao 5,00E-13 3,5 0,6 0,9 1,9 0,2 2,1 0,2SSH101B04 Miraculina Domínio Kunitz STI Youngia japonica 6,00E-09 3,6 0,7 0,7 1,5 0,3 2,2 0,4SSH202E06 Proteína relacionada a tumor Domínio Kunitz STI Nicotiana tabacum 3,00E-11 3,4 0,6 0,3 1,2 0,2 3,6 0,6SSH203H02 4-Difosfocitidil-2C-metil-D-erithritol sintase Arabidopsis thaliana 8,00E-38 3,2 0,7 0,8 1,3 0,4 1,6 0,6SSH202G05 Acetil COA sintetase Arabidopsis thaliana 8,00E-49 3,4 0,6 0,4 1,1 0,2 3,1 0,6SSH101B03 Glutamato decarboxilase Lycopersicon esculentum 1,00E-44 2,8 0,7 0,7 1,3 1,0 1,9 1,4SSH203G02 Proteína Domínio SET Nicotiana tabacum 2,00E-27 2,6 0,8 0,8 1,2 0,6 1,7 0,8SSH201D09 Peptidase sinal microsomal 25 kDa Arabidopsis thaliana 4,00E-13 3,6 0,5 0,8 1,2 0,1 1,5 0,2SSH104G04 Proteína de membrana de troca Na/Ca dependente de potássio 6,00E-11 3,1 0,6 0,5 1,3 0,3 2,9 0,6

DP302B11 Endoquitinase Ácida Lupinus albus 2853142|emb|CAA76203.1| (Y16415) class III chitinase [Lupinus albus]4,00E-31 3,9 1,4 0,3 1,1 4,7 3,5 14,6

Genes Induzidos (exemplos)

16,5% de clones de RDA (143) – alta redundância

17 % dos clones do SSH (117) – baixa redundância

Confirmação por northern blot

SSH104G04 Na/Ca trocador

0

10

20

30

40

Rc Ro Re Sc So Se

Tratamentos

Sin

al

DP3 102 B11 Quitinase

0

5

10

15

20

25

30

Rc Ro Re Sc So Se

Tratamentos

Sin

al

Miraculin SSH101B04

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Rc Ro Re Sc So Se

Treatments

Sig

nal

(arb

itra

ry u

nit

)

SPC25 SSH201D09

0

20

40

60

80

100

120

140

Rc Ro Re Sc So Se

Treatments

Sig

nal (arb

itra

ry u

nit

)

CAX9-like SSH104G04

0

5

10

15

20

25

30

35

40

Rc Ro Re Sc So Se

Treatments

Sig

nal (arb

itra

ry u

nit

)

Chitinase class I I I DP3102B11

0

5

10

15

20

25

Rc Ro Re Sc So Se

Treatments

Sig

na

l (a

rbit

rary

un

it)

psaH SSH202H06

0

20

40

60

80

100

120

140

160

Rc Ro Re Sc So Se

Treatments

Sig

nal (a

rbit

rary

unit

)

BEL1 SSH202C10

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

Rc Ro Re Sc So Se

Treatments

Sig

nal (arb

itra

ry u

nit

)

Rc Ro Re Sc SeSo

SSH 101B04SSH 201D09SSH 104G04

SSH 202H06SSH 202C10

DP3 102B11

RDA- Ideal para amostras com diferença de indução de 10x

SSH- Ideal para amostras contendo muitos transcritos diferencialmente expressos

Análise da estratégia Subtração + Macroarray

? Tente conhecer seu modelo experimental

Falso positivos

260 genes diferencialmente expressos

Epiderme Mesofilo TRÁFICO INTRACELULAR

Peptidase sinal SECY

METABOLISMODE AMINOÁCIDOS,

AÇÚCARES E VITAMINAS

METABOLISMO

SECUNDÁRIO

ESTRESSE OXIDATIVO

PROTEÓLISE

PROTEÍNAS

EFETORAS

Glutamato decarboxilaseTiamina sintaseAcetil COA sintase

GSTCatalasepsaH

Fosfocitidil sintaseFlavonol transferase

QuitinasesInibidor de protease

Metaloprotease

FUNÇÃODESCONHECID

ANo hitsUnknown protein

TRANSDUÇÃO DE SINAL

GTPase, Quinases, Trocador Na/Ca

FATORES DE TRANSCRIÇÃO

MYB, Homeoproteína BELL

Proteína associada à senescênciaRD22 – Proteína anti-seca

ESTRESSE ABIÓTICO

Oviposição

Eclosão

?

Modelo inicial das defesas da planta

Próximas etapas

Análise da expressão dos genes diferencialmente expressos

Análise de segregação em Southern blot de plantas resistentes e suscetíveis

Equipe

CBMEG - Unicamphttp://cafe.cbmeg.unicamp.br

Jorge Mondego (Dr.)Juliana de Maria Felix (Dr.)Rodrigo Drummond (Dr.) Renato Vicentini (IC)Cristiane Rocha (IC)Melina P. Duarte (IC)

Dr. Marcelo Menossi

IACDr. Oliveiro Guerreiro FilhoDra. Míriam MalufDaniel Ramiro (MSc.)Silvia Chebabi (M.Sc.)

IMECC – UnicampDr. Aluisio S. Pinheiro

IQ-USP Prof. Dra. Mari Cleide SogayarDr. Mario Henrique BengtsonChristian Colin (Dr.)

União Européia

CNC CNC PNP&DPNP&D