cap.25 - Ácidos nucléicos e síntese de proteínas

capíturo 25

Ferramentas paraAchar as FamíliasHá muito tempo a química é chamada de ciôncia central; ela está envolvida em todos os aspectos da vida,Muito do que aprendemos sobrequímica está relacionado com como as coisas funcionam. JÀo;; ã;""*podem ser tratadas em nível molecular, e como os materiais que precisamos no nosso dia-a-dia podem ieraperfeiçoados, ou novos podem ser criados. Das muitas aplicaçõei da química. porém, há uma de dimenJoimportante, que certamente não é das menores, relativa aos trabalhos dJdireitos homanos global e de justiça.Como bem sabemos, em muitas partes do mundo existem situações em que pessoas se sepâraram de sãus pa-rentes devido aos atos cruéis de gueffa ou de terorismo. Alguns cientistas estão rastreandò conexões ae faài-lia, deixadas após esses eventos dolorosos, usando ferramentas modernas de química. Laboratórios como osde M.-C. King (Universidade de'Washington) estão tentando ajudar famflias no reconhecimento, quando sórestos de parentes suspeitos são achados, e reunir pessoas em casos em que as vítimas sobreviveram e elas ouseus familiares estào procurando por laços de parentescos.

A chave paÍa esta ïarefa é o DNA, a impressão digital química, presente em cada tecido de cada indivíduo.Embora a estrutura geral do DNA seja a mesma de uma pessoa para outra lveja o gráfico molecular acima), aevidência de parentesco está presente na seqüência detalhada do DNA de caãa uria. Com o emprego de química relativamente simples, envolvendo corantes fluorescentes ou isótopos radioativos, enzimas de-bacté;astermofíÌicas e outras fontes, eletroforese em gel e um processo chamadò de reação em cadeia da polimerase(PC-R, sigla inglesa), que rendeu a seu inventor o Prêmio Nobel de Química Oe ÍSg: (Seção 25.8;, tornou-sefácil hoje sintetizar milhões de cópias a partir de uma amostra de DÌIIA e elaborar sua ieqúência rápida e con-venientemente. A aplicação dessas ferramentas para a comparação de amostras de DNA àe vítimaJe parentesforrece esperança de que, ao menos em poucos casos, a laiuna entre membros de família será fechaãa.

25.I Introdução25.2 Nucleotídeos e Nucleosídeos25.3 Síntese de Nucleosídeos e Nucleotídeos em Laboratório25.4 O Ácido Desoxirribonuctéico: DNA

?{<25.6Jan

25.8

RNA e Síntese de ProteínasDeterminação da Seqüência de Bases do DNASíntese de Oligonucleotídeos em LaboratórioA Reação em Cadeia pela Polimerase

Ácidos Nucléicos e Síntese de Proteínas 439

25. I lrrRoDuçÃoOs ácidos nucléicos, ácido desoxirribonucléico (DNA, sigla em inglês) e ácido ribonucléico (RNA,

sigla em inglês) são, respectivamente, as moléculas que preservam a informação hereditária e as qgea transcrevem e traduzem, de modo a permitir a síntese de todas as diversas proteínas da célula. Asvezes esses polímeros biológicos encontram-se associados com proteínas e sob esta forma são co-nhecidos como nucleoproteínas.

Boa parüe do conhecimento que temos sobre a preservação da informação genéúca, sobre a forma comoé passada para as sucessivas gerações do organismo e sobre a sua transformação em partes funcionais dacélula provém do estudo dos ácidos nucléicos. Por essas razões, vamos focalizar nossa atenção nas estru-turas e propriedades dos ácidos nucléicos e de seus componentes, nucleoúdeos e nucleosídeos.

25.2 Nucleoríoeos E NucLEosíDEosA degradação branda dos ácidos nucléicos produz suas unidades monoméricas, os compostos cha-

mados de nucleotídeos. Uma fórmula geral de um nucleotídeo e a estrutura específica de um deles,chamado de ácido adenflico, são mostradas na Fig. 25.1.

A hidrólise completa de um nucleotídeo fornece:

1. Uma base heterocíclica, a purina ou a pirimidina.2. Um monossacarídeo com cinco carbonos, a D-ribose ou a 2-desoxi-D-ribose.3. Um íon fosfato.

Baseheterocíclica N

8(,.N

NH,t6

-{ Nti l l

ì-*?'oll s'

Ácido adenilico

(ó)

Fig. 25. | (a) Estrutura geral de um nucleotídeo obtido do RNA. A base heterocíclica é a purina ou apirimidina. Em nucleotídeos do DNA, o açúcar é a 2'-desoxirribose; isto é, o grupo -OH na posição 2'estrí substitúdo por -II. O grupo fosfato do nucleotídeo é mostrado ligado ao C5'; ele pode tambémestar ligado ao C3'. No DNA e no RNA uma ligação fosfodiéster une o C5' de um nucleotídeo ao C3' dooutro. A base heterocíclica estrí sempre ligada ao Cl' por uma ligação B-N-glicosídica. (ó) Ácidoadenflico, um nucleotídeo típico.

A parte central de um nucleotídeo é o monossacarídeo, sempre presente como um anel de cinco mem-bros, isto é, como um furanosídio. A base heterocíclica do nucleoúdeo estí ügada ao C 1 ' da unidade da ribo-se ou da desoxirribose através de uma ligação N-glicosídic4 que é sempre p. O grupo fosfato do nucleotídeoestá presente como fosfoéster, podendo estar ligado ao C5' ou ao C3' . (Nos nucleoídeos os átomos de cm-bono da porção do monossacarídeo são designados por nrímeros com linhas, isto é, 1 ', 2' , 3' etc.)

A remoção do grupo fosfato de um nucleoídeo converüe-o num composto coúecido como nucleosí-deo (Seção 22.I5A). Todos os nucleosídeos que podem ser obtidos do DNA contêm a 2-desoxi-D-ribosecomo seu componente açúcar, e uma das quatro bases heterocíclicas, adenina, guanina, citosina ou timina:

NH, O| ,-Ar-t

z^-ï^Ì ò n I'Ì^*' '1^NANu,

HH

NH, O| ' r\*-"íAo,

H'c"-

i l t i l l\NÂo \NAo

t lHH

Citosina TiminaAdenina Guanina

r (c)u(T),

t*'Ì Ligação

-j,, J B-N-glicosídica

Um nucleotídeo

la)

Piúmidinas

440 Ácidos Nucléicos e Síntese de Proteínas

Os nucleosídeos obtidos do RNA contêm o açúcar D-ribose e a adenina, ou a guanina, ou a citosina.ou a uracila, como base heterocíclica.

otl

Uracila substitui timina nos nucleosídeos óry-t

lïï,ïï:ã::'3;ni"ïHi";Í,lii* \*Aoespeciais de RNA podem ainda conter Ioutras purinas e pirimidinas semelhantes.) H

Uracila(uma pirimidina)

As bases heterocíclicas obtidas dos nucleosídeos podem existir em mais de uma forma tautomérica.As formas que mostramos são as formas predominantes que as bases assumem quando presentes nosácidos nucléicos.

Problema 25. | > Escreva as estruturas das outras formas tautoméricas da adenina, guanina, citosina, timina euracila.

Os nomes e as estruturas dos nucleosídeos encontrados no DNA estão na Fig. 25.2; os encontra-dos no RNA estão naFig.25.3.

Probf ema 25.2 > Os nucleosídeos mostrados nas Figs. 25.2 e 25.3 são estáveis em base diluída. Em ácido diluído.porém, eles sofrem hidrólise râpida, produzindo um açúcar (desoxirribose ou ribose) e uma baseheterocíclica. (a) Que característica estrutural do nucleosídeo é responsável por este compoÍa-mento? (b) Proponha um mecanismo razoâvelpara a hidrólise.

Os nucleotídeos são denominados por diversos modos. Por exemplo, o ácido adenflico (Fig. 25.1)é chamado de ácido 5'-adenílico, para designar a posição do grupo fosfato; também é chamado de5'-fosfato de adenosina ou simplesmente monofosfato de adenosina (AMP, sigla em inglês). O ácido

Guanina

,---

,*ì4ry-"\^r-{

luoclz...o\ ï -N^NH,

L/\NH H/ lHL/H

t lHOH

2'-Desoxiguanosina

Timina

t--F

Fig. 25.2 Nucleosídeos quepodem ser obtidos do DNA.O DNA é desoxigenado naposição 2'. O RNA possuigrupos hidrodla nestaposição. O RNA tem umhidrogênio no lugar dogrupo metila da timina, oque constitui a base uracila(e o nucleosídeo uridina).

HoçH,

HOH2'-Desoxitimidina2'-Desoxicitidina

Adenina

NH"t -

zN=r;^N( l l INâNZ

Ácidos Nucléicos e Sínrese de Proteínas 441

Guanosina

OH OHAdenosina

Fig. 25.3 Nucleosídeos quepodem ser obtidos do RNA.O DNA tem átomos dehidrogênio no lugar dosgrupos hidroxila da ribose(DNA é desoxigenado naposição 2' de sua ribose).

Fig.25.4 Ácido 3',5'-cicloadenílico, suabiossíntese e síntese emlaboratório.

OH OIICitidina

OH OIIUridina

uridflico é também chamado ácido 5'-uridílico, 5'-fosfato de uridina ou monofosfato de uridina (UMp,sigla em inglês), e assim por diante.

Nucleosídeos e nucleotídeos são encontrados em outros lugares além da estrutura do DNA e doRNA. Vimos, por exemplo, que unidades de adenosina fazemparle da estrutura de duas çoenzi-mas importantes, NADH e coenzima A. O 5'-trifosfato de adenosina, é claro, é a importante fontede energia, ATP (Seção 22.18). O composto chamado âcido 3' ,5'-cicloadenflico (óu AMp cícli-co) (Fig. 25.4) é um regulador importante da atividade hormonal. As células sintetizam este com-posto a partir do ATP, pela ação da enzima adenilciclase. Em laboratório, o ácido 3',5,-cicloadenílico pode ser preparado pela desidratação do ácido 5'-adenílico, na presença dedicicloe x i lcarbodi imida.

Ácido 5'-adeníicoAdeniÌciclase^''--ì---l 1í*-^*Pirofosfaro

| |I INH,t t l -Y

)#*

?.,v'$^^,'o:Ë. \ /

l \ \ -Jo \ l I'o oH

bodiimida

Quando o ácido 3', 5'-cicloadenflico é tratado com hidróxido de sódio aquoso, o produtoprincipal obtido é o ácido 3'-adenílico (fosfato de 3'-adenosina) em vez do ácido 5'-adenílico.Sugira uma explicação para o curso desta reação.

Problema 25.3 >


25.3 SíNTEsE DE NucLEosíDEos E NucLEoríDEos EMLaeoRAroRto

Vários métodos foram desenvolvidos para a síntese de nucleosídeos. Uma tecnica emprega rea-

ções que constroem o nucleosídeo a partir de derivados da ribose e de bases heterocíclicas ativados

e proiegidos adequadamente. Um exemplo é a seguinte síntese da adenosina a partir do cloreto de

ribofuranosila protegido e da cloromercuripurina.

oil

NHCCH3

,f-rí\* - Hecr".- l - \ l l I

\^*oI

HgClcH3roo

orcH3o

ïNHCCH3

? 1-Êtc\coctHTo\\A*z

SAdenosina( )H'o

\Jt l

cH3co orcH3

Outra técnica envolve a formação da base heterocíclica num derivado da ribosilamina protegido:

otl

c6H5coçH2

NHI

c:o

zlrs oc2Hs

(-2 GrtoH) ------H

23,5-Thi-O-benzoil B-Etoxi'N'B-D-ribofuranosilamina etoxicarbonilacrilamida

CHtlCHI

OC

otlC\

OCC^H.i l " "o

C

otl

c6Hsco

o

Ary-"\-_-,\^

H2 N- --oot

> u.idinuHrO

Ácidos Nucléicos e Síntese de hoteínas M3

Probfema 25.4 > Baseando sua resposta sobre reações que já foram vistas, proponha um mecanismo provável para areação de condensação na primeira etapa da síntese da uridina que acabÍìmos de mostrar.

Uma terceira técnica envolve a síntese de um nucleosídeo com um substifuinte no anel heterocíclicoque pode ser substituído por outros grupos. Este método tem sido muito usado para sintetizar nucleosí-deos incomuns que não ocorrem, necessariamente, nanatureza. O exemplo a seguirutiüzaum derivadoda 6-cloropurina, obtido a partir do cloreto de ribofuranosila apropriado e da cloromercuripurina.

"{

CII

1ìío'u'"'2"{A'..',

\ /

HHO OH

><oH3C CH.'

Grupo pÍotetorisopropilideno

NH"I

)--'í^N

Ì^*"RAdenosina

S

)='rA*-"

\^*zI

R

HI

)-rl\N

Ì^""R

Vários agentes de fosforilação têm sido usados para converter nucleosídeos em nucleotídeos. Umdos mais empregados é o fosfocloridrato de dibenzila.

c6H5cHro\ /o

,zPr.c6HscH2o cl

Fosfocloridrato de dibenzila

Pode-se conseguir a fosforilação específica do grupo -OH em 5' se os grupos -OH em 2' e3' donucleosídeo estiverem protegidos por um grupo isopropilideno (veja a figura a seguir).

otl

(c6HscH2o)2P-cl +

HOçH2Diridina

otl

(c6HscH2o)2PocH HHO-

otlPOCIL

OH\( I ) HrO+, H,O -(2) H,, Pd

oxoCH,H,c

-/

444 Ácidos Nucléicos e Sínrese de Proteínas

Problema 25.5 >

Problema 25.ó >

Elion e Hitchings compârti-lharam o Prêmio Nobel deFisiologia ou Medicina de1988 pelo desenvolümentode agentes qúmioterapêuti-cos derivados da purina.

A hidrólise ácida moderada remove o grupo isopropilideno e a hidrogenólise cliva as ligações fosfa-to de benzila.

(a) Que tipo de ligação está envolvida no nucleosídeo protegido por isopropilideno e por que ela ésensível à hidrólise ácida moderada? (b) Como se pode instalar este grupo protetor?

O esquema reacional a seguir mostra a síntese da cordicepina (um nucleosídeo antibiótico) e aprimeira síntese da 2'-desoxiadenosina (relatada em 1958 por C. D. Anderson, L. Goodman e B.R. Baker, do Instituto de Pesquisa de Stanford).

Níquel de Raney , cordicepina (r)

I

I socl,V

\no\ Níquel de Ranev

, 2,-Desoxiadenosina (II)

Qual é a estrutura da cordicepina? (I e II são isômeros.)Proponha um mecanismo que explique a formação de II.

25.3A Aplicações MedicinaisNo início da década de 50, Gertrude Elion e George Hitchings (dos Laboratórios de Pesquisa

\ü/ellcome) descobriram que a 6-mercaptopurina tinha propriedades antitumorais e antileucêmicas.Esta descoberta levou ao desenvolvimento de outros derivados purínicos e de compostos relaci-onados, incluindo os nucleosídeos de importância medicinal considerável. A seguir têm-se trêsexemplos:

(a)(b)

SH

Nz\'N.'.t l t )=n'^ï

H

6-Mercaptopurina

oII

"\N\--\

t l l )H,N N^{'- l

\or-.,.--OrtAciclovirAlopurinol

A 6-mercaptopurina é usada, em combinação com outros agentes quimioterapêuticos, no trata-mento da leucemia aguda em crianças, pelo qual, quase 807o das crianças tratadas são curadas hoje.O alopurinol, outro derivado da purina, é a droga padrão para o tratamento da gota. O aciclovir, nu-cleosídeo que não possui dois átomos de carbono no seu anel da ribose, é altamente eficiente no tra-tamento de doenças causadas por certos vírus da herpes, dentre os quais o herpes simplex do tipo 1(pênfigo agudo), do tipo 2 (herpes genital) e do herpes zoster (cobreiro).

25.4 O Áctoo DesoxrnRtBoNuclÉtco: DNA

25.4A Estrutura Primária

Os nucleotídeos detêm a mesma relação com os ácidos nucléicos que os aminoácidos detêm comas proteínas; eles são suas unidades monoméricas. As ligações de conexão nas proteínas são gruposamida; nos ácidos nucléicos são as ligações de fosfoésteres. Os fosfoésteres ligam o grupo 3'-OHde uma ribose (ou desoxirribose) ao grupo 5'-OH de outro. Isto faz com que o ácido nucléico tenhauma cadeia longa não-ramificada como uma "espinha dorsal" de unidades de açúcar e de fosfato,

Acidos Nucléicos e Síntese de

Ì",

1*fÌt*A*y'I

pentose-baseAdenina

l5 'o:B-o-çH, o- -N' -O

-o Timina

ourC-.',,A*.-H

lr ^ i^ \--.\^

opentose-base

bsfat

|J ,N-.'Ar.r-"ql t| 5-:-- \*-\-.^-.-

l- l/ \c,,",.i''"Ï:.,*i: -NH, fosfatolo:P-o-cHz

-O K 7 --- '- ' ' . rrr Pentoie-ÌraseFig. 25.5 Segmentohipotético de uma únicacadeia de DNA mostrandocomo os grupos éster defosfato ligam os grupos-OH das posições 3' e 5'das unidades dadesoxirribose. O RNA temestrutura semelhante, comduas exceções: em cadaunidade da ribose umgrupo hidroxila substituium átomo de hidrogênio naposição2'eauraci lasubstitui a timina.

t'Não me surpreenderei seum dia um cientistaentusiasmado batizar seusgêmeos recém-nascidoscomo Adenina e Timina."F. H. C. Crick.*

-O \ / Pentose-base

o:P-o--o

com as bases heterocíclicas saindo da cadeia, em intervalos regulares (Fig. 25.5). Indicaremos a di-

reção das bases, na Fig.25.5, do seguinte modo:

5, <_ A-T-G-C ----> 3,

Como veremos, é aseqüência debases ao longo dacadeia deDNA que contémainformação genética

codificada. A seqüência de bases pode ser determinada através de técnicas baseadas em hidrólises enzi-

máticas seletivas. Paramuitos ácús nucléicos a seqüênciareal das bases jáfoi determinada (Seção 25.6).

25.48 Estrutura Secundária

Foi a proposta, hoje clássica, de Watson e Criçk (feita em 1953 e verificada logo depois porWilkins,

através de análise de raios X) que estabeleceu um modelo para a estrutura secundária do DNA' A

estrutura secundária do DNA é especialmente importante, porque nos permite entender como a in-

formação genética é preservada, cômo ela pode ser continuada durante o processo de divisão celular

" "ornó poãe t". transcrita para fornecer um gabarito para a síntese de proteínas.

Da maior importância para a proposta de Watson e Crick foi uma observação antiga, por E' Char-

gaff (no final dá década dé 40), de que certas regularidades podem ser observadas nas percentagens

ãas bases heterocíclicas obtidas do DNA de uma variedade de espécies. A Tabela 25.1 fornece os

resultados típicos que se obtêm.Chargaffìndicou que, para todas as espécies examinadas:

1. A percentagem molar total das purinas é aproximadÍìmente igual à das pirimidinas, isto é, (7oG *

VoA)l(%oC*VoT)=t.2. A percentagem molar da adenina é quase igual à da timina (isto é, VoN%T :- I), e a percentagem

môl* du gúanina é quase igual à da citosina (isto é' VoGlVoC = I)'

II

*Crick, jmtamente com J. D. Watson e Mauice wilkins, mmpartilhmm o Prêmio Nobel de Fisiologia ou Medicina, em 1962, pela proposta (e pela

ev-ldêrciajú esnutum de duplahélicedo DNA. (De Crick, F. H. C. '"The StÍuctuÍe of the HereditaÍy Material;' Sci. Am,1954, 191 (10)' 20' 54-61 )

446 Ácidos Nucléicos e Síntese de PÍoteínas

Tabela 25. I Composição do DNA de Várias Espécies

Proporções das Bases (7o molar)

G+AC+T

A+TG+C

A

T

G

Espécie TcG

Sarcina luteaEschertchia coliKl2Germe de trigoTimo bovinoStaphylococcus aureusTimo humanoFígado humano

37,r24,9) ) '7

21,52t,0t9,919,5

13,426,0

28,230,830,930,3

37,r) \J

)) Ra

)t \a

19,019,819,9

12,423,927,r27,829,229,4?o?

t,021,081,000,961,1 11,010,98

o?51,001,191,271,501<t

1 <^

1,081,091,011,011,051,0s1,00

1,000,991,000,961,1 11,010,98

'Citosina + meúlcitosina.Fonte: Smith, E. L.; Hill, R. L.; khman, I. R.; Lefkowitz, R. J.; Handler, P. e White, A. Princìples of Biochemistry:

General Aspects, 7." ed.; McGraw-Hill: Nova York ' 1983; p' 132'

Chargaff também notou que arazáo que vaÍia de espécie para espécie é (VoA + VoT)l(VoG * VoC).

Alénidisso, observou qoè "tta

tazão é caÍacteística do DNA de uma dada espécie, qu9 o mesmo

DNA é obtido de diferóntes tecidos do mesmo animal, e que este DNA não varia apreciavelmente

com a idade ou com as condições de crescimento de organismos individuais de uma mesma espécie-'Watson e Crick também possuíam dados de raios X que lhes forneceram os comprimentos e os

ângulos das ligações dos anèis purínicos e pirimidínicos de compostos modelados. Além disso, ti-

úam os dados de Wilkins, qo" indi.uuu-ummódulo derepetição muito longo(344) no DNA natural.

Raciocinando sobre estei dados, Watson e Crick propuserÍIm uma dupla hélice como modelo para

a estmtura secundária do DNA. De acordo com este modelo, duas cadeias de ácido nucléico são man-

tidasjuntas por ligações hidrogênio entre pares de bases de fitas opostas. Esta cadeia dupla é enros-

cadaãob a fõrmaãe nelice, colm ambas aJcadeias dividindo o mesmo eixo. Os pares de base ficam

na parte interna da hélice e o esqueleto açúcar-fosfato fica na parte extema (Fig.25.6)' O passo da

Sulcow

H

@o

@cadeia do Íosfato-

@CeNnasbases

,ruW

P

-r"3,4 AI

y'súcosecundário

Cna

principal.í

Sulcosecundário

.-

éster

Fig. 25.ó Modelo molecularde uma porção da duPlahélice do DNA. (AdaPtadodeNeal, A.L.Chemistryanil Biochemistry: AComprehensiveIntroduction : McGraw'Ilill:Nova York, 1971. Usadocom autorização dcMcGraw-Hill BookCompany, Nova York.)

F-ro Â

y'"ur"o

Ácidos Nucléicos e Síntese de proteínas U7

hélice (menor distância em que a hélice se repete) é tal que l0 pares sucessivos de nucleotídeos dãouma volta completa em 34 A (o módulo de repetição). O diâmetro externo da espiral é cerca de 20 Áe a distância interna entre as posições 1' das unidades de ribose das cadeias opoitas é cercade I I Ã.

Usando modelos moleculares em escala, Watson e Crick observaram qué a distância interna dadupla hélice só permitia ligações hidrogênio, entre os pares de bases, do tipo purina-pirimidina. Nãoocorriam, entre os pares de bases purina-purina, por serem muito grandes para se encaiiarem na hélice,

c l 'dadesoxirribose

Adenina

Guanina

,eo Âl-

cl 'dadesoxiriboseno DNA

Fig. 25.7 Emparelhamentodas bases (a) adenina comtimina e (b) citosina comguanina. As dimensões dospares ligados por ligaçãohidrogênio, timina-adeninae citosina-guanina, são taisque permitem a formaçãode ligações hidrogêniofortes e tambémpossibilitam que os pares debases se encaixem nointerior das duas cadeias defosfato-ribose da duplahélice. [Adaptado dePauling, L.; Corey, R. B.Arc h. Bio c he m. Btophy s.1956,65,164.181.1 Osmapas de potencialeletrostrítico calculadospara as bases indiüduaismostrarn a distribuiçãocomplementar de cargasque leva à formação deligação hidrogênio.

no DNA

C1' da - jdesoxirribose

no DNA

(a)

cl ' dadesoxirriboseno DNA

(b)

Citosina


Sulcosecundário

Fig. 25.8 Diagrama dadupla hélice do DNAmostrando oemparelhamentocomplementar das bases. Assetas indicam a direção3' -+ 5'.

nem entre os paÍes pirimidina-pirimidina, porque estariam muito afastados para formar ligações hi-úogênio efetivas.

Watson e Crick deram ainda um passo posterior fundamental em sua proposta. Assumindo que asbases heterocíclicas oxigenadas existiam nas formas cetônicas, argumentÍÌram que o emparelhamen-to de bases através de ligações hidrogênio só podia ocoffer por uma maneira específica: adenina (A)

com timina (T), e citosina (C) com guanina (G). A Fig. 25.7 mostra as dimensões dos pares e os mapasde potencial eletrostático para as bases individuais.

Emparelhamento de adenina e timina e Emparelhamento de guanina e citosina

Timina Adenina Citosina Guanina

Este tipo de emparelhamento de bases é consistente com a descoberta de Chargaff de que VoN%T=IeToGlVoC=1.

O emparelhamento específico das bases significa ainda que as duas cadeias de DNA são comple-mentares. Sempre que a adenina apaÍece em uma cadeia, a timina deve aparecer em outra oposta esempre que há citosina numa cadeia, a guanina deve aparecer na outra (Fig' 25.8).

Base

n

-?

H

N_H.....,órr ,N\

l -1 ,>-( t\ ( )''""''-( X*.'r1,....."-J-

H

*y'

Pirimidina

Ácidos Nucléicos e Síntese de Èc,t:úo +19

observe que, enquanto a€spinha dorsal açúcar-fosfato do DNA é completamente resuxaÍ" aseqüência de pares de bases heterocíclicas ao longo desta estrutura pode assumir

-ìi,"i-p"À"tações diferentes. Isto é importante, pois é a seqüênciaexatados pares de bases qr;;-2i,;gu,informação genética. observe também que uma cadeia da fita aupta e o complemento da orirra.Se a seqüência das bases ao longo de uma cadeia for conhecida, Ë possível o!r"r"u".Ãqtieo-cia ao longo da outra p-orque A sempre se emparelha com T, e G sempre se emparelha com C.Esta complementaridade. das duas fitas explica como a molécula ae ONe ," ,"pli"u au.uot. udivisão celular, transmitindo, assim, a infórmação genética para cada uma das duas células fi-lhas.

25.4C Replicação do DNAPouco antes da divisão celular, a dupla hélice deDNA começa a se desenrolar. Fitas complementares

se formam ao longo de cada cadeia (Fig.25.9). Na realidade, cada cadeia atua como om gauútopara a formação do seu complemento. Quando o desenrolamento e a duplicação terminamlforma-ram-se duas moléculas de DNA idênticas, onde apenas uma existia. Estas duas moléculas podem entãopassar para as cólulas descendentes, uma para cada célula.

Fig. 25.9 Replicação doDNA. A cadeia dupla sedesenrola numaextremidade. formandocadeias complementaresemparelhadas ao longo decada cadeia desenrolada.


Probfema 25.7 > (a) Existem aproximadamente 6 bilhões de pares de bases no DNA de uma única célula humana.Admitindo que este DNA exista como dupla hélice, calcule o comprimento de todo o DNAcontido numa célula humana. (b) O peso do DNA de uma célula humanaé 6 X 10-12 g. Admitindoque a população da Terra seja cerca de 3,5 bilhões de pessoas, podemos concluir que toda ainformação genética que deu origem a todos os seres humanos vivos nos dias de hoje estavacontida no DNA dos óvulos correspondentes fertilizados. Qual é o peso total deste DNA? (Ovolume que este DNA ocuparia é aproximadamente o de uma gota de chuva. Porém, se as molécu-las individuais fossem enfileiradas, cabeça com pé, elas cobririam o comprimento correspondentea quase oito vezes a distância de ida e volta à Lua')

Problema 25.8 > (a) A forma tautomérica mais estável da guanina é a forma lactâmica. Esta é normalmente a formapresente no DNA e, conforme já vimos, emparelha-se especificamente com a citosina. Se aguanina se tautomeriza na forma anormal lactâmica, emparelha-se com a timina. Escreva fórmulasestruturais mostrando as ligações hidrogênio deste par de bases anormal.

ooH

)-4"-t )--.-I*t

)4rA^", )4*4"",HH

Forma lactÍimicada guanina

Forma lactímicada guanina

(b) O emparelhamento impróprio de bases provocado por tautomerizações, que ocoÍïem durante oprocesso de replicação do DNA, é sugerido como fonte de mutações espontâneas. Vimos na parte(a) que, se a tautomerização da guanina ocorrer no momento apropriado, poderá levar à introduçãoda timina (emvez da citosina) na cadeia complementar do DNA. Que erro esta nova cadeia deDNA introduziia em sua frta complementar, na próxima replicação, mesmo sem ocorrer nenhumaoutra taútomenzação?

Problema 25.9 > As mutações também podem ser provocadas quimicamente, sendo o ácido nitroso um dos agentesmutagênicos mais potentes. Uma explicação sugerida para o efeito mutagênico deste ácido é queele causa reações de desaminação em purinas e pirimidinas contendo grupos amino. Quando, porexemplo, um nucleotídeo contendo adenina é tratado com ácido nitroso, converte-se em umderivado de hipoxantina.

N

N

R

o

rrNo, )--''4|0-"----r ( ll I

l^*"R

Nucleotídeoadenina

Nucleotídeohipoxantina

(a) Baseando sua resposta em reações quejá foram vistas, quais são os intermediários prováveisna interconversão adenina? hipoxantina? (b) Normalmente a adenina se emparelha com a timinano DNA, mas a hipoxantina se emparelha com a citosina. Mostre as ligações hidrogênio do par debase hipoxantina + citosina. (c) Mostre quais erros a interconversão adenina -+ hipoxantinapoderia gerar no DNA após duas replicações.

25.5 RNA e SínresE DE PRorEíNAsLogo depois da publicação da hipótese de Watson-Crick, os cientistas começarÍìm a estendê-la,

formulando o que Crick chamou de "o dogma central da genética molecular". Este dogma estúele-ceu que a informação genêtica flui da seguinte maneira:

DNA --+ RNA ----) proteína

A síntese de proteína é, obviamente, muito importante para a função da célula, pois as proteínas(as enzimas) catalisam suas reações. Mesmo células muito primitivas, de certas bactérias, requerem

Existem úrus, chamadosretroúrus, em que asinformações fluem do RNAparaoDNA.Ovíruscausador da AIDS é umretroúrus.

Problema 25.10 >

Fig.25. l0Transcrição docódigo genético doDNAparaonRNA.

etç. j. *tÇ. etc.

á)?Pts l

IT{'

, ' -* t , I

Y.is; PP

@**-"1" W e: i : i i ic+

| , rc:-Wï I* r-" "Y " & r::::;:cJ

- 'T

Ácidos Nucléicos e Síntese de proteínas 451

pelo menos 3.000 enzimas diferentes. Isto significa que as moléculas do DNA dessas células devemconter um número correspondente de genes para direcionar a síntese dessas proteínas. Gene é o seg-mento da molécula de DNA que contém a informação necessária para direèionar a síntese de umaproteína (ou de um polipeptídio).

O DNA é encontrado, primordialmente, no núcleo das células eucarióticas. A síntese das proteí-nas ocone principalmente na parte da célula chamada citoplasma. A síntese das proteínas ."qu"r urealização de dois processos principais; o primeiro ocorre no núcleo da célula e ó segundo no cito-plasma. O primeiro é a transcrição, processo no qual a mensagem genéiicaé transõrita pÍÌra umaforma do RNA, chamada RNA mensageiro (mRNA). O segundo proõesso envolve duas outras for-mas de RNA, o RNA ribossômico (rRNA) e o RNA rraasportador (tRNA).

25.5A Síntese do RNA Mensageiro.Transcrição

A síntese das proteínas começa no núcleo das células, com a síntese do mRNA. Parte da dupla hélicedo DNA se desenrola o suficiente pÉÌra expor. numa única c adeia, apartecorrespondente a peio menosum gene. Os ribonucleotídeos, presentes no núcleo da célula, agrupam-se ao longo da cadeìa de DNAexposta, emparelhando-se com as bases do DNA. Os padrões de emparelhamento são os mesmos doDNA, exceto que no RNA a uracila substitui a timina. As unidades de ribonucleotídeos do mRNA estãounidas numa cadeia por uma enzima chamada RNA polimerase. Este processo está ilustrado na Fig.25.t0.

Escreva fórmulas estruturais mostrando como a forma cetônica da uracila (Seção 25.2),nomRNA, pode emparelhar-se com a adenina do DNA através da formação de ligação hidrogênio.

Depois de o mRNA ter sido sintetizado no núcleo da célula, ele migra para o citoplasma onde,como veremos, age como um gabarito para a síntese das proteínas.

25.58 Ribossomas - rRNAEspalhados no citoplasma da maioria das células estão pequenos corpos chamados de ribossomas.Os ribossomas daEscherichia coli (8. coli),por exemplo, têm um diâmetro por volta de 180 Â e sãocompostos de aproximad amente 6OVo de RNA (RNA ribossô mico) e 4OVo de proteína. ApaÍentementeeles existem como duas subunidades associadas, chamadas subunidades 50S e 30S Gig. 2S.1 t;; iun-tos formam o ribossoma 70S.x Apesar de os ribossomas estarem no sítio da síntese dú proteinãs, o

PI

U{IPI

G{IP

G+IPI

c{I

Cadeia do mRNA

I e.

* ' - . )I t-(''

Cadeiade RibonucleotídeosDNA do gene

P = Ligação de éster de fosfato

K = Desoxirribose

| = nioo."

PP

ffi-*;:::;;c{; l

Cadeia do DNA Cadeiacomplementar

do RNA

A = Adenina

C = Citosina

G = Guanina

U = Uracila

t3

t__ AT

I

7

- II?I

K-oII

pI

ffic1

+S é o símbolo da unidade suedberg, usada pma descrgver o compoÍamento das proteínm em uma ultracentrífuga


Fig. 25.1 | O ribossoma 70Smostrando suâs duassubunidades.

*,O".r"t"r'r{Ribossoma 50S

Ribossoma 30S

Aminoácido

Seqüênciade Bases5'-+3'

próprio rRNA não direciona a síntese de proteínas. Em vez disso, vários ribossomas se ligam à ca-àeiã ae mRNA formando o que se chama de polissoma. É ao longo do polissoma - com o mRNAatuando como gabarito - que ocorre a síntese das proteínas. Uma das funções do rRNA é ligar oribossoma à cadeia do mRNA.

25.5C RNA TranspoÉador

O RNAtransportadortempeso molecularmuitobaixo, quando comparado ao do mRNA e dorRNA.Conseqüentemente, o RNA transportador é muito mais solúvel do que o mRNA ou o rRNA sendo, àsvezes, denominado RNA solúvel. A função do tRNA é transpoÍar aminoácidos para áreas específi-cas do mRNA do polissoma. Existem, assim, muitas formas de tRNA; mais de uma para cada um dos20 aminoácidos que estão incorporados nas proteínas, incluindo as redundâncias no código genético(ver Tabela 25.2).ï

Seqüênciade Bases

Aminoácido 5'-+3'

AACAAU

GACGAU

GCAGCCGCGGCU

AGAAGGCGACGCCGGCGU

UGCUGU

Cis

GAAGAG

GGAGGCGGGGGU

Asp

AGCAGUUCAUCGUCCUCU

ACAACCACGACU

UGG

GUAGUGGUCGUU

UGGUACUAU

CAACAG

GluIniciação da

cadeia fMet(N-formilmetionina)

Término da cadeia

rEmbora as proteínas sejam constitúdas por 22 minoácidos diferentes, a síntese de prcteÍnas requer apenas 20 deles. A prolina é convertida em

hidroxiprolina e a cisteína é convertida em cistina depois de terminada a síntese da cadeia polipeptídica.

Gln

Tabefa 25.20 Código Genético do RNA Mensageiro

UUUUUC

CCAcccCCGCCU

Acidos Nucléicos e Síntese rÌe h-:r,::no 453

A estrutura da maioria dos IRNA já foi determinada. São compostos por um número relauvÊ.''Ên-te pequeno de unidades nucleotídicas (70-90 unidades), enrohdâs

"- ütiu, .tplt* ou úoãç*- p.l-.

emparelhamento das bases ao longo da cadeia (Fig..25.12). Um braço sempre tèrmina na "eqlrêilmcitosina-citosina-adenina. E a este braço que um aminoácido específico se úga, aftavés a, urìÀ-i*o-

OH 3' do ácido adenílicoI

AI

C

ò

AI

ç:: : : : :çt l

ç:: : : : :çt tGUt lÇii i i !!cr l9::::::ct ly y ,rr_v_A,ç c-4-.Ç;.Ç.- 9-gl \

/c-A-u-c= F' ! : : : : i : ! ! ! : : : ! boúu ìc..-.ç.-=p..-.ç.-ú' ç-ü-c-ó'-ê'-ê: - * /"i" :!: :i: :i: ii: G J

-'F-F.-.'" \D-c ' -õ-ê--c------D-r U

c-c-H-a, M GüG\

\AìÇi!i i ! ict l

\a)

U::::::Al r?::::::ïï : : : : : : ï

,/c *\

Y ï'Uu...

.rMrI -G-C

IEìF-J

Anticódon

Fig. 25. | 2 (a) Estrutura do tRNA isolado da levedura e que possui afunção especíÍica de transportar resíduos da alanina. Os nNÀstransportadores contêm, freqüentemente, nucleosídeos incomuns.PSU = pseudouridina, RT = ribotimidina, MI = l-metilinosina. I =inosina, DMG = M-metilguanosina, DHU = 4,5-diidrouriaina. iMG= l-metilguanosina. (b) A estrutura de cristal de raios X do tíNA dafenilalanina da levedura (Hingerty, B. 8.1 Brown, R. S.; Jack, A..LMol. Biol.1978, 124,523, nome do arquivo do Banco de Dados deProteína: 4TNA.pdb).


ção éster, ao grupo 3'---OH da adenosina terminal. Esta reação de conexão é catúsada por uma enzimaespecífica para o tRNA e para o aminoácido em questão. Esta especificidade pode ultrapassaÍ a ha-bilidade da enzima em reconhecer seqüências de bases ao longo de outros braços do tRNA.

Na espiral de outro braço há uma seqüência específica de bases denominada anticódon. O anticódoné muito importante pois permite que o tRNA se ligue a um sítio específico - chamado códon - domRNA. A ordem em que os aminoácidos são levados por suas unidades de tRNA para o filamento demRNA é determinada pela seqüência de códons. Esta seqüência, então, constitui uma mensagemgenética. As unidades individuais desta mensagem (as palavras individuais, cada qual corresponden-do a um aminoácido) são trincas de nucleotídeos.

25.5D O Código Genético

Qual trinca do mRNA conesponde a qual aminoácido é o que se chama de código genético (vejaa Tabela 25.2). O código deve ser na forma de três bases, não de uma ou de duas, pois existem 20aminoácidos diferentes usados na síntese das proteínas, mas apenas quatro bases diferentes no mRNA.Se fossem usadas apenas duas bases haveria apenas 42 ou 16 combinações possíveis, um número muitopequeno para acomodar todos os possíveis aminoácidos. Porém, com um código de três bases, 43 ou64 seqüências diferentes são possíveis. Isto é muito mais do que o necessário e permite especificarum aminoácido em maneiras múltiplas. Também abre espaço para seqüências de pontuação da sínte-se de proteínas, seqüências que, por exemplo, determinem, "comece aqui" ou "termine aqui".

A metionina (Met) e a N-formilmetionina (fMet) possuem o mesmo código mRNA (AUG); po-rém, a N-formilmetionina é transpoÍada por um tRNA diferente do que transporta a metionina. A N-formilmetionina parece ser o primeiro aminoácido incorporado na cadeia de proteínas nas bactérias:e o tRNA que transporta a fMet parece ser a marca de pontuação que determina "comece aqui". An-tes da síntese de polipeptídio terminar, a N-formilmetionina é removida da cadeia de proteína poruma hidrólise enzimática.

cH3scH2cH2cHCo2HI

NH

c:o

lr-rormitmltlionina

Podemos ver agora como deveria ocoffer a síntese de um polipeptídio hipotético. Este processo échamado tradução. Imagine que uma longa fita de mRNA esteja no citoplasma de uma célula e emcontato com ribossomas. No citoplasma também estão presentes 20 aminoácidos diferentes, cada umacilado em seu próprio tRNA.

Como mostra aFig. 25 .13 , o tRNA que cÍrïega a fMet emprega seu anticódon para se associar aocódon apropriado (AUG), na parte do mRNA que está em contato com um ribossoma. A próximatrinca de bases nesta çadeia particular de mRNA é AAA; este é o códon específico da lisina. Umlisil-tRNA, com o anticódon conveniente, UUU, se liga a este sítio. Os dois aminoácidos, fMet e Lis,encontram-se agora em posição apropriada paÍa uma enzima uni-los numa ligação peptídica. Depoisque isto aconteceo o ribossoma se desloça na cadeia para entrar em contato com o próximo códon.Este códon, GUA, é específico da valina. O tRNA que canega avalina (com o anticódon apropriado)se liga neste sítio. Outra reação enzimáttica liga a valina à cadeia polipeptídica. Então, todo o proces-so se repete sucessivamente. O ribossoma se move ao longo da cadeia do mRNA, outros tRNAs sedeslocam com seus respectivos aminoácidos, novas ligações peptídicas se formam e a cadeia poli-peptídica vai aumentando. Em algum ponto uma reação errzimáttica remove a fMet do início da ca-deia. Por fim, quando a cadeia está no comprimento apropriado, o ribossoma alcança a marca de pon-tuação, UAA, dizendo "pare aqui". O ribossoma separa-se da cadeia do mRNA e separa-se tambéma proteína formada.

Mesmo antes de a cadeia polipeptídica estar completamente crescida, ela começa a formar suaspróprias estruturas secundária e terciária (Fig. 25.14).Isto ocorre porque a sua estmtura primiíria estáconeta - seus aminoáçidos estão ordenados na maneira correta. Formam-se então ligações hidrogê-nio, dando segmentos específicos de a-hélice, de lâminas pregueadas e de espiras ou novelos. Emseguida, toda a cadeia se dobra e encurva; as enzimas instalam as ligações dissulfeto, de modo que,quando a cadeia se completa, a proteína tem exatamente o formato que necessita para realizar suafunção. (Entretanto, prever as estruturas secundária eÍerciá$7a da proteína a partir da seqüência deaminoácidos ainda é um problema cítico na bioquímica estrutural.)

Se a proteína for a lisozima, por exemplo, há uma fenda ou boca profunda onde um polissacarídeoespecífico pode se encaixar. Se for a lisozima, e acontecer que uma bactéria passe por perto, a bocacomeça a agir; ataca e quebra o seu primeiro polissacarídeo pela metade.

Ácidos Nucléicos e Síntese de Proteína: 455

cH3?(?Hr, ?

HCNH-CH-C

NHzt -

.í%-o,->.b\

oA cadeiase inicia

fMet

Fig. 25. l3 Crescimento,passo a passo, de umacadeia polipeptídica, com oRNA mensageiro agindocomo gabarito. Os RNAstransportadores carregâmos resíduos de aminoácidospara o sítio do mRNA queestá em contato com umribossoma. Ocorre então oemparelhamento códon-anticódon entre o mRNA eo RNA, na superfÍcie doribossoma. Uma reaçãoenzimática liga os resíduosde aminoácidos através deuma ligação amídica.Depois que a primeiraligação amídica se forma, oribossoma se move para opróximo códon do mRNA.Um novo tRNA seaproxima, emparelha-se etransporta seu resíduo deaminoácido para a cadeiapeptídica em crescimento, eassim sucessivamente.

Anticódon:

Códon:

mRNA

TRNALIS

Adiçãode valina

Enquanto isto, outros ribossomas, mais próximos do início da cadeia do mRNA, já se aprontam,cada qual sintetizando outra molécula de polipeptídio. O tempo necess ârìo para sintetizar uma prote-ína depende, é claro, do número de resíduos de aminoácidos que ela contém; de maneira geral, cadaribossoma pode provocar a formação de 150 ligações peptídicas por minuto. Assim, uma proteína,tal como a lisozima, com I29 resíduos de aminoácidos, requer menos de um minuto paÍa ser sinteti-zada. Entretanto, se quatro ribossomas estiverem operando sobre uma única cadeia de mRNA, opolissoma pode produzir uma molécula de lisozima a cada 13 segundos.

Pode-se perguntar por que é necessária a síntese de proteínas - especialmente num organismototalmente desenvolvido? A resposta é que as proteínas não são permanentes; não são sintetizadasuma vez e depois deixadas intactas na célula pela vida toda do organismo. As proteínas são sintetiza-das quando e onde são necessárias. Depois são desmembradas, voltando aos aminoácidos; são enzi-

UUGGAAGA

UGGAAüA


Fig. 25. l4 O enovelamentoda molécula de proteínadurante sua síntese.[Adaptado com a permissãode Phillips, D. C. "TheThree-DimensionalStructure of an EnzymeMolecule." Em Bin - organicChemistry; Calvin, M.,Jorgenson, M. J., Eds.;Freeman and Co.: SanFrancisco, 1968; p.62.Direito autoral @ 1966 daScientiÍïc American, Inc.Todos os direitosreservados. @ Irving Geis.l

Cadeiapolipeptídica

em crescimento

RNA mensageiro

Ribossoma

Número do códon

mas que desmembram as enzimas. Alguns aminoácidos são metabolizados paÍa gerar energia; ou-tros - novos - provêm do alimento que o organismo ingere, e todo o processo se repete mais umavez.

Problema 25. | | > Um segmento de DNA tem a seguinte seqüência de bases:

. . . AC C C C C A A AATG TC G.. .

(a) Que seqüência de bases apaÍeceria no mRNA transcrito por este segmento?(b) Assuma que a primeira base neste mRNA seja o início de um códon. Qual a ordem de

aminoácidos que seria traduzida no polipeptídio sintetizado ao longo deste segmento?(c) Forneça anticódons para cada IRNA associado à tradução do item (b).

Ácidos Nucléicos e Síntese de Proteínas 457

Problema 25.12> (a) Usando o primeiro códon de cada aminoácido da Tabela 25.2, escreva a seqüência de basesdo mRNA que traduziria a síntese do seguinte pentapeptídio:

Arg'Ile'Cis'Tir'Val

(b) Que seqüência de bases, no DNA, transcreveria a síntese do mRNA? (c) Que anticódonsapareceriam nos tRNAs envolvidos na síntese do pentapeptídio?

Problema 25. | 3 > Explique como um erro de uma única base em cada fita de DNA poderia provocaÍ um eÍïo noresíduo de aminoácido causando a anemia falciforme (Seção 24.6C).

Gilbert e Sanger comparti-lharam o Prêmio Nobel deQuímica de 1980 com PaulBerg, pelo trabalho comácidos nucléicos. Sanger(Seção 24.5), pioneiro noseqüenciamento de proteí-nas,já havia recebido oPrêmio Nobel de 1958 peladeterminação da estruturada insulina.

25.6 DerenurNAçÃo DA SEeüÊNcra DE BAsEs Do DNAA estratégia básica usada para seqüenciar o DNA assemelha-se aos métodos de seqüenciamento

das proteínas (Seção 24.5). Como as moléculas de DNA são muito grandes, necessita-se, iniçialmen-te, quebrá-las em fragmentos menores, mais ffatáveis. Tais fragmentos são seqüenciados individual-mente, e então, identificando os pontos de sobreposição, são todos ordenados de modo a revelar aseqüência de nucleotídeos do ácido nucléico original.

A primeira parte do processo é realizada mediante enzimas denominadas endonucleases de res-trição. Estas enzimas clivam a fita dupla do DNA em seqüências de bases específicas. Hoje são co-nhecidas centenas de endonucleases de restrição. Uma delas, por exemplo, chamadaAlul, provoca aclivagem da seqüência AGCT entre G e C. Uma outra, a EcoRl, rompe a seqüência GAATTC entreG e A. A maioria dos sítios reconhecidos pelas enzimas de restrição possui seqüência de pares debases com a mesma ordem, em ambas as fitas, quando lidas a partir de 5' na direção de 3'. Por exem-plo:

5' <-- G*A-A-T-T-C ----> 3',

3' <- C-T-T-A-A-G ---- ' 5'

Essas seqüências são conhecidas como palíndromos. (Palíndromos são palavras ou frases que selêem da mesma forma num sentido ou no sentido inverso. Por exemplo, osso, radar, orava o avaro,Roma me tem amor.)

O seqüenciamento dos fragmentos (chamados fragmentos de restrição) pode ser feito quimica-mente (método descrito a seguir) ou com o auxflio de enzimas. O primeiro método químico foi intro-duzido em 1977 por Allan M. Maxam e Walter Gilbert, da Universidade de Harvard; o primeiro mé-todo enzimático foi apresentado, no mesmo ano, por Frederick Sanger.

25.óA Seqüenciamento Químico

O fragmento de restrição da fita dupla a ser seqüenciado é inicialmente marcado enzimaticamentena extremidade 5' por um grupo fosfato contendo fósforo radioativo. Depois disso, as fitas são sepa-radas e isoladas. Em seguida os fragmentos de fita simples, marcados, são tratados com reagentesque atacam bases específicas, modificando-as de modo a permitir a clivagem da cadeia próximo àquelasbases. Por exemplo, numa cadeia como a que se segue (lida de 5' para 3 ', da esquerda para a direita),

32P-GCAATCACGTC

otratamentodofragmentocomhidrazina(NHrNHr)emNaCl I,SM,itâatacar(porumcaminhoquenão descreveremos aqui) os resíduos de citosina, de modo que o tratamento posterior com piperidina(Seção 20.18) causará a clivagem no lado 5' de resíduos C. O que produzirá os seguintes fragmen-tos, marcados em 5':

32P-GCAATCACGT

3'P-GCAATCA

32P-GCAAT

32P-G

Esses fragmentos podem então ser separados por uma técnica chamada eletroforese em gel (Fig.25.15). Uma amostra contendo a mistura de fragmentos é çolocada numa extremidade da lâmina finade gel de poliacrilamida KCHTCHCONHÌ1. O gel irá sepaÍaÍ os fragmentos com o marcador radi-oativo, sobre a ação de um cÍìmpo elétrico. Os fragmentos desloçam-se através do gel, em velocida-des diferentes, conforme o número de grupos fosfato com carga negativa que possuem e, também,dos seus respectivos tamanhos. Os fragmentos menores movem-se mais rapidamente. Depois da se-paração a lâmina de gel é colocada em contato com uma chapa fotográfiça. A radiação de um frag-mento contendo o fosfato radioativo na posição 5' provoca o surgimento de uma mancha escura na

458 Ácidos Nucléicos e Síntese de PÍoreínas

Fig. 25. l5 Aparelho paraeletroforese em gel. Asamostrâs são aplicadas nasfendas no topo do gel.Aplicação de uma diferençade voltagem faz as amostrasse deslocarem. As amostrasse movem em trajetóriasparalelas. (De Voet, D.;Voet, J. G. Biochemistry,2."ed.; Wiley: Nova York,1995, p.92. [Usado comautorização.l)

Fig. 25.ló Uma auto-radiografia deseqüenciamento em gelcontendo fragmentos de umsegmento de DNA que foisubmetido aseqüenciamento químico. ODNA foi marcado com 32P

na extremidade 5'. Aseqüência deduzida para ofragmento de DNA estáescrita na coluna da direita.Como os fragmentosmenores estão no fundo daplaca de gel, a direção 5' -->3' na seqüênciacorresponde à direção debaixo para cima no gel.(Cortesia de DaüdDressler, de Yoet, D. e VoetJ. G. Biochemistry,2." edl.;Wiley, Nova York, 1995, p.892. Usado comautorização.)

chapa fotográfica, no ponto em contato com o gel. A chapa exposta é uma auto-radiograÍïa e estatécnica é denominadatécrljca auto-radiográfica. Os fragmentos não marcados da cadeia medianatambém estão presentes, mas não se revelam na placa e por isso são ignorados.

O DNA a ser seqüenciado pode ser rompido próximo a certos pares específicos, submetendo-oem alíquotas seprÌradas a quatro tratamentos diferentes. Além da clivagem exclusiva próxima do C,mencionada anteriormente, há reagentes que clivam, no lado do terminal 5', exclusivos para o G, enoladode5'paraoAeGenoladodo5'paraoCeT.Apósacl ivagem,asal íquotasseparadassãosubmetidas a eletroforeses simultâaeas, em quatro pistas paralelas do gel. Depois da auto-radiografiaos resultados, como os mostrados na Fig. 25 .16, permitem a leitura da seqüência de DNA diretamen-te do gel.

A leitura do gel é feita a partir da parte inferior: há uma mancha escura na pista A + G, mas ne-nhuma na pista G. Isto indica que o menor fragmento marcado é A. O mesmo padrão ocorre no se-gundo nível, indicando outro A. O terceiro nível acima é esçuro na pista do C e claro na pista C + T,indicandoqueCéaterceirabasenaseqüência.AquartabaseéAmaisumavez,eassimpordiante.O processo é tão regular que se usam computadores hoje em dia para auxiliar a leitura dos géis.

A*G C*T

,"cT

TG

T.

SEIT

éçcx

çõFÁ+r

Tt

-TIc[T

oGT

T

TA

TA

AA

Ácidos Nucléicos e Síntese de hoteínas 459

O avanço no seqüenciamento de DNA tem sido tão rápido que, nos dias de hoje, é este seqüen-ciamento no gene corespondente a uma proteína o método mais fácil para determinar a seqüènciade aminoácidos de uma proteína. (Uma vez conhecido o código genético, pode-se deduzir a seqüên-cia de aminoácidos da proteína a partir da seqüência de bases do DNA que codifica a proteína.j Umrecente êxito no seqüenciamento de DNA foi a determinação da seqüência total dos 172.282 paresde bases do vírus Epstein-Barr (vírus do herpes humano); também está sendo rápido o progresso noseqüenciamento dos 2,9 bilhões de pares de bases dos 100.000 genes que constituem o genoma hu-mano.

25.7 Sínrese DE OltcoNuclEoríoeos EM LABoRAToRtoUm gene é o projeto da proteína que está codifiçada em uma seqüência específica de pares de

bases do DNA. O que fazem os genes individuais e como funcionam? São essas as perguntas qrr"fazem os biólogos e bioquímicos atualmente. Ao enunciá-las, estão usando uma abordãeem comole-tamente nova para o estudo da genética, chamada genética invertida. A definição tradiãional da ge-nética envolve a alteração ou a anulação aleatórias dos genes, mediante mutações induzidas no orga-nismo, observando depois os efeitos nos descendentes. Com organismos superiores, como os verte-brados, existem desvantagens sérias nesta abordagem. As gerações são inconvenientemente longas,o número de descendentes é pequeno e as mutações mais interessantes geralmente são letais sendo,por isso, difíceis de se propagar e de serem estudadas.

A abordagem da genética invertida consiste em iniciar com um gene clonado e manipulá-lo paradescobrir como ele funciona. Uma forma de manipulaçáo é ade sintetizar cadeias de DNA (oligonu-cleotídeos com aproximadamente 15 bases) que são complementares a determinadas partes do gene.Esses oligonucleotídeos sintéticos, chamados nucleotídeos anti-sensores, são capazes de ligar-seno que se denomina a seqüência sensor do DNA. Assim, podem alterar aatividade do gene ou mes-mo anulá-lo totalmente. Por exemplo, se a parte de sensor do DNA num gene for

A_G-A-C-C_G-T_G-Go oligonucleotídeo anti-sensor seria

T-C_T-G_G-C_A_C_CA capacidade de desativar genes específicos dessa maneira leva a grandes esperanças médicas.

Alguns vírus e bactérias, durante seus ciclos vitais, utilizam um método como esse para regular al-guns dos seus próprios genes. A esperanç4, portanto, é sintetizar oligonucleotídeos anì-sensõres queprocurassem e destruíssem vírus nas células de uma pessoa, ligando-se a seqüências fundamentaisdo DNA ou do RNA do vírus. A síntese destes oligonucleotídeos é uma área ativa de pesquisa nosdias de hoje, e se direciona a muitas doenças provocadas por vírus, inclusive a AIDS.

Os métodos comuns para a síntese de oligonucleotídeos são similares aos utilizados na síntese deproteínas, e entre eles as técnicas em fase sólida automatizadas (Seção 24.7D). Um nucleotídeo, ade-quadamente protegido, é conectado a uma fase sólida denominada "vidro de poros controlados" ouCPG (sigla em inglês) (Fig. 25.17), por uma ligação que poderá ser posteriormente clivada. O próxi-mo nucleotídeo protegido, na forma de um fosforamidito, é adicionado e o acoplamento é proìoca-do por um agente de acoplamento, geralmente o I,2,3,4-tetrazol. O triéster de fosfito resultante doacoplamento é oxidado a triéster de fosfato, pelo iodo, produzindo uma çadeia estendida por um nu-cleotídeo. O grupo dimetoxitritila (DMTr) usado para proteger a extremidade 5' do nucleotídeo éremovido pelo tratamento com um ácido, e as etapas de acoplamento, oxidação e destritilação sãorepetidas. (Todas as etapas são realizadas em solventes não aquosos.) Com sintetizadores automati-zados o processo pode ser repetido pelo menos 50 vezes e o tempo paÍa um ciclo completo é 40 mi-nutos ou menos. Depois que o oligonucleotídeo desejado foi sintetizado, ele é liberado do suportesólido e então os grupos protetores, incluindo os das bases, são removidos.

25.8 A RraçÃo EM Caoen eELA PoltuenaseA reação em cadeia pela polimerase (RCP) é um método extraordinariamente simples e efiçiente

para se ampliar seqüências de DNA. Partindo-se de uma só moléçula de DNA, a reação em cadeiapela polimerase pode gerar 100 bilhões de cópias numa única tarde. A reação é fâcll de realizar re-quer alguns reagentes, um tubo de ensaio e uma fonte de calor.

A RCP já provocou efeito importante na biologia molecular. Está sendo usada na medicina paradiagnosticar doenças infecciosas e genéticas. Um dos objetivos originais no desenvolvimento da RCpera usá-la para aumentar a velocidade e a eficiência do diagnóstico pré-natal da anemia falciforme(Seção 24.6C). Atualmente está sendo aplicada no diagnóstico de várias outras doenças genéticas.

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460 Ácidos Nucléicos e Síntese de proteínas

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Fosforamidito

Fig,25.17 Etapasenvolvidas na sínteseautomatizada deoligonucleotídeos usando ométodo de acoplamentocom fosforamidito.

t"j'reincluindo a distrofia muscular e a fibrose cística. Dentre as doenças infecciosas, a RCP é usada paradetectar citomegalovírus e vírus que causam AIDS, certos carcinomas cervicais, hepatite, sarampo edoença de Epstein-Barr.

A RCP é usada na prática jurídica, na genética humana e na biologia evolucioniíria. A amostra deDNA copiada pode provir de uma gota de sangue ou de sêmen, ou de um fio de cabelo deixado nacena de um crime. Pode até mesmo provir do cérebro de uma múmia ou de um peludo mamute de40.000 anos.

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Mullis recebeu o PrêmioNobel de Química pelo seutrabalho em 1993.

Fig. 25.18 Um ciclo dareação em cadeia pelapolimerase. O aquecimentosepara as cadeias de DNAdo alvo, dando doisgabaritos com uma sócadeia. Os iniciadores.designados paracomplementar a seqüênciade nucleotídeos, ao seacoplarem lateralmente aoalvo. Íïxam-se em cadacadeia. A DNA polimerase,na presença de trifosfatosde nucleotídeos, catalisa asíntese de dois fragmentosde DNA. cada um idênticoao DNA original do alvo.

I Rquecimento para separar as

{ cadeias; depois adição do iniciador

Ácidos Nucìéicos e Síntese de Proteína-s 461

A RCP foi inventada por Karl B. Mullis e desenvolvida por ele e seus colaboradores. na CetusCorporation. UtilizaaenzimaDNA polimerase, descoberta em 1955 por Arthur Kornberg e associ-ados, na Universidade de Stanford. Nas células vivas a DNA polimerase ajuda a reparar e replicar oDNA. A RCP emprega uma propriedade caracteística das DNA polimerases: a capacidade de ligarnucleotídeos adicionais a um pequeno oligonucleotídeo "iniciador", quando este iniciador está liga-do a cadeias complementares de DNA denominadas gabarito. Os nucleotídeos são ligados na extre-midade 3' do iniciador e o nucleotídeo ao qual a polimerase se liga será o complementar à base naposição adjacente da cadeia do gabarito. Se o nucleotídeo adjacente no gabarito é G, a polimeraseadiciona C ao iniçiador; se o nucleotídeo adjacente no gabarito é A a polimerase adiciona T, e assimpor diante. A polimerase repete este processo inúmeras vezes, enquanto os nucleotídeos necessários(na forma de trifosfatos) estiverem presentes na solução, até atingir a extremidade 5' do gabarito.

A Fig. 25.18 mostra um ciclo da RCP na maneira que é normalmentercalizada. Não é necessárioconhecer a seqüência de nucleotídeos do alvo da RCP. No entanto, é necessário conhecer a seqüên-cia em pequenos segmentos em cada lado do alvo, para sintetizar dois oligonucleotídeos de cadeiasimples (com - 20 nucleotídeos) que atuarão como iniciadores. Os iniciadores devem possuir se-qüências de nucleotídeos complementares às seqüências laterais de cada cadeia do DNA.

No início da RCP, o DNA com dupla cadeia (duplex) é aquecido paÍa separar as cadeias. Os ini-ciadores (umpara cadacadeia) são adicionados e acoplados às respectivas seqüências laterais. Adi-cionam-se então a DNA polimerase e os trifosfatos dos nucleotídeos, pÍÌra que a polimerase promovao alongamento de cada iniciador através da seqüência alvo de cada cadeia. Se o alongamento de umdado iniciador for suficiente, ele incluirá a seqüência complementar ao outro iniciador. Conseqüen-

AACGACTGCAAGGA

AACGACTGCAAGGAT TCCGAGt l l t t t t tLt t t t t t t t t t t lt t t t t t t t t t t t t t t t t t l t lTïGCTGACGT TCCTAAGGCT C

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AACGACTGCAAGGAT TCCGAGl t r r r r t t t t t t t t r t t r t r ll t t t t t t t t t t t t t t t t t t t lïTGCTGACGT TCCTAAGGCTC

AACGACt t t t t lt t t t t lTTGCTGACGT TCCTAAGGCTC

I Rdicao de DNA oolimeraset 'le

Y de trifosfatos de nucleotíoeos


Fig. 25. l9 Cada ciclo dareação em cadeia pelapolimerase duplica onúmero de cópias do DNAna área-alvo.

Extensão dos iniciadores paÍafazerem-se as cópias

1.,

temente, cada novo produto de alongamento pode atuar, depois que as cadeias forem separadas, comogabarito para outro ciclo.

Cada ciclo duplica a quantidade de DNA alvo (Fig. 25.19).Isto significa que a quantidade de DNAaumenta exponencialmente. Após n ciçlos, a quantidade de DNA terá crescido 2" yezes. Após 10ciclos haverá aproximadamente 1.000 vezes mais DNA; após 20 ciclos será aproximadamente 1 milhãode vezes maior. A aplicação da RCP é bastante úrpidae foi automatizada;2S ciclos podem ser feitosem t hora.

Separação das cadeias e adiçãodo iniciador

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Acidos Nuclércos e Síntese de P:,r:e;:r,

Palavras-chave e Conceitos

Ácidos nucléicosNucleotídeosNucleosídeosReplicaçãoTranscriçãoCódigo genéticoCódon, anticódonTraduçãoEndonucleases de restriçãoReação em cadeia pela polimerase (RCP)

Seções 25.1, 25,4 e 25.5Seções 25.2 e 25.3Seções 25.2 e 25.3Seção 25.4CSeção 25.54Seções 25.5C e 25.5DSeção 25.5CSeção 25.5DSeção 25.6Seção 25.8

cap.25 - Ácidos nucléicos e síntese de proteínas

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